CN107034272B - Cxcl2在制备诊断或治疗肺腺癌工具中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基因标记物，该基因标记物是CXCL2。CXCL2可用于判断受试者是否具有患肺腺癌的风险或者判断受试者是否患有肺腺癌。另外，CXCL2还可以用于制备治疗肺腺癌的药物。本发明为临床在分子水平上诊断肺腺癌提供了新的诊断方法，同时为肺腺癌的基因治疗提供了新的药物靶点。

Description

CXCL2在制备诊断或治疗肺腺癌工具中的应用
技术领域
本发明涉及肿瘤诊断、治疗、预测预后领域，更具体地，本发明涉及以检测CXCL2异常为手段的肿瘤诊断、预测预后方法；及激活CXCL2基因或蛋白质的肿瘤治疗剂。
背景技术
恶性肿瘤是严重危害人类生命健康的疾病。我国每年癌症发病人数约160万。恶性肿瘤正超过心血管病成为致死原因的第一位。癌症的防治和研究正成为全世界科学家日益关注的课题。肺腺癌(lung adenocarcinoma)是肺癌的一种，属于非小细胞癌，腺癌大约占肺原发肿瘤的40％。不同于鳞状细胞肺癌，肺腺癌较容易发生于女性及不抽烟者。起源于支气管粘膜上皮，少数起源于大支气管的粘液腺。发病率比鳞癌和未分化癌低，发病年龄较小，女性相对多见。多数腺癌起源于较小的支气管，为周围型肺癌。早期一般没有明显的临床症状，往往在胸部X线检查时被发现。
对于肺癌的诊断检查，临床上常用的方法有以下几种：(1)X线检查；(2)支气管镜检查；(3)放射性核素检查；(4)细胞学检查；(5)剖胸探查术；(6)ECT检查；(7)纵隔镜检查。但是上述诊断方法均不能满足对肺癌早期诊断的这种要求。因此目前非常有必要寻找适合肺癌早期诊断的方法。
在分子水平上尤其是在基因水平上进行肿瘤的早期诊断已经成为了肿瘤诊断领域的发展趋势，在肺癌诊断方面，申请号为：201510220102.9、201510233085.2、201510243857、201610202285.6、201610200867、201610200574.2、201610200855.8专利文献均披露了可以用于肺癌诊断的基因标志物。本申请是在现有技术的启示下寻找新的可以用于肺癌诊断的生物标志物。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种通过检测CXCL2基因或蛋白表达差异来诊断肺腺癌的方法。
本发明的目的之二在于提供一种通过检测CXCL2基因或蛋白表达差异来预测肺腺癌预后的方法。
本发明的目的之三在于提供一种通过激活CXCL2基因或CXCL2蛋白来治疗肺腺癌的方法。
本发明的目的之四在于提供一种用于筛选治疗肺腺癌的药物的方法。
本发明的目的之五在于提供一种用于治疗肺腺癌的药物。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测CXCL2基因或CXCL2蛋白的产品在制备肺腺癌诊断工具中的用途。
本发明还提供了检测CXCL2基因或CXCL2蛋白的产品在制备预测肺腺癌预后工具中的用途。
进一步，所述检测CXCL2基因或CXCL2蛋白的产品包括检测CXCL2基因或CXCL2蛋白的表达水平的产品。所述产品包括能够结合CXCL2基因的核酸或者能够结合CXCL2蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测CXCL2基因的表达水平；所述物质能够检测CXCL2蛋白的表达水平。
本发明的检测CXCL2基因的产品可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该产品可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。
进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
上面所述的核酸包括扩增CXCL2基因的引物，产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
在本发明的具体实施方案中，所述核酸为QPCR实验中使用的扩增引物，所述引物的序列如SEQ ID NO.1(正向序列)和SEQ ID NO.2(反向序列)所示。
上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
本发明的检测CXCL2蛋白的产品可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
本发明的检测CXCL2蛋白的产品包括特异性结合CXCL2蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的检测CXCL2蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的CXCL2蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对CXCL2蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
作为依照本发明的检测产品的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。
在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
在本发明中，“预后”是指肿瘤患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的过程或结果。在本说明书中，预后可以是通过手术处理抑制或缓解肿瘤生长后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20年或更久时的生机状态。预后可以通过检查生物标志物即CXCL2蛋白或编码CXCL2蛋白的基因来预测。预后预测可以这样进行：根据生物标志物的有或无，或者升高或降低，确定患者的预后是良好还是不良，或者确定良好预后或不良预后的概率。
在本发明中，“预后良好”是指在通过手术处理等为患者抑制或缓解肿瘤生长之后，患者长时期(例如3、5、6、7、8、9、10、15、20年或更长)没有危急状况。或者，预后好可以意指在这样长时间内存活、无转移、无复发、或无再发。例如，预后良好可以意指至少3年或尤其是至少5年存活，优选没有转移或复发。预后良好最优选的状态是长期无疾病的存活。如本文中所使用的，“预后良好”还可以包括任何这样的状态，其中可以发现疾病如转移，但是恶性低且不严重地影响生存能力。
在本发明中，“预后不良”是指患者在通过手术处理等抑制或缓解肿瘤生长后的短时期(例如1、2、3、4、5年或更短)内发生致命状况。或者，预后差是指在这样的短时期里死亡、转移、复发、或再发。例如，预后差可以意指至少3年或尤其至少5年内复发、转移、或死亡。
预测预后是指预测患者状况的过程或结果，并不意味着能以100％的准确度预测患者状况的过程或结果。预测预后是指确定某些过程或结果的可能性是否增加，而并不意味着通过与某些过程或结果不发生的情况比较来确定发生某些过程或结果的可能性。如本发明而言，本发明中CXCL2基因或CXCL2蛋白的水平降低的患者中，与不显示该特征的患者相比，更有可能观察到特定过程或结果。
进一步，所述检测CXCL2基因或CXCL2蛋白的产品可以是检测CXCL2基因或CXCL2蛋白的试剂、也可以是包含所述试剂的试剂盒、芯片、试纸等，也可以是使用所述试剂的高通量测序平台。
本发明还提供了一种诊断肺腺癌的工具，所述工具能够检测CXCL2基因或CXCL2蛋白的表达水平。所述工具包括能够结合CXCL2基因的核酸或者能够结合CXCL2蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测CXCL2基因的表达水平；所述物质能够检测CXCL2蛋白的表达水平。
进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
进一步，所述诊断肺腺癌的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断肺腺癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知CXCL2基因的异常与肺腺癌相关也属于CXCL2基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明还提供了一种预测肺腺癌预后的工具，所述预测肺腺癌预后工具包括能够结合CXCL2基因的核酸或者能够结合CXCL2蛋白的物质(例如抗体)。所述核酸能够检测CXCL2基因的mRNA水平；所述物质能够检测CXCL2蛋白的表达水平。
进一步，所述核酸和所述物质的性质同前面所述。
进一步，所述预测肺腺癌预后的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断肺腺癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知CXCL2基因的异常与肺腺癌相关也属于CXCL2基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明的检测产品、诊断工具中使用的抗CXCL2抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合CXCL2即可。
本发明还提供了一种诊断肺腺癌或预测肺腺癌预后的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取受试者的样品；
(2)检测受试者样品中CXCL2基因或蛋白的表达水平；
(3)将测得的CXCL2基因或蛋白的表达水平与受试者的患病与否关联起来。
(4)与对照相比，CXCL2基因或蛋白的表达水平降低，则该受试者被诊断为肺腺癌，或该受试者被确定为预后不良。
本发明还提供了一种肺腺癌的治疗方法，所述方法包括激活CXCL2基因或CXCL2蛋白。
进一步，所述方法包括促进CXCL2基因的表达，或促进CXCL2蛋白的表达或增强CXCL2蛋白的活性。
本发明还提供了一种肿瘤药物的筛选方法，可以通过在对癌细胞添加测试药物后或在对肿瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量CXCL2基因或者CXCL2蛋白的表达水平来测定肿瘤药物改善肿瘤预后的效果。更具体地说，当CXCL2基因或者CXCL2蛋白的表达水平在添加或施用测试药物后升高时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善肿瘤预后的治疗药物。
本发明还提供了一种含有CXCL2基因或CXCL2蛋白的激活剂的药物。
本发明还提供了上述激活剂在制备治疗肺腺癌的药物中的应用。
本发明的CXCL2基因或CXCL2蛋白的激活剂不受限制，只要是可以促进或者增强CXCL2或涉及CXCL2上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于治疗肿瘤有效的药物即可。
进一步，所述激活剂包括CXCL2基因、CXCL2蛋白、促进型miRNA、促进型转录调控因子、或促进型靶向小分子化合物。
所述激活剂还包括包含携带CXCL2基因的载体或者宿主细胞。
本发明的激活剂一方面可以用于补充内源性的CXCL2蛋白的缺失或不足，通过提高CXCL2蛋白的表达，从而治疗因CXCL2蛋白缺乏导致的肺腺癌。另一方面可以用于增强CXCL2蛋白的活性，从而治疗肺腺癌。
本发明的药物可以作为医药单独施用或与其它药物一起施用。可以与本发明的药物一起施用的其它药物不受限制，只要它不损害本发明的治疗性或预防性药物的效果即可，优选的是，用于治疗或预防肿瘤的药物可以包括例如烷化剂，诸如异环磷酰胺、环磷酰胺、达卡巴嗪、替莫唑胺、尼莫司汀、白消安、丙卡巴肼、美法仑、和雷莫司汀；抗代谢物，诸如依诺他滨、卡培他滨、卡莫氟、克拉屈滨、吉西他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸盐(cytarabine ocfosfate)、替加氟、替加氟-尿嘧啶、替加氟吉美嘧啶奥替拉西钾、去氧氟尿苷、羟基脲、氟尿嘧啶、氟达拉滨、培美曲塞、喷司他丁、巯嘌呤、和甲氨蝶呤；植物生物碱，诸如伊立替康、依托泊苷、索布佐生、多西他赛、nogitecan、帕利他赛、长春瑞滨、长春地辛、和长春碱；抗癌抗生素，诸如放线菌素D、阿柔比星、氨柔比星、伊达比星、表柔比星、净司他丁stimalamer、柔红霉素、多柔比星、吡柔比星、博来霉素、培洛霉素、丝裂霉素C、和米托蒽醌；基于铂的药物，诸如奥沙利铂、卡铂、顺铂、和奈达铂；激素药物，诸如阿那曲唑、依西美坦、雌莫司汀、炔雌醇、氯地孕酮、戈舍瑞林、他莫昔芬、地塞米松、托瑞米芬、比卡鲁胺、氟他胺、泼尼松龙、磷雌酚、米托坦、甲睾酮、甲羟孕酮、美雄烷、亮丙瑞林、和来曲唑；生物反应修饰剂，诸如干扰素α、干扰素β、干扰素γ、白介素、乌苯美司、干BCG、和香菇多糖；和分子靶向药物，诸如伊马替尼(imatinib)、吉非替尼(gefitinib)、吉姆单抗、奥佐米星、他米巴罗汀、曲妥单抗、维A酸、硼替佐米(bortezomib)、和利妥昔单抗等。
本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可，可以依据症状、性别、年龄等来恰当的确定。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
在本发明的上下文中，“诊断肺腺癌”既包括判断受试者是否已经患有肺腺癌、也包括判断受试者是否存在患有肺腺癌的风险。
本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：
(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；
(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者
(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。
术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。
本发明的优点和有益效果：
本发明的发现了一种诊断肺腺癌的分子标志物，使用该分子标志物可以在肺腺癌发生的早期即可作为判断，提供了患者的生存率。
另外，通过预测患者的预后，本发明能够提供有意义的信息来为患者决定治疗方案策略。
本发明的包括CXCL2基因或蛋白的激活剂的治疗药物可用作新的肺腺癌的治疗药物。
附图说明
图1显示利用QPCR在mRNA水平上检测CXCL2基因差异表达情况的统计图；
图2显示利用免疫印迹在蛋白水平上检测CXCL2基因差异表达情况的统计图；
图3显示利用QPCR在mRNA水平上检测CXCL2基因过表达情况的统计图；
图4显示利用免疫印迹在蛋白水平上检测CXCL2基因过表达情况的统计图；
图5显示CXCL2基因过表达对肺腺癌细胞增殖影响的统计图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 筛选差异表达基因
1、取材：
8例原发肺腺癌患者的手术切除癌组织和癌旁组织作为实验样本。所有癌组织均术后病理证实为肺腺癌。全部原发肺腺癌患者术前均未行放、化疗，全部病例临床资料完整。
2、组织RNA的获取
从组织样品中提取total RNA，利用Nanodrop2000对所提RNA的浓度和纯度进行检测，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Agilent2100测定RIN值。单次建库要求RNA总量5ug,浓度≥200ng/μL,OD260/280介于1.8～2.2之间。
3、去除rRNA
细胞内一部分(>24％)的长链非编码RNA都是缺少传统poly A尾的，因此采用去除rRNA的方式建库可以获得更加全面的lncRNA信息。
4、片段化RNA
Illumina平台是针对短序列片段进行测序，去除rRNA得到的mRNA和lncRNA是完整的RNA序列，平均长度可能达几kb，因此需要对其进行随机打断。利用金属离子，可以将RNA随机断裂成200bp左右的小片段。
5、反转合成cDNA
在逆转录酶的作用下，利用随机引物，以mRNA为模板反转合成一链cDNA，进行二链合成时，dNTPs试剂中用dUTP代替dTTP，使cDNA第二链中碱基包含A/U/C/G。
6、连接adaptor
双链的cDNA结构为粘性末端，加入End Repair Mix将其补成平末端，随后在3’末端加上一个A碱基，用于连接Y字形的接头。
7、UNG酶消化cDNA二链
在PCR扩增前，用UNG酶将cDNA第二链消化，从而使文库中仅包含cDNA第一链。
8、Illumina Hiseq4000上机测序
文库富集，PCR扩增15个cycles；
2％琼脂糖胶回收目的条带(Certified Low Range Ultra Agarose)；
TBS380(Picogreen)定量，按数据比例混合上机；
cBot上进行桥式PCR扩增，生成clusters；
Hiseq4000测序平台，进行2*150bp测序。
9、原始测序数据过滤
将序列末端(5’端和3’端)低质量(质量值小于20)的碱基修剪掉；
去除含N比率超过10％的reads；
10、mRNA差异表达分析
分析软件：Cuffdiff:(http://Cufflinks.cbcb.umd.edu/)
Cuffdiff是Cufflinks套件里用来计算差异表达的一个工具，Cuffdiff利用Tophat比对的结果，调用Cufflinks计算每个基因/转录本的表达量。通常采用默认参数运行软件，同时根据实际情况，如测序数据量，基因组情况对参数做适当的调整。
显著差异mRNA筛选条件：p-value<0.05，两组的count平均值之差大于10。
11、结果
测序结果显示：与癌旁组织相比，肺腺癌组织中差异表达基因为1321个，其中上调的为587个，下调的为734个。
实施例2 大样本验证筛选出的差异表达基因
基于前期高通量转录组深度测序的结果，根据P value的大小，我们选择CXCL2基因进行验证。
1、样本收集
按照实施例1的方法收集肺腺癌组织及其对应的癌旁组织各45例。
2、在mRNA水平上进行验证
2.1提取组织RNA
步骤同实施例1。
2.2逆转录
反转录使用Primescript 1st strand cDNAsynthesis kit试剂盒，操作步骤如下进行：
(1)在微量离心管中加入以下反应液体，如表1所示：
表1反应液体
试剂 剂量
RNA 2.0μg
dNTP 1.0μl
Oligo(dT) 2.0μl
Rnase free dH<sub>2</sub>O 加至10.0μl
(2)70℃孵育5min，迅速冷却至4℃；
在微量离心管内加入以下反应试剂，制成反应体系：
表2反应体系的配制
试剂 剂量
5x1st Strand Synthesis Buffer 4.0μl
PrimeScript RTase 1.0μl
RNase Inhibitor 1.0μl
Rnase free dH<sub>2</sub>O 4.0μl
轻轻震荡，快速离心后，42℃反应1h，70℃10min终止反应，4℃冷却，-20℃保存。
采用SYBP Premix Ex TapTM II试剂盒，在Eppendorf Real-time PCR分析仪进行，具体操作如下：
(1)在冰上配制以下PCR反应液：
表3PCR反应液的配制
试剂 剂量
SYBR 10.0μl
正向引物 1.0μl
反向引物 1.0μl
cDNA 2.0μl
ddH<sub>2</sub>O 6.0μl
总量 20.0μl
引物序列设计如下：
CXCL2基因：
5’-TGATAGAGGCTGAGGAAT-3’(SEQ ID NO.1)；
5’-AATAACAACTGACATTCATCTT-3’(SEQ ID NO.2)
β-actin：
5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’(SEQ ID NO.3)；
5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTT-3’(SEQ ID NO.4)
(2)上机，执行下述程序：95℃预变性3min；95℃变性15s。59℃退火20s，72℃延伸20s，共40个循环。
结果釆用相对定量法，运用公式2-△△ct计算。实验重复3次。
△ct＝ct(A)-ct(β-actin)
△△ct＝△ct(实验组)-△ct(对照组)
结果如图1所示，与癌旁组织相比，肺腺癌组织中CXCL2基因的mRNA水平明显下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。
3、在蛋白水平上进行验证
按照RIPA蛋白裂解液试剂盒说明书提取各组蛋白，使用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测样品中蛋白浓度。以常规Western-blot方法检测CXCL2蛋白变化，各组实验均重复3次，以β-actin为内参，做CXCL2蛋白条带吸光度定量分析，表达量以CXCL2蛋白/β-actin吸光度的比值代表。
结果如图2所示，与癌旁组织相比，肺腺癌组织中CXCL2蛋白水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例3 CXCL2基因过表达
1、质粒构建
根据CXCL2基因的编码序列设计扩增引物，引物的设计为本领域技术人员所熟知。从成人胎脑的cDNA文库(clontech公司，货号：638831)中扩增全长的CXCL2基因的编码序列，上述cDNA序列插入到真核细胞表达载体pcDNA3.1中，连接获得的重组载体pcDNA3.1-CXCL2用于后续实验。
2、肺腺癌细胞的培养与转染
2.1细胞培养
将肺腺癌细胞株A549于RPMI1640培养基和10％胎牛血清中培养。
2.2细胞转染
(1)转染前一天将0.5-2*105个肿瘤细胞悬浮于500μl不含抗生素的培养基，接种至24孔培养板。
(2)转染当天细胞密度应达80％-90％，准备以下复合物A：将1μg质粒DNA稀释于无血清培养基中，轻轻混匀；复合物B：取4μl Lipofectamine2000稀释于无血清培养基中，混匀。
(3)将复合物A和B混合，轻轻混匀，室温孵育。
(4)将100μl脂质体复合体加入肿瘤细胞中，上下左右轻轻混匀，将细胞放入37℃含5％CO2培养箱孵育5-7小时。
(5)加1ml含有2倍正常血清和抗生素浓度的生长培养基，继续培养细胞18-24小时。
3、利用QPCR实验检测pcDNA3.1-CXCL2的过表达情况
3.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。
3.2逆转录
步骤同实施例2。
3.3QPCR
步骤同实施例2。
3.4结果
结果如图3所示，pcDNA3.1-CXCL2能够成功过表达，差异具有统计学意义(P<0.05)。
3、Western blot实验检测pcDNA3.1-CXCL2过表达情况
步骤同实施例2。
结果如图4所示，与转染pcDNA3.1组相比，转染pcDNA3.1-CXCL2的细胞中CXCL2蛋白的含量明显增加，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4 CXCL2基因的表达对肺腺癌细胞增殖能力的测定
1、步骤：
将转染24小时后的肺腺癌细胞A549接种于96孔细胞培养板中，每孔2*103个细胞/孔/200μl，细胞分组如下：
实验组1(对照组)：肺腺癌细胞转染pcDNA3.1；
实验组2：肺腺癌细胞转染pcDNA3.1-CXCL2。
将细胞在37℃、5％CO2培养箱再次孵育24小时后，根据Brd U细胞增殖试剂盒(Chemicon International)的说明书，测量细胞增殖速率。
2、统计学方法
实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
3、结果
结果如图5所示，相比于实验组1，实验组2的细胞增殖减缓，差异具有统计学意义(P<0.05)。上述实验结果表明，CXCL2表达可以抑制肺腺癌细胞增殖。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北医科大学第四医院（河北省肿瘤医院）
<120> CXCL2在制备诊断或治疗肺腺癌工具中的应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tgatagaggc tgaggaat 18
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
aataacaact gacattcatc tt 22
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gtggggcgcc ccaggcacca 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctccttaatg tcacgcacga ttt 23

Claims (1)

1.促进CXCL2基因表达的试剂在制备治疗肺腺癌的药物中的应用，其特征在于，所述试剂是CXCL2基因的pcDNA3.1过表达载体。
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Marrow adipocyte-derived CXCL1 and CXCL2 contribute to osteolysis in metastatic prostate cancer;Hardaway, AL et al.;《CLINICAL & EXPERIMENTAL METASTASIS》;20150430;第32卷(第4期);第353-368页 *

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