KR20240033766A - HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측용 Copine1 유전자 마커 및 이의 용도 - Google Patents
HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측용 Copine1 유전자 마커 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측용 Copine1 유전자 마커 및 이의 용도에 관한 것으로, HER2 양성 유방암 환자의 생물학적 시료 내 Copine1 유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준을 분석함으로써 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측용 Copine1 유전자 마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
유방암은 여성에 있어 발생률 및 사망률이 가장 높은 암으로, 초기 유방암의 경우에는 생존율이 90%에 이르지만 말기 유방암의 경우에는 생존율이 급격히 낮아지기 때문에, 증상이 없을 때 조기 발견하는 것이 생존율을 향상시킬 수 있는 방법이다. 유방암의 가장 기본적인 치료는 병변의 외과적인 절제 수술이고, 수술 후에는 항암 화학요법, 방사선 치료, 항호르몬 치료 등의 보조 치료를 받게 된다. 유방암의 예후를 결정짓는 가장 중요한 요소는 암 덩어리의 크기, 림프절 전이 여부 또는 전신 전이 여부 등이며, 전이가 진행된 4기 유방암의 경우에는 5년 생존율이 20% 미만인 것으로 보고되고 있다. 암의 전이(metastasis)란 암세포가 원래 발생한 조직이나 장기가 아닌 다른 곳에서 증식하는 것으로, 이를 위해서는 암세포가 주변 조직을 뚫고 인근 혈관까지 이동하거나, 신생혈관을 형성하여 이를 통해 다른 장기로 이동해야 하는데, 이를 침윤(invasion)이라 한다.
유방암은 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER), 프로게스테론 수용체(progesterone receptor, PR) 또는 인간 상피 성장인자 수용체 2(human epidermal growth factor receptor 2, HER2)의 발현 유무에 따라 크게 3가지 유형으로 분류된다. 유방암 조직내 ER 또는 PR이 발현된 경우에는 호르몬 수용체 양성 유방암(hormone receptor positive breast cancer)으로 분류되고, ER 또는 PR이 발현되지 않고 HER2가 발현된 경우에는 HER2 양성 유방암(HER2 positive breast cancer)으로 분류되며, ER, PR, HER2가 모두 발현되지 않는 경우에는 삼중 음성 유방암(triple negative breast cancer)으로 분류된다. 호르몬 수용체 양성 유방암은 다시 내강 A 유형(luminal A type) 또는 내강 B 유형(luminal B type)으로 분류된다. 유방암의 각 유형에 따라 증상 및 치료법이 다르며, 전체 유방암 중 호르몬 수용체 양성 유방암이 60%, HER2 양성 유방암이 25%, 삼중 음성 유방암이 15% 정도인 것으로 알려져 있다. 호르몬 수용체 양성 유방암은 암이 천천이 자라나고 덜 공격적인 것으로 알려져 있지만, HER2 양성 유방암과 삼중 음성 유방암은 암이 빠르게 자라나고 공격적인 것으로 알려져 있다. 특히, HER2 양성 유방암은 재발과 전이가 잦아 예후가 좋지 않기 때문에 HER2 단백질 표적 치료제 및 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측에 대한 연구가 꾸준히 진행되고 있다.
한편, 한국공개특허 제2022-0010871호에 FBXL16 유전자를 이용한 '전이성 유방암 진단 또는 예후 예측용 마커 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1888193호에 '유방암 전이 진단 지표로서의 혈중 페리오스틴'이 개시되어 있으나, 본 발명의 'HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측용 Copine1 유전자 마커 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 HER2 양성 유방암 세포(SK-BR3)와 내강 A 유형 유방암 세포(MCF-7)에 Copine1 유전자를 과발현시킨 후 세포의 침윤 분석을 수행하였다. 그 결과, HER2 양성 유방암 세포(SK-BR3)의 경우에는 Copine1 유전자를 과발현시켰을 때의 침윤된 세포의 수가 Copine1 유전자를 과발현시키지 않았을 때보다 현저히 증가하는 것을 확인한 반면, 내강 A 유형 유방암 세포(MCF-7)의 경우에는 Copine1 유전자를 과발현시켰을 때와 Copine1 유전자를 과발현시키지 않았을 때의 침윤된 세포의 수가 유의미한 차이가 없는 것을 확인하였다. 상기와 같은 결과를 통해 HER2 양성 유방암 특이적인 전이 예후 예측을 위한 바이오마커로서의 Copine1 유전자의 가능성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 Copine1 유전자를 유효성분으로 포함하는 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Copine1 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) HER2 양성 유방암 환자의 분리된 생물학적 시료로부터 Copine1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 발현되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; (2) 상기 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및 (3) 상기 발현 수준이 대조군 시료보다 높은 경우에 HER2 양성 유방암의 전이 위험성이 높다고 판단하는 단계;를 포함하는 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 HER2 양성 유방암의 전이를 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보 물질의 투여 후 Copine1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 HER2 양성 유방암의 전이 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 Copine1 단백질 발현 저해제를 유효성분으로 포함하는 HER2 양성 유방암의 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 Copine1 유전자 또는 이의 단백질은 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측을 위한 바이오마커로, Copine1 유전자 또는 이의 단백질의 발현 수준을 분석함으로써 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 HER2 양성 유방암 환자의 조직과 내강 A 유형 유방암 환자의 조직을 이용하여 Copine1 단백질에 대한 면역조직화학염색을 수행한 결과(A) 및 유방암 환자의 mRNA 발현 프로파일 데이타를 이용하여 Copine1 유전자의 mRNA 발현 수준을 비교한 결과(B)이다. Normal: 정상 조직(비종양 조직), 스케일 바(scale bar)=50 μm.
도 2는 HER2 양성 유방암 세포(SK-BR3) 및 내강 A 유형 유방암 세포(MCF-7)에 Copine1 유전자를 과발현시킨 후, Copine1 단백질의 발현을 확인한 결과(A) 및 세포의 침윤 분석을 수행한 결과(B, C)이다. GFP: 대조군, CPNE1: Copine1 유전자 과발현용 벡터 삽입군, 스케일 바(scale bar)=100 μm.
도 3은 HER2 양성 유방암 세포(SK-BR3) 및 내강 A 유형 유방암 세포(MCF-7)에 Copine1 유전자의 발현을 저해시킨 후, Copine1 단백질의 발현을 확인한 결과(A) 및 세포의 침윤 분석을 수행한 결과(B, C)이다. GFP: 대조군, CPNE1: Copine1 유전자 과발현용 벡터 삽입군, shCPNE1: Copine1 유전자 발현 저해용 벡터 삽입군, 스케일 바(scale bar)=100 μm.
도 2는 HER2 양성 유방암 세포(SK-BR3) 및 내강 A 유형 유방암 세포(MCF-7)에 Copine1 유전자를 과발현시킨 후, Copine1 단백질의 발현을 확인한 결과(A) 및 세포의 침윤 분석을 수행한 결과(B, C)이다. GFP: 대조군, CPNE1: Copine1 유전자 과발현용 벡터 삽입군, 스케일 바(scale bar)=100 μm.
도 3은 HER2 양성 유방암 세포(SK-BR3) 및 내강 A 유형 유방암 세포(MCF-7)에 Copine1 유전자의 발현을 저해시킨 후, Copine1 단백질의 발현을 확인한 결과(A) 및 세포의 침윤 분석을 수행한 결과(B, C)이다. GFP: 대조군, CPNE1: Copine1 유전자 과발현용 벡터 삽입군, shCPNE1: Copine1 유전자 발현 저해용 벡터 삽입군, 스케일 바(scale bar)=100 μm.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Copine1 유전자를 유효성분으로 포함하는 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 Copine1 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 상기 Copine1 유전자는 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기서열과 각각 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다. 또한, Copine1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, 용어 '전이(metastasis)'는 어떤 종양이 그 원발 부위에서 여러 경로를 따라 다른 신체의 부위에 이식되어 그곳에 정착 및 증식하는 상태를 말한다. 암의 전이 여부는 해당 암의 고유의 특성에 의하여 결정될 뿐만 아니라 암의 예후 결정에 있어서 가장 중요한 단서가 되는 사건이므로, 암 환자의 생존과 관련된 가장 중요한 임상정보로 다루어진다.
또한, 본 발명에서, 용어 '예후(prognosis)'는 HER2 양성 유방암 중증도의 증가 및 감소를 의미한다. 암 환자에 있어서 예후는 통상적으로 암 발병 또는 외과적 시술 후 일정기간 내에 전이 여부 또는 생존기간을 뜻한다. 예후의 예측은 특히 HER2 양성 유방암 환자의 화학치료 여부를 비롯하여 향후 치료의 방향에 대한 단서를 제시하는 것으로, 질환의 치료 후 환자의 생리적 또는 환경적 상태를 종합적으로 고려하여 치료 후 경과를 예측하는 모든 행위로 해석될 수 있다.
따라서, 본 발명의 목적상 상기 '전이 예후 예측'은 HER2 양성 유방암의 전이 여부를 미리 예상하여 HER2 양성 유방암 환자의 전이 위험성을 예측하는 것을 의미한다. 예를 들어, '예후가 좋다'고 예측하는 것은 HER2 양성 유방암 환자의 전이 위험성이 낮은 수준을 나타내어 HER2 양성 유방암 환자가 치료될 가능성이 높다는 것을 의미하고, '예후가 나쁘다'고 예측하는 것은 HER2 양성 유방암 환자의 전이 위험성이 높은 수준을 나타내어 HER2 양성 유방암 환자가 암이 전이되거나 재발하거나 또는 사망할 가능성이 높다는 것을 의미한다.
또한, 본 발명에서 'mRNA 발현 수준 측정'은, HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측을 위해 생물학적 시료에서 HER2 양성 유방암 전이 마커 유전자(Copine1)의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블롯팅(northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 Copine1 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 이에 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 상기 프라이머, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 Copine1 유전자의 염기서열(GenBank no.BC001142)을 참고하여, 당업계의 통상의 실시자가 공지된 방법, 프로그램 또는 툴을 이용하여 디자인할 수 있다.
본 발명에서, 용어 '프라이머'는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 Copine1 유전자의 염기서열에 결합할 수 있는 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 HER2 양성 유방암의 전이 예후를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명에서, 용어 '프로브'는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클로티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중연쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 Copine1 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 HER2 양성 유방암의 전이 예후를 예측할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
또한, 본 발명에서 '단백질의 발현 수준 측정'은, HER2 양성 유방암의 전이예후 예측을 위해 생물학적 시료에서의 HER2 양성 유방암 전이 마커 유전자(Copine1)에서 발현되는 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 통상적으로 단백질의 양을 확인함으로써 수행될 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 웨스턴 블랏(western blot), 방사선면역분석(radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(immunoprecipitation Assay), FACS(fluorescence activated cell sorting) 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 이에 한정되지는 않으나, 바람직하게는 Copine1 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체 또는 압타머일 수 있다.
본 발명에서, 용어 '항체'는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 Copine1 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 Copine1 항체는, Copine1 유전자의 전장 혹은 일부를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 Copine1 유전자의 전장 혹은 일부에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질을 면역원(항원)으로 사용하여 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 기능적인 단편도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 상기 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 ScFv 등이 있다.
본 발명에서, 용어 '압타머(aptamer)'는 안정된 삼차구조를 유지하면서 특정 분자에 특이적으로 강하게 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 특이적 결합을 하는 기능 때문에 항체와 비교되며 항체의 대체 기술로 평가되고 있다.
본 발명은 또한, 상기 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측용 조성물을 포함하는 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 Copine1 유전자의 mRNA 또는 이로부터 발현되는 단백질의 검출여부를 확인함으로써 HER2 양성 유방암의 전이 예후를 예측할 수 있다. 본 발명의 HER2 양성 유방암의 전이 예후를 예측하기 위한 키트에는 Copine1 유전자의 발현 수준을 검출하기 위한 제제(예컨대, 프라이머 또는 프로브) 또는 단백질을 특이적으로 검출할 수 있는 제제(예컨대, 항체 또는 압타머) 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명에서 Copine1 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 예측용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트가 Copine1 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 키트일 경우, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC(fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine B isothiocyanate) 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸벤지딘)가 사용될 수 있다.
본 발명은 또한,
(1) HER2 양성 유방암 환자의 분리된 생물학적 시료로부터 Copine1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 발현되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
(2) 상기 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(3) 상기 발현 수준이 대조군 시료보다 높은 경우에 HER2 양성 유방암의 전이 위험성이 높다고 판단하는 단계;를 포함하는 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명의 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 상기 대조군은 전이가 진행되지 않은 유방암 시료일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 생물학적 시료로부터 Copine1 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준 측정은, 생물학적 시료로부터 유전자의 mRNA 또는 단백질을 분리하여 측정될 수 있고, 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 분리 방법은 당업계의 공지된 방법을 이용하여 수행할 수 있다.
본 발명에서 용어 '생물학적 시료'란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않으며, 상기 생물학적 시료는 조작하거나 조작하지 않은 상태로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 상기 HER2 양성 유방암 환자의 분리된 생물학적 시료로부터 측정된 Copine1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 발현되는 단백질의 발현 수준이 대조군 시료에서 측정된 Copine1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 발현되는 단백질의 발현 수준보다 높은 경우, HER2 양성 유방암 환자를 전이 위험성이 높다고 판단할 수 있다.
본 발명은 또한, HER2 양성 유방암의 전이를 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보 물질의 투여 후 Copine1 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 HER2 양성 유방암의 전이 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
구체적으로, HER2 양성 유방암 전이 억제제 후보 물질의 존재 및 부재 하에서 Copine1 유전자 또는 Copine1 단백질의 발현 수준의 변화(증가 또는 감소)를 비교하는 방법으로 HER2 양성 유방암 전이 억제제를 스크리닝할 수 있고, 바람직하게는 Copine1 유전자 또는 Copine1 단백질의 발현 수준을 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 HER2 양성 유방암의 전이 억제제로서 선택할 수 있다. 즉, HER2 양성 유방암 전이 억제제 후보 물질의 부재 하에 HER2 양성 유방암 환자의 생물학적 시료에서 본 발명의 Copine1 유전자 또는 Copine1 단백질의 발현 수준을 측정하고, 또한 HER2 양성 유방암 전이 억제제 후보 물질의 존재하에서 본 발명의 Copine1 유전자 또는 Copine1 단백질의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, HER2 양성 유방암 전이 억제제 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 Copine1 유전자 또는 Copine1 단백질의 발현 수준이 HER2 양성 유방암 전이 억제제 후보 물질의 부재 하에서의 발현 수준보다 감소시키는 물질을 HER2 양성 유방암의 전이 억제제로 예측할 수 있는 것이다.
본 발명은 또한, Copine1 단백질 발현 저해제를 유효성분으로 포함하는 HER2 양성 유방암의 전이 억제용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 HER2 양성 유방암의 전이 억제용 약학 조성물에 있어서, 상기 Copine1 단백질 발현 저해제는 Copine1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, dsRNA, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA) 또는 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA)일 수 있고, Copine1 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 또는 천연물일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 면역조직화학염색을 통한 Copine1 단백질 발현 비교
본 발명에서는 한국종양조직은행(화순, 대한민국)에서 유방암 환자의 조직을 기증받아 사용하였다. HER2 양성 유방암 환자의 조직 샘플 11개와 내강 A 유형 유방암 환자의 조직 샘플 11개를 이용하여 Copine1(CPNE1) 단백질에 대한 면역조직화학염색을 수행하였다. 각 유방암 조직을 0.3% H2O2에 넣고 30분 동안 반응시키고, 블로킹 버퍼(5% FBS, 0.3% Triton X-100)에 넣고 반응시킨 후, 항-CPNE1 항체(1:100, Santa Cruz Biotechnology, USA)를 이용하여 4℃에서 밤새 반응시켰다. 이후, 바이오틴화된 2차 항체 및 스트렙타비딘(Vector Laboratories, USA)으로 반응시킨 후, 디아미노빈지딘 및 H2O2를 이용하여 발색을 유도하고, 광학현미경(ECLIPSE E600 POL; Nikon, Japan)을 이용하여 사진을 촬영하여 Copine1 단백질의 발현을 확인하였다.
2. TCGA 데이타를 이용한
Copine1
유전자의 mRNA 발현 비교
유방암 환자의 mRNA 발현 프로파일 데이타를 TCGA 데이타베이스(http://firebrowse.org/?cohort=BRCA&download_dialog=true)로부터 다운로드받아 사용하였다. 총 526개의 유방암 조직과 61개의 정상 조직(비종양 조직)의 mRNA 발현 프로파일 데이타를 Agilent 244K custom gene expression platform(G4502A-07-3; Agilent, USA)을 이용하여 정렬한 후, Quantile 정규화하고 t-검정을 통해 전체 유방암 조직과 정상 조직에서의 Copine1 유전자의 mRNA 발현 수준을 비교하였다.
3. 벡터 구축
Copine1(CPNE1) 유전자 과발현용 벡터를 구축하기 위하여 Copine1 유전자의 cDNA 서열(GenBank no.BC001142)을 게이트웨이 클로닝 시스템(Thermo Fisher, USA)을 이용하여 pDEST-Ad-GFP(pDEST-adenovirus-green fluorescent protein) 벡터에 삽입하여 Copine1 유전자 과발현용 벡터(pDEST-Ad-GFP-CPNE1)를 제조하였다.
또한, Copine1 유전자를 표적으로 하는 특이적인 shRNA(5'-CGCTTTGGAATCTATGACATA-3': 서열번호 3) 서열을 pDEST-Ad-GFP 벡터 골격 앞쪽에 삽입하여 Copine1 유전자 발현 저해용 벡터(pDEST-Ad-shCPNE1)를 제조하였다.
4. 세포 배양
사람 유방암 세포주인 SK-BR3 및 MCF-7(표 1)을 한국세포주은행에서 구입하여 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium) 배지에서 37℃, 5% CO2 조건으로 배양하여 실험에 사용하였다.
| cell line | molecular characteristics | subtype |
| SK-BR3 | ER-, PR-, HER2+ | HER2 positive (HER2 양성) |
| MCF-7 | ER+, PR+, HER2- | Luminal A (내강 A) |
(ER: estrogen receptor, PR: progesterone receptor, HER2: human epidermal growth factor receptor 2.)
5. 세포내 벡터 주입
유방암 세포에 Copine1 유전자를 과발현시키거나 발현을 저해시키기 위하여 아데노바이러스(adenovirus)를 이용한 트랜스펙션을 수행하였다. 아데노바이러스는 ViraPower™ Adenoviral Expression System(Thermo Fisher Scientific)을 이용하여 293A 세포(Korean Cell Line Bank, Korea)에서 증식시켰고, pDEST-Ad-GFP 벡터, pDEST-Ad-GFP-CPNE1 벡터 또는 pDEST-Ad-shCPNE1 벡터를 293A 세포에 각각 트랜스펙션시키고 10일 후, 아데노바이러스 입자를 회수하였다. 6웰 플레이트에 유방암 세포를 1×105 세포/㎖로 접종하고 MOI(multiplicity of infection)가 100이 되도록 아데노바이러스를 트랜스펙션시키고 37℃에서 48시간 동안 배양하였다.
6. 세포의 침윤 분석
유방암 세포의 침윤(invasion)은 트랜스웰 챔버(transwell chamber, 8 μm pore size; BD Biosciences, USA)를 이용하여 분석하였다. 아래쪽 챔버에는 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 넣고, 위쪽 챔버에는 혈청이 첨가되지 않은 DMEM 배지에 5×105의 세포를 현탁시켜 넣었다. 48시간 후, 아래쪽 챔버로 이동한 세포를 메탄올로 고정시키고 0.2% 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색한 후 광학 현미경(IX71; Olympus, Japan)을 이용하여 침윤된 세포의 수를 측정하였다.
실시예 1. 유방암 환자에서의 Copine1 발현 확인
HER2 양성 유방암 환자의 샘플 11개와 내강 A 유형 유방암 환자의 샘플 11개를 이용하여 Copine1 단백질에 대한 면역조직화학염색을 수행한 결과, 정상 조직(비종양 조직) 대비 HER2 양성 유방암 환자 또는 내강 A 유형 유방암 환자의 유방암 조직에서의 Copine1 단백질이 높게 발현되는 것을 확인하였다(도 1A).
또한, 유방암 환자의 mRNA 발현 프로파일 데이타(출처: TCGA 데이타베이스)를 이용하여 유방암 조직과 정상 조직에서의 Copine1 유전자의 mRNA 발현 수준을 비교한 결과, 정상 조직 대비 전체 유방암 환자의 조직에서의 Copine1 유전자의 mRNA의 발현 수준이 약 2.35배로 과발현되어 있는 것을 확인하였다(도 1B).
실시예 2.
Copine1
유전자 과발현시 세포의 침윤 분석
HER2 양성 유방암 세포(SK-BR3)와 내강 A 유형 유방암 세포(MCF-7)에 Copine1 유전자를 각각 과발현시킨 후, Copine1 단백질의 발현을 확인하였고, 세포의 침윤 분석을 수행하였다.
그 결과, Copine1 유전자를 과발현시킨 HER2 양성 유방암 세포(SK-BR3)와 내강 A 유형 유방암 세포(MCF-7)에서의 Copine1 단백질의 발현양은 대조군 대비 증가하는 것을 확인하였다(도 2A).
또한, HER2 양성 유방암 세포(SK-BR3)의 경우, Copine1 유전자를 과발현시켰을 때의 침윤된 세포의 수가 Copine1 유전자를 과발현시키지 않았을 때보다 현저히 증가하는 것을 확인하였다(도 2B). 반면, 내강 A 유형 유방암 세포(MCF-7)의 경우, Copine1 유전자를 과발현시켰을 때와 Copine1 유전자를 과발현시키지 않았을 때의 침윤된 세포의 수는 유의미한 차이가 없는 것을 확인하였다(도 2C).
실시예 3.
Copine1
유전자의 발현 저해시 세포의 침윤 분석
HER2 양성 유방암 세포(SK-BR3)와 내강 A 유형 유방암 세포(MCF-7)에 Copine1 유전자의 발현을 각각 저해시킨 후, Copine1 단백질의 발현을 확인하였고, 세포의 침윤 분석을 수행하였다.
그 결과, Copine1 유전자의 발현을 저해시킨 HER2 양성 유방암 세포(SK-BR3)와 내강 A 유형 유방암 세포(MCF-7)에서의 Copine1 단백질의 발현양은 대조군 대비 감소하는 것을 확인하였다(도 3A).
또한, HER2 양성 유방암 세포(SK-BR3)의 경우, Copine1 유전자의 발현을 저해시켰을 때의 침윤된 세포의 수가 Copine1 유전자를 과발현시켰을 때보다 현저히 감소하는 것을 확인하였다(도 3B). 반면, 내강 A 유형 유방암 세포(MCF-7)의 경우, Copine1 유전자를 과발현시켰을 때와 Copine1 유전자의 발현을 저해시켰을 때의 침윤된 세포는 차이가 없는 것을 확인하였다(도 3C).
상기 결과를 바탕으로, HER2 양성 유방암 세포내 Copine1 유전자의 발현양이 높은 경우에는 암세포의 침윤이 증가함으로써 전이 위험성이 높다고 판단할 수 있으며, 이는 내강 A 유형 유방암 세포에는 적용되지 않는 것을 알 수 있었다.
Claims (12)
- Copine1 유전자를 유효성분으로 포함하는 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측용 바이오마커 조성물.
- Copine1 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것인 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 압타머를 포함하는 것인 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측용 조성물.
- 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측용 키트.
- 제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측용 키트.
- (1) HER2 양성 유방암 환자의 분리된 생물학적 시료로부터 Copine1 유전자의 mRNA 또는 상기 유전자로부터 발현되는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
(2) 상기 발현 수준을 대조군 시료와 비교하는 단계; 및
(3) 상기 발현 수준이 대조군 시료보다 높은 경우에 HER2 양성 유방암의 전이 위험성이 높다고 판단하는 단계;를 포함하는 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법. - 제7항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준 측정은 RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real time quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 노던 블롯팅(northern blotting), 또는 DNA 칩을 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준 측정은 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 웨스턴 블랏(western blot), 방사선면역분석(radioimmunoassay, RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(immunoprecipitation Assay), FACS(fluorescence activated cell sorting) 또는 단백질 칩(protein chip)을 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 HER2 양성 유방암의 전이 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법.
- HER2 양성 유방암의 전이를 억제할 수 있을 것으로 예상되는 후보 물질의 투여 후 Copine1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 HER2 양성 유방암의 전이 억제제의 스크리닝 방법.
- Copine1 단백질 발현 저해제를 유효성분으로 포함하는 HER2 양성 유방암의 전이 억제용 약학 조성물.
- 제11항에 있어서, 상기 Copine1 단백질 발현 저해제는 Copine1 단백질에 대한 항체, Copine1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 dsRNA, siRNA, shRNA 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 HER2 양성 유방암의 전이 억제용 약학 조성물.
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