JPWO2017007031A1 - 子宮体がんのリンパ節転移能の評価方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年7月9日に出願した日本国特願2015−138104の優先権を主張するものであり、その全内容は本明細書において参照として援用される。
また、本明細書に引用される全ての文献は、あらゆる目的から全体として参照により援用される。いずれの文献の引用も、それが本発明に関する先行技術であることを認めるものと解釈されてはならない。
しかしながら、SEMA3Dと子宮体がんとの関係や子宮体がんにおけるリンパ節転移との関係についてはこれまでに全く知られていない。
1)子宮体がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料について、SEMA3Dの発現レベルを測定する工程を含む、子宮体がんのリンパ節転移若しくはリンパ節転移能又は予後を評価する方法。
2)以下のa及びbの工程を含む、上記1)に記載の方法。
a)子宮体がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料中のSEMA3Dの発現レベルを測定する工程
b)SEMA3Dの発現レベルを、対照レベル又は閾値レベルと比較する工程
3)SEMA3Dの発現レベルが対照レベル又は閾値レベルよりも増加している場合に、リンパ節転移なし又はリンパ節転移能が低い又は予後が良好と判定する上記1)又は2)に記載の方法。
4)生体試料中のSEMA3Dの発現レベルが、子宮体がん組織におけるSEMA3Dの転写産物又は翻訳産物の量である、上記1)〜3)のいずれかに記載の方法。
5)子宮体がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料について、SEMA3D及びTACC2の発現レベルを測定する工程を含む、子宮体がんのリンパ節転移若しくはリンパ節転移能又は予後を評価する方法。
6)以下のc及びdの工程を含む、上記5)に記載の方法。
c)子宮体がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料中のSEMA3D及びTACC2の発現レベルを測定する工程
d)SEMA3D及びTACC2の発現レベルを、対照レベル又は閾値レベルと比較する工程
7)SEMA3Dの発現レベルをTACC2の発現レベルと比較したときの相対的な発現レベルが対照レベル又は閾値レベルよりも増加している場合に、リンパ節転移なし又はリンパ節転移能が低い又は予後が良好と判定する上記5)又は6)に記載の方法。
8)生体試料中のSEMA3D及びTACC2の発現レベルが、子宮体がん組織におけるSEMA3D及びTACC2の転写産物又は翻訳産物の量である、上記5)〜7)のいずれかに記載の方法。
9)SEMA3Dタンパク質と特異的に結合する抗体、又はSEMA3D遺伝子由来の核酸を特異的に認識するオリゴヌクレオチドを含有する、上記1)〜4)のいずれかに記載の方法に用いる子宮体がんのリンパ節転移若しくはリンパ節転移能又は予後を評価するための検査用キット。
10)SEMA3Dタンパク質と特異的に結合する抗体及びTACC2タンパク質と特異的に結合する抗体、又はSEMA3D遺伝子由来の核酸を特異的に認識するオリゴヌクレオチド及びTACC2遺伝子由来の核酸を特異的に認識するオリゴヌクレオチドを含有する、上記5)〜8)に記載の方法に用いる子宮体がんのリンパ節転移若しくはリンパ節転移能又は予後を評価するための検査用キット。
11)上記1)〜8)のいずれかに記載の方法に用いる、子宮体がんのリンパ節転移若しくはリンパ節転移能又は予後を評価するための装置。
12)SEMA3Dの、子宮体がんのリンパ節転移若しくはリンパ節転移能又は予後を評価するためのマーカーとしての使用。
13)SEMA3D及びTACC2の、子宮体がんのリンパ節転移若しくはリンパ節転移能又は予後を評価するためのマーカーとしての使用。
生体試料からRNAを抽出する方法は、公知の任意の方法を用いることができる。具体的には、ライフテクノロジーズ社製Ambion RiboPureキット、キアゲン社製miRNeasy、同社製RNeasyが例示できるが、これらのうちキアゲン社製miRNeasyキットが好適に用いられる。
SEMA3Dは、その遺伝子及びタンパク質が、NCBIに以下のように登録されている。
SEMA3D遺伝子:NM_152754(配列番号1)
SEMA3Dタンパク質:NP_689967(配列番号2)
TACC2は、Transforming acidic coiled-coil-containing protein 2(UniProtKB/Swiss-Prot: TACC2#HUMAN (O95359))であるが、本発明においては、TACC2の遺伝子座に存在するTACC2アイソフォームを用いることもできる。ここで、TACC2アイソフォームとしては、例えば、ヒトリファレンスゲノム(GRCh37)の染色体番号10(chr10)、開始位置123779316、終了位置123779341を転写開始領域(TSS)として持つ、配列番号3(TACC2アイソフォームL)又は4(TACC2アイソフォームS)で示される塩基配列からなる遺伝子と、そこからコードされるタンパク質である、UniProtKB/Swiss-Prot: TACC2#HUMAN (O95359,配列番号5)、E9PBC6#HUMAN (E9PBC6, 配列番号6), E7EMZ9#HUMAN (E7EMZ9, 配列番号7)のいずれか又はその一部が挙げられる。当該TACC2アイソフォームは子宮体がんのリンパ節転移を評価するためのマーカーとなり得ることを本出願人らは既に見出している(PCT/JP2015/050551)。
後記実施例に示すように、TACC2の遺伝子発現量は、リンパ節転移陰性群に対して陽性群の方が有意に高値であり(図3)、SEMA3DとTACC2の2つの遺伝子を組み合わせた相対発現量<−ΔCt(SEMA3D−TACC2)>は、リンパ節転移陽性群において低発現、陰性群においてで高発現となる(図4)。また、リンパ節転移陽性群では−ΔCt(SEMA3D)低値、−ΔCt(TACC2)高値であり、SEMA3DとTACC2の発現量は、リンパ節転移診断において負の相関が認められる(図5)。さらにSEMA3DとTACC2を組み合わせた場合には、感度・特異度が、それぞれを単独で用いた場合よりさらに優れている(図6)。
したがって、SEMA3DとTACC2の組み合わせは、子宮体がんのリンパ節転移若しくはリンパ節転移能又は予後を評価するためのマーカーとして極めて有用である。
特異的なハイブリダイゼーションとは、実質的に目的の核酸のみにハイブリダイズすることを意味し、例えばストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが挙げられる。ここで、ストリンジェントな条件としては、通常「1×SSC、0.1%SDS、37℃」程度の洗浄条件、より厳しいハイブリダイズ条件としては「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」程度、さらに厳しいハイブリダイズ条件としては「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」程度の条件を挙げることができる。ハイブリダイズ条件は、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Thrd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。
前記アレイに固定化される核酸としては、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であればよく、例えば、マーカー遺伝子の全配列を有する核酸であってもよく、部分配列からなる核酸であってもよい。ここで、「部分配列」とは、少なくとも15〜25塩基からなる核酸が挙げられる。
斯かるホモログ遺伝子としては、例えば配列番号1や配列番号3〜4で示される塩基配列の相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列からなり、且つ配列番号2や配列番号5〜7で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と生物学的活性が等価である、ポリヌクレオチドが挙げられる。
ここで、ストリンジェントな条件としては、前記と同様に、「1×SSC、0.1%SDS、37℃」、より厳しくは「0.5×SSC、0.1%SDS、42℃」、さらに厳しくは「0.1×SSC、0.1%SDS、65℃」を挙げることができる。このようなポリヌクレオチドとして、具体的には配列番号1や配列番号3〜4で示される塩基配列と80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチドを例示することができる。塩基配列の同一性は、前記BLAST等のアルゴリズムにより決定することができる。
例えば、ウェスタンブロット法によれば、一次抗体として上記の抗体を用いた後、二次抗体として放射性同位元素、蛍光物質又は酵素等で標識した一次抗体に結合する抗体を用いて、その一次抗体を標識し、これら標識物質由来のシグナルを放射線測定器、蛍光検出器等で測定することが行われる。
得られた抗体を酵素処理又は得られた抗体の配列情報を利用することにより、抗体の断片を得ることができる。
ここで、「対照レベル」とは、例えば、リンパ節転移がない子宮体がん患者から分離された子宮内膜がん組織若しくは子宮体がん患者から分離された正常組織におけるマーカーの発現レベル、又は子宮体がんを発症していない健常人群におけるマーカーの発現レベルが挙げられる。
例えば、対象患者のがん組織のSEMA3Dの発現レベルが、リンパ節転移がない子宮体がん患者から分離された子宮内膜がん組織、正常組織或いは健常人由来の組織における発現レベルに近い、当該発現レベルの範囲内に属する、或いは当該発現レベルより有意に高い場合には、当該患者の子宮体がんはリンパ節転移がない又はリンパ節転移能が低い、又は予後が良好と評価できる。
また、対象患者のがん組織におけるTACC2の発現量に対するSEMA3Dの相対発現量が、リンパ節転移がない子宮体がん患者から分離された子宮内膜がん組織、正常組織或いは健常人由来の組織における発現レベルに近い、当該発現レベルの範囲内に属する、或いは当該発現レベルより有意に高い場合には、当該患者の子宮体がんはリンパ節転移がない又はリンパ節転移能が低い、又は予後が良好と評価できる。
また、当該検査用キットには、上記抗体や核酸の他、標識試薬、緩衝液、発色基質、二次抗体、ブロッキング剤や、試験に必要な器具やコントロール等を含むことができる。
(1)検体
子宮体部に限局した内膜腺癌G1及びG2症例で、術前に包括同意を得たリンパ節転移陽性患者7例と陰性患者53例を対象とし、原発巣摘出時に主要病変部を採取した。
摘出組織片は、摘出後速やかに液体窒素中で凍結し、2mLマイクロチューブに入れ−80℃で保存した。
1)RNAの抽出及び精製
保存組織片を2mLサンプルチューブに50mg以下に分割して入れ、ジルコニアビーズφ2.0とRNA抽出試薬(RNeasy(登録商標)Mini Kit (QIAGEN))を加えビーズ式細胞破砕装置(TOMY Micro Smash MS-100)を用いて13500rpm、3分間ホモジネートした。次に、RNA抽出試薬のプロトコールに従ってRNAの抽出を行った。抽出RNAは、分光高度計(Thermo Nano Drop)による紫外線吸収(230、260、280nm)を測定し、260/230比及び260/280比が1.9−2.2であることを確認した。
1)で抽出した手術摘出検体由来の抽出RNA2000ng分から、PrimeScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA)のプロトコールに従って、1st strand cDNAを合成した。
Fast SYBR(登録商標) Green Master Mix(Applied Biosystems)のプロトコールに従って反応液を調製し、以下に示すプライマーを用いて、Life technologies 7500 Fast Real-Time PCR Systemを用いてRT-qPCRを行った。
a)SEMA3D primer(TAKARA Primer Set ID:HA239516)
b)SUDS3 primer(TAKARA Primer Set ID:HA237699)
c) TACC2アイソフォームL又はS primer:
Primer F: CCAgTTgCTgAAgggCAgAA(配列番号8)
Primer R: gCggACCTTggAgTCTgAg(配列番号9)
遺伝子発現量は、SEMA3D又はTACC2アイソフォームL又はSのCt値から対照遺伝子として定量したSUDS3のCt値を差し引き-1を掛けた−ΔCt値を算出し、unpaired student t−testでリンパ節転移陽性群と陰性群の統計学的有意差を評価した。対照遺伝子(ハウスキーピング遺伝子)として選択したSUDS3は、リンパ節転移陽性群と陰性群の間での発現量の差が小さい遺伝子として確認されたものである。両遺伝子に対するこの定量試験においてPCR増幅効率がほぼ一定であることを確認した。
結果を図1及び図2に示す。
1)SEMA3D発現量は、リンパ節転移陽性群に対して陰性群の方が有意に高値であった(図1、P=0.0065)。さらにSEMA3Dの感度・特異度を算出してROC曲線を作成したところ、AUCは0.87であり、感度、特異度ともに高いバイオマーカーとなり得ることが示された(図2)。
以上より、SEMA3Dをマーカーとして、早期癌と進行癌及び組織悪性度に制限されることなく、リンパ節転移の有無を判定できると考えられる。
3)SEMA3DとTACC2アイソフォームL又はSの2つの遺伝子を組み合わせた−ΔCt(SEMA3D−TACC2アイソフォームL又はS)を検討した結果、リンパ節転移陽性群と陰性群において、相対発現量が有意に異なっていた(P値 0.0004)。リンパ節転移陽性群は低発現、陰性群で高発現であった(図4)。また、リンパ節転移陽性群では−ΔCt(SEMA3D)低値、−ΔCt(TACC2)高値であり、SEMA3DとTACC2アイソフォームL又はSの発現量は、リンパ節転移診断において負の相関を認めることが示された(図5)。
さらにSEMA3DとTACC2アイソフォームL又はSに関しての感度・特異度を算出しROC曲線を作成した。−ΔCt(SEMA3D)、−ΔCt(TACC2)の単遺伝子でのAUCは、0.87、0.78と共に高いものであったが、−ΔCt(SEMA3D−TACC2アイソフォームL又はS)のAUCは0.96とさらに感度・特異ともに優れていた(図6)。
以上より、SEMA3D及びTACC2を組み合わせたバイオマーカーは、早期癌と進行癌及び組織悪性度に制限されることなく、より精度よくリンパ節転移の有無の評価できることが示された。そこで、偽陰性率が0%となる極限(図6においてsensitivityが1.0、1-specificityが0.1以下になるポイント)にカットオフ値を設定した場合、子宮体がん群において癌組織を体内に残すリスクを回避しつつ、不要なリンパ節郭清の大半(92%)が省略可能になることが期待される。
(1)SEMA3Dタンパク質又はTACC2タンパク質に対する免疫組織染色
1)切片試料の調製
子宮体がん患者から分離した生体試料を常法によりホルマリン固定した後、パラフィンに包埋して3μmの組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付けたものを切片試料として使用した。
切片について脱パラフィンを行った後、TACC2タンパク抗体反応用切片は、0.01M(pH6.0)クエン酸緩衝液中で120℃10分間オートクレーブし、抗原を賦活化した。SEMA3Dタンパク抗体反応用切片は、0.01M(pH6.0)クエン酸緩衝液中でMicro Wave 700Wで6分間加熱を2回行い、抗原を賦活化した。
それぞれの切片を3%過酸化水素溶液で10分間反応させペルオキシダーゼをブロックし、1次抗体反応は、10%ヤギ血清/PBSで2000倍に希釈したポリクローナルTACC2抗体(MERCK MILLIPORE, #2397077)もしくはポリクローナルSEMA3D抗体(SIGMA-ALDRICH, #HPA037522-100UL)と4℃で一晩インキュベートした。陰性対照実験では、ウサギIgG(DAKO, #1 X0936)を1次抗体として使用した。2次抗体反応は標識ストレプトアビジンビオチン法を用いて行い、抗原抗体複合体を3,3−ジアミノベンジジン溶液(1mmol/L 3,3−ジアミノベンジジン、50mmol/L PBS緩衝液(pH7.4)、0.006% H2O2)を用いて可視化した。核はヘマトキシリンエオジンで対比染色したのち検鏡観察を行った。ヘマトキシリンエオジン染色の結果を図7Aに、SEMA3Dタンパク質に対する免疫染色結果を図7Dに、Dに対する陰性対照を図7Eに、TACCタンパク質に対する免疫染色結果を図7Fに、Fに対する陰性対照を図7Gに示す。
1)FISHプローブ
SEMA3D mRNA(NM_152754)に対するFISHプローブは、Stellaris(登録商標)RNA FISHプローブデザイナー(Biosearch Technologies Inc., Petaluma, CA)(https://www.biosearchtech.com/support/tools/design-software/stellaris-probe-designer)を用いて設計し、カルボキシフルオレセインで標識した。FISHプローブは、SEMA3D mRNAの全塩基配列に対して設計した25個のプローブを混合して使用した。使用したプローブを表1に示す。
子宮体がん患者から分離した生体試料を常法によりホルマリン固定した後、パラフィンに包埋して4μmの組織片に薄切し、スライドガラスに貼り付けたものを切片試料として使用した。
プロトコール(www.biosearchtech.com/stellarisprotocols, Protocol for Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) Tissue)に従って脱パラフィンを行った切片を、37℃20分間10μg/mlのプロテイナーゼK(和光純薬, #169-22761)を含有する1×PBS中でインキュベートした。
陰性対照として使用したスライドに取り付けられた組織切片は、ハイブリダイゼーション工程前に37℃30分間50μg/mlのリボヌクレアーゼA(ナカライテスク, #30100-31)で前処理し、切片中のmRNAを除去した。ハイブリダイゼーションは125nMのプローブを含むハイブリダイゼーション溶液と37℃で16時間反応させ、常法でDAPIによる核染色を行った。AXIOVERT 200M倒立広視野蛍光顕微鏡 (Zeiss, Oberkochen, Germany) により蛍光観察を行った。SEMA3D mRNAに対する蛍光in situ hybridizationの結果を図7Bに、Bに対する陰性対照を図7Cに示す。図7B中、SEMA3D mRNAを緑色で、図7B及びC中、DAPIによる核染色を青色で示す。
1)TACC2タンパク質に対する免疫染色は子宮体がん細胞に一致して陽性を示し、具体的には子宮体がん細胞の細胞核に一致して陽性を呈した(図7F、G)。
2)SEMA3Dタンパク質に対する免疫染色も子宮体がん細胞質に一致して陽性を示したが、同タンパク質はIgドメインを有し細胞外分泌されるため検体誤差が大きかった(図7D、E)。
3)SEMA3D局在をさらに同定するために、SEMA3D mRNAに対するプローブを作成し、in situ hybridization(FISH)を行ったところ、SEMA3D mRNAの緑色蛍光は主に子宮体がん細胞の細胞質に一致して陽性を呈した(図7B、C)。
これらの結果により、同定されたマーカーは、検体に混在する間質細胞ではなく子宮体がん細胞のみで発現されることを実証した。
すなわち、従来のリンパ節転移診断に用いられている画像評価や腫瘍マーカーでは早期癌や微小転移には適さないが、本発明のマーカー(SEMA3D、又はSEMA3D及びTACC2)は早期癌でもリンパ節転移を診断可能であり、微小転移も検出できる可能性がある。原発巣のマーカー遺伝子発現定量解析によるリンパ節転移診断が実現すれば、転移陰性群では、組織学的悪性度を考慮した上で後腹膜リンパ節郭清を省略できる症例を抽出することが可能となり、リンパ節郭清手術による合併症の回避や患者侵襲度の軽減が可能になると考えられる。
さらに、高リスクなどの理由により子宮体がん原発巣に加えリンパ節郭清も実施した結果であっても最終病理診断でリンパ節転移陰性の場合がある。この場合、リンパ節転移巣の摘出精度及び病理診断精度による偽陰性の可能性を否定できないが、SEMA3D低発現或いは(SEMA3D−TACC2)の低発現を認める場合はリンパ節転移のリスクが高いと判断し、根治療法及び再発予防としての術後治療の追加や経過観察間隔の設定などリスクに準じた個別医療を設定することが可能となるといえる。
Claims (13)
- 子宮体がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料について、SEMA3Dの発現レベルを測定する工程を含む、子宮体がんのリンパ節転移若しくはリンパ節転移能又は予後を評価する方法。
- 以下のa及びbの工程を含む、請求項1に記載の方法。
a)子宮体がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料中のSEMA3Dの発現レベルを測定する工程
b)SEMA3Dの発現レベルを、対照レベル又は閾値レベルと比較する工程 - SEMA3Dの発現レベルが対照レベル又は閾値レベルよりも増加している場合に、リンパ節転移なし又はリンパ節転移能が低い又は予後が良好と判定する請求項1又は2に記載の方法。
- 生体試料中のSEMA3Dの発現レベルが、子宮体がん組織におけるSEMA3Dの転写産物又は翻訳産物の量である、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 子宮体がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料について、SEMA3D及びTACC2の発現レベルを測定する工程を含む、子宮体がんのリンパ節転移若しくはリンパ節転移能又は予後を評価する方法。
- 以下のc及びdの工程を含む、請求項5に記載の方法。
c)子宮体がん患者から分離されたがん組織由来の生体試料中のSEMA3D及びTACC2の発現レベルを測定する工程
d)SEMA3D及びTACC2の発現レベルを、対照レベル又は閾値レベルと比較する工程 - SEMA3Dの発現レベルをTACC2の発現レベルと比較したときの相対的な発現レベルが対照レベル又は閾値レベルよりも増加している場合に、リンパ節転移なし又はリンパ節転移能が低い又は予後が良好と判定する請求項5又は6に記載の方法。
- 生体試料中のSEMA3D及びTACC2の発現レベルが、子宮体がん組織におけるSEMA3D及びTACC2の転写産物又は翻訳産物の量である、請求項5〜7のいずれか1項に記載の方法。
- SEMA3Dタンパク質と特異的に結合する抗体、又はSEMA3D遺伝子由来の核酸を特異的に認識するオリゴヌクレオチドを含有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法に用いる子宮体がんのリンパ節転移若しくはリンパ節転移能又は予後を評価するための検査用キット。
- SEMA3Dタンパク質と特異的に結合する抗体及びTACC2タンパク質と特異的に結合する抗体、又はSEMA3D遺伝子由来の核酸を特異的に認識するオリゴヌクレオチド及びTACC2遺伝子由来の核酸を特異的に認識するオリゴヌクレオチドを含有する、請求項5〜8のいずれか1項に記載の方法に用いる子宮体がんのリンパ節転移若しくはリンパ節転移能又は予後を評価するための検査用キット。
- 請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法に用いる、子宮体がんのリンパ節転移若しくはリンパ節転移能又は予後を評価するための装置。
- SEMA3Dの、子宮体がんのリンパ節転移若しくはリンパ節転移能又は予後を評価するためのマーカーとしての使用。
- SEMA3D及びTACC2の、子宮体がんのリンパ節転移若しくはリンパ節転移能又は予後を評価するためのマーカーとしての使用。
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