CN111910005B - Cdk4/6抑制剂敏感性相关基因及其应用 - Google Patents

Cdk4/6抑制剂敏感性相关基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了CDK4/6抑制剂敏感性相关基因及其应用，具体涉及S6K在预测乳腺癌患者对CDK4/6抑制剂的敏感性方面的应用。本发明还公开了S6K在预测乳腺癌患者预后方面的应用。同时还公开了相关试剂、试剂盒。另外，本发明还公开了用于提高乳腺癌患者对CDK4/6抑制剂敏感性的方法和药物，上述研究成果为临床治疗乳腺癌提供了新的策略和思路。

Description

CDK4/6抑制剂敏感性相关基因及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及CDK4/6抑制剂敏感性相关基因及其应用，具体涉及S6K在预测乳腺癌患者对CDK4/6抑制剂的敏感性方面的应用。
背景技术
乳腺癌是中国和世界范围内女性最常见的恶性肿瘤。激素受体阳性(HR+)人表皮生长因子受体2阴性(HER2-)是最常见的亚型，占转移性乳腺癌(MBC，Metastatic breastcancer)的65％。细胞周期蛋白依赖性激酶4和6(CDK4/6)抑制剂，包括Palbociclib(帕博西尼)，ribociclib(瑞博西尼)和abemaciclib(阿贝西利)，可显著改善HR+HER2-转移性乳腺癌患者的无进展生存期(PFS)和总体生存期(OS)。因此，CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗已成为大多数HR+HER2-转移性乳腺癌患者首选的一线和二线治疗方法。
然而，耐药性的存在降低了这些患者从CDK4/6抑制剂治疗中获益。一部分患者没有从CDK4/6抑制剂中获得任何益处，通常在三个月内改用其他疗法，这被定义为先天性耐药。许多其他患者在临床从治疗中受益后对CDK4/6抑制剂产生耐药性，这被定义为获得性耐药。与CDK4/6抑制剂相关的耐药机制尚未得到全面理解。CDK4/6抑制剂的预测生物标志物，唯一确定的是雌激素受体阳性。
S6K是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，能够促进细胞增殖和代谢调节。S6K的耐药性研究非常有限。S6K基因与CDK4/6抑制剂耐药性的关系尚不清楚。
本研究利用包含1021个癌症相关基因的panel，分析了HR+HER2-MBC严重预处理患者对CDK4/6抑制剂联合内分泌治疗的临床耐药性。本研究首次揭示了S6K扩增与CDK4/6抑制的先天性耐药相关。
发明内容
根据本发明的一个方面，本发明提供了检测分子标志物的试剂在制备预测乳腺癌患者对CDK4/6抑制剂的敏感性的产品或预测乳腺癌患者预后的产品中的应用。
进一步，所述检测分子标志物的试剂包括检测样品中分子标志物的表达量的试剂。
更进一步，所述检测样品中分子标志物的表达量的试剂包括能够定量样品中分子标志物mRNA的试剂，和/或能够定量样品中分子标志物编码蛋白的试剂。
本发明的定量样品中mRNA的试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
在本发明的具体实施方案中，所述分子标志物是S6K。
进一步，所述试剂包括与S6K基因结合的核酸。
包含在上述试剂中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
更进一步，所述核酸包括实时定量PCR中使用的特异扩增S6K基因的引物。
引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
如本文使用的，术语“引物”是指具有短的游离3′-末端羟基的核酸序列，其是短的核酸序列，可以与互补模板形成碱基对并用作模板链复制的起始点。在合适的缓冲液在合适的温度在存在用于聚合的试剂(例如，DNA聚合酶或反转录酶)和四种三磷酸核苷的情况下，引物可以起始DNA合成。PCR条件和有义和反义引物的长度可以根据本领域中已知技术适当选择。
上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
在本文使用的术语“基因”指编码功能蛋白质、多肽或者肽的单元。如本领域的技术人员所理解的，这一功能性的术语包括两个基因组序列、cDNA序列或者其片段或组合，以及基因的产物，包括可以经人工改变的那些。经纯化的基因、核酸、蛋白质等等用于指从至少一种通常与其相关的污染核酸或者蛋白质中鉴定并分离出来的这些实体。术语“等位基因”或者“等位基因形式”指编码同样的功能性蛋白的基因的可选择的形式，但是含有与同一基因的其他形式相关的核苷酸序列上的差异。
如本文所使用的，“核酸”或者“核酸分子”指多核苷酸，如脱氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、由聚合酶链式反应(PCR)所产生的片段以及通过任意的连接、剪切、核酸内切酶和核酸外切酶活动产生的片段。核酸分子可以由天然产生的核苷酸的单体组成(例如DNA和RNA)，或者由天然产生的核苷酸的类似物组成(例如天然产生的核苷酸的α-对映体形式)，或者两者的组合组成。经修饰的核苷酸可以在糖部分和/或在嘧啶或者嘌呤碱基部分上有改变。糖的修饰包括，例如将一个或者多个羟基以卤素、烷基、胺和叠氮基团替代，或者可以将糖功能化成为醚或者酯。除此之外，整个的糖部分可以用空间上和电子上类似的结构替换，如阿扎糖以及碳环的糖类似物。在碱基部分上修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰化的嘌呤和嘧啶或者其他公知的杂环替代物。核酸单体可以通过磷酸二酯键或者该连接的类似物进行连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸酯(phosphorodiselenoate)、phosphoroanilothioate、phosphoranilidate、氨基磷酸酯等等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其包括连接到聚酰胺骨架上的天然产生的或者经修饰的核酸碱基。核酸可以是单链的或者双链的。
本发明的定量样品中分子标志物编码蛋白通过抗原-抗体反应测量。更特别是，抗原-抗体反应可以根据本领域已知的定量或定性免疫测定方案进行。免疫测定形式可以包括，但不限于，酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、夹心测定、蛋白质印迹、免疫沉淀、免疫组织化学染色、流式细胞术、荧光辅助的细胞分选(FACS)、酶底物显色测定和抗原-抗体聚集。
作为实例，本发明的定量样品中分子标志物编码蛋白的试剂包括特异性结合分子标志物编码蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的定量样品中分子标志物编码蛋白的试剂可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的分子标志物蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对分子标志物蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
作为依照本发明的检测方法中使用的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液。
在本发明的具体实施方案中，所述样品来源于血液。更具体地，所述样品来源于血浆。
根据本发明的另一个方面，本发明还提供了一种预测乳腺癌患者对CDK4/6抑制剂的敏感性的产品或预测乳腺癌预后的产品，所述产品包括检测样品中S6K的试剂。
上述产品可用于检测样品中S6K的表达量。
在其中一个实施例中，该产品包括检测样品中S6K编码mRNA试剂。这样的产品可用于检测样品中mRNA的含量，该检测可以为定量检测、半定量检测或定性检测均可。
进一步，本发明的产品可以是试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用前面所述试剂的高通量测序平台。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种预测乳腺癌患者对CDK4/6抑制剂的敏感性的方法，所述方法包括将S6K作为检测的靶目标，当乳腺癌患者体内S6K高表达时，预测乳腺癌患者对CDK4/6抑制剂具有耐药性；当乳腺癌患者体内S6K低表达时，预测乳腺癌患者对CDK4/6抑制剂具有敏感性。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种预测乳腺癌患者预后的方法，所述方法包括将S6K作为检测的靶目标，当乳腺癌患者体内S6K高表达时，预测乳腺癌患者预后不良；当乳腺癌患者体内S6K低表达时，预测乳腺癌患者预后良好。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种提高乳腺癌患者对CDK4/6抑制剂的敏感性的方法，所述方法包括将S6K作为靶目标，抑制S6K表达，以提高乳腺癌患者对CDK4/6抑制剂的敏感性。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种改善乳腺癌患者预后的方法，所述方法包括将S6K作为靶目标，抑制S6K表达，以改善乳腺癌患者预后。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了S6K在制备提高乳腺癌患者对CDK4/6抑制剂敏感性的药物或改善乳腺癌患者预后的药物中的应用。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了抑制S6K的试剂在制备提高乳腺癌患者对CDK4/6抑制剂敏感性的药物或改善乳腺癌患者预后的药物中的应用。
优选地，所述试剂包括抑制S6K表达或抑制S6K活性的试剂。
更优选地，所述抑制S6K表达的试剂包括反义核酸、dsRNA、核酶、适体、S6K结合蛋白片段、或抗体或其片段。
“dsRNA”指含有双链RNA结构，通过RNA干扰(RNAi)来抑制基因表达的RNA，包括siRNA(短干扰RNA)和shRNA(短发夹RNA)。dsRNA不需要与靶基因序列具有100％的同源性，只要它可抑制靶基因表达即可。为了稳定化或其它目的，可以将dsRNA的一部分用DNA替代。优选的是，siRNA是21-23个碱基的双链RNA。siRNA可以通过本领域技术人员公知的方法来制备，例如通过化学合成或作为天然存在RNA的类似物。shRNA是具有发夹转角(hairpinturn)结构的短链RNA。shRNA可以通过本领域技术人员公知的方法来制备，例如通过化学合成或通过将编码shRNA的DNA引入细胞并表达DNA。
更优选地，所述抑制S6K活性的试剂包括抑制S6K上游蛋白分子活性的试剂、抑制S6K蛋白活性的试剂、抑制S6K下游蛋白分子活性的试剂。
进一步，所述抑制S6K蛋白活性的试剂包括LY2584702、PF-4708671。
进一步，所述抑制S6K上游蛋白分子活性的试剂包括Everolimus(依维莫司)、雷帕霉素。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括抑制S6K的试剂、CDK4/6抑制剂。
进一步，所述抑制S6K的试剂包括所述试剂包括抑制S6K表达或抑制S6K活性的试剂；
优选地，抑制S6K表达的试剂包括反义核酸、dsRNA、核酶、适体、S6K结合蛋白片段、或抗体或其片段。
优选地，抑制S6K活性的试剂包括抑制S6K上游蛋白分子活性的试剂、抑制S6K蛋白活性的试剂、抑制S6K下游蛋白分子活性的试剂；
更优选地，所述抑制S6K蛋白活性的试剂包括LY2584702、PF-4708671；
更优选地，所述抑制S6K上游蛋白分子活性的试剂包括Everolimus、雷帕霉素。
进一步，所述CDK4/6抑制剂包括Palbociclib、ribociclib、abemaciclib。
在本发明的具体实施方案中，所述药物组合物包括Palbociclib、PF-4708671。
在本发明的具体实施方案中，所述药物组合物包括Palbociclib和Everolimus。
本发明的抑制S6K表达的试剂可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的抑制S6K表达的试剂可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把抑制S6K表达的试剂进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的抑制剂施用于人，其中口服安全有效量通常至少约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
本发明的药物的施用途径不受限制，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。
在本发明中，“预后”是指癌症患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过程或结果。在本说明书中，预后可以是通过手术处理抑制或缓解肿瘤生长后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检测S6K基因来预测。预后预测可以这样进行：根据S6K的有或无，或者升高或降低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。
在本发明中，“预后良好”是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解肿瘤生长之后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。或者，预后好可以意指在这样长时间内存活、无转移、无复发、或无再发。例如，预后良好可以意指至少3年或尤其是至少5年存活，优选没有转移或复发。预后良好最优选的状态是长期无疾病的存活。如本文中所使用的，“预后良好”还可以包括任何这样的状态，其中可以发现疾病如转移，但是恶性低且不严重地影响生存能力。
在本发明中，“预后不良”是指患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的短时期(例如1、2、3、4、5年或更短)内发生致命状况。或者，预后差是指在这样的短时期里死亡、转移、复发、或再发。例如，预后差可以意指至少3年或尤其至少5年内复发、转移、或死亡。
预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，本发明中S6K的水平升高的患者中，与不显示该特征的患者相比，更有可能观察到特定过程或结果。
附图说明
图1显示血浆中检测到的高频分子变化情况的结果图；
图2显示S6K表达情况的结果图，其中，A：散点图；B：分类图；
图3显示S6K表达与乳腺癌患者预后相关性分析图，其中，A：全部乳腺癌患者；B：ER+亚型乳腺癌患者；
图4显示乳腺癌细胞中S6K表达情况的结果图，其中，A：4种乳腺癌细胞中S6K mRNA水平；B：4种细胞中S6K蛋白水平；C：50种乳腺癌细胞中S6K表达；
图5显示乳腺癌细胞对Palbociclib的敏感性结果图，其中，A：T47D；B：MCF7；
图6显示S6K表达对乳腺癌细胞活力的影响的结果图，其中：A：S6K过表达对细胞活力的影响；B：抑制S6K表达对细胞活力的影响；C：S6K过表达在mRNA水平检测；D：S6K过表达在蛋白水平上检测；E：抑制S6K表达在mRNA水平检测；F：抑制S6K表达在蛋白水平检测；
图7显示PDO模型对药物反应性的结果图，其中，A：Palbociclib；B:Everolimus；C：PF-4708671；
图8显示药物对细胞活力影响的结果图，其中，A：Palbociclib+PF-4708671；B:Palbociclib+Everolimus；
图9显示药物反应矩阵图，A：palbociclib+PF-4708671；B：Palbociclib+everolimus；
图10显示协同热图，其中，A：palbociclib+PF-4708671；B：Palbociclib+everolimus。
具体的实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。下述实施例中，若非特意表明，所用的试剂均为分析纯，所用试剂均可从商业渠道获得。文中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著的科学出版社2002年出版的《分子克隆实验指南》一书中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。
实施例1与Palbociclib耐药性相关的标志物筛选
1、样本来源与方法
2016年5月至2019年11月，连续到中国医学科学院肿瘤医院就诊的患者186例，均采用Palbociclib治疗。36名患者同意在治疗开始前保留血液样本进行基因检测，并纳入了这项研究。血液样本是在获得适当书面知情同意的情况下从机构肿瘤库获得的。活检采集和分析经中国医学科学院肿瘤研究所和医院伦理委员会批准(12-123/657)。CT扫描是在中国医学科学院肿瘤医院使用标准程序进行的，作为患者常规临床护理的一部分。RECIST1.1测量由接受过肿瘤测量学正式培训的医生进行。PFS被定义为从开始服用Palbociclib到疾病进展日期的时间，由医生根据放射学信息确定。临床获益被定义为开始服用Palbociclib后PFS>3个月，而先天性耐药被定义为PFS≤3个月。采用Fisher精确检验对患者的基线特征进行分类和比较。
应用包含1021个癌症相关基因的panel，对36例MBC患者的血浆DNA进行测序和生物信息学分析。在不了解临床信息的情况下进行基因表达分析。样品制备按照实验室流程和制造商协议进行。DNA提取、文库制备、杂交捕获和测序如参考文献所述(Ma F,Guan Y,YiZ,et al:Assessing tumor heterogeneity using ctDNA to predict and monitortherapeutic response in metastatic breast cancer.Int J Cancer 146:1359-1368,2020)。对于t检验和Fisher精确检验，P值<0.05被认为具有统计学意义。使用GraphPadPrism(GraphPad软件)进行统计分析。
2、结果
为了评估肿瘤和血浆中检测到的分子改变之间的一致性，利用包含1021个癌症相关基因的panel对71例乳腺癌患者队列的基因进行了测序。分析了48例肿瘤组织与配对的正常外周血DNA的拷贝数改变、突变和结构变异。在血浆中检测到的分子变化很好地反应了肿瘤组织状态[Zhou Y,Xu Y,Gong Y,et al:Clinical factors associated withcirculating tumor DNA(ctDNA)in primary breast cancer.Mol Oncol 13:1033-1046,2019]。
对36例HR+HER2-MBC患者接受Palbociclib联合内分泌治疗后的52份连续血浆标本进行ctDNA分析。临床特征总结见表1。半数患者接受Palbociclib联合fulvestrant治疗，10例(27.8％)接受Palbociclib联合来曲唑治疗，5例(13.9％)接受依西美坦治疗，3例(8.3％)接受阿那曲唑治疗。只有4例(11.1％)患者接受了以CDK4/6抑制剂为基础的治疗作为其转移性疾病的一线治疗。有19例(52.8％)接受过三种以上的全身治疗。32例经Palbociclib治疗后取得进展，其余3例仍在治疗中。共有15名患者从CDK4/6抑制剂中获益，并在开始治疗后3个月以上出现了病情进展。同时，20例患者对Palbociclib产生先天性耐药(PFS≤3个月)。有1例患者在治疗4周后由于严重的骨髓抑制而停药，因此无法评估Palbociclib的耐药性。两组患者的临床和病理特征无显著性差异(表1)。
在至少三名基线时具有先天性耐药的患者中观察到了S6K突变，但在那些临床受益的患者中没有观察到(图1)。有趣的是，在3例先天Palbociclib耐药患者中观察到S6K扩增(阈值＝2.5拷贝数)，提示S6K是一种新的候选耐药机制。在临床受益的患者中未发现S6K基因变异。使用cBioPortal对数据进行Meta分析表明，S6K拷贝数变异在乳腺癌患者中很常见(11％，图2A)。在ER+HER2-MBC患者样本中，S6K基因座大量扩增。S6K拷贝数变化与S6K的表达显著相关(图2B)。Kaplan-Meier Plotter显示S6K基因高表达的患者预后明显较差(图3)。
表1临床特征信息表
Figure BDA0002639746700000121
Figure BDA0002639746700000131
实施例2体外细胞实验研究S6K表达对Palbociclib耐药的影响
1、方法
1.1细胞系和抑制剂
MCF7和T47D细胞均由国家分子肿瘤重点实验室保存，在添加10％FBS的DMEM中培养。
Palbociclib(HYA0065)、Fulvestrant(HY13636)、PF-4708671(HY15773)从MCE购买。
1.2siRNA干扰S6K表达
在无血清细胞培养液中用脂质体(Invitgen)和25nm siRNA(Ribo)逆转染细胞，6h后将细胞接种于10％DMEM-FBS中。
siRNA由锐博生物合成，针对s6K的siRNA具体序列如下：
si-s6K-1(针对s6K的siRNA-1)
正义链：5’-GAUGAGAAGUGGCCACAAUtt-3’(SEQ ID NO.1)；
反义链：5’-AUUGUGGCCACUUCUCAUCtt-3’(SEQ ID NO.2)；
靶序列为：5’-GATGAGAAGTGGCCACAAT-3’(SEQ ID NO.7)
si-s6K-2(针对s6K的siRNA-2)
正义链：5’-GGACGCUGGAGAAGUUGAAtt-3’(SEQ ID NO.3)；
反义链：5’-UUGAACUUCUCCAGCGUCCtt-3’(SEQ ID NO.4)；
靶序列为：5’-GGACGCTGGAGAAGTTCAA-3’(SEQ ID NO.8)
si-s6K-3(针对s6K的siRNA-3)
正义链：5’-GAGUUGGACCAUAUGAACUtt-3’(SEQ ID NO.5)；
反义链：5’-AGUUCAUAUGGUCCAACUCtt-3’(SEQ ID NO.6)；
靶序列为：5’-GAGTTGGACCATATGAACT-3’(SEQ ID NO.9)
阴性对照序列为通用阴性对照，由锐博生物提供。
1.3慢病毒介导S6K过表达
将S6K编码序列插入慢病毒载体中，之后用293T细胞包装慢病毒，收集细胞培养上清。将上清液按1：1的比例加入T47D细胞培养基中，6h后换成新鲜培养基，48h后加入嘌呤进行筛选。
1.4IC50试验
取对数生长期细胞，96孔板每孔取3000～5000个细胞进行培养。细胞贴壁后改为梯度浓度药物培养。对照细胞长满后，用CCK8试剂盒检测。
2、结果
采用T47D、MCF-7、MDA-MB-468和MDA-MB-231细胞株检测S6K在乳腺癌细胞中的表达。其中，MCF-7细胞中的S6K在mRNA和蛋白水平的表达量均最高(图4A和图4B)。与上述结果一致，在50多个乳腺癌细胞系中，MCF-7中S6K mRNA的表达显著升高，这是由于拷贝数扩增导致的(图4C)。
S6K扩增细胞系MCF-7对Palbociclib的敏感性低于T47D细胞(图5)。利用RNAi在MCF-7细胞中敲除S6K(图6E-F)。用两个独立的siRNAs敲除S6K能使MCF-7细胞恢复对Palbociclib的敏感性，细胞活力降低(图6B)。在慢病毒感染表达外源性S6K的T47D细胞中也得到了类似的结果(图6A、6C、6D)。这些结果表明S6K过表达促进ER+/HER2-细胞对Palbociclib的耐药性。
实施例3类器官研究S6K表达对Palbociclib耐药的影响
1、患者衍生的类器官模型构建
乳腺癌类器官是使用先前描述的培养方法衍生的[参考文献：Sachs N,de LigtJ,Kopper O,et al:A Living Biobank of Breast Cancer Organoids Captures DiseaseHeterogeneity.Cell 172:373-386.e10,2018]。简而言之，乳腺癌组织取自临床研究中同意的患者(NCT03544047)。用剪刀将组织切碎，并在胶原酶(Sigma-Aldrich，1mg/ml)和Dispase(Sigma-Aldrich，1mg/ml)的酶混合物中于37℃消化1-2小时。将解离的乳腺癌细胞与降低生长因子的基质胶(Corning)混合，并在37℃的培养板上接种30分钟。细胞悬浮液/基质胶的固化混合物表面用完全的乳腺类器官介质密封，该介质由Advanced DMEM/F12组成，并补充有Sachs等人[参考文献：Sachs N,de Ligt J,Kopper O,et al:A LivingBiobank of Breast Cancer Organoids Captures Disease Heterogeneity.Cell 172:373-386.e10,2018]所描述的系列添加剂。使用TrypLE(Gibco)每两周消化一次乳腺癌类器官。解离的类器官可进行传代或化合物评估。
乳腺癌类器官用基质凝胶包被于96孔板中2天，然后用稀释的Palbociclib单独或联合mTOR抑制剂，S6K抑制剂，PI3Kα抑制剂或CDK2/5抑制剂治疗96小时。用CellTiter-Glo法(Promega)测定细胞活力。另外，通过剂量反应矩阵评估了palbociclib联合S6K抑制剂或mTOR抑制剂的协同作用。使用R中的SynergyFinder软件包计算极乐协同得分并进行绘图。
2、结果
KOBR-011PDO模型对Palbociclib耐药，对单药Everolimus(mTOR抑制剂)或PF-4708671(S6K抑制剂)反应有限，IC50分别>10μM、743nM和493nM(图7)。Everolimus或PF-4708671存在时，量效曲线明显左移，IC50明显降低(图8)。分别加入41nM、123nM、370nM和1111nM的PF-4708671，其IC50分别降至546nM、122nM、67nM和21nM。分别加入14nM、41nM、123nM和370nM的Everolimus，其IC50分别降至3110nM、995nM、325nM和41nM。用Bliss法对不同剂量水平的联合用药反应进行定量分析。图9显示3倍稀释方案中6种浓度的Palbociclib和6种浓度的Everolimus或PF4708671之间的剂量-反应矩阵。协同热图显示，在较宽的药物组合比例范围内，Palbociclib与Everolimus或PF-4708671联用对抑制细胞增殖具有协同作用(模型图中的红色区域)(图10)。Palbociclib与PF-4708671或Everolimus联合应用的平均协同分数分别为7.1和11.6。提示Palbociclib与PF-4708671或Everolimus对S6K扩增的乳腺癌PDO有协同作用。
以上数据表明，Palbociclib和S6K抑制剂在乳腺癌类器官中具有协同作用。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 中国医学科学院肿瘤医院
<120> CDK4/6抑制剂敏感性相关基因及其应用
<141> 2020-08-19
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gaugagaagu ggccacaaut t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
auuguggcca cuucucauct t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggacgcugga gaaguugaat t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
uugaacuucu ccagcgucct t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaguuggacc auaugaacut t 21
<210> 6
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aguucauaug guccaacuct t 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gatgagaagt ggccacaat 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggacgctgga gaagttcaa 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gagttggacc atatgaact 19

Claims (7)

1.检测S6K表达水平的试剂在制备预测乳腺癌患者对CDK4/6抑制剂的敏感性的产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CDK4/6抑制剂包括Palbociclib、ribociclib、abemaciclib。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括与S6K基因结合的核酸或与S6K蛋白结合的物质。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述核酸包括扩增S6K基因的引物。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述物质包括与S6K蛋白特异性结合的抗体。
6.抑制S6K表达水平的试剂在制备提高乳腺癌患者对CDK4/6抑制剂敏感性的药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抑制S6K表达水平的试剂包括反义核酸、dsRNA、核酶、适体、S6K结合蛋白片段、抗体或抗体片段。
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Cdk4 and Cdk6 Couple the Cell-Cycle Machinery to Cell Growth via mTORC1;Gianluca Figlia等;《Cell Reports》;20200430;第31卷(第2期);第2页右栏第4段 *
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