ES2906203T3 - Variante de CIP2A novedosa y usos de la misma - Google Patents

Abstract

Variante polipeptídica aislada de CIP2A que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.

Description

DESCRIPCIÓN

Variante de CIP2A novedosa y usos de la misma

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un biomarcador asociado al cáncer novedoso y diferentes aplicaciones del mismo. Más específicamente, la invención se refiere a una variante de corte y empalme novedosa de CIP2A denominada NOCIVA, así como a cuerpos de unión tales como sondas, cebadores de amplificación y anticuerpos específicos para los mismos. También se proporcionan diversos métodos para detectar y pronosticar cáncer en función de dicha variante de corte y empalme, y un kit para su uso en dichos métodos. Sin limitarse a los mismos, la invención se refiere a, en particular, cánceres linfocíticos tales como leucemia mielógena aguda (LMA).

Antecedentes de la invención

La leucemia mielógena aguda (LMA) es la leucemia aguda más común que afecta a adultos. La incidencia de la LMA es de 2 a 3 casos nuevos por 100.000 habitantes por año. LMA es una neoplasia hemática clónica heterogénea que altera la hematopoyesis normal y es uno de los tipos de cáncer más agresivamente progresivos. Las primeras terapias curativas para la LMA se desarrollaron en las décadas de 1970-80 y antes estos pacientes con LMA tenían un pronóstico pésimo de sólo tres meses. En la década de 2010 el 50% de los pacientes con LMA por debajo de 60-65 años pueden obtener una remisión completa.

Los avances en la comprensión de la diversidad genética de la LMA han permitido la identificación de subgrupos de pronóstico dentro de los casos de LMA. La clasificación de los subtipos de LMA también es clínicamente relevante para optimizar las estrategias de tratamiento y reducir la mortalidad relacionada con el tratamiento y el riesgo de recaída. A los pacientes en la categoría de riesgo de buen pronóstico se les trata con quimioterapia, lo que permite que hasta el 70% de los pacientes entren en remisión completa. Alternativamente, el tratamiento para aquellos pacientes de pronóstico intermedio y malo para los que es adecuado, es el trasplante alogénico de células madre, que sigue siendo un procedimiento peligroso con muchas posibles complicaciones con una mortalidad del 30%. Los efectos secundarios relacionados con el trasplante también pueden ser a corto plazo, con una duración de semanas a meses, o a largo plazo, que pueden durar años o toda la vida.

A pesar de los avances por comprender la biología molecular de la LMA y aunque hasta en la mitad de los pacientes se produce una remisión completa, para muchos pacientes generalmente se espera una recaída y el pronóstico es pésimo. Por tanto, el desafío clínico actual es estratificar mejor a los pacientes con LMA según su pronóstico esperado. Especialmente sería útil desarrollar métodos de diagnóstico más sensibles para la detección de aquellos pacientes que con la clasificación actual del grupo de riesgo se determinan como pacientes de pronóstico favorable pero que no pueden curarse con quimioterapia convencional y deben ser dirigidos inmediatamente a un trasplante de células madre.

Por tanto, se necesitan nuevos marcadores clínicos y moleculares para el pronóstico de la LMA y la monitorización de la enfermedad residual mínima. Como parte del diagnóstico clínico de rutina, las muestras de pacientes con LMA se examinan con PCR en busca de mutaciones y genes de fusión que son característicos de la LMA. Sin embargo, no se conocen todas las anomalías genéticas que subyacen a la clasificación de la OMS de la LMA de mal pronóstico y, en realidad, sólo para la mitad de los pacientes con LMA existe una prueba de PCR genética molecular relevante disponible. Por tanto, existe una clara necesidad médica de identificar nuevos cambios genéticos que puedan usarse para diseñar y optimizar estrategias de tratamiento para pacientes con LMA.

La proteína fosfatasa 2A (PP2A) es un complejo supresor de tumores trimérico (subunidades A-B-C). En las células cancerosas, se inhibe la actividad supresora de tumores de PP2A. Sin embargo, las proteínas del complejo PP2A están mutadas con una frecuencia bastante baja en todos los tipos de cáncer. En cambio, el modo más frecuente de inhibición de PP2A en el cáncer parece ser la sobreexpresión de proteínas inhibidoras de PP2A, tales como CIP2A, SET y PME1. La sobreexpresión de CIP2A se asocia con un mal pronóstico del paciente en más de una docena de tipos de cáncer sólido humano (Khanna y Pimanda, 2015). Se sabe que SET se sobreexpresa en la LMA humana (Cristóbal I et al, 2010). El documento US2013/115599 da a conocer un método para ayudar en el diagnóstico de cáncer de vejiga usando CIP2A como marcador.

Todavía se necesitan marcadores adicionales para el pronóstico del cáncer, incluyendo cánceres linfocíticos tales como LMA.

Breve descripción de la invención

Un objeto de la presente invención es proporcionar medios y métodos para diversos aspectos del diagnóstico y pronóstico del cáncer. Este objeto se logra mediante disposiciones que se caracterizan por lo que se menciona en las reivindicaciones independientes. Algunas realizaciones preferidas se dan a conocer en las reivindicaciones dependientes.

La invención se basa, al menos parcialmente, en estudios que revelan que las células cancerosas pueden expresar diferentes isoformas de CIP2A con funciones posiblemente diferentes. Se identifica una isoforma novedosa de CIP2A.

Por tanto, en un aspecto, la invención proporciona una variante polipeptídica aislada de CIP2A, denominada NOCIVA, que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en ^s E^q ID NO: 3. En algunas realizaciones, dicho polipéptido comprende al menos parte de una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, o comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con SEQ ID NO: 2 fuera de la región formada por los aminoácidos 546-558. En algunas realizaciones adicionales, el polipéptido está codificado por un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico definida por los nucleótidos 1636-1674 de SEQ ID NO: 1, o que comprende los exones 1-13 de CIP2A unidos de manera C-terminal en marco a parte del intrón 13 de CIP2A. Incluso en algunas realizaciones adicionales, el polipéptido está codificado por un polinucleótido que comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 1 o una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con SEQ ID NO: 1 fuera de la región definida por los nucleótidos 1636-1674 de SEQ ID NO: 1.

En otro aspecto, la invención proporciona una variante de polinucleótido de CIP2A aislado, preferiblemente una variante de ADNc, que codifica para el polipéptido de la invención. En algunas realizaciones, el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico definida por los nucleótidos 1636-1674 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones adicionales, el polinucleótido comprende los exones 1-13 de CIP2A unidos de manera C-terminal en marco a parte del intrón 13 de CIP2A. En todavía algunas realizaciones adicionales, el polinucleótido comprende además 3'UTR. Incluso en algunas realizaciones adicionales, el polinucleótido comprende al menos parte de una secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 1, o comprende o consiste en una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con SEQ ID NO: 1 fuera de la región definida por los nucleótidos 1636-1674 de SEQ ID NO: 1.

También se proporciona el uso de los presentes polipéptidos o polinucleótido como biomarcadores de cáncer. En algunas realizaciones, dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en cánceres linfocíticos y cánceres sólidos. En algunas realizaciones adicionales, dicho cáncer linfocítico se selecciona del grupo que consiste en leucemia mielógena aguda (LMA) y leucemia mielógena crónica (LMC); mientras que el cáncer sólido se selecciona del grupo que consiste en carcinoma de células escamosas (SCC), carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de cuello uterino, esófago, cáncer de vejiga, cáncer de riñón y cáncer de páncreas.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un anticuerpo variante anti-CIP2A, es decir, un anticuerpo anti­ NOCIVA, o un fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al polipéptido según la invención.

En todavía un aspecto adicional, la invención proporciona un oligonucleótido, tal como una sonda, que se hibrida específicamente con el polinucleótido según la invención. En algunas realizaciones, el oligonucleótido se hibrida específicamente con una secuencia diana, que está abarcada por o se solapa con una secuencia formada por los nucleótidos 1635-1983 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones adicionales, el oligonucleótido se hibrida con 8-40, preferiblemente 15-35, más preferiblemente 20-30 nucleótidos consecutivos de una secuencia formada por los nucleótidos 1635-1983, 1636-1674 ó 1675-1983 de SEQ ID NO: 1.

Incluso en un aspecto adicional, la invención proporciona un par de cebadores que amplifica específicamente al menos una parte del polinucleótido según la invención. En algunas realizaciones, el par de cebadores comprende un cebador en 3' que se hibrida específicamente con una secuencia diana abarcada por, o que se solapa con una secuencia formada por los nucleótidos 1635-1983, 1636-1674 ó 1675-1983 de SEQ ID NO: 1. En algunas realizaciones, el par de cebadores comprende un cebador en 5' que se hibrida específicamente con una secuencia diana abarcada por una secuencia formada por los nucleótidos 1 a 1634 de SEQ ID NO: 1.

También se proporciona un método para pronosticar, detectar, clasificar, diagnosticar o monitorizar un cáncer. Dicho método comprende determinar el nivel de expresión del polipéptido o polinucleótido según la invención en una muestra de un sujeto. En algunas realizaciones, el método puede implicar la amplificación de ácidos nucleicos, por ejemplo, por un par de cebadores según la invención, y/o la hibridación del presente polinucleótido con un oligonucleótido según la invención. Alternativamente, el método puede implicar el uso de un anticuerpo según la invención. El método también puede implementarse usando una técnica seleccionada del grupo que consiste en secuenciación de próxima generación, hibridación in situ de ARN, y proteómica cuantitativa dirigida mediante espectrometría de masas tal como monitorización de reacción seleccionada (SRM), SWATH y citometría de masas, por ejemplo.

En un aspecto, la invención proporciona un método para asignar tratamiento a un sujeto al que se le ha diagnosticado LMA. El método comprende las etapas de: poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un reactivo que se une específicamente a un polipéptido o polinucleótido según la invención; determinar el nivel de expresión de dicho polipéptido o dicho polinucleótido basándose en dicha unión; determinar si el nivel de expresión determinado de dicho polipéptido o dicho polinucleótido está aumentado o no en la muestra comparando dicho nivel de expresión con un control; y asignando un régimen de tratamiento que comprende terapia con células madre si dicha expresión está aumentada.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un inmunoensayo para detectar la presencia del polipéptido según la invención en una muestra clínica. El inmunoensayo comprende poner en contacto la muestra con el anticuerpo según la invención; y detectar la unión específica del anticuerpo, si la hay, cualitativa o cuantitativamente.

En todavía un aspecto adicional, la invención proporciona un método para detectar la presencia del polinucleótido según la invención en una muestra biológica. El método comprende: a) poner en contacto la muestra con un oligonucleótido según la invención; y b) detectar la hibridación específica del oligonucleótido. En algunas realizaciones, el método puede comprender antes de a), amplificar dicho polinucleótido usando un par de cebadores según la invención.

Incluso en un aspecto adicional, la invención proporciona un método para detectar la presencia del polinucleótido según la invención en una muestra biológica. El método comprende: a) poner en contacto la muestra con un par de cebadores según la invención; b) realizar la amplificación de ácidos nucleicos; y c) detectar el amplicón obtenido en la etapa b) cualitativa o cuantitativamente con el oligonucleótido según la invención.

También se proporciona un kit para determinar el nivel del polipéptido según la invención, en el que el kit comprende un anticuerpo según la invención; y un kit para determinar el nivel del polinucleótido según la invención, en el que el kit comprende un oligonucleótido según la invención y/o el par de cebadores según la invención.

Otros objetivos, aspectos, realizaciones, detalles y ventajas de la presente invención resultarán evidentes a partir de las siguientes figuras, descripción detallada, ejemplos y reivindicaciones dependientes.

Breve descripción de los dibujos

A continuación, se describirá la invención con mayor detalle por medio de realizaciones preferidas con referencia a los dibujos adjuntos, en los que

Las figuras 1A a 1D ilustran la identificación de las variantes de ARNm de CIP2A novedosas.

La figura 1A es una presentación esquemática de isoformas de ARNm de CIP2A identificadas con RACE-PCR. Se encontraron tres variantes de ARNm de CIP2A. El ARNm de NOCIVA contiene un exón alternativo del intrón número 13 de CIP2A y, por tanto, forma una secuencia codificante única y previamente desconocida. La región no traducida (5'UTR o 3'UTR) se marca con puntos, el exón alternativo único en NOCIVA con rayado vertical y la 3'UTR específica de NOCIVA con un gradiente de grises y trazo de rayas.

La figura 1B ilustra el extremo 3' del ARNm de NOCIVA con las características diferentes de la secuencia de ARNm de CIP2A original. La secuencia compartida de los nucleótidos entre ARNm de CIP2A y NOCIVA está subrayada. La proteína NOCIVA comprende 545 aminoácidos N-terminales de CIP2A y 13 aminoácidos únicos en el extremo C-terminal (en negrita). El codón de terminación se indica mediante un asterisco. El ARNm de NOCIVA contiene también la 3'UTR (1675-2010 de SEQ ID NO: 1) y la señal de poliadenilación (AATAAA en 1962-1967 de SEQ ID NO: 1). La señal de poliadenilación y la cola de poli(A) están marcadas con recuadros. Se muestra una secuencia parcial de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 y una secuencia parcial de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.

La figura 1C muestra los resultados de la RT-PCR de confirmación para validar la expresión de la secuencia de ARNm específica de NOCIVA a partir de varias líneas celulares. ⁿT^c significa control sin molde. Se extrajeron las bandas resultantes y se confirmó la presencia de ARNm de NOCIVA específico mediante secuenciación. La figura 1D ilustra la formación de ARNm de NOCIVA a partir del gen KIAA1524 y muestra una parte de la secuencia de ácido nucleico de KIAA1524 (SEQ ID NO: 89). El exón 13 y el exón 14 de CIP2A está marcados con subrayado. El texto normal se usa para la secuencia intrónica entre los exones 13 y 14. En negrita está la región intrónica de la que se produce el ARNm de NOCIVA (correspondiente a los nucleótidos 1635-1983 en SEQ ID NO: 1). La secuencia en negrita es también una parte de la secuencia intrónica entre los exones 13 y 14. Las figuras 2A a 2E muestran la expresión del ARNm de NOCIVA y CIP2A en muestras normales y cancerosas de tejidos y células.

La figura 2A demuestra la expresión del ARNm de NOCIVA medido mediante qPCR con dos conjuntos de cebador-sonda diferentes en células de carcinoma de células escamosas (SCC) y queratinocito (Ker). Se usaron b-actina y GAPDH como genes de mantenimiento y los niveles de expresión de ARNm en células Ker 45B se definieron como valor 1.

La figura 2B muestra la expresión del ARNm de NOCIVA, CIP2Ae13 (es decir, CIP2A determinada usando un cebador en 5' que se hibrida con el exón 13 y un cebador en 3' que se hibrida con el exón 14) y CIP2Ae20 (es decir, CIP2A determinada usando un cebador en 5' que se hibrida con el exón 20 y un cebador en 3' que se hibrida con el exón 21) en un panel de tejido normal (panel I y II de MTC humano, Clontech). Se usaron b-actina y GAPDH como genes de mantenimiento.

La figura 2C muestra las razones de las expresiones del ARNm de NOCIVA y CIP2Ae13 en las muestras de tejido normal de la figura 2B.

La figura 2D muestra la expresión del ARNm de NOCIVA y CIP2Ae20 en las líneas celulares de LMA y LMC indicadas. LMA: leucemia mielógena aguda; LMC: leucemia mielógena crónica. Hela, UT-7 y MCF7 representan en este caso cánceres humanos sólidos.

La figura 2E muestra la expresión del ARNm de NOCIVA en muestras de LMA de diagnóstico derivadas de pacientes en comparación con la expresión promedio en queratinocitos y células de la figura 2A.

Las figuras 3A a 3B ilustran la sobreexpresión del ARNm de NOCIVA en muestras linfocíticas de diagnóstico. La figura 3A es una transferencia en cascada que muestra la distribución de 93 muestras de LMA humana de diagnóstico con sobreexpresión o subexpresión de ARNm de CIP2A o NOCIVA en comparación con la muestra de médula ósea normal definida como valor cero. Se usaron b-actina y GAPDH como genes de mantenimiento. La figura 3B muestra el porcentaje de 93 muestras de pacientes con LMA de diagnóstico que muestran sobreexpresión de los genes indicados en comparación con la muestra de médula ósea normal. FC > 2: porcentaje de muestras con sobreexpresión superior al doble.

Las figuras 4A a 4F muestran estadísticas y correlaciones clínicas del material de pacientes con LMA.

La figura 4A muestra la distribución del material del paciente con información de seguimiento clínico según los grupos de riesgo definidos en la tabla. El porcentaje vivo se refiere a los pacientes vivos después del tiempo de seguimiento (03/17, mediana de seguimiento de 5,4 años).

La figura 4B muestra la correlación estadística de la edad de diagnóstico del paciente y el grupo de riesgo con la supervivencia global en un análisis multivariante.

La figura 4C muestra la correlación de la expresión de los marcadores indicados con el grupo de riesgo en la población de pacientes estudiada. Ni la expresión del ARNm de CIP2A ni de NOCIVA es estadísticamente diferente entre los grupos de riesgo (los valores de p se muestran entre paréntesis).

La figura 4D muestra que la expresión alta de NOCIVA se asocia significativamente con una mala supervivencia global en un análisis multivariante.

La figura 4E muestra el diagrama de Kaplan-Meier de la supervivencia global de los pacientes con LMA según los niveles de expresión de NOCIVA divididos en bajo o alto. La mediana sirve como un punto de corte del valor. La figura 4F muestra que una razón alta de NOCIVA/CIP2Ae13 se asocia significativamente con una mala supervivencia global en un análisis multivariante.

La figura 5 muestra que un anticuerpo específico de NOCIVA detecta la proteína GST-NOCIVA recombinante de tamaño correcto (aprox. 90 kDa), pero no los fragmentos de CIP2A recombinantes. La señal puede bloquearse con un péptido bloqueante de NOCIVA.

La figura 6 ilustra una presentación esquemática de ejemplos no limitativos de diseño de oligonucleótidos para la detección de secuencias específicas de NOCIVA con PCR o qPCR. La línea discontinua marca el final de la secuencia de ARNm de CIP2A normal y el comienzo de la secuencia de ARNm específica de NOCIVA.

cebador, -Mj***»»»* cebador intercalado, sonda.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona una variante novedosa del inhibidor canceroso de PP2A (CIP2A o KIAA1524), denominada NOCIVA. A nivel del ARNm, la variante comprende los exones 1-13 de CIP2A fusionados de manera C-terminal con una parte del intrón entre los exones 13 y 14 en el gen KIAA1524. El transcripto de NOCIVA así formado es una secuencia única y previamente desconocida, en el que la secuencia intrónica está en un marco codificante con una secuencia de ARNm de CIP2A precedente, y después de 40 nucleótidos, correspondientes a 13 aminoácidos, está seguida por un codón de terminación (terminación de traducción) clásico TAA. La región no traducida tres prima (3'UTR) es la sección de ARNm que sigue inmediatamente al codón de terminación de traducción y las regiones reguladoras dentro de la 3'UTR pueden influir en la poliadenilación, eficacia de traducción, localización y estabilidad del ARNm. La posible 3'UTR de NOCIVA consiste en aproximadamente 350 nucleótidos incluyendo la secuencia AATAAA que dirige la adición de varios residuos de adenina denominados la cola de poli(A) al final del transcripto del ARNm. Por tanto, el producto génico de NOCIVA codifica para una proteína CIP2A truncada con 13 nuevos aminoácidos (NNKNTQEAFQVTS; SEQ ID NO: 3) en el extremo C-terminal. Es importante destacar que, esta secuencia peptídica de 13 aa no se empareja con cualquier secuencia de proteína conocida en el proteoma humano basándose en una búsqueda de homología mediante Blast. La secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 1 representa la secuencia de ADN complementario (ADNc) del ARNm de NOCIVA, mientras que la secuencia de aminoácidos del polipéptido de NOCIVA expuesta en SEQ ID NO: 2. SEQ ID NO: 3 corresponde a los aminoácidos 546-558 de SEQ ID NO: 2. Por motivos de claridad, las estructuras de interés en la secuencia de ARNm de NOCIVA se indican refiriéndose a la secuencia de ADN/ADNc respectiva de NOCIVA de SEQ ID NO: 1.

El ARNm específico de NOCIVA (nucleótidos 1635-2010 en la SEQ ID NO:1, longitud 376 nt) contiene las siguientes estructuras:

• secuencia de ARNm intrónica específica de NOCIVA sin la cola de poli-A: nucleótidos 1635-1983 de SEQ ID NO:1 (350 nt);

• secuencia de ARNm de NOCIVA que codifica para el péptido de NOCIVA novedoso (13 aminoácidos):

nucleótidos 1636-1674 (39 nt) de SEQ ID NO: 1;

• 3' UTR: nucleótidos 1675-2010 (335 nt) de SEQ ID NO: 1;

• 3'UTR sin la cola de poli-A: nucleótidos 1675-1983 de SEQ ID NO: 1 (310 nt);

• cola de poli-A: nucleótidos 1984-2010 de SEQ ID NO: 1; y señal de poliadenilación: nucleótidos 1962­ 1967 de SEQ ID NO: 1.

Debe indicarse que mientras que el primer nucleótido de la secuencia de NOCIVA única (nucleótido 1635 en SEQ ID NO: 1) no da como resultado un cambio del último aminoácido que precede al péptido de NOCIVA novedoso, es aún específico para el ARNm de NOCIVA.

También se incluyen polipéptidos y polinucleótidos de NOCIVA que tienen una identidad de secuencia de al menos el 80%, el 81%, el 82%, el 83%, el 84%, el 85%, el 86%, el 87%, el 88%, el 89%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o el 100% con las secuencias representadas en las SEQ ID NO:1-3, proporcionadas que retienen las propiedades funcionales de NOCIVA.

En vista de lo anterior, los polipéptidos y polipéptidos de NOCIVA abarcan variantes de secuencias conservadoras de las mismas. Junto con los polipéptidos, el término “variante de secuencia conservadora” se refiere a modificaciones de secuencias de aminoácidos, que surgen de sustituciones de aminoácidos con aminoácidos similares bien conocidos en la técnica (por ejemplo, aminoácidos de tamaño similar y con propiedades de carga similares) y que no alteran significativamente las propiedades biológicas del polipéptido en cuestión. También se contemplan deleciones y adiciones de aminoácidos. Junto con los polinucleótidos, el término “variante de secuencia conservadora” se refiere a modificaciones de secuencias de nucleótidos, que no alteran significativamente las propiedades biológicas del polipéptido codificado. Las variantes de secuencias conservadoras de nucleótidos incluyen variantes que surgen de la degeneración del código genético y de mutaciones silenciosas. También se contemplan sustituciones, deleciones y adiciones de nucleótidos.

Tal como se usa en el presente documento, el porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de identidad = n.° de posiciones idénticas/n.° total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias puede lograrse usando algoritmos matemáticos disponibles en la técnica. Esto se aplica a las secuencias tanto de aminoácido como de ácido nucleico.

En algunas realizaciones, el polipéptido de NOCIVA comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el polipéptido de NOCIVA comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 o una variante de secuencia conservadora de la misma. En algunas realizaciones, el polipéptido de NOCIVA puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% (o cualquier otro % de identidad de secuencia expuesto anteriormente) con SEQ ID NO: 2 fuera de la región formada por los aminoácidos 546-558. Dicho de otro modo, a pesar de la variación de secuencia, tales variantes de NOCIVA todavía comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 (correspondiente a los aminoácidos 546-558 de SEQ ID NO: 2). Tales variantes de NOCIVA deben retener las propiedades funcionales del polipéptido de NOCIVA. La determinación de si una determinada variante de NOCIVA ha retenido o no las propiedades funcionales del polipéptido de NOCIVA de SEQ ID NO: 2 puede llevarse a cabo mediante experimentación de rutina.

En algunas realizaciones, el polipéptido de NOCIVA comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el polipéptido de NOCIVA comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 o una variante de secuencia conservadora de la misma. En algunas realizaciones, el polipéptido de NOCIVA puede comprender una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% (o cualquier otro % de identidad de secuencia expuesto anteriormente) con SEQ ID NO: 2 fuera de la región formada por los aminoácidos 546-558. Dicho de otro modo, a pesar de la variación de secuencia, tales variantes de NOCIVA todavía comprenden la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3 (correspondiente a los aminoácidos 546-558 de SEQ ID NO: 2). Tales variantes de NOCIVA deben retener las propiedades funcionales del polipéptido de NOCIVA. La determinación de si una determinada variante de NOCIVA ha retenido o no las propiedades funcionales del polipéptido de NOCIVA de SEQ ID NO: 2 puede llevarse a cabo mediante experimentación de rutina.

NOCIVA se expresa sólo a un nivel muy bajo en tejidos humanos normales, pero se expresa en células de diversos cánceres, tales como carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), leucemia mielógena aguda (LMA) y leucemia mielógena crónica (LMC). Por tanto, NOCIVA es un biomarcador asociado al cáncer novedoso que puede utilizarse o bien a nivel de ARNm o a nivel de proteína. Aunque la presente divulgación se centra en algunos cánceres linfocíticos, concretamente LMA, LMC y leucemia promielógena aguda (LPA), NOCIVA puede utilizarse no sólo como marcador de cánceres hemáticos, tales como leucemias, sino también para cánceres sólidos así como, incluyendo, pero sin limitarse a carcinoma de células escamosas (SCC) tal como HNSCC, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de cuello uterino, esófago, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, y cáncer de páncreas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “cáncer hemático” se refiere a una neoplasia maligna que afecta a la sangre, la médula ósea o los ganglios linfáticos. Los cánceres hemáticos se denominan leucemia, linfoma y mieloma dependiendo del tipo de célula afectada. El linfoma es un grupo de leucemias que se desarrollan a partir de los linfocitos. El mieloma múltiple, también conocido como mieloma de células plasmáticas, es un cáncer de las células plasmáticas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “leucemia” se refiere a un cáncer que comienza en tejido hematopoyético, habitualmente la médula ósea, y afecta a los glóbulos blancos. La leucemia puede clasificarse por el tipo de glóbulo blanco afectado (mielógena o linfocítica). Los ejemplos no limitativos de leucemias incluyen leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC), leucemia promielógena aguda (LPA), y subgrupos de las mismas.

Tal como se usan en el presente documento, los términos “biomarcador” y “marcador” son intercambiables, y se refieren a una molécula que está presente de manera diferencial en una muestra tomada de un sujeto con cáncer en comparación con una muestra comparable tomada de un sujeto de control, tal como un sujeto aparentemente sano o un sujeto con el mismo cáncer, pero que tiene un pronóstico diferente de la enfermedad.

La medición de NOCIVA en muestras de pacientes proporciona información que puede correlacionarse con una presencia, ausencia o pronóstico probable de un cáncer sospechado o un subtipo del mismo. La medición de NOCIVA puede realizarse antes de, simultáneamente o tras el ensayo de otros marcadores relevantes para el cáncer sospechado o un subtipo del mismo. Esto también significa incluir casos en los que la presencia, ausencia o pronóstico de cáncer, o un subtipo del mismo, no se determina finalmente, pero se justifican pruebas de diagnóstico adicionales. En tales realizaciones, el método no es por sí mismo determinante de la presencia, ausencia o pronóstico de cáncer, o un subtipo del mismo, pero puede indicar que son necesarias o podrían ser beneficiosas pruebas de diagnóstico adicionales. Por tanto, NOCIVA puede usarse en combinación con uno o más de otros métodos o marcadores de diagnóstico para la determinación final de la presencia, ausencia o pronóstico de dicho cáncer, o un subtipo del mismo. Tales otros métodos y marcadores de diagnóstico son bien conocidos por un experto en la técnica. Con respecto a la LMA, tales otros marcadores incluyen, pero no se limitan a, WT1, EVI1 y SET.

Por consiguiente, NOCIVA puede usarse no sólo para fines de diagnóstico sino también, por ejemplo, para el pronóstico, predicción, agrupación o estratificación de pacientes, monitorización de la progresión del cáncer a lo largo del tiempo, monitorización de cualquier posible remisión, recidiva o recaída del cáncer, selección de terapias y monitorización del tratamiento.

Tal como se usa en el presente documento, el término “pronóstico” se refiere a un curso o evolución clínica probables de una enfermedad, mientras que la expresión “pronosticar” se refiere a una predicción del curso futuro de la enfermedad.

Tal como se usa en el presente documento, el término “buen pronóstico” se refiere a un curso favorable probable de la enfermedad durante un determinado periodo de tiempo. “Supervivencia global prolongada”, “supervivencia prolongada libre de enfermedad”, “supervivencia prolongada libre de recidiva” y “supervivencia prolongada libre de progresión”, cuando se comparan con la mediana del desenlace de la enfermedad, por ejemplo, son ejemplos no limitativos de buen pronóstico. Dependiendo del cáncer hemático y la realización en cuestión, buen pronóstico puede referirse a, por ejemplo, una posibilidad de al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% de sobrevivir más de 1 año, más de 2 años, más de 3 años, más de 4 años o más de 5 años después del diagnóstico.

Tal como se usa en el presente documento, el término “mal pronóstico” se refiere a un curso desfavorable probable de la enfermedad durante un determinado periodo de tiempo. “Supervivencia global reducida”, “supervivencia reducida libre de enfermedad”, “supervivencia reducida libre de recidiva” y “supervivencia reducida libre de progresión”, cuando se comparan con la mediana del desenlace de la enfermedad, por ejemplo, son ejemplos no limitativos de mal pronóstico. Dependiendo del cáncer hemático y la realización en cuestión, mal pronóstico puede referirse a, por ejemplo, una verosimilitud de menos del 60%, menos del 50%, menos del 40%, menos del 30%, menos del 20% o menos del 10% de sobrevivir más de 1 año, más de 2 años, más de 3 años, más de 4 años o más de 5 años después del diagnóstico.

La verosimilitud de un determinado desenlace clínico de una enfermedad, tal como la verosimilitud de un mal pronóstico en un sujeto al que se le ha diagnosticado un cáncer hemático, puede expresarse como probabilidad, tal como un “cociente de riesgos instantáneos” (HR), término que se refiere a la razón de un riesgo instantáneo en dos grupos experimentales a lo largo del periodo de tiempo del estudio. Representa una estimación puntual en cualquier punto de tiempo dado.

Por tanto, con respecto al mal pronóstico, por ejemplo, si la estimación de riesgo de HR para un nivel de biomarcador particular es mayor de uno, esto indica que un sujeto con este nivel de biomarcador particular tiene un mayor riesgo de mal pronóstico que un sujeto sin el nivel de biomarcador particular. Por el contrario, si la estimación de riesgo de HR para un nivel de biomarcador particular es menor de uno, esto indica que un sujeto con este nivel de biomarcador particular tiene un riesgo reducido de mal pronóstico en comparación con un sujeto sin el nivel de biomarcador particular.

Tal como se usa en el presente documento, el término “intervalo de confianza del 95%” (IC del 95%) se refiere a un intervalo estimado de valores que uno puede estar seguro en un 95% que contiene la verdadera media de la población, calculándose el intervalo estimado a partir de un conjunto dado de datos de muestra. Generalmente, el IC del 95% se usa para estimar la precisión del HR. Un IC amplio indica un bajo nivel de precisión de1HR, mientras que un IC estrecho indica una mayor precisión del HR.

El análisis multivariante (modelo de riesgo proporcional de Cox) descrito en el presente documento reveló asociaciones estadísticamente significativas entre los niveles de expresión de NOCIVA y los desenlaces clínicos, de tal manera que los pacientes con una mayor carga de NOCIVA tuvieron tiempos de supervivencia global más bajos (p=0,0205, HR: 1,511; figura 4D) que los pacientes con menor carga de NOCIVA. Curiosamente, no se observó tal asociación con CIP2A. De hecho, la estimación del riesgo de HR para la supervivencia global cuando se usó CIP2A como nivel de biomarcador fue inferior a uno (p=0,0775, HR: 0,173; figura 4D), lo que indica un riesgo reducido de mala supervivencia global para pacientes con una carga de CIP2A mayor que los pacientes con menor carga de CIP2A.

Las determinaciones de NOCIVA pueden proporcionar una ayuda sustancial en la toma de decisiones clínicas para elegir los procedimientos de tratamiento apropiados, especialmente porque la expresión del ARNm de NOCIVA no parece depender de la clasificación del grupo de riesgo de LMA descrita, por ejemplo, en “Diagnosis and management of AML in adults: 2017 ELN recommendations from an international expert panel” de Hartmut Dohner y otros. Por ejemplo, la expresión aumentada de NOCIVA en un sujeto que tiene LMA indica una mala supervivencia global y que podría ser beneficioso dirigir tales sujetos a un trasplante inmediato de células madre, que es una modalidad de tratamiento bien conocida en la técnica. Por otro lado, sería suficiente tratar a los pacientes con LMA sin expresión aumentada de NOCIVA sólo con quimioterapia. Por tanto, NOCIVA puede usarse para estratificar sujetos en grupos de mal pronóstico o buen pronóstico, así como estratificar sujetos para diferentes modalidades de tratamiento.

Según lo anterior, la presente invención proporciona un método para asignar un tratamiento a un sujeto al que se le ha diagnosticado LMA, comprendiendo el método las etapas de: poner en contacto una muestra biológica obtenida del sujeto con un reactivo (tal como un cuerpo de unión proporcionado en el presente documento) que se une específicamente al presente polipéptido o polinucleótido de NOCIVA; determinar si la expresión de dicho polipéptido o dicho polinucleótido está aumentada o no en dicha muestra comparando dicha expresión con un control relevante; y asignar un régimen de tratamiento que comprende, por ejemplo, terapia con células madre, si dicha expresión está aumentada.

La presente invención proporciona ventajas no sólo para el cuidado de pacientes individuales, sino también para una mejor selección y estratificación de pacientes para ensayos clínicos. Por ejemplo, pacientes con cáncer agrupados en función de sus niveles de expresión de NOCIVA podrían emplearse en estudios clínicos con el objetivo de desarrollar nuevas herramientas terapéuticas personalizadas eficaces tales como nuevos fármacos o procedimientos médicos.

Según lo anterior, el análisis y la predicción de una respuesta al tratamiento pueden llevarse a cabo en cualquiera de las siguientes cohortes: una cohorte que responde favorablemente a un régimen de tratamiento, una cohorte que no responde favorablemente a un régimen de tratamiento, una cohorte que responde significativamente a un régimen de tratamiento, una cohorte que no responde significativamente a un régimen de tratamiento, y una cohorte que responde de manera adversa a un régimen de tratamiento (por ejemplo, presenta uno o más efectos secundarios). Estas cohortes se proporcionan sólo como ejemplos, y puede analizarse cualquier otra cohorte o subcohorte. Por tanto, puede determinarse el nivel de expresión de NOCIVA en un sujeto para predecir si responderá favorable o significativamente a un régimen de tratamiento, no responderá favorable o significativamente a un régimen de tratamiento, o responderá de manera adversa a un régimen de tratamiento. Si es probable que un sujeto responda positivamente a un tratamiento contra el cáncer, puede tratarse dicho sujeto debidamente. Por otro lado, si es probable que un sujeto responda negativamente (es decir, no presente efectos positivos o presente efectos secundarios adversos) a un tratamiento contra el cáncer, puede aplicarse un curso alternativo de tratamiento.

Por consiguiente, la presente invención proporciona diversos métodos o ensayos para los propósitos expuestos anteriormente. Estos métodos o ensayos implican la determinación del nivel de expresión de NOCIVA en una muestra obtenida de un sujeto en cuestión. Tal como se usa en el presente documento, el término “determinar un nivel de expresión de NOCIVA”, y cualquier expresión correspondiente, se refiere a cuantificar o semicuantificar NOCIVA en función de la cantidad de ARNm, ADNc o proteína. El término “nivel” es intercambiable con los términos “cantidad” y “concentración”, y puede referirse a una cantidad absoluta o relativa. Determinar la expresión de NOCIVA también puede incluir determinar la ausencia o presencia de NOCIVA de manera cualitativa.

En algunas realizaciones, el nivel de expresión relativo de NOCIVA puede basarse en la razón relativa de expresión de NOCIVA con respecto a la expresión de una forma de CIP2A previamente conocida, es decir, CIP2A con exones 1-21. El nivel de expresión de CIP2A puede determinarse, por ejemplo, en función del nivel de expresión del exón 13 (CIP2Ae13), el exón 16 (CIP2Ae16) o el exón 20 (es decir, CIP2Ae20). Preferiblemente, la razón de expresión relativa de NOCIVA con respecto a CIP2A se basa en determinar los niveles de expresión de NOCIVA y CIP2A en las mismas células. En algunas realizaciones, CIP2Ae13 se determina usando un cebador en 5' que se hibrida al exón 13 y un cebador en 3' que se hibrida al exón 14; CIP2Ae16 se determina usando un cebador en 5' que se hibrida al exón 16 y un cebador en 3' que se hibrida al exón 17; mientras que CIP2Ae20 se determina usando un cebador en 5' que se hibrida al exón 20 y un cebador en 3' que se hibrida al exón 21.

En algunas realizaciones adicionales, el nivel de expresión de NOCIVA puede determinarse como razón relativa entre el nivel de expresión de NOCIVA y el de un gen de mantenimiento apropiado, en las mismas células. Los ejemplos no limitativos de genes de mantenimiento adecuados incluyen GAPDH (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa), ACTB (actina, beta), RRN18S (ARN ribosómico 18S), PGK1 (fosfoglicerato cinasa 1), PPIA (peptidil prolil isomerasa A (ciclofilina A)), RPL13A (proteína ribosómica L13a), RPLP0 (proteína ribosómica, grande, P0), B2M (beta-2-microglobulina), YWHAZ (proteína de activación de la tirosina 3-monooxigenasa/triptófano 5-monooxigenasa, polipéptido zeta), SDHA (succinato deshidrogenasa), TFRC (receptor de transferrina (p90, CD71)), ALAS1 (delta-aminolevulinato, sintasa 1), GUSB (glucuronidasa, beta), HMBS (hidroximetilbilano sintasa), HPRT1 (hipoxantina fosforibosiltransferasa 1), TBP (proteína de unión a la caja TATA), y TUBB (tubulina, polipéptido beta). En algunas realizaciones, los genes de mantenimiento preferidos incluyen GAPDH y AC^t B.

Para determinar si un nivel de expresión de NOCIVA detectado es indicativo de un cáncer o un pronóstico del mismo, debe compararse con un control relevante. Una vez que se conoce el nivel de control, el nivel de NOCIVA determinado o detectado puede compararse con el mismo y la significación de la diferencia puede evaluarse usando métodos estadísticos convencionales. En algunas realizaciones, una diferencia estadísticamente significativa entre el nivel de NOCIVA determinado y el nivel de control es indicativa de la presencia de cáncer o un subgrupo del mismo (por ejemplo, un subgrupo en función del pronóstico o respuesta esperada al tratamiento). En algunas realizaciones adicionales, antes de compararse con el control, los niveles de NOCIVA se normalizan usando métodos convencionales.

Tal como se usa en el presente documento, el término “control” puede referirse a muchos tipos diferentes de controles. Por ejemplo, “control negativo” o “control normal” significa el nivel de control de NOCIVA, solo o en comparación con otro marcador o control, determinado a partir de un tejido no canceroso del mismo sujeto, o de una muestra obtenida de un individuo aparentemente sano o un conjunto de individuos aparentemente sanos. “Control positivo” puede significar, por ejemplo, tejido canceroso del mismo sujeto, o una muestra obtenida de un individuo al que se le ha diagnosticado el cáncer de interés, o un conjunto de individuos a los que se les ha diagnosticado previamente cáncer. Un valor umbral predeterminado que es indicativo de la presencia, ausencia o pronóstico de un cáncer en cuestión o un subgrupo del mismo también puede emplearse como control, es decir, “control de umbral”. Por consiguiente, el valor umbral puede ser un valor de control negativo obtenido de un conjunto de individuos aparentemente sanos, en el que el valor se refiere a los niveles de expresión de NOCIVA en células normales no cancerosas; o puede ser un valor de control positivo, obtenido de un conjunto de individuos con cáncer, en el que el valor se refiere a un nivel de expresión de NOCIVA en tejidos cancerosos.

“Control interno” puede referirse a un nivel de expresión de CIP2A y/o un nivel de expresión de uno o más genes de mantenimiento apropiados determinados a partir de las mismas células que el nivel de expresión de NOCIVA. Dicho de otro modo, el control interno puede significar un control de carga que permite cuantificar NOCIVA en la muestra que se está analizando. Los ejemplos de un control interno, dicho de otro modo, “control de carga” o “control de cuantificación” incluyen genes de mantenimiento y proteínas de mantenimiento. La cantidad de NOCIVA también puede medirse en relación con un “biomarcador de control” tal como otra forma de CIP2A. “Razón de control” significa la relación de NOCIVA con cualquier control seleccionado, por ejemplo, la razón entre NOCIVA y otra forma de CIP2A.

En algunas realizaciones preferidas, se emplea otra forma de CIP2A, tal como CIP2Ae20, como control para que el nivel de expresión de NOCIVA determinado se compare con el nivel de expresión de CIP2Ae20 determinado para obtener una razón de expresión de NOCIVA con respecto a la expresión de CIP2Ae20. A continuación, dicha razón obtenida se compara con dicho umbral predeterminado para deducir el estado del cáncer del paciente.

Los métodos estadísticos para determinar los valores umbral o de control apropiados serán fácilmente evidentes para los expertos habituales en la técnica. Los valores umbral o de control pueden haberse determinado, si es necesario, a partir de muestras de sujetos del mismo grupo de edad, características demográficas y/o estado de enfermedad, etc. El control negativo o valor umbral puede provenir de un sólo individuo no afectado por un cáncer en cuestión o un subtipo del mismo, o ser un valor combinado de más de uno de tales individuos.

Tal como se usa en el presente documento, el término “aparentemente sano” se refiere a un individuo o conjunto de individuos que no muestran signos de un cáncer o su subtipo en cuestión y, por tanto, se cree que no están afectados por dicho cáncer o su subtipo en cuestión y/o que se prevé que no desarrollarán dicho cáncer o su subtipo en cuestión.

Tal como se usa en el presente documento, el término “sujeto” se refiere a un animal, preferiblemente a un mamífero, más preferiblemente a un ser humano. El término incluye, pero no se limita a, animales mamíferos tales como animales domésticos tales como ganado, mascotas y animales para actividades deportivas. Los ejemplos de tales animales incluyen, sin limitación, carnívoros tales como gatos y perros y ungulados tales como caballos. Por tanto, la presente invención puede aplicarse tanto en medicina humana como veterinaria. En el presente documento, los términos “sujeto”, “paciente” e “individuo” son intercambiables.

Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra” se refiere a una muestra biológica o clínica obtenida de un sujeto cuyo nivel de expresión de NOCIVA va a determinarse. Normalmente, la muestra es una muestra de un tejido canceroso o un tejido sospechoso de ser canceroso. En el caso de cánceres hemáticos, tales como las leucemias, la muestra puede ser una muestra de sangre o una muestra de médula ósea obtenida, por ejemplo, por una biopsia o aspiración. La muestra también puede ser una muestra de tejido incrustada en parafina. Los ejemplos de muestras de sangre incluyen muestras de sangre completa, muestras de suero, muestras de plasma, muestras de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fraccionadas o no fraccionadas o muestras de otros tipos de glóbulos sanguíneos purificados.

El término “muestra” también incluye las muestras que han sido manipuladas o tratadas de manera adecuada después de su obtención, incluyendo, pero sin limitarse a, centrifugación, filtración, precipitación, diálisis, cromatografía, tratamiento con reactivos, lavado o enriquecimiento de un determinado componente de la muestra tal como una población celular.

Tal como se usa en el presente documento, el término “expresión aumentada” se refiere a un aumento en la cantidad de un biomarcador en una muestra en comparación con un control relevante. Dicho aumento puede determinarse cualitativa y/o cuantitativamente según métodos convencionales conocidos en la técnica. La expresión está aumentada si la cantidad o el nivel del biomarcador en la muestra es, por ejemplo, al menos aproximadamente 1,5 veces, 1,75 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 8 veces, 9 veces, tiempo veces, 10 veces, 20 veces o 30 veces el valor de control o la cantidad del mismo biomarcador (NOCIVA) o un biomarcador de control (por ejemplo, CIP2A o un gen de mantenimiento) en la muestra de control. En algunas realizaciones, el término “expresión aumentada” se refiere a un aumento estadísticamente significativo en el nivel o la cantidad del biomarcador en comparación con el de un control relevante, preferiblemente negativo. La expresión aumentada en comparación con un control negativo indica que el sujeto tiene o tiene un riesgo aumentado de tener un mal pronóstico.

Tal como se usa en el presente documento, el término “expresión no aumentada” se refiere a un nivel de expresión de un biomarcador que es esencialmente el mismo tanto en una muestra que va a analizarse como en un control relevante. La expresión no aumentada en comparación con un control negativo indica que el sujeto no tiene o no está en riesgo de tener un mal pronóstico.

Tal como se usa en el presente documento, el término “expresión disminuida” se refiere a una disminución en la cantidad de un biomarcador en una muestra en comparación con un control relevante. Dicha disminución puede determinarse cualitativa y/o cuantitativamente según métodos convencionales conocidos en la técnica. La expresión está disminuida si la cantidad o el nivel del biomarcador en la muestra es, por ejemplo, al menos aproximadamente 1,5 veces, 1,75 veces, 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 8 veces, 9 veces, tiempo veces, 10 veces, 20 veces o 30 veces menor que el valor de control o la cantidad del mismo biomarcador o un biomarcador de control (por ejemplo, CIP2A o un gen de mantenimiento) en la muestra de control. En algunas realizaciones, el término “expresión disminuida” se refiere a una disminución estadísticamente significativa en el nivel o la cantidad del biomarcador en comparación con la de un control relevante. La expresión disminuida en comparación con un control positivo puede indicar que el sujeto no tiene o no está en riesgo de tener un mal pronóstico.

Determinar el nivel de expresión de NOCIVA en una muestra obtenida de un sujeto que va a ser diagnosticado de cáncer, al que se le ha pronosticado cáncer, monitorizado para determinar la progresión del cáncer, monitorizado para determinar cualquier posible remisión, recidiva o recaída del cáncer, sometido a selección de terapia, monitorizado para determinar la respuesta al tratamiento, o agrupado o estratificado para cualquier fin relevante relacionado con el cáncer puede determinarse por cualquier medio disponible o futuro adecuado para este fin. Dicha determinación puede ejecutarse a diferentes niveles moleculares, preferiblemente a nivel de ARNm, ADNc o proteína tal como se conoce bien en la técnica. La presente invención no se limita a ninguna técnica de determinación. Por tanto, en diferentes realizaciones, pueden usarse diferentes medios o combinaciones de los mismos para analizar una muestra biológica o clínica para la expresión de NOCIVA.

En un aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-NOCIVA que reconoce específicamente NOCIVA pero no reconoce ninguna otra forma de CIP2A, es decir, el polipéptido de CIP2A codificado por un ARNm de CIP2A que comprende exones que superan el exón 13. Por consiguiente, los epítopos preferidos para los presentes anticuerpos anti-NOCIVA incluyen polipéptidos que contienen de 5 a 20 aminoácidos consecutivos de una secuencia correspondiente o solapada con una secuencia formada por los aminoácidos 546-558 de SEQ ID NO: 2.

El anticuerpo proporcionado puede ser, por ejemplo, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo recombinante, un anticuerpo de cadena sencilla o un fragmento de anticuerpo funcional, tal como Fab, Fab', F(ab')2 o Fv, todos los cuales se abarcan en el término “anticuerpo”.

Los anticuerpos anti-NOCIVA según la invención pueden obtenerse mediante una variedad de técnicas o cualquier combinación apropiada de las mismas. Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse mediante métodos de inmunización tradicionales, injertos de CDR, expresión de proteínas in vitro, expresión de proteínas libres de células, traducción libre de células o síntesis de proteínas libres de células, u obtenidas de una biblioteca de expresión recombinante, por ejemplo, empleando una estrategia basada en la presentación en fago. Los fragmentos de anticuerpos funcionales y los anticuerpos de cadena sencilla pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante separación enzimática o química de inmunoglobulinas intactas, tal como se conoce bien en la técnica.

En algunas realizaciones, el presente anticuerpo anti-NOCIVA puede conjugarse o unirse de otro modo con, o producirse como una fusión con, una o más etiquetas de péptidos o proteínas pequeñas que facilitan la purificación, el aislamiento, la inmovilización y/o la detección. Los ejemplos no limitativos de etiquetas de afinidad adecuadas para fines de purificación o inmovilización incluyen etiquetas de polihistidina (etiquetas His), etiquetas de hemaglutinina (etiquetas HA), etiquetas de glutatión-S-transferasa (etiquetas GST) y etiquetas de biotina. Las etiquetas de detección adecuadas incluyen proteínas fluorescentes, tales como GFP, y etiquetas enzimáticas que generarán un producto coloreado al entrar en contacto con un sustrato cromogénico. Los ejemplos no limitativos de etiquetas enzimáticas adecuadas incluyen fosfatasa alcalina (AP) y peroxidasa de hidrógeno (rábano) (HRP). También pueden emplearse otras etiquetas tales como biotina, avidina y estreptavidina con fines de detección. Pueden detectarse con una proteína de unión a biotina/avidina/estreptavidina que se conjuga con una enzima, un fluoróforo u otra molécula indicadora. Los medios y métodos para producir tales anticuerpos anti­ NOCIVA detectables y/o inmovilizables están fácilmente disponibles en la técnica.

Los presentes anticuerpos anti-NOCIVA pueden usarse para detectar la expresión de NOCIVA a nivel de proteína para cualquier fin establecido anteriormente. Esto puede lograrse empleando cualquier técnica adecuada disponible en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, los métodos y ensayos descritos a continuación. Dado que NOCIVA es una proteína intracelular, dichos métodos y ensayos pueden comprender lisar o romper células, permeabilizar membranas celulares o aislar proteínas según medios y métodos bien conocidos en la técnica.

Generalmente, determinar el nivel de expresión de NOCIVA a nivel de proteína comprende poner en contacto una muestra obtenida de un sujeto que necesita dicha determinación con un cuerpo de unión, tal como un anticuerpo, que reconoce específicamente el polipéptido de NOCIVA en condiciones en las que el cuerpo de unión interactúa específicamente con NOCIVA, pero no con CIP2A de longitud completa cuya secuencia de aminoácidos se establece en SEQ ID NO: 4; y detectar dicha interacción (si la hay); donde la presencia o grado de dicha interacción se correlaciona con la presencia de NOCIVA o el nivel de expresión de NOCIVA en dicha muestra. Los cuerpos de unión alternativos a los anticuerpos y fragmentos de los mismos adecuados para determinar la expresión de NOCIVA a nivel de proteína incluyen, pero no se limitan a, aptámeros de oligonucleótidos o péptidos, receptores y proteínas que interactúan biológicamente.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, la presente invención proporciona un inmunoensayo para detectar y analizar la expresión de NOCIVA en una muestra biológica o clínica, en el que el inmunoensayo comprende: proporcionar un anticuerpo que se une específicamente a NOCIVA; poner en contacto una muestra, que comprende preferiblemente células permeabilizadas o rotas, con el anticuerpo; y detectar la presencia de un complejo del anticuerpo unido a NOCIVA en la muestra. Si se desea, el anticuerpo puede fijarse a un soporte sólido para facilitar el lavado y posterior detección del complejo, antes de poner en contacto el anticuerpo con una muestra. Después de incubar la muestra con un anticuerpo anti-NOCIVA, la mezcla puede lavarse y detectarse el complejo anticuerpo-NOCIVA formado. Esto puede lograrse, por ejemplo, usando un anticuerpo detectable, es decir, un anticuerpo marcado de manera detectable, o un anticuerpo marcado con una enzima e incubando el complejo con un reactivo de detección, es decir, un sustrato de la enzima. Alternativamente, NOCIVA puede detectarse usando un ensayo indirecto, en el que, por ejemplo, se usa un segundo anticuerpo marcado para detectar el complejo anticuerpo-NOCIVA formado.

En algunas realizaciones, el nivel de expresión de NOCIVA puede determinarse usando un formato de ensayo no competitivo. Los inmunoensayos no competitivos, también conocidos como ensayos con exceso de reactivo, ensayos tipo sándwich, ensayos inmunométricos o ensayos de dos sitios, implican generalmente el uso de dos anticuerpos que seleccionan como diana diferentes epítopos en el antígeno, un anticuerpo para la captura del antígeno y el otro marcado para detección. Preferiblemente, el primer anticuerpo es el presente anticuerpo anti­ NOCIVA, mientras que el segundo anticuerpo es uno que selecciona como diana un epítopo dentro de una secuencia formada por los aminoácidos 1-545 de SEQ ID NO: 2. Un segundo anticuerpo de este tipo se une específicamente tanto a CIP2A como a NOCIVA. En algunas realizaciones, el primer anticuerpo se emplea como anticuerpo de captura, mientras que el segundo anticuerpo se emplea como anticuerpo de detección. En algunas otras realizaciones, el primer anticuerpo se emplea como anticuerpo de detección, mientras que el segundo anticuerpo se emplea como anticuerpo de captura. Un experto en la técnica podrá establecer un ensayo de unión para medir la presencia, ausencia o nivel de NOCIVA solo o en relación con otra forma de CIP2A o cualquier otro control. Por consiguiente, la formación del complejo anticuerpo-NOCIVA puede determinarse usando cualquiera de varios ensayos de unión inmunitarios no competitivos bien reconocidos. Los ensayos útiles incluyen, por ejemplo, inmunoensayos enzimáticos (EIA) tales como ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA); ensayos de inmunoadsorción fluorescentes (FIA) tales como ensayos inmunofluorométricos a tiempo resuelto (TR-IFMA); inmunoensayos de quimioluminiscencia (CLIA) y radioinmunoensayos (RIA).

Dependiendo del tipo de ensayo empleado, o bien el primer anticuerpo o bien el segundo anticuerpo, o ambos, pueden conjugarse o asociarse de otro modo con un marcador detectable seleccionado del grupo que incluye, pero no se limita a, agentes ópticos tales como marcadores fluorescentes que incluyen una variedad de moléculas pequeñas orgánicas y/o inorgánicas y una variedad de proteínas fluorescentes y derivados de las mismas, marcadores fosforescentes, marcadores quimioluminiscentes y marcadores cromogénicos; marcadores radiactivos tales como los radionúclidos que emiten rayos gamma, positrones, partículas beta o alfa o rayos X, y enzimas tales como la fosfatasa alcalina (AP) y la peroxidasa de hidrógeno (rábano) (HRP). Dicha asociación puede ser directa, por ejemplo, a través de un enlace covalente, o indirecta, por ejemplo, a través de un agente de unión secundario, un quelante o un ligador. Las técnicas para conjugar con o asociar de otro modo agentes detectables a anticuerpos son bien conocidas y los kits de marcado de anticuerpos están disponibles comercialmente de docenas de fuentes. Uno o ambos anticuerpos también pueden expresarse como proteínas de fusión con un marcador detectable o un marcador de detección mediante técnicas recombinantes.

En algunas realizaciones de inmunoensayos no competitivos, el anticuerpo de detección se marca de manera detectable. En algunas otras realizaciones, el anticuerpo de detección es reconocido por un anticuerpo adicional que comprende un marcador detectable. En todavía algunas otras realizaciones, el anticuerpo de detección comprende una etiqueta que es reconocible por un anticuerpo adicional que comprende un marcador detectable.

En todavía algunas realizaciones adicionales, el anticuerpo de detección y dichos anticuerpos adicionales se marcan con el mismo marcador, por ejemplo, para mejorar la sensibilidad. En algunas otras realizaciones, el anticuerpo de detección y dichos anticuerpos adicionales se marcan con marcadores diferentes.

Los inmunoensayos según la presente invención incluyen inmunoensayos en fase sólida, tales como ensayos de flujo lateral y ensayos de tipo sándwich convencionales llevados a cabo sobre una superficie sólida tal como vidrio, plástico, cerámica, metal o un material fibroso o poroso tal como papel, en forma de, por ejemplo, una placa de microtitulación, un bastoncillo, una tarjeta, un alineamiento, un sensor, una perla o una microperla. Dicho inmunoensayo en fase sólida puede ser o bien heterogéneo o bien homogéneo. En los ensayos heterogéneos, cualquier antígeno o anticuerpo libre se separa físicamente de los inmunocomplejos formados, por ejemplo, mediante lavados, mientras que tal separación no es necesaria en ensayos homogéneos que incluyen las muchas formas de biosensores.

Los presentes inmunoensayos homogéneos no se limitan a formatos de ensayo en fase sólida, sino que también abarcan inmunoensayos homogéneos llevados a cabo en disolución. Tales inmunoensayos en disolución son particularmente ventajosos porque no se requieren etapas de inmovilización ni de lavado, lo que los hace simples y fáciles de realizar. Por tanto, en algunas realizaciones, el inmunoensayo es un inmunoensayo homogéneo de base líquida.

Cualquiera de los inmunoensayos mencionados anteriormente puede usarse en combinación con un inmunoensayo adicional para determinar el nivel de expresión de otra forma de CIP2A en la misma muestra. En tales realizaciones, el nivel de expresión de NOCIVA determinado se compara con el nivel de expresión de CIP2A determinado para obtener una razón de expresión de NOCIVA con respecto a expresión de CIP2A. La determinación de dicha razón puede usarse para cualquier fin establecido anteriormente. En algunas realizaciones, la razón aumentada de NOCIVA con respecto a CIP2A en comparación con la de un control relevante es indicativa de un mal pronóstico.

Los anticuerpos adecuados para el fin mencionado anteriormente incluyen aquellos que reconocen específicamente a CIP2A pero no reconocen específicamente a NOCIVA. El epítopo de tales anticuerpos reside de manera C-terminal con respecto al exón 13. Dicho de otro modo, el epítopo reside entre los aminoácidos 546 y 905 de SEQ ID NO: 4. Cuando va a determinarse el nivel de expresión de CIP2A mediante un inmunoensayo no competitivo, un segundo anticuerpo que va a emplearse puede ser uno que seleccione como diana la región de aminoácidos 1-545 de SEQ ID NO: 4 (correspondiente a la región de aminoácidos 1-545 de NOCIVA, SEQ ID NO: 2). Un segundo anticuerpo de este tipo se une específicamente tanto a CIP2A como a NOCIVA.

Los ejemplos adicionales de métodos adecuados para determinar el nivel de expresión de NOCIVA a nivel de proteína incluyen ensayos de inmunotransferencia de tipo Western convencionales, ensayos de transferencia puntual y formatos de ensayo basados en inmunohistoquímica. Además, por ejemplo, la citometría de flujo, tal como la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), puede usarse para detectar complejos anticuerpo-NOCIVA. Además, las técnicas adecuadas para determinar el nivel de expresión de NOCIVA a nivel de proteína incluyen métodos de detección basados en EM, tales como la monitorización de reacción seleccionada (SRM), SWATH y citometría de masas de muestras de células cancerosas basadas en el péptido único. También en tales realizaciones, el método puede incluir comparar el nivel de expresión de NOCIVA con el de CIP2A.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona cuerpos de unión a ácidos nucleicos para su uso en la determinación de la expresión de NOCIVA a nivel de ácido nucleico, por ejemplo, mediante los métodos dados a conocer en el presente documento. Tales cuerpos de unión incluyen sondas específicas para ARNm o ADNc de NOCIVA, así como cebadores para la amplificación específica de NOCIVA.

Las regiones especialmente adecuadas para determinar la expresión de NOCIVA a nivel de ácido nucleico incluyen la secuencia específica de NOCIVA sin la cola de poli-A (nucleótidos 1635-1983 de SEQ ID NO: 1); la secuencia que codifica el péptido de NOCIVA novedoso (nucleótidos 1636-1674 de SEQ ID NO: 1); y la 3'U^t R sin la cola de poli-A (nucleótidos 1675-1983 de SEQ ID ⁿ O: 1).

Una realización preferida para determinar la presencia/ausencia y/o cantidad de ARNm de NOCIVA comprende las etapas de:

a) proporcionar una muestra biológica obtenida de un sujeto y sospechosa de contener ARNm de NOCIVA; b) opcionalmente realizar transcripción inversa del ARNm en ADNc usando, por ejemplo, cebadores aleatorios o poli-T o cebadores específicos de secuencia;

c) amplificar opcionalmente el ADN específico de NOCIVA en dicha muestra, si lo hay; y

d) detectar la secuencia específica de NOCIVA, tal como ARNm, ADNc o ADN amplificado con cualquier método seleccionado adecuado para dicha tarea,

en la que las etapas c) y d) pueden realizarse o bien por separado o bien simultáneamente.

Debido a la secuencia del ARNm de NOCIVA, que es en su mayor parte única en comparación con otros ARNm humanos, en el presente método pueden emplearse muchos diseños alternativos de oligonucleótidos. Un experto en la técnica puede diseñar fácilmente ensayos que sean específicos para NOCIVA o, por ejemplo, que pueden separar y/o cuantificar NOCIVA y alguna otra forma de CIP2A.

Los métodos aplicables que emplean tales oligonucleótidos, particularmente sondas, incluyen microalineamientos, que son una colección de ácido nucleico, por ejemplo, manchas de ADN adheridas a una superficie sólida. Cada mancha de ADN contiene un oligonucleótido de una secuencia de ADN específica, conocida como sonda o sonda de captura. Estos pueden consistir en una sección corta de un gen u otro oligonucleótido, tal como un elemento de ADN o LNA, que se usan para hibridar ADNc, ARNm o ARNc diana (también denominado ARN antisentido) en una muestra en condiciones de alta rigurosidad. La hibridación de sonda-diana puede detectarse y/o cuantificarse, por ejemplo, mediante la detección de ácidos nucleicos diana marcados con fluoróforo, plata o quimioluminiscencia para determinar su abundancia relativa en la muestra. En algunos tipos de alineamiento, puede incorporarse un elemento de reconocimiento (transductor) que puede convertir una interacción de ácido nucleico diana-sonda unida a la superficie en una señal cuantificable. Entre los varios tipos diferentes de transductores disponibles, especialmente aquellos basados en detección electroquímica u óptica son populares en la técnica. De manera similar a otros métodos de análisis de ácidos nucleicos, ambos tipos de sensores pueden ejecutarse sin marcadores o con marcadores y también pueden dividirse en formatos de ensayo heterogéneos y homogéneos según los requisitos de lavado.

Una aplicación adecuada es la tecnología nCounter de NanoString, que es una variación del microalineamiento de ADN. Usa “códigos de barras” moleculares e imágenes microscópicas para detectar y contar hasta varios cientos de transcriptos únicos en una reacción de hibridación. Cada código de barras codificado por colores se adjunta a una única sonda específica de diana correspondiente a un gen de interés. En algunas realizaciones, el uso de una tecnología basada en alineamientos, tal como NanoString, es beneficioso para detectar la expresión de NOCIVA. Cualquier polinucleótido u oligonucleótido descrito en el presente documento como sonda puede usarse en otras realizaciones como cebadores, y viceversa. Más generalmente, la presente invención proporciona polinucleótidos u oligonucleótidos que pueden hibridarse con el polinucleótido de NOCIVA, es decir, polinucleótidos u oligonucleótidos que son complementarios al ARNm o ADNc de NOCIVA. Los presentes cuerpos de unión específica a NOCIVA pueden diseñarse tal como se conoce bien en la técnica y tal como se ejemplifica en la figura 6 y la tabla 2. Los ejemplos no limitativos de sondas adecuadas para detectar NOCIVA incluyen sondas que comprenden o consisten en una secuencia expuesta en las SEQ ID NO: 26-44.

Los presentes oligonucleótidos específicos de NOCIVA pueden generarse según cualquier método de síntesis de oligonucleótidos conocido en la técnica, tal como la síntesis enzimática o la síntesis en fase sólida. El equipo y los reactivos para ejecutar la síntesis en fase sólida están disponibles comercialmente, por ejemplo, en Applied Biosystems. También puede emplearse cualquier otro medio para tal síntesis; la síntesis real de los oligonucleótidos está dentro de las capacidades de un experto en la técnica y puede lograrse a través de metodologías establecidas.

La presente invención también se refiere a secuencias complementarias de los cuerpos de unión a ácidos nucleicos o las secuencias de ácidos nucleicos diana dadas a conocer en el presente documento. El término “complementario” se conoce bien en la técnica y significa apareamiento de bases de Watson-Crick en el que la nucleobase adenina (A) en una secuencia de motivo diana está representada por la nucleobase timina (T) en una unidad de unión correspondiente, o viceversa. Por consiguiente, la nucleobase citosina (C) en un motivo diana está representada por la nucleobase guanina (G) en una unidad de unión correspondiente, o viceversa. Dicho de otro modo, la secuencia complementaria a, por ejemplo, 5'-T-T-C-A-G-3' es 3'-A-A-G-T-C-5'.

En algunas realizaciones, el cuerpo de unión a ácidos nucleicos proporcionado en el presente documento es un cebador. Tal como se usa en el presente documento, el término “cebador” se refiere a un oligonucleótido que puede aparearse (hibridarse con) una secuencia diana, creando de este modo una región bicatenaria que puede servir como punto de iniciación para la síntesis de ADN en condiciones adecuadas. Tal como se usa en el presente documento, el término “par de cebadores” se refiere en el presente documento a un par de oligonucleótidos, que se usan juntos en la amplificación de una secuencia de ácido nucleico seleccionada mediante cualquier técnica de amplificación disponible, preferiblemente reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Preferiblemente, la PCR de transcripción inversa (RT-PCR) debe llevarse a cabo en una muestra de ARNm. Otros tipos de procedimientos de amplificación incluyen, pero no se limitan a, la reacción en cadena de la ligasa (LCR), amplificación por desplazamiento de cadena (SDA), amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos, amplificación mediada por transcripción, amplificación mediada por señales de tecnología de ARN, amplificación por círculo rodante, amplificación mediada por bucle, amplificación de desplazamiento múltiple, amplificación dependiente de helicasa, amplificación isotérmica de cebador único o amplificación dependiente de helicasa circular. Tal como se conoce comúnmente en la técnica, los cebadores están diseñados para unirse a sus secuencias complementarias en condiciones seleccionadas. Un par de cebadores contiene un cebador en 5', es decir, un “cebador directo”, y un cebador en 3', es decir, un “cebador inverso”.

Los presentes cebadores de oligonucleótidos pueden tener cualquier longitud adecuada, dependiendo del formato de ensayo particular empleado. Normalmente, los cebadores de oligonucleótidos tienen una longitud de 10-40, preferiblemente 15-35 y más preferiblemente de 20-30 nucleótidos, y pueden adaptarse para ser especialmente adecuados para un sistema de amplificación de ácidos nucleicos elegido. Tal como se conoce comúnmente en la técnica, los cebadores de oligonucleótidos pueden diseñarse teniendo en cuenta el punto de fusión (es decir, la temperatura de fusión, Tm) de hibridación de los mismos con su secuencia diana. Existen muchos métodos para aumentar la temperatura de fusión de modo que se logren temperaturas de fusión suficientemente altas incluso con oligonucleótidos muy cortos. Estos métodos incluyen, por ejemplo, el uso de nucleótidos modificados tales como el ácido nucleico bloqueado (LNA) o la tecnología de agente de unión al surco menor (MGB).

Hay varias maneras de proporcionar especificidad de NOCIVA en un ensayo de ácido nucleico. En algunas realizaciones que usan al menos dos cebadores, tales como PCR, al menos el cebador en 3' está diseñado para aparearse o hibridarse específicamente con al menos parte de la secuencia que codifica para la región C-terminal única de la proteína NOCIVA, es decir, la región intrónica que codifica para el péptido formada por los nucleótidos 1635-1674 de SEQ ID NO: 1, de tal manera que la producción de un amplicón específico de NOCIVA se produce sólo cuando la región que codifica para el péptido está presente en la muestra. Alternativamente, se logra una especificidad similar cuando el cebador en 3' está diseñado específicamente para otro sitio del ácido nucleico específico de NOCIVA de longitud completa (sin cola de poli-A) o la 3'UTR de NOCIVA, es decir, puede aparearse o hibridarse específicamente con al menos parte de una secuencia formada por o solapada con los nucleótidos 1635-1983 ó 1675-1983 de SEQ ID NO: 1. Esto se debe a que, aunque no está presente en la proteína, la secuencia de nucleótidos del ARNm de NOCIVA es en la mayoría de las partes exclusiva de NOCIVA. Alternativamente, el cebador en 3' también puede aparearse o hibridarse específicamente con una secuencia de SEQ ID NO: 1 que se solapa con el límite de la región que codifica para el péptido y la 3'UTR de NOCIVA. Dicho de otro modo, el cebador en 3' se hibrida con una región diana abarcada por, o que reside en la misma o se solapa con una secuencia formada por los nucleótidos 1675-1983 de SEQ ID NO: 1. En este sentido, el término “abarcado por” significa que el cebador no se hibrida con la secuencia completa formada por dichos nucleótidos, sino con una subsecuencia de los mismos, subsecuencia que corresponde a la secuencia diana. Esta definición se aplica no sólo a los cebadores, sino también a otros cuerpos de unión, tales como las sondas.

Dado que es suficiente que la especificidad de NOCIVA del par de cebadores sea proporcionada por el cebador en 3', el sitio de apareamiento del cebador en 5' a lo largo del polinucleótido de NOCIVA puede diseñarse más libremente. Por tanto, el cebador en 5' puede diseñarse para hibridarse con una secuencia de ácido nucleico compartida al menos en parte por NOCIVA y CIP2A, es decir, la secuencia de ácido nucleico abarcada por los nucleótidos 1-1634 de SEQ ID NO: 1. Alternativamente, también el cebador en 5' puede ser específico de NOCIVA, es decir, diseñado para aparearse o hibridarse específicamente con una parte de la región intrónica formada por los nucleótidos 1635-1983 de SEQ ID NO: 1, una parte de la secuencia codificante del péptido de NOCIVA formada por los nucleótidos 1636-1674 de SEQ ID ⁿ O: 1, una parte de la región 3'UTR de NOCIVA formada por los nucleótidos 1675-1983 de SEQ ID NO: 1, o la región que se solapa con la región que codifica para el péptido y la 3'UTR de NOCIVA.

En términos más generales, la invención proporciona un par de cebadores para la amplificación específica de NOCIVA, en el que al menos el cebador en 3' es específico de NOCIVA, es decir, se hibrida con una subsecuencia de SEQ ID NO: 1 correspondiente total o parcialmente a la región intrónica de longitud completa, la región intrónica que codifica para el péptido o la región intrónica de 3-UTR (nucleótidos 1635-1983, 1636-1674 ó 1675-1983 de SEQ ID NO: 1, respectivamente). En algunas realizaciones, tanto el cebador en 5' como el cebador en 3' son específicos de NOCIVA. En algunas otras realizaciones, el cebador en 5' comprende una secuencia que se aparea o hibrida específicamente con al menos una parte de la secuencia compartida por NOCIVA y CIP2A, es decir, una secuencia formada por los nucleótidos 1-1634 de SEQ ID NO: 1. Normalmente, los cebadores están diseñados de tal manera que la longitud del amplicón es de desde aproximadamente 50 nucleótidos hasta aproximadamente 350 nucleótidos cuando se diseñan para seleccionar como diana sólo la secuencia intrónica de NOCIVA, es decir, los nucleótidos 1635-1983 de SEQ ID NO: 1. Dicho de otro modo, cuando se usan en un ensayo de amplificación de ácidos nucleicos, los cebadores producen un producto de amplificación con una longitud que varía de desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 350 nucleótidos.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, el par de cebadores de la invención amplifica sólo la secuencia intrónica específica de NOCIVA, es decir, al menos parte de la secuencia definida por los nucleótidos 1635-1983 de SEQ ID NO: 1. En tales realizaciones, el cebador en 3' del par de cebadores se hibrida específicamente con 10-40, preferiblemente 15-35, más preferiblemente 20-30 nucleótidos consecutivos de una secuencia formada por los nucleótidos 1635-1983, 1635-1674 ó 1675-1983 de SEQ ID NO:1 y el cebador en 5' se hibrida específicamente con 10-40, preferiblemente 15-35, más preferiblemente 20-30 nucleótidos consecutivos de una secuencia formada por los nucleótidos 1635-1983, 1635-1674 ó 1675-1983 de SEQ ID NO: 1.

En algunas otras realizaciones, el par de cebadores de la invención sólo amplifica una parte de la secuencia específica de NOCIVA definida por los nucleótidos 1635-1983 de SEQ ID NO: 1 de manera que el amplicón abarque uno o más nucleótidos en la secuencia compartida por NOCIVA y CIP2A, es decir, la secuencia formada por los nucleótidos 1-1634 de SEQ ID NO: 1. En tales realizaciones, al menos el cebador en 3' del par de cebadores se hibrida específicamente con 10-40, preferiblemente 15-35, más preferiblemente 20-30 nucleótidos consecutivos de una secuencia formada por los nucleótidos 1635-1983, 1635-1674 ó 1675-1983 de SEQ ID NO: 1. En realizaciones adicionales, el cebador en 5' se hibrida específicamente con 10-40, preferiblemente 15-35, más preferiblemente 20-30 nucleótidos consecutivos de una secuencia formada por los nucleótidos 1-1984, 1­ 1635, 1635-1983, 1635-1674 ó 1675-1983 de SEQ ID NO: 1. En muchas de tales realizaciones, la longitud del amplicón producido por los cebadores en 5' y en 3' varía desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 2000, preferiblemente desde aproximadamente 60 hasta aproximadamente 1000, más preferiblemente desde aproximadamente 70 hasta aproximadamente 500, e incluso más preferiblemente desde aproximadamente 75 hasta aproximadamente 250 nucleótidos. Algunos ejemplos no limitativos de cebadores en 5' y en 3' adecuados se exponen en la tabla 2 e incluyen cebadores en 5' seleccionados del grupo que consiste en secuencias establecidas en las SEQ ID NO: 5-25, y/o cebadores en 3' seleccionados del grupo que consiste en secuencias expuestas en las SEQ ID NO: 45-65. Un experto en la técnica puede diseñar cebadores según cualquiera de las realizaciones descritas, teniendo en cuenta los requisitos de espacio para ajustar tanto los cebadores de amplificación como, opcionalmente, la(s) sonda(s) en el marco deseado.

En muchas realizaciones en las que se busca una alta eficacia de amplificación, los cebadores en 5' y en 3' del par de cebadores tienen temperaturas de fusión (Tm) compatibles, por ejemplo, temperaturas de fusión que difieren en menos de 7°C, preferiblemente menos de 5°C, más preferiblemente menos de 4°C, lo más preferiblemente menos de 3°C, e idealmente entre 3°C y 0°C.

Los medios y métodos para considerar cualquier posible direccionamiento inespecífico al diseñar oligonucleótidos específicos de NOCIVA, tales como cebadores y sondas, y ensayos de detección de NOCIVA están fácilmente disponibles en la técnica. Es suficiente si la combinación o el ensayo de oligonucleótidos que se va a usar proporciona en conjunto suficiente especificidad de NOCIVA para permitir una detección fiable de la expresión de NOCIVA.

Dependiendo de la técnica que va a emplearse para detectar el producto de amplificación, los cebadores pueden ser detectables de tal manera que no sean necesarias sondas para la detección. Alternativamente, pueden emplearse marcadores intercalantes (por ejemplo, SYBR Green). En combinación con el análisis de la curva de fusión, los marcadores intercalantes pueden usarse para detectar y diferenciar entre amplicones, incluso con ligeras diferencias, sin necesidad de usar sondas. En una realización a modo de ejemplo de la presente invención, podría emplearse un cebador en 5' común tanto para NOCIVA como para CIP2^a , combinado con dos cebadores en 3', uno de los cuales es específico para cada secuencia.

Según lo anterior, la expresión de NOCIVA a nivel de ácido nucleico puede determinarse usando cualquier método adecuado con o sin amplificación de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ARNm de NOCIVA puede convertirse en primer lugar en su ADNc complementario con la ayuda de una transcriptasa inversa, seguido por la amplificación del ADN, por ejemplo, mediante PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) que incluye, pero no se limita a, PCR cuantitativa (qPCR), también conocida como PCR en tiempo real. La presencia, ausencia o concentración del polinucleótido de ARNm de NOCIVA expresado o un producto de amplificación o una propiedad del mismo puede evaluarse según los métodos disponibles en la técnica, por ejemplo, usando una sonda de detección o captura específica de NOCIVA. Posibles métodos adicionales adecuados para determinar la expresión de NOCIVA a nivel de ácido nucleico, con o sin una etapa de transcripción inversa y/o una etapa de amplificación de ácidos nucleicos dependiendo del método seleccionado, incluyen, pero no se limitan a, ensayos de protección de ARNasa, ensayos de hibridación de oligonucleótidos basados en balizas moleculares, análisis de curvas de fusión combinados con sondas de oligonucleótidos y/o marcadores intercalantes, análisis de electroforesis en gel, transferencia de tipo Southern, microalineamientos tales como microalineamientos de ADN y microalineamientos de ARN, sondeo directo y ensayos de acumulación de señales.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, el cuerpo de unión es una sonda de oligonucleótidos que puede usarse en diversos aspectos de la presente invención. Preferiblemente, la sonda es un polinucleótido monocatenario que se hibrida específicamente con una secuencia o su complemento correspondiente total o parcialmente a la región de secuencia única de NOCIVA, es decir, la región intrónica entre los exones 13 y 14 de NOCIVA. El gen KIAA1524 (correspondiente a los ácidos nucleicos 1635-1984 de SEQ ID NO: 1). La presente invención también abarca sondas que se hibridan con secuencias complementarias a las secuencias expuestas anteriormente. En algunas realizaciones, la sonda puede comprender o consistir en una secuencia que no es complementaria a toda dicha región de secuencia única sino sólo a una parte de la misma. Dicho de otro modo, una sonda de oligonucleótidos de la presente invención puede diseñarse para hibridarse con una secuencia de ácido nucleico que se solape o comprenda al menos una parte de dicha región intrónica.

Las presentes sondas específicas de NOCIVA pueden variar en su longitud. Los expertos en la técnica pueden diseñar fácilmente una sonda que tenga una longitud adecuada u óptima para la técnica que va a aplicarse para determinar el nivel de expresión de NOCIVA. Por ejemplo, la parte específica de diana de la sonda puede tener una longitud de 8-40, preferiblemente de 15-35, más preferiblemente de 20-30 nucleótidos. En algunas realizaciones, la sonda se hibrida específicamente con NOCIVA pero no con las isoformas de CIP2A previamente conocidas en condiciones de hibridación de moderadas a rigurosas, condiciones que resultan evidentes para los expertos en la técnica. Por consiguiente, tales sondas se hibridan específicamente con una región que comprende o se solapa al menos parcialmente con la región intrónica única de NOCIVA, región intrónica que tiene una longitud de 350 nucleótidos y corresponde a los nucleótidos 1635-1983 de SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, tales sondas son útiles en realizaciones en las que sólo se detectará la secuencia específica de NOCIVA independientemente de qué productos de expresión o amplificación estén presentes.

En algunas otras realizaciones, la sonda se hibrida o se solapa con la región que precede a la secuencia específica de NOCIVA, es decir, en la región que está presente al menos en parte también en las isoformas CIP2A conocidas, corresponde a los nucleótidos 1-1634 de SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, tal sonda es útil en realizaciones en las que una isoforma de CIP2A y NOCIVA previamente conocidas se amplifican en pocillos de reacción separados y, por ejemplo, por motivos de cuantificación, se detecta preferiblemente con la misma sonda o esencialmente similar. Por ejemplo, tales sondas también son útiles en realizaciones en las que la secuencia diana para la sonda está presente, es decir, por ejemplo, los productos de amplificación están disponibles para el análisis sólo si la muestra analizada contiene polinucleótidos de NOCIVA.

En aún realizaciones adicionales, se emplean al menos dos sondas, una se hibrida o se solapa específicamente con la región intrónica de NOCIVA correspondiente a los nucleótidos 1635-1983 de SEQ ID NO: 1 y la otra se hibrida o se solapa específicamente con la región común entre todas las isoformas de CIP2A correspondientes a los nucleótidos 1-1634 de SEQ ID NO: 1. Por ejemplo, tales sondas son útiles en realizaciones en las que la amplificación y detección de diferentes isoformas de CIP2A se realizan en una reacción multiplexada. En tales ensayos, también pueden diseñarse sondas adicionales o alternativas en las regiones que cubren, por ejemplo, los exones 1-13, 14-19 y/o 20-21.

Algunos ejemplos no limitativos de sondas adecuadas se exponen en la tabla 2.

Si las presentes sondas específicas de NOCIVA van a usarse en un método que implica el uso del presente par de cebadores, puede ser ventajoso en algunas realizaciones diseñar la sonda de tal manera que su temperatura de fusión sea compatible con la del par de cebadores que va a usarse.

Los oligonucleótidos específicos de NOCIVA, es decir, cebadores y/o sondas de la presente invención incluyen, por ejemplo, aquellos que contienen estructuras principales modificadas, uniones de internucleósidos no naturales y/o una o más modificaciones o sustituciones de bases tal como resulta evidente para los expertos en la técnica. Además, la composición química de las sondas puede ser, por ejemplo, ADN, ARN, ácido nucleico bloqueado (LNA) o ácido nucleico peptídico (PNA), o pueden componerse de polímeros mixtos que contienen cualquier número de monómeros de ADN, ARN, LNA, PNA, u otros análogos de ácidos nucleicos. Además, las sondas pueden construirse como sondas de unión al surco menor (MGB).

Según lo anterior, la presente invención proporciona un método que determina el nivel de expresión de NOCIVA a nivel de ácido nucleico. Un método de este tipo puede comprender, por ejemplo, poner una muestra del sujeto que necesita dicha determinación y se sospecha que contiene ARNm de NOCIVA o un ARNm de NOCIVA aislado obtenido de dicha muestra con un cuerpo de unión a oligonucleótidos, tal como una sonda, que interactúa específicamente con el ARNm de NOCIVA o un producto de amplificación de ensayos de ácidos nucleicos específicos de NOCIVA en condiciones en las que el cuerpo de unión se hibrida específicamente con dicha diana prevista; y detectar un complejo de hibridación, si lo hay; en el que la presencia de dicho complejo de hibridación se correlaciona con la presencia de ARNm de NOCIVA en dicha muestra.

La detección de complejos de hibridación puede llevarse a cabo mediante cualquier método adecuado disponible en la técnica. Los complejos de hibridación pueden separarse físicamente en algunos métodos de ensayo de los ácidos nucleicos no hibridados (por ejemplo, empleando una o más etapas de lavado para eliminar por lavado el exceso de ARNm/ADNc diana, la sonda, o ambos), y luego se detectan los marcadores detectables unidos a los complejos. Más a menudo, sin embargo, se emplea una detección homogénea en la que no se requiere la separación física de las moléculas hibridadas y no hibridadas. En los ensayos de amplificación de ácidos nucleicos, la detección homogénea puede realizarse como una etapa independiente después de la amplificación, es decir, usando una detección de criterios de valoración homogénea. La acumulación del amplicón también puede monitorizarse de manera homogénea durante el ensayo de amplificación mediante el uso de métodos de tipo qPCR. Los diversos métodos de detección homogéneos pueden clasificarse además en formatos que usan sondas y que no usan sondas.

Los marcadores detectables se refieren a etiquetas o marcadores radioactivos, fluorescentes, biológicos o enzimáticos de uso convencional en la técnica. Un marcador detectable puede conjugarse con o bien la sonda de oligonucleótidos o bien el polinucleótido diana. Tal como resultará evidente para los expertos en la técnica, la elección de un marcador detectable particular dicta la manera en la que se une a la sonda o la secuencia diana, así como la técnica que va a usarse para la detección. Aunque la presente invención no depende específicamente del uso de un marcador para la detección de una secuencia de ácido nucleico particular, un marcador de este tipo puede ser beneficioso, aumentando la sensibilidad o especificidad de la detección y simplificando la multiplexación de los ensayos. Además, un marcador detectable puede permitir mejor la automatización.

Los tintes intercalantes (por ejemplo, SYBR Green) pueden usarse para detectar la amplificación del fragmento de ADN de interés durante una reacción de amplificación de ácidos nucleicos tal como PCR. La intercalación se produce cuando los ligandos de un tamaño y naturaleza química apropiados se posicionan entre los pares de bases planos del ADN. Estos ligandos son en su mayoría policíclicos, aromáticos y planos y, por tanto, a menudo hacen tinciones de ácidos nucleicos adecuadas. La intensidad de fluorescencia aumenta respectivamente durante la amplificación y puede medirse en tiempo real sin la necesidad de sondas de oligonucleótidos independientes.

Tal como aprecian los expertos en la técnica, pueden emplearse una variedad de controles y aditivos para mejorar la precisión de los ensayos de hibridación. Por ejemplo, las muestras pueden hibridarse con una sonda irrelevante y/o tratarse con ARNasa A antes de la hibridación, para evaluar una falsa hibridación o impedir efectos inespecíficos o no deseados.

En algunas realizaciones, el método de detección descrito anteriormente puede comprender detectar el nivel de expresión de CIP2A usando cebadores y/o sondas específicos de CIP2A, que están fácilmente disponibles o pueden diseñarse usando medios y métodos disponibles en la técnica. El nivel de expresión de NOCIVA puede compararse con el de CIP2A, en el que la expresión aumentada de NOCIVA es indicativa de un mal pronóstico. En algunas realizaciones, la determinación de la expresión de NOCIVA se realiza mediante técnicas de secuenciación. Se han descrito en la técnica numerosos métodos adecuados para este fin e incluyen, pero no se limitan a, técnicas de secuenciación de Sanger tradicionales y de secuenciación de próxima generación (NGS). Las presentes realizaciones no están limitadas a ninguna técnica de marca.

Una plataforma comercial representativa adecuada para su uso según algunas realizaciones de la invención, en la que la presencia o cantidad de NOCIVA, si la hay, se detecta mediante secuenciación, es la secuenciación de Illumina mediante tecnología de síntesis (SBS), particularmente la tecnología TruSeq®. La aplicación de la tecnología TruSeq® requiere que se diseñen y sinteticen dos sondas oligonucleótidos, que se hibridan en el sentido de 5' y en el sentido de 3' de la región de interés. Cada sonda contiene una secuencia específica de diana única y una secuencia adaptadora universal. Una reacción de extensión-ligamiento se usa para unir las dos sondas y crear una biblioteca de nuevas moléculas de molde con extremos comunes. Luego se somete el ADN ligado al adaptador a amplificación por PCR, que añade índices y cebadores de secuenciación en ambos extremos. Luego puede realizarse la secuenciación mediante cualquier equipo adecuado, tal como el secuenciador MiSeq®, utilizando un método a base de terminadores reversibles que permite la detección de bases individuales a medida que se incorporan a las cadenas de ADN en crecimiento.

Los ejemplos no limitativos del equipo adecuado para los presentes fines de secuenciación incluyen secuenciadores de Illumina®, tales como MiSeq™, NExtSeq500™ y HiSeq™ (por ejemplo, HiSeq™ 2000 y HiSeq™ 3000), y secuenciadores de Life Technologies, tales como el secuenciador Ion Torrent™ y el secuenciador Ion Proton™. Debe entenderse que la utilización de estos equipos requiere que se usen una técnica de secuenciación y química apropiadas.

En algunas realizaciones relacionadas con las técnicas de NGS, la detección de la variante de ARNm de NOCIVA es posible con una secuenciación profunda tal como la que se realiza con la plataforma HiSeq™ 3000 de Illumina, longitud de lectura de 150 pb y biblioteca de extremos emparejados.

En algunas realizaciones de técnicas basadas en NGS, la primera sonda que va a emplearse se hibrida con una secuencia de ácido nucleico comprendida por los nucleótidos 1-1634 de SEQ ID NO: 1, es decir, con una región correspondiente a los exones 1 a 13 de KIAA1524 y compartida por NOCIVA y CIP2A, mientras que la segunda sonda que va a emplearse se hibrida con una secuencia de ácido nucleico que es específica de NOCIVA, es decir, la región intrónica única o la 3'UTR descrita con más detalle en otra parte de esta solicitud.

Métodos adicionales adecuados para detectar el nivel de expresión de NOCIVA incluyen, pero no se limitan a, tecnologías de hibridación in situ de ARN tales como RNAscope® (Advanced Cell Diagnostics, ACD) y ViewRNA™ (Invitrogen).

Según lo anterior, la presente invención proporciona un método para cualquier fin expuesto anteriormente, incluyendo, pero sin limitarse a pronosticar, detectar, clasificar, diagnosticar o monitorizar un cáncer en un sujeto que lo necesita, en el que el método comprende poner en contacto una muestra obtenida de dicho sujeto con un reactivo que se une específicamente al presente polipéptido de NOCIVA o polinucleótido de NOCIVA; y determinar el nivel de expresión de dicho polipéptido o polinucleótido en función de la unión de dicho reactivo; y comparar el nivel de expresión determinado con un control relevante; en el que la expresión aumentada de dicho polipéptido o polinucleótido es indicativa de un mal pronóstico. Normalmente, dicho reactivo es un cuerpo de unión específica a NOCIVA según la presente invención, tal como un anticuerpo anti-NOCIVA o al menos un oligonucleótido específico de NOCIVA, tal como una sonda y/o un par de cebadores.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un kit para detectar el nivel de expresión de NOCIVA en una muestra biológica o clínica, para cualquier fin expuesto anteriormente. Preferiblemente, el kit comprende un cuerpo de unión específica a NOCIVA, tal como un anticuerpo anti-NOCIVA o al menos un oligonucleótido específico de NOCIVA, una sonda y/o un par de cebadores de este tipo. En algunas realizaciones, el cuerpo de unión puede comprender un marcador detectable. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente cualquier reactivo adicional que se incluya en el kit dependiendo de la técnica deseada para llevar a cabo la determinación del nivel de expresión de NOCIVA. Por tanto, el kit puede comprender adicionalmente al menos un reactivo para realizar, por ejemplo, un inmunoensayo tal como ELISA, una inmunotransferencia de tipo Western, un ensayo inmunohistoquímico, un ensayo de amplificación de ácidos nucleicos, un ensayo de amplificación de señales, un ensayo de hibridación de ARN in situ, un ensayo de espectrometría de masas o un ensayo de secuenciación.

En algunas realizaciones, pueden estar comprendidos en el kit un reactivo o muestra de control apropiados o un valor umbral. El kit también puede comprender un medio legible por ordenador, que comprende instrucciones ejecutables por ordenador para realizar cualquiera de los métodos de la presente divulgación.

Resultará obvio para un experto en la técnica que, a medida que avanza la tecnología, el concepto de la invención puede implementarse de diversas maneras. La invención y sus realizaciones no están limitadas a los ejemplos descritos a continuación, pero pueden variar dentro del alcance de las reivindicaciones.

Parte experimental

Material y métodos

3' RACE y 5' RACE

Se usó el ARN total extraído con el kit Macherey-Nagel NucleoSpin RNA II como molde para los experimentos de RACE. Para la amplificación de ADNc de los extremos 3' y 5', se usaron kits Invitrogen 3'RACE (n.° de catálogo 183743-019) y 5'RACE (n.° de catálogo 18374-058) según los protocolos del fabricante. Se diseñaron y usaron múltiples cebadores específicos de genes (GSP) para la amplificación apropiada relacionada con CIP2A de los extremos de ADNc. Se corrieron las secuencias amplificadas en geles de agarosa (porcentaje ligado con los tamaños de fragmento predichos), se cortaron, se extrajo el ADN (NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up, Macherey-Nagel) y el ADN secuenciado para análisis. Los cebadores de secuenciación se diseñaron para estar en el sentido de 3' de los GSP.

Aislamiento de ARN y síntesis de ADNc

Se aisló el ARN total de sedimentos celulares de línea celular o de células mononucleares extraídas (muestras de médula ósea de pacientes). Se extrajo el ARN total de las líneas celulares con el kit NucleoSpin RNA II (Macherey-Nagel) y se aisló a partir de las muestras de pacientes el ARN total de las células mononucleares usando el kit E.Z.N.A® Total RNA Kit I (OMEGA bio-tek) según las instrucciones del fabricante. Después del aislamiento, se midió la concentración de ARN usando un dispositivo NanoDrop (ND-1000; NanoDrop Technologies).

Se realizó la síntesis de ADNc para todas las muestras usando 1 |ig de ARN total como material de partida. Se sintetizó el ADNc de las líneas celulares usando transcriptasa inversa del M-MLV, ARNasa (H-) (M3682, Promega), cebadores aleatorios (C1181, Promega), inhibidor de ribonucleasa RNasin (N2511, Promega) y mezcla de dNTP (10 mM cada uno, n.° R0192, Thermo Scientific). Se sintetizó el ADNc de muestras de pacientes usando transcriptasa inversa SuperScript III (18080093, Invitrogen), cebadores aleatorios (C1181, Promega), inhibidor de ribonucleasa RiboLock(tm) (n.° E00381, Thermo Scientific) y mezcla dNTP (100 mM, BIO-39028, Bioline). Las reacciones de RT, incluyendo las temperaturas y los volúmenes, se realizaron según las instrucciones del fabricante de la enzima.

PCR cuantitativa en tiempo real

Los cebadores para cada ensayo específico de gen, si era posible, se diseñaron para ubicarse en diferentes secuencias exónicas para evitar la amplificación del ADN genómico. La concentración de cebador en cada reacción fue de 300 nM y la concentración de sonda de 200 nM. La especificidad de las reacciones de qPCR se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa y análisis de la curva de fusión. Se requerían una banda del tamaño esperado y un único pico, respectivamente. La amplificación de los ADNc diana se realizó usando el kit KAPA PROBE FAST qPCR (Kapa Biosystems) y el sistema de PCR en tiempo real rápida 7900 HT (Thermo Fisher) según con las instrucciones del fabricante. La PCR cuantitativa en tiempo real se ejecutó en las siguientes condiciones: 95°C durante 10 min seguido por 45 ciclos de 95°C durante 15 s y 60°C durante 1 min. Los datos de expresión génica relativa se normalizaron al nivel de expresión de los genes de mantenimiento endógenos gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y beta-actina usando el método 2A-AAC(t) con el software SDS (versión 2.4.1, Applied Biosystems). Los resultados se derivaron del promedio de al menos dos experimentos independientes y dos réplicas técnicas.

Las secuencias de los cebadores y la sonda para el ensayo de CIP2A e13 fueron: directo cagtctggactgagaatattattgga (SEQ ID NO: 23), inverso ggcattgtttgctgctatacttt (SEQ ID NO: 66), sonda tccactgc (SEQ ID NO: 42). Las secuencias de los cebadores y la sonda para el ensayo de CIP2A e20 fueron: directo gaacagataagaaaagagttgagcatt (SEQ ID NO: 67), inverso cgaccttctaattgtgcctttt (SEQ ID NO: 68), sonda cttcctcc (SEQ ID NO: 69). Las secuencias de los cebadores y la sonda para el ensayo de b-actina fueron: directo tcacccacacrgtgcccatctacgc (SEQ ID NO: 70), inverso cagcggaaccgctcattgccaatgg (SEQ ID NO: 71), sonda atgccctcccccatgccatcctgcgt (SEQ ID NO: 72). Las secuencias de los cebadores y la sonda para el ensayo de GAPDH fueron: directo acccactcctccacctttga (SEQ ID NO: 73), inverso ttgctgtagccaaattcgttgt (SEQ ID NO: 74), sonda acgaccactttgtcaagctcatttcctggt (SEQ ID NO: 75). Las secuencias de los cebadores y la sonda para el ensayo de EVI1 fueron: directo AGTGCCCTGGAGATGAGTTG (SEQ ID ⁿ O: 76), inverso TTTGAGGCTATCTGTGAAGTGC (SEQ ID NO: 77), sonda CCCCAGTGAGGTATAA-AGAGGA (SEQ ID NO: 78). Las secuencias de los cebadores y la sonda para el ensayo de WT1 fueron: directo GGGCGTGTGACCGTAGCT (SEQ ID NO: 79), inverso CGCTATTCGCAATCA-GGGTTA (SEQ ID NO: 80), sonda AGCACGGTCACCTTCGACGGG (SEQ ID NO: 81). Las secuencias de los cebadores y la sonda para el ensayo de PME1 fueron: directo acaggtttgcagaacccatc (SEQ ID NO: 82), inverso ggacagcaggtcactaacagc (SEQ ID NO: 83), sonda tccagtgt (SEQ ID NO: 84). Las secuencias de los cebadores y la sonda para el ensayo de ARPP19 fueron: directo cagagggagcactatgtctgc (SEQ ID NO: 85), inverso gcttttaattttgcttcttctgct (SEQ ID NO: 86), biblioteca de sondas universal de sonda (UPL) n.° 68. Las secuencias de los cebadores y la sonda para el ensayo de TIPRL fueron: directo catgatgatccacggcttc (SEQ ID NO: 87), inverso tcagggagagatggcatatgta (SEQ ID NO: 88), sonda UPL n.° 81. El ensayo de SET usado fue: SET5-6-3, AIY9AXG, Applied Biosystems.

Expresión y purificación de proteínas

Se clonaron los dominios truncados de CIP2A humana (1-560, 1-330, 561-905) y NOCIVA de longitud completa para dar el vector pGEX-4T1 (GE Healthcare) con una etiqueta GST N-terminal y un sitio de escisión TEV entre los mismos. Se sobreexpresaron todos los constructos en células de E. coli BL21 (DE3) (Novagen), hechas crecer en medio LB. Se cultivaron las células bacterianas a 37°C hasta que la DO600 alcanzó 0,5-0,7 y luego se indujeron con isopropil-p-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) 0,2 mM a 16°C durante la noche. Se recogieron los sedimentos bacterianos y se lisaron mediante sonicación. Se purificaron las proteínas de fusión con GST mediante la columna Glutathione Sepharose 4B (GE17-0756-01, GE Healtcare). Se verificó la pureza de las muestras mediante SDS-PAGE y tinción con azul brillante de Coomassie.

Anticuerpos

Se usaron los siguientes anticuerpos: anticuerpo monoclonal anti-CIP2A de ratón (sc-80659, Santa Cruz); anticuerpo monoclonal anti-nucleolina C23 de ratón (sc-17826, Santa Cruz), anticuerpos secundarios ligados a HRP para ECL (GE Healthcare) marcados con 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, Life Technologies), anticuerpos secundarios conjugados con Alexa Fluor (anticuerpo anti-IgG de conejo 488, anticuerpo anti-IgG de ratón 594, Life Technologies).

Inmunotransferencia de tipo Western

Se separaron los extractos de proteínas usando SDS-PAGE en condiciones desnaturalizantes (geles Mini-PROTEAN TGX al 4-20%) y se transfirieron a la membrana de PVDF (Bio-Rad Laboratories). Se bloquearon las membranas con TBST-leche al 5 % (solución salina tamponada con Tris y Tween 20 al 0,1%), se incubaron con los anticuerpos primarios indicados durante la noche a 4°C y luego se incubaron anticuerpos secundarios ligados a HRP para ECL (GE Healthcare) a temperatura ambiente durante 1 h. Se añadió reactivo de inmunotransferencia de tipo Western para ECL Plus (GE Healthcare) a la membrana y se reveló la película. Inmunotinción

Se fijaron las células con PFA al 4% durante 5 min a temperatura ambiente, se lavaron, se permeabilizaron con Triton X-100 al 0,2 % suero de caballo al 30% en PBS durante 15 min y se bloquearon con suero de caballo al 30% en PBS durante 30 min a temperatura ambiente. Se lavaron las células y luego se tiñeron con los anticuerpos primarios indicados diluidos en suero de caballo al 30% en PBS (1:100) durante la noche a 4°C. Luego se lavaron las células y se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con Alexa (1:200) y suero de caballo al 30% con 4'6-diamidino-2-fenilindol (DAPI, tinción de núcleos, 1:10.000) en PBS durante una hora a temperatura ambiente. Se obtuvieron imágenes de los campos ópticos de las células con un microscopio de fluorescencia invertido Zeiss AxioVert 200M de Zeiss (Cari Zeiss).

Inmunohistoquímica

Se preparó el material tisular según la práctica histológica convencional, es decir, se fijó con formalina tamponada (pH 7,0) y se incrustó en bloques de parafina. Se realizó la inmunohistoquímica (IHC) en secciones cortadas a 3 |im. Para la recuperación de antígeno, se trataron las secciones de tejido dos veces durante 7 min cada una en tampón citrato en un horno de microondas (Dako REAL Target Retrieval Solution, S2031, Dako, Glostrup, Dinamarca). Se realizó la IHC con un dispositivo Lab Vision Autostainer 480 (Thermo-Fisher Scientific, Fremont, CA, EE.UU.) y se detectaron las señales aplicando un kit de polímeros PowerVision+, según el protocolo del fabricante (DPVB 110HRP; Immunovision Technologies, Vision Biosystems, Norwell, MA, EE.UU.), con diaminobencidina como cromógeno. Se aplicaron anticuerpos específicos de NOCIVA (dos anticuerpos policlonales de conejo independientes, Biogenes) a una dilución de 1:2000.

Análisis estadístico

Se realizaron el análisis estadístico y las comparaciones usando el programa JMP Pro 12. Se sumaron las variables continuas mediante estadísticas descriptivas (mediana, rango intercuartílico y rango) mientras que las frecuencias y los porcentajes se calcularon para los datos categóricos. Para las variables continuas, se usó la prueba de la U de Mann-Whitney para comparaciones entre muestras independientes y la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para datos emparejados. Se estimaron las funciones de supervivencia global mediante el estimador de Kaplan-Meier y se usó la prueba de rangos logarítmicos para las comparaciones entre grupos. Se realizó un análisis multivariante para estudiar la relación de los niveles de expresión génica (por debajo o por encima de la mediana) y la respuesta (muerto frente a vivo para SG y recaída frente a no recaída para la recaída). Todas las pruebas fueron bilaterales con un nivel de significación del 5%.

Identificación de una variante NOCIVA novedosa de corte y empalme de CIP2A

Para identificar posibles variantes de ARNm de CIP2A, se emplearon ensayos de PCR para amplificación rápida de extremos de ADNc (3'RACE y 5'RACE) en muestras de ARNm de líneas celulares humanas. Como resultado, se identificaron tres variantes de ARNm de CIP2A que se validaron además con RT-PCR y secuenciación (figura 1A). Una forma variante contenía sólo los exones 1-19 de CIP2A, y la otra variante encontrada contenía los exones 1-21, pero carecía de 3'UTR. Se identificó una nueva secuencia de ARNm, denominada NOCIVA, y comprendía los exones 1-13 de CIP2A fusionados de manera C-terminal con parte del intrón entre los exones 13 y 14. La figura 1D ilustra la formación de ARNm de NOCIVA a partir del gen KIAA1524 a través de corte y empalme alternativo. La región intrónica (en negrita en la figura 1D) entre el exón 13 y exón 14 del gen KIAA1524 (subrayado en la figura 1D) se considera un exón alternativo por la maquinaria de corte y empalme y se une al extremo del exón 13. Después de procesar el pre-ARNm para dar ARNm maduro, se une la cola de poli(A) al extremo 3' de los transcriptos de NOCIVA. El transcripto de NOCIVA formó así una secuencia única y previamente desconocida (figuras 1A y B). Curiosamente, la secuencia intrónica específica de NOCIVA está en el marco codificante con la secuencia de ARNm de CIP2A anterior, y después de 40 nucleótidos, que corresponden a 13 aminoácidos, seguido por el codón de terminación clásico TAA (figura 1B). La posible 3'UTR de NOCIVA consiste en aprox. 350 nucleótidos seguidos por una secuencia AATAAA y la secuencia de poli-A clásica. Por tanto, el producto del gen NOCIVA codifica para CIP2A truncada con 13 nuevos aminoácidos (NNKNTQEAFQVTS) en el extremo C-terminal (figura 1B). Es importante destacar que esta secuencia peptídica de 13 aa no coincide con ninguna secuencia de proteína conocida en el proteoma humano según la búsqueda de homología de Blast (tabla 1). La PCR de validación para la expresión de NOCIVA se realizó en múltiples líneas celulares con cebadores específicos para la codificación de ARNm para la porción C-terminal única de NOCIVA (figura 1C). Posteriormente se secuenciaron las bandas del tamaño correcto del gel para confirmar que el producto de PCR representaba el producto de ARNm de NOCIVA.

Tabla 1. Secuencias que producen alineamientos significativos con SIVA en la búsqueda de BLAST:

Puntuación máx. Valor de E Identidad NP_001001715.2 PERM, .. que contiene dominios RhoGEF y

pleckstrina 23,5 17 75% BAFS3484.1 producto de proteína sin nombre [Homo sapiens] 23,5 17 78% NP_005757.1 PERM. pro.. que contiene dominios RhoGEF y

pleckstrina 23,5 17 75% NP_001273768.1 FERM. .. que contiene dominios RhoGEF y

pleckstrina 23,5 17 75% AAH71S92.1 proteína FARP1 [Homo sapiens] 23,5 17 75% EAW78561.1 hCG1786642, isoforma CRA_a [Homo sapiens] 22,7 35 75% AAH64971.1 proteína IQGAP1 [Homo sapiens] 22,7 35 86% BAG65182.2 producto de proteína sin nombre [Homo sapiens] 22,7 35 86% AAI39732.1 motivo IQ que contiene proteína activadora de GTPasa

1 [H... 22,7 35 86% NP_003861.1 proteína Ras de tipo activadora de GTPasa IQGAP1

{Homos... 22,7 35 86%

Expresión de NOCIVA en células cancerosas

Para estudiar la expresión de la variante de ARNm de NOCIVA en tejidos normales y cancerosos, se realizaron qPCR con dos conjuntos de cebador-sonda específicos de NOCIVA (pares de cebador y sonda 16 y 17 de la tabla 2) en un panel de células normales y células cancerosas. Se usaron muestras de queratinocitos (Ker) derivadas de pacientes como modelo para tejido normal, y muestras de células de carcinoma de células escamosas (SCC) de cabeza y cuello para tejido canceroso. Anteriormente, se ha demostrado que CIP2A se sobreexpresa significativamente en muestras de HNSCC, y su alta expresión se correlaciona con un mal pronóstico del paciente en HNSCC humano (Ventela et al., 2015). Curiosamente, la expresión de NOCIVA también mostró una expresión significativamente elevada en muestras de SCC en comparación con Ker (figura 2A).

A continuación, se evaluó la expresión de CIP2A y NOCIVA en un panel de ADNc de tejido humano normal (panel I y II de MTC humano, Clontech, n.° de catálogo 636742 y 636743). En particular, los cebadores para PCR de CIP2Ae13, CIP2Ae20 y NOCIVA se optimizaron para producir una eficiencia de amplificación similar, lo que descartó la posibilidad de que las posibles diferencias en los niveles de expresión se deban a motivos técnicos relacionados con el ensayo de pCr . De acuerdo con la evidencia publicada (Ventela et al., 2012), CIP2A se expresó en niveles bajos en la mayoría de los tejidos humanos normales, excepto en los testículos (figura 2B). Curiosamente, los cebadores del exón 13 de CIP2^a (CIP2Ae13), que amplifican específicamente CIP2A pero no NOCIVA, mostraron niveles de expresión notablemente mayores que los cebadores del exón 20 de CIP2A (CIP2Ae20). En comparación con CIP2A, NOCIVA mostró un nivel de expresión general muy bajo en tejidos humanos normales (figura 2B).

Aunque el ARNm de NOCIVA se expresó a un nivel muy bajo en todos los tejidos humanos normales, la correlación de la expresión de NOCIVA con la expresión de CIP2A e13 facilitó el análisis de aquellos tejidos en los que la expresión de NOCIVA fue relativamente más abundante con respecto a CIP2A. De los tejidos analizados, los leucocitos mostraron la razón NOCIVA/CIP2Ae13 más alta (figura 2C). Por tanto, para examinar si la diferencia ya observada entre tejidos normales y cancerosos (figura 2A) sería relevante para otros tipos de cáncer, a continuación se concentró en los cánceres linfocíticos leucemia mielógena aguda (LMA), leucemia mielógena crónica (LMC) y leucemia promielógena aguda (LPA). En particular, en comparación con las líneas celulares de cáncer que representan cánceres humanos sólidos UT-7 (HNSCC), MCF-7 (cáncer de mama) y HeLa (cáncer de cuello uterino), muchas líneas celulares de LMA, pero también líneas celulares de LMC, mostraron una expresión claramente mayor de ARNm de NOCIVA (figura 2D). Incluso de manera más interesante, aquellas líneas celulares de LMA y LMC que expresaron NOCIVA a un nivel mayor que en UT-7, también mostraron una expresión relativamente mayor de NOCIVA que CIP2Ae20 (figura 2D). De hecho, también se observó una mayor expresión de NOCIVA que de CIP2Ae2o en células UT-7 hasta cierto punto. Estos resultados revelan que los cánceres linfocíticos, incluyendo la LMA y la LMC, consisten en tipos de cáncer en los que la expresión de NOCIVA está aumentada y podría ser clínicamente relevante. Por tanto, se postula que tras la transformación oncogénica hay un interruptor de corte y empalme que aumenta la expresión del transcripto alternativo que codifica para NOCIVA en comparación con CIP2A de longitud completa. Para validar la sobreexpresión de NOCIVA en la LMA, se analizó una pequeña cohorte de muestras de médula ósea de pacientes con diagnóstico de LMA y se compararon los niveles de NOCIVA con la expresión promedio en queratinocitos o células de HNSCC. En particular, 6/8 de las muestras de pacientes con LMA mostraron una expresión claramente mayor de NOCIVA que los niveles promedio encontrados en las células de HNSCC (figura 2E).

Sobreexpresión de NOCIVA en muestras linfocíticas humanas de diagnóstico

Para validar adicionalmente el estado del ARNm de NOCIVA y CIP2A en muestras de pacientes con LMA, se empleó qPCR en un panel de muestra más grande de muestras de médula ósea de pacientes con LMA de diagnóstico. El panel de muestra se recogió entre enero de 2000 y julio de 2010 y consiste en un total de 93 pacientes de 18-65 años y a los que se les ha diagnosticado LMA de novo o secundaria en e1Hospital Central de la Universidad de Turku (TYKS). Se obtuvo un permiso ético válido tanto para la recogida de muestras como para el perfil de expresión descrito en este caso. Se usaron GAPDH y b-actina como genes de mantenimiento para la normalización de la expresión en cada muestra. Para estimar el grado de sobreexpresión en LMA, se normalizó la expresión de tanto NOCIVA como CIP2A e20 en muestras de LMA a los niveles de estos genes en una muestra de control comercial de médula ósea (BM) normal (Clontech). Además de CIP2A y NOCIVA, se analizaron las muestras para determinar la expresión de los marcadores de LMA conocidos WT1 y EVI1, y otras proteínas inhibidoras de PP2A, SET, que anteriormente se ha implicado en la LMA (Ciccone et al., 2015). Casi todos los pacientes expresaron un nivel más bajo de CIP2Ae13 o CIP2Ae20 en comparación con la muestra de médula ósea normal, mientras que en total el 78% de las muestras de AML mostraron sobreexpresión de NOCIVA (figuras 3A y B). El porcentaje de pacientes que mostraron una sobreexpresión de NOCIVA mayor de 2 veces sobre la muestra de médula ósea normal fue del 68%. WT1, EVI1 y SET mostraron patrones de expresión que están de acuerdo con la bibliografía publicada.

Relevancia clínica de la expresión de NOCIVA en muestras de LMA humanas de diagnóstico

De los 93 pacientes analizados anteriormente, la información de seguimiento clínico estaba disponible para 80 pacientes. En la figura 4A se presenta la distribución de estos pacientes en grupos de riesgo usados clínicamente en función de sus perfiles genéticos. En un análisis multivariante para determinar la supervivencia global (SG), la edad de diagnóstico y los grupos de riesgo intermedio (grupo de riesgo 2) y adverso (grupo de riesgo 3) se correlacionaron significativamente con una mala supervivencia del paciente (figura 4B). A continuación, se evaluó si la expresión de NOCIVA, CIP2Ae13, CIP2Ae20, WT1, E^v I 1 o SET se asocia con grupos de riesgo. La única asociación estadísticamente significativa se encontró con la expresión de EV1 cuando se comparó con la diferencia entre todos los grupos de riesgo (figura 4C). Estos datos indican que la expresión de NOCIVA es independiente de la clasificación de grupos de riesgo de LMA usada actualmente. Es importante destacar que la expresión alta de NOCIVA se correlacionó significativamente con una SG deficiente en el análisis multivariante con un cociente de riesgos instantáneos mayor que para la expresión de EVI1 (1,511 frente a 1,265) (figura 4D). De manera muy interesante, la baja expresión de CIP2Ae13 en cambio fue un predictor de importancia limítrofe de una mejor supervivencia del paciente con un cociente de riesgos instantáneos de 0,173 (figura 4D). En el análisis de Kaplan-Meier de la supervivencia global de los pacientes usando niveles de expresión de ARNm de NOCIVA divididos en dos grupos, alto y bajo, en relación con la mediana, los pacientes con expresión alta de NOCIVA también mostraron una supervivencia significativamente más mala (figura 4E, p = 0,022). Por último, dado que una NOCIVA alta se asocia con una mala SG, mientras que un CIP2Ae13 bajo parece asociarse más bien con una SG buena, se sometió a prueba si una razón NOCIVA/CIP2Ae13 alta podría funcionar como un novedoso marcador de diagnóstico que predice la mala SG de los pacientes con LMA. Tal como se muestra en la figura 4F, este es el caso, ya que la razón NOCIVA/CIP2Ae13 mostró una asociación estadísticamente muy significativa con una mala SG en el análisis multivariante.

Se diseñaron diferentes conjuntos de secuencias de cebadores y sonda para la amplificación y detección de ADNc específico de NOCIVA según las líneas generales ilustradas en la figura 6 usando Primer3Plus, Herramienta PrimerQuest de IDT y Roche Assay Design Center. Los diseños se realizaron o bien manualmente con la ayuda de las sugerencias de Primer3Plus o bien fueron recomendados por el programa de diseño de oligonucleótidos usado. Los programas calcularon las temperaturas de fusión durante los diseños de ensayo. Los ensayos se diseñaron para usarse principalmente en la configuración de qPCR, pero también se diseñaron ensayos adicionales para la PCR tradicional con Primer3Plus. Los cebadores se diseñaron normalmente para amplificar el producto de 70 a 150 pb. Normalmente, la longitud del cebador se fijó en 18-23 pb, la Tm del cebador 58-62°C, % de GC del cebador 30-80 y la diferencia máxima de Tm del par de cebadores 3°C. La longitud de la sonda se fijó normalmente en 18-27 pb, Tm de oligonucleótidos 60-68°C y % de GC de oligonucleótidos 20-80. Cuando se diseñó una sonda de unión al surco menor (MGB) o de ácido nucleico bloqueado (LNA), se calculó que la Tm de la sonda estaba cerca de 60°C, de tal manera que la modificación química aumentaría la Tm de la sonda más cerca de 68-70°C. El diseño del ensayo de MGB se realizó manualmente usando Primer3Plus, mientras que el diseño del ensayo de LNA se realizó automáticamente en el Roche Design Center. El Roche Design Center usa la biblioteca de sondas universales de Roche en los diseños. Los detalles de las secuencias, las temperaturas de fusión y la química de la sonda para cada diseño de ensayo se proporcionan en la tabla 2.

Tabla 2. Ejemplos de los cebadores y sondas diseñados

* M, diseño manual; R, diseño recomendado

** 1, manualmente en función de la búsqueda de Primer3Plus

2, Primer3Plus

3, Herramienta PrimerQuest de IDT

4, Roche Assay Design Center

Desarrollo del ensayo del exón 16 de CIP2A y reevaluación de los resultados existentes basándose en la razón NOCIVA/CIP2Ae16

CIP2A puede distinguirse de NOCIVA en función de la presencia del exón 16 (CIP2Ae16). Con este fin, se desarrolla un ensayo descrito a continuación. El ensayo de expresión génica TaqMan® para los exones 16 de CIP2A, Hs00405413_m1, de Life Technologies ya existe y también se somete a prueba para el mismo material de muestra. Como alternativa o adicionalmente, CIP2A puede distinguirse de NOCIVA en función de CIP2Ae13 o CIP2Ae20 tal como se describió en los ejemplos anteriores.

El ARN total se aísla usando el minikit RNeasy (Qiagen). Se sintetiza el ADNc con transcriptasa inversa SuperScriptIII (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. La cuantificación de la expresión de CIP2A e16 se realiza mediante el ensayo de expresión génica TaqMan (Applied Biosystems). Se usa gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y beta-actina como control interno. El kit de qPCR kApA PROBE FAST se usa para la reacción de qPCR y el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio™ 12K Flex para procesamiento de placas. Ciclo de reacción de PCR: 1: 95°C 10 min, 2: 95°C 15 s, 3: 60°C 1 min; repetir las etapas 2-3 x 45. El análisis de los datos de expresión génica relativa se realiza usando el método 2-AACT con el software Thermo Fisher Cloud. Un gen se considera desregulado si su valor de expresión es mayor o menor que el valor del punto de corte establecido para cada gen (media+3 d.e.), definido por el análisis de muestra de control de BM normal (Clontech, ARN total de médula ósea humana).

Taqman de NOCIVA en células de leucemia mielógena crónica y otras neoplasias hemáticas

La cuantificación de la expresión del gen NOCIVA en otras neoplasias hemáticas y líneas celulares establecidas, incluyendo la leucemia mielógena crónica, se realiza mediante ensayos de expresión génica TaqMan diseñados en el Roche Design Centre. Los ensayos se validan mediante la curva de fusión y el análisis de eficiencia de amplificación. El ARN total se aísla usando el minikit RNeasy (Qiagen) del extracto de células monoclonales. El ADNc se sintetiza con transcriptasa inversa SuperScriptIII Reverse (Invitrogen) según las instrucciones del fabricante. Se utiliza gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y beta-actina como control interno. El kit de qPCR KAPA PROBE FAST se usa para la reacción de qPCR y el sistema de PCR en tiempo real QuantStudio™ 12K Flex para procesamiento de placas. Ciclo de reacción de PCR: 1: 95°C 10 min, 2: 95°C 15 s, 3: 60°C 1 min; repetir las etapas 2-3 x 45. El análisis de los datos de expresión génica relativa se realiza usando el método 2-AACT con el software Thermo Fisher Cloud. Un gen se considera desregulado si su valor de expresión es mayor o menor que el valor de punto de corte establecido para cada gen (media+3 d.e.), definido por el análisis de muestra de control de BM normal (Clontech, ARN total de médula ósea humana).

Técnicas in situ para detectar NOCIVA en cánceres sólidos

Se someten a prueba tecnologías de hibridación de ARN in situ, incluyendo RNAscope® (Advanced Cell Diagnostics, ACD) y ViewRNA™ (Invitrogen) para la detección de NOCIVA y CIP2A según las instrucciones del fabricante en diversas líneas celulares de cáncer sólido fijadas con formalina y muestras de tejido fijadas con formalina e incrustadas en parafina (FFPE) (al menos mama, próstata, ^h N^s CC). Se eligen los controles biológicos negativos y positivos en función del análisis previo de qPCR de muestras similares para la detección de CIP2A y NOCIVA. Los controles técnicos se incluyen en los escenarios experimentales según las instrucciones del fabricante. Se contactará a ACD e Invitrogen para el diseño de sondas novedosas para la detección in situ de ARNm de CIP2A y NOCIVA. ACD e Invitrogen diseñarán y fabricarán las sondas de hibridación in situ para la detección de CIP2A y NOCIVA. El análisis de la lectura recibida se examinará según las instrucciones del fabricante.

Generación de anticuerpos específicos de NOCIVA

Se generaron dos anticuerpos específicos de NOCIVA inmunizando conejos contra el péptido específico de NOCIVA NNKNTQEAFQVTS (SeQ ID NO: 3) por BioGenes GmbH. Tras la síntesis del péptido (pureza de al menos el 80%, control de calidad por HPLC y EM), se añadió una cisteína N-terminal adicional al péptido específico de NOCIVA para la conjugación dirigida con una proteína portadora.

Se purificaron los anticuerpos IgG monoespecíficos a partir de sueros posteriores a la inmunización mediante cromatografía de afinidad usando una columna de antígeno de péptido NOCIVA (SEQ ID NO: 3) con Sepharose™ activada con CNBr como matriz de afinidad.

Se sometió a prueba la especificidad de los anticuerpos purificados por afinidad con proteínas recombinantes expresadas en bacterias (figura 5), así como con proteína de fusión g FP-NOCIVA sobreexpresada en células. El péptido bloqueante, que también se compone de SEQ ID NO: 3, se usó como control. Ambos anticuerpos detectaron tanto GST-NOCIVA purificada recombinante producida de manera bacteriana (figura 5), así como GFP-NOCIVA sobreexpresada en células Hela (datos no mostrados). Es importante destacar que los anticuerpos contra NOCIVA eran específicos y no reconocieron ninguno de los fragmentos de CIP2A recombinantes (figura 5).

Uso de anticuerpos específicos de NOCIVA para determinar la innumohistoquímica de diagnóstico en muestras de tejido de cáncer humano sólido

Se sometió a prueba y se optimizó la aplicabilidad de los anticuerpos específicos de NOCIVA generados tal como se describió anteriormente para determinar la inmunohistoquímica (IHC) de diagnóstico. Es importante elegir un método de IHC apropiado para obtener un resultado de detección fiable. La micromatriz de tejido (TMA) que consiste en muestras incrustadas en parafina de tejidos de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello y cáncer de mama se tiñó con anticuerpos generados contra el péptido específico de NOCIVA.

La técnica de estreptavidina/biotina marcada (LSAB) no tiene la sensibilidad para alguna expresión antigénica, donde en su lugar puede ser necesario el uso de sistemas poliméricos o la amplificación con tiramina. La comparación de tampones de recuperación de epítopos inducida por calor (HIER) de pH 6 y pH 9 junto con la incubación del anticuerpo en dos diluciones/concentraciones proporciona una indicación inicial de qué combinación vale la pena continuar. Otras variaciones que se someten a prueba incluyen la temperatura y el tiempo de HIER, el intervalo de dilución/concentración de anticuerpos y la incubación de anticuerpos primarios. Pueden investigarse fijadores alternativos, pero sólo pueden aplicarse a un grupo menor de muestras, ya que la mayoría de las colecciones de tejidos tanto en la investigación como en el ámbito clínico utilizan formaldehído tamponado neutro. También se tiene cuidado de abordar la variación de la técnica de manera sistemática, de emplear los mismos lotes de reactivos durante la validación y de registrar los resultados de la tinción usando una plantilla de informe estandarizada.

Además de los enfoques usados de manera rutinaria para la validación y optimización de un nuevo anticuerpo para uso IHC de diagnóstico, las células agotadas en NOCIVA se usan como control de especificidad en un formato de microalineamiento de lisado celular (CMA) desarrollado recientemente en el laboratorio de los inventores. Las células agotadas en NOCIVA sirven como control biológico negativo en esta configuración. El control positivo se elige en función de un análisis de inmunotransferencia de tipo Western previo de las muestras de tejido similares para la detección de NOCIVA. Con fines de investigación, los anticuerpos específicos de NOCIVA también se someten a prueba y el rendimiento de los mismos se valida en diversas muestras de lisado celular y de tejido (incluyendo muestras de mama, próstata y HNSCC) para evaluar todas las indicaciones de uso (tipos de cáncer) en las que NOCIVA actúa como biomarcador.

Uso de anticuerpos específicos de NOCIVA para el análisis de FACS de diagnóstico tanto en cánceres hemáticos como cánceres sólidos

Los anticuerpos específicos de NOCIVA generados tal como se describió anteriormente se validan y optimizan para su uso en la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de diagnóstico. Con este fin, se desarrolla un protocolo para investigar el valor predictivo de la medición de NOCIVA en muestras de sangre periférica y médula ósea recién recogidas en el momento del diagnóstico. La preparación de muestras se realiza según el protocolo de TYKSlab para el manejo de muestras hemáticas de pacientes para análisis de FACS. En un protocolo de FACS típico para muestras hemáticas, se resuspenden las células en 500 |il de paraformaldehído al 2%, se fijan durante 10 min a 37°C y se enfrían en hielo durante 1 min. Se recogen las células mediante centrifugación (770 g, 3 min), se añaden 500 |il de metanol al 90%, después de lo cual se agitan brevemente con vórtex las muestras y se incuban en hielo durante 30 min. Luego se lavan las células (completamente con 1 ml de un tampón de incubación que contiene solución salina tamponada con fosfato y albúmina de suero bovino al 0,5%), se recogen y se resuspenden en 25 |il del tampón de incubación. Después de esto, se incuban las muestras a temperatura ambiente durante 10 min. Se añaden los anticuerpos a una concentración final de 30 |ig/ml, se agitan y se incuban a temperatura ambiente durante 40 min. Se lavan las muestras dos veces, se resuspenden en anticuerpo secundario marcado con fluoresceína Alexa Fluor 488 (10 |ig/ml) y se incuban a temperatura ambiente en la oscuridad durante 30 min. Luego se analizan las células lavadas dos veces usando citometría de flujo (FACScalibur o análogo), con el software Cellquest pro (o análogo) para el análisis de datos. El nivel de proteína NOCIVA presente en las muestras se determina como la intensidad de fluorescencia media geométrica (IFM) menos el valor de IFM de la muestra de control. Las células agotadas en NOCIVA también sirven como control biológico negativo en esta configuración. El control positivo se elige en función de un análisis de inmunotransferencia de tipo Western previo de muestras de LMA para la detección de NOCIVA. Con fines de investigación, el FACS específico de NOCIVA también se somete a prueba y su rendimiento se valida en diversas muestras de tejido y líneas celulares de cáncer sólido (incluyendo muestras de mama, próstata y HNSCC).

Bibliografía

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Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Variante polipeptídica aislada de CIP2A que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 3.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con SEQ ID NO: 2 fuera de la región formada por los aminoácidos 546-558.

3. Polipéptido según la reivindicación 1 ó 2, codificado por un polinucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico definida por los nucleótidos 1636-1674 de SEQ ID NO: 1.

4. Polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 1 o una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con SEQ ID NO: 1 fuera de la región definida por los nucleótidos 1636-1674 de SEQ ID NO: 1.

5. Polinucleótido de CIP2A aislado que codifica para el polipéptido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 4, que comprende opcionalmente una secuencia de ácido nucleico definida por los nucleótidos 1636-1674 de SEQ ID NO: 1.

6. Polinucleótido según la reivindicación 5, en el que el polinucleótido es ADNc.

7. Polinucleótido de CIP2A aislado que codifica para el polipéptido definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, en el que el polinucleótido es ADNc.

8. Polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, que comprende además 3'UTR.

9. Polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en el que el polinucleótido comprende una secuencia de ácido nucleico expuesta en SEQ ID NO: 1 o una secuencia de ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de al menos el 80% con SEQ ID NO: 1 fuera de la región definida por los nucleótidos 1636-1674 de SEQ ID NO: 1.

10. Uso in vitro del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o del polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 5-9, como biomarcador de cáncer.

11. Uso según la reivindicación 10, en el que dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en cánceres linfocíticos y cánceres sólidos, opcionalmente

en el que dicho cáncer linfocítico se selecciona del grupo que consiste en leucemia mielógena aguda (LMA) y leucemia mielógena crónica (LMC); o

en el que dicho cáncer sólido se selecciona del grupo que consiste en carcinoma de células escamosas (SCC), carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de cuello uterino, esófago, cáncer de vejiga, cáncer de riñón y cáncer de páncreas.

12. Uso según la reivindicación 10 u 11, como biomarcador de mal pronóstico tal como supervivencia global reducida.

13. Anticuerpo variante anti-CIP2A o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente al polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el epítopo contiene de 5 a 20 aminoácidos consecutivos seleccionados de una secuencia correspondiente a o que se solapa con los aminoácidos 546-558 de SEQ ID NO: 2.

14. Oligonucleótido que se hibrida específicamente con una secuencia diana en el polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 5-10,

en el que la secuencia diana está abarcada por o se solapa con una secuencia formada por los nucleótidos 1635-1983 de SEQ ID NO: 1, opcionalmente en el que el oligonucleótido se hibrida con 8-40, preferiblemente 15­ 35, más preferiblemente 20-30 nucleótidos consecutivos de una secuencia formada por los nucleótidos 1635­ 1983, 1636-1674 ó 1675-1983 de SEQ ID NO: 1, y/o

en el que el oligonucleótido es una sonda, que comprende preferiblemente un marcador detectable.

15. Par de cebadores que amplifica específicamente al menos una parte del polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 5-9, que comprende un cebador en 3' que se híbrida específicamente con una secuencia diana abarcada por, o que se solapa con una secuencia formada por los nucleótidos 1635-1983, 1636-1674 ó 1675-1983 de SEQ ID NO: 1, opcionalmente

en el que el par de cebadores comprende un cebador en 5' que se hibrida específicamente con una secuencia diana abarcada por una secuencia formada por los nucleótidos 1 a 1634 de SEQ ID NO: 1, y/o

en el que dicho cebador tiene una longitud de 10-40, preferiblemente 15-35, o lo más preferiblemente 20-30 nucleótidos.

16. Método para pronosticar, detectar, clasificar, diagnosticar o monitorizar un cáncer, que comprende determinar el nivel de expresión del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o del polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 5-9 en una muestra de un paciente.

17. Método según la reivindicación 16, en el que determinar dicho nivel de expresión comprende realizar la amplificación de ácidos nucleicos, opcionalmente

en el que dicha amplificación se realiza usando el de cebadores según la reivindicación 15; y/o

en el que determinar dicho nivel de expresión comprende hibridar dicho polinucleótido con un oligonucleótido según la reivindicación 14; o

en el que determinar dicho nivel de expresión comprende detectar la unión del anticuerpo según la reivindicación 13 al polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 en dicha muestra.

18. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 16-17, en el que dicho cáncer se selecciona del grupo que consiste en cánceres linfocíticos tales como LMA, LMC y PLM, y cánceres sólidos tales como de carcinoma de células escamosas (SCC), carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (HNSCC), cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de próstata, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de cuello uterino, esófago, cáncer de vejiga, cáncer de riñón y cáncer de páncreas.

19. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 16-18, en el que la expresión aumentada de dicho polipéptido o polinucleótido en comparación con la de un control es indicativa de un mal pronóstico.

20. Método para asignar un tratamiento a un sujeto al que se le ha diagnosticado leucemia mielógena aguda (LMA), comprendiendo el método las etapas de:

poner en contacto una muestra biológica del sujeto con un reactivo que se une específicamente al polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4 o al polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 5-9;

determinar el nivel de expresión de dicho polipéptido o dicho polinucleótido basándose en dicha unión; determinar si el nivel de expresión determinado de dicho polipéptido o dicho polinucleótido está aumentado o no en la muestra comparando dicho nivel de expresión con un control; y

asignar un régimen de tratamiento que comprende terapia con células madre si dicha expresión está aumentada, opcionalmente en el que dicho control es CIP2A o un gen de mantenimiento.

21. Inmunoensayo para detectar la presencia del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en una muestra clínica, que comprende:

poner en contacto la muestra con el anticuerpo según la reivindicación 13; y

detectar la unión específica del anticuerpo, si la hay, cualitativa o cuantitativamente, opcionalmente en el que el ensayo comprende poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo adicional, que se une específicamente al polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, pero cuyo epítopo es diferente del epítopo del anticuerpo según la reivindicación 13, para formar un inmunocomplejo intercalado, y detectar la presencia de dicho inmunocomplejo, si lo hay, cualitativa o cuantitativamente, y/o en el que el ensayo comprende poner en contacto dicha muestra con un anticuerpo adicional, que se une específicamente al polipéptido de CIP2A, pero cuyo epítopo reside entre los aminoácidos 546 y 905 de SEQ ID NO: 4, para formar un segundo inmunocomplejo intercalado, y detectar la presencia de dicho segundo inmunocomplejo, si lo hay, cualitativa o cuantitativamente, opcionalmente en el que se determina la razón de los dos inmunocomplejos intercalados.

22. Método para detectar la presencia del polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 5-9, en una muestra biológica, que comprende:

a) poner en contacto la muestra con el oligonucleótido según la reivindicación 14; y

b) detectar la hibridación específica del oligonucleótido,

opcionalmente que comprende antes de a), amplificar dicho polinucleótido usando el par de cebadores según la reivindicación 15, o

a) poner en contacto la muestra con el par de cebadores según la reivindicación 15;

b) realizar la amplificación de ácidos nucleicos; y

c) detectar el amplicón obtenido en la etapa b) cualitativa o cuantitativamente con el oligonucleótido según la reivindicación 14.

23. Kit para determinar el nivel del polipéptido según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende el anticuerpo según la reivindicación 13, o kit para determinar el nivel del polinucleótido según una cualquiera de las reivindicaciones 5-9, que comprende el oligonucleótido según la reivindicación 14, y/o el par de cebadores según la reivindicación 15.