CN108841963B - 诊治宫颈癌的mlf1基因及其应用 - Google Patents

诊治宫颈癌的mlf1基因及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了诊治宫颈癌的MLF1基因及其应用。本发明利用高通量测序筛选宫颈癌组织中异常表达基因，然后利用QPCR实验和Western bolt大样本验证证明MLF1基因和MLF1蛋白在正常组织和宫颈癌组织中的表达存在显著差异。根据上述研究成果，本发明开发了用于诊断宫颈癌的产品以及用于治疗宫颈癌的药物。

Description

诊治宫颈癌的MLF1基因及其应用
技术领域
本发明涉及生物医学领域，更具体地，本发明涉及MLF1基因在制备诊治宫颈癌的产品中的应用。
背景技术
宫颈癌是最常见的妇科恶性肿瘤，在女性生殖器官肿瘤中占首位。根据世界卫生组织2014年统计数据，宫颈癌的年新发病例约为52.8万例，年死亡例数约为26.6万例，其中85％的患者均发生在在发展中国家，且农村高于城市。我国是宫颈癌发病的大国，根据国家肿瘤中心公布的最新癌症统计数据，2015年我国的宫颈癌新发病例约为9.89万例，年死亡例数约为3.05万例，并且该数据呈现逐年上升且发病年轻化的趋势[Chen W,Zheng R,Baade P D,et al.Cancer statistics in China,2015[J].CA Cancer J Clin,2016,66(2):115-132]。宫颈癌的发生与多种因素密切相关，如早婚、早育、多产及性生活紊乱等，但人乳头状瘤病毒(Human papilloma virus，HPV)感染被认为是宫颈癌发病的必要条件，99.7％的宫颈癌患者HPV筛查呈阳性，且HPV持续感染患者罹患宫颈癌的风险是HPV阴性者的250多倍[Wentzensen N,Arbyn M.HPV-based cervical cancer screening-facts,fiction,and misperceptions[J].Prev Med,2017,98:33-35l；Torre L A,Islami F,Siegel R L,et al.Global cancer in women:burden and trends[J].Cancer EpidemiolBiomarkers Prev,2017]。自上世纪七八十年代首次明确HPV感染是宫颈癌发病重要的成因后，学者们针对HPV感染诱发宫颈癌发病的机制展开深入研究，并因此开发出了针对宫颈癌的诊断方法和治疗策略，包括敏感特异的癌前诊断方法、靶向性的免疫预防措施以及治疗方法，极大的改善了宫颈癌患者生存及生活质量。
随着现代生物检测技术的发展和肿瘤发病机制的不断深入研究，涉及肿瘤发生的多种生物学过程中的多种分子，如核酸、蛋白质、糖类、脂类、小分子代谢物乃至血液中游离的肿瘤细胞，均可作为重要的肿瘤标志物，给临床预防、诊断和治疗提供明确的依据。在宫颈癌中，目前己经发现了一些肿瘤标志物用于宫颈癌的临床预防。
Ki-67和p16INK4a是两种常见的用于分析肿瘤细胞增殖状态以及肿瘤恶性程度的分子标志物。其中Ki-67在静默GO期细胞不表达，而高表达于G1,S,G2和M期细胞，因此其可广泛用于分析细胞的增殖活性来评估肿瘤进程[Endl E,Gerdes J.The Ki-67protein:fascinating forms and an unknown function[J].Exp Cell Res,2000,257(2):231-237]；同时，由于其表达谱系广泛，作为特异性的肿瘤标志物仍具有一定的缺陷，临床尚需其他分子标志物辅助诊断。p16INK4a作为一种周期调节蛋白，可特异性与CDK4和CDK6结合从而抑制其活性以及下游pRb的磷酸化，调节细胞周期进行及细胞分化过程；有研究发现，p16INK4a表达与HR-HPV持续感染以及宫颈肿瘤病理分级呈正相关，对于患者术后HPV的清除以及持续感染具有一定的指导价值[Koh J,Enders G H,Dynlacht B D,et al.Tumour-derived p16alleles encoding proteins defective in cell-cycle inhibition[J].Nature,1995,375(6531):506-510]。
ProExC抗体(BD公司)可特异性的识别因HPV感染而诱导的胞核蛋白MCM2以及拓扑异构酶TOP2A复合物。在宫颈腺体和鳞状细胞不典型增生中，E7癌基因诱导的细胞S期基因会促进TOP2A和MCM2在细胞核内高表达，同时TOP2A可与6个MCM2分子结合形成稳定的结构滞留于细胞核[Santin A D,Zhan F,Bignotti E,et al.Gene expression profiles ofprimary HPV16-and HPV18-infected early stage cervical cancers and normalcervical epithelium:identification of novel candidate molecular markers forcervical cancer diagnosis and therapy[J].Virology,2005,331(2):269-291]。因其在正常宫颈上皮细胞中不表达，而在HPV诱导的增殖活跃的鳞状细胞内显著高表达，临床上可用于区分不典型增生与鳞状细胞发育不完全或萎缩等类似改变。
HPV DNA完整性和稳定性主要是由衣壳蛋白L1与L2蛋白共同形成一个稳定的保护壳来维持。其中，L1蛋白还可通过识别宿主细胞上的相应受体，促进病毒颗粒侵染粘膜基底膜带细胞或宫颈上皮细胞。在HPV侵染的轻度至中度不典型增生过程中会持续检测到L1蛋白的表达，但是随着宫颈癌化程度进展L1蛋白的表达会逐渐消失[Mcmurray H R,MccanceD J.Human papillomavirus type 16E6activates TERT gene transcription throughinduction of c-Myc and release of USF-mediated repression[J].J Virol,2003,77(18):9852-9861]。因此HPV-L1表达消失提示病毒基因组己整合在宿主基因组，可用于宫颈癌CIN3期的诊断。
Lanminin-5是一种与肿瘤侵袭密切相关的肿瘤标志物，在多种不同类型恶性肿瘤中Lanminin-5基因的表达常与肿瘤的进展密切相关。在宫颈癌的发生过程中，Laminin-5主要表达在肿瘤的早期阶段，特别是在微小浸润的皮损处，因此其可用于宫颈鳞状细胞浸润早期的检测。MIB-I具有与Ki-67类似的表达模式，即在显著的高表达于GINS各期的增殖状态活跃的肿瘤细胞，结合Ki-67检测可用于辅助分析肿瘤细胞所处的周期状态。因此MIB-1是另一重要的检测不典型增生过程中细胞增殖活性的一个重要指标。
综上所述，目前虽然己有多种肿瘤标志物用于临床宫颈癌的诊断，但是己有肿瘤标志物因在正常情况下组成性表达、或在非恶性肿瘤疾病中水平也升高，缺乏肿瘤特异性。因此，亟待寻找肿瘤特异性抗原作为生物标志，用于临床宫颈癌的早期诊断和预后判定。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种通过检测MLF1基因表达差异来实现宫颈癌诊断的方法。
本发明的目的之二在于提供一种通过抑制MLF1基因表达来治疗宫颈癌的方法。
本发明的目的之三在于提供一种用于筛选宫颈癌治疗药物的方法。
本发明的目的之四在于提供一种用于治疗宫颈癌的药物。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明提供了检测MLF1的试剂在制备诊断宫颈癌的工具中的应用。
进一步，所述检测MLF1的试剂包括检测MLF1基因表达量的试剂。
更进一步，所述检测MLF1的试剂包括能够定量MLF1基因mRNA的试剂，和/或能够定量MLF1蛋白的试剂。
本发明的定量MLF1基因mRNA的试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用该试剂可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。
进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。
所述能够定量MLF1基因mRNA的试剂可以是MLF1基因或转录本的特异性引物，也可以是MLF1基因或转录本的特异性识别探针，或同时包括引物和探针。
上面所述的MLF1基因或转录本的特异性引物包括实时定量PCR中使用的特异扩增MLF1基因的引物。在本发明的的具体实施例中，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。
引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。
探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。
本发明的定量MLF1蛋白的试剂可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。
本发明的定量MLF1蛋白的试剂包括特异性结合MLF1蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的定量MLF1蛋白的试剂可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。
抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的MLF1蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对MLF1蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。
标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。
本发明的用于检测MLF1基因表达量检测的样品的获得是本领域的常规技术，优选可选择非侵入性或具有最低程度侵入性的方法获得。
所述的样品可以是(但不限于)：组织、外周血、骨髓、淋巴结、腹腔清洗液、尿液、汗液。在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的组织。
本发明还提供了一种用于诊断宫颈癌的工具，所述工具能够检测MLF1基因表达量。
进一步，所述工具包括能够定量MLF1基因mRNA的试剂，和/或能够定量MLF1蛋白的试剂。
通常，所述的试剂存在于适当的容器中。可使用稀释剂如去离子水将每种所述引物或探针调整到至少一种需要量的浓度，分装于容器中。
进一步，所述能够定量MLF1基因mRNA的试剂包括实时定量PCR中使用的特异扩增MLF1基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
进一步，所述用于诊断宫颈癌的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱，容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知MLF1基因的异常与宫颈癌的发生相关也属于使用了本发明的MLF1的新用途，同样在本发明的保护范围之内。
本发明的试剂盒中还可包括用于提取核酸的试剂，用于PCR的试剂，用于染色或显色的试剂等。例如，这些试剂包括但不限于：抽提液、扩增液、杂交液、显色液、洗液等。
此外，所述的试剂盒中还可包括描述检测MLF1基因表达的方法的说明书等。
本发明所述的试剂盒可包含适于实用(如针对于不同的检测方法)的多种不同的试剂，并不限于目前所列举的试剂，只要是基于MLF1基因或转录本的检测来诊断宫颈癌的试剂均包含在本发明范围内。
本发明还提供了一种诊断宫颈癌的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)获取受试者的样品；
(2)检测受试者样品中MLF1基因表达水平；
(3)将测得的MLF1基因表达水平与受试者的疾病相关性关联起来。
(4)与正常对照相比，MLF1基因表达水平在统计学上升高，表明受试者被判断患有宫颈癌、或者判断受试者患有宫颈癌的风险高。
本发明还提供了一种宫颈癌的治疗方法，所述方法包括抑制MLF1基因表达、或抑制MLF1基因表达产物的活性。
本发明还提供了一种治疗宫颈癌的候选药物的筛选方法，可以通过在对模型细胞添加测试药物后的某个时期测量MLF1基因或者MLF1蛋白的表达水平来测定候选药物改善预后的效果。更具体地说，当MLF1基因或者MLF1蛋白的表达水平在添加或施用测试药物后降低时或者恢复正常水平时，可选择该药物作为改善宫颈癌的治疗药物。
本发明还提供了一种治疗宫颈癌的药物，所述药物包含抑制MLF1的试剂。
本发明的抑制MLF1的试剂不受限制，只要所述试剂能够抑制MLF1或涉及MLF1上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于治疗宫颈癌有效的药物即可。
本发明还提供了MLF1基因或其表达产物在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。
进一步，所述药物包括针对MLF1基因表达的干扰RNA，或者负调控miRNA、负调控型的转录调控因子、或抑制型靶向小分子化合物。
本发明的药物可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的药物可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把药物进行给药。使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的药物施用于人，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。
本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。
本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的治疗效果或者预防效果即可。本发明的治疗药物或预防药物的剂量可以使用例如对疾病的治疗效果或者预防效果作为指标来确定。
本发明的“MLF1基因”(Chromosome 3,NC_000003.12(158571163..158606460))序列可以NCBI数据库中进行查询。
在本发明的上下文中，“宫颈癌诊断”包括判断受试者是否已经患有宫颈癌、判断受试者是否存在患有宫颈癌的风险、或者判断宫颈癌患者复发。
本文所用的“治疗”涵盖患有相关疾病或病症的哺乳动物例如人类中治疗相关的疾病或疾病状态，并且包括：
(1)预防疾病或疾病状态在哺乳动物中发生，尤其是当该哺乳动物易感于所述疾病状态，但尚未被诊断出患有这种疾病状态时；
(2)抑制疾病或疾病状态，即阻止其发生；或者
(3)缓解疾病或疾病状态，即使疾病或疾病状态消退。
术语“治疗”通常涉及治疗人类或动物(例如，被兽医所应用)，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。
本发明的优点和有益效果：
本发明首次发现并证实MLF1基因表达与宫颈癌发生的密切相关性，验证的样本量多，结果准确。该相关性的提出为宫颈癌的诊断与治疗提供了新的途径。
附图说明
图1显示利用QPCR检测MLF1基因在宫颈癌组织与正常对照组织中的差异表达的统计图；
图2显示利用Western blot实验检测MLF1蛋白在宫颈癌组织与正常对照组织中的差异表达的统计图；
图3显示利用Western blot实验检测MLF1基因表达抑制率的统计图。
具体的实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1筛选宫颈癌患者的癌组织中异常表达基因
1、组织收集
收集医院妇产科提供的宫颈癌组织4例，来源于经子宫切除术(锥切或全切)术后病理诊断为宫颈癌的患者，其中周边正常组织作为对照组。
2、组织RNA提取
取-80℃冻存的宫颈癌患者组织和周边正常宫颈组织约50mg，放入液氮中进行研磨，至无大颗粒组织时转移至1.5mL EP管中，加入1m L Trizol用于总RNA提取和实时定量PCR分析，具体流程如下：
1)在上述含有1mL Trizol的组织悬液中加入200μL氯仿，手动充分震荡混匀后室温静置10min；
2)12000rpm，4℃离心15min；
3)待离心完毕后，轻柔吸取EP管上层水相至新的1.5mL EP管仲，加入600μL异丙醇，上下颠倒充分混匀，室温放置20min(或-20℃放置2h，可增加RNA的析出)；
4)12000rpm，4℃离心15min；
5)弃去上清，加入DEPC水稀释的75％乙醇，用枪头轻轻吹吸悬浮沉淀；
6)12000rpm，4℃离心15min；
7)弃去上清，用枪头吸取残余的液体，室温下晾置5min；
8)取20μL RNAase-free水溶解沉淀，定量后使用或冻存-80℃冰箱待用。
3、定量RNA
取上述提取的总RNA 2μL稀释于98μL DEPC水中，利用紫外分光光度计测定波长260nm和280nm处的吸光度值，根据A260/A280比值判断本RNA的纯度，根据A260值计算样本RNA的浓度。
4、高通量转录组测序
(1)RNA-seq读段定位
首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat v1.3.1将清洁片段与UCSC H.sapiens参考基因组(hg19)进行匹配，H.sapiens UCSC hg19版的预先构建的索引从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用TopHat方法的系统默认参数。
(2)转录丰度评估
匹配上的读段文件通过Cufflinks v1.0.3处理，Cufflinks v1.0.3将RNA-seq片段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定基因1kb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载(Homo_sapiens.GRCh37.63.gtf)。
(3)差异表达基因的检测
将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff，Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表达。在Cuffidff输出中只有q值＜0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
4、结果
RNA-seq结果显示，与正常对照组织相比，宫颈癌组织中高表达的基因为351个，低表达的基因为294个，差异均具有统计学意义(P<0.05)。
实施例2大样本验证差异表达基因的表达
一、在转录水平上进行检测
1、组织收集
按照实施例1的标准收集宫颈癌组织和相应的正常对照组织40例。
2、组织RNA提取与鉴定
步骤同实施例1。
3、引物的设计与制备
本申请所用实时定量PCR引物序列如下(委托生工生物工程(上海)股份有限公司设计并合成)：
MLF1基因引物：
上游引物：5’-CATAATCGTAGAGGACAT-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物5’-ATAACTGAGGAAGAACAA-3’(SEQ ID NO.2)，
GAPDH基因引物：
上游引物：5’-GACCTGACCTGCCGTCTA-3’(SEQ ID NO.3)；
下游引物：5’-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3’(SEQ ID NO.4)。
4、逆转录PCR
使用Takara反转录试剂盒(含基因组DNA去除酶)进行反转录，具体反应体系如下：
去除基因组DNA的反应体系：
表1去除基因组DNA的反应体系
试剂 体积
总RNA 1.0μg
gDNA Eraser 1.0μL
5*gDNA Eraser B buffer 2.0μL
RNase Free水 补至10μL
42℃下反应5min。
逆转录PCR反应体系：
表2逆转录PCR反应体系
试剂 体积
RT Primer Mix 1.0μL
PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μL
5*Prime Script Buffer 4.0μL
去除基因组DNA的反应体系 10.0μL
RNase Free水 4.0μL
37℃反应15min，85℃反应5s。
5、实时定量PCR
反应体系：
表3逆转录PCR反应体系
Figure BDA0001751522300000121
Figure BDA0001751522300000131
反应条件：95℃预变性30s；
95℃15s，39.1℃15s，72℃20s，总循环次数为45次；
72℃延伸5min(GAPDH为内参)。
采用2-△△Ct相对定量法分析MLF1的表达水平，Ct是热循环仪检测到反应体系中荧光信号的强度值。计算方法为：ΔΔCt＝(Ct目的基因-Ct内参基因)宫颈癌组织实验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)正常对照组织组，2-△△Ct表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，实验数据分析由Bio-RAD分析软件完成。
6、统计学分析采用统计学软件SPSS19.0进行数据分析，应用配对T检验判断宫颈癌组织与正常对照组织样本中MLF1的表达是否存在统计学意义上的差异。统计检验都为双侧检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
7、结果
与正常对照组织相比，40例宫颈癌组织中35例的MLF1基因表达显著升高。统计结果如图1所示，与正常对照组织相比，宫颈癌组织中MLF1基因显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
二、在蛋白水平上进行检测
1、提取收集到的宫颈癌组织总蛋白
(1)从液氮中取出保存的宫颈癌患者组织和周边正常宫颈组织，室温待其解冻后切取组织约100mg，转移至组织匀浆器中并使用干净的剪刀将组织剪碎；
(2)加入含有1％PMSF的RIPA裂解液约300μL，然后在冰上进行匀浆；
(3)将组织匀浆液转移至1.5mL EP管中，冰上放置15min；
(4)12000rpm，4℃离心15min；
(5)转移上清至新1.5mL EP管中，取10μL进行BCA蛋白定量，其余置-20℃冻存。
2、电泳
以β-actin为内参。50μg总蛋白经SDS-PAGE分后，电转移至PVDF膜，用含5％脱脂奶粉的1×TBST室温轻摇封闭1h；分别加入MLF1单抗和β-actin单抗，4℃过夜；1×TBST洗膜4次，加入二抗，室温孵育1h；1×TBST洗膜4次后，置于Super Signal化学发光试剂中反应2min，暗室中使X光片曝光，常规方法显影定影，从中选取曝光好的照片利用Image Pro软件进行灰度分析。
3、统计学处理
将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，以β-actin为内参，将MLF1蛋白条带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是以平均值±标准差的方式来表示，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
4、结果
与正常对照组织相比，40例宫颈癌组织中35例的MLF1蛋白水平显著升高，差异具有统计学意义。统计结果如图2所示，与正常对照组织相比，宫颈癌组织中MLF1蛋白水平显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
实施例2干扰MLF1基因表达
1、干扰RNA设计合成
根据MLF1基因序列由上海吉玛制药技术有限公司设计合成siRNA。上海吉玛制药技术有限公司同时提供与MLF1基因无序列同源性的阴性对照siRNA(siRNA-NC)。
siRNA-MLF1：
正义链为5’-AUAUAGUUUCUCAUAUUUGAC-3’(SEQ ID NO.5)；
反义链为5’-CAAAUAUGAGAAACUAUAUGC-3’(SEQ ID NO.6)，
2、Hela细胞的培养
细胞用含有双抗和10％胎牛血清的1640培养基置于37℃，5％CO2的培养箱内培养，每隔24h换1次培养液，48h传代1次。取对数生长期的细胞进行后续实验。
3、细胞瞬时转染
在转染前一天消化细胞，并将细胞接种6孔板，每孔约2x105个细胞，培养过夜，观察细胞融合度(约50-70％)进行细胞siRNA瞬时转染，具体流程如下：
1)按照siRNA合成书上的说明，使用RNase Free水稀释siRNA至20μM；
2)取两只无菌EP管分别标记为A和B，A管加入125μL/孔无血清培养基以及5μLsiRNA，B管加入125μL/孔无血清培养基以及5μL Lipofectamine 3000；
3)充分混匀上述A，B管的溶液，室温静置5min；
4)更换6孔板中的培养基为无血清培养基，每孔2mL；
5)加入上述混匀的A,B混合溶液，十字摇动充分混匀细胞；
6)放置于CO2培养箱中，37℃进行常规培养；
7)在转染48h后，分别加入1ml Trizol或200μL RIPA裂解细胞，提取RNA和蛋白质进行实时定量PCR和Western blot检测，分析干涉效果后进行后续实验。
4、结果
如图3所示，与阴性对照组(转染siRNA-NC)相比，实验组(转染siRNA-MLF1)细胞中MLF1蛋白表达量显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。
实施例4MLF1基因的表达对Hela细胞增殖的影响
细胞增殖的检测采用CCK-8法
(1)按照实施例3的方法进行转染；
(2)转染24h后的Hela细胞，吸弃培养基，以0.25％胰蛋白酶消化细胞，以结晶紫染液计数细胞，以含0.5％FBS的1640培养基重悬细胞并调整细胞浓度为2x 104/ml；
(3)无菌条件下向新的96孔培养板中每孔加入细胞悬液100μl，即2x103个细胞，37℃，5％CO2静置24h；
(4)分别向各孔中加入10μl CCK溶液，培养2h；
(5)450nm波长，紫外分光光度计测量各实验组吸光值。
结果：
结果显示，阴性对照组(转染siRNA-NC)细胞OD值为0.988±0.142，实验组(转染siRNA-MLF1)细胞OD值为0.486±0.087。上述结果表明，抑制MLF1表达宫颈癌细胞增殖受到抑制，差异具有统计学意义(P<0.05)。
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
序列表
<110> 北京泱深生物信息技术有限公司
<120> 诊治宫颈癌的MLF1基因及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cataatcgta gaggacat 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ataactgagg aagaacaa 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gacctgacct gccgtcta 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aggagtgggt gtcgctgt 18
<210> 5
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
auauaguuuc ucauauuuga c 21
<210> 6
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
caaauaugag aaacuauaug c 21

Claims (3)

1.MLF1基因或其表达产物在制备治疗宫颈癌的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包含抑制MLF1的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括能够抑制MLF1的表达或活性的试剂。
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Nguyen Phuoc Long 等.Systematic assessment of cervical cancer initiation and progression uncovers genetic panels for deep learning-based early diagnosis and proposes novel diagnostic and prognostic biomarkers.《Oncotarget》.2017,第8卷(第65期),109436-109456. *
Systematic assessment of cervical cancer initiation and progression uncovers genetic panels for deep learning-based early diagnosis and proposes novel diagnostic and prognostic biomarkers;Nguyen Phuoc Long 等;《Oncotarget》;20171125;第8卷(第65期);109436-109456 *
伴有t(3;5)(q25;q34)的骨髓增生异常综合征急性髓系白血病变患者的分子特征;张悦等;《中华血液学杂志》;20061231;第27卷(第12期);833-837 *

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Applicant after: Qingdao Yangshen biomedical Co., Ltd

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