CN110082538B - CCR9+IL-17+Treg细胞在制备用于检测NEC的试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了本发明提供CCR9⁺IL‑17⁺Treg细胞在制备用于检测NEC的试剂盒中的应用，NEC患者外周血中的CCR9⁺IL‑17⁺Treg细胞得到升高，且NEC患者外周血中的CCR9⁺IL‑17⁺Treg细胞与Bell分期呈负相关，CCR9⁺IL‑17⁺Treg细胞可作为NEC的标志物。

Description

CCR9+IL-17+Treg细胞在制备用于检测NEC的试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞在制备用于检测NEC的试剂盒中的应用。

背景技术

坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis，NEC)是新生儿最常见的胃肠道急症。NEC多见于早产儿，在极低出生体重(extremely low birth weight，ELBW) 儿中，其发生率和死亡率分别高达10％和50％。幸存者常伴有肠狭窄、肠外瘘、胆汁淤积、短肠综合征等严重胃肠道并发症，甚至还会对远期神经系统发育造成影响，这将给家庭和社会带来沉重负担。目前普遍认为，肠道菌群异常定植、缺血缺氧、配方奶喂养以及其它因素协同作用导致未成熟肠黏膜损伤，促使炎性细胞释放大量促炎因子引起炎性坏死是其发生的基本机制。

目前，越来越多的免疫细胞如单核/巨噬细胞、γδT细胞、Th17细胞(T helper 17cell，Th17)、调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)等异常增殖已被证实与NEC 发生密切相关。

因此，急切希望通过深入开展NEC炎性坏死密切相关的细胞分子机制研究，为加强和促进NEC防治工作提供理论基础。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术存在的不足，而提供CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞在制备用于检测NEC的试剂盒中的应用，NEC患者外周血中的CCR9⁺IL-17⁺Treg 细胞得到升高，且NEC患者外周血中的CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞与Bell分期呈负相关，CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞可作为NEC的标志物。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞在制备或筛选用于检测坏死性小肠结肠炎的试剂盒中的应用，所述CCR9⁺IL-17⁺Treg 细胞为阳性表达归巢分子CCR9和白细胞介素IL-17。

作为上述技术方案的改进，所述CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞还高表达以下蛋白： CTLA-4、CD127、CCR6、CD161和IL-10。

另外，本发明还提供用于检测CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞的试剂在制备或筛选用于检测坏死性小肠结肠炎的试剂盒中的应用。

另外，本发明还提供一种用于检测坏死性小肠结肠炎的试剂盒，其包括用于检测CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞的试剂。

作为上述技术方案的改进，用于检测CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞的试剂包括用于检测Treg细胞的试剂及荧光素标记的CCR9抗体、荧光素标记的IL-17抗体。

作为上述技术方案的进一步改进，用于检测Treg细胞的试剂包括荧光素标记的CD4抗体、荧光素标记的CD25抗体和荧光素标记的CD127抗体。

作为上述技术方案的更进一步改进，用于检测Treg细胞的试剂还至少包括荧光素标记的CTLA-4抗体、荧光素标记的CCR6抗体、荧光素标记的CD161 抗体和荧光素标记的IL-10抗体中的一种。

本发明有益效果：本发明提供CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞在制备用于检测NEC 的试剂盒中的应用，NEC患者外周血中的CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞得到升高，且 NEC患者外周血中的CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞与Bell分期呈负相关， CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞可作为NEC的标志物。

附图说明

图1显示研究对象基本临床特征；

图2为研究对象外周血中白细胞和淋巴细胞的计数；其中，图左WBC为白细胞计数；图右ALC为淋巴细胞计数；CTRL：对照组；NEC：疾病组；

图3显示NEC病人中白细胞和淋巴细胞与Bell分期的相关性；其中，图左显示WBC与Bell分期无明显相关；图右显示ALC与Bell分期无明显相关；Bell 分期：一期(I)、二期(II)和三期(III)；

图4显示异常白细胞计数分布特征；其中，图左显示异常WBC在CTRL和NEC组中的分布特征，方框中提示低异常WBC计数在NEC中明显升高；图右显示异常WBC与Bell分期无明显相关；

图5显示淋巴细胞亚群分析射门策略；

图6显示淋巴细胞亚群分布特征；其中，上图为淋巴细胞亚群绝对计数；下图为淋巴细胞亚群百分比含量；

图7显示NEC病人中各淋巴细胞亚群与Bell分期的相关性；其中，上图显示NEC病人各淋巴细胞亚群绝对计数与Bell分期关系；下图显示NEC病人各淋巴细胞亚群百分比含量与Bell分期关系；

图8显示代表性CCR9⁺T细胞亚群分布特征；其中，上图为代表性CCR9⁺ CD3⁺T细胞流式散点图，中图为代表性CCR9⁺CD4⁺T细胞流式散点图，下图为代表性CCR9⁺CD8⁺T细胞流式散点图；

图9显示CCR9⁺T细胞亚群在数量及频率上的分布特征；其中，上图为 CCR9⁺CD3⁺T细胞数量(左)和频率(右)在CTRL和NEC中的统计分析，中图为CCR9⁺CD4⁺T细胞数量(左)和频率(右)在CTRL和NEC中的统计分析，下图为CCR9⁺CD8⁺T细胞数量(左)和频率(右)在CTRL和NEC中的统计分析；

图10显示NEC病人中CCR9⁺T细胞亚群与Bell分期的相关性；其中上图显示NEC病人中各CCR9⁺T细胞亚群绝对计数与Bell分期关系，下图显示NEC 病人中各CCR9⁺T细胞亚群百分比含量与Bell分期关系；

图11显示RORγt和Foxp3在NEC和CTRL组转录情况；其中，图左为Foxp3 的转录水平，图右为RORγt的转录水平，CTRL：对照组；NEC：疾病组；样本数：CTRL，n＝7，NEC，n＝6；ns：在两组间差异无统计学意义；*：P<0.05；

图12显示NEC病人外周血中CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞明显升高；其中，图 12A为代表性流式散点图，显示NEC病人外周血中CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞明显升高；图12B统计分析显示CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞在NEC组显著高于CTRL组； CTRL：对照组；NEC：疾病组；样本数：CTRL，n＝73，NEC，n＝71；***：P<0.001；

图13显示NEC病人中CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞与CCR9⁺CD4T细胞关联性；其中，图左为CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞与CCR9⁺CD4⁺T细胞在频率上进行关联分析，图右为CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞与CCR9⁺CD4⁺T细胞在绝对计数上进行关联分析；

图14显示NEC病人中CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞与Bell分期的相关性；其中，图左显示CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞与Bell分期在频率上进行关联分析，图右显示 CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞与Bell分期在绝对计数上进行关联分析。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明。

材料与方法

研究对象

病例组：选取2016年3月至2017年9月在中山大学附属第六医院新生儿科、广东省妇幼保健院新生儿科(包括新生儿外科)、东莞市第五人民医院新生儿科、佛山市幼保健院新生儿科病房住院治疗的77例NEC病人，参照《实用新生儿学》(第四版)NEC修正的Bell分期标准，根据最后诊断结果分为3组：疑似NEC(NEC I期28例)、确诊NEC(NEC II期30例)、进展NEC(NEC III 期19例)，其中疑似NEC均出现了喂养不耐受症状(腹胀、胃潴留)，所有病例均经过影像学检查。

对照组：以同期住院的与病例组同胎龄、性别、出生体重、分娩方式、出生5分钟Apgar评分和采血日龄相匹配的80例非NEC新生儿(排除全身炎症反应综合征、脓毒症、消化道畸形及遗传代谢病患儿)为对照组。

如图1所示，两组间的基本临床资料无明显差异。本研究已通过中山大学附属第六医院伦理委员会审查，符合中华伦理委员会制定的伦理学标准，同时获得研究对象监护人的知情同意。

主要试剂

FITC标记anti-CD3(HIT3a)，BD公司，美国；APC标记anti-CD3(UCHT1)， BD公司，美国；APC/Cy7标记anti-CD4(RPA-T4)，BD公司，美国；APC/Cy7 标记anti-CD8(RPA-T8)，BD公司，美国；APC/Cy7标记anti-CD19(SJ25C1)， BD公司，美国；PE-Cy7标记anti-CD25(BC96)，BioLegend公司，美国；Alexa 488标记anti-CCR9(112509)，BD公司，美国；PE标记anti-CD45RO(UCHL1)， BD公司，美国；PE标记anti-CCR7(G043H7)，BioLegend公司，美国；PE标记anti-CD62L(SK11)，BD公司，美国；PE标记anti-Foxp3(259D/C7)，BD公司，美国；PerCP-Cy5.5标记anti-IL-17A(N49-653)，BD公司，美国；PE-Cy7 标记anti-CD45RA(L48)，BD公司，美国；APC标记anti-CD127(A019D5)， BioLegend公司，美国；APC标记anti-CTLA-4(BNI3)，BioLegend公司，美国； APC标记anti-CD127(A1)，BioLegend公司，美国；APC标记anti-CCR6(G034E3)，BioLegend公司，美国；APC标记anti-CD161(HP-3G10)，BioLegend 公司，美国；APC标记anti-IL-10(JES3-19F1)，BioLegend公司，美国；BD PharmLyse^TM(Cat.No.555899)，BD公司，美国；BD Cytofix/Cytoperm^TM Fixation/Permeabilization Kit，BD公司，美国；IL-10酶联免疫吸附测定试剂盒，武汉华美生物工程有限公司(货号：CSB-E04593h)，中国；IL-17A酶联免疫吸附测定试剂盒，武汉华美生物工程有限公司(货号：CSB-E12819h)，中国。

实验方法

标本收集与处理

病例组样本收集均在临床诊断NEC后4h内，应用无菌、肝素抗凝管采集 1ml外周静脉血，充分混匀后经3000转/分钟，4℃，离心10分钟，取上层血浆于无菌EP管中，然后置于-80℃冰箱保存，集中用酶联免疫吸附测定试剂盒 (ELISA)对相关的细胞因子和肠屏障功能蛋白检测。下层血细胞即刻进行流式检测。对照组选择与病例组一致的采血日龄采血，具体要求同上。此外，对于部分病例组和对照组样本，另外应用无菌、EDTA抗凝管采集2ml外周静脉血，充分混匀后，分离获取外周血单个核细胞(PBMCs)，经流式分选后，提取RNA。

流式检测

全血细胞表面抗原染色

1)将离心后的下层血细胞混匀后取50μl，加入1ml 1×BD PharmLyse，轻轻涡旋后，室温静止10分钟，裂解红细胞；

2)500g，4℃，离心5分钟；

3)弃上清、重悬细胞后，加入2ml 1×染色Buffer，轻轻涡旋洗涤细胞；重复步骤2)，弃上清并重悬细胞；

4)加入100μl 1×染色Buffer，按照使用要求加入相应量的抗体，避光冰浴 20分钟；

5)加入1ml 1×染色Buffer，500g，4℃，离心5分钟，洗涤1次，小心吸弃上清；

6)加入300μl～500μl 1×染色Buffer重悬细胞，上机检测。

全血细胞活化及胞内抗原染色

1)将离心后的下层血细胞用含有10％胎牛血清的RPMI-1640完全培养基按照1:3稀释，混匀后取200μl于48孔板；

2)加入终浓度为50ng/ml的PMA、1μM的离子霉素，及10μg/ml的BFA，混匀后于37℃、含有5％的CO2细胞培养箱内孵育5小时；

3)收集细胞，500g，4℃，离心5分钟，弃上清；

4)加入1ml 1×BD PharmLyse，轻轻涡旋后，室温静止10分钟，裂解红细胞；

5)500g，4℃，离心5分钟，弃上清；

6)重悬细胞，加入2ml 1×染色Buffer，轻轻涡旋洗涤细胞；重复步骤5)，弃上清并重悬细胞；

7)加入100μl 1×染色Buffer，按照使用要求加入相应量的表面标记抗体，避光冰浴20分钟；加入1ml 1×染色Buffer，500g，4℃，离心5分钟，洗涤2 次，弃上清；

8)加入500μl预冷的固定/破膜剂，轻轻涡旋后，室温避光孵育20分钟； 500g，4℃，离心5分钟，弃上清；

9)加入2ml BD Perm/Wash^TMbuffer，室温避光孵育10分钟；500g，4℃，离心5分钟，弃上清；

10)加入100μl BD Perm/Wash^TMbuffer，按照使用要求加入相应量的胞内标记抗体，避光冰浴30分钟；加入2ml BD Perm/Wash^TMbuffer，500g，4℃，离心5分钟，洗涤2次，弃上清；

11)加入300μl～500μl 1×染色Buffer重悬细胞，上机检测。

流式分选

流式分选上机前的操作步骤同全血细胞表面抗原染色，分选后纯化的细胞用于RNA的抽提。

细胞总RNA提取

1)收集细胞5×10⁵于无RNA酶的EP管中，并用PBS洗涤一次，然后将1 ml Trizol加入EP管中，反复轻轻吹打至澄清；

2)室温放置10分钟，待充分裂解后加入200μl氯仿，盖上EP管盖并剧烈震荡15秒，室温静置5分钟；

3)4℃、12000g离心15分钟，轻轻打开管盖吸取上层水相至新的无RNA 酶的EP管中，加预冷的等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温孵育10分钟；

4)4℃、12000g离心10分钟，小心移去上清(此时仔细观察可见管底有白色RNA沉淀)；

5)加入1ml经无RNA酶的去离子水配制的75％乙醇，4℃、7500g离心5 分钟，洗涤2次；

6)彻底弃上清后，使RNA自然风干至透明状，然后将其溶解在适量的无 RNA酶的水中，经紫外光分光光度计和琼脂糖凝胶电泳鉴定后，剩余RNA产物保存于-80℃超低温冰箱备用。

逆转录反应(cDNA第一链合成)

1)去除RNA样本中污染的基因组DNA，按DNase I试剂盒说明书操作，具体如下：于无RNA酶的PCR管中依次加入下列试剂(总RNA1μg，10X DNase I Reaction Buffer 1μl，Dnase I 1μl，补充DEPC处理的去离子水至总体积10μl)，然后室温孵育15分钟，接着加入50mM EDTA1μl，65℃加热反应10分钟后终止反应，即可除去污染的基因组DNA；

2)于无RNA酶的PCR管中加入下列试剂：纯化的RNA样本1μg， Oligo(dT)18primer(0.2μg/μl)1μl，补充DEPC处理的去离子至12μl；轻轻混匀后在PCR仪内反应，条件如下：70℃5分钟，4℃终止反应。

3)取出PCR管置于冰上，然后依次加入AMV 5×反应缓冲液4μl，10mM dNTP Mix 2μl，Ribonuclease inhibitor 1μl，接着在PCR仪内反应，条件如下： 37℃5分钟，4℃终止反应；

4)取出PCR管置于冰上，然后加入M-Mulv Reverse Transcriptase 1μl，轻轻混匀后在PCR仪内反应，条件如下：42℃温育60分钟，接着70℃10分钟，最后4℃终止反应；

5)反应结束后，将逆转录产物保存于-80℃超低温冰箱备用。

荧光定量PCR

1)定量PCR反应各基因引物序列见表1；表1中，F：Forward sequence； R：Reversesequence；

表1各基因引物序列及反应条

2)于0.5ml PCR管内依次加入表2中试剂至反应总体积20μl；

表2荧光定量PCR反应体系

3)反应体系配制好后，点动离心将上述试剂混合均匀，并避免产生气泡，然后放置于荧光定量PCR仪反应板上，盖紧后按照表3反应条件进行扩增；

表3荧光定量PCR反应条件

4)每个样本均以β-actin为内参基因，以2^-△△Ct计算方法对基因表达水平进行分析；其中，△Ct＝(目的基因平均Ct-内参平均Ct)；△△Ct＝(待测样品中目的基因△Ct-参照样品中目的基因△Ct)。

ELISA检测

血浆IL-10、IL-17A的浓度应用酶联免疫吸附测定试剂盒(武汉华美)，按照说明书操作要求进行检测，具体如下：

1)试剂盒基本参数

a.IL-10ELISA试剂盒(范围：12.5pg/ml-800pg/ml；灵敏度：3.12pg/ml；精密度：批内CV％<8％，批间CV％<10％；特异性：检测人IL-10，与其他相关蛋白无交叉反应)；

b.IL-17A ELISA试剂盒(范围：6.25pg/ml-400pg/ml；灵敏度：1.56pg/ml；精密度：批内CV％<8％，批间CV％<10％；特异性：检测人IL-17A，与其他相关蛋白无交叉反应)；

2)细胞因子检测原理：采用双抗体夹心ELISA(Sandwich ELISA)，该方法适用于血清、脑脊液、胸腹水等各种液相中的可溶性抗原的检查；简单来说，先将已知抗体包被在固相上，洗去未吸附的抗体；加入待检样本，充分作用后，样本中相应抗原与固相上已知抗体相结合，洗去未结合的抗原成分；加入已知酶标抗体，再洗去未结合的酶标抗体；加底物后，酶分解底物产生呈色反应，根据颜色深浅判定待检样本中抗原含量；包被抗体和酶标抗体一般是针对抗原分子中不同表位的抗体；

3)样本及试剂的准备

a.试剂、样本的复温：室温(18-25℃)下，将各种试剂放置30～40分钟进行复温；

b.标准品的稀释：将复温的标准品10000rpm离心30秒，使其瓶盖及瓶口的粉末全部沉与瓶底；然后轻轻开启瓶盖加入1ml样本稀释液，并将加样枪深入管底反复吹打5～8次助其溶解，待充分溶解并混匀即可得到标准品并(按照试剂盒说明书，对标准品进行倍比稀释，具体如下：对7个1.5ml的EP管依次编号(S0-S6)，并加入250μl样本稀释液；从S7的标准品管中吸取250μl标准品到S6中；轻轻吹打并混匀后，再从S6中吸取250μl到S5中；然后以此类推，完成标准品的倍比稀释；S0仅加入样本稀释液作为空白对照组；即可分别获得IL-10(表1-7)和IL-17A不同稀释倍数的标准品；在临用前15分钟内配制)；

c.浓缩洗涤缓冲液稀释流程：对浓缩洗涤缓冲液进行25倍的稀释，具体如下：量取480ml的去离子水于烧杯中，再量取20ml浓洗涤缓冲液，并缓慢加入去离子水中，待混合均匀后即可使用，一般在临用前配制；低温保存时，浓洗涤缓冲液会有盐析出，稀释前可在温水浴中加热帮助其溶解；

d.配制生物素标记抗体工作液：将复温的生物素标记抗体瓶10000rpm离心30秒，使瓶内抗体全部集中到管低，然后应用抗体稀释液对其进行100倍的稀释；稀释后轻轻混匀后即可使用，一般在临用前配制；

e.配制辣根过氧化物酶标记亲和素工作液：将复温的辣根过氧化物酶标记亲和素瓶10000rpm离心30秒，使瓶内容物全部集中到管低，然后应用辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液对其进行100倍的稀释；稀释后轻轻混匀后即可使用，一般在临用前配制；

4)ELISA操作步骤：a.加样：标准品和待测样本均设置1个复孔，每孔 100μl；b.孵育：样品加完后，轻轻晃动混匀，盖上板贴，37℃孵育2h；c.洗板：小心去掉板贴，弃去液体、甩干，不同洗涤；d.加生物素标记抗体工作液， 100μl/孔；f.盖上新板贴，37℃温育1小时；g.小心去掉板贴，弃去液体、甩干，在全自动洗板机上洗板3次，每孔加稀释缓冲液200μl，浸泡2分钟；h.加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液，100μl/孔；i.盖上新板贴，37℃温育1小时； j.弃去液体并甩干，然后在自动洗板机上洗3次，每孔加稀释缓冲液200μl，浸泡2分钟；k.加入TMB，90μl/孔；l.37℃避光孵育15分钟至30分钟；m.终止反应：加入终止液50μl/孔；n.读取数据：用酶标仪在450nm波长处读取各孔光密度值(终止反应5分钟内进行该操作)。

数据统计与分析

除非单独说明，所有数据以均值±标准差表示，统计采用Mann-Whitney U 检验，与Bell分期及CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞相关性分析采用Spearman等级检验。

结果

CCR9⁺CD4⁺T细胞在NEC病人外周血中显著升高

首先，对白细胞(white blood cell,WBC)和淋巴细胞(absolute lymphocyte,ALC)计数分析，如图2所示，发现仅WBC在NEC组存在轻度但有差异性降低、ALC无明显变化。如图3所示，WBC和ALC二者与新生儿NEC修正Bell 分期标准均无明显的相关性。

如图4所示，低异常WBC计数在NEC中明显升高，异常WBC与Bell分期无明显相关性；由于异常白细胞计数(WBC<5×10⁶/ml，或WBC>20×10⁶/ml) 是NEC常见的临床表现，可见NEC组WBC降低可能由较多的低异常白细胞计数所致。

如图5所示，应用PFC对外周血淋巴细胞亚群分析；如图6所示，发现CD3⁺T 细胞、B细胞及CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞亚群在NEC和CTRL间差异无统计学意义；如图7所示，CD3⁺T细胞、B细胞及CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞亚群与 Bell分期也无明显的相关性。

应用淋巴细胞小肠归巢特征性分子CCR9联合CD3、CD4和CD8对T细胞进行标记，如图8所示，发现CCR9⁺CD3⁺T、CCR9⁺CD4⁺T和CCR9⁺CD8⁺T细胞在NEC和CTRL组中均有表达。

如图9所示，CCR9⁺CD3⁺T细胞计数在NEC病人中虽然仅显示升高趋势，但是其频率在NEC病人中明显升高；事实上，CCR9⁺CD3⁺T细胞在NEC病人中的升高，并不是各亚群均升高，而是集中在CCR9⁺CD4⁺T细胞中(CCR9⁺ CD4⁺T细胞的频率在NEC病人中明显升高)，在CCR9⁺CD8⁺T细胞中并未观察到差异性变化。

另外，如图10所示，与Bell分期关联分析发现，CCR9⁺CD3⁺T细胞和CCR9⁺ CD4T细胞均与Bell分期呈负相关，而CCR9⁺CD8⁺T细胞与Bell分期间无明显相关性。

上述研究表明，NEC病人外周血CCR9⁺CD4⁺T细胞显著升高，而且该群细胞与临床严重程度成负相关，提示CCR9⁺CD4⁺T细胞在NEC发病中具有重要的保护作用。

NEC病人外周血升高的CCR9⁺CD4⁺T细胞亚群特征

近年来，IL-17⁺Treg细胞在多种炎症病人外周血显著升高，而且在炎症反应中具有重要作用。由于IL-17⁺Treg细胞同时表达Treg和Th17细胞特异性转录因子RORγt和Foxp3。因此，我们应用qRT-PCR技术，检测RORγt和Foxp3转录情况，如图11所示，发现在NEC组Foxp3转录水平虽然较CTRL组偏低，但差异无统计学意义；相反RORγt在NEC组明显升高。

接下来应用PFC对CCR9⁺CD4⁺T细胞检测，如图12所示，发现分泌IL-17 的Treg细胞在NEC和CTRL组中均能检测到，但是NEC病人中显著升高。

进一步关联分析，如图13所示，CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞与CCR9⁺CD4⁺T细胞存在显著的正相关；如图14所示，CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞与Bell分期呈负相关。

综合上述，这表明：

1)NEC病人外周血中升高的CCR9⁺CD4T细胞，主要为CCR9⁺IL-17⁺Treg 细胞；

2)Treg细胞可分为三个不同亚群，CD45RA⁺Foxp3^low resting Treg(rTreg) 细胞、CD45RA^-Foxp3^hi activated Treg(aTreg)细胞和CD45RA^-Foxp3^low nonsuppressive Treg(nonTreg)，后者在转录水平呈RORγt和Foxp3双阳性，同时能够产生IL-17；本发明研究发现，CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞主要集中nonTreg 细胞中，CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞高表达CTLA-4、CD127、CCR6和CD161，并能高水平分泌IL-10和IL-17A；CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞同时具有Treg细胞和Th17 细胞特征；

3)结合“CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞与CCR9⁺CD4⁺T细胞存在显著的正相关，且CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞与Bell分期呈负相关”，这表明CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞虽然在外周血中保持免疫抑制效应，但归巢至肠道固有层后则失去了抑制功能，进而发挥促炎效应。

最后所应当说明的是，以上实施例用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者同等替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞在制备用于检测坏死性小肠结肠炎的试剂盒中的应用，所述CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞为阳性表达归巢分子CCR9和白细胞介素IL-17。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞还高表达以下蛋白：CTLA-4、CD127、CCR6、CD161和IL-10。

3.用于检测CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞的试剂在制备用于检测坏死性小肠结肠炎的试剂盒中的应用。

4.一种用于检测坏死性小肠结肠炎的试剂盒，其特征在于，包括用于检测CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞的试剂。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，用于检测CCR9⁺IL-17⁺Treg细胞的试剂包括用于检测Treg细胞的试剂及荧光素标记的CCR9 抗体、荧光素标记的IL-17抗体。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，用于检测Treg细胞的试剂包括荧光素标记的CD4抗体、荧光素标记的CD25抗体和荧光素标记的CD127抗体。

7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，用于检测Treg细胞的试剂还至少包括荧光素标记的CTLA-4抗体、荧光素标记的CCR6抗体、荧光素标记的CD161抗体和荧光素标记的IL-10抗体中的一种。

Images