CN107488737B - 一种检测外周血tcr可变区编码基因的液体活检试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了可用于预测乳腺癌患者对治疗药物的敏感性的基因标志物，该基因标志物是TRBV15。本发明实验证明乳腺癌患者外周血T细胞中TRBV15基因频率和基因表达在疗效pCR组和non‑pCR组之间存在差异，根据差异可以区分能从曲妥珠单抗联合化疗新辅助治疗中生存获益的乳腺癌人群。本发明还公开了预测乳腺癌患者对治疗药物的敏感性的产品，该产品可以通过检测血液中TRBV15基因频率或基因表达来实现预测目的。

Description

一种检测外周血TCR可变区编码基因的液体活检试剂盒及其 应用

技术领域

本发明涉及肿瘤诊断、治疗领域，更具体地，本发明涉及以检测TRBV15异常为手段的预测患者对肿瘤治疗药物的敏感性的方法和用途。

背景技术

乳腺癌是目前女性最常见的恶性肿瘤，GLOBOCAN2012资料显示2012年全球共有170万乳腺癌新增病例，总死亡52.2万例，居女性癌症死因的第二位，因此其疗效预测及改善预后一直是临床科研工作者的研究重点。在局部晚期或高生物学风险的乳腺癌患者中，新辅助治疗用于缩小肿瘤负荷以增加根治性切除率及保乳率并减少疾病复发和死亡的风险。激素受体(HR)(即雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR))阴性表达和HER2过表达是与乳腺癌疾病进展和预后差相关的分子生物学因素。大约20-30％的乳腺癌患者HER2过表达。HER2阳性乳腺癌患者的预后因曲妥珠单抗的应用有了很大的改善。关于新辅助治疗疗效，研究证实疗效达病理完全缓解(pCR)患者无病生存期和总生存期的延长具有显著相关性，预后明显优于非pCR患者。在当前的实践中，有大肿瘤负荷的HR阴性HER2阳性的乳腺癌患者通常受益于曲妥珠单抗联合化疗的新辅助治疗，有近30-50％的患者疗效能够达到pCR。

目前仍缺乏有效预测pCR的分子标志物，预测治疗反应是具有挑战性和亟待解决的临床难题。当肿瘤发生后，机体可产生针对肿瘤抗原的适应性免疫应答，包括细胞免疫和体液免疫，其中细胞免疫占主要地位，体液免疫仅在少数情况下起协同作用。肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte，TIL)是存在于肿瘤癌巢内及间质中的以淋巴细胞为主的异质性淋巴细胞群体。近年来，随着肿瘤免疫学的进展，TIL成为乳腺癌研究者关注的焦点，并有较多最新研究结果证实了其在新辅助治疗和辅助治疗疗效和预后预测方面的价值。不同乳腺癌分子分型中，三阴性与HER2阳性乳腺癌病灶中TIL浸润程度较高；这可能与这两种分子分型的乳腺癌细胞具有较强的免疫原性，从而可较大程度地激活机体的免疫反应有关。有研究显示在HER2阳性肿瘤患者人群中，新辅助治疗后TIL水平提高也与更高的pCR率相关。曲妥珠单抗可以通过刺激HER2特异性的毒性T细胞来引发特异性的适应性免疫反应。之前的一项研究表明，曲妥珠单抗新辅助治疗的乳腺癌患者中，针对HER2的T细胞应答与pCR显著相关。

以前的大多数研究简单地量化肿瘤组织中T淋巴细胞的数量，但T淋巴细胞是一群极具异质性的免疫细胞群，T细胞受体(TCR)的也存在分子多样性。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，分为两类：TCR1和TCR2；TCR1由γ和δ两条肽链组成，TCR2由α和β两条肽链组成。外周血中，90％-95％的T细胞表达TCR2。TCR的每条肽链又可分为可变区(V区)，恒定区(C区)，跨膜区和胞质区等几部分，其抗原特异性存在于V区；V区又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，最能代表受体库的特异性。TCR是由V、D、J、C四个基因簇编码的，其中V区(可变区)是由V、D、J基因簇通过V-J(TCRα)和V-D-J(TCRβ)片段间的基因重排、剪接等过程编码。在重排时，β链在胚系DNA水平上先进行D-J的重排，而后V与DJ重排连接；β链VDJ基因重排完成后发生α链VJ基因重排。各个基因片段之间的连接处会随机插入丢失一些寡核苷酸片段，在T淋巴细胞的亲和力成熟阶段还会发生高频突变，在这些机制的介导下，产生了数量巨大的TCR库。因此，TCR DNA测序是一个有吸引力和潜力的替代TIL，探索肿瘤抗原特异性T细胞表面特征，并分析TCR基因多态性与治疗敏感性的相关性。在本研究中，申请人通过对新辅助治疗前外周血T细胞中TCRβ链CDR3区域进行高通量二代测序研究了TCRB的基因多态性。本申请的目标是通过对外周血T细胞中TCRβ链CDR3区基因进行高通量二代测序，以期待发现可以预测HER2阳性早期乳腺癌新辅助治疗疗效达pCR的分子标志物。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种通过检测外周血T细胞TRBV15基因频率或基因表达来预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性的方法。

本发明的目的之二在于提供一种通过抑制TRBV15基因表达来提高HER2阳性乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性的方法。

本发明的目的之三在于提供一种用于筛选提高乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性的药物的方法。

本发明的目的之四在于提供一种用于提高乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性的药物。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提供了检测TRBV15基因的产品在制备预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性的工具中的应用。

进一步，所述检测TRBV15基因的产品包括能够检测TRBV15基因频率的试剂。

进一步，所述检测TRBV15基因的产品包括能够检测TRBV15基因表达量的试剂。

更进一步，检测TRBV15基因表达量的试剂包括能够定量TRBV15基因mRNA的产品，和/或能够定量TRBV15蛋白的试剂。

本发明的定量TRBV15基因mRNA的试剂可基于使用核酸分子的已知方法来发挥其功能：如PCR、如Southern杂交、Northern杂交、点杂交、荧光原位杂交(FISH)、DNA微阵列、ASO法、高通量测序平台等。使用上述试剂可以定性地、定量地、或半定量地实施分析。

包含在上述产品中的核酸可以通过化学合成来获得，或通过从生物材料制备含有期望核酸的基因，然后使用设计用于扩增期望核酸的引物扩增它来获得。

进一步，所述PCR方法为已知方法，例如，ARMS(Amplification RefractoryMutation System，扩增不应突变系统)法、RT-PCR(逆转录酶-PCR)法、嵌套PCR法等等。扩增的核酸可以通过使用点印迹杂交法、表面等离子共振法(SPR法)、PCR-RFLP法、原位RT-PCR法、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP法、AMPFLP(可扩增片段长度多态性)法、MVR-PCR法、和PCR-SSCP(单链构象多态性)法来检测。

所述能够定量TRBV15基因mRNA的试剂包括实时定量PCR中使用的特异扩增TRBV15基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

产品中包括的引物可以通过通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备。

上面所述的核酸还可包括探针，所述探针可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员知道的方法参考已知信息来恰当设计，并通过化学合成来制备，或者可以通过从生物材料制备含有期望核酸序列的基因，并使用设计用于扩增期望核酸序列的引物扩增它来制备。

本发明的定量TRBV15蛋白的试剂可基于使用抗体的已知方法来发挥其功能：例如，可以包括ELISA、放射免疫测定法、免疫组织化学法、Western印迹等。

本发明的定量TRBV15蛋白的试剂包括特异性结合TRBV15蛋白的抗体或其片段。可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的检测产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分(部分片段)或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)₂、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。本发明的定量TRBV15蛋白的产品可以包括编码抗体或编码抗体片段的氨基酸序列的分离的核酸，包含该核酸的载体，和携带该载体的细胞。

抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合骨髓瘤细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的TRBV15蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对TRBV15蛋白的单克隆抗体。可以如下制备多克隆抗体：用与上文相同的抗原免疫动物，从经过免疫的动物收集血液样品，从血液中分离出血清，然后使用上述抗原对血清实施抗原特异性纯化。可以通过用酶处理获得的抗体或通过使用获得的抗体的序列信息来获得抗体片段。

标记物与抗体或其片段的结合可以通过本领域普遍知道的方法来实施。例如，可以如下荧光标记蛋白质或肽：用磷酸盐缓冲液清洗蛋白质或肽，添加用DMSO、缓冲剂、等准备的染料，然后混合溶液，再于室温放置10分钟。另外，标记可使用商品化的标记试剂盒，诸如生物素标记试剂盒，如生物素标记试剂盒-NH2、生物素标记试剂盒-SH(DojindoLaboratories)；碱性磷酸酶标记试剂盒诸如碱性磷酸酶标记试剂盒-NH2、碱性磷酸酶标记试剂盒-SH(Dojindo Laboratories)；过氧化物酶标记试剂盒诸如过氧化物酶标记试剂盒-NH2、过氧化物酶标记试剂盒-NH2(Dojindo Laboratories)；藻胆蛋白标记试剂盒诸如藻胆蛋白标记试剂盒-NH2、藻胆蛋白标记试剂盒-SH、B-藻红蛋白标记试剂盒-NH2，B-藻红蛋白标记试剂盒-SH、R-藻红蛋白标记试剂盒-NH2、R-藻红蛋白标记试剂盒SH(DojindoLaboratories)；荧光标记试剂盒诸如荧光素标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)555标记试剂盒-NH2、HiLyte Fluor(TM)647标记试剂盒-NH2(DojindoLaboratories)；及DyLight 547和DyLight647(Techno Chemical Corp.)、Zenon(TM)、Alexa Fluor(TM)抗体标记试剂盒、Qdot(TM)抗体标记试剂盒(Invitrogen Corporation)和EZ-标记物蛋白质标记试剂盒(Funakoshi Corporation)。为了正确标记，可以使用适宜的仪器来检测经过标记的抗体或其片段。

作为依照本发明的检测产品的样品，可以使用例如自活检受试者获得的组织样品或流体。样品不受特别限制，只要它适于本发明的测定；例如，它可以包括组织、血液、血浆、血清、淋巴液、尿液、浆膜腔液、脊髓液、滑液、房水、泪液、唾液、或其级分或经过处理的材料。

在本发明的具体实施方案中，所述样品来自受试者的血液。即在本发明的具体实施方案中，本发明所述的检测TRBV15基因指的是检测外周血T细胞中的TRBV15基因。

进一步，本发明的乳腺癌患者是HR阴性HER2阳性乳腺癌。

本发明还提供了一种预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性的工具，所述工具包括能够检测TRBV15基因频率的试剂，或能够检测TRBV15基因表达量的试剂。

进一步，所述检测TRBV15基因频率的试剂包括免疫组库测序方法中使用的试剂；所述检测TRBV15基因表达的试剂包括能够定量TRBV15基因mRNA的试剂，和/或能够定量TRBV15蛋白的试剂。

更进一步，所述能够定量TRBV15基因mRNA的试剂是实时定量PCR中使用的特异扩增TRBV15基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。所述能够定量TRBV15蛋白的试剂包括特异性结合TRBV15蛋白的抗体。

进一步，所述预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性的工具包括但不限于芯片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高通量测序平台是一种特殊的诊断乳腺癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。在高通量测序中获知TRBV15基因的异常与乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性相关也属于TRBV15的用途，同样在本发明的保护范围之内。

本发明的检测产品、预测工具中使用的抗TRBV15抗体或其片段所识别的氨基酸的数目没有特别限制，只要抗体能够结合TRBV15即可。

本发明还提供了一种预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)获取受试者的样品；

(2)检测受试者样品中TRBV15基因频率或基因表达；

(3)将测得的TRBV15基因频率或基因表达与受试者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性关联起来。

(4)与不敏感性患者相比，TRBV15基因频率降低，或TRBV15基因表达降低，则受试者被判断对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗具有敏感性。

本发明还提供了一种提高乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性的方法，所述方法包括抑制TRBV15基因或TRBV15蛋白。

进一步，所述方法包括抑制TRBV15基因的表达，或抑制TRBV15蛋白的表达或抑制TRBV15蛋白的活性。

本发明还提供了一种致敏剂的筛选方法，可以通过在对癌细胞添加测试药物后或在对肿瘤模型动物施用测试药物后的某个时期测量TRBV15基因或者TRBV15蛋白的表达水平来测定致敏剂对癌细胞对治疗药物敏感性。更具体地说，当TRBV15基因或者TRBV15蛋白的表达水平在添加或施用测试药物后降低时，可选择该药物作为提高乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性的致敏剂。

本发明还提供了一种提高乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性的药物，所述药物包含TRBV15的抑制剂。

本发明的TRBV15的抑制剂不受限制，只要所述抑制剂能够抑制TRBV15或涉及TRBV15上游或下游途径的物质的表达或活性，且对于提高乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性有效的药物即可。

本发明还提供了上述抑制剂在制备提高乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性的药物中的应用。

进一步，所述抑制剂包括针对TRBV15基因表达的干扰RNA，或者负调控miRNA、负调控型的转录调控因子、或抑制型靶向小分子化合物。

本发明的抑制剂可以通过本领域任何已知的方式配制药物组合物来使用。这种组合物包含活性成分，加上一种或多种药物可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂及其它赋形剂，这依赖于给药方式及所设计的剂量形式。本领域枝术人员已知的治疗惰性的无机或有机的载体包括(但不限于)乳糖、玉米淀粉或其衍生物、滑石、植物油、蜡、脂肪、多羟基化合物例如聚乙二醇、水、蔗糖、乙醇、甘油，诸如此类，各种防腐剂、润滑剂、分散剂、矫味剂。保湿剐、抗氧化剂、甜味剂、着色剂、稳定剂、盐、缓冲液诸如此类也可加入其中，这些物质根据需要用于帮助配方的稳定性或有助于提高活性或它的生物有效性或在口服的情况下产生可接受的口感或气味，在这种组合物中可以使用的制剂可是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，本发明的抑制剂可以单独给药，或以各种组合给药，以及与其它治疗药剂一起结合形式给药。如此配制的组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式把抑制剂进行给药。

本发明的药物可根据需要制备成各种剂型。包括但不限于，经皮、粘膜、鼻、口颊、舌下或经口使用的片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于静脉内，腹膜内，眼内，动脉内，肺内，口服，小泡内，肌肉内，气管内，皮下的，通过皮肤，通过胸膜，局部的，吸入，通过粘膜，皮肤，肠胃，关节内，心室内，直肠，阴道，颅骨内，尿道内，肝内，瘤内。在某些情况下，可以系统地给药。在某些情况下是局部地给药。

本发明的药物的剂量不受限制，只要获得期望的效果即可。

在发明的具体实施方案中，本发明的所述乳腺癌患者收集的是HR阴性HER2阳性乳腺癌患者。

在发明的具体实施方案中，本发明的所述化疗药物包括紫杉醇和卡铂的组合，或紫杉醇和表柔比星的组合。

本发明的优点和有益效果：

本发明发现了一种预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性的分子标志物，使用该分子标志物可以在乳腺癌治疗之前即可作出判断，为临床医生制定治疗方案提供指导。

本发明的TRBV15抑制剂可用作提高乳腺癌患者对治疗药物敏感性的致敏剂。

附图说明

图1显示利用二代测序检测与乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性相关的基因频率统计图；

图2显示利用QPCR检测TRBV15基因在non-pCR和pCR组中的差异表达图。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1筛选与乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性相关的基因标志物

1、样品收集

1.1纳入标准

研究纳入临床经病理确诊ER/PR阴性HER2阳性浸润性乳腺癌患者26例，平均年龄48岁，患者临床分期为II-III期，21位患者接受4-6个周期的曲妥珠单抗联合紫杉醇+卡铂治疗(TCH)新辅助治疗，5位患者接受曲妥珠单抗联合表柔比星+紫杉醇(ATH)新辅助治疗。患者既往未因乳腺癌行任何其他抗肿瘤治疗(包括放疗、化疗及靶向治疗、内分泌治疗)。其中11例患者术后病理疗效达病理完全缓解(pCR)和15例患者为非完全缓解(non-pCR)。

1.2样本和临床资料采集

取得患者知情同意后，采集患者新辅助治疗前的外周血样本。

采集血样本后，于4℃，1600g离心10min，离心后将上清(血浆)分装到1.5mL/2mL离心管中，即得到分离后所需血细胞。血浆样本处理完后，分离得到的血浆及剩余血细胞均保存到-30℃冰箱中，避免反复冻融。

2、DNA的提取和定量

采用QIAamp DNA Mini Kit(商品号：51306)提取外周血细胞中的DNA，实验步骤详见说明书。

Qubit(Invitrogen，the Quant-iT TM dsDNA HS Assay Kit)定量所提取的DNA，要求DNA≥1g，OD260/OD280≥1.8，OD260/OD2300≥2。

3、TCRB的多重PCR扩增

使用QIAGEN的多重PCR试剂盒进行TCRB的CDR3的多重PCR扩增。

3.1PCR1反应

配置PCR1反应体系：2×多重PCR缓冲液25μl，5×Q溶剂5μl，上下游引物各1μl，DNA模板600ng。

PCR1扩增条件：95℃15min；(94℃30s，60℃90s，72℃30s)×10个循环；72℃5min；4℃保持。

使用磁珠(Agencourt No.A63882,Beckman,Beverly,MA,USA)纯化PCR产物的目标片段。

3.2PCR2反应

对PCR1的扩增产物进行第二轮的PCR扩增；

向扩增产物中加入2μl通用引物，25μlphusion master mix，加入无核酸酶水至终体积50μl；

反应程序：98℃1min；(98℃20s，65℃30s，72℃30s)×25个循环，72℃5min，4℃保持。

4、多重PCR产物目的片段的纯化、构库以及测序

1)琼脂糖凝胶电泳检测(400mA/100V,2h)；

2)回收200-350bps的目的片段；

3)使用QIAGEN公司的QIAquick Gel Purification Kit进行纯化；

4)构建cDNA文库；

5)使用IlluminaHiSeq 3000平台对样品进行上机测序。

5、数据分析

1)对新测序序列进行数据过滤，去除接头序列以及比对质量小于30的测序序列；

2)将1)中得到的测序序列与IMGT数据库中V、D和J区基因片段的胚系参考序列进行比对注释，同时根据唯一标签对每个模板的唯一标记，对各免疫亚克隆进行统计定量；

3)对2)的结果进行序列结构分析，免疫组库表达谱分析、Biomarker分析。

6、统计学分析

使用GraphPad Prism 5.01进行统计学分析，结果数据以mean±SEM、或者中位数和范围；使用Mann-Whitney U检测或非配对t检验对不同组间比例和变量进行比较分析，使用Pearson对单变量间的相关性进行分析。使用双边分析，认为当P<0.05时具有统计学意义。

7、结果

结果表明，与非完全缓解组(non-pCR)相比，病理完全缓解组(pCR)中TRBV15基因频率显著降低(如图1所示)。

实施例2差异基因在大样本中的验证

1、样品收集

1.1纳入标准

研究纳入临床经病理确诊ER/PR阴性HER2阳性浸润性乳腺癌患者80例，平均年龄47岁，患者处于临床II-III期。32例患者接受曲妥珠单抗联合表柔比星+紫杉醇(ATH)的新辅助治疗，48例患者接受曲妥珠单抗联合紫杉醇+卡铂(TCH)的新辅助治疗。经统计，疗效non-pCR的患者49人，疗效pCR的患者31人。

1.2血液总RNA提取

取得患者知情同意后，采集患者治疗前的外周血样本。

(1)新鲜全血，红细胞裂解液(1：1)，颠倒混匀数次，静置5min。10000g，4℃，10min。此时可见白细胞沉淀和上层亮红色的液体。

(2)加入TRIzol(10⁶-10⁷细胞加500μl)，反复抽吸，直至有大量泡沫产生(细胞裂解的标志之一)，常温孵育5min。

(3)加入氯仿(氯仿：TRIzol＝1：5)，剧烈混匀15s,室温静置10min。

(4)离心，12,000g 15min，4℃。

(5)小心吸取上清液，转移到新EP管中,加入异丙醇(异丙醇：TRIzol＝1:2),充分混匀(8-10次),室温孵育10min。

(6)离心，12,000g 10min，4℃。

(7)可见管底有凝胶状沉淀，弃去上清液，加入 75％乙醇(乙醇：TRIzol＝1:1)，温和混匀，7500g，5min。

(8)弃尽上清液，倒扣在滤纸片上(放在玻璃皿中)室温干燥5min(不要干透，即RNA略微出现透明时)，加入60μl DEPC水溶解沉淀。

2、逆转录

用逆转录缓冲液对lμg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μl反应体系，每个样品取1μg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入以下组分：DEPC水，5×逆转录缓冲液，10mmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30μmmol/l OligodT,200U/μl M-MLV，模板RNA。42℃孵育1h，72℃10min，短暂离心。

3、实时荧光定量PCR

采用25μl反应体系，每个样本设置3个平行管，所有扩增反应均重复三次以上以保证结果的可靠性。

配制以下反应体系：SYBR Green聚合酶链式反应体系12.5μl，正向引物(5μM/μl)1μl，反向引物(5μM/μl)1μl，模板cDNA 2.0μl，无酶水8.5μl。

引物序列如下：

扩增TRBV15基因的正向引物序列为5’-CTGTTCCACTACTATGAC-3’(SEQ ID NO.1)，反向引物序列为5’-CAAGAAAGCAGAAAGAAG-3’(SEQ ID NO.2)；

扩增GAPDH基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’(SEQ IDNO.3)，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’(SEQ ID NO.4)。

扩增程序：95℃10min，(95℃5s，60℃60s)*45个循环。以SYBR Green作为荧光标记物，在Light Cycler荧光实时定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确定目的条带，ΔΔCT法进行相对定量。

4、结果

结果如图2显示，与疗效non-pCR组相比，pCR组患者TRBV15基因mRNA水平显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国医学科学院肿瘤医院

<120> 一种检测外周血TCR可变区编码基因的液体活检试剂盒及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ctgttccact actatgac 18

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

caagaaagca gaaagaag 18

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttaactctg gtaaagtgga tat 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtggaatca tattggaaca 20

Claims (6)

1.检测TRBV15基因的产品在制备预测乳腺癌患者对曲妥珠单抗与化疗药物联合治疗的敏感性的工具中的应用，其特征在于，所述检测TRBV15基因的产品是能够检测TRBV15基因频率的试剂，或能够检测TRBV15基因mRNA水平的试剂；所述乳腺癌是HR阴性HER2阳性乳腺癌。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测TRBV15基因的产品是检测外周血T细胞中的TRBV15基因的产品。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述化疗药物包括紫杉醇和卡铂的组合，或紫杉醇和表柔比星的组合。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测TRBV15基因频率的试剂包括免疫组库测序方法中使用的试剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述免疫组库测序方法中使用的试剂包括特异性扩增CDR3区域的引物。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测TRBV15基因mRNA水平的试剂是实时定量PCR中使用的特异扩增TRBV15基因的引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。

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