CN106834496B - Pnliprp3基因及其表达产物在舌鳞癌诊治中的应用 - Google Patents

Pnliprp3基因及其表达产物在舌鳞癌诊治中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了PNLIPRP3基因可以作为舌鳞癌诊断的分子标志物，本发明的实验证明：与正常组织相比，PNLIPRP3基因在舌鳞癌组织中表达量低。本发明还公开了PNLIPRP3基因可以用于制备治疗舌鳞癌的药物。本发明的研究成果提供了一种新的舌鳞癌临床诊断方法，同时提供了一种治疗舌鳞癌的药物新靶标。

Description

PNLIPRP3基因及其表达产物在舌鳞癌诊治中的应用
技术领域
本发明涉及肿瘤诊断、治疗、预测预后领域，更具体地，本发明涉及以检测PNLIPRP3异常为手段的肿瘤诊断、预测预后方法；及激活PNLIPRP3基因或蛋白质的肿瘤治疗剂。
背景技术
口腔鳞癌是头颈部肿瘤最常见的恶性肿瘤，约占全身肿瘤的3％，占口腔肿瘤的90％，而舌癌占口腔鳞癌发病率的首位。虽然近几年在发达国家口腔癌的发病率呈现缓慢下降趋势，但总的发病率却在增加。患者多数为40岁以上男性，好发部位多在舌、颊、牙龈等。舌鳞癌的发生是个多因素、多步骤、多阶段的复杂过程，病因学也复杂多样，涉及理化因素、微生物感染、遗传、种族等方面。虽然有关舌鳞癌病因学及相关机制一直是研究的热点，也取得一定成果，但舌鳞癌仍然具有较高的死亡率及预后差。而预后较差的原因往往是诊断和治疗的不及时，由于舌鳞癌早期一般无任何症状，患者往往因疼痛、难以愈合溃疡、不明原因的出血、口腔或者颈部肿块等临床症状就诊，这时病情较晚，生存率较低。有报道认为早期病例及时治疗，5年生存率可达到85％，而一旦出现症状，五年生存率在50％左右。另外病灶面积大，手术切除范围广，也将严重影响患者术后生活质量。研究舌鳞癌生物学行为、发生和发展机制，有助于疾病早诊断、预防和治疗；寻找有效的分子靶基因，降低舌癌的死亡率，是迫切需要解决的问题；同时具有广阔的临床医用前景及重大的科学价值。
在分子水平上尤其是在基因水平上进行口腔癌的早期诊断已经成为了诊断口腔癌领域的发展趋势，申请号为：201611136247.1、201511009921.5、201511009794.9、201610245087.8、201610277716.5、201511009921.5、201610798012.2专利文献均披露了可以用于口腔癌或者舌鳞癌诊断的基因标志物。本申请是在现有技术的启示下寻找新的可以用于舌鳞癌诊断的生物标志物。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种通过检测PNLIPRP3基因或蛋白表达差异来诊断舌鳞癌的方法。
本发明的目的之二在于提供一种通过检测PNLIPRP3基因或蛋白表达差异来预测舌鳞癌预后的方法。
本发明的目的之三在于提供一种通过激活PNLIPRP3基因或PNLIPRP3蛋白来治疗舌鳞癌的方法。
本发明的目的之四在于提供一种用于筛选治疗舌鳞癌的药物的方法。
本发明的目的之五在于提供一种用于治疗舌鳞癌的药物。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测PNLIPRP3的产品在制备舌鳞癌诊断工具中的应用。
进一步，所述检测PNLIPRP3的产品包括检测PNLIPRP3基因表达量的产品。
更进一步，所述检测PNLIPRP3的产品包括能够定量PNLIPRP3基因mRNA的产品，和/或能够定量PNLIPRP3蛋白的产品。
本发明的定量PNLIPRP3基因mRNA的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
所述能够定量PNLIPRP3基因mRNA的产品包括实时定量PCR中使用的特异扩增PNLIPRP3基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
本发明的定量PNLIPRP3蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
本发明的定量PNLIPRP3蛋白的产品包括特异性结合PNLIPRP3蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的定量PNLIPRP3蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的PNLIPRP3蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对PNLIPRP3蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
作为依照本发明的检测产品的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。
在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
进一步，所述定量PNLIPRP3基因或PNLIPRP3蛋白的产品可以是检测PNLIPRP3基因或PNLIPRP3蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
本发明还提供了一种诊断舌鳞癌的工具，所述工具能够检测PNLIPRP3基因表达量。
进一步，所述工具包括包括能够定量PNLIPRP3基因mRNA的试剂，和/或能够定量PNLIPRP3蛋白的试剂。
更进一步，所述能够定量PNLIPRP3基因mRNA的试剂是实时定量PCR中使用的特异扩增PNLIPRP3基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述诊断舌鳞癌的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断舌鳞癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知PNLIPRP3基因的异常与舌鳞癌相关也属于PNLIPRP3的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗PNLIPRP3抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合PNLIPRP3即可。
本发明还提供了一种诊断舌鳞癌的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取受试者的样品；
(2)检测受试者样品中PNLIPRP3基因或蛋白的表达水平；
(3)将测得的PNLIPRP3基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
(4)与对照相比，PNLIPRP3基因或蛋白的表达水平降低，则该受试者被判断患有舌鳞癌或者具有患有舌鳞癌的风险、或者舌鳞癌患者被判断为复发、或者舌鳞癌患者被判断为预后不良。
本发明还提供了一种舌鳞癌的治疗方法，所述方法包括激活PNLIPRP3基因或PNLIPRP3蛋白。
进一步，所述方法包括促进PNLIPRP3基因的表达，或促进PNLIPRP3蛋白的表达或增强PNLIPRP3蛋白的活性。
本发明还提供了一种肿瘤药物的筛选方法，可以通过在对癌细胞添加测试药物后或在对肿瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量PNLIPRP3基因或者PNLIPRP3蛋白的表达水平来测定肿瘤药物改善肿瘤预后的效果。更具体地说，当PNLIPRP3基因或者PNLIPRP3蛋白的表达水平在添加或施用测试药物后升高时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善肿瘤预后的治疗药物。
本发明还提供了一种治疗舌鳞癌的药物，所述药物包含PNLIPRP3的激活剂。
发明的PNLIPRP3的激活剂不受限制，只要所述激活剂能够促进或增强PNLIPRP3或涉及PNLIPRP3上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于治疗肿瘤有效的药物即可。
本发明还提供了上述激活剂在制备治疗舌鳞癌的药物中的应用。
进一步，所述激活剂包括PNLIPRP3基因、PNLIPRP3蛋白、促进型miRNA、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。
本发明的激活剂一方面可以用于补充内源性的PNLIPRP3蛋白的缺失或不足，通过提高PNLIPRP3蛋白的表达，从而治疗因PNLIPRP3蛋白缺乏导致的舌鳞癌。另一方面可以用于增强PNLIPRP3蛋白的活性，从而治疗舌鳞癌。
本发明的药物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物的效果即可，优选的是，用于治疗或预防肿瘤的药物可以包括例如烷化剂，诸如异环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法仑、和雷莫司汀；抗代谢物，诸如依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐(cytarabine ocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟吉美嘧啶奥替拉西钾、去氧氟尿苷、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯嘌呤、和甲氨蝶呤；植物生物碱，诸如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他赛、nogitecan、帕利他赛、长春瑞滨、长春地辛、和长春碱；抗癌抗生素，诸如放线菌素D、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁stimalamer、柔红霉素、多柔比星、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素C、和米托蒽醌；基于铂的药物，诸如奥沙利铂、卡铂、顺铂、和奈达铂；激素药物，诸如阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡鲁胺、氟他胺、泼尼松龙、磷雌酚、米托坦、甲睾酮、甲羟孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和来曲唑；生物反应修饰剂，诸如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素、乌苯美司、干BCG、和香菇多糖；和分子靶向药物，诸如伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆单抗、奥佐米星、他米巴罗汀、曲妥单抗、维A酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔单抗等。
本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
在本发明的上下文中，“诊断舌鳞癌”包括判断受试者是否已经患有舌鳞癌、判断受试者是否存在患有舌鳞癌的风险、判断舌鳞癌患者是否已经复发与转移、判断舌鳞癌患者对药物治疗的反应性、或者判断舌鳞癌患者的预后情况。
本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：
(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；
(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者
(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。
术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。
本发明的优点和有益效果：
本发明的发现了一种诊断舌鳞癌的分子标志物，使用该分子标志物可以在舌鳞癌发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。
本发明的包括PNLIPRP3基因或蛋白的激活剂的治疗药物可用作新的舌鳞癌的治疗药物。
附图说明
图1显示利用QPCR在mRNA水平上检测PNLIPRP3基因差异表达情况的统计图；
图2显示利用Western blot在蛋白水平上检测PNLIPRP3基因过表达情况的统计图；
图3显示PNLIPRP3基因过表达对舌鳞癌细胞增殖影响的统计图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选差异表达基因
1、实验材料
5例舌鳞癌组织标本取自口腔颌面外科手术病人，其中，高分化鳞癌2例，中分化鳞癌2例，低分化鳞癌1例；包括男性2例，女性3例。同时，选取每一例癌组织癌肿周围>5cm处正常组织为自身对照。所有患者就诊前均未经过化疗、放疗、生物治疗及其它针对肿瘤的治疗。取材后一部分组织立即放入液氮中储存备用。
2、RNA提取、cDNA合成
Trizol RNA试剂(Invitrogen公司)抽提总RNA，经紫外分光光度计(ND-1000,NanoDrop公司)和琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA；按照Qiagen公司说明书,经RNeasy MinEluteCleanup Kit纯化得到mRNA；mRNA经Poly-A RNA Controlkit(Affymetrix公司)反转录合成双链cDNA，并纯化；
3、生物素标记cRNA杂交
以cDNA为模板,应用MessageAmpTM II-Biotin Arna Amplification Kit(Ambion公司)体外转录合成生物素标记cRNA，纯化后按Affymetrix公司的真核生物表达谱单轮芯片扩增程序加入5×片段化缓冲液得到大小分布在 35～200nt的片段化cRNA；靶标制备完成后,应用真核生物Hybridization Control Kit(Affymetrix公司)配制杂交液,注入杂交液的芯片平衡放置于杂交炉中,45℃,60r/min旋转杂交16h(Hybridization Oven 640,Affymetrix公司)，然后在Affymetrix公司提供的洗涤工作站中(Fluidics Station 450，Affymetrix公司)完成芯片的清洗染色；
4、扫描和分析
应用
Figure BDA0001237826510000091
Scanner 3000(Affymetrix公司)扫描仪扫描图像。扫描图像首先用
Figure BDA0001237826510000092
Operating Software Version1.4(GCOS 1.4,Affymetrix公司)软件进行图像到信号值的转换,转换成原始数据文件。然后使用软件dChip 2006中的invariant setNormalization方法和Model-base ExpressionIndex模型对GCOS输出结果进行进一步的数据分析。根据在各芯片中检测到的P值，当数据集的检测值Call值(Absolute Call,AbsCall)为不存在A(Absent)或者临界值M(Marginal)时,被视为不表达,只有Abs Call值为存在P(present)的数据集才被用于进一步的分析。
5、组织差异表达基因的筛选
差异表达基因的筛选利用Significant Analysis of Microarray Software(SAM)算法进行。
6、结果
芯片共筛选出859个差异表达基因。与正常组织相比，舌鳞癌组织中表达上调的基因为517个，表达下调的基因为342个。
实施例2差异表达基因在大样本中的验证
基于芯片初筛的结果，我们选择PNLIPRP3基因进行大样本验证。
1、样本收集
按照实施例1的方法收集舌鳞癌组织和正常组织各45例。
2、在mRNA水平上进行验证
2.1提取组织RNA
步骤同实施例1。
2.2逆转录
反转录使用Primescript 1st strand cDNA synthesis kit试剂盒，操作步骤如下进行：
(1)在微量离心管中加入以下反应液体，如表1所示：
表1反应液体
试剂 剂量
RNA 2.0μg
dNTP 1.0μl
Oligo(dT) 2.0μl
Rnase free dH<sub>2</sub>O 加至10.0μl
(2)70℃孵育5min，迅速冷却至4℃；
在微量离心管内加入以下反应试剂，制成反应体系：
表2反应体系的配制
Figure BDA0001237826510000101
Figure BDA0001237826510000111
轻轻震荡，快速离心后，42℃反应1h，70℃10min终止反应，4℃冷却，-20℃保存。
采用SYBP Premix Ex TapTM II试剂盒，在Eppendorf Real-time PCR分析仪进行，具体操作如下：
(1)在冰上配制以下PCR反应液：
表3 PCR反应液的配制
试剂 剂量
SYBR 10.0μl
正向引物 1.0μl
反向引物 1.0μl
cDNA 2.0μl
ddH<sub>2</sub>O 6.0μl
总量 20.0μl
引物序列设计如下：
PNLIPRP3基因：
5’-TCCTGCTCTACACTATACAC-3’(SEQ ID NO.1)；
5’-TGAGGCTTGGATAGTTGAA-3’(SEQ ID NO.2)
β-actin：
5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’(SEQ ID NO.3)；
5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’(SEQ ID NO.4)
(2)上机，执行下述程序：95℃预变性3min；95℃变性15s，60℃退火20s，72℃延伸20s，共45个循环。
结果釆用相对定量法，运用公式2-△△ct计算。实验重复3次。
△ct＝ct(A)-ct(β-actin)
△△ct＝△ct(实验组)-△ct(对照组)
结果如图1所示，与正常组织相比，舌鳞癌组织中PNLIPRP3基因的mRNA水平明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例3PNLIPRP3基因过表达
1、PNLIPRP3基因重组质粒构建
(1)扩增PNLIPRP3基因的编码序列；
(2)设计扩增引物；
(3)将扩增后的PNLIPRP3基因连接到表达载体pcDNA3.0中，构建pcDNA3.0-PNLIPRP3重组表达载体。
2、舌鳞癌细胞的培养与转染
2.1细胞培养
人舌鳞癌细胞株HN4培养于含10％FBS、100U/m L青霉素和100μg/m L链霉素的DMEM/F12培养基中。所有细胞放在含 5％CO2的37℃细胞培养箱中。
2.2细胞转染
(1)转染前24h将细胞以2×105/孔接种于6孔板，加入DMEM/F12培养基，贴壁过夜，待细胞汇合达80-90％时进行转染。
(2)将1μg质粒DNA稀释于无血清培养基中，轻轻混匀；取4μl Lipofectamine2000稀释于无血清培养基中，混匀，并将两部分混合静置20min，获得脂质体复合体。
(3)将100μl脂质体复合体加入肿瘤细胞中，上下左右轻轻混匀，将细胞放入37℃含5％CO2培养箱孵育6小时。
(4)加1ml含有2倍正常血清和抗生素浓度的生长培养基，继续培养细胞24小时。
3、细胞总蛋白的提取
按照EpiQuik全细胞提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
4、Western blot检测
总蛋白用Brandford法定量，取适量与样品缓冲液混合煮沸5min，冷却5min；取30pg蛋白上样到制备好的15％聚丙烯酰胺凝胶，进行电泳，开始设为80V恒压，看见Marker后增加至120V；将电泳后的胶取出，使用Bio.Rad半干转印系统于100V转移50min；转膜完毕后，用1xPBS洗一次，浸入封闭液，40℃过夜；倒掉封闭液，加入Western洗涤液洗涤5-10min，加入一抗摇床室温杂交2h；按照适当比例用Western二抗稀释液稀释于封闭缓冲液中，孵育60min；洗膜液洗3次，每次10min；使用ECL试剂显影、定影检测蛋白表达。
5、统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将PNLIPRP3蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
6、结果
结果如图 2所示，与转染pcDNA3.0组的细胞相比，转染pcDNA3.0-PNLIPRP3组的细胞中PNLIPRP3蛋白的表达水平显著增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4PNLIPRP3基因过表达对舌鳞癌细胞增殖能力的测定
1、步骤：
将转染24小时后的舌鳞癌细胞HN4接种于96孔细胞培养板中，每孔2*103个细胞/孔/200μl，设置对照组和过表达组，对照组细胞转染pcDNA3.0空载体；过表达组转染pcDNA3.0-PNLIPRP3。
将细胞在37℃、5％CO2培养箱再次孵育24小时后，根据Brd U细胞增殖试剂盒(Chemicon International)的说明书，测定被Brd U标记的阳性细胞数和阴性细胞数，按照以下公式：阳性细胞/(阳性细胞+阴性细胞)*100％计算增殖细胞的百分率，也叫做细胞增殖率。
2、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
3、结果
结果如图3所示，与转染pcDNA3.0组的细胞相比，转染pcDNA3.0-PNLIPRP3组的细胞增殖率降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，PNLIPRP3表达可以抑制舌鳞癌细胞增殖。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> PNLIPRP3基因及其表达产物在舌鳞癌诊治中的应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tcctgctcta cactatacac 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tgaggcttgg atagttgaa 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtggggcgcc ccaggcacca 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctccttaatg tcacgcacga ttt 23

Claims (9)

1.特异性检测PNLIPRP3的产品在制备诊断舌鳞癌工具中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述特异性检测PNLIPRP3的产品包括检测PNLIPRP3基因表达量的产品。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述特异性检测PNLIPRP3的产品包括能够定量PNLIPRP3基因mRNA的产品，和/或能够定量PNLIPRP3蛋白的产品。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述能够定量PNLIPRP3基因mRNA的试剂包括实时定量PCR中使用的特异扩增PNLIPRP3基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述能够定量PNLIPRP3蛋白的试剂包括特异性结合PNLIPRP3蛋白的抗体。
5.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述工具包括能够检测PNLIPRP3基因表达量的工具。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述工具包括包括能够定量PNLIPRP3基因mRNA的试剂，和/或能够定量PNLIPRP3蛋白的试剂。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述能够定量PNLIPRP3基因mRNA的试剂是实时定量PCR中使用的特异扩增PNLIPRP3基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQID NO.2所示。
8.PNLIPRP3的激活剂在制备治疗舌鳞癌的药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述激活剂能够促进或增强PNLIPRP3或涉及PNLIPRP3上游或下游途径的物质的表达或活性。
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