CN107405398A - 鉴定vsig8作为推定vista受体及其用以产生vista/vsig8激动剂和拮抗剂的用途 - Google Patents

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Abstract

鉴定了VISTA的受体(VSIG8)，以及使用这个受体鉴定或合成激动或拮抗VSIG8和/或VISTA的作用和/或VSIG8/VISTA结合相互作用的激动剂或拮抗剂化合物，优选是抗体、多肽和融合蛋白。这些拮抗剂可用于抑制VISTA对T细胞免疫性的抑制作用，以及更特定地，用于治疗癌症或感染性疾病。这些激动剂化合物可用于加强或增强VISTA对T细胞免疫性的抑制作用，并且由此抑制T细胞免疫性，诸如在治疗自体免疫性、过敏或炎症性病状时。也提供用于鉴定这些激动剂和拮抗剂化合物的筛选测定。

Description

鉴定VSIG8作为推定VISTA受体及其用以产生VISTA/VSIG8激 动剂和拮抗剂的用途
相关申请
本申请要求2014年12月5日提交的美国临时序列号62/088,058的优先权，所述美国临时申请的内容以引用的方式整体并入本文。
领域
本申请大体上涉及鉴定VISTA(含有V区免疫球蛋白的T细胞活化抑制剂(V-regionImmunoglobulin-containing Suppressor of T cell Activation)1)的受体，所述VISTA是一种先前鉴定的属于B7家族的调节T细胞活化和增殖的免疫调节多肽。本发明也涉及所得受体用以产生激动或拮抗VSIG8的作用的化合物的用途，所述化合物可用作治疗剂，尤其在治疗癌症、感染性病状、自体免疫性、炎症和过敏性病症方面。本发明明确涉及所得受体用以产生激动或拮抗VISTA/VISTA-R结合相互作用的化合物的用途。此外，本发明涉及所述激动剂或拮抗剂用以增强或抑制受VISTA影响的免疫功能诸如CD4+或CD8+ T细胞增殖、CD4+或CD8+ T细胞活化和免疫细胞因子产生的用途。
背景
免疫负性检查点调节剂(NCR)路径已被证明是治疗人免疫相关疾病的卓越临床靶标。使用单克隆抗体(mAb)阻断两种NCR即CTLA-4和PD-1以增强肿瘤免疫性正在彻底改变对癌症的治疗，并且已将这些路径确定为人疾病情况下的临床验证靶标。更新近地，触发NCR路径的可溶性形式的NCR配体已作为用以治疗自体免疫性的免疫抑制性药物(即针对类风湿性关节炎的AMP-110/B7-H4-Ig)进入临床，并且急切等待着早期临床结果。
VISTA(含有V区免疫球蛋白的T细胞活化抑制剂(1))是一种新近鉴定的NCR配体，其最密切系统发生亲缘物是PD-L1。如同PD-L1一样，VISTA是深度抑制免疫性的配体(1)，并且如同PD-L1一样，阻断VISTA允许在临床前肿瘤学模型中产生对癌症的治疗免疫性(2)。尽管阻断VISTA会增强免疫性，尤其是CD8+和CD4+介导的T细胞免疫性，但用VISTA的细胞外结构域的可溶性Ig融合蛋白(VISTA-Ig)治疗会抑制免疫性，并且已显示会遏止多个鼠类自体免疫性疾病模型的进展。
明确科学证据已显示VISTA是诱导深度T细胞抑制的配体；然而，转导这个抑制作用的受体的身份当前未知。鉴于在NCR路径方面的受体的极低uM亲和力和低密度，对它们的鉴定已特别具有挑战性。
在本文中，我们呈现已将那个“含有V组和免疫球蛋白结构域的蛋白8(V-Set andImmunoglobulin domain containing 8)”鉴定为VISTA的受体(下文称为“V-R”或“VSIG8”)的实验方法。我们进一步公开验证VSIG8与VISTA在体外和在体内特异性相互作用，并且VISTA与VSIG8的相互作用对T细胞活化、增殖和/或免疫细胞因子产生具有抑制作用的测定。
鉴定VSIG8作为VISTA的受体具有许多临床和科学前景。已知VISTA拮抗剂例如αVISTA mAb适用作治疗肿瘤学疾病和感染的治疗剂。此外，VISTA的片段可用作VISTA拮抗剂，并且潜在适用作治疗肿瘤学疾病和感染的治疗剂。此外，已证明VISTA多肽例如VISTA-Ig融合蛋白用于预防和治疗自体免疫性、炎症和过敏性病症。
因此，VSIG8将类似地适用，因为它将提供用于开发VISTA-R激动剂和拮抗剂的第二独立靶标。实际上，关于B7家族中的受体，迄今为止出现的最有效治疗剂是(αCTLA4{叶沃(Yervoy)}和αPD-1{纳武单抗(Novolumab)})，其两者均是阻断受体信号传导的抗体而非针对相应配体的抗体。
因此，阻断或抑制VISTA/VISTA-R相互作用的针对VSIG8的抗体应有效治疗肿瘤学疾病和感染性疾病。特定来说，VISTA-R拮抗剂将潜在用于治疗癌症或感染性疾病适应症诸如黑素瘤和肺癌或HIV感染。相比来说，促进或增强VISTA/VISTA-R结合相互作用的VISTA-R激动剂将潜在用于治疗自体免疫适应症、过敏性适应症和炎症性适应症、GVHD、移植适应症或其中需要抑制T细胞活化、T细胞增殖或细胞因子产生的其它适应症。
此外，对V-R的鉴定将极大加快作为免疫抑制性药物的VISTA-Ig的临床开发，并且进一步促进药力学、靶标衔接和药物动力学研究的探知，所述研究可用于探知为产生最优临床结果所需的受体占位水平。
本发明通过鉴定VSIG8作为VISTA的受体来满足这些目标。
概述
本发明的一个目标在于使用结合和功能性测定来鉴定和确认VSIG8是VISTA的受体。
本发明的一个目标也在于使用鉴定的受体来产生激动或拮抗VISTA/VISTA-R结合相互作用的化合物，诸如激动性和拮抗性抗VISTA-R抗体以及VISTA-R多肽、VISTA-R片段和衍生物以及VISTA-R融合蛋白。
本发明的一个目标也在于使用激动或拮抗VISTA-R和/或VISTA/VISTA-R结合相互作用的VSIG8激动剂或拮抗剂例如激动性和拮抗性抗VSIG8抗体以及VSIG8多肽、VSIG8片段和衍生物以及VISTA-R融合蛋白来调节免疫性，尤其是T细胞和树突细胞免疫性。
本发明的一个特定目标也在于使用激动或拮抗VISTA-R和/或VISTA/VISTA-R结合相互作用的VISTA-R激动剂或拮抗剂例如激动性和拮抗性抗VISTA-R抗体以及VISTA-R多肽、VISTA-R片段和衍生物以及VISTA-R融合蛋白来调节CD4+或CD8+ T细胞活化、增殖和细胞因子产生。
本发明的一个特定目标也在于使用激动或拮抗VISTA-R和/或VISTA/VISTA-R结合相互作用的VISTA-R激动剂或拮抗剂例如激动性和拮抗性抗VISTA-R抗体以及VISTA-R多肽、VISTA-R片段和衍生物以及VISTA-R融合蛋白来治疗癌症、感染性疾病诸如病毒性感染。
本发明的一个特定目标也在于使用激动或拮抗VISTA-R和/或VISTA/VISTA-R结合相互作用的VISTA-R激动剂或拮抗剂例如激动性和拮抗性抗VISTA-R抗体以及VISTA-R多肽、VISTA-R片段和衍生物以及VISTA-R融合蛋白来治疗自体免疫性、过敏性和炎症性疾病适应症。
本发明的另一个目标在于使用鉴定的V-R来加快作为免疫抑制性药物的VISTA-Ig的临床开发，并且促进药力学、靶标衔接和药物动力学研究的探知，以及限定为产生VISTA-Ig治疗性化合物的最优临床结果所需的受体占位水平和剂量。
本发明的一个特定目标在于提供一种激动或拮抗VISTA和VSIG8的相互作用的化合物，例如特异性结合VSIG8的抗体或抗体片段，诸如激动性抗VSIG8抗体或抗体片段或拮抗性抗VSIG8抗体或抗体片段。
本发明的一个特定目标在于提供一种激动或拮抗VISTA和VSIG8的相互作用的化合物，例如人源化、人、灵长类动物源化或嵌合抗VSIG8抗体或抗体片段，例如Fab、Fab’、scFv或Fab2。
本发明的一个特定目标在于提供一种激动或拮抗VISTA和VSIG8的相互作用的化合物，例如包含VSIG8的细胞外区域的全部或一部分或与优选是人、灵长类动物或鼠类VSIG8的VSIG8的细胞外区域具有至少80％、90％、95％或更大序列同一性％的所述细胞外区域的衍生物的化合物。
本发明的一个特定目标在于提供一种激动或拮抗VISTA和VSIG8的相互作用的化合物，例如包含VSIG8的整个细胞外区域或整个细胞外区域的至少90％的化合物。
本发明的一个特定目标在于提供一种拮抗VISTA和VSIG8优选人、灵长类动物或鼠类VSIG8和/或VISTA的相互作用的化合物。
本发明的一个特定目标在于提供一种激动或拮抗VISTA和VSIG8的相互作用的化合物，例如VSIG8融合蛋白诸如VSIG8-Ig融合蛋白，优选是包含任选被诱变以消除FcR或补体结合或另一Fc效应物功能的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区或其片段的融合蛋白。
本发明的一个特定目标在于提供一种激动或拮抗VISTA和VSIG8的相互作用的化合物，例如包含任选被诱变以增强FcR或补体结合或另一Fc效应物功能的IgG1或IgG3恒定区或其部分的化合物。
本发明的一个特定目标在于提供一种激动或拮抗VISTA和VSIG8的相互作用的化合物，例如其连接于水溶性聚合物以增加血清半衰期，诸如聚乙二醇化蛋白质。
本发明的一个特定目标在于提供一种包含VISTA和VSIG8的分离的复合物，例如其中所述VISTA和/或VSIG8中的任一者或两者是多聚的。
本发明的一个特定目标在于提供一种被工程改造以表达VISTA和/或VSIG8，以及在它的表面上包含含有VISTA和VSIG8的复合物的重组细胞或经分离细胞膜。
本发明的一个特定目标在于提供一种特异性结合包含VISTA和VSIG8的分离的复合物的抗体或抗体片段，例如其中所述VISTA和/或VSIG8是多聚的，并且此外其中所述抗体优选是人、人源化、灵长类动物源化或嵌合抗体，或是Fab、Fab’、scFv或Fab2。
本发明的另一个特定目标在于提供一种特异性结合包含VISTA和VSIG8的分离的复合物的抗体或抗体片段，例如其中所述VISTA和/或VSIG8是多聚的，其中所述抗体不明显地结合单价或非复合VISTA或VSIG8，并且此外其中所述抗体优选是人、人源化、灵长类动物源化或嵌合抗体，或是FAb、FAb’、scFv或Fab2。
本发明的另一个特定目标在于提供使用根据本发明的拮抗剂化合物来抑制VISTA和VSIG8的相互作用，例如以抑制或阻断VISTA相关的对T细胞活化、增殖或细胞因子产生的抑制，例如以治疗癌症或感染性疾病诸如病毒性、细菌性、原虫、酵母或真菌性或寄生虫性疾病的方法。
本发明的另一个特定目标在于提供使用根据本发明的激动剂化合物来增强VISTA和VSIG8的相互作用，并且由此加强VISTA相关的对T细胞活化、增殖或细胞因子产生的抑制，例如以治疗自体免疫性、过敏性或炎症性病状的方法。
本发明的另一个特定目标在于提供一种连接于可检测标记、接头或治疗性部分的根据本发明的激动剂或拮抗剂化合物。
本发明的另一个特定目标在于提供一种包含诊断或治疗有效量的根据本发明的激动剂或拮抗剂化合物的诊断性或治疗性组合物，例如其适于在人疗法中使用，诸如可静脉内、皮下或肌肉内施用的组合物。
本发明的另一个特定目标在于提供一种诊断或治疗方法，其与PD-1或PD-L1激动剂或拮抗剂联合使用根据本发明的激动剂或拮抗剂化合物，例如其中所述PD-1或PD-L1激动剂或拮抗剂选自抗PD-1抗体或抗体片段、抗PD-L1抗体或抗体片段、可为单价或多聚的PD-L1多肽或其片段、可为单价或多聚的PD-1多肽或其片段、或包含任何前述各物的复合物或融合蛋白。
本发明的另一个特定目标在于提供使免疫细胞在体外或在体内与根据本发明的激动剂或拮抗剂化合物接触的方法，所述免疫细胞例如是人免疫细胞，例如其中将经接触细胞输注至人受试者诸如患有癌症或感染性疾病的受试者或患有炎症性、过敏性或自体免疫性病状的受试者中。
本发明的另一个特定目标在于提供一种包括单独或与VISTA-R联合使用VSIG8来鉴定VSIG8/VISTA激动剂或拮抗剂的筛选测定，优选是鉴定结合VSIG8以及抑制VSIG8/VISTA相互作用的化合物的结合测定，所述化合物诸如是结合VSIG8以及增强VSIG8/VISTA相互作用的化合物或抑制VISTA/VSIG8相互作用对T细胞免疫性或细胞因子产生的影响的化合物。
本发明的另一个特定目标在于提供一种包括单独或与VISTA-R联合使用VSIG8来鉴定VSIG8/VISTA激动剂或拮抗剂的筛选测定，优选是筛选增强VISTA/VSIG8相互作用对T细胞免疫性或细胞因子产生的影响的化合物的功能性测定。这些测定可为体外测定或使用表达人或啮齿动物VISTA和/或人或啮齿动物VSIG8的转基因动物，并且可为高通量筛选测定。
附图简述
图1含有显示VISTA抑制早期TCR诱导的T细胞活化的实验的结果。在实验中，分离T细胞，并且与CD3+/-对照Ig或VISTA-Ig一起培养10分钟。检测总ERK和磷酸Erk。
图2含有显示NCR的分级结构的示意图。
图3含有显示VISTA mAb治疗降低肿瘤生长的实验的结果。在实验中，小鼠用A.MB49、B.MCA105或C.EG7肿瘤细胞皮下接种，或D.用ID8-荧光素酶肿瘤细胞腹膜内接种，并且在第+1天开始用VISTA mAb 13F3每隔一天治疗(300μg)。监测皮下肿瘤生长。对于ID8-荧光素酶肿瘤，使用Xenogen IVIS在第30天将小鼠成像。
图4含有显示在NZBWF1 SLE模型的情况下，用mVISTA-IgG2a治疗性治疗使肾损害逆转，以及延长存活期的实验的结果。在这个实验中，NZBWF1雌性小鼠从24周龄开始用PBS(黑色圆圈)、150 g对照-IgG2a(蓝色方块)或150g mVISTA-IgG2a(红色三角)每3天1次进行治疗性治疗。(A)每周根据蛋白尿来监测疾病严重性。数据显示为每组6个动物的平均值±SEM，并且代表3个实验。确定对照-IgG2a相对于mVISTA-IgG2a之间的统计显著性；根据未配对曼惠特尼检验(unpaired Mann Whitney test)，p＝0.0156。相对于PBS或IgG2a对照治疗的小鼠中无存活，6只VISTA治疗小鼠中的5只得以存活。
图5显示使用淘选来检测PD-1→PD-L1相互作用。用所指示GFP标记的蛋白质转染CHO-S细胞。48小时后，在10ug/ml的板结合Fc蛋白的情况下培养细胞1小时。移除非粘附细胞，并且用胰蛋白酶-EDTA使结合的细胞释放。A)在PDL1-Fc的情况下结合之后的代表性阳性图和阴性图。B)在淘选之后回收的细胞的数目。
图6含有显示VISTA-Ig可抑制αCD3对原代人T细胞的活化的实验。这个数据确定可使用VISTA-Ig来防止作为经转化人T细胞系的Jurkat T细胞中的CD69的上调。
图7含有将富集的T细胞群体中的VSIG8的表达相对于含有总脾细胞的样品进行比较的qPCR测定的结果。
图8含有显示VISTA融合蛋白特异性结合VSIG8过表达性293细胞的实验。
图9A-C含有显示针对VSIG8和VISTA的抗体阻断VISTA Ig与VSIG8之间的相互作用的实验。
图10含有指示VISTA-Ig显示低水平的结合小鼠VSIG8过表达性细胞的能力的实验。
图11含有揭示VISTA过表达性细胞特异性接合于VSIG8过表达性细胞的实验。
图12含有揭示针对VSIG8的抗体结合CD8 T细胞和NK细胞的实验。
图13含有揭示VSIG8 mRNA由人CD4和CD8 T细胞表达的实验。
图14含有证明VISTA通过VSIG8向T细胞传导信号以抑制T细胞活化的实验。使表达GFP(对照)或VISTA+GFP的A20细胞与DO11.10T细胞一起在ISQ肽存在下孵育。通过在72小时时的CD25表达来测量T细胞活化。
图15含有显示在用VISTA-Ig处理的VSIG8表达性A20细胞上不同免疫蛋白(包括PD-1)得以上调的实验。
图16含有标识VSIG8的物种直系同源物的不同序列的表。
详述
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都与由本发明所属领域中的普通技术人员通常理解的那些具有相同含义。尽管与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料可用于本发明中或用于测试本发明，但本文描述适合方法和材料。材料、方法和实例仅具有说明性而不意图具有限制性。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学关联利用的命名法以及本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的实验室程序和技术是本领域中熟知并通常使用的那些。标准技术可用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及治疗患者。
如本文描述和整篇随后权利要求中所用，除非上下文另外明确规定，否则“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”的含义包括复数个指示物。
如本文所用的“活化性受体”广泛指代结合抗原、复合抗原(例如在MHC分子的情形下)、Ig融合蛋白、配体或抗体的免疫细胞受体。活化性受体包括但不限于T细胞受体(TCR)、B细胞受体(BCR)、细胞因子受体、LPS受体、补体受体和Fc受体。举例来说，T细胞受体存在于T细胞上，并且与CD3分子缔合。T细胞受体由处于MHC分子的情形下的抗原(以及由多克隆T细胞活化性试剂)刺激。通过TCR达成的T细胞活化导致众多变化，例如蛋白质磷酸化、膜脂质变化、离子流动、环状核苷酸改变、RNA转录变化、蛋白质合成变化和细胞体积变化。举例来说，T细胞受体存在于T细胞上，并且与CD3分子缔合。T细胞受体由处于MHC分子的情形下的抗原(以及由多克隆T细胞活化性试剂)刺激。通过TCR达成的T细胞活化导致众多变化，例如蛋白质磷酸化、膜脂质变化、离子流动、环状核苷酸改变、RNA转录变化、蛋白质合成变化和细胞体积变化。
如本文所用的“佐剂”是指用于刺激免疫系统以及增加对疫苗的应答，而本身不具有任何特定抗原效应的试剂。
“有助于诊断”或“有助于检测”疾病在本文中意指单独或与一种或多种其它标志物联合检测特定标志物多肽或表达的RNA的表达水平以评估受试者是否具有为特定疾病状况或特定疾病状况的发作所特有的细胞，或包含免疫功能异常，诸如例如在患有慢性和非慢性疾病的个体中，特征在于VSIG8和/或VISTA表达的免疫抑制或特征在于诸如在自体免疫性、炎症或过敏性应答期间，细胞具有降低的VSIG8水平的异常免疫上调。
如本文所用的“过敏性疾病”广泛指代涉及过敏反应的疾病。更具体来说，“过敏性疾病”定义为其过敏原被鉴定的疾病，其中在暴露于那个过敏原与发生病理性变化之间存在强烈关联，并且其中那个病理性变化已被证明具有免疫机理。在本文中，免疫机理意指白细胞显示对过敏原刺激的免疫应答。
如本文所用的“氨基酸”广泛指代天然存在的氨基酸和合成氨基酸以及以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些，以及随后被修饰的那些氨基酸(例如羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即结合于氢、羧基、氨基的碳)和R基团(例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍)的化合物。类似物可具有经修饰R基团(例如正亮氨酸)或经修饰肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指结构不同于氨基酸的一般性化学结构，但以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用的化合物。
如本文所用的“无反应性”或“耐受性”或“延长的抗原特异性T细胞抑制”或“延长的免疫抑制”广泛指代对活化性受体介导的刺激的抵抗性。抵抗性通常具有抗原特异性，并且在已停止暴露于耐受抗原之后持续。举例来说，在T细胞的情况下的无反应性(与无应答相对比)的特征在于缺乏细胞因子产生，例如IL-2。T细胞无反应性在T细胞暴露于抗原以及在不存在第二信号(共刺激信号)下接收第一信号(T细胞受体或CD-3介导的信号)时发生。在这些条件下，使细胞重新暴露于相同抗原(即使重新暴露在共刺激分子存在下发生)导致不能产生细胞因子，并且因此导致不能增殖。然而，无反应性T细胞可发动对无关抗原的应答，并且如果与细胞因子(例如IL-2)一起培养，那么可增殖。举例来说，T细胞无反应性也可根据缺乏由T淋巴细胞产生IL-2来观察，如通过ELISA或通过使用指示细胞系进行增殖测定来测量。或者，可使用报道体基因构建体。举例来说，无反应性T细胞未能引发在5'IL-2基因增强子控制下由异源性启动子诱导，或由可见于增强子内的API序列的多聚体诱导的IL-2基因转录(Kang等(1992)Science 257:1134)。调节共刺激信号导致对免疫细胞的效应物功能的调节。
如本文所用的“抗体”广泛指代抗体的“抗原结合部分”(也可与“抗体部分”、“抗原结合片段”、“抗体片段”互换使用)以及整个抗体分子。如本文所用的术语“抗原结合部分”是指抗体的一种或多种保留特异性结合抗原(例如VSIG8和/或VISTA或其特定部分)的能力的片段。如本文提及的术语“抗体”包括整个多克隆和单克隆抗体及其任何抗原结合片段(即“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含由二硫键互连的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。各重链包含至少一个重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域，即CHI、Cm和Cm。各轻链包含至少一个轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域，即CL。VH区和VL区可进一步再分成称为互补决定区(CDR)的高变区，其与称为框架区(FR)的更保守区域交替分散。各VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端按以下顺序安置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白结合宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。更通常地，术语“抗体”意图包括具有与表位相配合以及识别表位的特定形状的任何含有多肽链的分子结构，其中一种或多种非共价结合相互作用使所述分子结构与所述表位之间的复合物稳定。原型抗体分子是免疫球蛋白，并且来自所有来源(例如人、啮齿动物、兔、母牛、绵羊、猪、狗、其它哺乳动物、鸡、其它禽类等)的所有类型的免疫球蛋白即IgG、IgM、IgA、IgE、IgD等都被视为“抗体”。
抗体的抗原结合功能可由全长抗体的片段进行。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的抗原结合片段的非限制性实例包括(a)Fab片段，即由VL、VH、CL和CHI结构域组成的单价片段；(b)F(ab')2片段，即包含由二硫桥在铰链区处连接的两个Fab片段的二价片段；(c)由VH和CHI结构域组成的Fd片段；(d)由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(e)dAb片段(Ward等(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；和(f)经分离互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由单独基因编码，但可使用重组方法由使得它们能够成为其中VL区和VH区配对以形成单价分子的单一蛋白质链(称为单链Fv(scFv))的合成接头将它们接合。参见例如Bird等(1988)Science 242:423-426；Huston等(1988)ProcNatl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；以及Osbourn等(1998)Nat.Biotechnol.16:778。单链抗体也意图涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。可使特定scFv的任何VH和VL序列连接于人免疫球蛋白恒定区cDNA或基因组序列以产生编码完整IgG分子或其它同种型的表达载体。VH和VL也可用于使用蛋白质化学或重组DNA技术来产生Fab、Fv或其它免疫球蛋白片段。也涵盖其它形式的单链抗体，诸如双链抗体。双链抗体是二价双特异性抗体，其中VH结构域和VL结构域在单一多肽链上表达，但使用太短以致不允许在同一链上的两个结构域之间配对的接头，由此迫使结构域与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。参见例如Holliger等(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448；Poljak等(1994)Structure2:1121-1123。更进一步，抗体或其抗原结合部分(抗原结合片段、抗体片段、抗体部分)可为通过抗体或抗体部分与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价缔合来形成的较大免疫粘附分子的一部分。免疫粘附分子的实例包括使用抗生蛋白链菌素核心区域来制备四聚scFv分子(Kipriyanov等(1995)Hum.Antibodies Hybridomas 6:93-101)以及使用半胱氨酸残基、标记肽和C末端聚组氨酸标记来制备二价和生物素化scFv分子。Kipriyanov等(1994)Mol.Immunol.31:1047-1058。可使用常规技术诸如分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化整个抗体来由整个抗体制备诸如Fab和F(ab')2片段的抗体部分。此外，可使用如本文所述的标准重组DNA技术获得抗体、抗体部分和免疫粘附分子。抗体可为多克隆、单克隆、异种异体、同种异体、同基因抗体或其经修饰形式，例如人源化或嵌合抗体。
“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中可与术语“特异性结合抗原的抗体”互换使用，并且是指特异性结合抗原的免疫球蛋白或其片段。
如本文所用的“抗原”广泛指代能够由抗体结合的分子或分子的一部分，其另外能够诱导动物产生能够结合那个抗原的表位的抗体。抗原可具有一个表位，或具有超过一个表位。本文提及的特异性反应指示抗原将以高度选择性方式与它的相应抗体反应，而不与可由其它抗原激起的众多其它抗体反应。在需要对特定目标抗原的免疫应答增强的情况下，抗原包括但不限于可引发针对其的保护性免疫应答的示例性感染性疾病抗原。
如本文所用的“抗原递呈细胞”广泛指代专门抗原递呈细胞(例如B淋巴细胞、单核细胞、树突细胞和朗格汉斯细胞(Langerhans cell))以及其它抗原递呈细胞(例如角质化细胞、内皮细胞、星形细胞、纤维母细胞和寡树突细胞)。
如本文所用的“反义核酸分子”广泛指代与编码蛋白质的“有义”核酸互补(例如与双链cDNA分子的编码链互补)，与mRNA序列互补或与基因的编码链互补的核苷酸序列。因此，反义核酸分子可与有义核酸分子进行氢键合。
如本文所用的“凋亡”广泛指代可使用本领域中已知的技术表征的程序化细胞死亡。凋亡细胞死亡的特征可在于以细胞破碎为终结的细胞收缩、膜起泡和染色质凝缩。经受凋亡的细胞也显示核小体间DNA裂解的特征样式。
如本文所用的“自体免疫性”或“自体免疫性疾病或病状”广泛指代产生于以及针对个体的自身组织的疾病或病症或其共同分离形式或表现形式或由其所致的病状，并且包括所述疾病或病症或其共同分离形式或表现形式或由其所致的病状。在本文中，自体免疫病状包括炎症性或过敏性病状，例如特征在于针对自身抗原的宿主免疫反应，潜在地与组织破坏相关的慢性疾病诸如类风湿性关节炎。
如本文所用的“B细胞受体(BCR)”广泛指代见于B细胞上的膜Ig(mlg)与其它跨膜多肽(例如IgA和Ig)之间的复合物。mlg的信号转导功能通过由寡聚或多聚抗原交联受体分子来触发。B细胞也可由抗免疫球蛋白抗体活化。在BCR活化后，在B细胞中发生众多变化，包括酪氨酸磷酸化。
如本文所用的“癌症”广泛指代特征在于细胞分裂异常和不受控制，从而导致恶性生长或肿瘤(例如细胞生长不受调节)的任何赘生疾病(侵袭性或转移性)。如本文所用的术语“癌症”或“癌性”应被理解为涵盖特征在于细胞分裂异常和不受控制，从而导致恶性生长或肿瘤的任何赘生疾病(侵袭性、非侵袭性或转移性)，其非限制性实例在本文中加以描述。这包括哺乳动物的特征通常在于细胞生长不受调节的任何生理状况。癌症的实例在工作实施例中例示。其它癌症包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。所述癌症的更特定实例包括鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric cancer/stomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer/renal cancer)、肝癌(liver cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)和各种类型的头颈部癌、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma，NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级淋巴母细胞性NHL；高级小非核裂细胞NHL；巨大肿块疾病NHL；套膜细胞淋巴瘤；AIDS相关的淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Macroglobulinemia))；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性淋巴母细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性髓母细胞白血病；多发性骨髓瘤和移植后淋巴组织增生性病症(PTLD)。可经受通过本发明来治疗的其它癌症包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴性恶性肿瘤。所述癌症的更特定实例包括结肠直肠癌、膀胱癌、卵巢癌、黑素瘤、鳞状细胞癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、肝癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈部癌、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)；小淋巴细胞性(SL)NHL；中级/滤泡性NHL；中级弥漫性NHL；高级免疫母细胞性NHL；高级淋巴母细胞性NHL；高级小非核裂细胞NHL；巨大肿块疾病NHL；套膜细胞淋巴瘤；AIDS相关的淋巴瘤；和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症)；慢性淋巴细胞性白血病(CLL)；急性淋巴母细胞性白血病(ALL)；毛细胞白血病；慢性髓母细胞性白血病；和移植后淋巴组织增生性病症(PTLD)以及异常血管增生伴瘢痣病、水肿(诸如与脑肿瘤相关)和梅格斯综合征(Meigs'syndrome)。优选地，癌症选自由以下组成的组：结肠直肠癌、乳腺癌、结肠直肠癌、直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、肾细胞癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、软组织肉瘤、卡波西氏肉瘤、类癌癌瘤、头颈部癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤和多发性骨髓瘤。在示例性实施方案中，癌症是早期或晚期(包括转移性)膀胱癌、卵巢癌或黑素瘤。在另一实施方案中，癌症是结肠直肠癌。可经受本发明的治疗的癌性病状包括表达或不表达VSIG8和/或VISTA的癌，并且进一步包括非转移性或非侵袭性以及侵袭性或转移性癌，其中由免疫细胞、基质细胞或患病细胞达成的VSIG8和/或VISTA表达抑制抗肿瘤应答和抗侵袭性免疫应答。本发明方法特别适于治疗血管化肿瘤。
根据本发明的癌包括表达或不表达VSIG8和/或VISTA的癌，并且进一步包括非转移性或非侵袭性以及侵袭性或转移性癌，其中由免疫细胞、基质细胞或患病细胞达成的VSIG8和/或VISTA表达抑制抗肿瘤应答和抗侵袭性免疫应答，以及特征在于血管化肿瘤的那些。
“癌症疗法”在本文中是指预防或治疗癌症或改善癌症的一种或多种症状的任何方法。通常，所述疗法将包括单独或更通常与化学疗法或放射疗法或其它生物物质组合并用于增强其活性来施用根据本发明的免疫刺激性VSIG8和/或VISTA多肽或融合蛋白、缀合物、多聚体(同多聚体或异多聚体)或含有其的组合物，即在其中VSIG8和/或VISTA表达抑制抗肿瘤应答和化学疗法或放射疗法的功效或生物功效的个体中进行施用。展现抗癌活性的任何化学治疗剂都可根据本发明加以使用。优选地，化学治疗剂选自由以下组成的组：烷化剂、抗代谢剂、叶酸类似物、嘧啶类似物、嘌呤类似物和相关抑制剂、长春花生物碱、表鬼臼毒素、抗生素、L-天冬酰胺酶、拓扑异构酶抑制剂、干扰素、铂配位络合物、蒽二酮取代的脲、甲基肼衍生物、肾上腺皮质抑制剂、肾上腺类固醇、孕激素、雌激素、抗雌激素剂、雄激素、抗雄激素剂和促性腺激素释放激素类似物。更优选地，化学治疗剂选自由以下组成的组：5-氟尿嘧啶(5-FU)、甲酰四氢叶酸(leucovorin，LV)、伊立替康(irinotecan)、奥沙利铂(oxaliplatin)、卡培他滨(capecitabine)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)。两种或更多种化学治疗剂可以待与抗VEGF抗体的施用组合施用的混合物形式使用。一种优选组合化学疗法基于氟尿嘧啶，包含5-FU和一种或多种其它化学治疗剂。组合化学疗法的适合给药方案在本领域中是已知的，并且描述于例如Saltz等Proc ASCO 18:233(1999)以及Douillard等Lancet 355:1041-7(2000)中。生物制剂可为另一免疫增效剂，诸如针对PD-L1、PD-L2、CTLA-4或VISTA的抗体、以及PD-L1、PD-L2、CTLA-4或VISTA融合蛋白、以及细胞因子、生长因子拮抗剂和激动剂、激素和抗细胞因子抗体。
如本文所用的“嵌合抗体”广泛指代以下抗体分子：其中改变、替换或交换恒定区或其一部分以使抗原结合位点(可变区)连接于不同或改变类别、效应物功能和/或物种的恒定区或对嵌合抗体赋予新性质的完全不同分子例如酶、毒素、激素、生长因子、药物，用具有不同或改变抗原特异性的可变区改变、替换或交换可变区或其一部分。
如本文所用的“编码区”广泛指代核苷酸序列的包含密码子，被翻译成氨基酸残基的区域，而术语“非编码区”是指核苷酸序列的不被翻译成氨基酸的区域(例如5'和3'未翻译区)。
如本文所用的“保守修饰的变体”用于氨基酸和核酸序列，并且关于特定核酸序列，广泛指代以下保守修饰的变体：其是指编码同一或基本上同一氨基酸序列的那些核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时，其是指基本上同一序列。由于遗传密码的简并性，许多在功能上相同的核酸编码任何给定蛋白质。“沉默变化”是一种保守修饰的核酸变化。本文每个编码多肽的核酸序列也描述核酸的每个可能的沉默变化。技术人员将认识到核酸中的各密码子(除AUG(其通常是甲硫氨酸的唯一密码子)和TGG(其通常是色氨酸的唯一密码子)之外)可被修饰以产生在功能上相同的分子。
如本文所用的“互补决定区”、“高变区”或“CDR”广泛指代见于抗体的轻链或重链的可变区中的一个或多个高变区或互补决定区(CDR)。参见Kabat等(1987)Sequences ofProteins of Immunological Interest National Institutes of Health,Bethesda,Md。这些表述包括如由Kabat等(1983)Sequences of Proteins of Immunological Interest,U.S.Dept.of Health确定的高变区或抗体的3维结构中的高变环。Chothia和Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917。各链中的CDR由框架区紧密邻近固持，并且与来自另一链的CDR一起促进形成抗原结合位点。在CDR内，存在已被描述为选择性决定区(SDR)的选择氨基酸，其代表由CDR在抗体-抗原相互作用中使用的关键接触残基。(Kashmiri Methods 36:25-34(2005))。
如本文所用的“对照量”广泛指代标志物可为待相对于标志物的测试量加以比较的任何量或一定范围的量。举例来说，标志物的对照量可为患有特定疾病或病状的患者或不患有这种疾病或病状的人士中标志物的量。对照量可呈绝对量形式(例如微克/毫升)或可为相对量(例如相对信号强度)。
如本文所用的“共刺激受体”广泛指代将共刺激信号传递至免疫细胞的受体，例如CD28或ICOS。如本文所用，术语“抑制性受体”包括将负信号传递至免疫细胞例如T细胞或NK细胞的受体。
如本文所用的“共刺激”广泛指代共刺激分子能够提供诱导增殖或效应物功能的第二非活化性受体介导的信号(“共刺激信号”)。举例来说，共刺激信号可导致细胞因子分泌(例如在已接收T细胞受体介导的信号的T细胞的情况下)。已接收细胞受体介导的信号(例如通过活化性受体)的免疫细胞可在本文中称为“活化的免疫细胞”。关于T细胞，将共刺激信号传递至T细胞涉及不由环孢菌素A(cyclosporin A)抑制的信号传导路径。此外，共刺激信号可诱导T细胞中细胞因子分泌(例如IL-2和/或IL-10)和/或可防止在T细胞中诱导抗原无应答、诱导无反应性或诱导细胞死亡。
“共刺激多肽”或“共刺激分子”在本文中是指在与T细胞上的细胞表面分子相互作用后调节T细胞应答的多肽。
如本文所用的“共刺激信号传导”是由在抗原特异性T细胞应答期间抗原递呈细胞上的共刺激多肽与它们在T细胞上的受体之间的相互作用所致的信号传导活性。在不希望受单一假设限制下，抗原特异性T细胞应答据信由以下两种信号介导：1)T细胞受体(TCR)与在MHC的情形下递呈的抗原肽衔接(信号1)，和2)通过不同共刺激受体/配体对之间的接触来递送的第二抗原非依赖性信号(信号2)。在不希望受单一假设限制下，这个“第二信号”在决定T细胞应答的类型(活化相对于抑制)以及那个应答的强度和持续时间方面至关重要，并且由来自共刺激分子诸如B7家族的蛋白质的正信号与负信号两者调节。
“B7”多肽在本文中意指B7蛋白质家族的成员，所述蛋白质共刺激T细胞，包括但不限于B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H5、B7-Hl、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-S3及其生物活性片段和/或变体。代表性生物活性片段包括共刺激T细胞的细胞外结构域或细胞外结构域的片段。
如本文所用的“细胞质结构域”广泛指代蛋白质的延伸至细胞的细胞质中的部分。
如本文所用的“诊断”广泛指代鉴定病理状况的存在或性质。诊断方法在它们的灵敏性和特异性方面不同。诊断测定的“灵敏性”是测试阳性的患病个体的百分比(“真阳性”的百分比)。未由测定检测出的患病个体是“假阴性”。未患病以及在测定中测试阴性的受试者被称为“真阴性”。诊断测定的“特异性”是1减去假阳性率，其中“假阳性”率定义为测试阳性的无疾病者的比例。尽管特定诊断方法可能不提供对病状的确定诊断，但如果方法提供有助于诊断的正性指示，那么就足够了。
如本文所用的“诊断”或“有助于诊断”广泛指代将疾病或症状分类和/或确定个体具有疾病状况的可能性(例如基于不存在或存在VSIG8和/或VISTA表达，和/或由免疫细胞、基质细胞和/或推定患病细胞达成的表达增加或降低)；确定疾病的严重性，监测疾病进展，预测疾病的结果和/或恢复前景。术语“检测”也可任选涵盖任何前述事项。在一些实施方案中，根据本发明来诊断疾病可通过测定从受试者获得的生物样品中本发明的多核苷酸或多肽的水平来实现，其中可使测定的水平与疾病易感性或存在或不存在疾病相关联。应注意“从受试者获得的生物样品”也可任选包括尚未从受试者物理移除的样品。
如本文所用的“有效量”广泛指代化合物、抗体、抗原或细胞的当向患者施用以治疗疾病时足以实现对所述疾病的所述治疗的量。有效量可为有效用于防治的量，和/或有效用于预防的量。有效量可为有效达成减轻的量，有效预防征象/症状的发生，减轻征象/症状的发生的严重性，消除征象/症状的发生，减缓征象/症状的发生的进展，预防征象/症状的发生的进展，和/或实现对征象/症状的发生的防治的量。“有效量”可视疾病和它的严重性以及待治疗的患者的年龄、重量、医疗史、易感性和预先存在的病状而变化。出于本发明的目的，术语“有效量”与“治疗有效量”同义。
如本文所用的“细胞外结构域”或“ECD”广泛指代蛋白质的从细胞的表面延伸的部分。
如本文所用的“表达载体”广泛指代用于在体外或在体内在包括原核、酵母、真菌、植物、昆虫或哺乳动物细胞的任何细胞中组成性或诱导性表达本发明的核酸序列的目的的任何重组表达系统。所述术语包括线性或环状表达系统。所述术语包括保持游离或整合至宿主细胞基因组中的表达系统。表达系统可能够自我复制或不能够自我复制，即驱动在细胞中仅短暂表达。所述术语包括仅含有为重组核酸的转录所需的最少元件的重组表达盒。
如本文所用的“家族”广泛指代本发明的多肽和核酸分子意指两种或更多种具有共同结构域或基序，以及具有如本文定义的足够氨基酸或核苷酸序列同源性的多肽或核酸分子。家族成员可为天然或非天然存在的，并且可来自相同或不同物种。举例来说，家族可含有第一人源多肽以及其它不同人源多肽，或者可含有非人源同源物(例如猴多肽)。家族的成员也可具有共同功能特征。
如本文所用的“Fc受体”(FcR)广泛指代免疫球蛋白分子(Ig)的Fc部分的细胞表面受体。Fc受体见于参与免疫应答的许多细胞上。在迄今为止已鉴定的人FcR之中的是识别IgG(指定为FcyR)、IgE(FceRl)、IgA(FcaR)和聚合IgM/A(FcεμR)的那些。FcR见于以下细胞类型中：FceRI(肥大细胞)、FceRII(许多白细胞)、FcaR(嗜中性白细胞)和FcμR(腺上皮、肝细胞)。(Hogg Immunol.Today 9:185-86(1988))。广泛研究的FcyR在细胞免疫防御方面是重要的，并且负责刺激自体免疫性疾病的发病机理中涉及的炎症介体和水解酶的释放。(Unkeless,Annu.Rev.Immunol.6:251-87(1988))。FcyR提供效应细胞与分泌Ig的淋巴细胞之间的关键关联，因为巨噬细胞/单核细胞、多形核白细胞和天然杀伤(NK)细胞FcyR赋予由IgG介导的特异性识别的要素。人白细胞具有IgG的至少三种不同受体：hFcμRI(见于单核细胞/巨噬细胞上)、hFcyRII(在单核细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、可能B细胞和K562细胞系上)和Fcylll(在NK细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞上)。
如本文所用的“框架区”或“FR”广泛指代抗体的轻链和重链的可变区内的一个或多个框架区。参见Kabat等"Sequences of Proteins of Immunological Interest"National Institutes of Health,Bethesda,Md(1987)。这些表述包括在抗体的轻链和重链的可变区内插入在CDR之间的那些氨基酸序列区域。
如本文所用的“异源性”广泛指代核酸的各部分指示所述核酸包含两个或更多个在自然界中不以相同彼此关系所见的子序列。举例来说，通常重组产生具有两个或更多个来自无关基因，被安置以产生新功能性核酸的序列(例如来自一个来源的启动子和来自另一来源的编码区)的核酸。类似地，异源性蛋白质指示蛋白质包含两个或更多个在自然界中不以相同彼此关系所见的子序列(例如融合蛋白)。
如本文所用的“高亲和力”广泛指代抗体或融合蛋白对靶标抗原或受体具有的KD是至少10-6M，更优选是10-7M，甚至更优选是至少10～8M，并且甚至更优选是至少10～9M、10- 10M、10-11M或10～12M。
IgG抗体或融合蛋白的“高亲和力”在本文中是指抗体对靶标抗原或受体具有的KD是10-6M或更小，更优选是10-7M或更小，优选是10-8M或更小，更优选是10-9M或更小，并且甚至更优选是10-10M、10"-11M或10-12M或更小。特定关于抗体，不同抗体同种型的“高亲和力”结合可不同。举例来说，IgM同种型的“高亲和力”结合是指抗体具有的KD是10-7M或更小，更优选是10-8M或更小。
如本文所用的“同源性”广泛指代核酸序列与参照核酸序列之间或多肽序列与参照多肽序列之间的类似性程度。同源性可为部分的或完全的。完全同源性指示核酸或氨基酸序列是同一的。部分同源核酸或氨基酸序列是不与参照核酸或氨基酸序列同一的序列。可通过例如使用国家生物技术信息中心(National Center of BiotechnologyInformation，NCBI)的BlastP软件，利用缺省参数进行序列比较来确定同源性程度。术语“序列同一性”可与“同源性”互换使用。
如本文所用的“宿主细胞”广泛指代已将本发明的核酸分子诸如本发明的重组表达载体引入其中的细胞。宿主细胞可为原核细胞(例如大肠杆菌(E.coli))、或真核细胞诸如酵母、昆虫(例如SF9)、两栖动物或哺乳动物细胞，诸如CHO、HeLa、HEK-293，例如培养的细胞、外植体和体内细胞。术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可互换使用。应了解所述术语意图不仅指代特定主题细胞，而且指代这种细胞的子代或潜在子代。因为某些修饰可由于突变或环境影响而发生在继代中，所以子代可能实际上不与亲本细胞相同，但仍然被包括在如本文所用的术语的范围内。
“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有其中框架区与CDR区两者均源于人种系免疫球蛋白序列的可变区。在一个实施方案中，由杂交瘤产生人单克隆抗体，所述杂交瘤包括从转基因非人动物例如转基因小鼠获得的具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的B细胞融合于永生化细胞。这包括完全人单克隆抗体及其缀合物和变体，例如所述抗体结合于诸如治疗剂或诊断剂的效应剂。
如本文所用的“人源化抗体”广泛指代包括由非人细胞制备的具有已被改变以更密切类似于将由人细胞制备的抗体的可变区和恒定区的抗体。举例来说，通过改变非人抗体氨基酸序列以并入见于人种系免疫球蛋白序列中的氨基酸。本发明的人源化抗体可例如在CDR中包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。如本文所用的术语“人源化抗体”也包括其中源于诸如小鼠的另一哺乳动物物种的种系的CDR序列已移植于人框架序列上的抗体。
如本文所用的“杂交”广泛指代互补(包括部分互补)多核苷酸链通过当彼此反平行安置所述链时在互补核苷酸之间形成氢键所达成的物理相互作用。
如本文所用的“IgV结构域”和“IgC结构域”广泛指代Ig超家族成员结构域。这些结构域对应于具有称为Ig折叠的不同折叠样式的结构单元。Ig折叠包含两个β片的夹层结构，各β片由具有5-10个氨基酸的反平行β链组成，在大多数而非所有结构域中，在两片之间具有保守二硫键。Ig、TCR和MHC分子的IgC结构域共有相同类型的序列样式，并且被称为Ig超家族内的CI组。其它IgC结构域属于其它组。IgV结构域也共有序列样式，并且被称为V组结构域。IgV结构域长于C结构域，并且形成一对额外β链。
如本文所用的“免疫细胞”广泛指代具有造血来源，以及在免疫应答中起作用的细胞。免疫细胞包括但不限于淋巴细胞诸如B细胞和T细胞；天然杀伤细胞；树突细胞和骨髓细胞，诸如单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
如本文所用的“免疫测定”广泛指代使用抗体来特异性结合抗原的测定。免疫测定的特征可在于使用特定抗体的特异性结合性质来分离、靶向和/或定量抗原。
如本文所用的“免疫相关疾病(或病症或病状)”应被理解为涵盖选自包括但不限于以下的组的任何疾病、病症或病状：自体免疫性疾病、炎症性病症和与移植物移植排斥相关的免疫病症，诸如急性和慢性器官移植排斥、同种异体干细胞移植排斥、自体干细胞移植排斥、骨髓移植排斥和移植物抗宿主疾病。
如本文所用的“免疫应答”广泛指代受调节T细胞共刺激影响的T细胞介导和/或B细胞介导的免疫应答。示例性免疫应答包括B细胞应答(例如抗体产生)、T细胞应答(例如细胞因子产生和细胞细胞毒性)以及例如巨噬细胞的细胞因子应答性细胞的活化。如本文所用，关于免疫应答的术语“下调”包括任何一种或多种免疫应答的减弱，而关于免疫应答的术语“上调”包括任何一种或多种免疫应答的增加。应了解一种类型的免疫应答的上调可导致另一类型的免疫应答的相应下调。举例来说，某些细胞因子(例如IL-10)的产生的上调可导致细胞免疫应答的下调。
“免疫(Immunologic/immunological/immune)”应答在本文中是指在接受者患者中产生针对肽的体液(抗体介导)和/或细胞(由抗原特异性T细胞或它们的分泌产物介导)应答。这种应答可为通过施用免疫原来诱导的主动应答或通过施用抗体或致敏T细胞来诱导的被动应答。在不希望受单一假设限制下，细胞免疫应答通过递呈与II类或I类MHC分子缔合的多肽表位以分别活化抗原特异性CD4+ T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞来引发。应答也可涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、树突细胞、星形细胞、小神经胶质细胞、嗜酸性粒细胞的活化，嗜中性白细胞或先天免疫性的其它组分的活化或募集。可通过增殖测定(CD4+ T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)测定来确定存在细胞介导的免疫应答。可通过从经免疫同基因动物分别分离抗体和T细胞，以及在第二受试者中测量保护或治疗作用来区分体液应答和细胞应答对针对免疫原的保护或治疗作用的相对贡献。
“免疫原性试剂”或“免疫原”是在任选与佐剂联合向哺乳动物施用时能够诱导针对它自身的免疫应答的部分。
“感染物”在本文中是指感染优选是人细胞的哺乳动物细胞，并且导致疾病状况的任何病原体或作用物。其实例包括细菌、酵母、真菌、原虫、支原体、病毒、朊病毒和寄生虫。所述感染物的实例例如包括以下之中涉及的那些：(a)病毒性疾病，诸如像由被腺病毒、疱疹病毒(例如HSV-I、HSV-II、CMV或VZV)、痘病毒(例如正痘病毒诸如天花病毒或痘苗病毒、或触染性软疣病毒)、微小RNA病毒(例如鼻病毒或肠病毒)、正粘病毒(例如流感病毒)、副粘病毒(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒和呼吸道融合性病毒(RSV))、冠状病毒(例如SARS)、乳多空病毒(例如乳头状瘤病毒，诸如导致生殖器疣、寻常疣或足底疣的那些)、嗜肝DNA病毒(例如乙型肝炎病毒)、黄病毒(例如丙型肝炎病毒或登革病毒(Dengue virus))、或逆转录病毒(例如慢病毒诸如HIV)感染所致的疾病；(b)细菌性疾病，诸如像由被例如埃希氏菌属(Escherichia)、肠杆菌属(Enterobacter)、沙门氏菌属(Salmonella)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、志贺氏菌属(Shigella)、李斯特菌属(Listeria)、气杆菌属(Aerobacter)、螺旋杆菌(Helicobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形杆菌属(Proteus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链球菌属(Streptococcus)、衣原体属(Chlamydia)、支原体属(Mycoplasma)、肺炎球菌属(Pneumococcus)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、梭菌属(Clostridium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、棒杆菌属(Corynebacterium)、分支杆菌属(Mycobacterium)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、弧菌属(Vibrio)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗威登菌属(Providencia)、色杆菌属(Chromobacterium)、布鲁氏菌属(Brucella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、嗜血杆菌属(Haemophilus)或博德特氏菌属(Bordetella)的细菌感染所致的疾病；(c)其它感染性疾病，诸如衣原体病；真菌性疾病，包括但不限于假丝酵母病、曲霉病、组织胞浆菌病、隐球菌脑膜炎；寄生虫性疾病，包括但不限于疟疾、卡氏肺孢子虫(Pneumocystis carnii)肺炎、利什曼病(leishmaniasis)、隐孢子虫病、弓浆虫病(toxoplasmosis)和锥体虫感染；以及朊病毒导致的人疾病，诸如克罗伊茨费尔特-雅各布病(Creutzfeldt-Jakob Disease，CJD)、变异克罗伊茨费尔特-雅各布病(vCJD)、格斯特曼-施特劳斯勒-史茵克综合征(Gerstmann-Straüssler-Scheinker syndrome)、致命性家族性失眠和库鲁病(kuru)。
“感染物抗原”在本文中意指化合物例如肽、多肽、糖肽、糖蛋白等或其缀合物、片段或变体，所述化合物由特定感染物表达，并且所述抗原可用于引发针对诸如病毒的感染物的特异性免疫应答，例如抗体或细胞介导的免疫应答。通常，抗原将包含某一部分，例如在病毒或其它感染物的表面上表达的多肽或糖蛋白，诸如衣壳蛋白或其它膜蛋白质。
“炎症性肠病”在本文中包含任何炎症性肠病状，并且尤其包括炎症性肠病、克罗恩氏病(Crohn's disease)、溃疡性结肠炎(UC)、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转流性结肠炎、贝塞特氏病(disease)和未确定型结肠炎。
在本文中可互换使用的“炎症性病症”、“炎症性病状”和/或“炎症”广泛指代慢性或急性炎症性疾病，并且明确包括炎症性自体免疫性疾病和炎症性过敏性病状。这些病状例如包括特征在于对有害刺激诸如病原体、受损细胞或刺激物的免疫应答调节异常的炎症性异常。炎症性病症潜伏于种类繁多的人疾病下。病因起源于炎症性过程中的非免疫疾病包括癌症、动脉粥样硬化和缺血性心脏病。与炎症相关的病症的实例包括：慢性前列腺炎、肾小球性肾炎、过敏、骨盆炎症性疾病、再灌注损伤、类肉瘤病、血管炎、间质性膀胱炎、正常补体血症性荨麻疹性血管炎、心包炎、肌炎、抗合成酶综合征、巩膜炎、巨噬细胞活化综合征、贝塞特氏综合征、PAPA综合征、布劳氏综合征(Blau's Syndrome)、痛风、成人和青少年斯蒂尔氏病(Still's disease)、冷炎素病变、马克尔-韦尔斯综合征(Muckle-Wellssyndrome)、家族性寒冷诱发的自体炎症性综合征、新生儿发作型多系统炎症性疾病、家族性地中海热、慢性婴儿神经、皮肤和关节综合征、全身性青少年特发性关节炎、高IgD综合征、史尼兹勒氏综合征(Schnitzler's syndrome)、TNF受体相关的周期综合征(TRAPSP)、齿龈炎、牙周炎、肝炎、肝硬化、胰腺炎、心肌炎、血管炎、胃炎、痛风、痛风性关节炎以及选自由牛皮癣、异位性皮炎、湿疹、红斑痤疮、荨麻疹和粉刺组成的组的炎症性皮肤病症。
如本文所用的“抑制性信号”广泛指代通过免疫细胞上的抑制性受体分子传递的信号。信号拮抗通过活化性受体(例如通过TCR、CD3、BCR或Fc分子)达成的信号，并且可例如导致抑制：第二信使产生；增殖；或免疫细胞中的效应物功能，例如降低吞噬作用、抗体产生或细胞细胞毒性，或免疫细胞不能产生介体(例如细胞因子(例如IL-2)和/或过敏性应答的介体)；或产生无反应性。
如本文所用的“经分离”广泛指代物质被从它天然存在所处的它的原始环境移除，并因此被从它的天然环境人为改变，并且包括“重组”多肽。经分离物质可为例如包括在载体系统中的外源性核酸、含于宿主细胞内的外源性核酸、或已被从它的原始环境移除并因此人为改变的任何物质(例如“经分离抗体”)。举例来说，如本文所用的“经分离”或“经纯化”广泛指代蛋白质、DNA、抗体、RNA或其生物活性部分大致上不含来自生物物质所源于的细胞或组织来源的细胞物质或其它污染蛋白质，或当化学合成时大致上不含化学前体或其它化学物质。如本文所用，术语“经分离”是指目标化合物(例如多核苷酸或多肽)处于与所述化合物天然存在所处的环境不同的环境中，例如诸如通过将肽浓缩至它不在自然界中被发现所处的浓度来从它的天然环境分离。“经分离”包括化合物处于实质上富含目标化合物和/或其中目标化合物被部分或实质上纯化的样品内。
如本文所用的“经分离抗体”意指大致上不含具有不同抗原特异性的其它抗体的抗体(例如特异性结合VSIG8和/或VISTA的经分离抗体大致上不含特异性结合除VSIG8以外的抗原的抗体)。此外，经分离抗体可大致上不含其它细胞物质和/或化学物质。
“同种型”在本文中是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
如本文所用的“K缔合”或“Ka”广泛指代特定抗体-抗原相互作用的缔合速率，而如本文所用的术语“K解离”或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率。
如本文所用的术语“KD”意指解离常数，其从Kd与Ka的比率(即Kd/Ka)获得，并且表示为摩尔浓度(M)。可使用本领域中明确建立的方法诸如等离子体共振ELISA和KINEXA来确定抗体的KD值。一种优选用于确定抗体的KD的方法通过使用表面等离子体共振，优选利用生物传感器系统诸如系统，或通过ELISA来进行。
如本文所用的“标记”或“可检测部分”广泛指代可通过分光、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。
如本文所用的“低严格性”、“中等严格性”、“高严格性”或“极高严格性条件”广泛指代用于核酸杂交和洗涤的条件。用于进行杂交反应的指导可见于Ausubel等,ShortProtocols in Molecular Biology(第5版)John Wiley&Sons,NY(2002)中。示例性特定杂交条件包括但不限于：(1)低严格性杂交条件，在约45℃下于6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中进行，随后至少在50℃下在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤两次(对于低严格性条件，洗涤温度可增加至55℃)；(2)中等严格性杂交条件，在约45℃下于6X SSC中进行，随后在60℃下在0.2XSSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；(3)高严格性杂交条件，在约45℃下于6X SSC中进行，随后在65℃下在0.2X.SSC、0.1％SDS中洗涤一次或多次；和(4)极高严格性杂交条件是在65℃下0.5M磷酸钠、7％SDS，随后在65℃下以0.2X SSC和1％SDS洗涤一次或多次。
如本文所用的“哺乳动物”广泛指代哺乳纲的特征在于在皮肤上覆盖有毛发以及在雌性中具有用于养育幼仔的产生乳汁的乳腺的任何和所有温血脊椎动物，包括人。哺乳动物的实例包括但不限于羊驼、犰狳、水豚、猫、骆驼、黑猩猩、灰鼠、牛、狗、山羊、大猩猩、仓鼠、马、人、狐猴、美洲驼、小鼠、非人灵长类动物、猪、大鼠、绵羊、鼩鼱、松鼠、貘和田鼠。哺乳动物包括但不限于牛科动物、犬科动物、马科动物、猫科动物、鼠科动物、羊科动物、猪科动物、灵长类动物和啮齿动物物种。哺乳动物也包括由位于华盛顿哥伦比亚特区的隶属史密森尼学会的国家自然历史博物馆(National Museum of Natural History,SmithsonianInstitution in Washington D.C.)维护的世界哺乳动物物种(Mammal Species of theWorld)上列出的任何和所有哺乳动物。
如本文所用的“天然存在的核酸分子”广泛指代具有在自然界中存在(例如编码天然蛋白质)的核苷酸序列的RNA或DNA分子。
如本文所用的“核酸”或“核酸序列”广泛指代呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸寡核苷酸。所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，即寡核苷酸。所述术语也涵盖具有合成骨架的核酸样结构。除非另外指示，否则特定核酸序列也暗中涵盖其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。术语核酸可与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
“寡聚化结构域”或“多聚化结构域”或“二聚化结构域”在本文中可互换使用，并且广泛指代当连接于VSIG8和/或VISTA细胞外结构域或其片段时促进寡聚化的结构域。所述寡聚化结构域包含可进一步由额外二硫键加以稳定化的自我缔合性α螺旋例如亮氨酸拉链。结构域被设计以可与跨膜向量性折叠相容，所述折叠是一种被认为促进多肽在体内折叠成功能性结合蛋白的过程。其实例在本领域中是已知的，并且例如包括卷曲GCN4和COMP。a螺旋卷曲螺旋可能是蛋白质中所见的最广泛分布的亚单位寡聚化基序。因此，卷曲螺旋实现多种不同功能。在若干转录活化子家族中，例如短亮氨酸拉链在使DNA结合区定位在DNA上方面起重要作用。Ellenberger等(1992)Cell 71:1223-1237。卷曲螺旋也用于形成中间丝蛋白质的寡聚物。此外，卷曲螺旋蛋白质似乎在囊泡膜融合与病毒膜融合两方面均起重要作用。(Skehel和Wiley Cell 95:871-874(1998))。在两种情况下，包埋在待融合的膜中的疏水性序列位于由一束长α螺旋组成的杆状复合物的同一端处。这个分子排列据信会当复合物被装配以达成膜融合时导致紧密膜并置。卷曲螺旋常用于控制寡聚化。它见于许多类型的蛋白质中，包括转录因子(包括但不限于GCN4)、病毒融合肽、SNARE复合物和某些tRNA合成酶以及其它蛋白质。极长卷曲螺旋见于诸如原肌凝蛋白、中间丝和纺缍体极体组分的蛋白质中。卷曲螺旋涉及以高度组织化方式围绕彼此加以超卷曲，以平行或反平行定向进行缔合的许多α螺旋。但二聚体和三聚体是最常见的。螺旋可来自相同或来自不同蛋白质。卷曲螺旋通过组成螺旋合起来包埋它们的疏水缝来形成。因为疏水缝围绕各螺旋扭曲，所以螺旋也扭曲以围绕彼此卷曲，从而包埋疏水缝并形成超螺旋。正是相邻螺旋之间的特征性侧链交错接合(称为钮入孔堆积)将结构限定为卷曲螺旋。对于发生这个类型的相互作用，螺旋不必在相同方向上延伸，但平行构象更常见。反平行构象在三聚体中极其罕见并且在五聚体中是未知的，但更常见于分子内二聚体中，其中两个螺旋常由短环连接。在细胞外间隙中，异三聚卷曲螺旋蛋白质层粘连蛋白(laminin)在基底膜的形成方面起重要作用。其它实例是血栓反应素(thrombospondin)和软骨寡聚基质蛋白质(COMP)，其中三个(血栓反应素1和2)或五个(血栓反应素3、4和COMP)链被连接。分子具有花束样外观，并且达成它们的寡聚结构的原因可能是C末端结构域与细胞受体的多价相互作用。酵母转录活化子GCN4是超过30种鉴定的含有碱性区亮氨酸拉链(bZIP)DNA结合基序的真核蛋白质中的1种。Ellenberger等Cell 71:1223-1237(1992)。bZIP二聚体是一对连续a螺旋，其历经它们的羧基末端34个残基形成平行卷曲螺旋，并且朝向它们的氨基末端逐渐发散以穿过DNA结合位点的大沟。卷曲螺旋二聚化界面几乎垂直于DNA轴定向，从而给与复合物字母T形外观。bZIP含有一起堆积在平行a螺旋卷曲螺旋中的疏水性和非极性残基的4-3七联体重复。(Ellenberger等Cell 71:1223-1237(1992))。二聚体的稳定性由在七联体重复的位置a和d中的亮氨酸和非极性残基的并排堆积，以及GCN4亮氨酸拉链肽的晶体结构中所示的有限数目的螺旋内和螺旋间盐桥所致。(Ellenberger等Cell 71:1223-1237(1992))。另一实例是从牛气管软骨分离，呈具有Mr 52,000的亚单位的同三聚体形式的CMP(基质素-1(matrilin-1))(Paulsson和Heinegard(1981),Biochem.J.197:367-375)，其中各亚单位由vWFAl模块、单一EGF结构域、vWFA2模块和跨越五个七联体的卷曲螺旋结构域组成。(Kiss等J.Biol.Chem.264:8126-8134(1989)；Hauser和Paulsson J.Biol.Chem.269:25747-25753(1994))。对纯化CMP的电子显微镜检查显示花束样三聚体结构，其中各亚单位形成从对应于卷曲螺旋的共同点显露的椭圆体。(Hauser和Paulsson J.Biol.Chem.269:25747-25753(1994))。基质素-1中的卷曲螺旋结构域已被广泛研究。在非变性条件下完全还原链间二硫键之后，三聚结构得以保留。(Hauser和Paulsson J.Biol.Chem.269:25747-25753(1994))。另一实例是软骨寡聚基质蛋白质(COMP)。首先在软骨中鉴定出非胶原糖蛋白COMP。(Hedbom等J.Biol.Chem.267:6132-6136(1992))。所述蛋白质是具有五个亚单位的524kDa同五聚体，其由N末端七联体重复区域(cc)，继之以四个表皮生长因子(EGF)样结构域(EF)，七个钙结合结构域(T3)和C末端球状结构域(TC)组成。根据这个结构域组构，COMP属于血栓反应素家族。在位置a和d处具有优先疏水性残基的七联体重复(abcdefg)n形成螺旋卷曲螺旋结构域。(Cohen和Parry Science 263:488-489(1994))。近来，COMP的重组五链卷曲螺旋结构域(COMPcc)被结晶，并且它的结构以0.2nm分辨率被解析。(Malashkevich等Science 274:761-765(1996))。
如本文所用的“操作性地连接”广泛指代当使两个DNA片段接合时，致使由所述两个DNA片段编码的氨基酸序列保持同框。
如本文所用的“互补位”广泛指代抗体的识别抗原的部分(例如抗体的抗原结合位点)。互补位可为抗体的Fv区的小区域(例如15-22个氨基酸)，并且可含有抗体的重链和轻链的各部分。参见Goldsby等Antigens(第3章)Immunology(第5版)New York:W.H.Freemanand Company,第57-75页。
“患者”或“受试者”或“接受者”、“个体”或“所治疗的个体”在本文中可互换使用，并且广泛指代需要治疗以缓和疾病状态或预防疾病状态的发生或复发的任何动物。此外，如本文所用的“患者”广泛指代具有风险因素、疾病史、易感性、症状和征象；先前被诊断；处于疾病的风险下；或是疾病的患者群体的成员的任何动物。患者可为临床患者诸如人，或兽医学患者诸如伴侣动物、驯化动物、家畜动物、珍稀动物或动物园动物。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，并且广泛指代氨基酸残基的任何长度聚合物，而与修饰(例如磷酸化或糖基化)无关。所述术语用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的类似物或模拟物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物。所述术语用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。多肽可例如通过添加碳水化合物残基以形成糖蛋白来修饰。术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”明确包括糖蛋白以及非糖蛋白。
如本文所用的“启动子”广泛指代引导核酸的转录的一系列核酸序列。如本文所用，启动子包括靠近转录起始位点的必要核酸序列，诸如在聚合酶II型启动子的情况下，包括TATA元件。启动子也任选包括远端增强子或阻遏子元件，其可位于离转录起始位点多达数千个碱基对。“组成型”启动子是在大多数环境和发育条件下具有活性的启动子。“诱导型”启动子是在环境或发育调节下具有活性的启动子。
如本文所用的“防治有效量”广泛指代化合物的当向患者施用以防治疾病或预防疾病复发时足以实现对所述疾病或复发的所述防治的量。防治有效量可为有效预防征象和/或症状的发生的量。“防治有效量”可视疾病和它的严重性以及待治疗的患者的年龄、重量、医疗史、病状易感性和预先存在的病状而变化。
“防治性疫苗”和/或“防治性疫苗接种”是指用于预防疾病或与疾病相关的症状诸如癌症或感染性病状的疫苗。
如本文所用的“防治”广泛指代其中征象和/或症状不存在于患者中，处于缓解的情况下，或先前存在于患者中的疗程。防治包括预防疾病在对患者的疾病治疗之后发生。此外，预防包括治疗可潜在显现疾病的患者，尤其是易患疾病的患者(例如患者群体的成员、具有风险因素或处于显现疾病的风险下的那些)。
如本文所用的“重组”广泛关于产物，例如关于细胞或核酸、蛋白质或载体，指示所述细胞、核酸、蛋白质或载体已通过引入异源性核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质来修饰，或所述细胞源于如此修饰的细胞。因此，举例来说，重组细胞表达不见于天然(非重组)形式的细胞内的基因，或表达另外异常表达，欠表达或完全不表达的天然基因。
如本文所用的术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如(a)从人免疫球蛋白基因转基因性或转染色体性动物(例如小鼠)或由其制备的杂交瘤分离的抗体(以下进一步描述)，(b)从被转化以表达人抗体的宿主细胞，例如从转染瘤分离的抗体，(c)从重组组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接成其它DNA序列的任何其它手段制备、表达、产生或分离的抗体。所述重组人抗体具有其中框架区和CDR区源于人种系免疫球蛋白序列的可变区。然而，在某些实施方案中，可使所述重组人抗体经受体外诱变(或当使用人Ig序列转基因性动物时，经受体内体细胞诱变)，并且因此，重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是尽管源于以及相关于人种系VH和VL序列，但可不在体内天然存在于人抗体种系谱系内的序列。
如本文所用的“信号序列”或“信号肽”广泛指代含有约15个或更多个氨基酸的肽，其存在于分泌性和膜结合多肽的N末端，并且含有许多疏水性氨基酸残基。举例来说，信号序列含有至少约10-30个氨基酸残基，优选约15-25个氨基酸残基，更优选约18-20个氨基酸残基，并且甚至更优选约19个氨基酸残基，并且具有至少约35-65％，优选约38-50％，并且更优选约40-45％疏水性氨基酸残基(例如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或苯丙氨酸)。“信号序列”在本领域中也称为“信号肽”，用于将含有这种序列的多肽引导至脂质双层，并且在分泌时被裂解。
如本文所用的“特异性(或选择性)结合”抗体或“特异性(或选择性)与…具有免疫反应性”或“特异性相互作用或结合”广泛涉及蛋白质或肽(或其它表位)，在一些实施方案中，是指确定在蛋白质和其它生物物质的异质群体中存在蛋白质的结合反应。举例来说，在指定免疫测定条件下，指定抗体结合特定蛋白质比背景(非特异性信号)大至少两倍，并且不实质上大量结合样品中存在的其它蛋白质。通常，特异性或选择性反应将至少两倍于背景信号或噪声，并且更通常超过约10至100倍于背景。
如本文所用的“可特异性杂交”和“互补”广泛指代核酸可通过传统沃森-克里克(Watson-Crick)类型或其它非传统类型来与另一核酸序列形成氢键。核酸分子与它的互补序列的结合自由能足以使得核酸的相关功能发生，例如RNAi活性。对核酸分子的结合自由能的测定在本领域中是熟知的。(参见例如Turner等CSH Symp.Quant.Biol.LII:123-33(1987)；Frier等PNAS 83:9373-77 1986)；Turner等J.Am.Chem.Soc.109:3783-85(1987))。互补性百分比指示核酸分子中可与第二核酸序列形成氢键(例如沃森-克里克碱基配对)的连续残基的百分比(例如在10个中有约至少5、6、7、8、9、10个，那么是约至少50％、60％、70％、80％、90％和100％互补的，包括所述值)。“完全互补”或100％互补性广泛指代核酸序列的所有连续残基都与第二核酸序列中相同数目的连续残基进行氢键合。
“大致上互补性”是指将多核苷酸链的被选择以致是非互补性的区域诸如突出部分排除，多核苷酸链展现约至少90％互补性。特异性结合需要足够互补性程度以避免寡聚化合物与非靶标序列在需要特异性结合所处的条件下，即在体内测定或治疗性治疗的情况下的生理条件下，或在体外测定的情况下在进行测定所处的条件下，进行非特异性结合。非靶标序列的差异通常可在于至少5个核苷酸。
如本文所用的疾病的“征象”广泛指代可在检查患者时发现的指示疾病的任何异常；不同于作为主观疾病指示的症状的客观疾病指示。
如本文所用的“固体载体”、“载体”和“基底”广泛指代提供固体或半固体结构，另一材料可与其连接的任何材料，包括但不限于平滑载体(例如金属、玻璃、塑料、硅和陶瓷表面)以及纹理化和多孔材料。
如本文所用的VSIG8和/或VISTA的“可溶性外结构域(ECD)”或“外结构域”或“可溶性VSIG8或VISTA蛋白/分子”意指非细胞表面结合的VSIG8和/或VISTA分子或其任何部分，包括但不限于：VSIG8和/或VISTA融合蛋白或VSIG8和/或VISTA ECD-Ig融合蛋白(其中使VSIG8和/或VISTA的细胞外结构域或其片段融合于免疫球蛋白(Ig)部分，从而致使融合分子可溶)或其片段和衍生物；VSIG8和/或VISTA的细胞外结构域与生物活性或化学活性蛋白质(诸如乳头状瘤病毒E7基因产物、黑素瘤相关的抗原p97或HIV包膜蛋白)的一部分融合或接合的蛋白质或其片段和衍生物；杂合(嵌合)融合蛋白(诸如VSIG8和/或VISTA-Ig)或其片段和衍生物。以下更详细描述所述融合蛋白。
“可溶性VSIG8或VISTA蛋白/分子”在本文中也包括跨膜结构域被移除以致使蛋白质可溶的VSIG8或VISTA分子或其片段和衍生物；其片段、部分或衍生物以及可溶性VSIG8或VISTA突变分子。用于根据本发明的至少一些实施方案的方法中的可溶性VSIG8或VISTA分子可或可不包括信号(前导)肽序列。
在疗法或诊断的情形下的“受试者”或“患者”或“个体”在本文中包括任何人或非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，诸如非人灵长类动物、绵羊、狗、猫、马、母牛、鸡、两栖动物、爬行动物等，即适于根据本发明治疗的任一动物，包括但不限于禽类和哺乳动物受试者，并且优选是哺乳动物。需要根据本发明治疗的任何哺乳动物受试者都是适合的。两个性别以及处于任何发育阶段(即新生儿、婴儿、青少年、青年和成人)的人受试者都可根据本发明加以治疗。本发明也可对动物受试者特别是哺乳动物受试者诸如小鼠、大鼠、狗、猫、牛、山羊、绵羊和马进行以达成兽医学目的，以及达成药物筛选和药物开发目的。“受试者”可与“个体”和“患者”互换使用。
如本文所用的“大致上不含化学前体或其它化学物质”广泛涉及VSIG8或VISTA蛋白的制剂，其中蛋白质与蛋白质的合成中涉及的化学前体或其它化学物质分离。在一个实施方案中，措辞“大致上不含化学前体或其它化学物质”包括VSIG8或VISTA蛋白的制剂具有小于约30％(以干重计)的化学前体或非VSIG8化学物质，更优选小于约20％化学前体或非VSIG8或VISTA化学物质，还更优选小于约10％化学前体或非VSIG8或VISTA化学物质，并且最优选小于约5％化学前体或非VSIG8或VISTA化学物质。
如本文所用的疾病的“症状”广泛指代由患者所感受并且指示疾病的在结构、功能或感觉方面的任何病态现象或与正常情况的偏离。
如本文所用的“T细胞”广泛指代CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。术语T细胞也包括T辅助1型T细胞与T辅助2型T细胞两者。
如本文所用的“疗法”、“治疗性”或“治疗”广泛指代治疗疾病，遏止或降低疾病或它的临床症状的进展，和/或缓解疾病，导致疾病或它的临床症状消退。疗法涵盖防治、治疗、医冶、减轻、缓和疾病、疾病的征象和/或症状，和/或提供从疾病、疾病的征象和/或症状的缓解。疗法涵盖缓和具有进行性疾病征象和/或症状(例如炎症、疼痛)的患者的征象和/或症状。疗法也涵盖“防治”。出于疗法的目的，术语“减轻”广泛指代征象和/或症状的临床显著减轻。疗法包括治疗复发或复发性征象和/或症状(例如炎症、疼痛)。疗法涵盖但不限于阻止征象和/或症状在任何时候出现以及减轻现有征象和/或症状和消除现有征象和/或症状。疗法包括治疗慢性疾病(“维持”)和急性疾病。举例来说，治疗包括治疗或预防复发或征象和/或症状(例如炎症、疼痛)的复发。
“治疗性疫苗”和/或“治疗性疫苗接种”是指用于治疗疾病诸如癌症或感染性病状的疫苗。
如本文所用的“Treg细胞”(有时也被称为抑制T细胞或诱导性Treg细胞或iTreg)是指T细胞的调节免疫系统并维持对自身抗原的耐受性，并且可消除自体免疫性疾病的子群体。Foxp3+CD4+CD25+调节性T细胞(Treg)在维持外周耐受性处于正常情况方面至关重要。
如本文所用的“跨膜结构域”广泛指代长度是约15个氨基酸残基的跨越质膜的氨基酸序列。更优选地，跨膜结构域包括约至少20、25、30、35、40或45个氨基酸残基，并且跨越质膜。跨膜结构域富含疏水性残基，并且通常具有a螺旋结构。在一实施方案中，跨膜结构域的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或更多的氨基酸是疏水性的，例如亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸或色氨酸。跨膜结构域例如描述于Zagotta等Annu.Rev.Neurosci.19:235-263(1996)中。
如本文所用的“转基因动物”广泛指代非人动物，优选是哺乳动物，更优选是小鼠，其中所述动物的一个或多个细胞包括“转基因”。术语“转基因”是指以下外源性DNA：其被整合至转基因动物从其发育的细胞的基因组中，以及保持在成熟动物的基因组中，例如引导在所述转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中表达所编码基因产物。
如本文所用的“肿瘤”广泛指代内源性组织的至少一个呈组织新生物形式，特别是呈或多或少脱抑制的自发性、自主性和不可逆过度生长物形式的细胞或细胞团块，所述生长物通常与特定细胞和组织功能的或多或少明确丧失相关。这个细胞或细胞团块关于它的生长不由它自身或由宿主生物体的调节机理有效抑制，例如结肠直肠癌、黑素瘤或癌瘤。肿瘤抗原不仅包括恶性细胞自身之中或之上存在的抗原，而且也包括肿瘤的包括内皮细胞和其它血管组分的基质支持组织上存在的抗原。
如本文所用的“无应答”广泛指代免疫细胞对刺激例如以及通过活化性受体或细胞因子达成的刺激的抵抗性。无应答可例如由于暴露于免疫抑制剂或高剂量的抗原而发生。
如本文所用的“疫苗”是指改进对特定疾病例如癌症或感染性疾病的免疫性的生物制剂，其中所述疫苗包括针对其来引发免疫应答的疾病特异性抗原例如癌抗原或感染物抗原。疫苗通常包括佐剂作为免疫增效剂以刺激免疫系统。这包括防治性疫苗(其预防疾病)和治疗性疫苗(其治疗疾病或它的症状)。
如本文所用的“可变区”或“VR”广泛指代抗体中各对轻链和重链内直接涉及所述抗体结合抗原的结构域。各重链在一端具有可变结构域(VH)，继之以许多恒定结构域。各轻链具有在一端的可变结构域(VL)和在它的另一端的恒定结构域；轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。
如本文所用的“载体”广泛指代能够转运它已与其连接的另一核酸分子的核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其是指额外DNA区段可被连接至其中的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，其中额外DNA区段可被连接至病毒基因组中。某些载体能够在它们所引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其它载体(例如非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞中后被整合至宿主细胞的基因组中，并且由此连同宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够引导它们所操作性地连接的基因的表达。载体在本文中被称为“重组表达载体”或简称为“表达载体”。一般来说，在重组DNA技术中具有效用的表达载体常常呈质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最通常使用的载体形式。然而，本发明意图包括发挥等效功能的所述其它形式的表达载体诸如病毒载体(例如复制缺陷性逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。技术和程序通常根据本领域中熟知以及如本说明书整篇引用和讨论的各种一般性和更特定参考文献中所述的常规方法来进行。参见例如Sambrook等Molec.Cloning:Lab.Manual[第3版]Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)。标准技术可用于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如电穿孔、脂质体转染)。可根据制造商说明书，或如本领域中通常所实现，或如本文所述来进行酶促反应和纯化技术。
现已定义用于本申请中的某些术语和短语，以下进一步描述由本发明包括的特定类型的VSIG8多肽、融合蛋白、抗VSIG8抗体和抗原结合抗体片段及其产生和使用方法。
如表1中所示，Ig超家族包含许多关键免疫调节剂，包括B7家族配体和受体。在这些之中，最充分表征的共刺激配体是在专门抗原递呈细胞(APC)上表达，并且其受体是CD28、PD-L1和CTLA-4的CD80和CD86(12)。这些靶标已被证明是治疗自体免疫性和癌症的有价值临床靶标。
B7家族配体已扩大来包括共刺激B7-H2(ICOS配体)和B7-H3(受体未知)以及共抑制B7-H1(PD-L1)、B7-DC(PD-L2)、B7-H4(B7S1或B7x；受体未知)、B7-H5(仅人)13和B7-H6(12,14)。对PD-L1→PD-1相互作用的机理、CTLA-4和它由它的配体B7-1和B7-2衔接的研究已完全使药物和生物技术行业能够预测结果，策略性设计PK和PD研究，以及了解与治疗干预相关的毒性。通过全面了解MOA，此包括了解受体-配体相互作用，这些治疗的成功已得以极大增强。值得注意的是，由于在鉴定受体方面的特殊困难，这可能归因于低密度和低配体结合亲和力，一些较少详述的NCR配体不具有鉴定的受体。
含有V区免疫球蛋白的T细胞活化抑制剂(15)(VISTA)是一种负性检查点调节剂(NCR)配体，其最接近的系统发生亲缘物是PD-L1。已显示VISTA会深度抑制静息T细胞的活化。在人与小鼠两者中，VISTA表达似乎具有造血限制并在骨髓区室中大量表达，并且在较低强度上在T细胞上表达(16)。如同阻断PD-L1和PD-1一样，在鼠类癌症模型的情况下阻断VISTA会增强免疫性(17)。
阻断或抑制VISTA的作用的抗体可用于增强人免疫应答，特别是对恶性肿瘤和感染的免疫应答。相比来说，激动VISTA的分子诸如可溶性VISTA例如VISTA-Ig可用于抑制非所需人免疫应答诸如自体免疫、过敏性或炎症性免疫应答。在本发明之前，VISTA的受体尚未被报道。预期对如本文公开的这个受体的鉴定将有助于设计用于治疗肿瘤学适应症、感染性疾病适应症、自体免疫适应症、过敏性适应症和炎症性适应症的其它治疗剂。同时，对受体的鉴定将有助于更大程度了解VISTA与它的受体缔合来调节免疫性的方式。
基于其，本发明的目标在于鉴定VISTA的受体。与VISTA类似，拮抗这个受体或调节(抑制或阻断)这个受体结合VISTA的化合物应适用于治疗其中需要上调T细胞或NK细胞免疫性的病状诸如癌症或感染性疾病状况。此外，与VISTA类似，激动这个受体或调节(促进或增强)这个受体结合VISTA的化合物应适用于治疗其中需要下调T细胞或NK细胞免疫性的病状诸如自体免疫性、过敏、炎症、GVHD、移植或细胞或基因疗法。
本发明者预测VISTA受体是B7家族的成员，因为B7受体家族的所有鉴定的成员都是Ig超家族的成员。这个Ig超家族包括是细胞-细胞信号传导/相互作用、粘附和通讯中涉及的可溶性蛋白质与膜蛋白质两者的蛋白质。所有这些分子都含有与Ig V区(IgV)或恒定区(IgC)的那些结构域类似的结构域。结构域在长度方面通常是70-110个氨基酸，具有特征性Ig折叠，其具有由两个α平行片形成的夹层样结构，所述平行片在B链和F链中的半胱氨酸残基之间形成，并且使Ig折叠稳定。
B7受体(CTLA-4、ICOS、PD-1)具有一个IgV结构域，这不同于这些受体的具有一个IgV结构域和一个Ig-C结构域的配体(CD80、CD86、ICOSL、PD-L1和PD-L2)。奇特的是，如同家族中的受体一样，VISTA具有一个Ig-V结构域。因此，除它的配体样活性(抑制T细胞活化)之外，VISTA也可具有细胞信号传导功能。然而，因为这个家族中所有当前鉴定的受体和配体都是Ig超家族的成员，所以本发明者预测VISTA的结合配偶体将包含B7家族的成员。
公开的研究和付梓中的参考文献(15、16和17)已显示VISTA是一种新型和在结构上不同的Ig超家族抑制性配体，其关键特征是：
(i)VISTA的表达仅在造血区室内，并且在成熟骨髓细胞(CD11b强烈DC和Mac)上较高，在CD4+ T细胞、Treg和CD8+ T细胞上具有较低表达水平。
(ii)固定化而非可溶性鼠类VISTA-Ig融合蛋白，或VISTA在APC上表达会抑制体外鼠类PD-1+和PD-1-CD4+和CD8+ T细胞增殖15和细胞因子产生。这确定VISTA具有免疫抑制性，并且PD-1不是VISTA的受体。
(iii)VISTA-Ig抑制早期T细胞活化抗原(CD69、CD44)的表达以及p-ERK活化，从而表明VISTA的受体(V-R)在静息T细胞上表达。
(iv)阻断性αVISTA mAb(13F3)使自体免疫性加剧(EAE)(15)。
(v)αVISTA mAb在多个鼠类肿瘤模型的情况下诱导肿瘤缓解(17)。
(vi)VISTA诱导人(16)CD4+ T细胞与小鼠(17)CD4+ T细胞两者中Foxp3的表达。
(vii)施用VISTA-Ig诱导对鼠类SLE和鼠类EAE的抑制。
(viii)关于鼠类VISTA的所有研究结果都已用人VISTA在人T细胞情况下在体外重演(16)。
此外，尽管VISTA对免疫调节的所有影响都还有待于阐明，但这个NCR配体似乎如同PD-L1一样具有停止T细胞增殖(16)和诱导Foxp3表达(17)的活性。VISTA在骨髓细胞上在高水平下组成性表达(15、16)，并且可抑制静息T细胞、明显活化的T细胞以及记忆T细胞的活化(15、16)。
进一步基于前述事项，本发明者进一步推理VISTA受体将可能在静息T细胞上表达。这个理论部分地基于TCR诱导的磷酸ERK活化(在活化后10分钟)可由VISTA-Ig完全遏止的事实(图1)。此外，T细胞活化的最早变化(CD69、CD62L、CD44)也由VISTA-Ig1完全遏止(15、16)。
此外，BiaCore分析已显示VISTA-Ig不结合任何已知B7或PD家族成员(数据未显示)或过表达CD28、CTLA-4、PD-1、TLT-2、TLT4、CD300A和CD300D的细胞(未公开的数据)。基于VISTA-Ig能够在刺激后10分钟抑制αCD3磷酸ERK信号(图1)，预测VISTA-R在静息T细胞上表达。
此外，鉴于VISTA对B细胞不具有功能性作用的事实，本发明者进一步预测VISTA受体将可能对B细胞活化或增殖不具有影响，并且将可能不在静息或活化的B细胞上可观表达。
VISTA作为负性调节剂。
VISTA似乎负性调节(至少)TCR的滋养信号传导(在同源活化之前；图2)，从而作为变阻器发挥防止混杂T细胞活化的体内恒定功能。这将与VISTA-/-小鼠中所见的活化T细胞的高出现率(数据未显示)一致。然而，VISTA也可抑制活化后T细胞功能的观察结果表明它也可为同源T细胞活化之后的有效负性调节剂。
PD-L1/PD-1和CTLA-4/CD80/86是固有不同路径，其中受体仅在T细胞活化之后上调。相比来说，VISTA具有专门造血限制，并且因此它的主要作用将似乎在次级淋巴器官(SLO)中，或在其中存在重度白细胞浸润的部位(如同TME)中发挥，这不同于在组织中在非造血细胞上表达的PD-L1。因此，调节VSIG8或VISTA和/或VISTA/VISTA-R相互作用的化合物应在控制早期T细胞活性方面具有根本上不同的作用。
VISTA作为癌症中的负性检查点调节剂。
在鼠类癌症模型的情况下进行的研究已阐明对VISTA的抑制性功能的重大额外见地。尽管VISTA在天然小鼠中的骨髓细胞上在高水平下表达，但VISTA在肿瘤微环境(TME)内的骨髓源性抑制细胞(MDSC)上的表达格外较高。此外，在四种不同肿瘤模型的情况下，用αVISTA治疗小鼠显著损害肿瘤生长(图3)。这些研究结果表明在MDSC上表达的VISTA是干扰产生保护性抗肿瘤免疫性的主要抑制性分子，并且αVISTA缓解这个抑制活性，从而允许免疫干预和减缓肿瘤生长。这些研究结果进一步支持在自体免疫性疾病的情况下骨髓细胞上的VISTA在调节炎症程度方面发挥关键功能的假设。VISTA不在这些肿瘤上表达。
检查点调节剂Ig配体。
毫无疑问NCR在控制自体免疫性的产生方面起关键作用。在WT C57Bl/6背景的情况下，CTLA-4-/-小鼠显现侵袭性全身性自体免疫性疾病(4-6)，并且在Balb/c背景的情况下，PD-1-/-小鼠显现心肌病变和轻度狼疮(7,19)。在人中，阻断PD-1或CTLA-4的主要免疫相关毒性是出现自体免疫病症。除“简单”负性调节之外，许多NCR通过对天然(n)Treg起作用或通过增强天然T细胞向适应性(a)Treg的转变来对Treg功能产生影响。显现的数据显示NCR路径与激动剂正性衔接将通过诱导免疫抑制来提供治疗功效。通过NCR配体的相应受体来主动诱导免疫抑制性信号的NCR配体Ig融合蛋白(B7-Ig)(B7-H4-Ig、VISTA-Ig、PD-L1-Ig)表现为治疗自体免疫性的有效治疗剂。
研究已显示PD-L1-Ig和PD-L2-Ig与免疫抑制性药物组合可显著延长心脏同种异体移植物存活期(23)和角膜同种异体移植物存活期24的强力数据。在CIA、EAE和糖尿病的情况下，B7-H4已显示抑制活性(25-29)。视模型而定，这似乎归因于Treg功能的增强和/或对Th1或Th17群体的抑制(25-29)。我们已显示如同PD-L1和B7-H4一样，VISTA可增强向Treg的转变，并且这在它们对自身反应性的控制方面可为重要的(16)。对开发人治疗剂有意义的是，在2013年1月，Daiichi Sankyo开始用B7-H4–Ig在类风湿性关节炎的情况下进行1期试验(27、29、30)。
如同其它B7-Ig一样，VISTA-Ig可在体外完全遏止αCD3诱导的T细胞增殖以及停止实际上所有早期T细胞活性(15-17)。鉴于VISTA-Ig可损害T细胞活化，我们在鼠类全身性红斑狼疮模型的情况下评估它的治疗功效。潜伏于SLE肾炎的进展下的一个普遍机理牵涉慢性T细胞活化，伴有炎症性骨髓细胞随后向肾中募集，此促进病变。充分表征的小鼠品系BWF1显现与在人狼疮的情况下所见的自体免疫肾病类似的自体免疫肾病，包括存在循环自身反应性抗体，促炎性细胞因子增加，免疫复合物沉积肾小球性肾炎(GN)，进行性蛋白尿，以及最终由于肾衰竭而死亡。为确定VISTA-Ig是否可抑制确立的肾病，在24周时用VISTA-IgG2a治疗BW F1小鼠。这个干预导致蛋白尿快速和显著逆转，并且显著延长这些小鼠的存活期(图4)。我们也显示在VISTA-Ig治疗的情况下，活化T细胞的出现率降低，Foxp3信号增加和体内细胞因子产生降低(数据未显示)。我们提出视通过V-R达成的信号的强度而定，通过V-R达成的活性信号传导诱导T细胞无应答和/或出现aTreg(15、16)。也已显示VISTA-Ig在鼠类多发性硬化症(一种常规T细胞介导的疾病)模型的情况下的类似治疗功效(未显示)。
基于前述事项，有效治疗性开发VISTA-Ig将极大受益于对V-R的鉴定以明确确定VISTA的靶标细胞群体以及进一步有助于PK和PD研究。
A.用于鉴定VISTA受体的方法
1.通过检测多聚VISTA结合来鉴定V-R。
对于鉴定VISTA受体至关重要的是产生高品质多聚配体。关于这个的原因是VISTA与它的受体的预测相互作用可能极低(uM)。这个预测基于PD-1与PD-L1之间的相互作用较低(Kd 526nM；PD-L2也是如此(Kd 89nM))的事实。如果配体或受体被过表达，那么可观察到PD-1→PD-L1相互作用(34)。然而，为另外观察PD-1→PD-L1结合，必须使用多聚配体如四聚体。或者，可易于在用互补结合蛋白涂布的塑料盘上淘选过表达配体或受体的细胞(35)。
基于这个预测，我们已产生适于二聚化、寡聚化或多聚化以及淘选的VISTA配体。举例来说，VISTA-Ig已被工程改造有N末端BirA位点以产生具有高分子量骨架的多聚体。我们已与ImmuDex(http://www.immudex.com)一起工作来产生VISTA-Ig的(VISTA右旋糖苷聚体)这些是通过以预先指定的化学计量使配体连接于右旋糖苷骨架来产生的极高分子量多聚体。这些多聚体在检测受体时远比使用常规基于抗生蛋白的四聚体更灵敏。初步数据显示VISTA右旋糖苷聚体具有在体外抑制T细胞的活性(数据未显示)。
特定来说，VISTA二聚体可用于V-R鉴定。使用PD-L1分子中的结构基序(15)将VISTA的原始结构描述建模。然而，基于Fab片段的替代性模型表明VISTA可使用半胱氨酸残基形成涉及二硫桥的二聚体。支持这个推定二聚体结构的是三个糖基化位点位于VISTA多肽中，其似乎以离推定二聚体界面有足以允许形成二聚体的距离来定位。这些研究结果支持天然功能性VISTA可以二聚体形式存在的事实。此外，这个理论不由于在功能性研究中使用VISTA-Fc蛋白而被驳斥。这并非如同这个融合蛋白在Fc部分中含有可容许二聚化的链间二硫桥那样。此外，已发现相对较长和柔性的接头导致VISTA Ig融合蛋白比缺乏这种较长柔性接头的融合物在活性方面更加强力。
这个观察结果也支持VISTA形成功能性二聚体，因为这个接头可有助于两个链以特定方式相互作用(二聚化)。因此，产生由VISTA细胞外IgV结构域和CH3蛋白组成的融合蛋白(VISTA-CH3)，其应允许形成VISTA二聚体(即将不迫使两个链的C末端太靠近在一起)。仅在非还原性条件下，SDS-PAGE显示这个蛋白质是二聚的，从而表明存在VISTA链间二硫桥。此可发生的唯一位置在VISTA IgV中，因此这进一步指示VISTA在适当条件下形成共价同二聚体。
因此，推理相较于VISTA-Ig，VISTA-CH3可为用于检测V-R的优选配体。因此，设想具有C末端BirA位点的VISTA-CH3适用于酶促生物素化中以进行受体发现尝试。这些VISTA配体迄今为止尚未被证明会可检测地结合T细胞。然而，由于这个家族中配体和受体的相互作用的亲和力较低，所以这并非是惊人的。如同其它PD配体一样，预期这些VISTA配体在过表达时将可检测地结合V-R。这是合理信念，因为已显示相比于单体PD-L1 31，四聚PD-L1对PD-1的结合高100倍(Kd 6x10-8M)。较高亲合力配体已用于受体检测，并且基于配体结合的表达克隆已取得成功(BTLA-4)(31、32)。
基于前述事项，本发明者将它们的尝试集中于当使用可溶性配体时进行的V-R鉴定，其中用于测定中的可溶性配体包括VISTA右旋糖苷聚体(VISTA19-dex：19个VISTA分子在250K右旋糖苷骨架上)或包括VISTA二聚体。
2.通过淘选和通过可溶性配体结合进行的候选物文库筛选。
我们已从UniProt/SwissProt数据库选择和购买编码约200个候选跨膜Ig/TNF家族成员的质粒。对这些基因的选择基于它们在造血细胞中表达以及一些基因由文献所知的活性。这些质粒含有所论述的候选基因的开放阅读框以及用以确认质粒的转染和表达的GFP两者。作为POC，将PD-1/GFP转染至s-CHO细胞中。在过夜培养之后，可易于观察和定量GFP+细胞的特异性粘附于PD-L1而非其它板结合配体(图5)。
对于高通量尝试，以96孔形式用来自>200个所选基因的候选清单的GFP标记的蛋白质的CMV表达载体(Origene)转染CHO-S细胞(Life Technologies)。24小时后，将细胞分配于用VISTA-Fc融合蛋白或无关Fc融合蛋白涂布的板上，并且培养1小时。非粘附细胞将通过温和吸移至新的96孔板中来收集。粘附细胞通过胰蛋白酶-EDTA处理来释放，并且两个群体均通过流式细胞计量术来检查。这个技术显示极少背景，并且阳性物甚至用光学显微术明确可见。基于其，过表达V-R的CHO-S细胞应可检测地结合VISTA-Ig涂布的板。
3.通过配体结合进行的阵列候选物筛选。
重组荧光VISTA19-dex可用于筛选膜蛋白质文库，例如由Retrogenix(UK)http://www.retrogenix.com产生的(约3800个独特基因)以在简单高通量结合测定中鉴定推定结合配偶体。在一系列HEK293细胞中表达基因，并且荧光染料偶联的配体用于检测表达结合配偶体的细胞。
4.酵母双杂交筛选。
或者或此外，酵母双杂交系统诸如由Hybrigenics(France)开发的系统可用于使用VISTA-ECD诱饵和由活化和非活化健康人PBMC构建的猎物文库鉴定VISTA的推定受体(http://www.hybrigenics-services.com)。
在这些方法中，VISTA的细胞外结构域(aa 33-195；GenBank登记号gi：62339431)的编码序列用PCR扩增并克隆至pB29中成为LexA的N末端融合物(N-VISTA-LexA-C)。通过对整个插入物测序来确证构建体的正确性，并且接着用作诱饵来筛选被构建至pP6中的随机致敏的白细胞和活化的单核细胞cDNA文库，pB29和pP6分别源于原始pBTM116(37、38)和pGADGH(39)质粒。
可如先前所述(40)，使用用YHGX13(Y187 ade2-101::loxP-kanMX-loxP,matα)和L40αGal4(mata)酵母菌株进行的交配方法来筛选6300万个克隆(6倍于文库复杂度)。在缺乏色氨酸、亮氨酸和组氨酸的培养基上选择161His+菌落。通过PCR来扩增阳性克隆的猎物片段，并且在它们的5’接合点和3’接合点处测序。所得序列用于使用完全自动程序在GenBank数据库(NCBI)中鉴定相应相互作用蛋白质。接着如先前所述(41)，将置信度得分(PBS表示预测生物得分)归于各相互作用。
5.整体沉默。
我们已显示VISTA-Ig可抑制αCD3活化原代人T细胞。仅在原代细胞中具有活性的一个限制是对原代细胞的遗传操作是困难的。初步数据现时确定可使用VISTA-Ig来防止作为经转化人T细胞系的Jurkat T细胞中的CD69的上调(图5)。这个研究结果允许使用Jurkat细胞来试图遗传沉默由VISTA诱导的CD69表达抑制以鉴定V-R。在这些方法中，使用来自Sigma的Mission shRNA完整基因组文库。将所述文库分成10管，各管含有约12,000个靶向约2,000个基因的shRNA构建体。在使得每个细胞仅一个基因被敲低的MOI下用文库转染Jurkat细胞。
将在嘌呤霉素存在下培养经转导细胞和/或进行分选以选择shRNA表达性细胞。稳定敲低的细胞将用抗CD3+/- VISTA-Ig刺激24小时，并且在VISTA-Ig存在下的CD69+细胞将被当作阳性命中物。除CD69之外，恢复IL-2产生也将用于阐明受体沉默。将分选CD69+细胞，并且将由Sigma使用深度测序和去卷积技术来落实shRNA的身份。将使用额外测定例如增殖和多种细胞因子，在Jurkat细胞与原代T细胞两者中，通过单基因敲低和过表达方法来测试顶尖候选物的特异性。
6.表达克隆。
用于B7受体发现的一经证明策略已由Freeman和同事反复使用(35、36)。将使用CloneMinerTMII cDNA文库构建试剂盒和重组系统(Life Technologies)从分离自VISTA应答性人T细胞系的总mRNA定向克隆含有约3X106个初级插入物的未切割全长ORF cDNA文库，随后使用消减杂交进行标准化以增强较小频率mRNA物质的显示。所得cDNA文库将被直接调换至可相容DEST表达载体中人延伸因子1-α启动子的下游以及IRES(内部核糖体进入位点)-ZsGreen1荧光蛋白盒的上游以追踪从相同mRNA物质克隆的cDNA插入物的共同表达。将在VISTA-Ig涂布的板上进行连续多轮淘选文库转染的CHO-S细胞以富集VISTA受体表达。当高频率的细胞粘附于板(>50％)时，将分离质粒，转化至细菌中以进行克隆扩增，并且测序。
B.用以确认推定V-R(VISTA-R)是真正VISTA受体的功能性测定
可在功能性测定中评估通过任何前述方法鉴定的推定VISTA-R候选物以确认推定V-R的结合相互作用对于VISTA对免疫性的影响具有调节作用，所述影响最特别是VISTA对T细胞活化、增殖和细胞因子产生的抑制作用。以下描述示例性测定。
1.通过抗V-R单克隆抗体来阻断VISTA功能：在抗V-R单克隆抗体存在下逆转VISTA-Ig介导的T细胞抑制。
重组VISTA-Ig融合蛋白以剂量依赖性方式抑制抗CD3(OKT3)介导的体外T细胞增殖和细胞因子产生。因此，在抗V-R抗体(其是不具有激动性或拮抗性活性的阻断/中和抗体)存在下，VISTA-Fc的抑制作用将被抑制。
举例来说，在一示例性抗V-R抗体阻断测定中，用单独抗CD3抗体(OKT3)或抗CD3加VISTA-Ig在37℃下涂布96孔板1小时。抗CD3和VISTA-Ig可分别在最终浓度2.5和10ug/ml下使用。添加来自健康供给者外周血液的20万个纯化人T细胞至各孔中。将在抗V-R mAb存在下进行一式两份实验。在37℃下将板孵育5天。在第5天，将移除30ul上清液以用于细胞因子(IFN-γ和IL-2)分析，并且添加25μl氚化胸苷至细胞培养物中。接着再培养细胞8小时，随后通过氚合并来测量细胞增殖。
2.通过产生VISTA受体敲除细胞系来阻断VISTA功能。
V-R对VISTA功能的影响可进一步使用其中推定V-R的表达被敲除的T细胞系或Jurkat细胞系来确证。以下描述示例性方法。
方法A
重组VISTA-Ig融合蛋白以剂量依赖性方式抑制作为淋巴瘤细胞系的Jurkat细胞中抗CD3(OKT3)诱导的CD69和IL-2上调。使用慢病毒shRNA沉默技术敲低Jurkat细胞中VISTA受体候选物。所述敲除细胞将对VISTA-Ig介导的抑制无应答。
构建基因特异性shRNA慢病毒粒子以敲低VSIG8(Mission shRNA粒子，TCR文库来自Sigma)。Jurkat细胞将用shRNA慢病毒粒子在优化多重性感染下转导以实现靶标基因的大于90％敲低而无非特异性基因缺失。在嘌呤霉素药物存在下选择经转导细胞。通过定量PCR确认靶标基因的敲低特异性和水平。将在存在或不存在VISTA-Ig下用抗CD3刺激细胞。将通过流式细胞计量术来评估CD69的水平，并且将通过ELISA来测量在72小时之后培养上清液中的IL-2。
方法B
重组VISTA-Ig融合蛋白以剂量依赖性方式抑制抗CD3(OKT3)介导的体外T细胞增殖和细胞因子产生。使用慢病毒shRNA沉默技术敲低T细胞中VISTA受体候选物。所述敲除细胞将应对VISTA-Ig介导的抑制无应答。
构建基因特异性shRNA慢病毒粒子以敲低VSIG8(Mission shRNA粒子，TCR文库来自Sigma)。来自健康供给者的T细胞将用shRNA慢病毒粒子在优化多重性感染下转导以实现靶标基因的大于90％敲低而无非特异性基因缺失。将在嘌呤霉素药物存在下选择经转导细胞。将通过定量PCR确认靶标基因的敲低特异性和水平。将在存在或不存在VISTA-Ig下，如上所述进行抗CD3介导的T细胞增殖测定。将评估细胞因子和细胞增殖。
3.V-R表达测定
除使用原代人T细胞和Jurkat细胞来沉默推定V-R的沉默方法，或使用板结合抗V-R抗体来诱导T细胞活化抑制的抗体阻断测定之外，可进一步通过检测T细胞上的mRNA和蛋白质表达来确证对推定V-R作为VISTA的真正受体的确认。
这些测定将检测相较于适当对照，T细胞或Jurkat细胞中V-R mRNA或蛋白质水平。预测这些表达测定将指示真正V-R由静息T细胞以及由Jurkat细胞组成性表达。
如工作实施例中所详述，阐明并发现VISTA受体是含有V组和免疫球蛋白结构域的蛋白8或VSIG8。
C.VSIG8用以产生VISTA/V-R激动剂和拮抗剂的用途以及在疗法和诊断中的用途
鉴定的V-R用于鉴定VISTA/V-R激动剂或拮抗剂。这些激动剂和拮抗剂化合物将特别包括激动或拮抗VSIG8对T或NK免疫性的影响的抗体和抗体片段，并且优选包括抑制或促进VISTA和VSIG8的相互作用的那些。这些抗体可通过使用VSIG8多肽或其片段或缀合物作为免疫原进行熟知体内或体外免疫来获得。优选地，这些抗体和抗体片段将包括人、人源化、灵长类动物源化和嵌合抗体以及抗体片段，诸如Fab、Fab'、scFv、(Fab)2、IgNar、metMab以及其它已知类型的抗体和抗体片段。
这些激动剂和拮抗剂化合物将进一步包括多肽，即包含VSIG8的细胞外区域的全部或一部分的多肽，或与VSIG8的细胞外区域或其一部分(诸如其中IgV或IgC结构域)具有至少80、90、95或99％序列同一性的多肽。也可使这些VSIG8多肽融合于另一多肽诸如任选可被诱变以增强或抑制FcR和/或补体结合或其它效应物功能的Ig恒定区，例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区。此外，激动剂或拮抗剂可包含一个或多个拷贝的VSIG8多肽或片段，即化合物可为多聚的，并且VSIG8多肽的各拷贝可由接头间插，所述接头例如是长柔性肽，诸如是至少15-25个氨基酸以及含有一个或多个丝氨酸残基的肽。
此外，根据本发明的激动剂和拮抗剂化合物将进一步包括激动或拮抗VISTA/VSIG8结合相互作用的小分子。
优选地，根据本发明的拮抗剂将实质上抑制或防止VISTA对T细胞或NK细胞免疫性的抑制作用。这可使用体外基于细胞的测定，用表达VISTA和/或VSIG8的细胞来检测。拮抗剂将抑制或阻断由VISTA介导的对T细胞活化或增殖或NK T细胞活化或增殖的抑制作用，例如相较于适合对照，它将增加CD8+或CD4+ T细胞活化或CD8+或CD4+ T细胞增殖和/或促进NK细胞介导的活性。
相反，根据本发明的激动剂优选将加强或增强VISTA对T细胞或NK细胞免疫性的抑制作用。这可使用体外基于细胞的测定，用表达VISTA和/或VSIG-8的细胞来检测。激动剂将促进由VISTA介导的对T细胞活化或增殖或对NK细胞介导的活性的抑制作用，例如相较于适合对照，它将抑制CD8+或CD4+ T细胞活化或增殖或NK介导的细胞功能诸如溶解。
必要时，用于鉴定所述激动剂和拮抗剂的筛选方法可以高通量形式实现。
可配制鉴定的激动剂和拮抗剂以在人疗法中使用。这可包括添加适合稳定剂、赋形剂或载体。此外，可修饰激动剂或拮抗剂以增强体内稳定性，诸如通过连接于一种或多种水溶性聚合物诸如聚乙二醇聚合物，或通过酰化。用于使所述部分连接于蛋白质的方法在本领域中是熟知的。
如所提及，含有根据本发明的激动剂的组合物可用于抑制T细胞免疫性以及治疗其中这是在治疗上合乎需要的病状诸如自体免疫性、过敏性或炎症性病状。这些组合物将包含有效抑制有此需要的受试者中T细胞活化或增殖的量的根据本发明的激动剂。所述自体免疫性、炎症性和过敏性病状包括例如关节炎病状诸如RA、牛皮癣性关节炎、硬皮病、多发性硬化症、狼疮、IBD、ITP、糖尿病、类肉瘤病、过敏性哮喘等。
含有根据本发明的拮抗剂的组合物可用于促进T细胞免疫性以及治疗其中这是在治疗上合乎需要的病状诸如癌症和感染性疾病适应症。这些组合物将包含有效促进有此需要的受试者例如患有癌性病状的受试者中T细胞活化或增殖的量的根据本发明的拮抗剂。
可用主题拮抗剂治疗的癌症例如包括黑素瘤、淋巴瘤、白血病、肺癌、卵巢癌、子宫颈癌、睾丸癌、消化道癌、食道癌、肝癌、胰腺癌、肾癌、皮肤癌。
可用根据本发明的拮抗剂治疗的感染性疾病包括病毒性疾病(诸如HIV、HPV、EBV、脑炎、疱疹、其它痘病毒和其它已知人病毒)、寄生虫性疾病、细菌性疾病、真菌或酵母相关的疾病以及影响人的其它感染性疾病状况。
应了解以上标识的疾病状况意图是示例性的而非是详尽的。此外，可使主题激动剂或拮抗剂与可于相同或不同组合物中在相同或不同时间施用的其它治疗剂组合。举例来说，主题激动剂或拮抗剂可以包括施用PD-1或PD-L1激动剂或拮抗剂、CTLA4-Ig、细胞因子、细胞因子激动剂或拮抗剂或另一受体激动剂或拮抗剂的治疗方案施用。
具有特定种系序列的抗VSIG8抗体
在某些实施方案中，根据本发明的抗VSIG8抗体包含来自特定种系重链免疫球蛋白基因的重链可变区和/或来自特定种系轻链免疫球蛋白基因的轻链可变区。举例来说，所述抗VSIG8抗体可包含以下或由以下组成：包含是特定种系序列“的产物”或“源于”特定种系序列的重链或轻链可变区的人抗体，条件是所述抗体的可变区从使用人种系免疫球蛋白基因的系统获得。所述系统包括用目标抗原使携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠免疫，或用目标抗原筛选在噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因文库。是人种系免疫球蛋白序列“的产物”或“源于”人种系免疫球蛋白序列的人抗体可照此通过比较人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列，以及选择在序列方面与人抗体的序列最密切(即最大同一性％)的人种系免疫球蛋白序列来鉴定。
是特定人种系免疫球蛋白序列“的产物”或“源于”特定人种系免疫球蛋白序列的人抗体相较于种系序列可含有归因于例如天然存在的体细胞突变或故意引入定点突变的氨基酸差异。然而，所选人抗体通常在氨基酸序列方面与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少90％同一，并且含有当相较于其它物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如鼠类种系序列)时，将人抗体鉴定为人性的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体可在氨基酸序列方面与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列至少95、96、97、98或99％，或甚至至少96％、97％、98％或99％同一。通常，源于特定人种系序列的人抗体将显示与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列的不超过10个氨基酸差异。在某些情况下，人抗体可显示与由种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列的不超过5个，或甚至不超过4、3、2或1个氨基酸差异。
同源性抗体
在某些实施方案中，根据本发明的抗VSIG8抗体包含分别包含与优选抗VSIG8抗体的经分离抗VSIG8氨基酸序列同源的氨基酸序列的重链可变区和轻链可变区，其中抗体保留亲本抗VSIG8抗体的所需功能性质。如本文所用，两个氨基酸序列之间的同源性百分比等于两个序列之间的同一性百分比。两个序列之间的同一性百分比是在考虑需要被引入以达成两个序列的最优比对的空位的数目和各空位的长度的情况下，由序列共有的同一位置的数目的函数(即同源性％＝同一位置的数目/位置的总数目X 100)。可如以下非限制性实例中所述，使用数学算法来实现序列比较以及确定两个序列之间的同一性百分比。
可使用E.Meyers和W.Miller(Comput.Appl.Biosci.,4:11-17(1988))的算法来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，所述算法已被并入ALIGN程序(2.0版)中，所述程序使用PAM120权重残基表、空位长度罚分12和空位罚分4。此外，可使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.48:444-453(1970))算法来确定两个氨基酸序列之间的同一性百分比，所述算法已被并入GCG软件包(可商购获得)中的GAP程序中，所述程序使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵、以及空位权重16、14、12、10、8、6或4和长度权重1、2、3、4、5或6。
另外或替代地，本发明的蛋白质序列可进一步用作“查询序列”以相对于公共数据库进行搜索来例如鉴定相关序列。所述搜索可使用Altschul等(1990)J Mol.Biol.215:403-10的XBLAST程序(2.0版)进行。可用XBLAST程序(得分＝50、字长＝3)进行BLAST蛋白质搜索以获得与根据本发明的至少一些实施方案的抗体分子同源的氨基酸序列。为出于比较目的获得空位化比对，可如Altschul等,(1997)Nucleic Acids Res.25(17):3389-3402中所述利用空位化BLAST。当利用BLAST和空位化BLAST程序时，可使用相应程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。
具有保守性修饰的抗体
在某些实施方案中，根据本发明的抗VSIG8抗体包含含有CDRl、CDR2和CDR3序列的重链可变区和含有CDRl、CDR2和CDR3序列的轻链可变区，其中这些CDR序列中的一者或多者包含基于使用本文方法分离和产生的优选抗VSIG8抗体的指定氨基酸序列或其保守性修饰，并且其中抗体相应地保留根据本发明的至少一些实施方案的抗VSIG8抗体的所需功能性质。
在各种实施方案中，抗VSIG8抗体可为例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。如本文所用，术语“保守性序列修饰”意指不显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。所述保守性修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可通过本领域中已知的标准技术诸如定点诱变和PCR介导的诱变来将修饰引入根据本发明的至少一些实施方案的抗体中。保守性氨基酸取代是其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换的氨基酸取代。本领域中已定义具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，根据本发明的至少一些实施方案的抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可用来自同一侧链家族的其它氨基酸残基替换，并且可使用本文所述的功能性测定来测试经改变抗体的保留功能(即以上(c)至j)中所示的功能)。
结合相同表位的抗VSIG8抗体
在某些实施方案中，根据本发明的抗VSIG8抗体具有所需功能性质，诸如调节免疫刺激和相关功能。可选择具有相同表位特异性的其它抗体，并且其将能够与所需抗体交叉竞争结合VSIG8抗原。或者，可使用构成整个VSIG8多肽的重叠肽(例如15聚体)的文库或构成含有VSIG8的所需表位的部分的重叠肽文库来确定所需抗体的表位特异性，并且确定结合文库中相同肽或其一个或多个残基的抗体结合相同线性或构象性表位。
经工程改造和经修饰抗体
在某些实施方案中，可使用具有一个或多个源于抗VSIG8抗体起始物质的VH序列和/或VL序列的抗体以进行经修饰抗体工程改造来制备根据本发明的抗VSIG8抗体，所述经修饰抗体可具有从起始抗体改变的性质。可通过修饰一个或两个可变区(即VH和/或VL)内，例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个框架区内的一个或多个残基来工程改造抗体。另外或替代地，可通过修饰恒定区内的残基例如以改变抗体的效应物功能来工程改造抗体。
可进行的一种类型的可变区工程改造是CDR移植。抗体主要通过位于6个重链和轻链互补决定区(CDR)中的氨基酸残基来与靶标抗原相互作用。出于这个原因，在个别抗体之间，CDR内的氨基酸序列比在CDR外部的序列更加互异。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，所以有可能通过构建包括来自特定天然存在的抗体的CDR序列移植于来自具有不同性质的不同抗体的框架序列上的表达载体来表达模拟特定天然存在的抗体的性质的重组抗体(参见例如Riechmann,L.等(1998)Nature 332:323-327；Jones,P.等(1986)Nature 321:522-525；Queen,C.等(1989)Proc.Natl.Acad.See.U.S.86:10029-10033；属于Winter的美国专利号5,225,539以及属于Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
适合框架序列可从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开参考文献获得。举例来说，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可见于“VBase”人种系序列数据库(在因特网上可用)中以及Kabat,E.A.等(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版号91-3242；Tomlinson,I.M.等(1992)"The Repertoire of Human Germline VHSequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with DifferentHypervariable Loops"J.Mol.Biol.227:776-798；以及Cox,J.P.L.等(1994)"A Directoryof Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage"Eur.JImmunol.24:827-836中；其各自的内容以引用的方式明确并入本文。
另一类型的可变区修饰在于使VH和/或VL CDR 1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基突变以由此改进目标抗体的一种或多种结合性质(例如亲和力)。可进行定点诱变或PCR介导的诱变以引入突变，并且可在适当体外或体内测定中评估对抗体结合或其它目标功能性质的影响。优选地，引入保守性修饰(如上所讨论)。突变可为氨基酸取代、添加或缺失，但优选是取代。此外，通常改变CDR区内的不超过1个、2个、3个、4个或5个残基。
根据本发明的至少一些实施方案的工程改造的抗体包括其中已对VH和/或VL内的框架残基进行修饰，例如以改进抗体的性质的那些。通常，进行所述框架修饰以降低抗体的免疫原性。举例来说，一种方法在于使一个或多个框架残基“回复突变”成相应种系序列。更具体来说，已经受体细胞突变的抗体可含有不同于抗体所源于的种系序列的框架残基。可通过比较抗体框架序列与抗体所源于的种系序列来鉴定所述残基。
除在框架区或CDR区内进行的修饰之外或替代所述修饰，根据本发明的至少一些实施方案的抗体可被工程改造以在Fc区内包括修饰，通常以改变抗体的一种或多种功能性质，诸如血清半衰期、补体固定、Fc受体结合和/或抗原依赖性细胞细胞毒性。此外，根据本发明的至少一些实施方案的抗体可被化学修饰(例如可使一个或多个化学部分连接于抗体)或被修饰以改变它的糖基化，同样以改变抗体的一种或多种功能性质。以下进一步描述所述实施方案。Fc区中残基的编号是Kabat的EU索引的编号。
在一个实施方案中，修饰CHI的铰链区以使铰链区中半胱氨酸残基的数目被改变，例如增加或降低。这个方法进一步描述于由Bodmer等人所完成的美国专利号5,677,425中。改变CHI的铰链区中半胱氨酸残基的数目以例如有助于轻链和重链的装配或以增加或降低抗体的稳定性。
在另一实施方案中，使抗体的Fc铰链区突变以降低所述抗体的生物半衰期。更具体来说，将一个或多个氨基酸突变引入Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域界面区中以使相对于天然Fc-铰链结构域葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein A，SpA)结合，抗体具有受损SpA结合。这个方法进一步详细描述于由Ward等人所完成的美国专利号6,165,745中。
在另一实施方案中，抗体被修饰以增加它的生物半衰期。各种方法是可能的。举例来说，可引入一个或多个以下突变：T252L、T254S、T256F，如属于Ward的美国专利号6,277,375中所述。或者，为增加生物半衰期，可在CHI区或CL区内改变抗体以含有取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环的补救受体结合表位，如由Presta等人所完成的美国专利号5,869,046和6,121,022中所述。
在其它实施方案中，通过用不同氨基酸残基替换至少一个氨基酸残基来改变Fc区以改变抗体的效应物功能。举例来说，可用不同氨基酸残基替换一个或多个选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320和322的氨基酸以使抗体对效应配体具有改变的亲和力，但保留亲本抗体的抗原结合能力。对其的亲和力被改变的效应配体可为例如Fc受体或补体的Cl组分。这个方法进一步详细描述于两者均由Winter等人所完成的美国专利号5,624,821和5,648,260中。
在另一实例中，可用不同氨基酸残基替换一个或多个选自氨基酸残基329、331和322的氨基酸以使抗体具有改变的Clq结合和/或降低或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这个方法进一步详细描述于由Idusogie等人所完成的美国专利号6,194,551中。
在另一实例中，改变一个或多个在氨基酸位置231和239内的氨基酸残基以由此改变抗体固定补体的能力。这个方法进一步描述于由Bodmer等人所完成的PCT公布WO 94/29351中。
在另一实例中，通过修饰一个或多个在以下位置处的氨基酸来修饰Fc区以增加抗体介导抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)的能力和/或以增加抗体对Fey受体的亲和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。这个方法进一步描述于由Presta所完成的PCT公布WO 00/42072中。此外，已定位人IgGl上对FcyRI、FcyRII、FcyRIII和FcRn的结合位点，并且已描述具有改进结合的变体(参见Shields,R.L.等(2001)J.Biol.Chem.276:6591-6604)。显示在位置256、290、298、333、334和339处的特定突变会改进与FcyRIII的结合。另外，显示以下组合突变体会改进FcyRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A和S298A/E333A/K334A。此外，诸如M252Y/S254T/T256E或M428L/N434S的突变改进与FcRn的结合，并且增加抗体循环半衰期(参见Chan CA和Carter PJ(2010)Nature Rev Immunol 10:301-316)。
在另一实施方案中，抗体可被修饰以消除体内Fab臂交换。具体来说，方法涉及在其它IgG4抗体之间交换IgG4半分子(一个重链加一个轻链)，所述交换有效产生在功能上是单价的双特异性抗体。对重链的铰链区和恒定结构域的突变可消除这个交换(参见Aalberse,RC,Schuurman J.,2002,Immunology 105:9-19)。
在另一实施方案中，修饰抗体的糖基化。举例来说，可制备无糖基化抗体(即抗体缺乏糖基化)。可改变糖基化以例如增加抗体对抗原的亲和力。所述碳水化合物修饰可通过例如改变抗体序列内的一个或多个糖基化位点来实现。举例来说，可进行一个或多个导致消除一个或多个可变区框架糖基化位点的氨基酸取代以由此消除在那个位点处的糖基化。所述无糖基化可增加抗体对抗原的亲和力。这种方法进一步详细描述于由Co等人所完成的美国专利号5,714,350和6,350,861中。
另外或替代地，可制备具有改变类型的糖基化的抗体，诸如具有降低量的海藻糖基残基的低海藻糖基化抗体或具有增加的对切GlcNac结构的抗体。已证明所述改变的糖基化样式会增加抗体的ADCC能力。所述碳水化合物修饰可通过例如在糖基化机构改变的宿主细胞中表达抗体来实现。糖基化机构改变的细胞已在本领域中被描述，并且可用作在其中表达根据本发明的至少一些实施方案的重组抗体的宿主细胞以由此产生具有改变的糖基化的抗体。举例来说，细胞系Ms704、Ms705和Ms709缺乏海藻糖基转移酶基因FUT8((1,6)海藻糖基转移酶)，以致在Ms704、Ms705和Ms709细胞系中表达的抗体在它们的碳水化合物上缺乏海藻糖。通过使用两种替换载体在CHO/DG44细胞中靶向破坏FUT8基因来产生Ms704、Ms705和Ms709FUT8细胞系(参见由Yamane等人所完成的美国专利公布号20040110704以及Yamane-Ohnuki等(2004)Biotechnol Bioeng 87:614-22)。作为另一实例，由Hanai等人所完成的EP 1,176,195描述具有编码海藻糖基转移酶的在功能上被破坏的FUT8基因的细胞系，以致由于降低或消除1,6键相关酶，在这种细胞系中表达的抗体展现低海藻糖基化。Hanai等人也描述用于向结合抗体的Fc区的N-乙酰基葡萄糖胺添加海藻糖的酶活性较低，或不具有酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL 1662)。由Presta所完成的PCT公布WO 03/035835描述变异CHO细胞系Lecl3细胞，其具有降低的使海藻糖连接于Asn(297)连接的碳水化合物的能力，从而也导致在那个宿主细胞中表达的抗体具有低海藻糖基化(也参见Shields,R.L.等(2002)J.Biol.Chem.277:26733-26740)。由Umana等人所完成的PCT公布WO 99/54342描述被工程改造以表达糖蛋白修饰性糖基转移酶(例如P(l,4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII))的细胞系，以致在工程改造的细胞系中表达的抗体展现增加的对切GlcNac结构，此导致抗体的ADCC活性增加(也参见Umana等(1999)Nat.Biotech.17:176-180)。或者，可使用海藻糖苷酶来裂解去除抗体的海藻糖残基。举例来说，海藻糖苷酶a-L-海藻糖苷酶从抗体移除海藻糖基残基(Tarentino,A.L.等(1975)Biochem.14:5516-23)。
由本发明涵盖的本文抗体的另一修饰是聚乙二醇化或添加其它水溶性部分，通常是聚合物，例如以增强半衰期。可使抗体聚乙二醇化以例如增加所述抗体的生物(例如血清)半衰期。为使抗体聚乙二醇化，通常使所述抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)诸如PEG的反应性酯或醛衍生物在其中一个或多个PEG基团变得连接于所述抗体或抗体片段的条件下反应。优选地，通过与反应性PEG分子(或类似反应性水溶性聚合物)的酰化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。如本文所用，术语“聚乙二醇”意图涵盖已用于衍生其它蛋白质的任何形式的PEG，诸如单(Ci-Cio)烷氧基聚乙二醇或芳基氧基聚乙二醇或聚乙二醇-顺丁烯二酰亚胺。在某些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化抗体。用于使蛋白质聚乙二醇化的方法在本领域中是已知的，并且可应用于根据本发明的至少一些实施方案的抗体。参见例如由Nishimura等人所完成的EP 0 154 316和由Ishikawa等人所完成的EP 0 401 384。
工程改造抗体的方法
在某些实施方案中，根据本发明具有VH序列和VL序列的抗VSIG8抗体可分别通过修饰VH序列和/或VL序列或与其连接的恒定区来用于产生新型抗VSIG8抗体。因此，在根据本发明的至少一些实施方案的另一方面，根据本发明的至少一些实施方案的抗VSIG8抗体的结构特征用于产生保留根据本发明的至少一些实施方案的抗体的至少一种功能性质(诸如与人VSIG8结合)的结构相关抗VSIG8抗体。举例来说，可使一种VSIG8抗体的一个或多个CDR区或其突变形式与已知框架区和/或其它CDR重组组合以产生根据本发明的至少一些实施方案的额外重组工程改造的抗VSIG8抗体，如上所讨论。其它类型的修饰包括先前章节中所述的那些。用于工程改造方法的起始物质是一个或多个本文提供的VH序列和/或VL序列或其一个或多个CDR区。为产生工程改造的抗体，不必实际制备(即表达成蛋白质)具有一个或多个本文提供的VH序列和/或VL序列或其一个或多个CDR区的抗体。更确切来说，序列中含有的信息用作起始物质来产生源于原始序列的“第二代”序列，接着制备所述“第二代”序列并表达成蛋白质。
标准分子生物学技术可用于制备和表达改变的抗体序列。优选地，由改变的抗体序列编码的抗VSIG8抗体是通过各种方法以及用本文提供的序列来产生的分别保留抗VSIG8抗体的一种、一些或全部功能性质的抗体，所述功能性质包括以特定KD水平或更小的KD水平与VSIG8抗原结合和/或调节免疫应答和/或选择性结合所需靶标细胞诸如像表达VSIG8抗原的细胞。
可使用本领域中可用和/或本文所述的标准测定评估改变的抗体的功能性质。在工程改造根据本发明的至少一些实施方案的抗体的方法的某些实施方案中，可随机或选择性沿抗VSIG8抗体编码序列的全部或一部分引入突变，并且可筛选具有结合活性和/或其它所需功能性质的所得经修饰抗VSIG8抗体。
本领域中已描述突变方法。举例来说，由Short所完成的PCT公布WO 02/092780描述用于使用饱和诱变、合成连接装配或其组合来产生和筛选抗体突变的方法。或者，由Lazar等人所完成的PCT公布WO 03/074679描述使用计算筛选方法来优化抗体的生理化学性质的方法。
VSIG8片段多肽
术语VSIG8的“可溶性外结构域(ECD)”或“外结构域”或“可溶性”形式也指编码相应蛋白质的核酸序列。任选地，VSIG8 ECD蛋白及其片段是指SEQ ID NO:1-3中的任一者列出的任一多肽序列和/或其变体，所述变体与所述多肽序列具有至少80％序列同一性，更优选具有至少90％序列同一性，并且甚至更优选与其具有至少95、96、97、98或99％序列同一性，和/或其融合物和/或缀合物，和/或编码以上各物的多核苷酸。
特定来说，VSIG8的细胞外结构域的片段可包括对应于VSIG8的细胞外结构域的IgV结构域的任何部分或包含所述IgV结构域的任何序列。
VSIG8蛋白含有细胞外结构域内的与抗体的可变结构域相关的免疫球蛋白结构域，即IgV结构域(或V结构域)。就类似于其它B7家族成员来说，IgV结构域可负责受体结合。细胞外结构域的Ig结构域包括一个在结构域内半胱氨酸残基之间形成的二硫键，如同这个折叠所特有，并且对于结构-功能可为重要的。
在一个实施方案中，提供VSIG8的可溶性片段；如以下关于融合蛋白章节更详细所述，这种可溶性片段可任选被描述为第一融合配偶体。适用片段是单独或当包含在融合蛋白中或多聚化时保留结合它们的一种或多种例如在T细胞和NK细胞上表达的天然受体的能力，和/或调节(抑制或促进)T细胞和/或NK细胞活化的那些。相较于全长VSIG8，是全长VSIG8的片段的VSIG8多肽通常具有至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、100％或甚至超过100％的结合它的天然受体的能力和/或对VSIG8对于免疫性和对于特定免疫细胞的一种或多种功能性作用的调节作用(激动作用或拮抗作用)。可溶性VSIG8多肽片段是可从产生性细胞排出、分泌或另外提取的VSIG8多肽的片段。在其它实施方案中，VSIG8多肽的可溶性片段包括VSIG8细胞外结构域的保留VSIG8生物活性的片段，诸如保留结合它们的一种或多种天然受体的能力和/或调节(抑制或促进)T细胞或NK细胞活化的片段。细胞外结构域可包括来自跨膜结构域的1、2、3、4或5个连续氨基酸，和/或1、2、3、4或5个来自信号序列的连续氨基酸。
或者，细胞外结构域可从C末端、N末端或两者移除1、2、3、4、5个或更多个氨基酸。
在一些实施方案中，VSIG8细胞外结构域多肽包含如SEQ ID NO:1、2或3中的任一者所示的IgV结构域的氨基酸序列或其片段或变体。在其它实施方案中，VSIG8细胞外结构域多肽基本上由如SEQ ID NO:1-3中的任一者所示的IgV结构域的氨基酸序列组成。
通常，VSIG8多肽片段由包括编码信号序列的序列的核酸表达。信号序列通常从不成熟多肽裂解以产生缺乏信号序列的成熟多肽。可使用标准分子生物学技术，用另一多肽的信号序列替换VSIG8的信号序列以影响多肽的表达水平、分泌、溶解性或其它性质。用于替换VSIG8信号肽序列的信号肽序列可为本领域中已知的任何信号肽序列。
优选地，VSIG8的所述“可溶性外结构域(ECD)”或“外结构域”或“可溶性”形式将调节(激动或拮抗)VSIG8对免疫性和特定类型的免疫细胞诸如细胞毒性或效应T细胞、Treg和NK细胞的一种或多种作用。
VSIG8多肽的变体
在至少一些实施方案中，本发明涵盖VSIG8多肽的适用变体，包括如通过任何本文所述的测定所指示使生物活性增加，或使蛋白质的半衰期或稳定性增加的那些。可溶性VSIG8蛋白或其具有VSIG8蛋白活性的片段或融合物分别可被工程改造以增加生物活性。在另一实施方案中，以至少一个使分子与免疫细胞例如T细胞的结合增加，以及将抑制性信号传递至T细胞中的氨基酸取代、缺失或插入来修饰VSIG8蛋白或融合蛋白。根据前述权利要求中任一项的经分离或重组VSIG8多肽或融合蛋白包含至少一个半衰期延长部分。
所述半衰期延长部分可例如包括聚乙二醇(PEG)、单甲氧基PEG(mPEG)、XTEN分子、rPEG分子、纤维连接蛋白(adnectin)、血清白蛋白、人血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或其片段、或酰基。在一些实施方案中，根据本发明的包含异源性多肽或半衰期延长部分或其它异源性分子的半衰期改进的经分离或重组VSIG8多肽或融合蛋白相较于缺乏所述异源性多肽、半衰期延长部分或其它异源性分子的另外相同分子可使VSIG8多肽或融合蛋白的体内半衰期增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍或更多。
其它任选变体是被工程改造以相对于其它免疫细胞或NK细胞，选择性结合一种类型的T细胞的那些VSIG8蛋白。举例来说，VSIG8多肽可被工程改造以任选结合Treg、Th0、Th1、Thl7、Th2或Th22细胞或NK细胞。优先结合是指对一种类型的细胞的结合超过对另一类型的细胞的结合至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或更大。VSIG8蛋白的其它变体可被工程改造以分别相对于野生型VSIG8蛋白具有降低的与免疫细胞的结合。这些变体可与具有较强结合性质的变体组合来以中度影响调节免疫应答。
也任选地，变异VSIG8蛋白可被工程改造以相对于野生型具有增加的半衰期。这些变体通常被修饰以抵抗酶促降解。示例性修饰包括抵抗酶促降解的经修饰氨基酸残基和经修饰肽键。用以将此实现的各种修饰在本领域中是已知的。
优选地，所述变异形式的VSIG8将调节(激动或拮抗)VSIG8对免疫性以及对特定类型的免疫细胞诸如细胞毒性或效应T细胞、Treg、MDSC、其它抑制细胞类型或对NK细胞的一种或多种作用。
VSIG8融合蛋白
根据至少一些实施方案，VSIG8融合多肽具有包含VSIG8蛋白的全部或一部分的第一融合配偶体，其直接或通过用于连接两个蛋白质的接头肽序列或化学接头融合于第二多肽。可任选使VSIG8多肽融合于第二多肽以形成如本文所述的融合蛋白。存在第二多肽可改变VSIG8融合多肽的溶解性、稳定性、亲和力和/或化合价。如本文所用，“化合价”是指每个分子可用的结合位点的数目。在一个实施方案中，第二多肽是来自不同来源或不同蛋白质的多肽。
根据至少一些实施方案，如本文所述，VSIG8蛋白或片段由于它用于治疗免疫相关病症、感染性病症、败血症、癌症和/或用于阻断在基因转移之后不合需要的免疫活化的活性而被选择。
在一个实施方案中，第二多肽含有免疫球蛋白重链恒定区的一个或多个结构域，优选具有对应于人免疫球蛋白Cyl、Cy2、Cy3或Cy4链的铰链区、Cm和Cm区或对应于鼠类免疫球蛋白Cy2a链的铰链区、Cm和Cm区的氨基酸序列。根据至少一些实施方案，融合蛋白是任选能够交联两个或更多个靶标的二聚融合蛋白。在一任选二聚融合蛋白中，二聚体由两个Ig重链的铰链区中Cys残基的共价键合所致，所述Cys残基是在二聚化正常Ig重链中以二硫键连接的相同Cys残基。所述蛋白质被称为VSIG8多肽、其片段或融合蛋白。
在一个实施方案中，免疫球蛋白恒定结构域可含有一个或多个增强或降低与特定细胞类型的结合，增加生物可用度，或增加VSIG8多肽、其融合蛋白或片段的稳定性的氨基酸插入、缺失或取代。适合氨基酸取代包括如上所述的保守性和非保守性取代。
融合蛋白任选含有起使两个或更多个融合蛋白二聚化或多聚化的作用的结构域。肽/多肽接头结构域可为单独结构域，或者可含于融合蛋白的一个其它结构域(VSIG8多肽或第二多肽)内。类似地，起使融合蛋白二聚化或多聚化的作用的结构域可为单独结构域，或者可含于融合蛋白的一个其它结构域(VSIG8多肽、第二多肽或肽/多肽接头结构域)内。在一个实施方案中，二聚化/多聚化结构域和肽/多肽接头结构域是相同的。以下给出二聚化/多聚化结构域和接头的其它特定、说明性和非限制性实例。
根据本发明的至少一些实施方案的本文公开的融合蛋白具有式I：N-R1-R2-R3-C，其中“N”代表融合蛋白的N末端，“C”代表融合蛋白的C末端。在其它实施方案中，“Rl”是VSIG8多肽，“R2”是任选肽/多肽或化学接头结构域，并且“R3”是第二多肽。或者，R3可为VSIG8多肽，并且Rl可为第二多肽。以下更详细描述接头的各种非限制性实例。
任选地，融合蛋白包含如本文所述的VSIG8多肽片段任选通过具有一个或多个氨基酸的接头肽(例如GS)融合于一个或多个“半衰期延长部分”。“半衰期延长部分”是当附接于蛋白质时使那个蛋白质在受试者的身体内(例如在所述受试者的血浆中)的体内半衰期延长的任何部分，例如多肽、小分子或聚合物。举例来说，在本发明的一实施方案中，半衰期延长部分是聚乙二醇(PEG)、单甲氧基PEG(mPEG)、XTEN分子、rPEG分子、纤维连接蛋白、血清白蛋白、人血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或其片段、或酰基。在本发明的一实施方案中，PEG是5、10、12、20、30、40或50kDa部分或更大部分，或包含约12000个乙二醇单元(PEG12000)。根据本发明的经分离或重组VSIG8多肽或融合蛋白可任选包含至少一个半衰期延长部分。半衰期延长部分包括PEG、XTEN分子、rPEG分子、纤维连接蛋白、血清白蛋白、人血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或其片段、或酰基。在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白中含有的异源性多肽、半衰期延长部分或其它异源性分子相较于缺乏所述异源性多肽、半衰期延长部分或其它异源性分子的另外相同分子可使所述经分离或重组VSIG8多肽或融合蛋白的体内半衰期增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍或更多。
也可任选通过化学合成方法和在合成期间或在合成后化学实现的“接合”来制备融合蛋白。
可任选使用交联和其它所述方法(任选也用上述遗传水平融合方法)，如例如在属于Wallner等人的美国专利号5,547,853中所述，所述专利据此以引用的方式并入本文，所述引用的程度就好像仅作为一非限制性实例在本文中完全所示一样。
根据本发明，可通过与免疫球蛋白的包含免疫球蛋白的恒定区的一部分融合来由本发明的蛋白质制备融合蛋白。更优选地，免疫球蛋白的所述部分包含任选以及更优选是人重链恒定区的重链恒定区。重链恒定区最优选是IgG重链恒定区，并且任选以及最优选是Fc链，最优选是包含铰链结构域、Cm结构域和Cm结构域的IgG Fc片段。Fc链可任选是已知或“野生型”Fc链，或者可为突变的或截短的。融合蛋白的Fc部分可任选就同种型或子类来说而变化，可为嵌合物或杂合物，和/或可被修饰，例如以改进效应物功能，控制半衰期、组织可及性，加强生物物理学特征诸如稳定性，以及改进产生效率(并且花费较少)。用于构建所公开融合蛋白的许多修饰和用于制备所公开融合蛋白的方法在本领域中是已知的，参见例如Mueller等,Mol.Immun.,34(6):441-452(1997)，Swann等,Curr.Opin.Immun.,20:493-499(2008)，以及Presta,Curr.Opin.Immun.20:460-470(2008)。在一些实施方案中，Fc区是天然IgGl、IgG2、IgG3或IgG4Fc区。在一些实施方案中，Fc区是杂合物，例如由IgG2/IgG4Fc恒定区组成的嵌合物。
对Fc区的修饰包括但不限于IgG4被修饰以防止结合Fey受体和补体，IgGl被修饰以改进与一种或多种Fc y受体的结合，IgGl被修饰以使效应物功能最小(氨基酸变化)，IgGl具有改变的聚糖/不具有聚糖(通常通过改变表达宿主或取代在位置297处的Asn)，以及IgGl具有改变的pH依赖性FcRn结合。Fc区可包括整个铰链区，或少于整个铰链区。在另一实施方案中，Fc结构域可含有一个或多个降低与低亲和力抑制性Fc受体CD32B(FcyRIIB)的结合，并且保留与低亲和力活化性Fc受体CD16A(FcyRIIIA)的野生型结合水平或增强与低亲和力活化性Fc受体CD16A(FcyRIIIA)的结合的氨基酸插入、缺失或取代。
另一实施方案包括与FcR(Fc受体)的结合降低，此使它们的半衰期增加的IgG2-4杂合物和IgG4突变体。代表性IgG2-4杂合物和IgG4突变体描述于Angal,S.等,MolecularImmunology,30(1):105-108(1993)；Mueller,J.等,Molecular Immunology,34(6):441-452(1997)；以及属于Wang等人的美国专利号6,982,323中。在一些实施方案中，使IgGl和/或IgG2结构域缺失；例如Angal等Molecular Immunology,30(1):105-108(1993)描述丝氨酸241被脯氨酸替换的IgGl和IgG2。
在另一实施方案中，Fc结构域含有增强与CD 16 A的结合的氨基酸插入、缺失或取代。人IgGl的Fc结构域中使与CD16A的结合增加以及使与CD32B的结合降低的许多取代在本领域中是已知的，并且描述于Stavenhagen等,Cancer Res.,57(18):8882-90(2007)中。人IgGl Fc结构域的与CD32B的结合降低和/或与CD16A的结合增加的示例性变体含有F243L、R929P、Y300L、V305I或P296L取代。这些氨基酸取代可以任何组合存在于人IgGl Fc结构域中。
在一个实施方案中，人IgG1Fc结构域变体含有F243L、R929P和Y300L取代。在另一实施方案中，人IgGl Fc结构域变体含有F243L、R929P、Y300L、V305I和P296L取代。在另一实施方案中，人IgGl Fc结构域变体含有N297A/Q取代，因为这些突变消除FcyR结合。非限制性、说明性、示例性类型的突变描述于2006年2月16日公布的美国专利申请号20060034852中，所述美国专利申请据此以引用的方式并入本文，所述引用的程度就好像在本文中完全阐述一样。术语“Fc链”也任选包括任何类型的Fc片段。
已鉴定IgG子类中对于抗体恒定区介导的活性重要的若干特定氨基酸残基。因此，包括、取代或排除这些特定氨基酸允许包括或排除特定免疫球蛋白恒定区介导的活性。此外，特定变化可导致例如无糖基化和/或其它所需Fc链变化。可任选进行至少一些变化以阻断被视为不合需要的Fc功能，诸如不合需要的免疫系统作用，如以下更详细所述。
可进行以调节融合蛋白的活性的Fc突变的非限制性说明性实例包括以下变化(关于如根据Kabat EA等:Sequences of Proteins of Immunological Interest,USDepartment of Health and Human Services,NIH,(1991)，由Kabat给出的Fc序列命名法给出)：220C->S；233-238ELLGGP->EAEGAP；265D->A，优选与434N->A；297N->A(例如以阻断N-糖基化)；318-322EYKCK->AYACA；330-331AP->SS；或其组合进行组合(对于这些突变和它们的影响的描述，参见例如M.Clark,Chemical Immunol and Antibody Engineering,第1-31页)。特征在于以上变化的Fc链的构建体任选以及优选包含铰链区与Cm和Cm结构域的组合。
以上突变可任选被实施以增强所需性质，或者以阻断非所需性质。举例来说，显示抗体的无糖基化会维持所需结合功能性，同时阻断T细胞的消减或触发细胞因子释放，其可任选是非所需功能(参见M.Clark,Chemical Immunol and Antibody Engineering,第1-31页)。将331脯氨酸取代成丝氨酸可阻断使补体活化的能力，所述能力可任选被视为非所需功能(参见M.Clark,Chemical Immunol and Antibody Engineering,第1-31页)。在位置330处使丙氨酸变为丝氨酸与这个变化组合也可增强阻断使补体活化的能力的所需作用。
显示残基235和237涉及于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)中，以致如果ADCC被视为不合需要的功能，那么改变如所述的从233至238的残基段也可阻断所述活性。来自IgGl的Fc的残基220通常是半胱氨酸，其是重链与轻链形成共价连接所处的位点。任选地，可使这个残基变为另一氨基酸残基(例如丝氨酸)以避免任何类型的共价连接(参见M.Clark,Chemical Immunol and Antibody Engineering,第1-31页)，或通过缺失或截短来达成。
可任选实施以上残基265和434变化以降低或阻断与Fc受体的结合，此可任选阻断Fc的与它的免疫系统功能相关的非所需功能性(参见"Binding site on Human IgGl forFc Receptors",Shields等,第276卷,第6591-6604页,2001)。
以上变化仅意图作为对任选变化的说明，并且无论如何都不意图具有限制性。此外，仅出于描述目的而提供以上解释，而不希望受单一假设束缚。在另一实施方案中，融合蛋白包括VSIG8的细胞外结构域或融合于Ig Fc区的其片段。重组Ig VSIG8多肽、其片段或融合蛋白可通过使VSIG8的细胞外结构域或其片段的编码区融合于人IgGl或小鼠IgG2a的Fc区来制备，如先前所述(Chapoval等,Methods Mol.Med,45:247-255(2000))。
任选地，VSIG8ECD也指包含人VSIG8ECD的氨基酸序列融合于人免疫球蛋白Fc的融合蛋白。任选地，所述融合蛋白包含SEQ ID NO:1、2、3所示的人或非人VSIG8ECD的氨基酸序列或其片段。
在另一实施方案中，第二多肽可具有额外分子可通过其来结合于VSIG8融合蛋白的缀合结构域。在一个所述实施方案中，缀合的分子能够使融合蛋白靶向特定器官或组织；以下给出所述靶向性结构域和/或分子的其它特定、说明性、非限制性实例。
在另一所述实施方案中，缀合的分子是可增强或加强VSIG8融合蛋白的作用的另一免疫调节剂。在另一实施方案中，缀合的分子是聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含结合结构域，其中所述结合蛋白能够交联两个或更多个靶标。在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含另一结合部分，其中所述结合部分靶向肿瘤细胞、感染物例如病毒、细菌、支原体、真菌、酵母或寄生虫；或由此感染的细胞、免疫细胞或疾病部位。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含至少一种异源性多肽，其可为受体、激素、细胞因子、抗原、B细胞靶标、NK细胞靶标、T细胞靶标、TNF受体超家族成员、刺猬因子(Hedgehog)家族成员、受体酪氨酸激酶、蛋白聚糖相关的分子、TGF-β超家族成员、Wnt相关的分子、受体配体、树突细胞靶标、骨髓细胞靶标、单核细胞/巨噬细胞靶标或血管生成靶标。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含至少一种抗原，例如肿瘤抗原、自体抗原、过敏原或感染物抗原。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含选自由以下组成的组的T细胞靶标：2B4/SLAMF4、IL-2 Ra、4-1BB/TNFRSF9、IL-2R、ALCAM、B7-1/CD80、IL-4R、B7-H3、BLAME/SLAMF8、BTLA、IL-6R、CCR3、IL-7 Ra、CCR4、CXCRl/IL-8RA、CCR5、CCR6、IL-10Ra、CCR7、IL-10 R、CCR8、IL-12 R i、CCR9、IL-12 Rβ2、CD2、IL-13Ral、IL-13、CD3、CD4、ILT2/CD85j、ILT3/CD85k、ILT4/CD85d、ILT5/CD85a、整合素(Integrin)a 4/CD49d、CD5、整合素aE/CD103、CD6、整合素a M/CDl lb、CD8、整合素a X/CD 11c、整合素2/CD18、KIR/CD158、CD27/TNFRSF7、KIR2DL1、CD28、KIR2DL3、CD30/TNFRSF8、KIR2DL4/CD158d、CD31/PECAM-1、KIR2DS4、CD40配体/TNFSF5、LAG-3、CD43、LAIR1、CD45、LAIR2、CD83、白三烯B4 Rl、CD84/SLAMF5、NCAM-Ll、CD94、NKG2A、CD97、NKG2C、CD229/SL AMF3、NKG2D、CD2F-10/SLAMF9、NT-4、CD69、NTB-A/SLAMF6、共同γ链/IL-2 Ry、骨桥蛋白(Osteopontin)、CRACC/SLAMF7、PD-1、CRT AM、PSGL-1、CTLA-4、RANK/TNFRSF11A、CX3CR1、CX3CL1、L-选择素(L-Selectin)、CXCR3、SIRPCXCR4、SLAM、CXCR6、TCCRAVSX-1、DNAM-1、胸腺生成素(Thymopoietin)、细胞外金属蛋白酶诱导因子(EMMPRIN)/CD 147、TIM-1、EphB6、TIM-2、Fas/TNFRSF6、TIM-3、Fas配体/TNFSF6、TIM-4、Fey RIII/CD16、TIM-6、GITR/TNFRSF18、TNF Rl/TNFRSFIA、粒溶素(Granulysin)、TNF R11/TNFRSF1B、H VEM/TNFRSF 14、TRAIL R1/TNFRSF10A、ICAM-1/CD54、TRAIL R2/TNFRSF10B、ICAM-2/CD102、TRAIL R3/TNFRSF10C、IFN-yRl、TRAIL R4/TNFRSF10D、IFN-yR2、TSLP、IL-1 Rl和TSLP R。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含至少一种选自由以下组成的组的单核细胞/巨噬细胞细胞靶标：B7-1/CD80、ILT4/CD85d、B7-H1、ILT5/CD85a、共同β链、整合素a 4/CD49d、BLAME/SLAMF8、整合素a X/CD1lc、CCL6/C10、整合素β2/CD18、CD155/PVR、整合素β3/CD61、CD31/PECAM-1、Latexin、CD36/SR-B3、白三烯B4 Rl、CD40/TNFRSF5、LIMPII/SR-B2、CD43、LMIR1/CD300A、CD45、LMIR2/CD300c、CD68、LMIR3/CD300LF、CD84/SLAMF5、LMIR5/CD300LB、CD97、LMIR6/CD300LE、CD163、LRP-1、CD2F-10/SLAMF9、MARCO、CRACC/SLAMF7、MD-1、ECF-L、MD-2、细胞外金属蛋白酶诱导因子/CD 147、MGL2、内皮糖蛋白(Endoglin)/CD105、骨活素(Osteoactivin)/GPNMB、Fc yRl/CD64、骨桥蛋白、Fc y RIIB/CD32b、PD-L2、Fc yRIIC/CD32c、Siglec-3/CD33、Fey RIIA/CD32a、SIGNR1/CD209、Fey RIII/CD16、SLAM、GM-CSF R a、TCCR WSX-1、ICAM-2/CD102、TLR3、IFN-y Rl、TLR4、IFN-y R2、TREM-1、IL-1 RII、TREM-2、ILT2/CD85j、TREM-3、ILT3/CD85k、TREMLl/TLT-1、2B4/SLAMF4、IL-10R a、ALCAM、IL-10Rβ、氨基肽酶N/ANPEP、ILT2/CD85j、共同β链、ILT3/CD85k、Clq R1/CD93、ILT4/CD85d、CCR1、ILT5/CD85a、CCR2、整合素a 4/CD49d、CCR5、整合素a M/CD l ib、CCR8、整合素a X/CD 11c、CD155/PVR、整合素β2/CD18、CD14、整合素β3/CD61、CD36/SR-B3、LAIR1、CD43、LAIR2、CD45、白三烯B4 Rl、CD68、LIMPII/SR-B2、CD84/SLAMF5、LMIR1/CD300A、CD97、LMIR2/CD300c、CD163、LMIR3/CD300LF、凝血因子Ill/组织因子、LMIR5/CD300LB、CX3CR1、CX3CL1、LMIR6/CD300LE、CXCR4、LRP-1、CXCR6、M-CSF R、DEP-1/CD148、MD-1、DNAM-1、MD-2、细胞外金属蛋白酶诱导因子/CD 147、MMR、内皮糖蛋白/CD105、NCAM-L1、FcγR1/CD64、PSGL-1、Fc Y RIII/CD16、RP105、G-CSF R、L-选择素、GM-CSF R a、Siglec-3/CD33、H VEM/TNFRSF 14、SLAM、ICAM-1/CD54、TCCRAVSX-1、ICAM-2/CD102、TREM-1、IL-6 R、TREM-2、CXCRl/IL-8 RA、TREM-3和TREMLl/TLT-1。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含至少一种选自由以下组成的组的树突细胞靶标：CD36/SR-B3、LOX-1/SR-E1、CD68、MARCO、CD163、SR-AI/MSR、CD5L、SREC-I、CL-P 1/COLEC 12、SREC-II、LIMPII/SR-B2、RP105、TLR4、TLRl、TLR5、TLR2、TLR6、TLR3、TLR9、4-IBB配体/TNFSF9、IL-12/IL-23p40、4-氨基-l,8-萘二甲酰亚胺、ILT2/CD85j、CCL21/6Ckine、ILT3/CD85k、8-氧代-dG、ILT4/CD85d、8D6A、ILT5/CD85a、A2B5、整合素a 4/CD49d、Aag、整合素β2/CD18、AMICA、朗格素(Langerin)、B7-2/CD86、白三烯B4 Rl、B7-H3、LMIR1/CD300A、BLAME/SLAMF8、LMIR2/CD300c、Clq R1/CD93、LMIR3/CD300LF、CCR6、LMIR5/CD300LB、CCR7、LMIR6/CD300LE、CD40/TNFRSF5、MAG/Siglec-4a、CD43、MCAM、CD45、MD-1、CD68、MD-2、CD83、MDL-1/CLEC5A、CD84/SLAMF5、MMR、CD97、NCAM-L1、CD2F-10/SLAMF9、骨活素/GPNMB、Chem 23、PD-L2、CLEC-1、RP105、CLEC-2、Siglec-2/CD22、CRACC/SLAMF7、Siglec-3/CD33、DC-SIGN、Siglec-5、DC-SIGNR/CD299、Siglec-6、DCAR、Siglec-7、DCIR/CLEC4A、Siglec-9、DEC-205、Siglec-10、树突细胞C型凝集素-1(Dectin-1)/CLEC7A、Siglec-F、树突细胞C型凝集素-2/CLEC6A、SIGNR1/CD209、DEP-1/CD148、SIGNR4、DLEC、SLAM、细胞外金属蛋白酶诱导因子/CD 147、TCCR/WSX-1、FcγR1/CD64、TLR3、FcγRIIB/CD32b、TREM-1、Fc y RIIC/CD32c、TREM-2、Fcy RIIA/CD32a、TREM-3、FcγRIII/CD16、TREMLl/TLT-1、ICAM-2/CD102和类香草素Rl(Vanilloid Rl)。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含至少一种选自由以下组成的组的TNF受体超家族成员：4-1BB/TNFRSF9、NGF R/TNFRSF16、BAFF R/TNFRSF13C、骨保护素(Osteoprotegerin)/TNFRSFl lB、B CMA/TNFRSF 17、OX40/TNFRSF4、CD27/TNFRSF7、RANK/TNFRSF11 A、CD30/TNFRSF8、RELT/TNFRSF19L、CD40/TNFRSF5、T ACI/TNFRSF13B、DcR3/TNFRSF6B、TNF RI/TNFRSF1A、DcTRAIL R1/TNFRSF23、TNF RII/TNFRSF1B、DcTRAIL R2/TNFRSF22、TRAIL R1/TNFRSF10A、DR3/TNFRSF25、TRAIL R2/TNFRSF10B、DR6/TNFRSF21、TRAIL R3/TNFRSF10C、EDAR、TRAIL R4/TNFRSF 10D、Fas/TNFRSF6、TRO Y/TNFRSF19、GITR/TNFRSF18、TWEAK R/TNFRSF12、HVEM/TNFRSF14、XEDAR、淋巴细胞毒素(Lymphotoxin)βR/TNFRSF3、4-1BB配体/TNFSF9、淋巴细胞毒素、APRIL/TNFSF 13、淋巴细胞毒素/TNFSF3、BAFF/TNFSF13C、OX40配体/TNFSF4、CD27配体/TNFSF7、TL1A/TNFSF15、CD30配体/TNFSF8、TNF-a/TNFSFIA、CD40配体/TNFSF5、TNF-/TNFSFlB、EDA-A2、TRAIL/TNFSFIO、Fas配体/TNFSF6、TR ANCE/TNFSF 11、GITR配体/TNFSF18、TWEAK/TNFSFl 2和LIGHT/TNFSF14。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含至少一种选自由碎片蛋白(Patched)和润滑蛋白(Smoothened)组成的组的刺猬因子家族成员。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含至少一种选自由以下组成的组的受体酪氨酸激酶：Axl、FGF R4、Clq R1/CD93、FGF R5、DDR1、Flt-3、DDR2、HGF R、Dtk、IGF-I R、EGF R、IGF-II R、Eph、INSRR、EphAl、胰岛素R/CD220、EphA2、M-CSF R、EphA3、Mer、EphA4、MSP R/Ron、EphA5、MuSK、EphA6、PDGF R a、EphA7、PDGF Rβ、EphA8、Ret、EphBl、RORl、EphB2、ROR2、EphB3、SCF R/c-kit、EphB4、Tie-1、EphB6、Tie-2、ErbB2、TrkA、ErbB3、TrkB、ErbB4、TrkC、FGF Rl、VEGF Rl/Flt-1、FGF R2、VEGF R2/Flk-1、FGF R3和VEGFR3/Flt-4。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含至少一种选自由以下组成的组的转化生长因子(TGF)超家族成员：活化素RIA/ALK-2、GFR a-1、活化素RIB/ALK-4、GFR a2、活化素RHA、GFR a-3、活化素RUB、GFR a-4、ALK-1、MIS RII、ALK-7、Ret、BMPR-IA/ALK-3、TGF-βRl/ALK-5、BMPR-IB/ALK-6、TGF-βRII、BMPR-II、TGF-βRllb、内皮糖蛋白/CD 105和TGF-βRIII。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含至少一种选自由以下组成的组的Wnt相关的分子：卷曲蛋白-1(Frizzled-1)、卷曲蛋白-8、卷曲蛋白-2、卷曲蛋白-9、卷曲蛋白-3、sFRP-1、卷曲蛋白-4、sFRP-2、卷曲蛋白-5、sFRP-3、卷曲蛋白-6、sFRP-4、卷曲蛋白-7、MFRP、LRP 5、LRP 6、Wnt-1、Wnt-8a、Wnt-3a、Wnt-lOb、Wnt-4、Wnt-11、Wnt-5a、Wnt-9a和Wnt-7a。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含至少一种选自由以下组成的组的受体配体：4-1BB配体/TNFSF9、淋巴细胞毒素、APRIL/TNFSF 13、淋巴细胞毒素/TNFSF3、BAFF/TNFSF13C、OX40配体/TNFSF4、CD27配体/TNFSF7、TL1A/TNFSF15、CD30配体/TNFSF8、TNF-a/TNFSFIA、CD40配体/TNFSF5、TNF-β/TNFSF 1B、EDA-A2、TRAIL/TNFSF10、Fas配体/TNFSF6、RANCE/TNFSFl l、GITR配体/TNFSF18、TWEAK TNFSF12、LIGHT/TNFSF14、双调蛋白(Amphiregulin)、NRG1亚型GGF2、β细胞素(Betacellulin)、NRG1亚型SMDF、EGF、NRGl-a HRGl-a、上皮细胞有丝分裂蛋白(Epigen)、NRGl-βl/HRGl-β1、上皮调节蛋白(Epiregulin)、TGF-a、HB-EGF、TMEFFl/肿瘤调节蛋白-1(Tomoregulin-1)、神经调节蛋白-3(Neuregulin-3)、TMEFF2、IGF-I、IGF-II、胰岛素、活化素A、活化素B、活化素AB、活化素C、BMP-2、BMP-7、BMP-3、BMP-8、BMP-3b/GDF-10、BMP-9、BMP-4、BMP-15、BMP-5、生物皮肤生长因子(Decapentaplegic)、BMP-6、GDF-1、GDF-8、GDF-3、GDF-9、GDF-5、GDF-11、GDF-6、GDF-15、GDF-7、青蒿琥酯(Artemin)、神经秩蛋白(Neurturin)、GDNF、Persephin、TGF-β、TGF-β2、TGF-β1、TGF-β3、LAP(TGF-β1)、TGF-β5、潜活TGF-β1、潜活TGF-βbpl、TGF-β1.2、Lefty、Nodal、MIS/AMH、酸性FGF、FGF-12、碱性FGF、FGF-13、FGF-3、FGF-16、FGF-4、FGF-17、FGF-5、FGF-19、FGF-6、FGF-20、FGF-8、FGF-21、FGF-9、FGF-23、FGF-10、KGF/FGF-7、FGF-11、神经纤毛蛋白-1(Neuropilin-1)、P1GF、神经纤毛蛋白-2、P1GF-2、PDGF、PDGF-A、VEGF、PDGF-B、VEGF-B、PDGF-C、VEGF-C、PDGF-D、VEGF-D和PDGF-AB。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含至少一种选自由以下组成的组的肿瘤抗原：鳞状细胞癌抗原1(SCCA-1)、(蛋白T4-A)、鳞状细胞癌抗原2(SCCA-2)、卵巢癌抗原CA125(1A1-3B；KIAA0049)、粘蛋白1(MUCIN 1)(肿瘤相关的粘蛋白；癌相关的粘蛋白；多态性上皮粘蛋白；PEM；PEMT；上皮唾蛋白(EPISIALIN)；肿瘤相关的上皮膜抗原；EMA；H23AG；花生反应性尿粘蛋白；PUM；和乳腺癌瘤相关的抗原DF3)、CTCL肿瘤抗原sel-1、CTCL肿瘤抗原sel4-3、CTCL肿瘤抗原se20-4、CTCL肿瘤抗原se20-9、CTCL肿瘤抗原se33-l、CTCL肿瘤抗原se37-2、CTCL肿瘤抗原se57-l、CTCL肿瘤抗原se89-l、前列腺特异性膜抗原、5T4癌胚滋养层糖蛋白、Orf73卡波西氏肉瘤(Kaposi's sarcoma)相关的疱疹病毒、MAGE-C1(癌/睾丸抗原CT7)、MAGE-B 1抗原(MAGE-XP抗原；DAM10)、MAGE-B2抗原(DAM6)、MAGE-2抗原、MAGE-4a抗原、MAGE-4b抗原、结肠癌抗原NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12变体A、癌相关的表面抗原、腺癌抗原ART1、副赘生相关的脑-睾丸-癌抗原(肿瘤神经抗原MA2；副赘生神经元抗原)、神经肿瘤腹侧抗原2(NOVA2)、肝细胞癌抗原基因520、肿瘤相关的抗原CO-029、肿瘤相关的抗原MAGE-X2、滑膜肉瘤、X断裂点2、由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原、血清学确定的结肠癌抗原1、血清学确定的乳腺癌抗原NY-BR-15、血清学确定的乳腺癌抗原NY-BR-16、嗜铬粒蛋白A(Chromogranin A)、甲状旁腺分泌蛋白1、DUPAN-2、CA 19-9、CA 72-4、CA 195和L6。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含至少一种选自由以下组成的组的B细胞靶标：CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD38、CD39、CD40、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD78、CD79a/b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD89、CD98、CD126、CD127、CDwl30、CD138和CDwl50。
在某一实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含至少一种选自由以下组成的组的血管生成靶标：促血管生成素-1(Angiopoietin-1)、促血管生成素样2、促血管生成素-2、促血管生成素样3、促血管生成素-3、促血管生成素样7/CDT6、促血管生成素-4、Tie-1、促血管生成素样1、Tie-2、血管生成素、iNOS、凝血因子Ill/组织因子、nNOS、CTGF/CCN2、NOV/CCN3、DANCE、OSM、EDG-1、Plfr、EG-VEGF/PK1、增殖蛋白(Proliferin)、内皮抑素(Endostatin)、ROB 04、红血球生成素(Erythropoietin)、血栓反应素-1(Thrombospondin-1)、激肽抑制素(Kininostatin)、血栓反应素-2、MFG-E8、血栓反应素-4、一氧化氮、VG5Q、eNOS、EphAl、EphA5、EphA2、EphA6、EphA3、EphA7、EphA4、EphA8、EphBl、EphB4、EphB2、EphB6、EphB3、肝配蛋白-Al(Ephrin-Al)、肝配蛋白-A4、肝配蛋白-A2、肝配蛋白-A5、肝配蛋白-A3、肝配蛋白-B l、肝配蛋白-B3、肝配蛋白-B2、酸性FGF、FGF-12、碱性FGF、FGF-13、FGF-3、FGF-16、FGF-4、FGF-17、FGF-5、FGF-19、FGF-6、FGF-20、FGF-8、FGF-21、FGF-9、FGF-23、FGF-10、KGF/FGF-7、FGF-11、FGF Rl、FGF R4、FGF R2、FGF R5、FGF R3、神经纤毛蛋白-1、神经纤毛蛋白-2、信号素3A(Semaphorin 3A)、信号素6B、信号素3C、信号素6C、信号素3E、信号素6D、信号素6A、信号素7A、MMP、MMP-11、MMP-1、MMP-12、MMP-2、MMP-13、MMP-3、MMP-14、MMP-7、MMP-15、MMP-8、MMP-16/MT3-MMP、MMP-9、MMP-24/MT5-MMP、MMP-10、MMP-25/MT6-MMP、TIMP-1、TIMP-3、TIMP-2、TIMP-4、ACE、IL-13 R a 1、IL-13、Clq R1/CD93、整合素a 4/CD49d、VE-钙粘着蛋白(VE-Cadherin)、整合素β2/CD18、CD31/PECAM-1、KLF4、CD36/SR-B3、LYVE-1、CD151、MCAM、CL-P1/COLEC12、连接素-2(Nectin-2)/CD112、凝血因子Ill/组织因子、E-选择素、D6、P-选择素、DC-SIGNR/CD299、SLAM、细胞外金属蛋白酶诱导因子/CD147、Tie-2、内皮糖蛋白/CD105、TNF RI/TNFRSF1A、EPCR、TNF RII/TNFRSF1B、红血球生成素R、TRAIL R1/TNFRSF10A、ESAM、TRAIL R2/TNFRSF10B、FABP5、VCAM-1、ICAM-1/CD54、VEGFR2/Flk-1、ICAM-2/CD102、VEGF R3/Flt-4、IL-1 RI和VG5Q。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含根据本发明的VSIG8多肽和至少一种异源性多肽和/或结合部分或VSIG8多肽通过氨基酸间隔体彼此连接。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含VSIG8多肽和至少一种异源性多肽和/或结合部分或VSIG8多肽通过具有足够长度的氨基酸残基以使不同部分可成功结合它们的个别靶标的氨基酸间隔体彼此连接。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含2-10个任何本文公开的VSIG8 ECD多肽或其片段。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含一个或多个VSIG8多肽和至少一种异源性多肽，任选由异源性接头间插，所述接头任选包括不是VSIG8多肽的片段的多肽。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含接头，其是包含5-50个氨基酸残基，更优选5-25个氨基酸残基的肽。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含接头，其包含甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸残基，基本上由甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸残基组成。
在一些实施方案中，根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白将包含接头，其包含5-50、5-25、5-15、4-14、4-12个或更多个氨基酸残基，例如其可包括甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸残基或由甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸残基组成。
肽或多肽接头结构域
VSIG8融合蛋白任选可含有使VSIG8多肽与第二多肽分隔的肽或多肽接头结构域。本文描述所述接头结构域的各种非限制性实例。在一个实施方案中，接头结构域含有免疫球蛋白的铰链区。在另一实施方案中，铰链区源于人免疫球蛋白。铰链可源于的适合人免疫球蛋白包括IgG、IgD和IgA。在另一实施方案中，铰链区源于人IgG。免疫球蛋白铰链区和其它结构域的氨基酸序列在本领域中是熟知的。在另一实施方案中，接头结构域任选含有如上所述的免疫球蛋白的铰链区，并且进一步包括一个或多个额外免疫球蛋白结构域。
其它适合肽/多肽接头结构域任选包括天然存在或非天然存在的肽或多肽。肽接头序列的长度是至少2个氨基酸。任选地，肽或多肽结构域是柔性肽或多肽。“柔性接头”在本文中是指含有两个或更多个由肽键接合的氨基酸残基的肽或多肽，其对两个由此连接的多肽提供的旋转自由度比两个连接多肽将在不存在所述柔性接头下具有的旋转自由度增加。所述旋转自由度允许两个或更多个由柔性接头接合的抗原结合位点各自更高效接近靶标抗原。
示例性柔性肽/多肽包括但不限于氨基酸序列Gly-Ser、Gly-Ser-Gly-Ser、Ala-Ser、Gly-Gly-Gly-Ser、Gly4-Ser、(Gly4-Ser)2、(Gly4-Ser)3、(Gly4-Ser)4、[Gly4-Set]2Gly-Ala-Gly-Ser-Gly4-Ser Gly-(Gly4-Ser)2、Gly4-Ser-Gly、Gly-Ser-Gly2和Gly-Ser-Gly2-Ser。额外柔性肽/多肽序列在本领域中是熟知的。其它适合肽接头结构域任选包括TEV接头ENLYFQG，这是一种由烟草蚀刻病毒蛋白酶识别的线性表位。示例性肽/多肽包括但不限于GSENLYFQGSG和螺旋形成性接头诸如Ala-(Glu-Ala-Ala-Ala-Lys)n-Ala(n＝1-5)。额外螺旋形成性肽/多肽序列在本领域中是熟知的。在一些任选实施方案中，VSIG8片段例如ECD片段彼此连接(多聚体)，和/或一个或多个VSIG8片段例如ECD片段通过肽接头(优选是“柔性接头”序列)连接于异源性多肽诸如免疫球蛋白或其片段，尤其是免疫球蛋白重链或其片段。接头序列应允许VSIG8片段和异源性多肽诸如免疫球蛋白多肽或其结构域的有效定位以允许达成两个部分及其结构域的功能活性。成功递呈多肽融合物可调节细胞的活性以诱导或抑制T细胞增殖，或引发或抑制对特定部位的免疫应答。这可在诸如本文在以下公开的适当测定中确定，包括体外测定，其包括以下依序步骤：培养T细胞以使其增殖，以及使T细胞与根据本发明的融合多肽或表达所述融合多肽的细胞接触，接着评估所述融合多肽是否促进或抑制T细胞增殖。
如本文所用，短语“异源性多肽和VSIG8多肽的有效定位”或其它类似短语意指使这些部分的结构域定位以使VSIG8结构域和异源性多肽结构域能够与免疫或其它靶标细胞例如癌细胞或其它VSIG8表达性细胞相互作用以引发或抑制免疫反应，或抑制或刺激细胞发育。
关于VSIG8-Ig融合蛋白，接头序列也优选容许Fc结构域和VSIG8结构域的有效定位以允许达成各结构域的功能活性。在某些实施方案中，使Fc结构域有效定位以允许形成适当融合蛋白复合物和/或与免疫细胞上的Fc受体或补体系统的蛋白质相互作用来刺激Fc介导的作用包括调理作用、细胞溶解、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞的脱粒，以及其它Fc受体依赖性过程；补体路径的活化；和增强融合蛋白复合物的体内半衰期。
上文与根据本发明的融合蛋白关联来讨论接头序列。接头序列可任选用于连接生物活性多肽的两个或更多个VSIG8多肽以产生具有所需功能活性的单链分子。在一些优选实施方案中，接头序列包含约5至20个氨基酸，更优选约7或8至约16个氨基酸。接头序列优选是柔性的，以便不以单一非所需构象固持VSIG8多肽和与其连接的部分例如效应物分子。接头序列可例如用于使识别位点与融合的分子间隔。具体来说，肽接头序列可位于生物活性VSIG8多肽与效应物分子之间，例如以使其化学交联以及提供分子柔性。在一些实施方案中，接头将主要包含具有小侧链的氨基酸诸如甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸以提供柔性。优选地，接头序列的约80或90％或更多包含甘氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，特别是甘氨酸和丝氨酸残基。其它适合接头序列包括已成功用于将抗体可变区接合在一起的柔性接头设计，参见Whitlow,M.等,(1991)Methods:A Companion to Methods in Enzymology 2:97-105。在一些实例中，为使效应物分子共价连接于VSIG8分子，接头的氨基序列应能够跨越从VSIG8多肽的C末端残基至效应物分子的N末端残基的适合距离。可易于凭经验鉴定适合接头序列。另外，接头序列的适合尺寸和序列也可通过已知计算机建模技术基于融合多肽的预测尺寸和形状来确定。上文与根据本发明的融合蛋白关联来讨论其它接头序列。
任选地，如本文所述的多肽包含2-20个连接在一起的VSIG8ECD多肽片段。任选地，片段由异源性接头间插，所述接头任选包括不是VSIG8多肽的片段的多肽。
任选地，接头是包含5-50个氨基酸残基，更优选5-25个氨基酸残基的肽。任选地，接头包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：4-12个甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸残基。
二聚化、多聚化和靶向性结构域
本文公开的VSIG8融合蛋白任选含有起使两个或更多个融合蛋白二聚化、寡聚化或多聚化作用的二聚化或多聚化或寡聚化结构域，所述融合蛋白可相同或不同(异多聚体或同多聚体)。举例来说，VSIG8融合蛋白可连接于另一VSIG8融合蛋白或另一部分例如另一共刺激融合蛋白。使融合蛋白二聚化或多聚化的作用的结构域可为单独结构域，或者可含于融合蛋白的一个其它结构域(VSIG8多肽、第二多肽或肽/多肽接头结构域)内。
二聚化或多聚化可通过二聚化或多聚化结构域来发生在两个或更多个融合蛋白之间。或者，融合蛋白的二聚化或多聚化可通过化学交联来发生。形成的二聚体或多聚体可为同二聚/同多聚或异二聚/异多聚。VSIG8融合多肽中的第二多肽“配偶体”可包括一种或多种如本文所述的其它蛋白质、蛋白质片段或肽，包括但不限于任何免疫球蛋白(Ig)或其部分(优选是Fc区)，或诸如乳头状瘤病毒E7基因产物、黑素瘤相关抗原p97和HIV包膜蛋白(gpl20)的生物或化学活性蛋白质的一部分。任选选择“配偶体”以提供可溶性二聚体/多聚体和/或一种或多种如本文所述的其它生物活性。
“二聚化结构域”通过至少两个氨基酸残基或至少两个肽或多肽(其可具有相同或不同氨基酸序列)的缔合来形成。肽或多肽可通过共价和/或非共价缔合来彼此相互作用。任选二聚化结构域含有至少一个能够与配偶体融合蛋白上的半胱氨酸形成分子间二硫键的半胱氨酸。二聚化结构域可含有一个或多个半胱氨酸残基以使可在配偶体融合蛋白之间形成二硫键。在一个实施方案中，二聚化结构域含有一个、两个或三个至约十个半胱氨酸残基。在另一实施方案中，二聚化结构域是免疫球蛋白的铰链区。
额外示例性二聚化结构域可为本领域中已知的任何二聚化结构域，并且包括但不限于卷曲螺旋、酸片块、锌指、钙手、CHl-CL对、如美国专利号5,821,333中所述的具有工程改造的“钮”和/或“突起”的“界面”、亮氨酸拉链(例如来自jun和/或fos)(美国专利号5,932,448)、和/或酵母转录活化子GCN4、SH2(src同源结构域2)、SH3(src同源结构域3)(Vidal等,Biochemistry,43,7336-44((2004))、磷酸酪氨酸结合(PTB)结构域(Zhou等,Nature,378:584-592(1995))、WW(Sudol,Prog.Biochys.Mol Biol.,65:113-132(1996))、PDZ(Kim等,Nature,378:85-88(1995)；Komau等,Science,269.1737-1740(1995))、14-3-3、WD40(Hu5等,/Biol Chem.,273:33489-33494(1998))、EH、Lim、“异亮氨酸拉链”、受体二聚体对(例如白介素-8受体(IL-8R)；和整合素异二聚体诸如LFA-I和GPIIIb/IIIa)或其二聚化区域、二聚配体多肽(例如神经生长因子(NGF)、神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3))、白介素-8(IL-8)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、PDGF成员和脑源性神经营养因子(BDNF)(Arakawa等,J Biol.Chem.,269(45):27833-27839(1994)以及Radziejewski等,Biochem.,32(48):1350(1993))，并且也可为这些结构域的其中亲和力被改变的变体。各对多肽可通过本领域中已知的方法来鉴定，所述方法包括酵母双杂交筛选。酵母双杂交筛选描述于美国专利号5,283,173和6,562,576中。可使用本领域中已知的方法来确定一对相互作用性结构域之间的亲和力，所述方法包括如Katahira等,/.Biol Chem,277,9242-9246(2002))中所述的方法。或者，可例如使用WO 01/00814中所述的方法针对异二聚化来筛选肽序列文库。用于确定蛋白质-蛋白质相互作用的方法也描述于美国专利号6,790,624中。
本文提及的“多聚化结构域”或“寡聚化结构域”是导致三个或更多个肽或多肽通过共价和/或非共价缔合来彼此相互作用的结构域。适合多聚化或寡聚化结构域包括但不限于卷曲螺旋结构域。卷曲螺旋是具有主要是疏水性的残基(间隔3和4个残基)的连续样式的肽序列，通常呈具有7个氨基酸(七联体重复)或11个氨基酸(十一联体重复)的序列形式，其装配(折叠)以形成多聚螺旋束。也涵盖具有包括3和4残基间隔的某一不规则分布的序列的卷曲螺旋。疏水性残基特别是疏水性氨基酸Val、He、Leu、Met、Tyr、Phe和Trp。“主要是疏水性的”意指至少50％的残基必须选自提及的疏水性氨基酸。
卷曲螺旋结构域可源于层粘连蛋白。在细胞外间隙中，异三聚卷曲螺旋蛋白质层粘连蛋白在基底膜的形成方面起重要作用。显然，多功能寡聚结构为层粘连蛋白功能所需。卷曲螺旋结构域也可源于血栓反应素，其中三个(TSP-I和TSP-2)或五个(TSP-3、TSP-4和TSP-5)链被连接，或源于COMP(COMPcc)(Guo等,EMBO J,1998,17:5265-5272)，其折叠成平行五链卷曲螺旋(Malashkevich等,Science,274:761-765(1996))。源于其它蛋白质的卷曲螺旋结构域以及介导多肽多聚化的其它结构域的额外非限制性实例在本领域中是已知的，诸如血管舒张剂刺激的磷蛋白质(VASP)结构域、基质素-1(CMP)、病毒融合肽、可溶性NSF(N-乙基顺丁烯二酰亚胺敏感因子)连接蛋白受体(SNARE)复合物、富含亮氨酸的重复、某些tRNA合成酶适用于所公开融合蛋白中。
在另一实施方案中，可通过与第二多价多肽诸如抗体结合来诱导VSIG8多肽、其融合蛋白或片段以形成多聚体。适用于使VSIG8多肽、其融合蛋白或片段多聚化的抗体包括但不限于IgM抗体和交联多价IgG、IgA、IgD或IgE复合物。
二聚化或多聚化可通过二聚化或多聚化结构域(包括上述那些)来发生在两个或更多个融合蛋白之间。或者，融合蛋白的二聚化或多聚化可通过化学交联来发生。融合蛋白二聚体可为同二聚体或异二聚体。融合蛋白多聚体可为同多聚体或异多聚体。
如本文公开的融合蛋白二聚体具有式II：
N-R1-R2-R3-C
N-R4-R5-R6-C，或替代地，具有式III：
N-R1-R2-R3-C
C-R4-R5-R6-N，其中由式II提供的二聚体的融合蛋白被定义为呈平行定向，并且由式III提供的二聚体的融合蛋白被定义为呈反平行定向。平行二聚体和反平行二聚体也分别被称为顺式二聚体和反式二聚体。“N”和“C”分别代表融合蛋白的N末端和C末端。融合蛋白组分“Rl”、“R2”和“R3”如上关于式I所定义。关于式II与式III两者，“R4”是VSIG8多肽或第二多肽，“R5”是任选肽/多肽接头结构域，并且“R6”是VSIG8多肽或第二多肽，其中当“R4”是第二多肽时“R6”是VSIG8多肽，并且当“R4”是VSIG8多肽时“R6”是第二多肽。在一个实施方案中，“Rl”是VSIG8多肽，“R4”也是VSIG8多肽，并且“R3”与“R6”两者均是第二多肽。
当“Rl”＝“R4”，“R2”＝“R5”，并且“R3”＝“R6”时，式II融合蛋白二聚体被定义为同二聚体。类似地，当“Rl”＝“R6”，“R2”＝“R5”，并且“R3”＝“R4”时，式III融合蛋白二聚体被定义为同二聚体。当这些条件由于任何原因而未被满足时，融合蛋白二聚体被定义为异二聚体。举例来说，异二聚体可含有满足这些条件的结构域定向(即对于根据式II的二聚体，“Rl”与“R4”两者均是VSIG8多肽，“R2”与“R5”两者均是肽/多肽接头结构域，并且“R3”与“R6”两者均是第二多肽)，然而，这些结构域中的一个或多个的种类不相同。举例来说，尽管“R3”与“R6”可均为VSIG8多肽，但一个多肽可含有野生型VSIG8氨基酸序列，而另一多肽可为变异VSIG8多肽。一示例性变异VSIG8多肽是已被修饰以具有增加或降低的与靶标细胞的结合，增加的对免疫细胞的活性，增加或降低的半衰期或稳定性的VSIG8多肽。含有免疫球蛋白的CHI区或CL区作为多肽接头结构域的部分的融合蛋白的二聚体优选形成异二聚体，其中二聚体的一个融合蛋白含有CHI区，并且二聚体的另一融合蛋白含有CL区。
融合蛋白也可用于形成多聚体。如同二聚体一样，多聚体可为平行多聚体，其中多聚体的所有融合蛋白都关于它们的N末端和C末端以相同定向对齐。多聚体可为反平行多聚体，其中多聚体的融合蛋白替代地关于它们的N末端和C末端以相反定向对齐。多聚体(平行或反平行)可为同多聚体或异多聚体。融合蛋白任选以二聚形式产生；更优选地，如下所述在遗传水平上进行融合，此通过接合对应于两个(或更多个)蛋白质、蛋白质的各部分和/或肽的多核苷酸序列，以使接合或融合的蛋白质由细胞根据接合的多核苷酸序列来产生。对制备所述融合蛋白的描述关于属于Linsley等人的美国专利号5,851,795来描述，所述专利据此以引用的方式并入本文，所述引用的程度就好像仅作为非限制性实例在本文中完全阐述一样。
靶向性结构域
VSIG8多肽和融合蛋白可含有靶向性结构域以使分子靶向体内特定部位。任选靶向性结构域使分子靶向炎症区域。示例性靶向性结构域是对发炎组织或包括但不限于以下的促炎性细胞因子具有特异性的抗体或其抗原结合片段：IL17、IL-4、IL-6、IL-12、IL-21、IL-22、IL-23、MIF、TNF-a和TNF-β及其组合。在神经病症诸如多发性硬化症的情况下，靶向性结构域可使分子靶向CNS，或可结合血管上皮上的VCAM-I。额外靶向性结构域可为对促炎性分子具有特异性的肽适体。在其它实施方案中，VSIG8融合蛋白可包括对在免疫细胞例如T细胞的表面上展示的多肽具有特异性的结合配偶体。在其它实施方案中，靶向性结构域特异性靶向活化的免疫细胞。所靶向的任选免疫细胞包括Th0、Th1、Th17、Th2和Th22T细胞、分泌或导致其它细胞分泌包括但不限于IL-lβ、TNF-a、TGF-β、IFN-y、IL-17、IL-6、IL-23、IL-22、IL-21和MMP的炎症性分子的其它细胞以及Treg。举例来说，针对Treg的靶向性结构域可特异性结合CD25。
上文与根据本发明的示例性融合蛋白的合成关联来讨论任选可连接或含有在根据本发明的VSIG8多肽或融合蛋白内的其它靶向性部分或异源性多肽。
以上变化仅意图作为对任选变化的说明，并且无论如何都不意图具有限制性。此外，仅出于描述目的而提供以上解释，而不希望受单一假设束缚。
添加基团
如果根据本发明的蛋白质是线性分子，那么有可能在所述线性分子上易经受或适于化学修饰的各个点处放置各种官能团。官能团可被添加至根据本发明的至少一些实施方案的蛋白质的线性形式的末端。在一些实施方案中，官能团关于一种或多种特征来改进蛋白质的活性，包括但不限于改进稳定性、渗透(穿过细胞膜和/或组织屏障)、组织定位、功效、降低清除率、降低毒性、改进选择性、改进对由细胞泵进行的排出的抗性等。为了方便起见并且不希望具有限制性，根据本发明的至少一些实施方案的组合物中含有的一个序列的游离N末端将被称为组合物的N末端，并且序列的游离C末端将被视为组合物的C末端。可使序列的C末端或N末端或两者分别连接于羧酸官能团或胺官能团。
适合官能团的非限制性实例描述于Green和Wuts,"Protecting Groups inOrganic Synthesis",John Wiley and Sons,第5和7章,(1991)中，其教义以引用的方式并入本文。优选保护基是有助于通过降低活性成分的亲水性以及增加亲脂性来将与其连接的活性成分转运至细胞中的那些，这些是“用于达成跨越细胞膜进行转运的部分”的实例。
这些部分可任选以及优选在体内通过在细胞内部水解或以酶促方式被裂解。(Ditter等,/.Pharm Sci.57:783
(1968)；Ditter等,J.Pharm.Sci.57:828(1968)；Ditter等,/.Pharm.Sci.58:557(1969)；King等,Biochemistry 26:2294(1987)；Lindberg等,Drug Metabolism andDisposition 17:311(1989)；以及Tunek等,Biochem.Pharm.37:3867(1988)，Anderson等,Arch.Biochem.Biophys.239:538(1985)和Singhal等,FASEB J.1:220(1987))。羟基保护基包括酯、碳酸酯和氨基甲酸酯保护基。胺保护基包括烷氧基和芳基氧基羰基，如上对于N末端保护基所述。羧酸保护基包括脂族酯、苯甲基酯和芳基酯，如上对于C末端保护基所述。在一个实施方案中，优选以甲酯、乙酯、苯甲酯或取代的苯甲酯，更优选以苯甲酯形式保护本发明组合物中一个或多个谷氨酸或天冬氨酸残基的侧链中的羧酸基团。
N末端保护基的非限制性说明性实例包括酰基(-CO-R1)和烷氧基羰基或芳基氧基羰基(-CO-0-R1)，其中Rl是脂族基团、取代的脂族基团、苯甲基、取代的苯甲基、芳族基团或取代的芳族基团。酰基的特定实例包括但不限于乙酰基、(乙基)-CO-、正丙基-CO-、异丙基-CO-、正丁基-CO-、仲丁基-CO-、叔丁基-CO-、己基、月桂酰基、棕榈酰基、肉豆蔻酰基、硬脂酰基、油酰基、苯基-CO-、取代的苯基-CO-、苯甲基-CO-和(取代的苯甲基)-CO-。烷氧基羰基和芳基氧基羰基的实例包括CH3-0-CO-、(乙基)-O-CO-、正丙基-O-CO、异丙基-O-CO、正丁基-O-CO、仲丁基-O-CO、叔丁基-O-CO、苯基-O-CO-、取代的苯基-O-CO-和苯甲基-O-CO-、(取代的苯甲基)-0-CO-、金刚烷、萘、肉豆蔻油酸基、甲苯、联苯、肉桂酰基、硝基苯甲酰基、甲苯甲酰基、糠酰基、苯甲酰基、环己烷、降冰片烷或Z-己酸。为有助于N-酰化，1至4个甘氨酸残基可存在于分子的N末端中。
在化合物的C末端的羧基可例如用包括但不限于以下的基团保护：酰胺(即在C末端的羟基被-NH2、-NHR2和-NR2R3替换)或酯(即在C末端的羟基被-OR2替换)。R2和R3任选独立地是脂族基团、取代的脂族基团、苯甲基、取代的苯甲基、芳基或取代的芳基。此外，连同氮原子一起，R2和R3可任选形成具有约0-2个额外杂原子诸如氮、氧或硫的C4至C8杂环。适合杂环的非限制性适合实例包括哌啶基、吡咯烷基、吗啉代基、硫代吗啉代基或哌嗪基。C末端保护基的实例包括但不限于-NH2、-NHCH3、-N(CH3)2、-NH(乙基)、-N(乙基)2、-N(甲基)(乙基)、-NH(苯甲基)、-N(C1-C4烷基)(苯甲基)、-NH(苯基)、-N(C1-C4烷基)(苯基)、-OCH3-O-(乙基)、-O-(正丙基)、-O-(正丁基)、-O-(异丙基)、-0-(仲丁基)、-0-(叔丁基)、-O-苯甲基和-O-苯基。
用肽模拟部分取代
“肽模拟有机部分”可任选取代本发明的组合物中的氨基酸残基，作为保守性取代和作为非保守性取代。这些部分也被称为“非天然氨基酸”，并且可任选替换氨基酸残基、氨基酸，或充当肽内替代所缺失氨基酸的间隔基团。肽模拟有机部分任选以及优选具有与所替换氨基酸类似的立体、电子或构型性质，并且所述肽模拟物用于替换必要位置中的氨基酸，并且被视为保守性取代。然而，所述类似性未必被要求。根据本发明的优选实施方案，选择一个或多个肽模拟物以使组合物相较于根据本发明的天然蛋白质，至少大致上保留它的生理活性。
肽模拟物可任选用于抑制肽通过酶促过程或其它降解过程而降解。肽模拟物可任选以及优选通过有机合成技术来产生。适合肽模拟物的非限制性实例包括相应L氨基酸的D氨基酸、四唑(Zabrocki等,/.Am.Chem.Soc.110:5875-5880(1988))；酰胺键的电子等排体(Jones等,Tetrahedron Lett.29:3853-3856(1988))；LL-3-氨基-2-丙二酮-6-甲酸(LL-Acp)(Kemp等,J.Org.Chem.50:5834-5838(1985))。类似的类似物显示于Kemp等,Tetrahedron Lett.29:5081-5082(1988)以及Kemp等,Tetrahedron Lett.29:5057-5060(1988)，Kemp等,Tetrahedron Lett.29:4935-4938(1988)和Kemp等,/.Org.Chem.54:109-115(1987)中。其它适合但为示例性的肽模拟物显示于Nagai和Sato,TetrahedronLett.26:647-650(1985)；Di Maio等,/.Chem.Soc.Perkin Trans.,1687(1985)；Kahn等,Tetrahedron Lett.30:2317(1989)；Olson等,/.Am.Chem.Soc.112:323-333(1990)；以及Garvey等,J.Org.Chem.56:436(1990)中。其它适合示例性肽模拟物包括羟基-1,2,3,4-四氢异喹啉-3-甲酸酯(Miyake等,/.Takeda Res.Labs 43:53-76(1989))；1,2,3,4-四氢-异喹啉-3-甲酸酯(Kazmierski等,/.Am.Chem.Soc.133:2275-2283(1991))；组氨酸异喹啉酮甲酸(HIC)(Zechel等,Int.J.Pep.Protein Res.43(1991))；(2S,S)-甲基-苯丙氨酸、(2S,3R)-甲基-苯丙氨酸、(2R,3S)-甲基-苯丙氨酸和(2R,3R)-甲基-苯丙氨酸(Kazmierski和Hruby,Tetrahedron Lett.(1991))。
示例性、说明性但为非限制性的非天然氨基酸包括β-氨基酸(β3和β2)、高氨基酸、环状氨基酸、芳族氨基酸、Pro和Pyr衍生物、3-取代的丙氨酸衍生物、甘氨酸衍生物、环取代的Phe和Tyr衍生物、线性核心氨基酸或二氨基酸。它们可从多个供应商诸如Sigma-Aldrich(USA)获得。
蛋白质化学修饰
在本发明中，根据至少一些实施方案，根据本发明的至少一些实施方案的蛋白质的任何部分都可任选被化学修饰，即通过添加官能团来改变。举例来说，出现在天然序列中的侧边氨基酸残基可任选被修饰，但如下所述，或者，除侧边氨基酸残基之外或替代侧边氨基酸残基，蛋白质的其它部分可任选被修饰。如果遵循化学合成方法，那么可任选在分子的合成期间进行修饰，例如通过添加化学修饰的氨基酸。然而，也可能在氨基酸已存在于分子中时对它进行化学修饰(“原位”修饰)。
分子的任何序列区域的氨基酸都可任选根据任一以下示例性类型的修饰来修饰(在肽的情况下，在概念上视为“被化学修饰”)。非限制性示例性类型的修饰包括羧甲基化、酰化、磷酸化、糖基化或脂肪酰化。醚键可任选用于使丝氨酸或苏氨酸羟基接合于糖的羟基。酰胺键可任选用于使谷氨酸或天冬氨酸羧基接合于糖上的氨基(Garg和Jeanloz,Advances in Carbohydrate Chemistry and Biochemistry,第43卷,Academic Press(1985)；Kunz,Ang.Chem.Int.Ed.English 26:294-308(1987))。缩醛键和缩酮键也可任选在氨基酸和碳水化合物之间形成。可任选例如通过使游离氨基(例如赖氨酸)酰化来制备脂肪酸酰基衍生物(Toth等,Peptides:Chemistry,Structure and Biology,Rivier和Marshal编,ESCOM Publ.,Leiden,1078-1079(1990))。
如本文所用，术语“化学修饰”在涉及根据本发明的蛋白质或肽时是指以下蛋白质或肽：其中它的至少一个氨基酸残基通过天然过程诸如加工或其它翻译后修饰，或通过本领域中熟知的化学修饰技术而被修饰。众多已知修饰的实例通常包括但不限于：乙酰化、酰化、酰胺化、ADP-核糖基化、糖基化、形成GPI锚、共价连接脂质或脂质衍生物、甲基化、肉豆蔻酰化、聚乙二醇化、异戊二烯化、磷酸化、泛素化或任何类似过程。
其它类型的修饰任选包括向生物分子诸如蛋白质中添加环烷部分，如据此以引用的方式并入本文的PCT申请号WO 2006/050262中所述，所述引用的程度就好像在本文中完全阐述一样。这些部分被设计以与生物分子一起使用，并且可任选用于对蛋白质赋予各种性质。
此外，任选地，蛋白质上任何点都可被修饰。举例来说，可任选对蛋白质上糖基化部分进行聚乙二醇化，如据此以引用的方式并入本文的PCT申请号WO 2006/050247中所述，所述引用的程度就好像在本文中完全阐述一样。可任选添加一个或多个聚乙二醇(PEG)基团至O连接的和/或N连接的糖基化。PEG基团可任选是分支的或线性的。任选地，可通过糖基接头来使任何类型的水溶性聚合物连接于蛋白质上的糖基化位点。
改变的糖基化
根据本发明的至少一些实施方案的蛋白质可被修饰以具有改变的糖基化样式(即从原始或天然糖基化样式改变)。如本文所用，“改变”意指一个或多个碳水化合物部分被缺失，和/或至少一个糖基化位点被添加至原始蛋白质中。蛋白质的糖基化通常是N连接的或O连接的。N连接是指碳水化物部分连接于天冬酰胺残基的侧链。其中X是除脯氨酸之外的任何氨基酸的三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸是碳水化物部分酶促连接于天冬酰胺侧链的识别序列。因此，多肽中存在这些三肽序列中的任一者都会产生潜在糖基化位点。O连接糖基化是指糖N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖中的一者连接于羟基氨基酸，最通常是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟基脯氨酸或5-羟基赖氨酸。
向根据本发明的至少一些实施方案的蛋白质中添加糖基化位点宜通过改变蛋白质的氨基酸序列以使它含有上述三肽序列中的一者或多者来实现(针对N连接的糖基化位点)。改变也可通过在原始蛋白质的序列中添加一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基或取代原始蛋白质的序列中的一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(针对O连接的糖基化位点)。也可通过在DNA水平上引入变化来改变蛋白质的氨基酸序列。
增加蛋白质上碳水化合物部分的数目的另一手段是通过使糖苷化学或酶促偶联于蛋白质的氨基酸残基来达成。视所用偶联模式而定，糖可连接于(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离硫氢基，诸如半胱氨酸的那些，(d)游离羟基，诸如丝氨酸、苏氨酸或羟基脯氨酸的那些，(e)芳族残基，诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基团。这些方法描述于WO 87/05330中以及Aplin和Wriston,CRC Crit.Rev.Biochem.,22:259-306(1981)中。
移除存在于根据本发明的至少一些实施方案的蛋白质上的任何碳水化合物部分都可以化学方式或以酶促方式实现。化学去糖基化需要蛋白质暴露于三氟甲烷磺酸或等效化合物。这个处理导致对除连接糖(N-乙酰基葡萄糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大多数或全部糖的裂解，同时保持氨基酸序列完整。
化学去糖基化由Hakimuddin等,Arch.Biochem.Biophys.,259:52(1987)；以及Edge等,Anal.Biochem.,118:131(1981)描述。酶促裂解蛋白质上碳水化合物部分可通过使用多种内切糖苷酶和外切糖苷酶来实现，如由Thotakura等,Meth.EnzymoL,138:350(1987)所述。
编码抗体的核酸分子
本发明进一步提供编码根据本发明的抗VSIG8抗体或其片段或缀合物的核酸。核酸可存在于完整细胞中，细胞溶解产物中，或呈部分纯化或大致上纯净形式。当通过标准技术(包括碱/SDS处理、CsCl分带、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳和本领域中熟知的其它技术)被纯化离开其它细胞组分或其它污染物例如其它细胞核酸或蛋白质时，核酸被“分离”或“致使大致上纯净”。参见F.Ausubel等人编(1987)Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing and Wiley Interscience,New York。根据本发明的至少一些实施方案的核酸可为例如DNA或RNA，并且可或可不含有内含子序列。在一优选实施方案中，核酸是cDNA分子。
可使用标准分子生物学技术来获得根据本发明的至少一些实施方案的核酸。对于由杂交瘤(例如如以下进一步所述，由携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体，可通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术来获得编码由杂交瘤制备的抗体的轻链和重链的cDNA。对于从免疫球蛋白基因文库获得(例如使用噬菌体展示技术)的抗体，可从文库回收编码抗体的核酸。
一旦获得编码VH区段和VL区段的DNA片段，即可进一步通过标准重组DNA技术来操作这些DNA片段，例如以使可变区基因转换成全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，使编码VL或VH的DNA片段操作性地连接于编码另一蛋白质诸如抗体恒定区或柔性接头的另一DNA片段。如先前所定义，“操作性地连接”意指使两个DNA片段接合以致由所述两个DNA片段编码的氨基酸序列保持同框。
可通过使编码VH的DNA操作性地连接于编码重链恒定区(CHI、CH2和CH3)的另一DNA分子来使编码VH区的经分离DNA转换成全长重链基因。人重链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat,E.A.等(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版号91-3242)，并且可通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。重链恒定区可为IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但最优选是IgGl、IgG2或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因，可使编码Vn的DNA操作性地连接于仅编码重链CHI恒定区的另一DNA分子。
可通过使编码VL的DNA操作性地连接于编码轻链恒定区CL的另一DNA分子来使编码VL区的经分离DNA转换成全长轻链基因(以及Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列在本领域中是已知的(参见例如Kabat,E.A.等(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH出版号91-3242)，并且可通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区域的DNA片段。轻链恒定区可为κ(kappa)或λ恒定区，但最优选是κ恒定区。
为产生scFv基因，使编码VR和VL的DNA片段操作性地连接于编码柔性接头例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3的另一片段，以使VH序列和VL序列可表达成连续单链蛋白质，其中VL区和VH区由所述柔性接头接合(参见例如Bird等(1988)Science 242:423-426；Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；McCafferty等,(1990)Nature 348:552-554)。
产生抗VSIG8单克隆抗体
可通过多种技术来产生根据本发明的抗VSIG8单克隆抗体(mAb)和抗原结合片段，所述技术包括常规单克隆抗体方法学，例如Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495的标准体细胞杂交技术。尽管体细胞杂交程序是优选的，但在原则上可采用用于产生单克隆抗体的其它技术，例如B淋巴细胞的病毒性或致癌性转化。
用于制备杂交瘤的一优选动物系统是鼠类系统。在小鼠中产生杂交瘤是一种极其明确建立的程序。用于分离供融合用的经免疫脾细胞的免疫方案和技术在本领域中是已知的。融合配偶体(例如鼠类骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。可基于如上所述制备的鼠类单克隆抗体的序列来制备本发明的嵌合或人源化抗体。可从目标鼠类杂交瘤获得编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA，并且使用标准分子生物学技术加以工程改造以含有非鼠类(例如人)免疫球蛋白序列。举例来说，为产生嵌合抗体，可使用本领域中已知的方法来使鼠类可变区连接于人恒定区(参见例如属于Cabilly等人的美国专利号4,816,567)。为产生人源化抗体，可使用本领域中已知的方法来将鼠类CDR区插入人框架中(参见例如属于Winter的美国专利号5,225,539以及属于Queen等人的美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
根据本发明的至少一些实施方案，抗体是人单克隆抗体。可使用携带人免疫系统而非小鼠系统的各部分的转基因或转染色体小鼠来产生针对VSIG8的所述人单克隆抗体。这些转基因和转染色体小鼠包括在本文中分别称为HuMAb MouseTM和KM MouseTM的小鼠，并且在本文中总称为“人Ig小鼠”。HuMAb MouseTM(Medarex Inc.)含有编码未重排的人重链μ和γ以及κ轻链免疫球蛋白序列以及使内源性μ和κ链基因座失活的靶向突变的人免疫球蛋白基因小型基因座(参见例如Lonberg等(1994)Nature 368(6474):856-859)。因此，所述小鼠展现小鼠IgM或κ的表达降低，以及应答于免疫，引入的人重链和轻链转基因经受类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgGκ单克隆(Lonberg,N.等(1994),上文；综述于Lonberg,N.(1994)Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101中；Lonberg,N.和Huszar,D.(1995)Intern.Rev.Immunol.13:65-93，以及Harding,F.和Lonberg,N.(1995)Ann.N.Y.Acad.Sci.764:536-546))。HuMab Mouse RTM.的制备和使用以及由所述小鼠携带的基因组修饰进一步描述于Taylor,L.等(1992)Nucleic Acids Research 20:6287-6295；Chen,J.等(1993)International Immunology 5:647-656；Tuaillon等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:3720-3724；Choi等(1993)Nature Genetics 4:117-123；Chen,J.等(1993)EMBO J.12:821-830；Tuaillon等(1994)J.Immunol.152:2912-2920；Taylor,L.等(1994)International Immunology 6:579-591；以及Fishwild,D.等(1996)Nature Biotechnology 14:845-851中，其全部的内容据此以引用的方式整体明确并入本文。进一步参见全都属于Lonberg和Kay的美国专利号5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；属于Surani等人的美国专利号5,545,807；全都属于Lonberg和Kay的PCT公布号WO 92/03918、WO93/12227、WO 94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884和WO 99/45962；以及属于Korman等人的PCT公布号WO 01/14424。
在另一实施方案中，可使用携带转基因和转染色体上的人免疫球蛋白序列的小鼠诸如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠来产生根据本发明的至少一些实施方案的人抗体。在本文中称为“KM miceTM”的所述小鼠详述于属于Ishida等人的PCT公布WO 02/43478中。
更进一步，表达人免疫球蛋白基因的替代性转基因动物系统在本领域中是可用的，并且可用于产生根据本发明的至少一些实施方案的抗VSIG8抗体。举例来说，可使用被称为Xenomouse(Abgenix,Inc.)的替代性转基因系统；所述小鼠例如描述于属于Kucherlapati等人的美国专利号5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963中。
此外，表达人免疫球蛋白基因的替代性转染色体动物系统在本领域中是可用的，并且可用于产生根据本发明的至少一些实施方案的抗VSIG8抗体。举例来说，可使用被称为“TC小鼠”的携带人重链转染色体与人轻链转染色体两者的小鼠；所述小鼠描述于Tomizuka等(2000)Proc.Natl.Acad Sci.USA 97:722-727中。此外，携带人重链和轻链转染色体的母牛已在本领域中被描述(Kuroiwa等(2002)Nature Biotechnology 20:889-894)，并且可用于产生根据本发明的至少一些实施方案的抗VSIG8抗体。
也可使用用于筛选人免疫球蛋白基因的文库的噬菌体展示方法来制备根据本发明的至少一些实施方案的人单克隆抗体。本领域中建立了用于分离人抗体的所述噬菌体展示方法。参见例如：属于Ladner等人的美国专利号5,223,409；5,403,484；和5,571,698；属于Dower等人的美国专利号5,427,908和5,580,717；属于McCafferty等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；以及属于Griffiths等人的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
也可使用已将人免疫细胞重构至其中以致在免疫后可产生人抗体应答的SCID小鼠来制备根据本发明的至少一些实施方案的人单克隆抗体。所述小鼠例如描述于属于Wilson等人的美国专利号5,476,996和5,698,767中。
人IG小鼠的免疫
在一些实施方案中，人Ig小鼠用于产生根据本发明的人抗VSIG8抗体，例如通过用纯化或富集的VSIG8抗原和/或重组VSIG8或VSIG8融合蛋白制剂使所述小鼠免疫，如由Lonberg,N.等(1994)Nature 368(6474):856-859；Fishwild,D.等(1996)NatureBiotechnology 14:845-851；以及PCT公布WO 98/24884和WO 01/14424所述。优选地，在首次输注时，小鼠将为6-16周龄。举例来说，纯化或重组VSIG8抗原制剂(5-50μg)可用于经腹膜内使人Ig小鼠免疫。
一般来说，当初始用含抗原的完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant)腹膜内(IP)免疫，随后用含抗原的不完全弗氏佐剂每隔一周IP免疫(直至总计6次)时，转基因小鼠起应答。然而，除弗氏佐剂以外的佐剂也被发现是有效的。此外，发现在不存在佐剂下的完整细胞具有高度免疫原性。可历经免疫方案的过程，用通过眶后放血来获得的血浆样品监测免疫应答。可通过ELISA(如下所述)来筛选血浆，并且具有足够抗VSIG8人免疫球蛋白效价的小鼠可用于融合。可在处死以及移除脾之前3天用抗原使小鼠经静脉内加强免疫。预期对于各免疫可需要进行2-3次融合。对于各抗原，通常使6只与24只之间的小鼠免疫。通常，使用HCo7品系与HCol2品系两者。此外，可将HCo7转基因与HCol2转基因两者一起育种，从而获得具有两种不同人重链转基因(HCo7/HCo 12)的单一小鼠。或者或另外，可使用KMMouseTM品系。
产生人单克隆抗体的杂交瘤的产生
在某些实施方案中，可使用脾细胞来产生杂交瘤，所述杂交瘤产生根据本发明的人单克隆抗VSIG8抗体，和/或可分离来自经免疫小鼠的淋巴结细胞，并且使其融合于适当永生化细胞系诸如小鼠骨髓瘤细胞系。可筛选产生抗原特异性抗体的所得杂交瘤。举例来说，可用50％PEG，使来自经免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞混悬液融合于六分之一数目的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)。将细胞在约2X105下涂铺在平底微量滴定板中，随后在含有20％胎克隆血清、18％“653”条件培养基、5％三甲氧唑辛(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mM HEPES、0.055mM 2-巯基乙醇、50单位/毫升青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素和IX HAT(Sigma；在融合之后24小时添加HAT)的选择性培养基中孵育两周。在约两周之后，可在其中用HT替换HAT的培养基中培养细胞。可接着通过ELISA来筛选个别孔中人单克隆IgM和IgG抗体。一旦发生广泛杂交瘤生长，即可通常在10-14天之后观察培养基。可再涂铺分泌抗体的杂交瘤，再次筛选，并且如果仍然是人IgG阳性，那么可通过有限稀释来进行至少两次单克隆抗体亚克隆。可接着在组织培养基中在体外培养稳定亚克隆以产生少量抗体用于表征。
为纯化人单克隆抗体，可使所选杂交瘤在2升旋转烧瓶中生长以进行单克隆抗体纯化。可将上清液过滤并浓缩，随后用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia,Piscataway,N.J.)进行亲和色谱法。可通过凝胶电泳和高效液相色谱法来检查洗脱的IgG以确保纯度。可将缓冲溶液交换成PBS，并且可使用1.43消光系数，通过OD280来确定浓度。可将单克隆抗体等分并储存在-80℃下。
产生单克隆抗体的转染瘤的产生
在某些实施方案中，可使用例如如本领域中熟知的重组DNA技术和基因转染方法的组合，在宿主细胞转染瘤中产生根据本发明的抗VSIG8抗体(例如Morrison,S.(1985)Science 229:1202)。
举例来说，为表达抗体或其抗体片段，可通过标准分子生物学技术(例如使用表达目标抗体的杂交瘤进行PCR扩增或cDNA克隆)来获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，并且可将DNA插入表达载体中以使基因操作性地连接于转录和翻译控制序列。在这个情形下，术语“操作性地连接”意指将抗体基因连接至载体中以使所述载体内的转录和翻译控制序列发挥它们调节所述抗体基因的转录和翻译的预定功能。选择表达载体和表达控制序列以可与所用表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入单独载体中，或更通常地，将两个基因插入同一表达载体中。通过标准方法(例如抗体基因片段和载体上的互补限制位点的连接，或如果不存在限制位点，那么所进行的钝性末端连接)来将抗体基因插入表达载体中。本文所述的抗体的轻链和重链可变区可用于通过以下方式来产生任何抗体同种型的全长抗体基因：将它们插入已编码所需同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体中以使VH区段操作性地连接于载体内的CH区段，并且VL区段操作性地连接于载体内的CL区段。另外或替代地，重组表达载体可编码有助于抗体链从宿主细胞分泌的信号肽。可将抗体链基因克隆至载体中以使信号肽同框连接于抗体链基因的氨基末端。信号肽可为免疫球蛋白信号肽或异源性信号肽(即来自非免疫球蛋白的信号肽)。
抗体与抗原结合的表征
在某些实施方案中，通过已知抗体结合测定技术诸如ELISA来测定根据本发明的抗VSIG8抗体的结合特异性。在示例性ELISA中，用纯化抗原(在本文中是于PBS中的0.25μg/ml VSIG8)涂布微量滴定板，接着用含5％牛血清白蛋白的PBS阻断。添加抗体的稀释液(例如来自经免疫小鼠的血浆的稀释液)至各孔中，并且在37℃下孵育1-2小时。将板用PBS/吐温(Tween)洗涤，接着与缀合于碱性磷酸酶的二级试剂(例如对于人抗体是山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂)一起在37℃下孵育1小时。在洗涤之后，用pNPP底物(1mg/ml)使板显色，并且以OD 405-650加以分析。优选地，产生最高效价的小鼠将用于融合。
如上所述的ELISA测定也可用于筛选显示与VSIG8免疫原的阳性反应性的杂交瘤。对以高亲合力结合VSIG8的杂交瘤进行亚克隆，并且进一步表征。可选择来自各杂交瘤的一个保留亲本细胞的反应性(根据ELISA)的克隆用于制备5-10小瓶细胞储库储存在-140℃下，以及用于抗体纯化。
为纯化抗VSIG8抗体，可使所选杂交瘤在2升旋转烧瓶中生长以进行单克隆抗体纯化。可将上清液过滤并浓缩，随后用蛋白A-琼脂糖(Pharmacia,Piscataway,N.J.)进行亲和色谱法。可通过凝胶电泳和高效液相色谱法来检查洗脱的IgG以确保纯度。可将缓冲溶液交换成PBS，并且可使用1.43消光系数，通过OD280来确定浓度。可将单克隆抗体等分并储存在-80℃下。
为确定所选抗VSIG8单克隆抗体是否结合独特表位，可使用可商购获得的试剂(Pierce,Rockford,111.)使各抗体生物素化。可如上所述使用VSIG8涂布的ELISA板进行使用未标记单克隆抗体和生物素化单克隆抗体的竞争研究。可用链霉素-抗生蛋白-碱性磷酸酶探针检测生物素化rnAb结合。
为确定纯化抗体的同种型，可使用对特定同种型的抗体具有特异性的试剂进行同种型ELISA。举例来说，为确定人单克隆抗体的同种型，可用^g/ml的抗人免疫球蛋白在4℃下将微量滴定板的各孔涂布过夜。在用1％BSA阻断之后，使板与1mug/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化同种型对照在环境温度下反应1至2小时。可接着使各孔与人IgGl或人IgM特异性碱性磷酸酶缀合探针反应。如上所述来使板显色并加以分析。
可通过蛋白质印迹(Western blotting)来进一步分别测试抗VSIG8人IgG与VSIG8抗原的反应性。简要来说，可制备VSIG8抗原，并且使其经受十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。
在电泳之后，将分离的抗原转移至硝化纤维素膜中，用10％胎牛血清阻断，并且用待测试的单克隆抗体探测。可使用抗人IgG碱性磷酸酶检测人IgG结合，并且用BCIP/NBT底物片(Sigma Chem.Co.,St.Louis,Mo.)显色。
替代性抗VSIG8骨架
在某些实施方案中，本发明涉及一种包含连接于一个或多个表位结合结构域的蛋白质骨架的抗原结合构建体。所述工程改造的蛋白质骨架通常通过以下方式来获得：以诱变集中在环区域或另外可容许表面区域处来设计随机文库；以及通过噬菌体展示或相关技术来选择针对给定靶标的变体。根据至少一些实施方案，本发明涉及替代性骨架，包括但不限于抗运载蛋白(anticalin)、DARPin、犰狳重复蛋白(Armadillo repeat protein)、蛋白A、载脂蛋白、纤维结合蛋白结构域、锚蛋白共有重复结构域、硫氧还蛋白、化学约束肽等。根据至少一些实施方案，本发明涉及作为治疗剂用于治疗癌症、自体免疫、感染性疾病、败血症，或用于抑制在基因疗法之后不合需要的免疫活化，以及用于体内诊断的替代性骨架。
根据至少一些实施方案，本发明进一步提供一种包含如本文所述的抗原结合构建体、药学上可接受的载体的药物组合物。
如本文所用的术语‘蛋白质骨架’包括但不限于可为四链或双链抗体，或可仅包含抗体的Fc区，或可包含一个或多个来自抗体的恒定区(所述恒定区可具有人或灵长类动物来源)，或可为人恒定区和灵长类动物恒定区的人工嵌合体的免疫球蛋白(Ig)骨架例如IgG骨架。除一个或多个恒定区之外，所述蛋白质骨架也可包含抗原结合位点，例如其中蛋白质骨架包含完全IgG。所述蛋白质骨架将能够连接于其它蛋白质结构域，例如具有抗原结合位点的蛋白质结构域，例如表位结合结构域或ScFv结构域。
“结构域”是具有独立于蛋白质的其余部分的三级结构的折叠蛋白质结构。通常，结构域负责蛋白质的分立功能性质，并且在许多情况下，可被添加、移除或转移至其它蛋白质中，而不损失蛋白质的其余部分和/或结构域的功能。“单一抗体可变结构域”是包含为抗体可变结构域所特有的序列的折叠多肽结构域。因此，它包括完整抗体可变结构域和例如其中一个或多个环已被不为抗体可变结构域所特有的序列替换的经修饰可变结构域，或已被截短或包含N末端或C末端延伸部分的抗体可变结构域，以及可变结构域的至少保留全长结构域的结合活性和特异性的折叠片段。
短语“免疫球蛋白单一可变结构域”是指独立于不同V区或结构域来特异性结合抗原或表位的抗体可变结构域(VR、VRH、VL)。免疫球蛋白单一可变结构域可以具有其它不同可变区或可变结构域的形式(例如同多聚体或异多聚体)存在，其中其它区域或结构域不为由单一免疫球蛋白可变结构域进行抗原结合所需(即其中免疫球蛋白单一可变结构域独立于额外可变结构域来结合抗原)。“结构域抗体”或“dAb”与如本文所用的能够结合抗原的“免疫球蛋白单一可变结构域”相同。免疫球蛋白单一可变结构域可为人抗体可变结构域，但也包括来自其它物种的单一抗体可变结构域，诸如啮齿动物(例如如WO 00/29004中所公开)、护士鲨和骆驼科动物V-HH dAb。骆驼科动物V-HH是源于产生天然缺乏轻链的重链抗体的物种的免疫球蛋白单一可变结构域多肽，所述物种包括骆驼、美洲驼、羊驼、单峰驼和原驼。可根据本领域中可用的标准技术来使所述V-HH结构域人源化，并且所述结构域仍然被视为根据本发明的“结构域抗体”。如本文所用，“VH”包括骆驼科动物V-HH结构域。NARV是另一类型的免疫球蛋白单一可变结构域，其在包括护士鲨的软骨鱼中被鉴定。这些结构域也称为新型抗原受体可变区(通常缩写成V(NAR)或NARV)。参见例如Mol.Immunol.44,656-665(2006)以及US20050043519A。
术语“表位结合结构域”是指独立于不同V区或结构域来特异性结合抗原或表位的结构域，这可为结构域抗体(dAb)例如人、骆驼科动物或鲨鱼免疫球蛋白单一可变结构域，或它可为是选自由以下组成的组的骨架的衍生物的结构域：CTLA-4载脂蛋白；蛋白A衍生分子诸如蛋白A的Z结构域(SpA)、A结构域热休克蛋白诸如GroEI和GroES；转铁蛋白(穿膜抗体)；锚蛋白重复蛋白肽适体；C型凝集素结构域(四连接素)；人&#947；-晶状体蛋白(crystallin)和人泛素(ubiquitin)(affilin)；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂的蝎毒素库尼茨(kunitz)型结构域；犰狳重复蛋白、硫氧还蛋白和纤维结合蛋白(纤维连接蛋白)；其已经受蛋白质工程改造以获得与除天然配体以外的配体的结合。
对应于抗体的CDR的环可用异源性序列替代以赋予不同结合性质，即Evibody。对于其它细节，参见Journal of Immunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。载脂蛋白是一个家族的细胞外蛋白质，其转运疏水性小分子诸如类固醇、胆汁三烯(bilin)、类视黄醇和脂质。它们具有在锥形结构的开口端具有许多环的刚性二级结构，所述环可被工程改造以结合不同靶标抗原。抗运载蛋白在大小方面介于160-180个氨基酸之间，并且源于载脂蛋白。对于其它细节，参见Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000)，US7250297B 1和US20070224633。亲和体是源于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A的骨架，其可被工程改造以结合抗原。结构域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。已通过表面残基的随机化来产生文库。对于其它细节，参见Protein Eng.Des.Sel.17,455-462(2004)以及EP1641818A1。亲合多聚体是源于A结构域骨架家族的多结构域蛋白质。约35个氨基酸的天然结构域采用确定二硫键合结构。通过改组由A结构域家族展现的天然变化来产生多样性。对于其它细节，参见Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)以及ExpertOpinion on
Investigational Drugs 16(6),909-917(2007年6月)。转铁蛋白是单体血清转运糖蛋白。转铁蛋白可通过在容许表面环中插入肽序列来工程改造以结合不同靶标抗原。工程改造的转铁蛋白骨架的实例包括穿膜抗体。对于其它细节，参见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。
经设计锚蛋白重复蛋白(DARPin)源于锚蛋白，其是一个家族的介导整合膜蛋白连接于细胞骨架的蛋白质。单一锚蛋白重复是由两个a螺旋；-P转角组成的33残基基序。它们可通过使各重复的第一a螺旋和β转角中的残基随机化来工程改造以结合不同靶标抗原。它们的结合界面可通过增加模块的数目来增加(一种亲和力成熟方法)。对于其它细节，参见J.Mol.Biol.332,489-503(2003)，PNAS 100(4),1700-1705(2003)以及J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)和US20040132028A1。
纤维结合蛋白是可被工程改造以结合抗原的骨架。纤维连接蛋白由III型人纤维结合蛋白(FN3)的15个重复单元的第10结构域的天然氨基酸序列的骨架组成。在P；-夹层结构的一端的三个环可被工程改造以使得纤维连接蛋白能够特异性识别目标治疗靶标。对于其它细节，参见Protein Eng.Des.Sel.18,435-444(2005)，US200801 39791，WO2005056764以及US6818418B 1。
肽适体是由恒定骨架蛋白质组成的组合识别分子，所述恒定骨架蛋白质通常是含有插入在活性位点处的受约束可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。对于其它细节，参见ExpertOpin.Biol.Ther.5:783-797(2005)。
微体源于长度是25-50个氨基酸，含有3-4个半胱氨酸桥的天然存在的微蛋白-微蛋白的实例包括KalataBI以及芋螺毒素(conotoxin)和打结素(knottin)。微蛋白具有可被工程改造以包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的总体折叠的环。对于工程改造的打结素结构域的其它细节，参见WO2008098796。
其它表位结合结构域包括已作为骨架用于工程改造不同靶标抗原结合性质的蛋白质，包括人β-晶状体蛋白和人泛素(affilin)、人蛋白酶抑制剂的库尼茨型结构域、Ras结合蛋白AF-6的PDZ结构域、蝎毒素(卡律布德蝎毒素(charybdo toxin))、C型凝集素结构域(四连接素)，其综述于来自Handbook of Therapeutic Antibodies(2007,由Stefan Dubel编著)的第7章-Non-Antibody Scaffolds以及Protein Science 15:14-27(2006)中。本发明的表位结合结构域可源于任何这些替代性蛋白质结构域。
缀合物或免疫缀合物
本发明涵盖用于免疫疗法中的VSIG8抗原的缀合物，其包含VSIG8抗原及其可溶性部分，包括其外结构域或部分或变体。举例来说，本发明涵盖缀合物，其中VSIG8抗原的ECD连接于免疫球蛋白或其片段。本发明涵盖所述缀合物用于促进或抑制VSIG8抗原活性诸如免疫刺激的用途，以及所述缀合物治疗本文所述的移植适应症、自体免疫适应症和癌症适应症的用途。
在另一方面，本发明的特征在于例如用于治疗癌症的抗体-药物缀合物(ADC)，其由抗体(或抗体片段诸如单链可变片段(scFv))连接于有效载荷药物(常具有细胞毒性)组成。抗体导致ADC结合靶标癌细胞。常常，ADC接着由细胞内化，并且药物被释放至细胞中。由于具有靶向性，所以副作用较低，并且产生较宽治疗窗。亲水性接头(例如PEG4Mal)帮助防止药物通过MDR(多重药物抗性)转运体被泵出抗性癌细胞。
在另一方面，本发明的特征在于免疫缀合物，其包含抗VSIG8抗体或其片段缀合于治疗剂诸如细胞毒素、药物(例如免疫抑制剂)或放射性毒素。所述缀合物在本文中被称为“免疫缀合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫缀合物被称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害(例如杀灭细胞)的任何试剂。实例包括泰素(taxol)、细胞松弛素B(cytochalasin B)、短杆菌肽D(gramicidin D)、溴化乙锭(ethidium bromide)、吐根碱(emetine)、丝裂霉素(mitomycin)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(tenoposide)、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、秋水仙碱(colchicin)、多柔比星(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、二羟基炭疽菌素二酮(dihydroxy anthracindione)、米托蒽醌(mitoxantrone)、米拉霉素(mithramycin)、放线菌素D(actinomycin D)、1-去氢睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质素(glucocorticoids)、普鲁卡因(procaine)、四卡因(tetracaine)、利多卡因(lidocaine)、普萘洛尔(propranolol)和嘌呤霉素(puromycin)及其类似物或同源物。治疗剂也包括例如抗代谢剂(antimetabolite)(例如甲氨蝶呤(methotrexate)、6-巯基嘌呤(6-mercaptopurine)、6-硫鸟嘌呤(6-thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)、达卡巴嗪(decarbazine))、烷化剂(例如二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、塞替派苯丁酸氮芥(thioepa chlorambucil)、美法仑(melphalan)、卡莫司汀(carmustine)(BSNU)和洛莫司汀(lomustine)(CCNU)、环磷酰胺(cyclothosphamide)、白消安(busulfan)、二溴甘露醇(dibromomannitol)、链脲佐菌素(streptozotocin)、丝裂霉素C(mitomycin C)和顺式二氯二胺铂(II)(DDP)顺铂)、蒽环霉素(anthracycline)(例如柔红霉素(先前称为道诺霉素)和多柔比星)、抗生素(例如更生霉素(dactinomycin)(先前称为放线菌素(actinomycin))、博莱霉素(bleomycin)、米拉霉素(mithramycin)和安曲霉素(anthramycin)(AMC))、以及抗有丝分裂剂(例如长春新碱和长春花碱)。
可缀合于根据本发明的至少一些实施方案的抗体的治疗性细胞毒素的其它优选实例包括倍癌霉素(duocarmycin)、卡奇霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)和澳瑞他汀(auristatin)及其衍生物。卡奇霉素抗体缀合物的一实例可商购获得(MylotargTMWyeth)。
可使用本领域中可用的接头技术来使细胞毒素缀合于根据本发明的至少一些实施方案的抗体。已用于使细胞毒素缀合于抗体的接头类型的实例包括但不限于腙、硫醚、酯、二硫醚和含肽接头。可选择例如易经受由于溶酶体区室内的低pH达成的裂解或易经受由蛋白酶裂解的接头，所述蛋白酶诸如优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶诸如组织蛋白酶(cathepsin)(例如组织蛋白酶B、C、D)。对于各种类型的细胞毒素、接头和用于使治疗剂缀合于抗体的方法的进一步讨论，也参见Saito,G.等(2003)Adv.Drug Deliv.Rev.55:199-215；Trail,P.A.等(2003)Cancer Immunol.Immunother.52:328-337；Payne,G.(2003)Cancer Cell 3:207-212；Allen,T.M.(2002)Nat.Rev.Cancer 2:750-763；Pastan,I.和Kreitman,R.J.(2002)Curr.Opin.Investig.Drugs 3:1089-1091；Senter,P.D.和Springer,C.J.(2001)Adv.Drug Deliv.Rev.53:247-264。
也可使本发明的抗体缀合于放射性同位素以产生细胞毒性放射性药物，也被称为放射免疫缀合物。可缀合于抗体以进行诊断或治疗使用的放射性同位素的实例包括但不限于碘131、铟111、钇90和镥177。本领域中建立了用于准备放射免疫缀合物的方法。放射免疫缀合物可商购获得，包括(BiogenlDEC)和(CorixaPharmaceuticals)，并且使用根据本发明的至少一些实施方案的抗体，类似方法可用于制备放射免疫缀合物。
根据本发明的至少一些实施方案的本文公开的抗体或VSIG8融合蛋白或缀合物可用于改进给定生物应答，并且药物部分不应解释为限于经典化学治疗剂。举例来说，药物部分可为具有所需生物活性的蛋白质或多肽。所述蛋白质可包括例如酶活性毒素或其活性片段，诸如相思子毒素(abrin)、篦麻毒素A(ricin A)、假单胞菌外毒素(pseudomonasexotoxin)或白喉毒素(diphtheria toxin)；蛋白质诸如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物应答调节剂诸如像淋巴因子(lymphokine)、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)或其它生长因子。
用于使所述治疗性部分缀合于抗体的技术是熟知的，参见例如Arnon等,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy",Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy,Reisfeld等(编),第243-56页(AlanR.Liss,Inc.1985)；Hellstrom等,"Antibodies For Drug Delivery",Controlled DrugDelivery(第2版),Robinson等(编),第623-53页(Marcel Dekker,Inc.1987)；Thorpe,"orCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy:A Review",MonoclonalAntibodies'84:Biological And Clinical Applications,Pinchera等(编),第475-506页(1985)；"Analysis,Results,And Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy",Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy,Baldwin等(编),第303-16页(Academic Press 1985)，以及Thorpe等,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-ToxinConjugates",Immunol.Rev.,62:119-58(1982)。
双特异性分子
根据至少一些实施方案，本发明也涵盖一种多特异性抗VSIG8抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在另一方面，本发明的特征在于根据本发明的至少一些实施方案的双特异性分子，其包含抗VSIG8抗体或其片段。根据本发明的至少一些实施方案的抗体或其抗原结合部分可被衍生或连接于另一功能性分子例如另一肽或蛋白质(例如另一抗体或针对受体的配体)以产生结合至少两个不同结合位点或靶标分子的双特异性分子。根据本发明的至少一些实施方案的抗体可实际上被衍生或连接于超过一个其它功能性分子以产生结合超过两个不同结合位点和/或靶标分子的多特异性分子；所述多特异性分子也意图由如本文所用的术语“双特异性分子”涵盖。为产生根据本发明的至少一些实施方案的双特异性分子，抗体可被功能连接(例如通过化学偶联、遗传融合、非共价缔合或以其它方式)于一个或多个其它结合分子，诸如另一抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，以使得产生双特异性分子。在某些实施方案中，双特异性抗体的一种结合特异性是针对VSIG8，并且另一结合特异性是针对任何其它抗原。在某些实施方案中，双特异性抗体可结合VSIG8的两个不同表位。双特异性抗体也可用于使细胞毒性剂定位于表达VSIG8的细胞。双特异性抗体可被制备成全长抗体或抗体片段。
根据本发明的至少一些实施方案的双特异性抗体是可同时结合两个具有不同结构的靶标的抗体。根据本发明的至少一些实施方案的双特异性抗体(bsAb)和双特异性抗体片段(bsFab)具有至少一个特异性结合B细胞抗原或表位的臂和至少一个特异性结合可靶向缀合物的其它臂。
根据至少一些实施方案，本发明也涵盖一种融合抗体蛋白质，其是重组产生的抗原结合分子，其中连接两个或更多个具有相同或不同特异性的不同单链抗体或抗体片段区段。可使用分子工程改造来产生多种双特异性融合抗体蛋白质。在一种形式中，双特异性融合抗体蛋白质是单价的，由例如具有针对一种抗原的单一结合位点的sent和具有针对第二抗原的单一结合位点的Fab片段组成。在另一形式中，双特异性融合抗体蛋白质是二价的，由例如具有两个针对一种抗原的结合位点的IgG和具有两个针对第二抗原的结合位点的两个scFv组成。
本发明也进一步涵盖具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程改造的抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如US 2006/0025576A1)和“双重作用性FAb”或“DAF”抗体，其包含结合VSIG8以及另一不同抗原的抗原结合位点(参见例如US 2008/0069820)。
因此，本发明包括双特异性分子，其包含至少一个针对VSIG8的第一结合特异性和针对第二靶标表位的第二结合特异性。根据本发明的至少一些实施方案，第二靶标表位是Fc受体例如人FcyRI(CD64)或人Fca受体(CD89)。因此，本发明包括能够分别结合FcyR、FcaR或FcsR表达性效应细胞(例如单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))与表达VSIG8的靶标细胞两者的双特异性分子。这些双特异性分子使VSIG8表达性细胞靶向效应细胞，并且触发Fc受体介导的效应细胞活性，诸如吞噬VSIG8表达性细胞、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放或产生超氧化物阴离子。
根据本发明的其中双特异性分子是多特异性的至少一些实施方案，除抗Fc结合特异性之外，分子也可进一步包括第三结合特异性。在一个实施方案中，第三结合特异性是抗增强因子(EF)部分，例如结合细胞毒性活性中涉及的表面蛋白质，并且由此增加针对靶标细胞的免疫应答的分子。
“抗增强因子部分”可为结合给定分子例如抗原或受体，并且由此导致结合决定簇对Fc受体或靶标细胞抗原的作用增强的抗体、功能性抗体片段或配体。“抗增强因子部分”可结合Fc受体或靶标细胞抗原。或者，抗增强因子部分可结合与第一和第二结合特异性所结合的实体不同的实体。举例来说，抗增强因子部分可结合细胞毒性T细胞(例如通过CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1或导致针对靶标细胞的免疫应答增加的其它免疫细胞)。
根据本发明的至少一些实施方案，双特异性分子包含至少一个抗体或其抗体片段(包括例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或单链Fv)作为结合特异性。抗体也可为轻链或重链二聚体或其任何最小片段诸如Fv或单链构建体，如Ladner等美国专利号4,946,778中所述，所述专利的内容以引用的方式明确并入本文。
在一个实施方案中，针对Fey受体的结合特异性由单克隆抗体提供，所述单克隆抗体的结合不由人免疫球蛋白G(IgG)阻断。如本文所用，术语“IgG受体”是指位于染色体1上的8个γ链基因中的任一个。这些基因编码总计12个跨膜或可溶性受体亚型，其被分组成3个Fey受体类别：FcyRI(CD64)、FcyRII(CD32)和FcyRIII(CD16)。在一个优选实施方案中，Fcy受体是人高亲和力FcyRI。人FcyRI是72kDa分子，其显示对单体IgG的高亲和力。某些优选抗Fc y单克隆抗体的产生和表征由Fanger等人在PCT公布WO 88/00052中以及在美国专利号4,954,617中描述，所述专利的教义以引用的方式完全并入本文。这些抗体结合FcyRI，FcyRII或FcyRIII的在与受体的Fey结合位点不同的位点处的表位，并且因此，它们的结合不由生理水平的IgG实质上阻断。用于本发明中的特定抗FcyRI抗体是mAb 22、mAb 32、mAb44、mAb 62和mAb 197。产生mAb 32的杂交瘤可从美国典型培养物保藏中心(American TypeCulture Collection)获得(ATCC登记号HB9469)。在其它实施方案中，抗Fey受体抗体是人源化形式的单克隆抗体22(H22)。H22抗体的产生和表征描述于Graziano,R.F.等(1995)J.Immunol.155(10):4996-5002以及PCT公布WO 94/10332中。H22抗体产生性细胞系以标号HA022CLI寄存在美国典型培养物保藏中心处，并且具有登记号CRL 11177。
在其它优选实施方案中，针对Fc受体的结合特异性由结合人IgA受体例如Fc-a受体(FcαRI(CD89))的抗体提供，所述抗体的结合优选不由人免疫球蛋白A(IgA)阻断。术语“IgA受体”意图包括位于染色体19上的一个a-基因(FcαRI)的基因产物。已知这个基因编码55至10kDa的若干选择性剪接跨膜亚型。FcαRI(CD89)在单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中粒细胞上，而非在非效应细胞群体上组成性表达。FcαRI对IgAl与IgA2两者均具有中等亲和力(约5X10-7M-1)，所述亲和力在暴露于细胞因子诸如G-CSF或GM-CSF后得以增加(Morton,H.C.等(1996)Critical Reviews in Immunology 16:423-440)。已描述四种标识为A3、A59、A62和A77的FcaRI特异性单克隆抗体，其在IgA配体结合结构域的外部结合FcaRI(Monteiro,R.C.等(1992)J.Immunol.148:1764)。
FcαRI和FcyRI是用于根据本发明的至少一些实施方案的双特异性分子中的优选触发受体，因为它们(1)主要在免疫效应细胞例如单核细胞、PMN、巨噬细胞和树突细胞上表达；(2)在高水平下表达(例如每个细胞5,000-100,000)；(3)是细胞毒性活性(例如ADCC、吞噬作用)的介体；(4)介导被靶向它们的抗原(包括自身抗原)的增强抗原递呈。
尽管人单克隆抗体是优选的，但可用于根据本发明的至少一些实施方案的双特异性分子中的其它抗体是鼠类、嵌合和人源化单克隆抗体。
本发明的双特异性分子可通过使用本领域中已知的方法使组成结合特异性例如抗FcR和抗VSIG8结合特异性缀合来制备。举例来说，可单独产生各双特异性分子的结合特异性，接着彼此缀合。当结合特异性是蛋白质或肽时，多种偶联剂或交联剂可用于共价缀合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、S-乙酰基-硫代乙酸N-丁二酰亚胺酯(SATA)、5,5'-二硫基双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基二顺丁烯二酰亚胺(oPDM)、3-(2-吡啶基-二硫基)丙酸N-丁二酰亚胺酯(SPDP)和4-(N-顺丁烯二酰亚胺基甲基)环己烷-l-甲酸磺基丁二酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参见例如Karpovsky等(1984)J.Exp.Med.160:1686；Liu,M A等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:8648)。其它方法包括Paulus(1985)BehringIns.Mitt.第78期,118-132；Brennan等(1985)Science 229:81-83)以及Glennie等(1987)J.Immunol.139:2367-2375)中所述的那些。优选缀合剂是SATA和磺基-SMCC，两者均可从Pierce Chemical Co.(Rockford,ll.)获得。当结合部分是抗体时，它们可通过两个重链的C末端铰链区的硫氢基键合来缀合。在一特别优选实施方案中，在缀合之前，铰链区被修饰以含有奇数个硫氢基残基，优选是一个。
或者，两个结合特异性均可在同一载体中编码，并且在相同宿主细胞中表达和装配。当双特异性分子是mAbXmAb、mAbXFab、FabXF(ab')2或配体XFab融合蛋白时，这个方法特别适用。根据本发明的至少一些实施方案的双特异性分子可为包含一个单链抗体和结合决定簇的单链分子，或包含两个结合决定簇的单链双特异性分子。双特异性分子可包含至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法例如描述于美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；和美国专利号5,482,858中。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于重组共同表达具有不同特异性的两对免疫球蛋白重链-轻链(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))，WO 93/08829以及Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991))和“孔中钮”工程改造(参见例如美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可通过以下方式来制备：工程改造静电牵引效应以制备抗体Fc异二聚分子(WO 2009/089004A1)；控制Fab臂交换(参见Labrijn等,PNAS 110(13):5145-50(2013))；交联两个或更多个抗体或片段(参见例如美国专利号4,676,980以及Brennan等,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链来产生双特异性抗体(参见例如Kostelny等,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双链抗体”技术来制备双特异性抗体片段(参见例如Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993))；以及使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如Gruber等,J.Immunol.,152:5368(1994))；和如例如Tutt等J.Immunol.147:60(1991)中所述制备三特异性抗体。
可通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如生长抑制)或蛋白质印迹测定来确认双特异性分子与它们的特定靶标的结合。这些测定各自通常通过采用对目标复合物具有特异性的经标记试剂(例如抗体)来检测特定目标蛋白质-抗体复合物的存在性。举例来说，可使用例如识别和特异性结合抗体-FcR复合物的酶联抗体或抗体片段来检测FcR-抗体复合物。或者，可使用多种其它免疫测定中的任一种来检测复合物。举例来说，抗体可被放射性标记，并且用于放射免疫测定(RIA)中(参见例如Weintraub,B.,Principles of Radioimmunoassays,Seventh Training Course onRadioligand Assay Techniques,The Endocrine Society,March,1986，其以引用的方式并入本文)。可通过诸如使用γ计数器或闪烁计数器的手段或通过放射自显影来检测放射性同位素。
抗体及其药物组合物的用途
癌症免疫疗法
不同于旨在抑制对肿瘤生长和发育至关重要的分子路径，和/或消减肿瘤细胞的靶向肿瘤的疗法，癌症免疫疗法目的在于刺激患者的自身免疫系统来消除癌细胞，从而提供长期肿瘤破坏。各种方法可用于癌症免疫疗法中，在它们之中的是用以诱导肿瘤特异性T细胞应答的治疗性癌症疫苗和用以移除免疫抑制性路径的免疫刺激性抗体(即抑制性受体＝免疫检查点的拮抗剂)。
在靶向疗法或常规抗癌疗法的情况下的临床响应倾向于是短暂的，因为癌细胞会产生抗性，并且发生肿瘤复发。然而，在过去数年中临床使用癌症免疫疗法已显示这个类型的疗法可具有持久临床响应，从而显示对长期存活的显著影响。然而，尽管响应是长期的，但仅少数患者起响应(与其中许多患者起响应，但响应是短暂的常规或靶向疗法相反)。
当在临床上检测到肿瘤时，它已通过各种机理和多种免疫细胞来获得免疫抗性和免疫抑制性质以及产生免疫抑制性肿瘤微环境而逃避免疫防御系统。因此，在癌症免疫疗法中，变得日益明确的是疗法的组合为达成临床功效所需。
需要组合方法并预期其会增加受益于免疫疗法的患者的数目，并且扩大具有响应性的癌症的数目和类型，从而使检查点药剂的潜在癌症适应症充分扩大超出当前显示作为单药疗法的免疫检查点阻断剂的功效的初始适应症。免疫调节方法的组合意图使结果最大化，并且克服大多数肿瘤对单一方法的抗性机理。因此，在传统上被认为非免疫原性的肿瘤可能变得具有免疫原性，并且通过共同施用被设计以增加患者的抗肿瘤免疫应答的促免疫原性疗法而对免疫疗法起响应。本文在以下详述潜在致敏剂。
组合疗法的功效显著增加的潜伏科学基本原理主张作为单药疗法的免疫检查点阻断剂将仅当有预先存在的强烈抗肿瘤免疫应答时才诱导肿瘤消退，所述免疫应答将在路径被阻断时‘松开’。根据本发明的至少一些实施方案，VSIG8特异性抗体、抗体片段、缀合物和包含其的组合物用于在组合疗法的情况下以癌症免疫疗法治疗所有类型的癌症。
如本文所用的术语“治疗”是指治疗性治疗与防治性或预防性措施两者，其在这个实例的情况下涉及治疗癌症；然而，也如下所述，也提供抗体和药物组合物用于治疗感染性疾病、败血症和/或自体免疫病状，和/或用于抑制在基因疗法之后不合需要的免疫活化的用途。需要治疗者包括已患有癌症者以及将预防癌症者。因此，本文中待治疗的哺乳动物可已被诊断为患有癌症，或可易感于癌症或易患癌症。如本文所用，术语“治疗”是指预防上述癌性疾病、病症或病状，延迟其发作，治愈、逆转、减弱、缓和、最小化、抑制上述癌性疾病、病症或病状，停止其有害影响，或使其可辨别症状稳定。它也包括管理如上所述的癌症。就“管理”来说，其意指减轻疾病的严重性，降低疾病的发作频率，降低所述发作的持续时间，减轻所述发作的严重性，减缓/降低癌细胞生长或增殖，减缓至少一种症状的进展，改善至少一种可测量身体参数等。举例来说，免疫刺激性抗VSIG8抗体应促进针对靶标细胞例如癌细胞、受感染细胞或病原体细胞的T细胞或NK或细胞因子免疫性，并且由此通过消减疾病状况中涉及的细胞来治疗癌症或感染性疾病。相反，免疫抑制性抗VSIG8抗体应降低一些免疫疾病(诸如自体免疫病状、炎症性病状或过敏性病状)的疾病病理学中涉及的T细胞或NK活性和/或促炎性细胞因子分泌，并且由此治疗或改善可与所述病状相关的疾病病变和组织破坏(例如与类风湿性关节炎病状相关的关节破坏)。
出于治疗的目的，“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和农场动物、以及动物园动物、运动动物或玩赏动物，诸如狗、马、猫、母牛等。优选地，哺乳动物是人。优选地，哺乳动物是被诊断有一种上文所述的疾病、病症或病状的人，或者易感于至少一种类型的癌症者。
术语“治疗有效量”是指根据本发明的药剂的有效治疗哺乳动物的疾病或病症的量。
本发明的治疗剂可单独或作为药物组合物的一部分向受试者提供，在所述药物组合物中，它们与药学上可接受的载体混合。
根据本发明的至少一些实施方案的如本文所述的抗VSIG8抗体、其片段、缀合物或VSIG8融合蛋白和/或包含其的药物组合物也可以组合疗法施用，即与其它增效剂和/或其它疗法组合。根据至少一些实施方案，本文公开的抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白可与任何本领域中已知的护理标准癌症治疗(如可例如于http://www.cancer.gov/cancertopics中所见)组合使用。
举例来说，组合疗法可包括抗VSIG8抗体、其片段、缀合物和/或包含其的药物组合物与至少一种其它治疗剂或免疫调节剂、其它化合物或免疫疗法、或如本文所述的免疫刺激性策略组合。
根据本发明的至少一些实施方案，可与抗VSIG8抗体组合使用的治疗剂是增强抗肿瘤应答的增效剂。
各种策略可用于组合本文公开的抗VSIG8免疫刺激性抗体或VSIG8融合蛋白与增效剂以达成癌症免疫疗法。根据本发明的至少一些实施方案，用于癌症免疫疗法的抗VSIG8抗体与主要适合增加内源性抗肿瘤应答的增效剂组合使用，所述增效剂诸如放射疗法、冷冻疗法、加强抗肿瘤免疫应答的常规/经典化学疗法、加强抗肿瘤免疫应答的靶向疗法、抗血管生成疗法、靶向免疫抑制性细胞诸如Treg和MDSC的治疗剂、免疫刺激性抗体、细胞因子疗法、治疗性癌症疫苗、过继性细胞转移。
在与一些化学疗法或抗癌常规药物组合使用背后的科学基本原理是作为大多数化学治疗化合物的细胞毒性作用的后果的癌细胞死亡可导致肿瘤抗原的水平增加，从而导致增强的抗原递呈和抗肿瘤免疫应答刺激(即免疫原性细胞死亡)，从而与抗VSIG8抗体一起产生加强作用(Zitvogel等,2008,The journal of clinical investigation,第118卷,第1991-2001页；Galluzzi等,2012,Nature Reviews-Drug discovery,第11卷,第215-233页)。可通过肿瘤细胞死亡来加强抗肿瘤应答的其它组合疗法是放射疗法、冷冻疗法、手术和激素剥夺。这些癌症疗法各自在宿主中产生一定肿瘤抗原来源。
根据本发明的至少一些实施方案，本文公开的用于癌症免疫疗法的抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白与以下组合使用：
已显示具有抗癌活性的双膦酸盐，尤其是氨基-双膦酸盐(ABP)。与ABP相关的一些活性依附于人γδΤ细胞，其跨立于先天性免疫性和适应性免疫性的交界面，并且具有强力抗肿瘤活性。
靶向疗法也可通过诱导肿瘤细胞的免疫原性死亡或通过衔接免疫效应物机理来刺激肿瘤特异性免疫应答(Galluzzi等,2012,Nature Reviews-Drug discovery,第11卷,第215-233页)。
根据本发明的至少一些实施方案，作为药剂用于与抗VSIG8抗体组合来治疗癌症的靶向疗法如本文所描述。
也增加内源性抗肿瘤应答的其它癌症免疫疗法也可通过增强免疫效应物机理来加强本文公开的抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白的作用，诸如过继性T细胞疗法、治疗性癌症疫苗、降低免疫抑制性细胞和它们的功能、细胞因子疗法或免疫刺激性抗体。
根据本发明的至少一些实施方案，本文公开的用于癌症免疫疗法的抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白与靶向调节性免疫抑制性细胞诸如调节性T细胞(Treg)和骨髓源性抑制细胞(MDSC)的治疗剂组合使用。许多通常使用的化学治疗剂施加对Treg的非特异性靶向，并且降低Treg或MDSC的数目或免疫抑制能力(Facciabene A.等2012Cancer Res；72(9)2162-71；Byrne WL.等2011,Cancer Res.71:691520；Gabrilovich DI.和Nagaraj S,Nature Reviews 2009第9卷,第162-174页)。就此而言，用一些化学疗法药物进行的节拍疗法通过调节调节性细胞而产生免疫刺激性作用而非免疫抑制性作用。因此，根据本发明的至少一些实施方案，本文公开的用于癌症免疫疗法的抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白与选自但不限于环磷酰胺、吉西他滨(gemcitabine)、米托蒽醌、氟达拉滨(fludarabine)、氟达拉滨、多西他赛、太平洋紫杉醇、沙利度胺(thalidomide)和沙利度胺衍生物的药物组合使用。
此外，根据本发明的至少一些实施方案，本文公开的用于癌症免疫疗法的抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白与新型Treg特异性靶向剂组合使用，包括：1)通过识别Treg细胞表面受体来直接靶向Treg的消减性或杀灭性抗体，诸如抗CD25mAb达利珠单抗(daclizumab)、巴利昔单抗(basiliximab)，或2)配体定向毒素，诸如地尼白介素(denileukin diftitox)(温塔克(Ontak))-人IL-2和白喉毒素的融合蛋白、或LMB-2-针对CD25的scFv与假单胞菌外毒素之间的融合物，和3)靶向Treg细胞表面受体诸如CTLA4、PD-1、OX40和GITR的抗体，或4)靶向其它NK受体(诸如先前鉴定的NK受体)的抗体、小分子或融合蛋白。
根据本发明的至少一些实施方案，本文公开的用于癌症免疫疗法的抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白与用于破坏Treg诱导和/或功能的任何下述选项组合使用，包括TLR(toll样受体)激动剂；干扰腺苷能路径的药剂，诸如外核苷酸酶抑制剂或A2A腺苷受体的抑制剂；TGF-β抑制剂，诸如夫苏木单抗(fresolimumab)、乐地单抗(lerdelimumab)、美特利木单抗(metelimumab)、曲贝德生(trabedersen)、LY2157299、LY210976；Treg向肿瘤组织募集的阻断剂，包括趋化因子受体抑制剂，诸如CCR4/CCL2/CCL22路径。
根据本发明的至少一些实施方案，本文公开的用于癌症免疫疗法的抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白与用于抑制免疫抑制性肿瘤微环境的任何下述选项组合使用，包括施加免疫抑制活性的细胞因子和酶的抑制剂，诸如IDO(吲哚胺-2,3-双加氧酶)抑制剂；促进免疫抑制性微环境的消炎性细胞因子诸如IL-10、IL-35、IL-4和IL-13的抑制剂；降低Treg以及有利于DC的分化的
根据本发明的至少一些实施方案，本文公开的用于癌症免疫疗法的抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白与用于靶向MDSC(骨髓源性抑制性细胞)的任何下述选项组合使用，包括通过维生素D3或维生素A代谢物诸如视黄酸、全反式视黄酸(ATRA)来促进它们分化成不具有抑制性功能的成熟骨髓细胞；通过COX2抑制剂、磷酸二酯酶5抑制剂如昔多芬(sildenafil)、ROS抑制剂诸如硝基阿司匹林(nitroaspirin)来抑制MDSC抑制活性。
根据本发明的至少一些实施方案，本文公开的用于癌症免疫疗法的抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白与免疫刺激性抗体或加强抗肿瘤免疫应答的其它药剂(Pardoll J ExpMed.2012；209(2):201-209)组合使用。免疫刺激性抗体通过直接调节免疫功能，即阻断其它抑制性靶标或增强免疫刺激性蛋白质来促进抗肿瘤免疫性。根据本发明的至少一些实施方案，用于癌症免疫疗法的抗VSIG8抗体与以下组合使用：靶向免疫检查点的拮抗性抗体，包括抗CTLA4mAb，诸如易普利单抗(ipilimumab)、曲美木单抗(tremelimumab)；抗PD-1，诸如尼鲁单抗(nivolumab)BMS-936558/MDX-1106/ONO-4538、AMP224、CT-011、MK-3475；抗PDL-1拮抗剂，诸如BMS-936559/MDX-1105、MEDI4736、RG-7446/MPDL3280A；抗LAG-3诸如IMP-321，抗TIM-3，抗BTLA，抗B7-H4，抗B7-H3，抗VISTA；靶向免疫刺激性蛋白质的激动性抗体，包括抗CD40 mAb，诸如CP-870,893、鲁卡木单抗(lucatumumab)、达西珠单抗(dacetuzumab)；抗CD137 mAb，诸如BMS-663513乌瑞鲁单抗(urelumab)、PF-05082566；抗OX40 mAb，诸如OX40抗体；抗GITR mAb诸如TRX518；抗CD27 mAb，诸如CDX-1127；以及抗ICOSmAb。
细胞因子是允许免疫系统的细胞彼此通信以产生对靶标抗原的协调、稳健但自我限制的应答的分子信使。基于细胞因子的疗法包括直接试图刺激患者的自身免疫系统以排斥癌症。在过去20年间对利用免疫系统来根除癌症的日益增长的关注已伴随有增加的尝试用以表征细胞因子以及利用它们的巨大信号传导网络来开发癌症治疗法。细胞因子直接刺激在肿瘤部位处的免疫效应细胞和基质细胞，并且增强由细胞毒性效应细胞对肿瘤细胞识别。众多动物肿瘤模型研究已证明细胞因子具有广泛抗肿瘤活性，并且这已被转换为许多基于细胞因子的用于癌症疗法的方法(Lee和Margolin 2011,Cancers 3(4):3856-93)。许多细胞因子作为用于癌症免疫疗法的加强抗肿瘤免疫应答的药剂处于临床前或临床开发中，尤其包括：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18和IL-21、IL-23、IL-27、GM-CSF、IFNα(干扰素α)、IFNβ和IFNγ。
若干细胞因子已被核准用于癌症疗法，并且更多细胞因子处于开发之中。然而，治疗功效常受重度副作用和不良药物动力学性质阻碍。因此，除全身性施用细胞因子之外，多种策略也可用于递送治疗性细胞因子以及达成它们定位于肿瘤部位，以改进它们的药物动力学以及它们的功效和/或毒性，包括抗体-细胞因子融合分子(免疫细胞因子)，化学缀合于聚乙二醇(聚乙二醇化)，在自体完整肿瘤细胞中转基因表达细胞因子，将细胞因子基因并入DNA疫苗中，重组病毒载体用以递送细胞因子基因等。在免疫细胞因子的情况下，使细胞因子融合于肿瘤特异性抗体或抗体片段允许达成靶向递送以及因此改进功效和药物动力学，并且降低副作用。
根据本发明的至少一些实施方案，本文公开的用于癌症免疫疗法的抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白与细胞因子疗法组合使用，涉及使用细胞因子作为加强抗肿瘤免疫应答的药剂，包括诸如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18和IL-21、IL-23、IL-27、GM-CSF、IFNα(干扰素α)、IFNa-2b、IFNβ、IFNγ的细胞因子，以及如上所述的它们的不同递送策略。
癌症疫苗用于治疗现有癌症(治疗性)或预防在某些高风险个体中显现癌症(防治性)。治疗性癌症疫苗允许改进对T细胞的致敏和改进抗原递呈，并且可作为治疗剂用于加强抗肿瘤免疫应答(Mellman I.等,2011,Nature,480:22-29；Schlom J,2012,J NatlCancer Inst；104:599-613)。
若干类型的治疗性癌症疫苗处于临床前和临床开发中。这些包括例如：
1)完整肿瘤细胞疫苗，其中处理在手术期间移除的癌细胞以增强它们的免疫原性，并且将其注射至患者中以诱导针对肿瘤细胞中的抗原的免疫应答。肿瘤细胞疫苗可为自体疫苗，即患者的自身肿瘤；或同种异体疫苗，其通常含有给定肿瘤类型的两种或三种经确定和经表征人肿瘤细胞系，诸如GVAX疫苗平台。
2)肿瘤抗原疫苗，其中施用通常是蛋白质或肽的肿瘤抗原(或少许肿瘤抗原的组合)以加强免疫系统(可能与佐剂一起和/或与树突细胞的免疫调节剂或引诱剂诸如GM-CSF一起)。肿瘤抗原可为某一类型的癌症所特有，但它们并非针对特定患者而制备。
3)基于载体的肿瘤抗原疫苗和DNA疫苗可用作用以提供稳定抗原供给以刺激抗肿瘤免疫应答的方式。
将编码肿瘤抗原的载体注射至患者(可能与促炎性或其它引诱剂诸如GM-CSF一起)中，在体内由细胞摄取以产生特定抗原，其将接着激起所需免疫应答。载体可用于同时递送超过一种肿瘤抗原以增加免疫应答。此外，重组病毒、细菌或酵母载体应触发它们自身的免疫应答，此也可增强总体免疫应答。
4)溶瘤性病毒疫苗，诸如OncoVex/T-VEC，此涉及肿瘤内注射优先感染癌细胞的复制条件性单纯疱疹病毒。也被工程改造以表达GM-CSF的病毒能够在癌细胞内部复制，从而导致它的溶解，释放新病毒和一系列肿瘤抗原，以及在过程中分泌GM-CSF。因此，所述溶瘤性病毒疫苗增强肿瘤微环境中的DC功能以刺激抗肿瘤免疫应答。
5)树突细胞疫苗(Palucka和Banchereau,2102,Nat.Rev.Cancer,12(4):265-277)：树突细胞(DC)吞噬肿瘤细胞，并且向肿瘤特异性T细胞递呈肿瘤抗原。在这个方法中，从癌症患者分离DC并致敏以递呈肿瘤特异性T细胞。为此，可使用若干方法：用肿瘤细胞或溶解产物装载DC；用肿瘤抗原的融合蛋白或肽装载DC；使肿瘤抗原偶联于靶向DC的mAb。离体在刺激因子(诸如GM-CSF)存在下处理DC，活化并成熟，接着再输注回患者中以激起对癌细胞的免疫应答。树突细胞也可通过用被工程改造以分泌刺激性细胞因子(诸如GM-CSF)的经照射完整肿瘤细胞注射患者来在体内致敏。可用单核细胞进行类似方法。斯普柳赛-T(Sipuleucel-T)(普罗温基(Provenge))，即一种已被核准用于治疗晚期前列腺癌的治疗性癌症疫苗，是树突细胞疫苗的一实例。
因此，根据本发明的至少一些实施方案，本文公开的用于癌症免疫疗法的抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白与治疗性癌症疫苗组合使用。所述治疗性癌症疫苗的非限制性实例包括如上所述的完整肿瘤细胞疫苗、肿瘤抗原疫苗、基于载体的疫苗、溶瘤性病毒疫苗、树突细胞疫苗。
一种用于癌症免疫疗法的方法基于过继性T细胞疗法或过继性细胞转移(ACT)，其涉及离体鉴定和扩增自体天然存在的肿瘤特异性T细胞，其接着被过继性转移回癌症患者中(Restifo等,2013,Cancer Immunol.Immunother.62(4):727-36(2013)2012年12月4日电子出版)。在离体扩增之后被输注回患者中的细胞可迁移至肿瘤，并且介导它的破坏。在这个过继性转移之前，宿主可通过照射和/或化学疗法来加以免疫消减。淋巴细胞消减、过继性细胞转移和T细胞生长因子(诸如IL-2)的组合可导致肿瘤患者中肿瘤根除作用延长。一种更新型方法涉及离体遗传修饰正常外周血液T细胞以赋予对肿瘤相关抗原的特异性。举例来说，可将具有特别良好抗肿瘤应答的T细胞的TCR的克隆插入病毒表达载体中，并且用于感染来自待治疗的患者的自体T细胞。另一选项是使用嵌合抗原受体(CAR)，其本质上是嵌合免疫球蛋白-TCR分子，也称为T体。CAR具有抗体样特异性，并且识别靶标细胞的表面上的MHC非限制结构(细胞外靶标结合模块)，被移植于能够活化T细胞的TCR细胞内结构域上(Restifo等Cancer Immunol.Immunother.62(4):727-36(2013)2012年12月4日电子出版；以及Shi等,Nature 493:111-115 2013。
根据本发明的至少一些实施方案，本文公开的用于癌症免疫疗法的抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白与如上所述的用以加强抗肿瘤免疫应答的过继性细胞转移(包括遗传修饰的T细胞)组合使用。
根据本发明的至少一些实施方案的VSIG8特异性抗体和/或替代性骨架和/或多特异性和双特异性分子和免疫缀合物、包含其的组合物可连同一种或多种其它治疗剂一起共同施用，所述治疗剂与或以协同方式与根据本发明的至少一些实施方案的组合物联合起治疗或预防癌症的作用。VSIG8相关治疗剂和一种或多种其它治疗剂可以任一顺序或同时施用。其它治疗剂是例如细胞毒性剂、放射毒性剂或免疫抑制剂。可使组合物连接于药剂(以免疫复合物形式)，或可与药剂分开施用。在后述情况(分开施用)下，组合物可在药剂之前、之后或与其同时施用，或可与其它已知疗法例如抗癌疗法例如放射共同施用。所述治疗剂尤其包括独自仅在对患者具有毒性或亚毒性的水平下有效的抗赘生剂，诸如多柔比星(阿霉素(Adriamycin))、顺铂硫酸博莱霉素、卡莫司汀、苯丁酸氮芥和环磷酰胺羟基脲。顺铂每4周一次以100mg/剂静脉内施用，并且阿霉素每21天一次以60-75mg/ml剂量静脉内施用。共同施用根据本发明的至少一些实施方案的人抗VSIG8抗体或其抗原结合片段和/或替代性骨架与化学治疗剂提供两种抗癌剂，其通过对人肿瘤细胞产生细胞毒性作用的不同机理来起作用。所述共同施用可解决归因于将致使肿瘤细胞与抗体不反应的产生对药物的抗性或肿瘤细胞的抗原性变化的问题。在其它实施方案中，受试者可另外用调节(例如增强或抑制)Fey或Fey受体的表达或活性的药剂治疗，通过例如用细胞因子治疗受试者。用于在治疗期间与多特异性分子一起施用的优选细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子(T Fa或T FP)。
靶标特异性效应细胞例如连接于根据本发明的至少一些实施方案的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)的效应细胞也可用作治疗剂。用于靶向的效应细胞可为人白细胞诸如巨噬细胞、嗜中性白细胞或单核细胞。其它细胞包括嗜酸性粒细胞、天然杀伤细胞以及其它IgG或IgA受体携带细胞。必要时，可从待治疗的受试者获得效应细胞。可以细胞于生理上可接受的溶液中的混悬液形式施用靶标特异性效应细胞。施用的细胞的数目可约为10"8°至10-9*，但将视治疗目的而变化。一般来说，数量将足以获得在靶标细胞例如表达VSIG8蛋白的肿瘤细胞处定位，以及例如通过例如吞噬作用来实现细胞杀灭。施用途径也可变化。
可与用于移除所靶向细胞的其它技术联合用靶标特异性效应细胞进行疗法。举例来说，使用根据本发明的至少一些实施方案的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)和/或装备有这些组合物的效应细胞的抗肿瘤疗法可与化学疗法联合使用。
另外，组合免疫疗法可用于将两个不同细胞毒性效应物群体引向肿瘤细胞排斥。举例来说，连接于抗Fc-γRI或抗CD3的抗VSIG8可与IgG或IgA受体特异性结合剂联合使用。
根据本发明的至少一些实施方案的双特异性和多特异性分子也可用于调节效应细胞上的FcyR或FcyR水平，诸如通过对细胞表面上的受体加帽和消除。抗Fc受体的混合物也可用于这个目的。
根据本发明的至少一些实施方案的具有补体结合位点(诸如来自IgGl、IgG-2或IgG-3或IgM的结合补体的部分)的治疗性组合物(例如人抗体、替代性骨架、多特异性和双特异性分子以及免疫缀合物)也可在补体存在下使用。在一个实施方案中，用根据本发明的至少一些实施方案的结合剂和适当效应细胞离体处理一群包含靶标细胞的细胞可通过添加补体或含有补体的血清而得以补充。对被根据本发明的至少一些实施方案的结合剂包覆的靶标细胞的吞噬作用可通过结合补体蛋白质而改进。在另一实施方案中，被根据本发明的至少一些实施方案的组合物(例如人抗体、多特异性和双特异性分子)包覆的靶标细胞也可通过补体来溶解。在另一实施方案中，根据本发明的至少一些实施方案的组合物不使补体活化。
根据本发明的至少一些实施方案的治疗性组合物(例如人抗体、替代性骨架、多特异性和双特异性分子以及免疫缀合物)也可连同补体一起施用。
因此，根据本发明的至少一些实施方案，存在包含人抗体、多特异性或双特异性分子和血清或补体的组合物。这些组合物是有利的，因为补体紧密邻近于人抗体、多特异性或双特异性分子加以定位。或者，根据本发明的至少一些实施方案的人抗体、多特异性或双特异性分子以及补体或血清可分开施用。
根据本发明的至少一些实施方案的本文公开的抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白的“治疗有效剂量”优选导致疾病症状的严重性减轻，无疾病症状时期的频率和持续时间增加，寿命增加，疾病缓解，或归因于疾病折磨的损害或失能得以预防或降低。举例来说，对于治疗VSIG8阳性肿瘤，相对于未治疗受试者，“治疗有效剂量”优选抑制细胞生长或肿瘤生长至少约20％，更优选至少约40％，甚至更优选至少约60％，并且还更优选至少约80％。可在预测在人肿瘤的情况下的功效的动物模型系统中评估化合物抑制肿瘤生长的能力。
或者，可通过考查化合物的抑制能力来评估组合物的这个性质，所述体外抑制作用通过为熟练从业者所知的测定来确定。治疗有效量的治疗性化合物可降低肿瘤尺寸，或另外改善受试者的症状。
本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者的身材、受试者的症状的严重性、以及所选特定组合物或施用途径的因素来确定治疗有效量。
根据本发明的至少一些实施方案，抗VSIG8抗体可用作中和抗体。中和抗体(Nab)是能够结合和中和或抑制特定抗原，由此抑制它的生物作用的抗体，例如通过阻断细胞或病毒上的受体，抑制病毒结合宿主细胞。NAb将通过阻断为作用物的活性所需的重要表面分子或通过干扰作用物与它在靶标细胞上的受体的结合来部分或完全消除所述作用物。
如本文所用，“治疗剂”是以下中的任一者：包含特异性结合任一VSIG8多肽或其表位的抗原结合位点，被采用来治疗如本文所述的癌症的单克隆和/或多克隆抗体、和/或其抗原结合片段、和/或含有其的缀合物、和/或替代性骨架。
根据本发明的另一方面，治疗剂可用于预防对诸如针对癌细胞的T细胞活性的病理性抑制。
根据本发明的另一方面，治疗剂可用于抑制如可例如通过T细胞增殖和细胞因子分泌来显现的T细胞活化。
因此，根据本发明的另一方面，提供一种通过以下方式来治疗如本文所述的癌症，和/或用于促进受试者中由VSIG8多肽介导的免疫刺激的方法：向有此需要的受试者施用有效量的以下中的任一者：治疗剂和/或包含任何治疗剂，以及进一步包含药学上可接受的稀释剂或载体的药物组合物。
根据本发明的至少一些实施方案的治疗剂或药物组合物也可与其它化合物或免疫疗法联合施用。举例来说，组合疗法可包括本发明化合物与至少一种其它治疗剂或免疫调节剂或免疫刺激性策略组合，包括但不限于肿瘤疫苗、过继性T细胞疗法、Treg消减、抗体(例如贝伐单抗、爱必妥(Erbitux))、肽、肽体(peptibody)、小分子、化学治疗剂诸如细胞毒性剂和细胞抑制剂(例如太平洋紫杉醇、顺铂、长春瑞滨、多西他赛、吉西他滨、替莫唑胺(temozolomide)、伊立替康、5FU、卡铂)、免疫调节剂诸如干扰素和白介素、免疫刺激性抗体、生长激素或其它细胞因子、叶酸、维生素、矿物质、芳香酶抑制剂、RNAi、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂等。
根据至少一些实施方案，可在体内或离体使免疫细胞，优选是T细胞，与治疗剂接触以调节免疫应答。与治疗剂接触的T细胞可为表达T细胞受体(包括α/β和γ/δT细胞受体)的任何细胞。T细胞包括表达CD3的所有细胞，包括也表达CD4和CDS的T细胞子组。T细胞包括天然和记忆细胞以及效应细胞诸如CTL。T细胞也包括诸如Th1、Tel、Th2、Th2、Th3、Thl7、Th22、Treg和Trl细胞的细胞。T细胞也包括NKT细胞和T细胞谱系的类似独特类别。
VSIG8阻断剂也可与标准癌症治疗法组合。VSIG8阻断剂可与化学治疗方案有效组合。在这些情况下，有可能降低施用的化学治疗试剂的剂量。这种组合的一实例是本文公开的抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白与坦罗莫司(Temsirolimus)组合用于治疗晚期肾细胞癌。这种组合的另一实例是本文公开的抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白与白介素-2(IL-2)组合用于治疗晚期肾细胞癌以及与易普利单抗或BMS-936558组合。在组合使用VSIG8阻断剂和化学疗法背后的科学基本原理是作为大多数化学治疗化合物的细胞毒性作用的后果的细胞死亡应导致抗原递呈路径中的肿瘤抗原的水平增加。可通过细胞死亡来导致与VSIG8阻断剂的协同作用的其它组合疗法是放射疗法、冷冻疗法、手术和激素剥夺。与额外免疫调节分子的其它额外组合疗法将协同促进对免疫系统的刺激以根除癌症。这些方案各自在宿主中产生一定肿瘤抗原来源。血管生成抑制剂也可与VSIG8阻断剂组合。抑制血管生成导致肿瘤细胞死亡，此可将肿瘤抗原馈入宿主抗原递呈路径中。
VSIG8阻断抗体也可与使Fca或Fey受体表达性效应细胞靶向肿瘤细胞的双特异性抗体(参见例如美国专利号5,922,845和5,837,243)组合使用。双特异性抗体可用于靶向两种单独抗原。举例来说，抗Fc受体/抗肿瘤抗原(例如Her-2/neu)双特异性抗体已用于使巨噬细胞靶向肿瘤部位。这个靶向可更有效活化肿瘤特异性应答。这些应答的T细胞效力将通过使用VSIG8阻断剂而加强。或者，可通过使用结合肿瘤抗原和树突细胞特异性细胞表面标志物的双特异性抗体来将抗原递送递送至DC。
肿瘤通过多种机理来逃避宿主免疫监视。这些机理中的许多可通过使由肿瘤表达以及具有免疫抑制性的蛋白质失活来克服。这些尤其包括TGF-β(Kehrl,J.等(1986)J.Exp.Med.163:1037-1050)、IL-10(Howard,M.&O'Garra,A.(1992)Immunology Today 13:198-200)以及Fas配体(Hahne,M.等(1996)Science 274:1363-1365)。针对这些实体各自的抗体可与抗VSIG8组合用于抵抗免疫抑制剂的作用，并且有利于由宿主达成的肿瘤免疫应答。
可用于使宿主免疫应答性活化的其它抗体可与抗VSIG8组合使用。这些包括树突细胞的表面上的使DC功能和抗原递呈活化的分子。抗CD40抗体能够有效替代T辅助细胞活性(Ridge,J.等(1998)Nature 393:474-478)，并且可与VSIG8抗体联合使用(Ito,N.等(2000)Immunobiology 201(5)527-40)。针对T细胞共刺激分子诸如OX-40(Weinberg,A.等(2000)Immunol 164:2160-2169)、4-1BB(Melero,I.等(1997)Nature Medicine 3:682-685(1997)和ICOS(Hutloff,A.等(1999)Nature 397:262-266)的活化性抗体以及阻断负性共刺激分子诸如CTLA-4(例如美国专利号5,811,097，易普利单抗)或BTLA(Watanabe,N.等(2003)Nat Immunol 4:670-9)、B7-H4(Sica,G L等(2003)Immunity 18:849-61)、PD-1的活性的抗体也可提供T细胞活化水平增加。
骨髓移植当前用于治疗多种造血源性肿瘤。尽管移植物抗宿主疾病是这个治疗的后果，但可从移植物抗肿瘤应答获得治疗益处。VSIG8阻断剂可用于增加供给者移入的肿瘤特异性T细胞的有效性。也存在若干实验治疗方案涉及离体活化和扩增抗原特异性T细胞，以及将这些细胞过继性转移至接受者中以获得针对肿瘤的抗原特异性T细胞(Greenberg,R.和Riddell,S.(1999)Science 285:546-51)。这些方法也可用于活化T细胞对感染物诸如CMV的应答。可预期在抗VSIG8抗体存在下进行的离体活化会增加过继性转移的T细胞的出现率和活性。
任选地，针对VSIG8的抗体可与免疫原性作用物诸如癌性细胞、纯化肿瘤抗原(包括重组蛋白、肽和碳水化合物分子)、细胞和用编码免疫刺激性细胞因子的基因转染的细胞(He等(2004)J.Immunol.173:4919-28)组合。可使用的肿瘤疫苗的非限制性实例包括用于治疗结肠癌的MUC1的肽、用于治疗卵巢癌的MUC-1/CEA/TRICOM的肽、或被转染以表达细胞因子GM-CSF的肿瘤细胞(以下进一步讨论)。
在人中，已显示一些肿瘤具有免疫原性，诸如RCC。预期通过升高由VSIG8阻断剂达成的T细胞活化的阈值，我们可预期使宿主中的肿瘤应答活化。当与疫苗接种方案组合时，VSIG8阻断剂可能最有效。已设计用于针对肿瘤进行疫苗接种的许多实验策略(参见Rosenberg,S.,2000,Development of Cancer Vaccines,ASCO Educational BookSpring:60-62；Logothetis,C,2000,ASCO Educational Book Spring:300-302；Khayat,D.2000,ASCO Educational Book Spring:414-428；Foon,K.2000,ASCO Educational BookSpring:730-738；也参见Restifo,N.和Sznol,M.,Cancer Vaccines,第61章,第3023-3043页,DeVita,V.等(编),1997,Cancer:Principles and Practice of Oncology.第5版)。在这些策略中的一种中，使用自体或同种异体肿瘤细胞制备疫苗。已显示这些细胞疫苗在肿瘤细胞被转导以表达GM-CSF时最有效。已显示GM-CSF是用于肿瘤疫苗接种的强力抗原递呈活化剂。
抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白和含有其的药物组合物用于治疗自体免疫性疾病的用途
根据至少一些实施方案，如本文所述的充当VSIG8刺激性治疗剂的VSIG8抗体、其片段、缀合物或VSIG8融合蛋白和/或包含其的药物组合物可任选用于治疗免疫系统相关疾病。
任选地，免疫系统相关病状包括免疫相关病状、如本文所述的自体免疫性疾病、移植排斥和移植物抗宿主疾病，和/或用于阻断或促进由VSIG8介导的免疫刺激，如本文所述的免疫相关疾病，和/或用于免疫疗法(促进或抑制免疫刺激)。
任选地，免疫病状选自自体免疫性疾病、移植排斥或移植物抗宿主疾病。任选地，治疗与用于治疗免疫相关病状的另一部分组合。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂治疗多发性硬化症可与例如任选如本文所述的用于治疗多发性硬化症的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂治疗类风湿性关节炎可与例如任选如本文所述的用于治疗类风湿性关节炎的任何已知治疗剂或方法组合。因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂治疗IBD可与例如任选如本文所述的用于治疗IBD的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂治疗牛皮癣可与例如任选如本文所述的用于治疗牛皮癣的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂治疗1型糖尿病可与例如任选如本文所述的用于治疗1型糖尿病的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂治疗葡萄膜炎可与例如任选如本文所述的用于治疗葡萄膜炎的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂治疗休格连氏综合征(syndrome)可与例如任选如本文所述的用于治疗休格连氏综合征的任何已知治疗剂或方法组合。
因此，使用根据本发明的至少一些实施方案的药剂治疗全身性红斑狼疮可与例如任选如本文所述的用于治疗全身性红斑狼疮的任何已知治疗剂或方法组合。
在上述疗法中，优选地，患有一种以上提及的自体免疫病状或炎症性病状的受试者将被施用本发明的本文公开的免疫抑制性抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白或抗原结合片段，本文公开的所述抗体或VSIG8融合蛋白模拟或激动至少一种VSIG8介导的对免疫性的作用，例如它抑制疾病病理学中涉及的细胞毒性T细胞或NK活性和/或促炎性细胞因子产生，由此预防或改善疾病症状，并且潜在导致疾病缓解延长，例如由于诱导引发T细胞耐受性或延长的免疫抑制的Treg。
根据本发明的至少一些实施方案的如本文所述的治疗剂和/或包含其的药物组合物可作为唯一活性成分或连同免疫调节方案中的其它药物或例如用于治疗或预防同种异体移植物或异种移植物急性或慢性排斥或炎症性病症或自体免疫病症或用以诱导耐受性的其它消炎剂一起施用。
抗体或VSIG8融合蛋白和药物组合物用于治疗感染性疾病的用途
根据至少一些实施方案，如本文所述的充当VSIG8阻断治疗剂的VSIG8抗体、其片段、缀合物或VSIG8融合蛋白和/或药物组合物可任选用于治疗感染性疾病。
慢性感染的特征常在于病毒特异性T细胞应答具有不同程度的功能性损害，并且这个缺陷是宿主不能消除持久病原体的主要原因。尽管功能性效应T细胞初始在早期感染期间产生，但它们在慢性感染的过程期间由于持续暴露于外来抗原，从而产生T细胞耗竭而逐渐丧失功能。耗竭的T细胞表达高水平的多种共抑制性受体诸如CTLA-4、PD-1和LAG3(Crawford等,Curr Opin Immunol.2009；21:179-186；Kaufmann等,J Immunol 2009；182:5891-5897，Sharpe等,Nat Immunol 2007；8:239-245)。在临床上在罹患慢性病毒性感染(包括HIV、HCV和HBV)的患者中观察到由耗竭的T细胞达成的PD-1过表达(Crawford等,CurrOpin Immunol 2009；21:179-186；Kaufmann等,J Immunol 2009；182:5891-5897，Sharpe等,Nat Immunol 2007；8:239-245)。已有在额外病原体的情况下对这个路径的一定探究，所述病原体包括其它病毒、细菌和寄生虫(Hofmeyer等,J Biomed Biotechnol.第2011卷,文章标识符451694，Bhadra等,Proc Natl.Acad Sci.2011；108(22):9196-201)。举例来说，使用通过标准盲肠结扎和穿刺方法来诱导的败血症模型，显示PD-1路径涉及于控制细菌性感染中。在这个模型的情况下，在敲除小鼠中不存在PD-1保护免遭败血症诱发的死亡(Huang等,PNAS 2009:106；6303-6308)。
可通过阻断共抑制性路径诸如PD-1或CTLA-4来逆转T细胞耗竭(Rivas等,JImmunol.2009；183:4284-91；Golden-Mason等,J Virol.2009；83:9122-30；Hofmeyer等,JBiomed Biotechnol.第2011卷,文章标识符451694)，因此允许恢复抗病毒免疫功能。通过阻断PD-l/PD-Ll路径来广泛研究共抑制阻断剂用于治疗病毒性感染的治疗潜力，此显示在若干动物感染模型的情况下有效，包括恒河猴中的急性和慢性猿免疫缺陷病毒(SrV)感染(Valu等,Nature 2009；458:206-210)以及在小鼠慢性病毒性感染模型的情况下，诸如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)(Barber等,Nature.2006；439:682-7)，和SJL/J小鼠的泰累尔氏鼠类脑脊髓炎病毒(Theiler's murine encephalomyelitis virus，TMEV)模型(Duncan和Miller PLoS One.2011；6:el8548)。在这些模型的情况下，PD-l/PD-Ll阻断剂改进抗病毒应答，并且促进对持久病毒的清除。此外，PD-l/PD-Ll阻断剂增加体液免疫性，显现为血浆中特异性抗病毒抗体的产生升高，此与改进的细胞应答组合导致血浆病毒载量降低和存活期增加。
如本文所用，可互换使用的术语“感染性病症和/或疾病”和/或“感染”包括由病原性生物作用物在个别宿主生物体中存在和/或生长引起的任何病症、疾病和/或病状。如本文所用，术语“感染”包括展现临床明显病态(即疾病的特征性医学征象和/或症状)和/或对于它的许多或全部过程是无症状的如上病症、疾病和/或病状。如本文所用，术语“感染”也包括由外来抗原的持续性引起的病症、疾病和/或病状，所述持续性导致特征在于显现为增殖和细胞因子产生降低的功能性受损的耗竭T细胞表型。如本文所用，术语“感染性病症和/或疾病”和/或“感染”进一步包括任何以下列出的由细菌性感染、病毒性感染、真菌性感染和/或寄生虫感染引起的感染性病症、疾病和/或病状。
根据本发明的至少一些实施方案，提供如本文所述的治疗剂和/或包含其的药物组合物与有效用于治疗感染的已知治疗剂的组合的用途。
如本文所述的治疗剂和/或包含其的药物组合物可与一种或多种任选如本文所述的用于治疗细菌性感染的额外治疗剂组合施用。
如本文所述的治疗剂和/或包含其的药物组合物可与一种或多种任选如本文所述的用于治疗病毒性感染的额外治疗剂组合施用。如本文所述的治疗剂和/或包含其的药物组合物可与一种或多种任选如本文所述的用于治疗真菌性感染的额外治疗剂组合施用。
在上述疗法中，优选地，患有一种以上提及的感染性病状的受试者将被施用本发明的本文公开的免疫刺激性抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白或抗原结合片段，本文公开的所述抗体或VSIG8融合蛋白拮抗至少一种VSIG8介导的对免疫性的作用，例如它对细胞毒性T细胞或NK活性的抑制作用和/或它对促炎性细胞因子的产生的抑制作用，或抑制VSIG8对Treg的刺激作用，由此促使消减或杀灭受感染细胞或病原体，以及基于由受试者的免疫细胞对病原体或受感染细胞的杀灭增强来潜在导致疾病缓解。
抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白和含有其的药物组合物用于治疗败血症的用途
根据至少一些实施方案，如本文所述的充当VSIG8阻断治疗剂的VSIG8抗体、其片段、缀合物和/或药物组合物可任选用于治疗败血症。
败血症是感染的潜在危急生命的并发症。败血症代表复杂临床综合征，其当针对感染的初始宿主应答变得不适当放大和调节异常，从而变得对宿主有害时显现。败血症的初始高炎症期(‘细胞因子风暴’)继之以免疫抑制状态(Hotchkiss等2013LancetInfect.Dis.13:260-268)。后述免疫性受损(也被称为‘免疫麻痹’)期显现为不能清除原发性感染，诸如HSV和巨细胞病毒的病毒的再活化，以及显现新的继发性感染，常伴有对具有免疫能力的患者不特别具有毒性的生物体。绝大多数的败血症患者当今仅存活于他们的初始高炎症性伤害，直至在重病监护室中历经随后数日至数周以败血症诱发的多器官功能异常而告终。败血症诱导的免疫抑制日益被认定为这些易受影响的患者中的首要免疫功能异常。在原发性感染之后病原体清除受损和/或对继发性感染的易感性促成与败血症相关的高致病率和致死率。
抑制性蛋白质的上调近来已作为一种潜伏于败血症中免疫抑制下的关键机理而出现。PD-l/PDL-1路径例如似乎是败血症的结果的决定性因素，调节由抗微生物免疫应答达成的有效性与损害之间的微妙平衡。在实验模型中在败血症期间，腹膜巨噬细胞和血液单核细胞显著增加PD-1水平，此与显现细胞功能异常相关联(Huang等2009PNAS 106:6303-6308)。类似地，在患有败血性休克的患者中，外周T细胞上PD-1的表达和单核细胞上PDL-1的表达被显著上调(Zhang等2011 Crit.Care 15:R70)。新近动物研究已显示通过抗PDl或抗PDLl抗体来阻断PD-l/PDL-1路径使在败血症的情况下的存活期改进(Brahmamdam等2010J.Leukoc.Biol.88:233-240；Zhang等2010Critical Care 14:R220；Chang等2013Critical Care 17:R85)。类似地，用抗CTLA4抗体阻断CTLA-4使在败血症的情况下的存活期改进(Inoue等2011Shock 36:38-44；Chang等2013Critical Care 17:R85)。总之，这些研究结果表明阻断包括负性共刺激分子的抑制性蛋白质是一种用以预防败血症的有害影响的潜在治疗方法(Goyert和Silver,J Leuk.Biol.,88(2):225-226,2010)。
根据本发明的至少一些实施方案，提供如本文所述的治疗剂和/或包含其的药物组合物与有效用于治疗败血症的已知治疗剂的组合的用途。
恢复败血症患者中通常存在于免疫系统的活性效力与抑制效力之间的微妙平衡可取决于不平衡的确切性质，即导致感染的病原性生物体、它的位置、从感染发作以来所经过的时间量、以及其它个体参数。因此，正确选择工具可充分取决于各个别患者的特定免疫状况或缺陷，并且可需要组合不同药物。
根据本发明的至少一些实施方案，提供如本文所述的治疗剂和/或包含其的药物组合物可与以下进行组合所达成的组合的用途：针对败血症的护理标准治疗或新型治疗，阻断败血症的初始高炎症期的细胞因子风暴的疗法，和/或具有免疫刺激作用以克服败血症诱导的免疫抑制期的疗法。
与如由“国际重度败血症和败血性休克管理指导方针(InternationalGuidelines for Management of Severe Sepsis and Septic Shock)”(Dellinger等2013Intensive Care Med 39:165-228)推荐的针对败血症的护理标准治疗进行组合，以下描述所述护理标准治疗中的一些。
具有针对所有可能病原体的活性的广谱抗生素(当败血症被诊断，但未鉴定特定病原体时开始细菌和/或真菌治疗)-实例：头孢噻肟(Cefotaxime)提卡西林(Ticarcillin)和克拉维酸盐(clavulanate)哌拉西林(Piperacillin)和他佐巴坦(tazobactam)亚胺培南(Imipenem)和西司他丁(cilastatin)美罗培南(Meropenem)克林达霉素(Clindamycin)(氯洁霉素(Cleocin))、甲硝哒唑(Metronidazole)头孢曲松(Ceftriaxone)环丙沙星(Ciprofloxacin)头孢吡肟(Cefepime)左氧氟沙星(Levofloxacin)万古霉素(Vancomycin)或所列药物的任何组合。
血管加压剂：实例：去甲肾上腺素(Norepinephrine)、多巴胺(Dopamine)、肾上腺素(Epinephrine)、血管加压素(vasopressin)
类固醇：实例：氢化可的松(Hydrocortisone)、地塞米松(Dexamethasone)或氟氢可的松(Fludrocortisone)，静脉内或另外变力性疗法：实例：用于具有心肌功能异常的败血症患者的多巴酚丁胺(Dobutamine)
重组人经活化蛋白C(rhAPC)，诸如阿法多曲考津(drotrecogin alfa)(活化)(DrotAA)。
β阻断剂另外减轻局部和全身性炎症。
代谢干预诸如丙酮酸盐、丁二酸盐或高剂量胰岛素替代。
与用于败血症的新型潜在疗法进行组合：
sPLA2-IIA的选择性抑制剂(诸如LY315920NA/S-5920)。基本原理：在重度败血症的情况下在炎症期间释放的IIA组分泌性磷酸脂酶A2(sPLA2-IIA)增加，并且血浆水平与存活期逆相关。
磷脂乳液(诸如GR270773)。基本原理：临床前和离体研究显示脂蛋白结合并中和内毒素，并且实验动物研究证明当施用脂蛋白时被保护免遭败血性死亡。内毒素中和与脂蛋白粒子中磷脂的量相关联。
抗TNF-α抗体：基本原理：肿瘤坏死因子-a(TNF-a)诱发在败血症的情况下观察到的许多病理生理性征象和症状。抗CD 14抗体(诸如IC14)：基本原理：上游识别分子如CD 14在发病机理中起关键作用。细菌细胞壁组分结合骨髓细胞上的CD 14和共受体，从而导致细胞活化和产生促炎性介体。已显示抗CD 14单克隆抗体(IC14)会在动物和人内毒素血症模型的情况下降低脂多糖诱导的应答。
Toll样受体(TLR)和它们的下游信号传导路径的抑制剂。基本原理：感染性微生物在它们的表面上显示高度保守的大分子(例如脂多糖、肽聚糖)。当这些大分子由免疫细胞的表面上的样式识别受体(称为Toll样受体[TLR])识别时，宿主的免疫应答被引发。这可促成是败血症的特征的过度全身性炎症性应答。抑制若干TLR正被评估为一种潜在败血症疗法，特别是TLR4，即革兰氏阴性细菌外膜脂多糖或内毒素的受体。靶向TLR4表达和路径的各种药物具有败血症治疗潜力(Wittebole等2010Mediators of Inflammation第10卷文章标识符568396)。在这些药物之中的是靶向TLR4、可溶性TLR4的抗体、士他汀(Statin)(诸如)、氯胺酮(Ketamine)、烟碱酸类似物、依立托伦(eritoran)(E5564)、瑞沙托维(resatorvid)(TAK242)。此外，其它TLR的拮抗剂诸如氯喹(chloroquine)，用中和抗体(抗TLR-2)抑制TLR-2。
通过它对SOCS 1(细胞因子分泌抑制剂)的作用来起效的兰素拉唑(Lansoprazole)、乳铁蛋白(Talactoferrin)或重组人乳铁传递蛋白(Lactoferrin)。基本原理：乳铁传递蛋白是见于分泌物和免疫细胞中的具有抗感染和消炎性质的糖蛋白。乳铁蛋白α(Talactoferrin alfa)作为一种重组形式的人乳铁传递蛋白，具有类似性质，并且在维持胃肠粘膜屏障完整性方面起重要作用。乳铁蛋白在动物败血症模型的情况下以及在临床试验中在患有重度败血症的患者中显示功效(Guntupalli等Crit Care Med.2013；41(3):706-716)。
乳脂肪球EGF因子VIII(MFG-E8)-一种处于凋亡细胞与吞噬细胞之间的桥接性分子，其促进对凋亡细胞的吞噬作用。
‘胆碱能消炎路径’的激动剂，诸如尼古丁(nicotine)和类似物。基本原理：刺激迷走神经会降低细胞因子或免疫系统介体的产生，并且阻断炎症。这个神经“电路”，称为“炎症性反射”，通过从神经末梢释放的乙酰胆碱对在巨噬细胞上表达的烟碱酸乙酰胆碱受体的a7亚单位(a7nAChR)的特定作用来进行，即被称为‘胆碱能消炎路径’的机理。在多种全身性炎症、休克和败血症模型的情况下，通过迷走神经刺激或药理学a7激动剂来活化这个路径会预防组织损伤(Matsuda等2012J Nippon Med Sch.79:4-18；Huston 2012Surg.Infect.13:187-193)。
靶向炎性体路径的治疗剂。基本原理：炎性体路径极大促进在败血症的情况下的炎症性应答，并且关键组成部分负责驱动从局部化炎症向有害高炎症性宿主应答的转变(Cinel和Opal 2009 Crit.Care Med.37:291-304；Matsuda等2012 J Nippon Med Sch.79:4-18)。
干细胞疗法。基本原理：间质干细胞(MSC)通过它们的以下能力来展现多种有益性质：向受损组织归巢，活化驻留干细胞，分泌旁分泌信号以限制全身性和局部炎症性应答，有益调节免疫细胞，通过降低受威胁的组织中的凋亡以及刺激新血管生成来促进组织愈合，并且展现直接抗微生物活性。在败血症动物模型的情况下，这些作用伴有器官功能异常减轻和存活期改进，此已提供MSC可为适用治疗辅助物的证据(Wannemuehler等2012J.Surg.Res.173:113-26)。
本文公开的抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白与其它免疫调节剂诸如免疫刺激性抗体、细胞因子疗法、免疫调节药物进行组合。所述药剂致使免疫应答性增加，尤其在其中免疫防御(先天性和/或适应性)已退化的情形下，诸如在败血症诱导的低炎症性和免疫抑制性情况下。通过加强宿主免疫性的治疗剂来逆转败血症诱导的免疫麻痹可降低继发性感染的发生，并且改进具有经证明免疫抑制的患者的结果(Hotchkiss等2013 LancetInfect.Dis.13:260-268；Payen等2013 Crit Care.17:118)。
免疫刺激性抗体通过直接调节免疫功能，即阻断其它抑制性蛋白质，或通过增强共刺激蛋白质来促进免疫应答。实验性败血症模型已显示由抑制性蛋白质诸如PD-1、PDL-1或CTLA-4的抗体阻断剂达成的免疫刺激使在败血症的情况下的存活期改进(Brahmamdam等2010 J.Leukoc.Biol.88:233-240；Zhang等2010 Critical Care 14:R220；Chang等2013Critical Care 17:R85；Inoue等2011 Shock 36:38-44)，从而指出所述免疫刺激剂作为用于预防败血症诱导的免疫抑制的有害影响的潜在疗法(Goyert和Silver I Leuk.Biol.88(2):225-226,2010)。免疫刺激性抗体包括：1)靶向抑制性免疫检查点的拮抗性抗体，包括抗CTLA4 mAb(诸如易普利单抗、曲美木单抗)、抗PD-1(诸如尼鲁单抗BMS-936558/MDX-1106/ONO-4538、AMP224、CT-011、派姆单抗(lambrozilumab)MK-3475)、抗PDL-1拮抗剂(诸如BMS-936559/MDX-1105、MEDI4736、RG-7446/MPDL3280A)；抗LAG-3诸如IMP-321、抗TIM-3、抗BTLA、抗B7-H4、抗B7-H3、抗VISTA。2)增强免疫刺激性蛋白质的激动性抗体，包括抗CD40mAb(诸如CP-870,893、鲁卡木单抗、达西珠单抗)、抗CD137 mAb(诸如BMS-663513乌瑞鲁单抗、PF-05082566)、抗OX40 mAb(诸如抗OX40)、抗GITR mAb(诸如TRX518)、抗CD27 mAb(诸如CDX-1127)和抗ICOS mAb。
直接刺激免疫效应细胞以及增强免疫应答的细胞因子可与抗GEN抗体组合用于败血症疗法：IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18和IL-21、IL-23、IL-27、GM-CSF、IFNa(干扰素a)、ΠΤΝΓβ、IFNy。基本原理：基于细胞因子的疗法包括直接试图刺激患者的自身免疫系统。实验性败血症模型已显示施用诸如IL-7和IL-15的细胞因子会促进T细胞活力，并且导致在败血症的情况下的存活期改进(Unsinger等2010 J.Immunol.184:3768-3779；Inoue等2010 J.Immunol.184:1401-1409)。干扰素-γ(ΤΡΝγ)在体外逆转败血症诱导的单核细胞免疫麻痹。体内研究显示ΙFΝγ在人中在体内部分逆转免疫麻痹。ΙFΝγ和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)恢复患有败血症的患者的离体刺激的白细胞的免疫能力(Mouktaroudi等Crit Care.2010；14:第17页；Leentjens等Am J Respir Crit CareMed第186卷,第838-845页,2012)。
免疫调节药物诸如胸腺素(thymosin)al。基本原理：胸腺素a 1(Tal)是一种天然存在的胸腺肽，其充当先天性免疫系统与适应性免疫系统两者的内源性调节剂。它在全世界用于治疗与免疫功能异常相关的疾病，包括病毒性感染诸如乙型肝炎和丙型肝炎、某些癌症，以及用于疫苗增强。值得注意的是，在免疫调节研究方面的新近进展已指示Tal治疗在败血症患者中的有益作用(Wu等Critical Care 2013,17:R8)。
在上述败血症疗法中，优选地，患有败血症或由于毒性感染(例如对抗生素或其它药物具有抗性的毒性感染)而处于显现败血症的风险下的受试者将被施用本发明的本文公开的免疫刺激性抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白或抗原结合片段，本文公开的所述抗体或VSIG8融合蛋白拮抗至少一种VSIG8介导的对免疫性的作用，例如它对细胞毒性T细胞或NK活性的抑制作用和/或它对促炎性细胞因子的产生的抑制作用，或抑制VSIG8对Treg的刺激作用，由此促进消减或杀灭受感染细胞或病原体，以及基于由受试者的内源性免疫细胞对病原体或受感染细胞的杀灭增强来潜在导致疾病缓解。因为败血症可快速导致器官衰竭，所以在这个实施方案中，可有益的是施用抗VSIG8抗体片段诸如Fab而非完整抗体，因为它们可比完整抗体更快到达败血症和感染部位。(在所述治疗方案中，由于有时这个疾病的快速致病性，所以抗体半衰期可具有较小重要性)。
抗VSIG8抗体或VSIG融合蛋白和含有其的药物组合物用于降低在基因或细胞疗法或移植之后不合需要的免疫活化的用途
如本文所用，术语“基因疗法”涵盖任何类型的基因疗法、载体介导的基因疗法、基因转移、病毒介导的基因转移。
根据本发明的至少一些实施方案，如本文所述的靶向VSIG8，并且对免疫应答具有抑制活性的VSIG8抗体、其片段、缀合物和/或药物组合物可作为治疗剂用于降低在用于治疗各种遗传疾病的基因疗法之后不合需要的免疫活化。在不希望受单一假设限制下，所述抗体对免疫应答具有VSIG8样抑制活性，和/或增强VSIG8免疫抑制活性，任选通过抑制病原性T细胞和/或NK细胞。
用于治疗遗传疾病的基因疗法产品当前处于临床试验中。新近研究用文件记载使用基因疗法载体对若干遗传疾病的治疗成功。基因疗法策略的特征在于3个关键要素，即待转移的基因、将向其中引入基因的靶标组织和用于促进基因进入靶标组织中的载体(基因递送载体)。绝大多数的基因疗法临床试验已利用病毒载体作为极高效递送载体，包括逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、假型病毒和单纯疱疹病毒。然而，在人免疫系统与基因疗法载体的所有组分之间的相互作用似乎代表对持久治疗功效的一个主要限制。人研究已显示宿主对病毒载体的免疫应答的可能性较高。导致形成中和抗体和/或由细胞毒性细胞破坏经转导细胞的对病毒或转基因产物自身的所述免疫应答可极大干扰治疗功效(Seregin和Amalfitano 2010 Viruses 2:2O13；Mingozzi和High 2013 Blood 122:23；Masat等2013 Discov Med.15:379)。因此，开发用以规避免疫应答以及促进转基因治疗性蛋白质长期表达的策略是基因疗法在临床中取得成功的一个主要挑战。
影响针对由病毒载体编码的转基因蛋白质的免疫应答的因素包括施用途径、载体剂量、转基因蛋白质的免疫原性、宿主的炎症性状况和衣壳血清型。这些因素被认为通过触发先天免疫性、细胞因子产生、APC成熟、抗原递呈以及最终使天然T淋巴细胞致敏成为功能性效应物来影响免疫原性(Mingozzi和High 2013 Blood 122:23)。因此，用以通过干扰这些真正机理来减弱免疫活化的理念已在逻辑上出现，其中目的在于诱导短期免疫抑制，避免在载体施用之后的早期免疫致敏，以及促进长期耐受性。
作为一种用以抑制在基因疗法之后，特别是在多次注射之后不合需要的免疫活化的策略，在动物模型中测试在载体递送时通过靶向免疫应答的两种非冗余检查点来进行的免疫调节治疗。在小鼠或猴中进行的对在腺病毒载体滴注至肺中后载体介导的免疫应答的研究显示用抗CD40L抗体短暂治疗导致抑制腺病毒诱导的免疫应答；因此，动物可用腺病毒载体再次施用。用这个Ab短暂治疗导致对免疫功能的长期作用，并且使对腺病毒特异性体液应答的抑制充分延长超出Ab作用不再显著时所处的时间，从而指出阻断这个共刺激路径作为免疫调节方案来使得能够施用基因转移载体的治疗潜力(Scaria等1997 GeneTher.4:611；Chirmule等2000 J.Virol.74:3345)。其它研究显示大约在初级载体施用时共同施用CTLA4-Ig和抗CD40L Ab使对载体的免疫应答降低，延长长期腺病毒介导的基因表达，并且使得能够进行次级腺病毒介导的基因转移，即使在这些药剂的免疫抑制性作用不再存在之后也是如此，从而指示可有可能用短暂免疫抑制性疗法获得持续性以及次级腺病毒介导的基因转移(Kay等1997 Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:4686)。在另一研究中，类似施用CTLA4-Ig和抗CD40L Ab消除了形成针对载体的中和Ab，并且使得能够进行基因转移表达，条件是在各次基因转移注射期间施用治疗剂(Lorain等2008 Molecular Therapy16:541)。此外，，即使以单次施用来向小鼠施用CTLA4-Ig也导致在早期时间点抑制免疫应答，并且延长转基因表达(Adriouch等2011 Front.Microbiol.2:199)。然而，单独CTLA4-Ig不足以永久消灭针对转基因产物的免疫应答。用CTLA4-Ig和PD-Ll或PDL-2靶向两种免疫检查点的组合治疗导致在较迟时间点协同改进转基因耐受性，可能通过靶向两种非冗余免疫调节机理，从而导致长期转基因持续性和表达(Adriouch等2011 Front.Microbiol.2:199)。
根据本发明的至少一些实施方案，编码如本文所述的可溶性VSIG8蛋白和/或融合蛋白的核酸序列；单独或与另一免疫调节剂组合或与被测试以克服对基因疗法的免疫应答的限制的任何策略和方法组合，可用于降低在基因疗法之后不合需要的免疫活化。
当前方法包括排除具有针对递送载体的抗体的患者；施用高载体剂量；使用空衣壳来吸附抗载体抗体，从而允许随后载体转导；重复血浆交换(血浆除去法)循环以吸附免疫球蛋白并降低抗载体抗体效价。
试图克服这些限制的新型方法可被分成两个大类：选择性修饰Ad载体自身和抢先免疫调节宿主(Seregin和Amalfitano 2010 Viruses 2:2013)。第一种类包含若干创新策略，包括：(1)Ad衣壳展示特异性抑制剂或配体；(2)共价修饰整个Ad载体衣壳部分；(3)使用组织特异性启动子和局部施用途径；(4)使用基因组经修饰Ad；和(5)开发嵌合或替代性血清型Ad。
第二种类的方法包括使用免疫抑制性药物或特定化合物来阻断已知由病毒载体诱导的重要免疫路径。免疫抑制剂已在临床前研究中被测试，并且显示预防或根除对转移载体和转基因产物的免疫应答的功效。这些包括一般性免疫抑制剂，诸如环孢灵A(cyclosporine A)；环磷酰胺；FK506；糖皮质素或类固醇诸如地塞米松；TLR9阻断剂诸如TLR9拮抗剂寡核苷酸ODN-2088；TNF-a阻断剂和抗TNF-a抗体或TNFR-Ig抗体、Erk以及其它信号传导抑制剂诸如U0126。在临床环境中，施用糖皮质素已成功用于钝化在用表达人因子IX转基因的腺病毒相关病毒(AAV)载体向重度乙型血友病患者中进行肝基因转移后针对病毒衣壳的T细胞应答(Nathwani等2011 N.Engl.J.Med.365:2357)。
不同于利用倾向于“整体”和非特异性免疫抑制宿主的药物的先前方法，已开发更具选择性的免疫抑制性方法。这些包括使用提供对诸如CD40与CD 154、ICOS与ICOSL、CD28与CD80或CD86(包括CTLA4-Ig)、NKG2D与NKG2D配体、LFA-1与ICAM、LFA-3与CD2、4-IBB与4-1BBL、OX40与OX40L、GITR与GITRL之间的正性共刺激相互作用的阻断的药剂，以及刺激负性共刺激受体诸如CTLA-4、PD-1、BTLA、LAG-3、TIM-1、TEVI-3、KIR、以及B7-H4和B7-H3的受体的药剂。这些中的一些已用于临床前或临床移植研究中(Pilat等2011 Sem.Immunol.23:293)。
在上述基因或细胞疗法中或在治疗移植适应症时，优选地，得到或将接收细胞或基因疗法或移植组织或器官的受试者将被施用本发明的本文公开的免疫抑制性抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白或抗原结合片段，本文公开的所述抗体或VSIG8融合蛋白增强、激动或模拟至少一种VSIG8介导的对免疫性的作用，例如它对细胞毒性T细胞或NK活性的抑制作用和/或它对促炎性细胞因子的产生的抑制作用，或它对Treg的刺激作用，由此预防或降低宿主针对用于疗法中的细胞或基因的免疫应答或针对移植细胞、器官或组织的非所需免疫应答。优选地，治疗将引发针对移植或输注细胞、组织或器官的延长免疫耐受性。在一些情况下，例如在含有免疫细胞的移植细胞、组织或器官的情况下，可使本文公开的免疫抑制性抗VSIG8抗体或VSIG8融合蛋白或抗原结合片段在输注或移植之前与细胞、组织或器官，和/或可能与移植接受者的免疫细胞接触以使免疫细胞耐受，并且潜在预防非所需免疫应答或GVHD免疫反应。
药物组合物
在另一方面，本发明提供一种含有一种根据本发明的至少一些实施方案的治疗剂或根据本发明的至少一些实施方案的治疗剂的组合的组合物，例如药物组合物。因此，本发明的特征在于一种药物组合物，其包含治疗有效量的根据本发明的至少一些实施方案的治疗剂。
根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物进一步优选用于治疗癌症，其中所述癌症是非转移性的、侵袭性的或转移性的，和/或用于治疗如本文所述的免疫相关病症、感染性病症和/或败血症。
“治疗”是指治疗性治疗与防治性或预防性措施两者。需要治疗者包括已患有病症者以及将预防病症者。因此，本文中待治疗的哺乳动物可已被诊断为患有病症，或可易感于病症或易患病症。出于治疗的目的，“哺乳动物”是指分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和农场动物、以及动物园动物、运动动物或玩赏动物，诸如狗、马、猫、母牛等。优选地，哺乳动物是人。
术语“治疗有效量”是指本发明的药剂的有效治疗哺乳动物的疾病或病症的量。
本发明的治疗剂可单独或作为药物组合物的一部分向受试者提供，在所述药物组合物中，它们与药学上可接受的载体混合。
如果组合物的施用可由接受患者所耐受，那么它被称为“药学上可接受的载体”。如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上可相容的任何和所有溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、经脊柱或经表皮施用(例如通过注射或输注)。
所述组合物包括无菌水、缓冲盐水(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH和离子强度调节剂以及任选地，各添加剂，诸如清洁剂和增溶剂(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80)、抗氧化剂(例如抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)和增积物质(例如乳糖、甘露糖醇)。非水性溶剂或媒介物也可如下所详述加以使用。
可用于根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物中的适合水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适合混合物、植物油(诸如橄榄油)以及可注射有机酯诸如油酸乙酯。适当流动性可例如通过使用包覆物质(诸如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂加以维持。视施用途径而定，活性化合物，即特异性结合任一VSIG8蛋白的单克隆或多克隆抗体和抗原结合片段以及含有其的缀合物和/或替代性骨架，或双特异性分子，可以物质包覆以保护化合物免遭酸和可使化合物失活的其它天然条件的作用。根据本发明的至少一些实施方案的药物化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性，并且不赋予任何非所需毒理学作用的盐(参见例如Berge,S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。所述盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括由无毒无机酸，诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等；以及由无毒有机酸，诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族磺酸和芳族磺酸等获得的那些。碱加成盐包括由碱土金属，诸如钠、钾、镁、钙等；以及由无毒有机胺，诸如Ν,Ν'-二苯甲基乙二胺、N-甲基还原葡糖胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因(procaine)等获得的那些。
根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物也可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、a-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。
这些组合物也可含有佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止存在微生物可通过以下两种方式来确保：上文灭菌程序以及包括各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。也可合乎需要的是将等张剂诸如糖、氯化钠等包括至组合物中。此外，延长可注射药物形式的吸收可通过包括延迟吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶来达成。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。针对药物活性物质使用所述介质和试剂在本领域中是已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则涵盖其用于根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物中。补充性活性化合物也可并入组合物中。
治疗性组合物通常在制造和储存条件下必须无菌且稳定。可将组合物配制成溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其它有序结构。载体可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适合混合物。适当流动性可例如通过使用包覆剂(诸如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂加以维持。在许多情况下，将为优选的是在组合物中包括等张剂例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。延长可注射组合物的吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶来达成。可通过将活性化合物以所需量根据需要与以上列举的一种成分或成分的组合一起并入适当溶剂中，随后进行灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物并入含有基本分散介质和来自以上列举的成分的所需其它成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉剂。
可通过将活性化合物以所需量根据需要与以上列举的一种成分或成分的组合一起并入适当溶剂中，随后进行灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物并入含有基本分散介质和来自以上列举的成分的所需其它成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉剂。
可使用多种本领域中已知的方法中的一种或多种，通过一种或多种施用途径来施用本发明组合物。如将由熟练技术人员所了解，施用途径和/或模式将视所需结果而变化。用于根据本发明的至少一些实施方案的治疗剂的优选施用途径包括血管内递送(例如注射或输注)、静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、经脊柱、口服、经肠、经直肠、经肺(例如吸入)、经鼻、局部(包括经皮、经颊和舌下)、膀胱内、玻璃体内、腹膜内、经阴道、脑递送(例如脑室内、脑内和对流增强扩散)、CNS递送(例如鞘内、脊柱周和脊柱内)或胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内和真皮内)、经粘膜(例如舌下施用)、施用或通过植入物来施用、或其它胃肠外施用途径例如通过注射或输注、或本领域中已知的其它递送途径和/或施用形式。如本文所用的短语“胃肠外施用”意指除经肠和局部施用以外的通常通过注射达成的施用模式，并且包括不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。在特定实施方案中，可腹膜内或静脉内施用根据本发明的至少一些实施方案的蛋白质、治疗剂或药物组合物。
或者，本文公开的VSIG8特异性抗体或VSIG8融合蛋白可通过非胃肠外途径来施用，诸如局部、经表皮或经粘膜施用途径，例如鼻内、口服、经阴道、经直肠、舌下或局部。
可与将保护化合物对抗快速释放的载体一起制备活性化合物，诸如控制释放制剂，包括植入物、经皮贴片和微囊封递送系统。可使用可生物降解的生物可相容聚合物，诸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原蛋白(collagen)、聚原酸酯和聚乳酸。用于制备所述制剂的许多方法受专利权保护或通常为本领域技术人员所知。参见例如Sustained andControlled Release Drug Delivery Systems,J.R.Robinson编,Marcel Dekker,Inc.,New York,1978。
可用本领域中已知的医学装置施用治疗性组合物。举例来说，在一优选实施方案中，可用针皮下注射装置施用根据本发明的至少一些实施方案的治疗性组合物，所述装置诸如美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中公开的装置。用于本发明中的熟知植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其公开一种用于在控制速率下分配药物的可植入微输注泵；美国专利号4,486,194，其公开一种用于穿过皮肤来施用药剂的治疗装置；美国专利号4,447,233，其公开一种用于在精确输注速率下递送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224，其公开一种用于连续药物递送的变流可植入输注装置；美国专利号4,439,196，其公开一种具有多室隔间的渗透药物递送系统；以及美国专利号4,475,196，其公开一种渗透药物递送系统。这些专利以引用的方式并入本文。许多其它所述植入物、递送系统和模块为本领域技术人员所知。
在某些实施方案中，可配制抗VSIG8抗体以确保适当体内分布。举例来说，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水性化合物。为确保根据本发明的至少一些实施方案的治疗性化合物跨越BBB(如果需要)，可将它们例如于脂质体中加以配制。对于制造脂质体的方法，参见例如美国专利号4,522,811；5,374,548；和5,399,331。脂质体可包含一个或多个被选择性转运至特定细胞或器官中，因此增强靶向药物递送的部分(参见例如V.V.Ranade(1989)J.Clin.Pharmacol.29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如属于Low等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(Umezawa等,(1988)Biochem.Biophys.Res.Commun.153:1038)；抗体(P.G.Bloeman等(1995)FEBS Lett.357:140；M.Owais等(1995)Antimicrob.Agents Chemother.39:180)；表面活性蛋白A受体(Briscoe等(1995)Am.JPhysiol.1233:134)；pl20(Schreier等(1994)J.Biol.Chem.269:9090)；也参见K.Keinanen；M.L.Laukkanen(1994)FEBS Lett.346:123；J.J.Killion和I.J.Fidler(1994)Immunomethods 4:273。
在另一实施方案中，本发明的免疫缀合物可用于通过以下方式来使化合物(例如治疗剂、标记、细胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剂等)靶向具有VSIG8细胞表面受体的细胞：使所述化合物连接于本文公开的抗体或VSIG8融合蛋白。因此，本发明也提供用于离体或体内定位表达VSIG8的细胞的方法(例如用可检测标记，诸如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子)。或者，免疫缀合物可用于通过使细胞毒素或放射性毒素靶向VSIG8抗原来杀灭具有VSIG8细胞表面受体的细胞。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上可相容的任何和所有溶剂、分散介质、包覆剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适于静脉内、肌肉内、皮下、胃肠外、经脊柱或经表皮施用(例如通过注射或输注)。视施用途径而定，活性化合物，即含有VSIG8抗原的外结构域的可溶性多肽缀合物、抗体、免疫缀合物、替代性骨架和/或双特异性分子，可以物质包覆以保护化合物免遭酸和可使化合物失活的其它天然条件的作用。根据本发明的至少一些实施方案的药物化合物可包括一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所需生物活性，并且不赋予任何非所需毒理学作用的盐(参见例如Berge,S.M.等(1977)J.Pharm.Sci.66:1-19)。所述盐的实例包括酸加成盐和碱加成盐。酸加成盐包括由无毒无机酸，诸如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、亚磷酸等；以及由无毒有机酸，诸如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代的链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸、脂族磺酸和芳族磺酸等获得的那些。碱加成盐包括由碱土金属，诸如钠、钾、镁、钙等；以及由无毒有机胺，诸如Ν,Ν'-二苯甲基乙二胺、N-甲基还原葡糖胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因等获得的那些。
根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物也可包括药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，诸如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，诸如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基苯甲醚(BHA)、丁基化羟基甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、a-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。可用于根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物中的适合水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(诸如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其适合混合物、植物油(诸如橄榄油)以及可注射有机酯诸如油酸乙酯。适当流动性可例如通过使用包覆物质(诸如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂加以维持。
这些组合物也可含有佐剂，诸如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止存在微生物可通过以下两种方式来确保：上文灭菌程序以及包括各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等。也可合乎需要的是将等张剂诸如糖、氯化钠等包括至组合物中。此外，延长可注射药物形式的吸收可通过包括延迟吸收的试剂诸如单硬脂酸铝和明胶来达成。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。针对药物活性物质使用所述介质和试剂在本领域中是已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则涵盖其用于根据本发明的至少一些实施方案的药物组合物中。补充性活性化合物也可并入组合物中。
治疗性组合物通常在制造和储存条件下必须无菌且稳定。可将组合物配制成成溶液、微乳液、脂质体或适于高药物浓度的其它有序结构。载体可为溶剂或分散介质，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其适合混合物。适当流动性可例如通过使用包覆剂(诸如卵磷脂)，在分散液的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂加以维持。在许多情况下，将为优选的是在组合物中包括等张剂例如糖、多元醇(诸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠。延长可注射组合物的吸收可通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶来达成。可通过将活性化合物以所需量根据需要与以上列举的一种成分或成分的组合一起并入适当溶剂中，随后进行灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物并入含有基本分散介质和来自以上列举的成分的所需其它成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉剂。
可通过将活性化合物以所需量根据需要与以上列举的一种成分或成分的组合一起并入适当溶剂中，随后进行灭菌微滤来制备无菌可注射溶液。通常，通过将活性化合物并入含有基本分散介质和来自以上列举的成分的所需其它成分的无菌媒介物中来制备分散液。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选制备方法是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其产生活性成分加上来自其先前无菌过滤溶液的任何额外所需成分的粉剂。
可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将视所治疗的受试者和特定施用模式而变化。可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将通常是组合物的产生治疗作用的那个量。通常，出自100％，这个量将在约0.01％至约99％的活性成分，优选约0.1％至约70％，最优选约1％至约30％的活性成分的范围内，所述活性成分与药学上可接受的载体组合。
调整剂量方案以提供最优所需响应(例如治疗响应)。举例来说，可施用单次团注，可随时间施用若干分次剂量，或可如由治疗情况的紧急性所指示，按比例降低或增加剂量。尤其有利的是以剂量单位形式配制胃肠外组合物以易于施用和达成剂量均一性。如本文所用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理离散单元；各单元含有被计算以产生所需治疗作用的预定量的活性化合物以及所需药物载体。根据本发明的至少一些实施方案的剂量单位形式的规格由以下支配并且直接取决于以下：(a)活性化合物的独特特征和待实现的特定治疗作用，和(b)混配这种活性化合物以处理在个体中的敏感性的领域中固有的限制。
对于施用本文公开的抗体或VSIG8融合蛋白，剂量在每kg宿主体重约0.0001至100mg，并且更通常是0.01至5mg的范围内。举例来说，剂量可为每kg体重0.3mg，每kg体重1mg，每kg体重3mg，每kg体重5mg，或每kg体重10mg，或在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每周一次，每两周一次，每三周一次，每四周一次，一个月一次，每3个月一次或每3至6个月一次进行施用。用于根据本发明的至少一些实施方案的本文公开的抗体或VSIG8融合蛋白的优选剂量方案包括通过静脉内施用每kg体重1mg或每kg体重3mg，其中使用一种以下给药时程给与本文公开的抗体或VSIG8融合蛋白：(i)每4周，持续6次剂量，接着每3个月；(ii)每3周；(iii)每kg体重3mg，1次，继之以每3周，每kg体重1mg。
在一些方法中，同时施用两种或更多种具有不同结合特异性的单克隆抗体，在所述情况下，施用的各本文公开的抗体或VSIG8融合蛋白的剂量落在所指示范围内。通常在多个时刻施用本文公开的抗体或VSIG8融合蛋白。各单一剂量之间的间隔可为例如每日、每周、每月、每3个月或每年。如通过测量患者中针对靶标抗原的抗体的血液水平所指示，间隔也可为不定期的。在一些方法中，调整剂量以实现约1-1000mug/ml的血浆抗体浓度，而在一些方法中，实现约25-300微克/ml。
或者，治疗剂可以持续释放制剂形式施用，在所述情况下，需要的施用频率较小。剂量和频率视治疗剂在患者中的半衰期而变化。一般来说，人抗体显示最长半衰期，随后是人源化抗体、嵌合抗体和非人抗体。融合蛋白的半衰期可广泛变化。施用剂量和频率可视治疗是防治性的还是治疗性的而变化。在防治性应用中，历经长久时期在相对不频繁间隔下施用相对低剂量。一些患者持续他们的剩余生命持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要在相对短暂间隔下使用相对高剂量直至疾病的进展得以降低或终止，并且优选地，直至患者显示疾病的症状的部分或完全改善。此后，可向患者施用防治性方案。
可改变本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平以便获得活性成分的有效实现就特定患者、组合物和施用模式来说的所需治疗响应而对患者无毒的量。所选剂量水平将取决于多种药物动力学因素，包括所用本发明的特定组合物或其酯、盐或酰胺的活性；施用途径；施用时间；所用特定化合物的排泄速率；治疗的持续时间；与所用特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或物质；所治疗患者的年龄、性别、重量、状况、总体健康状况和先前医疗史；以及医学领域中熟知的类似因素。
根据以下条款来进一步描述本发明的实施方案
条款1.一种化合物，其激动或拮抗VISTA和V-R(VSIG8)的相互作用。
条款2.如条款1所述的化合物，其是特异性结合VSIG8的抗体或抗体片段。
条款3.如条款1所述的化合物，其是激动性抗VSIG8抗体或抗体片段。
条款4.如条款1所述的化合物，其是拮抗性抗VSIG8抗体或抗体片段。
条款5.如条款2、3或4所述的化合物，其是人源化、人、灵长类动物源化或嵌合抗VSIG8抗体或抗体片段。
条款6.如条款5所述的抗体，其包含任选被诱变以消除FcR或补体结合的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区或其片段。
条款7.如条款5所述的抗体，其包含任选被诱变以增强FcR或补体结合的IgG1或IgG3恒定区或其部分。
条款8.如前述条款中任一项所述的化合物，其是Fab、Fab’、scFv或Fab2。
条款9.如条款1所述的化合物，其包含至少一个拷贝的引发对T细胞免疫性的抑制作用的包含VSIG8的细胞外区域的多肽、其片段或所述VSIG8多肽的衍生物，所述衍生物与VSIG8的所述细胞外区域或与SEQ ID NO:1、2或3具有至少80、90、95、96、97、98或99％序列同一性。
条款10.如条款9所述的化合物，其包含至少一个包含人、非人灵长类动物或鼠类VSIG8的整个细胞外区域的多肽。
条款11.如条款9或10所述的化合物，其是融合蛋白。
条款12.如条款11所述的化合物，其是Ig融合蛋白。
条款13.如条款12所述的化合物，其包含任选被诱变以消除FcR或补体结合的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区或其片段。
条款14.如条款12所述的化合物，其包含任选被诱变以增强FcR或补体结合的IgG1或IgG3恒定区或其部分。
条款15.根据条款1至14中任一项所述的化合物，其连接于水溶性聚合物以增加血清半衰期。
条款16.如条款15所述的化合物，其被聚乙二醇化。
条款17.一种分离的复合物，其包含VISTA和VSIG8。
条款18.如条款17所述的复合物，其中所述VISTA和/或VSIG8是寡聚的或多聚的。
条款19.如条款17或18所述的复合物，其被包含在表达VISTA或VSIG8的重组细胞上。
条款20.一种经分离细胞膜，其包含根据条款17、18或19所述的复合物。
条款21.一种抗体或抗体片段，其特异性结合如条款17、18或19所述的VISTA-VSIG8复合物。
条款22.如条款21所述的抗体或抗体片段，其是人、人源化、灵长类动物源化或嵌合抗体或抗体片段。
条款23.如条款21或22所述的抗体片段，其是Fab、Fab’、scFv或Fab2。
条款24.如条款1所述的激动剂或拮抗剂化合物，其是小分子。
条款25.根据前述条款中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其包含任选所含有的一个或多个结构域被缺失的人恒定区例如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4恒定区或其变体。
条款26.根据前述条款中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含含有至少一个增加或降低Fc效应物功能和/或糖基化的突变和/或调节或消除IgG4Fab臂交换的突变的人恒定区。
条款27.根据条款26所述的抗体或其抗原结合片段，其中所述效应物功能包括FcR结合、ADCC活性、CDC活性、脱粒、吞噬作用和细胞因子释放。
条款28.如前述条款中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其选自由以下组成的组：Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab')、F(ab)、Fv或scFv片段和最小识别单元，其任选具有至少1周、2周、3周或1个月的体内半衰期。
条款29.根据以上条款中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其偶联于另一部分，例如治疗性部分、可检测部分或改变(增加或降低)体内半衰期的部分。
条款30.根据以上条款中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其偶联于选自药物、放射性核素、荧光团、酶、毒素或化学治疗剂的治疗剂；和/或选自放射性同位素、金属螯合剂、酶、荧光化合物、生物发光化合物或化学发光化合物的可检测标记。
条款31.根据以上条款中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或VSIG8融合蛋白，其不偶联于任何其它部分。
条款32.根据以上条款中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或VSIG8融合蛋白，其中所述抗体或抗原结合片段偶联于激动或拮抗NK细胞活性，或抑制NK细胞介导的细胞消减，或促进或活化NK细胞介导的细胞消减的另一抗体或抗原结合片段或融合蛋白，例如NK和/或T细胞受体，例如NK细胞受体。
条款33.根据32所述的抗体或其抗原结合片段或VSIG8融合蛋白，其中抑制性NK细胞受体选自由以下组成的组：KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、LILRB 1、NKG2A、NKG2C、NKG2E和LILRB5。并且NK活化性受体选自由以下组成的组：NKp30、NKp44、NKp46、NKp46、NKG2D、KIR2DS4CD2、CD16、CD69、DNAX辅助分子-1(DNAM-1)、2B4、NK1.1；杀伤免疫球蛋白(Ig)样活化性受体(KAR)；ILT/LIR；NKRP-1、CD69；CD94/NKG2C和CD94/NKG2E异二聚体、NKG2D同二聚体KIR2DS和KIR3DS。
条款34.根据前述条款中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其以不超过500nM的结合亲和力(KD)结合人、灵长类动物或鼠类VSIG8，如通过任何本文公开的结合亲和力方法所确定，例如结合亲和力(KD)是约10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、10-12M或更小，如通过任何本文公开的结合亲和力方法所确定。
条款35.根据前述条款中任一项所述的抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白，其中所述抗体或抗原结合片段(1)增强、激动或模拟，或(2)抑制、拮抗或阻断至少一种由VSIG8和VISTA的相互作用引发的对免疫性或对一种或多种类型的免疫细胞的作用。
条款36.如以上条款中任一项所述的拮抗性抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白，其介导至少一种对免疫性的以下免疫刺激作用的任何组合：(i)增加免疫应答，(ii)增加T细胞活化，(iii)增加细胞毒性T细胞活性，(iv)增加NK细胞活性，(v)缓和T细胞抑制，(vi)增加促炎性细胞因子分泌，(vii)增加IL-2分泌；(viii)增加干扰素-γ产生，(ix)增加Th1应答，(x)降低Th2应答，(xi)降低或消除调节性T细胞(Treg)、骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的至少一者的细胞数目和/或活性，(xii)降低调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者的活性，(xiii)降低或消除M2巨噬细胞，(xiv)降低M2巨噬细胞促肿瘤发生活性，(xv)降低或消除N2嗜中性白细胞，(xvi)降低N2嗜中性白细胞促肿瘤发生活性，(xvii)降低对T细胞活化的抑制，(xviii)降低对CTL活化的抑制，(xix)降低对NK细胞活化的抑制，(xx)逆转T细胞耗竭，(xxi)增加T细胞应答，(xxii)增加细胞毒性细胞的活性，(xxiii)刺激抗原特异性记忆应答，(xxiv)引发癌细胞的凋亡或溶解，(xxv)刺激对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制性作用，(xxvi)诱导癌细胞的直接杀灭，(xxvii)增加Thl7活性和/或(xxviii)诱导补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，条件是所述抗体或抗原结合片段可引发(i)-(xxviii)中的一者或多者的相反作用。
条款37.如前述条款中任一项所述的激动性抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白，其介导至少一种以下免疫抑制作用的任何组合：(i)降低免疫应答，(ii)降低T细胞活化，(iii)降低细胞毒性T细胞活性，(iv)降低天然杀伤(NK)细胞活性，(v)降低T细胞活性，(vi)降低促炎性细胞因子分泌，(vii)降低IL-2分泌；(viii)降低干扰素-γ产生，(ix)降低Thl应答，(x)降低Th2应答，(xi)增加调节性T细胞的细胞数目和/或活性，(xii)增加调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者，(xiii)增加调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者的活性，(xiii)增加M2巨噬细胞，(xiv)增加M2巨噬细胞活性，(xv)增加N2嗜中性白细胞，(xvi)增加N2嗜中性白细胞活性，(xvii)增加对T细胞活化的抑制，(xviii)增加对CTL活化的抑制，(xix)增加对NK细胞活化的抑制，(xx)增加T细胞耗竭，(xxi)降低T细胞应答，(xxii)降低细胞毒性细胞的活性，(xxiii)降低抗原特异性记忆应答，(xxiv)抑制细胞的凋亡或溶解，(xxv)降低对细胞的细胞毒性或细胞抑制性作用，(xxvi)降低细胞的直接杀灭，(xxvii)降低Thl7活性和/或(xxviii)降低补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，条件是所述抗VSIG8抗体或所述抗原结合片段可引发(i)-(xxviii)中的一者或多者的相反作用。
条款38.如前述条款中任一项所述的免疫调节抗体或其抗原结合片段，其增加VSIG8和/或VISTA对T细胞免疫性的抑制作用和/或其抑制CTL活性和/或其中CTL活性受抑制包括一种或多种促炎性细胞因子的分泌降低和/或CTL介导的对靶标细胞的杀灭降低和/或CD4+ T细胞活化和/或CD4+ T细胞增殖和/或CD4+ T细胞介导的细胞消减受抑制。
条款39.如前述条款中任一项所述的免疫调节抗体或其免疫调节抗原结合片段或VSIG8融合蛋白，其抑制NK细胞活性和/或NK细胞增殖和/或NK细胞介导的细胞消减。
条款40.如前述条款中任一项所述的免疫调节抗体或其免疫调节抗原结合片段或VSIG8融合蛋白，其通过增强VSIG8和/或VISTA对免疫性的一种或多种作用来促进抗原特异性耐受性或对例如针对移植细胞、组织或器官的抗原特异性免疫应答的延长抑制。
条款41.如前述条款中任一项所述的免疫调节抗体或其免疫调节抗原结合片段或VSIG8融合蛋白，其通过促进VSIG8和/或VISTA对免疫性的一种或多种作用来抑制针对自体抗原、过敏原或炎症性作用物的免疫应答。
条款42.如前述条款中任一项所述的免疫调节抗体或其免疫调节抗原结合片段或VSIG8融合蛋白，其用于抑制针对自体抗原、过敏原或炎症性作用物的免疫应答，和/或用于治疗炎症性疾病或应答，和/或用于治疗自体免疫性疾病，和/或用于减轻或预防移植排斥和/或移植物抗宿主疾病。
条款43.一种药物组合物，其包含至少一种根据以上条款中任一项所述的化合物。
条款44.一种疫苗组合物，其包含至少一种根据以上条款中任一项所述的化合物和抗原。
条款45.一种免疫抑制性疫苗组合物，其包含至少一种根据以上条款中任一项所述的抗体或其抗原结合片段或VSIG8融合蛋白，其中所述组合物中的所述抗体或其抗原结合片段抑制抗原特异性T细胞和/或B细胞免疫性或诱导耐受性。
条款46.如条款45所述的疫苗组合物，其中针对其的免疫性被抑制的抗原是人抗原、肿瘤抗原、感染物抗原、自体抗原或过敏原，例如人抗原、细胞或待向受试者中移植的细胞、组织或器官的抗原、自体抗原、炎症性作用物或过敏原。
条款47.如条款43至46中任一项所述的组合物，其适于通过选自以下的途径来施用：血管内递送(例如注射或输注)、静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、经脊柱、口服、经肠、经直肠、经肺(例如吸入)、经鼻、局部(包括经皮、经颊和舌下)、膀胱内、玻璃体内、腹膜内、经阴道、脑递送(例如脑室内、脑内和对流增强扩散)、CNS递送(例如鞘内、脊柱周和脊柱内)或胃肠外(包括皮下、肌肉内、静脉内和真皮内)、经粘膜(例如舌下施用)、施用或通过植入物来施用、或其它胃肠外施用途径，其中“胃肠外施用”是指除经肠和局部施用以外的施用模式。
条款48.如条款43至47中任一项所述的组合物，其包含至少一种其它活性剂，例如治疗剂或诊断剂，例如另一免疫调节化合物、化学治疗剂、药物、细胞因子、放射性核素和酶。
条款49.如条款43至47中任一项所述的组合物，其包含由靶标细胞(例如肿瘤或受感染细胞)表达的抗原。
条款50.如条款43至49中任一项所述的组合物，其包含另一组合物或与另一组合物一起使用，所述另一组合物含有至少一种选自以下的免疫调节剂：PD-1激动剂和拮抗剂、PD-L1和PD-L2抗体和抗体片段、TLR激动剂、CD40激动剂或拮抗剂、CTLA-4融合蛋白、CD28激动剂或拮抗剂、4-IBB激动剂或拮抗剂、CD27或CD70激动剂或拮抗剂、LAG3激动剂或拮抗剂、TIM3激动剂或拮抗剂、TIGIT激动剂或拮抗剂、ICOS激动剂或拮抗剂、ICOS配体激动剂或拮抗剂。
条款51.一种含有根据前述条款中任一项所述的VSIG8或VSIG8/VISTA激动剂或拮抗剂的组合物用于诊断或治疗使用的治疗和/或诊断方法或用途，所述方法或用途包括向有此需要的受试者施用至少一个剂量或包含治疗或诊断有效量的至少一种根据前述条款中任一项所述的VSIG8或VSIG8/VISTA激动剂或拮抗剂的组合物或根据以上条款中任一项所述的含有其的组合物。
条款52.一种抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或含有其的组合物检测个体是否患有与VSIG8和/或VISTA介导的对免疫性的作用增加或降低相关的病状的诊断方法或用途，其中所述方法或用途包括使来自所述个体的组织样品与根据前述条款中任一项所述的化合物例如抗体或抗原结合片段或组合物接触，以及检测与所述化合物的特异性结合。
条款53.如条款51或52所述的方法或用途，其中疾病选自由癌症、自体免疫性疾病或感染性疾病组成的组。
条款54.如条款51至53中任一项所述的方法或用途，其检测VSIG8或表达的上调和/或VSIG8表达性细胞的数目增加或VSIG8和/或VISTA表达的下调和/或VSIG8和/或VISTA表达性细胞的数目降低。
条款55.一种抗VSIG8抗体或抗原结合片段或含有其的组合物的诊断方法或用途，其包括检测个体是否患有与VSIG8介导的对免疫性的作用增加或降低相关的病状，包括使来自所述个体的组织样品与根据前述条款中任一项所述的抗体或抗原结合片段或组合物接触，其中所述诊断方法在体内进行，包括向受试者施用以根据前述条款中任一项所述的免疫调节抗体或抗原结合片段或组合物，以及检测与其的特异性结合。
条款56.如条款55所述的方法或用途，其中所述疾病选自由癌症、自体免疫性疾病、炎症性病状、过敏性病状或感染性疾病组成的组。
条款57.一种诊断方法或用途，其包括抗VSIG8抗体或抗原结合片段或含有其的组合物，并且所述方法或用途包括诊断受试者的疾病，其中所述疾病选自由癌症、自体免疫性疾病或感染性疾病组成的组，其中所述诊断方法离体或在体内进行，包括接触来自个体的样品，或向所述个体施用根据前述条款中任一项所述的抗体或抗原结合片段或组合物，以及检测如以上条款中任一项所述的免疫分子或抗体与所述受试者的组织的特异性结合。
条款58.如前述条款中任一项所述的诊断方法或用途，其中所述诊断方法或用途在向所述个体施用治疗有效量的根据前述条款中任一项所述的抗体、抗原结合片段或免疫调节多肽或含有其的药物组合物之前进行。
条款59.如前述条款中任一项所述的诊断方法或用途，其中治疗有效量的根据前述条款中任一项所述的抗体、抗原结合片段或免疫调节多肽或含有其的药物组合物仅如果所述个体患有特征在于以下的病状才施用：由患病和/或APC细胞达成的VSIG8和/或VISTA的表达增加和/或表达VSIG8和/或VISTA的患病和/或APC细胞的数目增加，根据0至3的标度，处于至少1。
条款60.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其中在癌细胞、免疫浸润细胞或基质细胞中的一者或多者上检测到VSIG8表达。
条款61.一种抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白的诊断方法或用途，所述方法或用途包括诊断取自受试者的组织样品是否展现与VSIG8表达增加或降低相关的免疫病状，包括(i)使所述样品与根据前述条款中任一项所述的化合物或组合物，或与检测VSIG8表达的核酸接触，和(ii)进行检测VSIG8表达的结合或扩增测定，以及(iii)基于其来诊断所述样品是否来自患有与相关于VSIG8表达增加或降低的免疫病状相关的病状的个体。
条款62.如条款61所述的方法或用途，其中所述免疫病状选自由癌症、自体免疫性疾病、炎症性病状、过敏性病状、感染性疾病或败血症组成的组。
条款63.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其中所述抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白是免疫刺激性抗体或化合物，其介导至少一种对免疫性的以下免疫刺激作用的任何组合：(i)增加免疫应答，(ii)增加T细胞活化，(iii)增加细胞毒性T细胞活性，(iv)增加NK细胞活性，(v)缓和T细胞抑制，(vi)增加促炎性细胞因子分泌，(vii)增加IL-2分泌；(viii)增加干扰素-γ产生，(ix)增加Th1应答，(x)降低Th2应答，(xi)降低或消除调节性T细胞(Treg)、骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的至少一者的细胞数目和/或活性，(xii)降低调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者的活性，(xiii)降低或消除M2巨噬细胞，(xiv)降低M2巨噬细胞促肿瘤发生活性，(xv)降低或消除N2嗜中性白细胞，(xvi)降低N2嗜中性白细胞促肿瘤发生活性，(xvii)降低对T细胞活化的抑制，(xviii)降低对CTL活化的抑制，(xix)降低对NK细胞活化的抑制，(xx)逆转T细胞耗竭，(xxi)增加T细胞应答，(xxii)增加细胞毒性细胞的活性，(xxiii)刺激抗原特异性记忆应答，(xxiv)引发癌细胞的凋亡或溶解，(xxv)刺激对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制性作用，(xxvi)诱导癌细胞的直接杀灭，(xxvii)增加Thl 7活性和/或(xxviii)诱导补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，条件是所述抗VSIG8抗体或抗原结合片段可引发(i)-(xxviii)中的一者或多者的相反作用。
条款64.一种含有抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白的组合物用于诊断或治疗使用的治疗和/或诊断方法或用途，其包括在有此需要的受试者中促进T细胞免疫性或天然杀伤(NK)免疫性和/或抑制Treg或MDSC，其包括施用治疗或诊断有效量的至少一种根据以上条款中任一项所述的抗体、抗原结合片段或含有其的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段抑制、拮抗或阻断具有与SEQ ID NO:1、2或3的多肽至少90％同一的氨基酸序列的VSIG8多肽对免疫性或免疫细胞的至少一种作用。
条款65.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其使用抑制VSIG8和/或VISTA对T细胞免疫性的抑制作用的VSIG拮抗剂。
条款66.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其使用促进CTL活性的VSIG拮抗剂。
条款67.根据条款66所述的方法或用途，其中CTL活性包括分泌一种或多种促炎性细胞因子和/或CTL介导的对靶标细胞的杀灭。
条款68.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其使用促进CD4+ T细胞活化和/或CD4+ T细胞增殖和/或CD4+ T细胞介导的细胞消减的VSIG拮抗剂。
条款69.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其使用促进CD8+ T细胞活化和/或CD8+ T细胞增殖和/或CD8+ T细胞介导的细胞消减的VSIG拮抗剂。
条款70.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其使用增强NK细胞活性的VSIG拮抗剂。
条款71.如条款70所述的方法或用途，其中NK细胞活性增强包括靶标细胞消减和/或促炎性细胞因子释放增加。
条款72.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其使用抑制和/或降低调节性细胞诸如Treg的分化、增殖和/或活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)的分化、增殖、浸润和/或活性的VSIG拮抗剂。
条款73.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其使用抑制和/或降低调节性细胞诸如Treg和MDSC向靶标部位中浸润的VSIG拮抗剂。
条款74.如条款73所述的方法或用途，其中所述靶标部位是移植细胞、组织或器官，或自体免疫、过敏性或炎症性部位或病变。
条款75.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其使用促进NK介导的细胞消减的VSIG拮抗剂。
条款76.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其使用通过抑制VSIG8和/或VISTA对免疫性的一种或多种作用来促进抗肿瘤免疫性的VSIG拮抗剂。
条款77.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其使用用于治疗癌症、败血症或感染性病状或其组合的VSIG拮抗剂。
条款78.一种含有抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白的组合物用于诊断或治疗使用的治疗和/或诊断和/或诊断方法或用途，其包括促进有此需要的受试者中NK或T细胞免疫性，并且其包括施用治疗或诊断有效量的至少一种根据前述条款中任一项所述的抗体、抗原结合片段或含有其的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段抑制具有氨基酸序列SEQ ID NO:1、2或3的多肽(VSIG8)或与所述多肽或与非人VSIG8直系同源物具有至少90％序列同一性的多肽对免疫性或免疫细胞或与人VISTA的至少一种作用。
条款79.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其中所治疗的个体罹患感染性疾病。
条款80.如条款79所述的方法或用途，其中所述感染性疾病由病毒、细菌、寄生虫、线虫、酵母、支原体、真菌或朊病毒引起。
条款81.如条款78或79所述的方法或用途，其中所述感染性疾病由以下引起：逆转录病毒科(Retroviridae)(例如人免疫缺陷病毒，诸如HIV-1或HIV-2，获得性免疫缺陷(AIDS)，也被称为HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV、或HIV-III；和其它分离株，诸如HIV-LP；微小核糖核酸病毒科(Picomaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒、甲型肝炎病毒；肠病毒、人柯萨奇病毒、鼻病毒、埃可病毒)；杯状病毒科(Calciviridae)(例如导致肠胃炎的株系)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如马脑炎病毒、风疹病毒)；黄病毒科(Flaviridae)(例如登革热病毒、脑炎病毒、黄热病毒)；冠状病毒科(Coronaviridae)(例如冠状病毒)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)(例如水泡性口膜炎病毒、狂犬病病毒)；丝状病毒科(Filoviridae)(例如埃博拉病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道融合性病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒)；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如汉坦病毒(Hantaan virus)、布尼亚病毒(bunga virus)、白蛉病毒和纳伊罗病毒(Nairo virus))；沙粒病毒科(Arena viridae)(出血热病毒)；呼肠孤病毒科(Reoviridae)(例如呼肠孤病毒、环状病毒和轮状病毒)；双核糖核酸病毒科(Birnaviridae)；肝脱氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(Parvoviridae)(细小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头状瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多数腺病毒)；疱疹病毒科(Herperviridae)(单纯疱疹病毒(HSV)1和2、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒(CMV)、疱疹病毒)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(Iridoviridae)(例如非洲猪瘟病毒)；未分类病毒(例如海绵状脑病变的病原体、丁型肝炎的作用物、非甲非乙型肝炎的作用物(类别1—内部传递；类别2—肠道外传递(即丙型肝炎)；诺瓦克(Norwalk)和相关病毒，以及星状病毒)以及重度急性呼吸综合征病毒和呼吸道融合性病毒(RSV)、西尼罗河脑炎、冠状病毒感染、鼻病毒感染、流感、登革热、出血热；耳科感染；重度急性呼吸综合征(SARS)、急性发热性咽炎、咽结膜热、流行性角膜结膜炎、婴儿胃肠炎、感染性单核细胞增多症、伯基特淋巴瘤(Burkitt lymphoma)、急性肝炎、慢性肝炎、肝硬化、肝细胞癌、原发性HSV-1感染(儿童龈口炎，成人扁桃体炎和咽炎，角膜结膜炎)、潜伏性HSV-1感染(唇疱疹、感冒疮)、无菌性脑膜炎、巨细胞病毒感染、巨细胞包涵体病、卡波西肉瘤(Kaposi sarcoma)、卡斯尔曼病(Castleman disease)、原发性渗出淋巴瘤、流感、麻疹、脑炎、感染后脑脊髓炎、腮腺炎、增生性上皮病变(普通疣，扁平疣，跖疣和肛门生殖器疣，喉乳头状瘤，疣状表皮发育不良)、哮吼、肺炎、细支气管炎、脊髓灰质炎、狂犬病、细支气管炎、肺炎、德国麻疹、先天性风疹、出血热、水痘、登革热、埃博拉感染、埃可病毒感染、EBV感染、第五病(Fifth Disease)、丝状病毒、黄病毒、手足口病、带状疱疹病毒(带状疱疹)、人乳头状瘤病毒相关的表皮病变，拉沙热(Lassa Fever)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎、副流感病毒感染、副粘病毒、细小病毒B19感染、微小核糖核酸病毒、痘病毒感染、轮状病毒腹泻、风疹、麻疹、水痘、天花感染。
条款82.如条款79或80所述的方法或用途，其中所述感染性疾病是由选自以下的寄生虫引起的寄生虫感染：原虫，诸如阿米巴虫(Amebae)、鞭毛虫、恶性疟原虫、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、纤毛虫、球虫、微孢子虫、孢子虫；蠕虫，线虫(蛔虫)，绦虫(带虫)，吸虫(片形吸虫(Fluke))，节肢动物和称为朊病毒的异常蛋白质。
条款83.如条款79或80所述的方法或用途，其中所述感染性疾病是选自由以下组成的组的由细菌引起的感染性病症和/或疾病：败血症、败血性休克、窦炎、皮肤感染、肺炎、支气管炎、脑膜炎、细菌性阴道病、泌尿道感染(UCI)、细菌性胃肠炎、脓疱病和丹毒、丹毒、蜂窝组织炎、炭疽、百日咳、莱姆病(lyme disease)、布鲁氏杆菌病(Brucellosis)、肠炎、急性肠炎、破伤风、白喉、假膜性结肠炎、气性坏疽、急性食物中毒、厌氧菌性蜂窝织炎、医院感染、腹泻、婴儿脑膜炎、旅行者腹泻、出血性结肠炎、溶血尿毒综合征、兔热病、消化性溃疡、胃和十二指肠溃疡、军团病、庞蒂亚克热(Pontiac fever)、钩端螺旋体病、李氏杆菌病(Listeriosis)、麻风(汉森氏病(Hansen's disease))、结核、淋病、新生儿眼炎、败血性关节炎、脑膜炎球菌疾病包括脑膜炎、沃特豪斯-弗里德里克森综合征(Waterhouse-Friderichsen syndrome)、假单胞菌感染、落基山斑疹热、伤寒型沙门氏菌病、沙门氏菌病伴胃肠炎和小肠结肠炎、杆菌性痢疾/志贺氏菌病、凝固酶阳性葡萄球菌感染:局部皮肤感染包括弥漫性皮肤感染(脓疱病)、深度局部感染、急性感染性心内膜炎、败血病、坏死性肺炎、毒素性病例如中毒性休克综合征和葡萄球菌性食物中毒、膀胱炎、子宫内膜炎、中耳炎、链球菌性咽炎、猩红热、风湿热、产褥热、坏死性筋膜炎、霍乱、瘟疫(包括腺鼠疫和肺鼠疫)、以及由选自但不限于以下的细菌引起的任何感染:幽门螺杆菌(Helicobacter pyloris)、伯氏疏螺旋体(Boreliai burgdorferi)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、分枝杆菌属种(例如结核分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、堪萨斯分枝杆菌、戈登分枝杆菌(M gordonae))、金黄色葡萄球菌、淋病奈瑟氏菌、脑膜炎奈瑟氏菌、单核细胞增多性李斯特菌、化脓性链球菌(A组链球菌)、无乳链球菌(B组链球菌)、链球菌属(草绿色组)、粪链球菌、牛链球菌、链球菌属(厌氧种)、肺炎链球菌、病原性弯曲杆菌属种、肠球菌属种、流感嗜血杆菌、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、白喉棒状杆菌、棒状杆菌属种、红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、产气肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)、多杀性巴斯德菌(Pasteurellamultocida)、拟杆菌属种、核粒梭形杆菌(Fusobacterium nucleatum)、念珠状链杆菌(Streptobacillus moniliformis)、梅毒密螺旋体(Treponema pallidum)、细弱密螺旋体、钩端螺旋体属和伊氏放线菌(Actinomyces israelii)。
条款84.如条款79或80所述的方法或用途，其中所述感染性疾病是选自以下的由真菌引起的感染性病症和/或疾病：过敏性支气管肺曲菌病、曲霉肿、曲霉病、蛙粪霉病(Basidiobolomycosis)、芽生菌病、假丝酵母病、慢性肺曲霉病、壶菌病(Chytridiomycosis)、球孢子菌病、耳霉病(Conidiobolomycosis)、坚黑穗病(大麦)、隐球菌病、皮肤真菌、皮真菌疹(Dermatophytid)、皮肤真菌病、毛内癣菌(Endothrix)、昆虫病原性真菌、兽疫性淋巴管炎、兽疫性溃疡综合征、食道假丝酵母病、毛外癣菌(Exothrix)、真菌血症、组织胞浆菌病、洛博芽生菌病(Lobomycosis)、虫生团孢霉、霉菌病、草莓蛇眼小球壳菌(Mycosphaerella fragariae)、鼓膜霉菌病、副球孢子菌病(Paracoccidioidomycosis)、病原性真菌、青霉病、千溃疡病(Thousand cankers disease)、癣、Zeaspora、接合菌病(Zygomycosis)；选自由以下组成的组但不限于以下的由寄生虫引起的感染性病症和/或疾病：棘阿米巴属、阿米巴病、蛔虫病、钩虫病、异尖线虫病、巴贝虫病、小袋虫病、贝蛔虫病(Baylisascariasis)、芽囊原虫病(Blastocystosis)、牙签鱼(Candiru)、查加斯病(Chagasdisease)、华支睾吸虫病、锥蝇属、球虫目、中华肝片形吸虫、隐孢子虫病、双核阿米巴病(Dientamoebiasis)、裂头绦虫病、肾膨结线虫(Dioctophyme renalis)感染、麦地那龙线虫病(Dracunculiasis)、包虫病(Echinococcosis)、象皮病、蛲虫病、片形吸虫病、姜片虫病、丝虫病、贾第鞭毛虫病、颚口线虫病、膜壳绦虫病、哈尔宗综合征(Halzoun Syndrome)、等孢球虫病、钉螺热(Katayama fever)、利什曼病、淋巴丝虫病、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、原发性阿米巴脑膜脑炎、寄生虫感染性肺炎、并殖吸虫病、疥疮、血吸虫病、昏睡病、类圆线虫病(Strongyloidiasis)、裂头蚴病(Sparganosis)、鼻孢子虫病、河盲症、绦虫病(囊尾蚴病的原因)、弓蛔虫病、弓浆虫病、旋毛虫病、滴虫病、鞭虫病、锥虫病、绦虫感染、新型隐球酵母(Cryptococcus neoformans)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、白色念珠菌(Candida albicans)。
条款85.如条款79至84中任一项所述的方法或用途，其中所述感染性疾病由以下中的任一者引起：乙型肝炎、丙型肝炎、感染性单核细胞增多症、EBV、巨细胞病毒、AIDS、HIV-1、HIV-2、结核、疟疾和血吸虫病。
条款86.根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或组合物或方法或用途，其包括用于治疗细菌性感染、病毒性感染、真菌性感染、寄生虫性感染或败血症的另一治疗剂。
条款87.如前述条款中任一项所述的方法、组合物、抗体或片段或VSIG8融合蛋白或用途，其通过抑制VSIG8和/或VISTA对免疫性的一种或多种作用来促进针对感染物的免疫应答。
条款88.如前述条款中任一项所述的方法、组合物、抗体或片段或VSIG8融合蛋白或用途，其进一步包括一种或多种用于治疗细菌性感染的额外治疗剂。
条款89.如条款88所述的方法、组合物、抗体或片段或用途，其中所述药剂选自由以下组成的组：抗生素，包括氨基糖苷、碳青霉烯、头孢菌素、大环内酯、林可酰胺、硝基呋喃、青霉素、多肽、喹诺酮、磺酰胺、四环素、针对分支杆菌的药物，包括但不限于氯苯吩嗪、环丝氨酸、环丝氨酸、利福布丁、利福喷丁、链霉素，以及其它抗细菌药物，诸如氯霉素、磷霉素、甲硝哒唑、莫匹罗星和磺甲硝咪唑，或其组合。
条款90.如前述条款中任一项所述的方法、组合物、抗体或片段或VSIG8融合蛋白或用途，其进一步包括一种或多种用于治疗病毒性感染的额外治疗剂。
条款91.如条款90所述的方法、组合物、抗体或片段或VSIG8融合蛋白或用途，其中所述药剂选自由以下组成的组：抗病毒药物，诸如奥司他韦(oseltamivir)(商标名称)和扎那米韦(zanamivir)(商标名称)、-金刚烷衍生物-神经氨酸酶抑制剂 核苷酸类似物逆转录酶抑制剂，包括嘌呤类似物鸟嘌呤 和腺嘌呤嘧啶类似物、尿苷 胸腺嘧啶胞嘧啶膦甲酸(Foscarnet)；核苷类似物/NARTI：恩替卡韦(Entecavir)、 核苷酸类似物/NtRTI：替诺福韦(Tenofovir)；核酸抑制剂，诸如干扰素、干扰素α-2b、聚乙二醇干扰素a-2a；抗逆转录病毒药物，包括齐多夫定(zidovudine)、拉米夫定(lamivudine)、阿巴卡韦(abacavir)、洛匹那韦(lopinavir)、利托那韦(ritonavir)、替诺福韦(tenofovir)/恩曲他滨(emtricitabine)、依法韦仑(它们各自单独或呈各种组合)、gp41(恩夫韦地(Enfuvirtide))、蛋白酶抑制剂诸如和 和
条款92.如前述条款中任一项所述的方法、组合物、抗体或片段或VSIG8融合蛋白或用途，其进一步包括一种或多种用于治疗真菌性感染的额外治疗剂。
条款93.如条款92所述的方法、组合物、抗体或片段或VSIG8融合蛋白或用途，其选自由以下抗真菌药物组成的组：多烯抗真菌剂、咪唑、三唑和噻唑抗真菌剂、烯丙胺、棘白菌素或其它抗真菌药物。
条款94.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其中所治疗的个体罹患癌症。
条款95.如条款94所述的方法或用途，其中所述癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、膀胱癌、肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt's lymphoma)、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓性白血病、急性骨髓源性白血病(AML)、慢性骨髓源性白血病、甲状腺癌、甲状腺滤泡癌、骨髓发育不良综合征(MDS)、纤维肉瘤和横纹肌肉瘤、畸胎癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、良性皮肤肿瘤、角化棘皮瘤、肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、食道癌、滤泡性树突细胞癌、精囊肿瘤、表皮癌、脾癌、膀胱癌、头颈部癌、胃癌、肝癌、骨癌、脑癌、视网膜癌、胆管癌、小肠癌症、唾液腺癌、子宫癌、睾丸癌、结缔组织癌、骨髓发育不良、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom's macroglobinaemia)、鼻咽癌、神经内分泌癌、间皮瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤、类癌、输卵管癌、腹膜癌、乳头状浆液性苗勒癌(papillary serous miilleriancancer)、恶性腹水、胃肠基质肿瘤(GIST)、李-弗劳明综合征(Li-Fraumeni syndrome)和冯希佩尔-林道综合征(Von Hippel-Lindau syndrome，VHL)、起因未知的原发性或转移性癌症，其中所述癌症是非转移性的、侵袭性的或转移性的。
条款96.如条款94所述的方法或用途，其中所述癌症选自B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、甲状腺癌、甲状腺滤泡癌、骨髓发育不良综合征(MDS)、纤维肉瘤和横纹肌肉瘤、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、畸胎癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤癌、角化棘皮瘤、间变性大细胞淋巴瘤、食道鳞状细胞癌、肝细胞癌、滤泡性树突细胞癌、肌肉侵袭性癌、精囊肿瘤、表皮癌、视网膜癌、胆管癌、小肠癌、唾液腺癌、结缔组织癌、骨髓发育不良、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、鼻咽癌、神经内分泌癌、骨髓发育不良综合征、间皮瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤、类癌、食管胃癌、输卵管癌、腹膜癌、乳头状浆液性苗勒癌、恶性腹水、胃肠基质肿瘤(GIST)、李-弗劳明综合征和冯希佩尔-林道综合征(VHL)；子宫内膜癌、乳腺癌瘤，优选是导管癌、浸润性导管癌、小叶癌、粘液性腺癌、导管内和侵袭性导管癌和硬癌性腺癌中的任一种，结肠直肠腺癌，优选是不良至充分分化的侵袭性和非侵袭性腺癌、不良至充分分化的盲肠腺癌、充分至不良分化的结肠腺癌、管状腺癌(优选是2级升结肠管状腺癌)、杜克氏分期CI结肠腺癌、侵袭性腺癌、直肠腺癌(优选是3级直肠腺癌、中度分化的直肠腺癌、中度分化的粘液性直肠腺癌)中的任一种；肺癌，优选是充分至不良分化的非小细胞癌、鳞状细胞癌(优选是充分至不良分化的鳞状细胞癌、角质化鳞状细胞癌)、腺癌(优选是不良至充分分化的腺癌、大细胞腺癌)、小细胞肺癌(优选是小细胞肺癌瘤，更优选是未分化的小细胞肺癌瘤)中的任一种；前列腺腺癌，优选是格里森(Gleason)6至9级腺癌、浸润性腺癌、高级前列腺上皮内赘瘤形成、未分化癌中的任一种；胃腺癌，优选是中度分化的胃腺癌；卵巢癌，优选是囊腺癌、浆液性乳头状囊性癌、浆液性乳头状囊性癌、侵袭性浆液性乳头状癌中的任一种；脑癌，优选是星形细胞瘤(条件是它不是2级星形细胞瘤，优选是4级星形细胞瘤)、多形性胶质母细胞瘤中的任一种；肾癌，优选是透明细胞肾细胞癌；肝癌，优选是肝细胞癌(优选是低级肝细胞癌、纤维板层肝细胞癌)中的任一种；淋巴瘤，优选是霍奇金氏淋巴瘤以及高级至低级非霍奇金氏淋巴瘤中的任一种，并且条件是如果所述癌症是脑癌，那么它不是2级星形细胞瘤，并且如果所述癌症是非霍奇金氏淋巴瘤，那么它不是大细胞非霍奇金氏淋巴瘤，并且其中所述癌症是非转移性的、侵袭性的或转移性的。
条款97.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其中相较于正常细胞样品，VSIG8和/或VISTA蛋白的水平升高。
条款98.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其中所治疗的个体罹患以下癌症：其中在肿瘤部位处所含有的所述癌或其它细胞不表达VSIG8和/或VISTA蛋白，或在高于正常的水平下不表达VSIG8和/或蛋白质。
条款99.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其中所治疗的受试者罹患癌症，其中患病细胞、APC、造血细胞、NK细胞、单核细胞、树突细胞、嗜中性白细胞、单核细胞或在疾病部位处的其它免疫细胞例如骨髓抑制细胞表达VSIG8和/或VISTA蛋白。
条款100.根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或组合物或方法或用途，其包括用抗VSIG8抗体或抗原结合片段或含有其的组合物治疗，并且疗法包括以下中的一者或多者：放射疗法、冷冻疗法、抗体疗法、化学疗法、光动力疗法、手术、激素剥夺或与常规药物的组合疗法。
条款101.根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或组合物或方法或用途，其包括用抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或含有其的组合物以及选自由以下组成的组的另一治疗剂治疗：细胞毒性药物、肿瘤疫苗、抗体、肽、肽体、小分子、化学治疗剂、细胞毒性剂和细胞抑制剂、免疫调节剂、干扰素、白介素、免疫刺激性生长激素、细胞因子、维生素、矿物质、芳香酶抑制剂、RNAi、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂和蛋白酶体抑制剂。
条款102.根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或组合物或方法或用途，其包括用抗VSIG8抗体或抗原结合片段或含有其的组合物和同时或依序向受试者施用的另一治疗剂或成像剂与一种或多种增效剂组合进行治疗以获得治疗作用，其中所述一种或多种增效剂选自由以下组成的组：放射疗法、加强抗肿瘤免疫应答的常规/经典抗癌疗法、加强抗肿瘤免疫应答的靶向疗法、靶向免疫抑制性细胞Treg和/或MDSC的治疗剂、免疫刺激性抗体、细胞因子疗法、过继性细胞转移。
条款103.根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或组合物或方法或用途，其中常规/经典抗癌剂选自基于铂的化合物、具有抗癌活性的抗生素、蒽环霉素、蒽二酮、烷化剂、抗代谢剂、抗有丝分裂剂、紫杉烷、类紫杉烷、微管抑制剂、长春花生物碱、叶酸拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、抗雌激素剂、抗雄激素剂、芳香酶抑制剂、GnRh类似物、5a-还原酶的抑制剂、双膦酸盐。
条款104.根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或组合物或方法或用途或VSIG8融合蛋白，其进一步包括基于铂的化合物，诸如奥沙利铂、顺铂、卡铂；具有抗癌活性的抗生素，诸如更生霉素、博莱霉素、丝裂霉素-C、米拉霉素和蒽环霉素，诸如多柔比星、柔红霉素、表柔比星、伊达比星；蒽二酮，诸如米托蒽醌；烷化剂，诸如达卡巴嗪、美法仑、环磷酰胺、替莫唑胺、苯丁酸氮芥、白消安、氮芥、亚硝基脲；抗代谢剂，诸如氟尿嘧啶、雷替曲塞、吉西他滨、胞嘧啶阿拉伯糖苷、羟基脲和叶酸拮抗剂，诸如甲氨蝶呤、三甲氧苄二氨嘧啶、乙胺嘧啶、培美曲塞；抗有丝分裂剂，诸如polo激酶(polokinase)抑制剂和微管抑制剂，诸如紫杉烷和类紫杉烷，诸如太平洋紫杉醇、多西他赛；长春花生物碱，诸如长春新碱、长春花碱、长春地辛、长春瑞滨；拓扑异构酶抑制剂，诸如依托泊苷、替尼泊苷、安吖啶、拓扑替康、伊立替康、喜树碱(camptothecin)；细胞抑制剂，包括抗雌激素剂，诸如他莫昔芬、氟维司群、托瑞米芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、艾多昔芬(iodoxyfene)，抗雄激素剂，诸如比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特和乙酸赛普龙(cyproterone acetate)，孕激素，诸如乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)，芳香酶抑制剂，诸如阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑、依西美坦；GnRH类似物，诸如亮丙瑞林、戈舍瑞林、布舍瑞林、地加瑞克(degarelix)；5a-还原酶的抑制剂，诸如非那雄胺。
条款105.根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或组合物或方法或用途，其进一步包括基于铂的化合物。
条款106.根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或组合物或方法或用途，其进一步包括选自由以下组成的组但不限于以下的靶向疗法：组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂，诸如伏立诺他、罗米地辛、帕比司他、贝利司他、莫西司他、阿贝司他(abexinostat)、恩替司他、瑞米司他、吉维司他、奎司司他(quisinostat)、丁酸钠；蛋白酶体抑制剂，诸如硼替佐米、卡非佐米、双硫仑；mTOR路径抑制剂，诸如坦罗莫司、雷帕霉素、依维莫司；PI3K抑制剂，诸如哌立福辛(perifosine)、CAL101、PX-866、IPI-145、BAY 80-6946；B-raf抑制剂，诸如威罗菲尼、索拉非尼；JAK2抑制剂，诸如来他替尼、帕克替尼；酪氨酸激酶抑制剂(TKI)，诸如埃罗替尼、伊马替尼、舒尼替尼、拉帕替尼、吉非替尼、索拉非尼、尼罗替尼、托西尼布、博舒替尼、来那替尼、瓦他拉尼、瑞戈非尼、卡博替尼；其它蛋白质激酶抑制剂，诸如克唑替尼(crizotinib)；丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂，例如Ras/Raf信号传导抑制剂，诸如法尼基(farnesyl)转移酶抑制剂；丝氨酸蛋白酶例如matriptase、hepsin、尿激酶的抑制剂；细胞内信号传导的抑制剂，诸如替吡法尼、哌立福辛；通过MEK和/或AKT激酶进行的细胞信号传导的抑制剂；极光激酶(aurora kinase)抑制剂，诸如AZD1152、PH739358、VX-680、MLN8054、R763、MP235、MP529、VX-528、AX39459；周期素(Cyclin)依赖性激酶抑制剂，诸如CDK2和/或CDK4抑制剂；包括Bcl-2、Bcl-XL的存活信号传导蛋白的抑制剂，诸如ABT-737；HSP90抑制剂；治疗性单克隆抗体，诸如抗EGFR mAb西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗，抗ERBB2 mAb曲妥珠单抗、帕妥珠单抗，抗CD20 mAb诸如利妥昔单抗、奥法珠单抗、维妥珠单抗以及靶向其它肿瘤抗原的mAb诸如阿来珠单抗、拉贝珠单抗、阿德木单抗、奥戈伏单抗、奥纳珠单抗(onartuzumab)；TRAIL路径激动剂，诸如杜拉乐明(dulanermin)(可溶性rhTRAIL)、阿泊单抗、马帕木单抗、来沙木单抗、可那木单抗、替加珠单抗(tigatuzumab)；抗体片段、双特异性抗体和双特异性T细胞衔接物(BiTE)，诸如卡妥索单抗、兰妥莫单抗；抗体药物缀合物(ADC)和其它免疫缀合物，诸如替坦异贝莫单抗(ibritumomab triuxetan)、托西莫单抗、维多汀布妥昔单抗(brentuximab vedotin)、奥佐米星吉妥单抗(gemtuzumab ozogamicin)、特曲西坦克利维珠单抗(clivatuzumabtetraxetan)、佩姆莫单抗(pemtumomab)、埃姆坦辛曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine)；抗血管生成疗法，诸如贝伐单抗、埃达珠单抗、伏洛昔单抗、雷莫芦单抗、阿柏西普、索拉非尼、舒尼替尼、瑞戈非尼、阿西替尼、尼达尼布、莫替沙尼、帕唑帕尼、西地尼布；金属蛋白酶抑制剂，诸如马立马司他(marimastat)；尿激酶纤维蛋白溶酶原活化因子受体功能的抑制剂；组织蛋白酶(cathepsin)活性的抑制剂。
条款107.根据条款106所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或组合物或方法或用途，所述另一治疗剂是选自以下的另一抗体：西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法珠单抗、维妥珠单抗、阿来珠单抗、拉贝珠单抗、阿德木单抗、奥戈伏单抗、奥纳珠单抗；阿泊单抗、马帕木单抗、来沙木单抗、可那木单抗、替加珠单抗、卡妥索单抗、兰妥莫单抗、替坦异贝莫单抗、托西莫单抗、维多汀布妥昔单抗、奥佐米星吉妥单抗、特曲西坦克利维珠单抗、佩姆莫单抗、埃姆坦辛曲妥珠单抗、贝伐单抗、埃达珠单抗、伏洛昔单抗、雷莫芦单抗、阿柏西普。
条款108.根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或组合物或方法或用途，其进一步包括选自以下的治疗性癌症疫苗：用于发动对肿瘤抗原的免疫原性应答的外源性癌症疫苗(包括蛋白质或肽)、编码肿瘤抗原的重组病毒和细菌载体、编码肿瘤抗原的基于DNA的疫苗、基于靶向树突细胞的蛋白质的疫苗、完整肿瘤细胞疫苗、表达GM-CSF、ICOS和/或Flt3配体的基因经修饰肿瘤细胞、溶瘤性病毒疫苗。
条款109.根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或组合物或方法或用途，其进一步包括选自一种或多种以下细胞因子的细胞因子疗法：诸如IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18和IL-21、IL-23、IL-27、GM-CSF、IFNa(干扰素α)、IFNa-2b、IFNβ、IFNγ，以及它们的不同递送策略。
条款110.根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或组合物或方法或用途，其进一步包括在选自以下的离体处理之后进行的过继性细胞转移疗法：扩增患者自体天然存在的肿瘤特异性T细胞或遗传修饰T细胞以赋予对肿瘤抗原的特异性。
条款111.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其中所述抗VSIG8抗体或抗原结合片段包括免疫抑制性抗体或抗原结合片段，其介导至少一种以下免疫抑制作用的任何组合：(i)降低免疫应答，(ii)降低T细胞活化，(iii)降低细胞毒性T细胞活性，(iv)降低天然杀伤(NK)细胞活性，(v)降低T细胞活性，(vi)降低促炎性细胞因子分泌，(vii)降低IL-2分泌；(viii)降低干扰素-γ产生，(ix)降低Thl应答，(x)降低Th2应答，(xi)增加调节性T细胞的细胞数目和/或活性，(xii)增加调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者，(xiii)增加调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者的活性，(xiii)增加M2巨噬细胞，(xiv)增加M2巨噬细胞活性，(xv)增加N2嗜中性白细胞，(xvi)增加N2嗜中性白细胞活性，(xvii)增加对T细胞活化的抑制，(xviii)增加对CTL活化的抑制，(xix)增加对NK细胞活化的抑制，(xx)增加T细胞耗竭，(xxi)降低T细胞应答，(xxii)降低细胞毒性细胞的活性，(xxiii)降低抗原特异性记忆应答，(xxiv)抑制细胞的凋亡或溶解，(xxv)降低对细胞的细胞毒性或细胞抑制性作用，(xxvi)降低细胞的直接杀灭，(xxvii)降低Thl7活性和/或(xxviii)降低补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，条件是所述抗VSIG8抗体或抗原结合片段可引发(i)-(xxviii)中的一者或多者的相反作用。
条款112.一种含有抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白的组合物用于诊断或治疗使用的治疗和/或诊断方法或用途，其包括在有此需要的受试者中抑制T细胞免疫性或天然杀伤(NK)免疫性和/或促进Treg或MDSC，其包括施用治疗或诊断有效量的至少一种根据以上条款中任一项所述的抗体、抗原结合片段或含有其的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段激动、模拟或促进具有氨基酸序列SEQ ID NO:1、2或3的多肽(VSIG8)或直系同源物对免疫性或免疫细胞的至少一种作用。
条款113.如条款111或112所述的方法或用途，其用于治疗过敏、自体免疫性、移植、基因疗法、炎症或其组合。
条款114.根据前述条款中任一项所述的方法或用途，其中所治疗的个体得到或将接受细胞疗法、基因疗法或移植组织或器官，并且治疗降低或抑制与所述细胞疗法、基因疗法或移植组织或器官相关的不合需要的免疫活化。
条款115.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其中所述抗体或其抗原结合片段或VSIG8融合蛋白是免疫抑制性抗体或片段，其实现以下中的一者或多者：(i)降低免疫应答，(ii)降低T细胞活化，(iii)降低细胞毒性T细胞活性，(iv)降低天然杀伤(NK)细胞活性，(v)降低T细胞活性，(vi)降低促炎性细胞因子分泌，(vii)降低IL-2分泌；(viii)降低干扰素-γ产生，(ix)降低Thl应答，(x)降低Th2应答，(xi)增加调节性T细胞的细胞数目和/或活性，(xii)增加调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者，(xiii)增加调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者的活性，(xiii)增加M2巨噬细胞，(xiv)增加M2巨噬细胞活性，(xv)增加N2嗜中性白细胞，(xvi)增加N2嗜中性白细胞活性，(xvii)增加对T细胞活化的抑制，(xviii)增加对CTL活化的抑制，(xix)增加对NK细胞活化的抑制，(xx)增加T细胞耗竭，(xxi)降低T细胞应答，(xxii)降低细胞毒性细胞的活性，(xxiii)降低抗原特异性记忆应答，(xxiv)抑制细胞的凋亡或溶解，(xxv)降低对细胞的细胞毒性或细胞抑制性作用，(xxvi)降低细胞的直接杀灭，(xxvii)降低Thl7活性和/或(xxviii)降低补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，条件是所述抗VSIG8抗体或抗原结合片段可引发(i)-(xxviii)中的一者或多者的相反作用。
条款116.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其增强、激动或模拟VSIG8和/或VISTA对T细胞或天然杀伤(NK)细胞免疫性的至少一种作用。
条款117.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其增加VSIG8和/或VISTA对T细胞免疫性的抑制作用。
条款118.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其抑制CTL活性。
条款119.如条款118所述的方法或用途，其中CTL活性受抑制包括一种或多种促炎性细胞因子的分泌降低和/或CTL介导的对靶标细胞的杀灭降低。
条款120.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其抑制CD4+ T细胞活化和/或CD4+ T细胞增殖和/或CD4+ T细胞介导的细胞消减。
条款121.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其抑制CD8+ T细胞活化和/或CD8+ T细胞增殖和/或CD8+ T细胞介导的细胞消减。
条款122.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其抑制NK细胞活性。
条款123.如条款122所述的方法或用途，其中NK细胞活性受抑制包括靶标细胞消减和/或促炎性细胞因子释放降低。
条款124.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其促进和/或增加调节性细胞诸如T细胞(Treg)的分化、增殖和/或活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)的分化、增殖、浸润和/或活性。
条款125.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其促进和/或增加调节性细胞诸如Treg或MDSC向疾病部位中浸润。
条款126.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其通过促进VSIG8和/或VISTA对免疫性的一种或多种作用来抑制过敏性、自体免疫或炎症性免疫应答。
条款127.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其通过增强VSIG8和/或VISTA对免疫性的一种或多种作用来促进抗原特异性耐受性或对抗原特异性免疫应答的延长抑制。
条款128.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其引发耐受性或对针对移植细胞、组织或器官的抗原特异性免疫性的延长抑制。
条款129.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其通过促进VSIG8和/或VISTA对免疫性的一种或多种作用来抑制针对自体抗原、过敏原或炎症性作用物的免疫应答。
条款130.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其中所治疗的个体得到或将接受细胞疗法、基因疗法或移植组织或器官，并且治疗降低或抑制与所述细胞疗法、基因疗法或移植组织或器官相关的不合需要的免疫活化。
条款131.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其用于治疗选自以下的炎症性病症或自体免疫病症或与炎症相关的病状：酸倒流/烧心、粉刺、寻常痤疮、过敏和敏感、阿尔茨海默氏病(Alzheimer's Disease)、哮喘、动脉粥样硬化和血管闭塞性疾病，任选是动脉粥样硬化、缺血性心脏病、心肌梗塞、中风、外周血管疾病或血管支架再狭窄，自体免疫性疾病、支气管炎、癌症、心脏炎、白内障、乳糜泻、慢性疼痛、慢性前列腺炎、肝硬化、结肠炎、结缔组织疾病，任选是全身性红斑狼疮、全身性硬化症、多发性肌炎、皮肤肌炎或休格连氏综合征和相关病状，诸如“休格连氏综合征”在本文中包括休格连氏综合征、原发性休格连氏综合征和继发性休格连氏综合征以及与休格连氏综合征相关的病状或并发症中的一者或多者，包括结缔组织疾病，诸如类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮或硬皮病，肺炎、肺纤维化、间质性肾炎、肾过滤器周围的组织的炎症、肾小球性肾炎、肾小管性酸中毒、腕管综合征、外周神经病变、颅侧神经病变、原发性胆汁性硬化(PBC)、肝硬化、食道炎症、胃炎症、胰腺炎症和肝炎症(包括肝炎)、多发性肌炎、雷诺氏现象(Raynaud's phenomenon)、血管炎、自体免疫甲状腺问题、淋巴瘤、角膜疾病、克罗恩氏病、晶体关节病变，任选是痛风、假性痛风、焦磷酸钙沉积疾病，痴呆、皮炎、糖尿病、干眼症、湿疹、水肿、气肿、纤维肌痛、胃肠炎、齿龈炎、肾小球性肾炎、心脏病、肝炎、高血压、过敏、炎症性肠病、炎症性病状，包括创伤或局部缺血的后果、胰岛素抗性、间质性膀胱炎、虹膜睫状体炎、虹膜炎、关节疼痛、关节炎、莱姆病、代谢综合征(综合征X)、多发性硬化症、肌炎、肾炎、肥胖症、眼病，包括葡萄膜炎，骨量减少、骨质疏松、帕金森氏病(Parkinson's Disease)、骨盆炎症性疾病、牙周病、多动脉炎、多软骨炎、风湿性多肌痛、牛皮癣、再灌注损伤、风湿性关节炎、风湿性疾病、类风湿性关节炎、骨关节炎或牛皮癣性关节炎、类风湿性关节炎、类肉瘤病、硬皮病、窦炎、“休格连氏综合征”和与其相关的相关病状或并发症，诸如以下中的一者或多者：休格连氏综合征、原发性休格连氏综合征和继发性休格连氏综合征、与休格连氏综合征相关的病状，包括结缔组织疾病，诸如类风湿性关节炎、全身性红斑狼疮或硬皮病，以及与休格连氏综合征相关的并发症，诸如肺炎、肺纤维化、间质性肾炎、肾过滤器周围的组织的炎症、肾小球性肾炎、肾小管性酸中毒、腕管综合征、外周神经病变、颅侧神经病变、原发性胆汁性硬化(PBC)、肝硬化、食道炎症、胃炎症、胰腺炎症和肝炎症(包括肝炎)、多发性肌炎、雷诺氏现象、血管炎、自体免疫甲状腺问题、淋巴瘤，休格连氏综合征、结肠痉挛、脊椎关节病变，任选是僵直性脊椎炎、反应性关节炎或莱特尔氏综合征(Reiter's Syndrome)，全身性假丝酵母病、肌腱炎、移植排斥、UTI、阴道炎、血管疾病，包括动脉粥样硬化性血管疾病、血管病、多发性结节性动脉炎、韦格纳氏肉芽肿病(Wegener's Granulomatosis)、车格-施特劳斯综合征(Churg-StraussSyndrome)或血管炎。
条款132.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其用于治疗选自以下的自体免疫性疾病或过敏性疾病：急性前葡萄膜炎、急性播散性脑脊髓炎(ADEM)、急性痛风性关节炎、急性坏死性出血性脑白质炎、急性或慢性窦炎、急性化脓性脑膜炎(或其它中枢神经系统炎症性病症)、急性严重炎症、阿狄森氏病(Addison's disease)、肾上腺炎、成人发作型糖尿病(II型糖尿病)、成人发作型特发性甲状旁腺机能减退(AOIH)、无γ球蛋白血症、粒性白细胞缺乏症、血管病，包括血管炎，任选是大血管血管炎，任选是风湿性多肌痛和巨细胞(高安氏(Takayasu's))关节炎，过敏性病状、过敏性接触性皮炎、过敏性皮炎、过敏性肉芽肿性血管炎、过敏性过敏病症、过敏性神经炎、过敏反应、弥漫性脱发、全部脱发、阿尔波特氏综合征(Alport's syndrome)、肺泡炎，任选是过敏性肺泡炎或纤维性肺泡炎，阿尔茨海默氏病、淀粉样变性、肌萎缩性侧索硬化(ALS；路格里克氏病(Lou Gehrig's disease))、嗜酸性粒细胞相关病症，任选是嗜酸粒细胞增多，过敏、僵直性脊椎炎、血管扩张、抗体介导的肾炎、抗GBM/抗TBM肾炎、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、抗磷脂抗体综合征、抗磷脂综合征(APS)、口疮、口疮性口炎、再生障碍性贫血、心律不齐、动脉硬化、动脉硬化性病症、关节炎，任选是类风湿性关节炎诸如急性关节炎或慢性类风湿性关节炎、慢性进行性关节炎、变形性关节炎，蛔虫病、曲霉肿、含有嗜酸性粒细胞的肉芽肿、曲霉病、无精子发生、哮喘、任选是支气管哮喘(asthma bronchiale)、支气管哮喘(bronchialasthma)或自体免疫哮喘，共济失调性毛细血管扩张症、运动失调性硬化、动脉粥样硬化、自闭症、自体免疫血管性水肿、自体免疫再生障碍性贫血、自体免疫萎缩性胃炎、自体免疫糖尿病、睾丸和卵巢的自体免疫性疾病，包括自体免疫睾丸炎和卵巢炎，与胶原性疾病相关的自体免疫病症、自体免疫自主神经异常、自体免疫耳病，任选是自体免疫内耳病(AGED)，自体免疫内分泌疾病，包括甲状腺炎诸如自体免疫甲状腺炎，自体免疫肠病综合征、自体免疫性腺衰竭、自体免疫听力损失、自体免疫溶血、自体免疫肝炎、自体免疫血液学病症、自体免疫高脂质血症、自体免疫免疫缺陷、自体免疫内耳病(AIED)、自体免疫心肌炎、自体免疫嗜中性白细胞减少症、自体免疫胰腺炎、自体免疫多内分泌病变、I型自体免疫多腺性综合征、自体免疫视网膜病变、自体免疫血小板减少性紫癜(ATP)、自体免疫甲状腺疾病、自体免疫荨麻疹、自体免疫介导的胃肠疾病、轴突和神经元神经病变、巴洛病(Balo disease)、贝塞特氏病(Behcet's disease)、良性家族性和缺血再灌注损伤、良性淋巴细胞性血管炎、伯杰氏病(Berger's disease)(IgA肾病变)、养鸟人肺(bird-fancier's lung)、失明、伯克氏病(Boeck's disease)、闭塞性细支气管炎(非移植)相对于NSIP、支气管炎、支气管肺炎曲霉病、布鲁顿氏综合征(Bruton's syndrome)、大疱性类天疱疮、卡普兰氏综合征(Caplan'ssyndrome)、心肌病变、心血管性缺血、卡斯尔曼氏综合征(Castleman's syndrome)、乳糜泻、乳糜泻口炎性腹泻(麸质肠病)、小脑变性、脑缺血和伴随血管化的疾病、查加斯病(Chagas disease)、通道病变，任选是癫痫、CNS的通道病变，脉络膜视网膜炎、脉络膜炎、自体免疫血液学病症、慢性活动性肝炎或自体免疫慢性活动性肝炎、慢性接触性皮炎、慢性嗜酸性球性肺炎、慢性疲劳综合征、慢性肝炎、慢性过敏性肺炎、慢性炎症性关节炎、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病变(CIDP)、慢性难治炎症、慢性皮肤粘膜假丝酵母病、慢性神经病变，任选是IgM多发性神经病变或IgM介导的神经病变，慢性阻塞性气道疾病、慢性肺炎症性疾病、慢性复发性多灶性骨髓炎(CRMO)、慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis))或亚急性甲状腺炎、车格-施特劳斯综合征、瘢痕性类天疱疮/良性粘膜类天疱疮、CNS炎症性病症、CNS血管炎、腹腔疾病、柯根氏综合征(Cogan's syndrome)、冷凝集素疾病、息肉状结肠炎、结肠炎诸如溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)、胶原性结肠炎，涉及T细胞的浸润和慢性炎症性应答的病状、先天性心脏阻滞、先天性风疹感染、库姆斯阳性贫血(Coombs positive anemia)、冠状动脉疾病、柯萨奇心肌炎(Coxsackie myocarditis)、CREST综合征(钙质沉着、雷诺氏现象)、克罗恩氏病、冷球蛋白血症、库兴氏综合征(Cushing's syndrome)、睫状体炎，任选是慢性睫状体炎、异时睫状体炎、虹膜睫状体炎或富克氏睫状体炎(Fuch's cyclitis)，囊性纤维化、细胞因子诱导的毒性、耳聋、退变性关节炎、脱髓鞘性疾病，任选是自体免疫脱髓鞘性疾病、脱髓鞘性神经病变、登革热、疱疹样皮炎和异位性皮炎，皮炎，包括接触性皮炎，皮肤肌炎、伴有急性炎症性组分的皮肤病、德维克氏病(Devic's disease)(视神经脊髓炎)、糖尿病性大动脉病症、糖尿病性肾病变、糖尿病性视网膜病变、戴阿蒙布粒凡贫血(Diamond Blackfananemia)、弥漫性间质性肺纤维化、扩张心肌病变、盘状狼疮、涉及白细胞血细胞渗出的疾病、德雷斯勒氏综合征(Dressler's syndrome)、迪皮特朗氏挛缩(Dupuytren'scontracture)、埃可病毒感染、湿疹，包括过敏性或播散性神经性皮炎，脑炎诸如拉斯穆森氏脑炎(Rasmussen's encephalitis)和边缘和/或脑干脑炎，脑脊髓炎，任选是过敏性脑脊髓炎(allergic encephalomyelitis)或过敏性脑脊髓炎(encephalomyelitis allergica)和实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)，动脉内增生、心内膜炎、内分泌眼病、子宫内膜异位、心内膜心肌纤维化、晶状体过敏性眼内炎、眼内炎、过敏性肠炎、嗜酸粒细胞增多-肌痛综合征、嗜酸性筋膜炎、流行性角膜结膜炎、后天性大疱性表皮松解(EBA)、巩膜外层、上鞏膜炎、艾伯斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)感染、持久性隆起性红斑、多形性红斑、麻风结节性红斑、结节性红斑、胎儿成红细胞增多、食道运动功能障碍、原发性混合冷球蛋白血症、筛骨、埃文氏综合征(Evan's syndrome)、实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)、因子VIII缺乏症、农民肺、风湿热、费尔提氏综合征(Felty's syndrome)、纤维肌痛、纤维性肺泡炎、丝虫病、局灶节段性肾小球硬化症(FSGS)、食物中毒、额叶萎缩、胃萎缩、巨细胞关节炎(颞叶关节炎)、巨细胞性肝炎、巨细胞多肌痛、肾小球肾炎、伴有和不伴有肾病综合征的肾小球性肾炎(GN)诸如慢性或急性肾小球性肾炎(例如原发性GN)，古德帕斯彻氏综合征(Goodpasture'ssyndrome)、痛风性关节炎、粒细胞输注相关的综合征、肉芽肿病，包括类淋巴瘤肉芽肿病，肉芽肿病伴多血管炎(GPA)、肉芽肿性葡萄膜炎、格雷福斯氏病(Grave's disease)、格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome)、滴状牛皮癣、阵发性血红蛋白尿、哈曼-里奇氏病(Hamman-Rich's disease)、桥本氏病、桥本氏脑炎、桥本氏甲状腺炎、血色素沉着病、溶血性贫血或免疫性溶血性贫血，包括自体免疫溶血性贫血(AIHA)，溶血性贫血、甲型血友病、亨诺克-舍恩来因紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、妊娠疱疹、人免疫缺陷病毒(HIV)感染、痛觉过敏、低γ球蛋白血症、性腺低能症、甲状旁腺机能减退、特发性尿崩症、特发性面神经麻痹、特发性甲状腺功能不足、特发性IgA肾病变、特发性膜性GN或特发性膜性肾病变、特发性肾脏综合征、特发性肺纤维化、特发性口炎性腹泻、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、IgA肾病变、IgE介导的疾病，任选是过敏和过敏性或异位性鼻炎，IgG4相关硬化性病、区域性回肠炎(ileitis regionalis)、免疫复合物性肾炎、与由细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性过敏、免疫介导的GN、免疫调节性脂蛋白相关的免疫应答，包括成人或急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，包涵体肌炎、感染性关节炎、归因于抗精子抗体的不育症、全部或部分葡萄膜的炎症、炎症性肠病(IBD)、炎症性过度增生性皮肤疾病、炎症性肌病变、胰岛素依赖性糖尿病(l型)、胰岛炎、间质性膀胱炎、间质性肺病、间质性肺纤维化、虹膜炎、缺血性再灌注病症、关节炎症、青少年关节炎、青少年皮肤肌炎、青少年糖尿病、青少年发作型(I型)糖尿病，包括儿科胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，青少年发作型类风湿性关节炎、川崎综合征(Kawasaki syndrome)、干燥性角膜结膜炎、锥虫病(kypanosomiasis)、兰伯特-伊顿综合征(Lambert-Eaton syndrome)、利什曼病(leishmaniasis)、麻风、白细胞减少、白细胞粘附缺乏症、白细胞破裂性血管炎、白血球减少症、扁平苔癣(lichen planus)、硬化性苔癣、木质性结膜炎、线性IgA皮肤病、线性IgA疾病(LAD)、吕弗勒氏综合征(Loffler's syndrome)、狼疮样肝炎、狼疮(包括肾炎、大脑炎、儿科狼疮、非肾性狼疮、肾外狼疮、盘状狼疮、脱发)、狼疮(SLE)、播散性红斑狼疮、莱姆关节炎(Lyme arthritis)、莱姆病、淋巴性间质性肺炎、疟疾、男性和女性自体免疫不育症、上颌血管血管炎、中等血管血管炎(包括川崎氏病和多发性结节性动脉炎)、膜或膜性增生性GN(MPGN)，包括I型和II型以及快速进行性GN、膜性GN(膜性肾病变)，美尼尔氏病(Meniere's disease)、脑膜炎、显微性结肠炎、显微性多血管炎、偏头痛、最小变化肾病变、混合结缔组织疾病(MCTD)、感染性单核细胞增多症(mononucleosis infectiosa)、慕伦氏溃疡(Mooren's ulcer)、慕夏-哈伯曼病(Mucha-Habermann disease)、多灶性运动神经病变、多内分泌腺衰竭、多器官损伤综合征诸如继发于败血病、创伤或出血的那些，多器官损伤综合征、多发性硬化症(MS)诸如脊髓-视觉MS，多发性硬化症、腮腺炎、肌肉病症、重症肌无力诸如胸腺瘤相关的重症肌无力，重症肌无力、心肌炎、肌炎、嗜睡病、坏死性小肠结肠炎和透壁性结肠炎以及自体免疫炎症性肠病、坏死性血管炎、皮肤血管炎或过敏血管炎、新生儿狼疮综合征(NLE)、肾变病、肾病综合征、神经疾病、视神经脊髓炎(德维克氏病)、视神经脊髓炎、神经性肌强直、嗜中性白细胞减少症、非癌性淋巴细胞增多、非肉芽肿性葡萄膜炎、非恶性胸腺瘤、眼和眼眶炎症性病症、眼瘢痕性类天疱疮、卵巢炎、交感性眼炎(ophthalmia symphatica)、斜视眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)、斜视眼阵挛或斜视眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)和感觉神经病变、视神经炎、肉芽肿性睾丸炎(orchitis granulomatosa)、骨关节炎、复发性风湿病、胰腺炎、全部血球減少症、PANDAS(与链球菌相关的儿科自体免疫神经精神病学病症)、副赘生性小脑变性、副肿瘤综合征、副肿瘤综合征，包括神经副肿瘤综合征，任选是兰伯特-伊顿肌无力综合征或伊顿-兰伯特综合征，寄生虫性疾病诸如利什曼原虫病，阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)、帕里龙伯格综合征(Parry Romberg syndrome)、扁平部睫状体炎(外周葡萄膜炎)、帕森尼奇-特纳综合征(Parsonnage-Turner syndrome)、细小病毒感染、类天疱疮诸如大疱性类天疱疮和皮肤类天疱疮，天疱疮(包括寻常天疱疮)、红斑性天疱疮、落叶状天疱疮、天疱疮粘膜类天疱疮、天疱疮、消化性溃疡、周期性麻痹、外周神经病变、静脉周脑脊髓炎、恶性贫血(perniciousanemia)(恶性贫血(anemia perniciosa))、恶性贫血、晶状体抗原性葡萄膜炎、肺变硬、POEMS综合征、I、II和III型多发性结节性动脉炎、慢性原发性多发性关节炎、多软骨炎(例如难治性或复发的多软骨炎)、多内分泌腺自体免疫性疾病、多内分泌腺衰竭、多腺性综合征，任选是自体免疫多腺性综合征(或多腺性内分泌病变综合征)，风湿性多肌痛、多发性肌炎、多发性肌炎/皮肤肌炎、多发性神经病变、急性多神经根炎(polyradiculitis acuta)、心切开术后综合征、后葡萄膜炎或自体免疫葡萄膜炎、心肌梗塞后综合征、心包切开术后综合征、链球菌感染后肾炎、疫苗接种后综合征、早老性痴呆、原发性胆汁性硬化、原发性甲状腺功能不足、原发性特发性粘液性水肿、原发性淋巴细胞增多，其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多，任选是良性单克隆γ球蛋白病和意义未确定的单克隆γ球蛋白病MGUS，原发性粘液性水肿、原发性进行性MS(PPMS)和复发缓解性MS(RRMS)、原发性硬化性胆管炎、孕酮皮炎、进行性全身性硬化、增生性关节炎、牛皮癣诸如斑块牛皮癣，牛皮癣、牛皮癣性关节炎、肺泡蛋白沉着病、肺浸润嗜酸粒细胞增多、纯红细胞贫血或再生障碍(PRCA)、纯红细胞再生障碍、脓性或非脓性窦炎、脓疱性牛皮癣和甲牛皮癣、肾盂炎、坏疽性脓皮病、奎尔万氏甲状腺炎(Quervain's thyroiditis)、雷诺氏现象、反应性关节炎、反复流产、血压应答降低、反射交感性营养不良、难治性口炎性腹泻、莱特尔氏病(Reiter's disease)或综合征、复发性多软骨炎、心肌或其它组织的再灌注损伤、再灌注损伤、呼吸窘迫综合征、多动腿综合征、视网膜自体免疫性、腹膜后纤维化、雷诺氏综合征(Reynaud's syndrome)、风湿性疾病、风湿热、风湿病、类风湿性关节炎、类风湿性脊椎炎、风疹病毒感染、桑普特氏综合征(Sampter'ssyndrome)、类肉瘤病、血吸虫病、施密特综合征(Schmidt syndrome)、SCID和艾伯斯坦-巴尔病毒相关的疾病、巩膜病、巩膜炎、指硬皮病、硬皮病，任选是全身性硬皮病，硬化性胆管炎、播散性硬化(sclerosis disseminata)、硬化诸如全身性硬化症，感觉神经性听力损失、血清反应阴性脊椎关节炎、席汉氏综合征(Sheehan's syndrome)、舒尔曼氏综合征(Shulman's syndrome)、硅肺病、休格连氏综合征、精子和睾丸自体免疫性、蝶窦炎、史蒂文斯-约翰逊综合症(Stevens-Johnson syndrome)、僵人(stiff-man/stiff-person)综合征、亚急性细菌性心内膜炎(SBE)、亚急性皮肤红斑狼疮、突发性耳聋、苏萨克氏综合征(Susac's syndrome)、西登哈姆氏舞蹈病(Sydenham's chorea)、交感性眼炎、全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus，SLE)或全身性红斑狼疮(lupus erythematodes)、皮肤SLE、全身性坏死性脉管炎、ANCA相关的血管炎，任选是车格-施特劳斯血管炎或综合征(CSS)，脊髓痨、高安氏动脉炎、毛细血管扩张、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、闭塞性血栓性脉管炎(thromboangiitis ubiterans)、血小板减少症，包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)和自体免疫或免疫介导的血小板减少症，诸如特发性血小板减少性紫癜(ITP)，包括慢性或急性ITP，血小板减少性紫癜(TTP)、甲状腺毒症、组织损伤、托洛萨-亨特综合征(Tolosa-Huntsyndrome)、中毒性表皮坏死溶解、中毒性休克综合征、输血反应、婴儿期短暂低γ球蛋白血症、横贯性脊髓炎、横穿脊髓炎、热带性肺嗜酸粒细胞增多、结核、溃疡性结肠炎、未分化结缔组织疾病(UCTD)、荨麻疹，任选是慢性过敏性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹，包括慢性自体免疫荨麻疹，葡萄膜炎、前葡萄膜炎、葡萄膜视网膜炎、瓣炎、血管功能异常、血管炎、脊椎关节炎、水疱大疱性皮肤病、白癜风、韦格纳氏肉芽肿病(肉芽肿病伴多血管炎(GPA))、维斯科特-奥尔德里奇综合症(Wiskott-Aldrich syndrome)或x染色体关联的高IgM综合征。
条款133.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其用于治疗选自由以下组成的组的自体免疫性疾病：多发性硬化症、牛皮癣；类风湿性关节炎；牛皮癣性关节炎、全身性红斑狼疮(SLE)；盘状红斑狼疮、炎症性肠病、溃疡性结肠炎；克罗恩氏病；良性淋巴细胞性血管炎、血小板减少性紫癜、特发性血小板减少症、特发性自体免疫溶血性贫血、纯红细胞再生障碍、休格连氏综合征、风湿性疾病、结缔组织疾病、炎症性风湿病、退变性风湿病、关节外风湿病、青少年类风湿性关节炎、痛风性关节炎(arthritis uratica)、肌肉风湿病、慢性多发性关节炎、冷球蛋白血症性血管炎(cryoglobulinemic vasculitis)、ANCA相关的血管炎、抗磷脂综合征、重症肌无力、自体免疫溶血性贫血、格林-巴利综合征、慢性免疫多发性神经病变、自体免疫甲状腺炎、胰岛素依赖性糖尿病、I型糖尿病、阿狄森氏病、膜性肾小球性肾病、古德帕斯彻氏病(Goodpasture's disease)、自体免疫胃炎、自体免疫萎缩性胃炎、恶性贫血、天疱疮、寻常天疱疮、肝硬化、原发性胆汁性硬化、皮肤肌炎、多发性肌炎、纤维肌炎、肌硬结、乳糜泻、免疫球蛋白A肾病变、亨诺克-舍恩来因紫癜、埃文斯综合征(Evanssyndrome)、皮炎、异位性皮炎、牛皮癣、关节病性牛皮癣、格雷福斯病、格雷福斯眼病、硬皮病、全身性硬皮病、进行性全身性硬皮病、哮喘、过敏、原发性胆汁性硬化、桥本氏甲状腺炎、原发性粘液性水肿、交感性眼炎、自体免疫葡萄膜炎、肝炎、慢性活动肝炎、胶原性疾病、僵直性脊椎炎、肩周炎、结节性全动脉炎(panarteritis nodosa)、假性痛风、韦格纳氏肉芽肿病、显微性多血管炎、慢性荨麻疹、大疱性皮肤病症、类天疱疮、播散性神经性皮炎、儿童期自体免疫溶血性贫血、特发性自体免疫溶血性贫血、难治性或慢性自体免疫血细胞减少症、在获得性甲型血友病的情况下防止产生自体免疫抗因子VIII抗体、冷凝集素疾病、视神经脊髓炎、僵人综合征、齿龈炎、牙周炎、胰腺炎、特发性心包炎、心肌炎、血管炎、胃炎、痛风、痛风性关节炎和炎症性皮肤病症、正常补体血症性荨麻疹性血管炎、心包炎、肌炎、抗合成酶综合征、巩膜炎、巨噬细胞活化综合征、贝塞特氏综合征、PAPA综合征、布劳氏综合征(Blau's Syndrome)、痛风、成人和青少年斯蒂尔氏病(Still's disease)、冷炎素病变、马克尔-韦尔斯综合征(Muckle-Wells syndrome)、家族性寒冷诱发的自体炎症性综合征、新生儿发作型多系统炎症性疾病、家族性地中海热、慢性婴儿神经、皮肤和关节综合征、风湿性疾病、风湿性多肌痛、混合结缔组织疾病、炎症性风湿病、退变性风湿病、关节外风湿病、青少年关节炎、青少年类风湿性关节炎、全身性青少年特发性关节炎、痛风性关节炎、肌肉风湿病、慢性多发性关节炎、反应性关节炎、莱特尔氏综合征、风湿热、复发性多软骨炎、雷诺氏现象、血管炎、冷球蛋白血症性血管炎、颞动脉炎、巨细胞动脉炎、高安动脉炎、贝塞特氏病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病变、自体免疫甲状腺炎、胰岛素依赖性糖尿病、I型糖尿病、阿狄森氏病、膜性肾小球性肾病、多腺自体免疫综合征、古德帕斯彻氏病、自体免疫胃炎、自体免疫萎缩性胃炎、恶性贫血、天疱疮、寻常天疱疮、肝硬化、原发性胆汁性硬化、特发性肺纤维化、肌炎、皮肤肌炎、青少年皮肤肌炎、多发性肌炎、纤维肌炎、肌硬结、乳糜泻、乳糜泻口炎性腹泻皮炎、免疫球蛋白A肾病变、亨诺克-舍恩来因紫癜、埃文斯综合征、异位性皮炎、牛皮癣、寻常性牛皮癣、关节病性牛皮癣、格雷福斯病、格雷福斯眼病、硬皮病、全身性硬皮病、进行性全身性硬皮病、弥漫性硬皮病、局部化硬皮病、Crest综合征、哮喘、过敏性哮喘、过敏、原发性胆汁性硬化、纤维肌痛、慢性疲劳和免疫功能异常综合征(CFIDS)、自体免疫内耳病、高IgD综合征、史尼兹勒氏综合征(Schnitzler's syndrome)、自体免疫视网膜病变、年龄相关的黄斑变性、动脉粥样硬化、慢性前列腺炎、脱发、斑形脱发、全身脱毛、全部脱发、自体免疫血小板减少性紫癜、特发性血小板减少性紫癜、纯红细胞再生障碍和TNF受体相关的周期综合征(TRAPS)。
条款134.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其中诊断和/或治疗与用于治疗免疫相关病状的另一部分组合。
条款135.如条款134所述的方法或用途，其中用于治疗免疫相关病状的所述其它部分选自免疫抑制剂，诸如皮质类固醇、环孢菌素、环磷酰胺、泼尼松、咪唑硫嘌呤、甲氨蝶呤、雷帕霉素、他克莫司、来氟米特(lef unomide)或其类似物；咪唑立宾；霉酚酸；霉酚酸吗啉乙酯；15-脱氧司加林(15-deoxyspergualine)或其类似物；生物制剂，诸如TNF-a阻断剂或拮抗剂或靶向任何炎症性细胞因子的任何其它生物制剂、非类固醇消炎药物/Cox-2抑制剂、羟氯奎、柳氮磺胺吡啶(sulphasalazopryine)、金盐、依那西普、英夫利昔单抗、霉酚酸吗啉乙酯、巴利昔单抗、阿塞西普(atacicept)、利妥昔单抗、癌得星(Cytoxan)、干扰素β-la、干扰素β-lb、乙酸格拉默(glatiramer acetate)、盐酸米托蒽醌(mitoxantronehydrochloride)、阿那白滞素(anakinra)和/或生物物质和/或静脉内免疫球蛋白(IVIG)、干扰素诸如IFN-p-la(和)和IFN-p-lb 乙酸格拉默多肽；那他珠单抗米托蒽醌细胞毒性剂、钙调神经磷酸酶抑制剂例如环孢菌素A(cyclosporin A)或FK506；免疫抑制性大环内酯例如雷帕霉素或其衍生物；例如40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素，淋巴细胞归巢剂例如FTY720或其类似物，皮质类固醇；环磷酰胺；咪唑硫嘌呤(azathioprene)；甲氨蝶呤；来氟米特或其类似物；咪唑立宾；霉酚酸；霉酚酸吗啉乙酯；15-脱氧司加林或其类似物；免疫抑制性单克隆抗体例如针对白细胞受体(例如MHC、CD2、CD3、CD4、CDl la/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40、4-1BB)或它们的配体的单克隆抗体；或其它免疫调节化合物例如CTLA4-Ig(阿巴西普(abatacept)、贝拉西普(belatacept))、CD28-Ig、B7-H4-Ig、或其它共刺激剂或粘附分子抑制剂，例如mAb或低分子量抑制剂，包括LFA-1拮抗剂、选择素拮抗剂和VLA-4拮抗剂或另一免疫调节剂。
条款136.根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或组合物或方法或用途，其包括用于降低在基因疗法之后不合需要的免疫活化的另一部分。
条款137.根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或组合物或方法或用途，其包括用抗VSIG8抗体或抗原结合片段或含有其的组合物与另一治疗剂或疗法组合进行治疗。
条款138.根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或组合物或方法或用途，其进一步包括靶向免疫抑制性细胞Treg和/或MDSC的治疗剂，选自抗有丝分裂药物、环磷酰胺、吉西他滨、米托蒽醌、氟达拉滨、沙利度胺、沙利度胺衍生物、COX-2抑制剂、通过识别Treg细胞表面受体来直接靶向Treg的消减性或杀灭性抗体、抗CD25达利珠单抗、巴利昔单抗、配体定向毒素、地尼白介素(温塔克)-人IL-2和白喉毒素的融合蛋白、或LMB-2-针对CD25的scFv与假单胞菌外毒素之间的融合物、靶向Treg细胞表面受体的抗体、TLR调节剂、干扰腺苷能路径的药剂、外核苷酸酶抑制剂或A2A腺苷受体的抑制剂、TGF-β抑制剂、趋化因子受体抑制剂、视黄酸、全反式视黄酸(ATRA)、维生素D3、磷酸二酯酶5抑制剂、昔多芬、ROS抑制剂和硝基阿司匹林。
条款139.根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或组合物或方法或用途，其进一步包括选自以下的另一抗体：靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中的一者或多者的拮抗性抗体和/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一者或多者的激动性抗体。
条款140.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其包括在治疗之前、同时和/或之后，通过所述个体的细胞来测定VSIG8和/或VISTA蛋白。
条款141.如条款140所述的方法或用途，其中所述方法在治疗之前，任选通过使用检测VSIG8和/或VISTA表达的抗体或核酸来检测由患病细胞和/或正常细胞达成的VSIG8和/或VISTA蛋白的表达。
条款142.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其进一步包括施用或使用另一诊断剂或治疗剂，其可在施用根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或含有其的组合物之前、同时或之后加以施用。
条款143.如条款142所述的方法或用途，其包括施用另一治疗剂。
条款144.如条款143所述的方法或用途，其中其它治疗剂选自药物、另一免疫调节化合物、放射性核素、荧光团、酶、毒素或化学治疗剂；并且可检测剂选自放射性同位素、金属螯合剂、酶、荧光化合物、生物发光化合物或化学发光化合物。
条款145.如前述条款中任一项所述的方法或用途，其进一步包括施用特异性结合NK细胞受体的抗体或其抗原结合片段。
条款146.如条款145所述的方法或用途，其中特异性结合NK细胞受体的所述抗体或其抗原结合片段激动所述NK细胞受体的作用。
条款147.如条款146所述的方法或用途，其中特异性结合NK细胞受体的所述抗体或其抗原结合片段拮抗所述NK细胞受体或抑制NK细胞活性的NK细胞受体的作用。
条款148.如条款147所述的方法或用途，其中所述抑制性NK细胞受体选自由以下组成的组：KIR2DL1、KIR2DL2/3、KIR2DL4、KIR2DL5A、KIR2DL5B、KIR3DL1、KIR3DL2、KIR3DL3、LILRB 1、NKG2A、NKG2C、NKG2E和LILRB5。
条款149.如条款145所述的方法或用途，其中所述NK细胞受体是促进NK细胞活性的NK细胞受体。
条款150.如条款149所述的方法或用途，其中NK细胞活化性受体选自由以下组成的组：NKp30、NKp44、NKp46、NKp46、NKG2D、KIR2DS4CD2、CD 16、CD69、DNAX辅助分子-1(DNAM-1)、2B4、NK1.1；杀伤免疫球蛋白(Ig)样活化性受体(KAR)；ILT/LIR；NKRP-1、CD69；CD94/NKG2C和CD94/NKG2E异二聚体、NKG2D同二聚体KIR2DS和KIR3DS。
条款151.一种用于选择根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原片段或VSIG8融合蛋白或适用于根据前述条款中任一项所述的方法或用途中的抗VSIG8抗体或抗原片段的测定方法，其中所述方法包括(i)获得一种或多种抗体或VSIG8融合蛋白，所述抗体或VSIG8融合蛋白推定结合具有选自SEQ ID NO:1、2或3中的任一者所示的氨基酸序列的序列的VSIG8多肽，或结合具有与所述VSIG8多肽具有至少90％序列同一性的多肽，或结合非人VSIG8直系同源物，或含有至少一个VSIG8表位的其片段或变体，所述片段或变体与所述VSIG8多肽或与非人VSIG8直系同源物具有至少90％同一性，(ii)确定所述抗体或抗原结合片段是否特异性结合所述VSIG8多肽，(ii)确定所述抗体或抗原结合片段是否调节(激动或拮抗)VSIG8对免疫性的至少一种作用，和(iv)如果(ii)和(ii)得以满足，那么选择所述抗体作为潜在用于根据前述条款中任一项所述的方法或用途中的抗体。
条款152.如条款151所述的方法，如果所述抗体或抗原结合片段不是人或非人灵长类动物抗体或其片段，那么其进一步包括人源化、灵长类动物源化或嵌合化。
条款153.如条款151或152所述的方法，其中用于获得所述抗体或抗原结合片段的免疫原包含具有选自SEQ ID NO:1、2和3中的任一者所示的氨基酸序列的序列的VSIG8多肽，或与所述VSIG8多肽具有至少90％序列同一性的结合性多肽，或结合性非人VSIG8直系同源物或非人VSIG8直系同源物的相同区域，或含有至少一个VSIG8表位的其片段或变体。
条款154.如条款151至153中任一项所述的方法，其中用于获得所述抗体或抗原结合片段的免疫原包含具有选自SEQ ID NO:1、2和3中的任一者所示的氨基酸序列的序列的VSIG8多肽，或与所述VSIG8多肽具有至少90％序列同一性的结合性多肽，或hVSIG8的非人直系同源物的相同结合性区域。
条款155.如条款151至154中任一项所述的方法，其中用于获得所述抗体或其抗原结合片段的免疫原由具有SEQ ID NO:1、2和3中的任一者所示的氨基酸序列的多肽，或与所述多肽具有至少90％序列同一性的结合性多肽，或非人VSIG8直系同源物的相同结合性区域，或不含有所述VSIG8多肽的任何另一部分的其缀合物组成。
条款156.如条款151至155中任一项所述的方法，其中步骤(iii)检测所述抗VSIG8抗体或抗原结合片段是否拮抗VSIG8和/或VISTA对免疫性的至少一种作用。
条款157.如条款151至156中任一项所述的方法，其中步骤(iii)检测所述抗VSIG8抗体或抗原结合片段是否激动VSIG8和/或VISTA对免疫性的至少一种作用。
条款158.如条款151至157中任一项所述的方法，其中所选抗体或VSIG8融合蛋白被证明介导至少一种以下作用：(i)增加免疫应答，(ii)增加T细胞活化，(iii)增加细胞毒性T细胞活性，(iv)增加NK细胞活性，(v)缓和T细胞抑制，(vi)增加促炎性细胞因子分泌，(vii)增加IL-2分泌；(viii)增加干扰素-γ产生，(ix)增加Thl应答，(x)降低Th2应答，(xi)降低或消除调节性T细胞(Treg)、骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的至少一者的细胞数目和/或活性，(xii)降低调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者的活性，(xiii)降低或消除M2巨噬细胞，(xiv)降低M2巨噬细胞促肿瘤发生活性，(xv)降低或消除N2嗜中性白细胞，(xvi)降低N2嗜中性白细胞促炎性活性，(xvii)降低对T细胞活化的抑制，(xviii)降低对CTL活化的抑制，(xix)降低对NK细胞活化的抑制，(xx)逆转T细胞耗竭，(xxi)增加T细胞应答，(xxii)增加细胞毒性细胞的活性，(xxiii)刺激抗原特异性记忆应答，(xxiv)引发癌细胞的凋亡或溶解，(xxv)刺激对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制性作用，(xxvi)诱导癌细胞的直接杀灭，(xxvii)增加Thl 7活性和/或(xxviii)诱导补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，条件是所述抗VSIG8抗体或抗原结合片段可引发(i)-(xxviii)中的一者或多者的相反作用。
条款159.如前述条款中任一项所述的方法，其中所选抗体或VSIG8融合蛋白被证明介导至少一种以下作用：(i)降低免疫应答，(ii)降低T细胞活化，(iii)降低细胞毒性T细胞活性，(iv)降低天然杀伤(NK)细胞活性，(v)降低T细胞活性，(vi)降低促炎性细胞因子分泌，(vii)降低IL-2分泌；(viii)降低干扰素-γ产生，(ix)降低Thl应答，(x)降低Th2应答，(xi)增加调节性T细胞的细胞数目和/或活性，(xii)增加调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者，(xiii)增加调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者的活性，(xiii)增加M2巨噬细胞，(xiv)增加M2巨噬细胞活性，(xv)增加N2嗜中性白细胞，(xvi)增加N2嗜中性白细胞活性，(xvii)增加对T细胞活化的抑制，(xviii)增加对CTL活化的抑制，(xix)增加对NK细胞活化的抑制，(xx)增加T细胞耗竭，(xxi)降低T细胞应答，(xxii)降低细胞毒性细胞的活性，(xxiii)降低抗原特异性记忆应答，(xxiv)抑制细胞的凋亡或溶解，(xxv)降低对细胞的细胞毒性或细胞抑制性作用，(xxvi)降低细胞的直接杀灭，(xxvii)降低Thl7活性和/或(xxviii)降低补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，条件是所述抗VSIG8抗体或抗原结合片段可引发(i)-(xxviii)中的一者或多者的相反作用。
条款160.如条款149至159中任一项所述的方法，其中所选抗体或VSIG8融合蛋白激动或拮抗VSIG8和/或VISTA对T细胞活性、NK细胞活性和/或一种或多种促炎性细胞因子的产生的作用。
条款161.如条款149至160中任一项所述的方法，其中所选抗体或VSIG8融合蛋白被证明与VISTA竞争结合人或啮齿动物VSIG8。
条款162.根据前述条款中任一项所述的免疫调节抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或含有其的药物或诊断组合物。
条款163.一种根据前述条款中任一项所述的免疫调节抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或含有其的药物或诊断组合物的用途，其用于治疗或诊断选自癌症、感染、败血症、自体免疫性、炎症、过敏性病状或其它免疫病状的疾病，或用以抑制对细胞或基因疗法治疗或移植细胞、组织或器官的非所需免疫反应。
条款164.一种移植疗法，其包括将细胞、组织或器官移植至接受者中，其中在将所述细胞、组织或器官输注或移植至所述接受者中之前使用含有根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或组合物的组合物离体处理所述细胞、组织或器官。
条款165.如条款164所述的方法，其中所述组合物包含供给者和/或移植接受者的免疫细胞。
条款166.如条款164或165所述的方法，其中所述移植细胞、组织或器官包括骨髓、其它淋巴样细胞或组织或干细胞。
条款167.一种核酸，其编码根据前述条款中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗体片段的可变重区多肽和/或轻区多肽，或含有所述其的载体或病毒。
条款168.一种经分离或重组细胞，其包含至少一种根据条款167所述的核酸或载体或病毒。
条款169.如条款168所述的细胞，其选自杂交瘤和重组细菌、酵母或真菌、哺乳动物、昆虫、两栖动物、爬行动物、植物和禽类细胞或卵。
条款170.一种产生抗VSIG8抗体或抗体片段的方法，其通过培养根据条款169所述的经分离或重组细胞来达成。
条款171.如条款170所述的方法，其中所述细胞是细菌、酵母、真菌、昆虫、植物、爬行动物、哺乳动物细胞或禽类卵。
条款172.一种体外或体内方法，其使用根据前述条款中任一项所述的拮抗剂化合物来抑制VISTA和VSIG8的相互作用。
条款173.一种体外或体内方法，其使用根据前述条款中任一项所述的拮抗剂化合物来抑制VISTA和/或VSIG8对免疫细胞或免疫性的抑制作用。
条款174.如条款172或173所述的方法，其抑制或阻断VISTA和/或VSIG8对T细胞活化、T细胞增殖或细胞因子产生或对骨髓树突细胞的抑制作用。
条款175.如条款172或173所述的方法，其抑制或阻断VISTA对T抑制(Tsup)细胞的促进作用。
条款176.如条款172至175中任一项所述的方法，其用于治疗癌症或感染性疾病。
条款177.如条款176所述的方法，其中所述癌症是实体肿瘤例如肉瘤、癌瘤或淋巴瘤，或血液癌症。
条款178.如条款176所述的方法，其中所述感染性疾病是病毒性、细菌性、原虫、酵母、真菌性或寄生虫性疾病。
条款179.一种方法，其使用根据前述条款中任一项所述的激动剂化合物来增强VISTA和VSIG8的相互作用。
条款180.如条款179所述的方法，其增强或促进VISTA对T细胞活化、增殖或细胞因子产生的抑制作用。
条款181.如条款178或179所述的方法，其用于治疗自体免疫病状、过敏性病状或炎症性病状。
条款182.根据前述条款中任一项所述的化合物，其连接于可检测标记。
条款183.一种诊断性或治疗性组合物，其包含诊断或治疗有效量的根据前述条款中任一项所述的化合物。
条款184.如条款183所述的组合物，其适于在人疗法中使用。
条款185.如条款184所述的组合物，其是可静脉内、皮下或肌肉内施用的组合物。
条款186.根据前述条款中任一项所述的方法，其进一步包括施用PD-1或PD-L1激动剂或拮抗剂。
条款187.如条款186所述的方法，其中所述PD-1或PD-L1激动剂或拮抗剂选自抗PD-1抗体或抗体片段、抗PD-L1抗体或抗体片段、可为单价或多聚的PD-L1多肽或其片段、可为单价或多聚的PD-1多肽或其片段、或包含任何前述各物的复合物或融合蛋白。
条款188.一种方法，其使免疫细胞与根据前述条款中任一项所述的激动剂或拮抗剂化合物接触。
条款189.如条款188所述的方法，其中将所述经接触细胞输注至人受试者中。
条款190.如条款188或189所述的方法，其中所述受试者患有癌症或感染性疾病。
条款191.如条款188或189所述的方法，其中所述受试者患有炎症性病状、过敏性病状或自体免疫病状。
条款192.一种筛选测定，其包括单独使用VSIG8或与VSIG8联合使用以鉴定VSIG8/VISTA激动剂或拮抗剂。
条款193.如条款192所述的测定，其是鉴定结合VSIG8以及抑制VSIG8/VISTA相互作用的化合物的结合测定。
条款194.如条款192所述的测定，其是鉴定结合VSIG8以及增强VSIG8/VISTA相互作用的化合物的结合测定。
条款195.如条款192所述的测定，其是筛选抑制VISTA/VSIG8相互作用对T细胞免疫性或细胞因子产生的作用的化合物的功能性测定。
条款196.如条款192至195所述的测定，其是筛选增强VISTA/VSIG8相互作用对T细胞免疫性或细胞因子产生的作用的化合物的功能性测定。
条款197.如条款192至196中任一项所述的测定，其使用人或啮齿动物免疫细胞。
条款198.如条款192至196中任一项所述的测定，其使用表达人VISTA和/或人VSIG8的转基因动物。
条款199.如条款192至198所述的测定，其是高通量筛选测定。
条款200.如前述条款中任一项所述的化合物或方法，其中所述VSIG8是人、鼠类或非人灵长类动物VSIG8蛋白。
条款201.一种包含VSIG8ECD的片段的经分离多肽，其中所述片段基本上由以下组成或由以下组成：如SEQ ID NO:1、2或3中的任一者所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与所述氨基酸序列具有至少80、85、90、95、96、97、98或99％序列同一性。
条款202.如条款201所述的经分离多肽，其包含2-10个所述VSIG8ECD多肽片段。
条款203.根据条款201或202所述的经分离多肽，其中所述片段由异源性接头间插，其中所述接头不是VSIG8多肽的片段。
条款204.如条款203所述的经分离肽，其中所述接头直接或间接缀合于所述片段。
条款205.如条款202、203或204所述的经分离多肽，其中所述接头是氨基酸间隔体。
条款206.如条款205所述的经分离肽，其中所述氨基酸间隔体具有足够长度的氨基酸残基以使不同片段可成功结合它们的个别靶标。
条款207.如条款205或206所述的经分离多肽，其中所述接头是包含5-50个氨基酸残基，更优选5-25个氨基酸残基的肽。
条款208.如条款207所述的经分离肽，其中所述接头是包含5-15个氨基酸残基的肽。
条款209.如条款205至208中任一项所述的经分离多肽，其中所述接头包含甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸残基，或基本上由甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸残基组成，或主要(至少50、60、70或80％的残基)由甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸残基组成。
条款210.如条款205至209中任一项所述的经分离肽，其中所述接头包含至少4-40、4-30、4-20或4-12个甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸残基。
条款211.一种融合蛋白，其包含如前述条款中任一项所述的经分离多肽或接合于异源性多肽和/或半衰期延长部分的SEQ ID NO 1、2或3，条件是所述异源性多肽或所述半衰期延长部分不是VSIG8多肽的片段。
条款212.根据条款211所述的融合蛋白，其中所述经分离多肽和所述异源性分子由异源性接头间插，条件是所述接头不包括是VSIG8多肽的片段的多肽。
条款213.如条款212所述的融合蛋白，其中所述接头直接或间接缀合于所述片段。
条款214.如条款212或213所述的融合蛋白，其中所述接头是氨基酸间隔体。
条款215.如条款214所述的融合蛋白，其中所述氨基酸间隔体具有足够长度的氨基酸残基以使不同片段可成功结合它们的个别靶标。
条款216.如条款214或215所述的融合蛋白，其中所述接头是包含5-50个氨基酸残基，更优选5-25个氨基酸残基的肽。
条款217.如条款216所述的融合蛋白，其中所述接头是包含5-15个氨基酸残基的肽。
条款218.如条款214至217中任一项所述的融合蛋白，其中所述接头包含甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸残基，或基本上由甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸残基组成，或主要(至少50、60、70或80％的残基)由甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸残基组成。
条款219.如条款214至218中任一项所述的融合蛋白，其中所述接头包含至少4-40、4-30、4-20或4-12个甘氨酸、丝氨酸和/或丙氨酸残基。
条款220.如以上条款中任一项所述的融合蛋白，其包含或进一步包含半衰期延长部分。
条款221.根据条款214至220中任一项所述的融合蛋白，其中所述半衰期延长部分包括聚乙二醇(PEG)、单甲氧基PEG(mPEG)、XTEN分子、rPEG分子、纤维连接蛋白、血清白蛋白、人血清白蛋白、免疫球蛋白恒定区或其片段或酰基。
条款222.根据条款214至221中任一项所述的融合蛋白，其中添加所述异源性多肽、半衰期延长部分或其它异源性分子使所述融合蛋白相较于不具有这种所述异源性多肽、半衰期延长部分或其它异源性分子的相同分子，体内半衰期增加至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约10倍或更多。
条款223.根据前述条款中任一项所述的融合蛋白，其包含免疫球蛋白分子或其片段。
条款224.根据条款214所述的融合蛋白，其中至少一种异源性多肽是包含重链和/或轻链Cm和Cm结构域的人或非人免疫球蛋白Fc多肽或片段。
条款225.如条款214或215所述的融合蛋白，其中至少一种异源性多肽是包含重链Cm和Cm结构域的人或非人免疫球蛋白Fc多肽或片段。
条款226.根据条款214至216中任一项所述的融合蛋白，其包含重链和/或轻链CHI结构域。
条款227.根据条款214至216中任一项所述的融合蛋白，其缺乏重链和/或轻链CHI结构域。
条款228.根据条款214至218中任一项所述的融合蛋白，其缺乏重链CHI结构域。
条款229.如以上条款中任一项所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子或其片段包含铰链区。
条款230.如条款229所述的融合蛋白，其中所述铰链区是完整铰链区。
条款231.如以上条款中任一项所述的融合蛋白，其中所述免疫球蛋白分子或其片段的特征不在于铰链区。
条款232.根据前述条款中任一项所述的融合蛋白，其包含人免疫球蛋白分子或其片段。
条款233.如前述条款中任一项所述的融合蛋白，其中所述异源性多肽包含以下或由以下组成：免疫球蛋白重链恒定区的Fc片段。
条款234.如前述条款中任一项所述的融合蛋白，其中所述异源性多肽包含以下或由以下组成：人免疫球蛋白重链恒定区的Fc片段和铰链区。
条款235.如前述条款中任一项所述的融合蛋白，其包含源于选自由IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgE、IgA和IgD组成的组的免疫球蛋白同种型的免疫球蛋白重链恒定区。
条款236.如前述条款中任一项所述的融合蛋白，其包含选自由人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4组成的组的人免疫球蛋白重链恒定区。
条款237.如前述条款中任一项所述的融合蛋白，其包含小鼠IgGl、IgG2a或IgG2b免疫球蛋白重链恒定区或其片段。
条款238.如前述条款中任一项所述的融合蛋白，其包含含有至少一个改变效应物功能和/或糖基化的突变的免疫球蛋白Fc区。
条款239.如条款238所述的融合蛋白，其中所述效应物功能选自FcR结合、补体结合、ADCC活性、CDC活性、脱粒、吞噬作用和/或细胞因子释放。
条款240.根据以上条款中任一项所述的融合蛋白，其中异源性序列包含特异性结合靶标细胞的至少一部分免疫球蛋白分子或包含特异性结合靶标细胞的另一部分。
条款241.根据条款41所述的融合蛋白，其中所述靶标细胞是癌性细胞、免疫细胞、感染物细胞、受感染细胞、免疫细胞、炎症性细胞、疾病部位或待向人接受者中移植的细胞。
条款242.如条款241所述的融合蛋白，其中所述感染物细胞选自由病毒、细菌、支原体、真菌、酵母或寄生虫组成的组。
条款243.如条款240或241所述的融合蛋白，其中所述受感染细胞被选自由病毒、细菌、支原体、真菌、酵母或寄生虫组成的组的感染物感染。
条款244.如以上条款中任一项所述的融合蛋白，其中至少一种异源性多肽是受体、激素、细胞因子、抗原、B细胞靶标、NK细胞靶标、T细胞靶标、TNF受体超家族成员、刺猬因子家族成员、受体酪氨酸激酶、蛋白聚糖相关的分子、TGF-β超家族成员、Wnt相关的分子、受体配体、树突细胞靶标、骨髓细胞靶标、单核细胞/巨噬细胞靶标或血管生成靶标。
条款245.如条款244所述的融合蛋白，其中所述抗原是肿瘤抗原、自体抗原、过敏原或感染物抗原。
条款246.如以上条款中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少一种异源性多肽包括免疫调节多肽。
条款247.如条款244至246中任一项所述的融合蛋白，其中所述T细胞靶标选自由以下组成的组：2B4/SLAMF4、IL-2 Ra、4-1BB/TNFRSF9、IL-2R、ALCAM、B7-1/CD80、IL-4R、B7-H3、BLAME/SLAMF8、BTLA、IL-6R、CCR3、IL-7 Ra、CCR4、CXCRl/IL-8 RA、CCR5、CCR6、IL-10 Ra、CCR7、IL-10 Rβ、CCR8、IL-12 R i、CCR9、IL-12 Rβ2、CD2、IL-13Ral、IL-13、CD3、CD4、ILT2/CD85j、ILT3/CD85k、ILT4/CD85d、ILT5/CD85a、整合素a 4/CD49d、CD5、整合素aE/CD103、CD6、整合素a M/CD1 lb、CD8、整合素a X/CD1 lc、整合素2/CD18、KIR/CD158、CD27/TNFRSF7、KIR2DL1、CD28、KIR2DL3、CD30/TNFRSF8、KIR2DL4/CD158d、CD31/PECAM-1、KIR2DS4、CD40配体/TNFSF5、LAG-3、CD43、LAIR1、CD45、LAIR2、CD83、白三烯B4 Rl、CD84/SLAMF5、NCAM-L1、CD94、NKG2A、CD97、NKG2C、CD229/SLAMF3、NKG2D、CD2F-10/SLAMF9、NT-4、CD69、NTB-A/SLAMF6、共同γ链/IL-2 Ry、骨桥蛋白、CRACC/SLAMF7、PD-1、CRTAM、PSGL-1、CTLA-4、RANK/TNFRSF11A、CX3CR1、CX3CL1、L-选择素、CXCR3、SIRPCXCR4、SLAM、CXCR6、TCCRAVSX-1、DNAM-1、胸腺生成素、细胞外金属蛋白酶诱导因子/CD 147、TIM-1、EphB6、TIM-2、Fas/TNFRSF6、TIM-3、Fas配体/TNFSF6、TIM-4、Fey RIII/CD16、TIM-6、GITR/TNFRSF18、TNF Rl/TNFRSFIA、粒溶素、TNF R11/TNFRSF1B、HVEM/TNFRSF14、TRAIL Rl/TNFRSFIOA、ICAM-1/CD54、TRAIL R2/TNFRSF10B、ICAM-2/CD102、TRAIL R3/TNFRSF10C、IFN-yRl、TRAILR4/TNFRSF10D、IFN-yR2、TSLP、IL-1 RI和TSLP R。
条款248.如条款244至246中任一项所述的融合蛋白，其中所述单核细胞/巨噬细胞靶标选自由以下组成的组：B7-1/CD80、ILT4/CD85d、B7-H1、ILT5/CD85a、共同β链、整合素a 4/CD49d、BLAME/SLAMF8、整合素a X/CDl lc、CCL6/C10、整合素β2/CD18、CD155/PVR、整合素β3/CD61、CD31/PECAM-1、Latexin、CD36/SR-B3、白三烯B4 Rl、CD40/TNFRSF5、LIMPII/SR-B2、CD43、LMIR1/CD300A、CD45、LMIR2/CD300c、CD68、LMIR3/CD300LF、CD84/SLAMF5、LMIR5/CD300LB、CD97、LMIR6/CD300LE、CD163、LRP-1、CD2F-10/SLAMF9、MARCO、CRACC/SLAMF7、MD-1、ECF-L、MD-2、细胞外金属蛋白酶诱导因子/CD147、MGL2、内皮糖蛋白/CD105、骨活素/GPNMB、Fc yRl/CD64、骨桥蛋白、FcγRIIB/CD32b、PD-L2、Fc yRIIC/CD32c、Siglec-3/CD33、Fey RIIA/CD32a、SIGNR1/CD209、Fey RIII/CD16、SLAM、GM-CSF R a、TCCR/WSX-1、ICAM-2/CD102、TLR3、IFN-y Rl、TLR4、IFN-y R2、TREM-1、IL-1 RII、TREM-2、ILT2/CD85j、TREM-3、ILT3/CD85k、TREMLl/TLT-1、2B4/SLAMF4、IL-10R a、ALCAM、IL-10Rβ、氨基肽酶N/ANPEP、ILT2/CD85j、共同β链、ILT3/CD85k、Clq R1/CD93、ILT4/CD85d、CCR1、ILT5/CD85a、CCR2、整合素a 4/CD49d、CCR5、整合素a M/CDl lb、CCR8、整合素a X/CDl lc、CD155/PVR、整合素β2/CD18、CD14、整合素β3/CD61、CD36/SR-B3、LAIR1、CD43、LAIR2、CD45、白三烯B4 Rl、CD68、LIMPII/SR-B2、CD84/SLAMF5、LMIR1/CD300A、CD97、LMIR2/CD300c、CD 163、LMIR3/CD300LF、凝血因子Ill/组织因子、LMIR5/CD300LB、CX3CR1、CX3CL1、LMIR6/CD300LE、CXCR4、LRP-1、CXCR6、M-CSF R、DEP-1/CD148、MD-1、DNAM-1、MD-2、细胞外金属蛋白酶诱导因子/CD 147、MMR、内皮糖蛋白/CD105、NCAM-L1、Fc y R1/CD64、PSGL-1、Fc y RIII/CD16、RP105、G-CSFR、L-选择素、GM-CSF R a、Siglec-3/CD33、HVEM/TNFRSF14、SLAM、ICAM-1/CD54、TCCR/WSX-1、ICAM-2/CD102、TREM-1、IL-6 R、TREM-2、CXCRl/IL-8 RA、TREM-3和TREMLl/TLT-1。
条款249.如条款244至246中任一项所述的融合蛋白，其中所述树突细胞靶标选自由以下组成的组：CD36/SR-B3、LOX-1/SR-E1、CD68、MARCO、CD163、SR-AI/MSR、CD5L、SREC-I、CL-P1/COLEC12、SREC-II、LIMPII/SR-B2、RP105、TLR4、TLR1、TLR5、TLR2、TLR6、TLR3、TLR9、4-1BB配体/TNFSF9、IL-12/IL-23 p40、4-氨基-l,8-萘二甲酰亚胺、ILT2/CD85j、CCL21/6Ckine、ILT3/CD85k、8-oxo-dG、ILT4/CD85d、8D6A、ILT5/CD85a、A2B5、整合素a 4/CD49d、Aag、整合素β2/CD18、AMICA、朗格素、B7-2/CD86、白三烯B4 Rl、B7-H3、LMIR1/CD300A、BLAME/SLAMF8、LMIR2/CD300c、Clq R1/CD93、LMIR3/CD300LF、CCR6、LMIR5/CD300LB、CCR7、LMIR6/CD300LE、CD40/TNFRSF5、MAG/Siglec-4a、CD43、MCAM、CD45、MD-1、CD68、MD-2、CD83、MDL-1/CLEC5A、CD84/SLAMF5、MMR、CD97、NCAM-L1、CD2F-10/SL AMF9、骨活素/GPNMB、Chem23、PD-L2、CLEC-1、RP105、CLEC-2、Siglec-2/CD22、CR ACC/SLAMF7、Siglec-3/CD33、DC-SIGN、Siglec-5、DC-SIGNR/CD299、Siglec-6、DCAR、Siglec-7、DCIR/CLEC4A、Siglec-9、DEC-205、Siglec-10、树突细胞C型凝集素-1/CLEC7A、Siglec-F、树突细胞C型凝集素-2/CLEC6A、SIGNR1/CD209、DEP-1/CD 148、SIGNR4、DLEC、SLAM、细胞外金属蛋白酶诱导因子/CD 147、TCCRAVSX-1、FcγR1/CD64、TLR3、FcγRIIB/CD32b、TREM-1、Fc Y RIIC/CD32C、TREM-2、FcγRIIA/CD32a、TREM-3、FcγRIII/CD16、TREMLl/TLT-1、ICAM-2/CD102和类香草素Rl。
条款250.如条款244至246中任一项所述的融合蛋白，其中所述TNF受体超家族成员选自由以下组成的组：4-1BB/TNFRSF9、NGF R/TNFRSF16、BAFF R/TNFRSF13C、骨保护素/TNFRSFl lB、B CMA/TNFRSF 17、OX40/TNFRSF4、CD27/TNFRSF7、RANK/TNFRSF11A、CD30/TNFRSF8、RELT/TNFRSF19L、CD40/TNFRSF5、TACI/TNFRSF13B、DcR3/TNFRSF6B、TNF RI/TNFRSF1A、DcTRAIL R1/TNFRSF23、TNF RII/TNFRSF1B、DcTRAIL R2/TNFRSF22、TRAIL R1/TNFRSF10A、DR3/TNFRSF25、TRAIL R2/TNFRSF10B、DR6/TNFRSF21、TRAIL R3/TNFRSF10C、EDAR、TRAIL R4/TNFRSF 10D、Fas/TNFRSF6、TROY/TNFRSF19、GITR/TNFRSF 18、TWEAK R/TNFRSF12、HVEM/TNFRSF14、XEDAR、淋巴细胞毒素βR/TNFRSF3、4-1BB配体/TNFSF9、淋巴细胞毒素、APRIL/TNFSF 13、淋巴细胞毒素/TNFSF3、BAFF/TNFSF13C、OX40配体/TNFSF4、CD27配体/TNFSF7、TL1A/TNFSF15、CD30配体/TNFSF8、TNF-a/TNFSFlA、CD40配体/TNFSF5、TNF-/TNFSFlB、EDA-A2、TRAIL/TNFSF10、Fas配体/TNFSF6、TR ANCE/TNFSF 11、GITR配体/TNFSF18、TWEAK/TNFSF12和LIGHT/TNFSF14。
条款251.如条款244至246中任一项所述的融合蛋白，其中所述刺猬因子家族成员选自由碎片蛋白和润滑蛋白组成的组。
条款252.如条款244至246中任一项所述的融合蛋白，其中所述受体酪氨酸激酶选自由以下组成的组：Axl、FGF R4、Clq R1/CD93、FGF R5、DDR1、Flt-3、DDR2、HGF R、Dtk、IGF-I R、EGF R、IGF-II R、Eph、INSRR、EphAl、胰岛素R/CD220、EphA2、M-CSF R、Eph A3、Mer、EphA4、MSP R/Ron、EphA5、MuSK、EphA6、PDGF R a、EphA7、PDGF Rβ、EphA8、Ret、EphB l、ROR1、EphB2、ROR2、EphB3、SCF R/c-kit、EphB4、Tie-1、EphB6、Tie-2、ErbB2、TrkA、ErbB3、TrkB、ErbB4、TrkC、FGF Rl、VEGF Rl/Flt-1、FGF R2、VEGF R2/Flk-1、FGF R3和VEGF R3/Flt-4。
条款253.如条款244至246中任一项所述的融合蛋白，其中所述转化生长因子(TGF)超家族成员选自由以下组成的组：活化素RIA/ALK-2、GFR a-1、活化素RIB/ALK-4、GFRa2、活化素RHA、GFR a-3、活化素RUB、GFR a-4、ALK-1、MIS RII、ALK-7、Ret、B MPR-I A/ALK-3、TGF-βRl/ALK-5、BMPR-IB/ALK-6、TGF-βRII、BMPR-II、TGF-βRllb、内皮糖蛋白/CD 105和TGF-βRIII。
条款254.如条款244至246中任一项所述的融合蛋白，其中所述Wnt相关的分子选自由以下组成的组：卷曲蛋白-1、卷曲蛋白-8、卷曲蛋白-2、卷曲蛋白-9、卷曲蛋白-3、sFRP-1、卷曲蛋白-4、sFRP-2、卷曲蛋白-5、sFRP-3、卷曲蛋白-6、sFRP-4、卷曲蛋白-7、MFRP、LRP5、LRP 6、Wnt-1、Wnt-8a、Wnt-3a、Wnt-lOb、Wnt-4、Wnt-11、Wnt-5a、Wnt-9a和Wnt-7a。
条款255.如条款244至246中任一项所述的融合蛋白，其中所述受体配体选自由以下组成的组：4-1BB配体/TNFSF9、淋巴细胞毒素、APRIL/TNFSF13、淋巴细胞毒素/TNFSF3、BAFF/TNFSF13C、OX40配体/TNFSF4、CD27配体/TNFSF7、TL1A/TNFSF15、CD30配体/TNFSF8、TNF-a/TNFSFlA、CD40配体/TNFSF5、TNF^/TNFSFIB、EDA-A2、TRAIL/TNFSF10、Fas配体/TNFSF6、TRANCE/TNFSF11、GITR配体/TNFSF18、TWEAK/TNFSF12、LIGHT/TNFSF 14、双调蛋白、NRG1亚型GGF2、β细胞素、NRG1亚型SMDF、EGF、NRGl-a/HRGl-a、上皮细胞有丝分裂蛋白、NRGl-βl/HRGl-β1、上皮调节蛋白、TGF-a、HB-EGF、TMEFFl/肿瘤调节蛋白-1、神经调节蛋白-3、TMEFF2、IGF-I、IGF-II、胰岛素、活化素A、活化素B、活化素AB、活化素C、BMP-2、BMP-7、BMP-3、BMP-8、BMP-3b/GDF-10、BMP-9、BMP-4、BMP-15、BMP-5、生物皮肤生长因子、BMP-6、GDF-1、GDF-8、GDF-3、GDF-9、GDF-5、GDF-11、GDF-6、GDF-15、GDF-7、青蒿琥酯、神经秩蛋白、GDNF、Persephin、TGF-β、TGF-β2、TGF-β1、TGF-β3、LAP(TGF-β1)、TGF-β5、潜活TGF-β1、潜活TGF-βbpl、TGF-β1.2、Lefty、Nodal、MIS/AMH、酸性FGF、FGF-12、碱性FGF、FGF-13、FGF-3、FGF-16、FGF-4、FGF-17、FGF-5、FGF-19、FGF-6、FGF-20、FGF-8、FGF-21、FGF-9、FGF-23、FGF-10、KGF/FGF-7、FGF-11、神经纤毛蛋白-1、P1GF、神经纤毛蛋白-2、P1GF-2、PDGF、PDGF-A、VEGF、PDGF-B、VEGF-B、PDGF-C、VEGF-C、PDGF-D、VEGF-D和PDGF-AB。
条款256.如条款244至246中任一项所述的融合蛋白，其中所述肿瘤抗原选自由以下组成的组：鳞状细胞癌抗原1(SCCA-1)、(蛋白T4-A)、鳞状细胞癌抗原2(SCCA-2)、卵巢癌抗原CA125(1A1-3B；KIAA0049)、粘蛋白1(MUCIN 1)(肿瘤相关的粘蛋白；癌相关的粘蛋白；多态性上皮粘蛋白；PEM；PEMT；上皮唾蛋白；肿瘤相关的上皮膜抗原；EMA；H23AG；花生反应性尿粘蛋白；PUM；和乳腺癌瘤相关的抗原DF3)、CTCL肿瘤抗原sel-1、CTCL肿瘤抗原sel4-3、CTCL肿瘤抗原se20-4、CTCL肿瘤抗原se20-9、CTCL肿瘤抗原se33-l、CTCL肿瘤抗原se37-2、CTCL肿瘤抗原se57-l、CTCL肿瘤抗原se89-l、前列腺特异性膜抗原、5T4癌胚滋养层糖蛋白、Orf73卡波西氏肉瘤相关的疱疹病毒、MAGE-Cl(癌/睾丸抗原CT7)、MAGE-B 1抗原(MAGE-XP抗原；DAM 10)、MAGE-B2抗原(DAM6)、MAGE-2抗原、MAGE-4a抗原、MAGE-4b抗原、结肠癌抗原NY-CO-45、肺癌抗原NY-LU-12变体A、癌相关的表面抗原、腺癌抗原ART1、副赘生相关的脑-睾丸-癌抗原(肿瘤神经抗原MA2；副赘生神经元抗原)、神经肿瘤腹侧抗原2(NOVA2)、肝细胞癌抗原基因520、肿瘤相关的抗原CO-029、肿瘤相关的抗原MAGE-X2、滑膜肉瘤、X断裂点2、由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原、血清学确定的结肠癌抗原1、血清学确定的乳腺癌抗原NY-BR-15、血清学确定的乳腺癌抗原NY-BR-16、嗜铬粒蛋白A、甲状旁腺分泌蛋白1、DUPAN-2、CA19-9、CA 72-4、CA 195和L6。
条款257.如条款244至246中任一项所述的融合蛋白，其中所述B细胞靶标选自由以下组成的组：CD10、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD24、CD37、CD38、CD39、CD40、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CD78、CD79a/b、CD80、CD81、CD82、CD83、CD84、CD85、CD86、CD89、CD98、CD126、CD127、CDwl30、CD138和CDwl50。
条款258.如条款244至246中任一项所述的融合蛋白，其中所述血管生成靶标选自由以下组成的组：促血管生成素-1、促血管生成素样2、促血管生成素-2、促血管生成素样3、促血管生成素-3、促血管生成素样7/CDT6、促血管生成素-4、Tie-1、促血管生成素样1、Tie-2、血管生成素、iNOS、凝血因子Ill/组织因子、nNOS、CTGF/CCN2、NOV/CCN3、DANCE、OSM、EDG-1、Plfr、EG-VEGF/PK1、增殖蛋白、内皮抑素、ROB 04、红血球生成素、血栓反应素-1、激肽抑制素、血栓反应素-2、MFG-E8、血栓反应素-4、一氧化氮、VG5Q、eNOS、EphAl、EphA5、EphA2、EphA6、EphA3、EphA7、EphA4、EphA8、EphBl、EphB4、EphB2、EphB6、EphB3、肝配蛋白-Al、肝配蛋白-A4、肝配蛋白-A2、肝配蛋白-A5、肝配蛋白-A3、肝配蛋白-B l、肝配蛋白-B3、肝配蛋白-B2、酸性FGF、FGF-12、碱性FGF、FGF-13、FGF-3、FGF-16、FGF-4、FGF-17、FGF-5、FGF-19、FGF-6、FGF-20、FGF-8、FGF-21、FGF-9、FGF-23、FGF-10、KGF/FGF-7、FGF-11、FGF Rl、FGF R4、FGF R2、FGF R5、FGF R3、神经纤毛蛋白-1、神经纤毛蛋白-2、信号素3A、信号素6B、信号素3C、信号素6C、信号素3E、信号素6D、信号素6A、信号素7A、MMP、MMP-11、MMP-1、MMP-12、MMP-2、MMP-13、MMP-3、MMP-14、MMP-7、MMP-15、MMP-8、MMP-16/MT3-MMP、MMP-9、MMP-24/MT5-MMP、MMP-10、MMP-25/MT6-MMP、TIMP-1、TIMP-3、TIMP-2、TIMP-4、ACE、IL-13 R a 1、IL-13、ClqR1/CD93、整合素a 4/CD49d、VE-钙粘着蛋白、整合素β2/CD18、CD31/PECAM-1、KLF4、CD36/SR-B3、LYVE-1、CD151、MCAM、CL-P1/COLEC12、连接素-2/CD112、凝血因子Ill/组织因子、E-选择素、D6、P-选择素、DC-SIGNR/CD299、SLAM、细胞外金属蛋白酶诱导因子/CD 147、Tie-2、内皮糖蛋白/CD105、TNF RI/TNFRSF1A、EPCR、TNF RII/TNFRSF1B、红血球生成素R、TRAILRl/TNFRSFIOA、ESAM、TRAIL R2/TNFRSF10B、FABP5、VCAM-1、ICAM-1/CD54、VEGF R2/Flk-1、ICAM-2/CD102、VEGF R3/Flt-4、IL-1 RI和VG5Q。
条款259.根据前述条款中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白，其激动VSIG8和/或VISTA的至少一种免疫抑制作用。
条款260.根据条款259所述的经分离多肽或融合蛋白，其介导至少一种以下作用：(i)降低免疫应答，(ii)降低T细胞活化，(iii)降低细胞毒性T细胞活性，(iv)降低天然杀伤(NK)细胞活性，(v)降低T细胞活性，(vi)降低促炎性细胞因子分泌，(vii)降低IL-2分泌；(viii)降低由T细胞达成的干扰素-y产生，(ix)降低Thl应答，(x)降低Th2应答，(xi)增加调节性T细胞的细胞数目和/或活性，(xii)增加调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者，(xiii)增加调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者的活性，(xiii)增加M2巨噬细胞，(xiv)增加M2巨噬细胞活性，(xv)增加N2嗜中性白细胞，(xvi)增加N2嗜中性白细胞活性，(xvii)增加对T细胞活化的抑制，(xviii)增加对CTL活化的抑制，(xix)增加对NK细胞活化的抑制，(xx)增加T细胞耗竭，(xxi)降低T细胞应答，(xxii)降低细胞毒性细胞的活性，(xxiii)降低抗原特异性记忆应答，(xxiv)抑制细胞的凋亡或溶解，(xxv)降低对细胞的细胞毒性或细胞抑制性作用，(xxvi)降低细胞的直接杀灭，(xxvii)降低Thl7活性和/或(xxviii)降低补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，条件是所述经分离或重组VSIG8多肽或融合蛋白可引发(i)-(xxviii)中的一者或多者的相反作用。
条款261.根据前述条款中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白，其拮抗VSIG8和/或VISTA的至少一种免疫抑制作用。
条款262.根据条款261所述的经分离多肽或融合蛋白，其介导至少一种以下作用：(i)增加免疫应答，(ii)增加T细胞活化，(iii)增加细胞毒性T细胞活性，(iv)增加NK细胞活性，(v)缓和T细胞抑制，(vi)增加促炎性细胞因子分泌，(vii)增加IL-2分泌；(viii)增加由T细胞达成的干扰素-y产生，(ix)增加Thl应答，(x)降低Th2应答，(xi)降低或消除调节性T细胞(Treg)、骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的至少一者的细胞数目和/或活性，(xii)降低调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者的活性，(xiii)降低或消除M2巨噬细胞，(xiv)降低M2巨噬细胞促肿瘤发生活性，(xv)降低或消除N2嗜中性白细胞，(xvi)降低N2嗜中性白细胞促肿瘤发生活性，(xvii)降低对T细胞活化的抑制，(xviii)降低对CTL活化的抑制，(xix)降低对NK细胞活化的抑制，(xx)逆转T细胞耗竭，(xxi)增加T细胞应答，(xxii)增加细胞毒性细胞的活性，(xxiii)刺激抗原特异性记忆应答，(xxiv)引发癌细胞的凋亡或溶解，(xxv)刺激对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制性作用，(xxiv)诱导癌细胞的直接杀灭，(xxvi)增加Thl7活性和/或(xxvii)诱导补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，条件是所述经分离或重组VSIG8多肽或融合蛋白可引发(i)-(xxvii)中的一者或多者的相反作用。
条款263.根据以上条款中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白，其激动或拮抗VSIG8和/或VISTA对T细胞、天然杀伤(NK)细胞或一种或多种促炎性细胞因子的产生的至少一种作用。
条款264.根据以上条款中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白，其抑制或促进CTL活性、CD4+ T细胞活化和/或CD4+ T细胞增殖和/或细胞消减或促炎性细胞因子的分泌中的一者或多者。
条款265.根据以上条款中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白，其抑制或促进NK细胞活性。
条款266.根据以上条款中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白，其抑制或促进Treg、MDSC、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞的分化、增殖和/或活性，和/或Treg(Treg)、MDSC、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞的浸润。
条款267.如条款266所述的多肽或融合蛋白，其中所述Treg是诱导性Treg。
条款268.根据前述条款中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白，其特异性结合由NK细胞表达的受体。
条款269.根据前述条款中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白，其特异性结合由活化T细胞或树突细胞或骨髓抑制细胞或单核细胞或嗜中性白细胞表达的受体。
条款270.一种多核苷酸，其编码根据前述条款中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白。
条款271.一种表达载体或病毒，其包含至少一种根据条款270所述的多核苷酸。
条款272.一种重组细胞，其包含根据条款270所述的表达载体或根据条款271所述的含有多核苷酸的病毒，其中所述细胞组成性或诱导性表达由DNA区段编码的多肽。
条款273.一种产生根据条款200至269中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白方法，其包括在各种条件下培养根据条款272所述的重组细胞，借此所述细胞表达由所述DNA区段或核酸编码的所述多肽，以及回收所述多肽。
条款274.一种药物组合物，其包含如条款200至269中任一项所述的经分离蛋白质或融合蛋白，或包含SEQ ID NO:1、2、3中的任一者所示的VSIG8 ECD蛋白、如条款270所述的多核苷酸、如条款271所述的表达载体或病毒、或如条款272所述的重组细胞。
条款275.根据条款274所述的药物组合物、如条款200至269中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白、如条款270所述的多核苷酸、如条款271所述的表达载体或病毒、如条款272所述的重组细胞，其用于在罹患癌症的受试者中进行治疗。
条款276.如条款275所述的药物组合物、癌症免疫疗法、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其用于对癌症的免疫疗法治疗。
条款277.如条款275或276所述的药物组合物、癌症免疫疗法、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中在诊断时或在治疗之前癌不表达足够水平的VSIG8蛋白。
条款278.如条款275或276所述的药物组合物、癌症免疫疗法、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中在诊断时或在治疗之前癌表达足够水平的VSIG8蛋白。
条款279.如条款275至278中任一项所述的药物组合物、癌症免疫疗法、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中与用于治疗癌症的治疗剂组合向有此需要的所述受试者施用所述药物组合物、经分离多肽、融合蛋白、多核苷酸、表达载体、病毒或细胞。
条款280.如条款275至279中任一项所述的药物组合物、癌症免疫疗法、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其用于进行以下中的至少一者：(i)增加免疫应答，(ii)增加T细胞活化，(iii)增加细胞毒性T细胞活性，(iv)增加NK细胞活性，(v)增加Thl7活性，(vi)缓和T细胞抑制，(vii)增加促炎性细胞因子分泌，(viii)增加IL-2分泌；(ix)增加由T细胞达成的干扰素-y产生，(x)增加Th1应答，(xi)降低Th2应答，(xii)降低或消除调节性T细胞(Treg)、骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的至少一者，(xiii)降低调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者的活性，(xiv)降低或消除M2巨噬细胞，(xv)降低M2巨噬细胞促肿瘤发生活性，(xvi)降低或消除N2嗜中性白细胞，(xvii)降低N2嗜中性白细胞促炎性活性，(xviii)降低对T细胞活化的抑制，(xix)降低对CTL活化的抑制，(xx)降低对NK细胞活化的抑制，(xxi)逆转T细胞耗竭，(xxii)增加T细胞应答，(xxiii)增加细胞毒性细胞的活性，(xxiv)刺激抗原特异性记忆应答，(xxv)引发癌细胞的凋亡或溶解，(xxvi)刺激对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制性作用，(xxvii)诱导癌细胞的直接杀灭，和/或(xxviii)诱导补体依赖性细胞毒性和/或(xxix)诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
条款281.如条款275至280中任一项所述的药物组合物、癌症免疫疗法、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其进一步包括施用包括以下中的一者或多者的额外疗法：放射疗法、冷冻疗法、抗体疗法、化学疗法、光动力疗法、手术、激素剥夺、靶向疗法药剂、癌症疫苗或与常规药物的组合疗法。
条款282.如条款275至281中任一项所述的药物组合物、癌症免疫疗法、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中所述治疗剂或额外疗法选自由以下组成的组：细胞毒性药物、肿瘤疫苗、抗体、肽、肽体、小分子、化学治疗剂、细胞毒性剂和细胞抑制剂、免疫调节剂、干扰素、白介素、免疫刺激性生长激素、细胞因子、维生素、矿物质、芳香酶抑制剂、RNAi、组蛋白脱乙酰基酶抑制剂和蛋白酶体抑制剂。
条款283.如条款275至282中任一项所述的药物组合物、癌症免疫疗法、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其与一种或多种治疗剂、额外疗法或增效剂组合同时或依序向受试者施用以获得治疗作用，其中所述一种或多种增效剂选自由以下组成的组：放射疗法、加强抗肿瘤免疫应答的常规/经典抗癌疗法、加强抗肿瘤免疫应答的靶向疗法、靶向免疫抑制性细胞Treg和/或MDSC的治疗剂、免疫刺激性抗体、细胞因子疗法和过继性细胞转移。
条款284.如条款275至283中任一项所述的药物组合物、癌症免疫疗法、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中所述常规/经典抗癌剂选自由以下组成的组：基于铂的化合物、具有抗癌活性的抗生素、蒽环霉素、蒽二酮、烷化剂、抗代谢剂、抗有丝分裂剂、紫杉烷、类紫杉烷、微管抑制剂、长春花生物碱、叶酸拮抗剂、拓扑异构酶抑制剂、抗雌激素剂、抗雄激素剂、芳香酶抑制剂、GnRh类似物、5a-还原酶的抑制剂、双膦酸盐和抗体。
条款285.如条款275至284中任一项所述的药物组合物、癌症免疫疗法、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中所述靶向疗法药剂选自由以下组成的组：组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂、蛋白酶体抑制剂、mTOR路径抑制剂、JAK2抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)、PI3K抑制剂、蛋白质激酶抑制剂、丝氨酸/苏氨酸激酶的抑制剂、细胞内信号传导的抑制剂、Ras/Raf信号传导的抑制剂、MEK抑制剂、AKT抑制剂、存活信号传导蛋白的抑制剂、周期素依赖性激酶抑制剂、治疗性单克隆抗体、TRAIL路径激动剂、抗血管生成剂、金属蛋白酶抑制剂、组织蛋白酶抑制剂、尿激酶纤维蛋白溶酶原活化因子受体功能的抑制剂、免疫缀合物、抗体药物缀合物、抗体片段、双特异性抗体、双特异性T细胞衔接物(BiTE)。
条款286.如条款275至285中任一项所述的药物组合物、癌症免疫疗法、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中所述抗体选自西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗、曲妥珠单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗、奥法珠单抗、维妥珠单抗、阿来珠单抗、拉贝珠单抗、阿德木单抗、奥戈伏单抗、奥纳珠单抗；阿泊单抗、马帕木单抗、来沙木单抗、可那木单抗、替加珠单抗、卡妥索单抗、兰妥莫单抗、替坦异贝莫单抗、托西莫单抗、维多汀布妥昔单抗、奥佐米星吉妥单抗、特曲西坦克利维珠单抗、佩姆莫单抗、埃姆坦辛曲妥珠单抗、贝伐单抗、埃达珠单抗、伏洛昔单抗、雷莫芦单抗、阿柏西普。
条款287.如条款275至286中任一项所述的药物组合物、癌症免疫疗法、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中靶向免疫抑制性细胞Treg和/或MDSC的所述治疗剂选自抗有丝分裂药物、环磷酰胺、吉西他滨、米托蒽醌、氟达拉滨、沙利度胺、沙利度胺衍生物、COX-2抑制剂、通过识别Treg细胞表面受体来直接靶向Treg的消减性或杀灭性抗体、抗CD25达利珠单抗、巴利昔单抗、配体定向毒素、地尼白介素(温塔克)-人IL-2和白喉毒素的融合蛋白、或LMB-2-针对CD25的scFv与假单胞菌外毒素之间的融合物、靶向Treg细胞表面受体的抗体、TLR调节剂、干扰腺苷能路径的药剂、外核苷酸酶抑制剂或A2A腺苷受体的抑制剂、TGF-β抑制剂、趋化因子受体抑制剂、视黄酸、全反式视黄酸(ATRA)、维生素D3、磷酸二酯酶5抑制剂、昔多芬、ROS抑制剂和硝基阿司匹林。
条款288.如条款275至287中任一项所述的药物组合物、癌症免疫疗法、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中所述免疫刺激性抗体选自靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中的一者或多者的拮抗性抗体和/或靶向CD40、CD 137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一者或多者的激动性抗体。
条款289.如条款275至288中任一项所述的药物组合物、癌症免疫疗法、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中所述治疗性癌症疫苗选自用于发动对肿瘤抗原的免疫原性应答的外源性癌症疫苗(包括蛋白质或肽)、编码肿瘤抗原的重组病毒和细菌载体、编码肿瘤抗原的基于DNA的疫苗、基于靶向树突细胞的蛋白质的疫苗、完整肿瘤细胞疫苗、表达GM-CSF、ICOS和/或Flt3配体的基因经修饰肿瘤细胞、溶瘤性病毒疫苗。
条款290.如条款275至289中任一项所述的药物组合物、癌症免疫疗法、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中所述细胞因子疗法选自细胞因子IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18和IL-21、IL23、IL-27、GM-CSF、IFNa(干扰素α)、IFNa-2b、ΙΡΝβ、IFNy中的一者或多者，以及它们的不同递送策略。
条款291.如条款275至290中任一项所述的药物组合物、癌症免疫疗法、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中所述过继性细胞转移疗法在选自以下的离体处理之后进行：扩增患者自体天然存在的肿瘤特异性T细胞或遗传修饰T细胞以赋予对肿瘤抗原的特异性。
条款292.一种用于诊断或有助于诊断受试者的疾病的测定，其中所述疾病选自由癌症、自体免疫性疾病或感染性疾病组成的组，所述测定包括如以上条款中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白和/或使用SEQ ID NO:1、2、3中的任一者所示的VSIG8ECD蛋白，以及用于检测所述经分离蛋白质或融合蛋白与取自所述受试者的组织样品的特异性结合的检测器。
条款293.一种用于诊断或有助于诊断受试者的疾病的诊断方法，其中所述疾病选自由癌症、自体免疫性疾病或感染性疾病组成的组，所述诊断方法包括使用如条款292所述的测定来进行所述方法。
条款294.一种用于诊断或有助于诊断受试者的疾病的诊断方法，其中所述疾病选自由癌症、自体免疫性疾病或感染性疾病组成的组，其中所述诊断方法离体进行，并且包括使来自所述受试者的组织样品与如以上条款中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白和/或与SEQ ID NO:1、2、3中的任一者所示的VSIG8ECD蛋白接触，以及检测与所述组织样品的特异性结合。
条款295.一种用于诊断或有助于诊断受试者的疾病的诊断方法，其中所述疾病选自由癌症、自体免疫性疾病或感染性疾病组成的组，其中所述诊断方法在体内进行，包括向受试者施用如以上条款中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白，和/或使用SEQ ID NO:1、2、3中的任一者所示的VSIG8ECD蛋白，以及检测与组织的特异性结合。
条款296.如条款293至295中任一项所述的方法，或如条款292所述的测定的用途，其中所述诊断方法在疗法或治疗之前进行，所述疗法或治疗包括向所述受试者施用如条款200至269中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白、如条款270所述的多核苷酸、如条款271所述的表达载体或病毒、如条款272所述的重组细胞、如条款274所述的药物组合物、如条款275所述的用途、或如条款276至291中任一项所述的蛋白质、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞、药物组合物或用途。
条款297.如条款293至296中任一项所述的方法，其用于筛选疾病，筛选VSIG8介导的免疫抑制，检测疾病的存在性或严重性，提供疾病的预后，监测疾病进展或复发，以及评估疾病、病症或病状的治疗功效和/或复发，以及选择针对疾病的疗法和/或治疗，优化针对疾病的给定疗法，监测疾病的治疗，和/或预测疗法对于特定患者或子群体的适合性或确定治疗性产品在患者或子群体中的适当给药。
条款298.如条款200至269中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白、如条款270所述的多核苷酸、如条款271所述的表达载体或病毒、如条款272所述的重组细胞、如条款274所述的药物组合物、如条款275所述的用途、或如条款276至291中任一项所述的蛋白质、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞、药物组合物、用途、如条款292所述的测定、或如条款94至98中任一项所述的方法，其中所述癌症选自由以下组成的组：乳腺癌、子宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、膀胱癌、肺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、前列腺癌、白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、骨髓性白血病、急性骨髓源性白血病(AML)、慢性骨髓源性白血病、甲状腺癌、甲状腺滤泡癌、骨髓发育不良综合征(MDS)、纤维肉瘤和横纹肌肉瘤、畸胎癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤、良性皮肤肿瘤、角化棘皮瘤、肾癌、间变性大细胞淋巴瘤、食道癌、滤泡性树突细胞癌、精囊肿瘤、表皮癌、脾癌、膀胱癌、头颈部癌、胃癌、肝癌、骨癌、脑癌、视网膜癌、胆管癌、小肠癌症、唾液腺癌、子宫癌、睾丸癌、结缔组织癌、骨髓发育不良、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、鼻咽癌、神经内分泌癌、间皮瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤、类癌、输卵管癌、腹膜癌、乳头状浆液性苗勒癌、恶性腹水、胃肠基质肿瘤(GIST)、李-弗劳明综合征和冯希佩尔-林道综合征(VHL)、起因未知的原发性或转移性癌症，其中所述癌症是非转移性的、侵袭性的或转移性的。
条款299.如条款298所述的经分离蛋白质、融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞、药物组合物、测定或方法，其中所述乳腺癌是乳腺癌瘤，并且选自由以下组成的组：导管癌、浸润性导管癌、小叶癌、粘液性腺癌、导管内和侵袭性导管癌和硬癌性腺癌。
条款300.如条款298所述的经分离蛋白质、融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞、药物组合物、测定或方法，其中所述结肠癌选自由以下组成的组：不良至充分分化的侵袭性和非侵袭性腺癌、不良至充分分化的盲肠腺癌、充分至不良分化的结肠腺癌、管状腺癌，优选是2级升结肠管状腺癌，杜克氏分期CI结肠腺癌、侵袭性腺癌、直肠腺癌，优选是3级直肠腺癌、中度分化的直肠腺癌、中度分化的粘液性直肠腺癌。
条款301.如条款298所述的经分离蛋白质、融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞、药物组合物、测定或方法，其中所述肺癌选自由以下组成的组：充分至不良分化的非小细胞癌、鳞状细胞癌，优选是充分至不良分化的鳞状细胞癌、角质化鳞状细胞癌，腺癌，优选是不良至充分分化的腺癌、大细胞腺癌，小细胞肺癌，优选是小细胞肺癌瘤，更优选是未分化的小细胞肺癌瘤。
条款302.如条款298所述的经分离蛋白质、融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞、药物组合物、测定或方法，其中所述前列腺癌是前列腺腺癌，并且选自由以下组成的组：格里森6至9级腺癌、浸润性腺癌、高级前列腺上皮内赘瘤形成、未分化癌。
条款303.如条款298所述的经分离蛋白质、融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞、药物组合物、测定或方法，其中所述胃癌是中度分化的胃腺癌。
条款304.如条款298所述的经分离蛋白质、融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞、药物组合物、测定或方法，其中所述卵巢癌选自由以下组成的组：囊腺癌、浆液性乳头状囊性癌、浆液性乳头状囊性癌、侵袭性浆液性乳头状癌。
条款305.如条款298所述的经分离蛋白质、融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞、药物组合物、测定或方法，其中所述脑癌选自由以下组成的组：星形细胞瘤，条件是它不是2级星形细胞瘤，优选是4级星形细胞瘤，或多形性胶质母细胞瘤。
条款306.如条款298所述的经分离蛋白质、融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞、药物组合物、测定或方法，其中所述脑癌是星形细胞瘤。
条款307.如条款298所述的经分离蛋白质、融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞、药物组合物、测定或方法，其中所述肾癌是透明细胞肾细胞癌。
条款308.如条款298所述的经分离蛋白质、融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞、药物组合物、测定或方法，其中肝癌是肝细胞癌。
条款309.如条款308所述的经分离蛋白质、融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞、药物组合物、测定或方法，其中所述肝细胞癌是低级肝细胞癌或纤维板层肝细胞癌。
条款310.如条款298所述的经分离蛋白质、融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞、药物组合物、测定或方法，其中所述淋巴瘤选自由以下组成的组：霍奇金氏淋巴瘤以及高级至低级非霍奇金氏淋巴瘤。
条款311.如条款298所述的经分离蛋白质、融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞、药物组合物、测定或方法，其用于治疗罹患选自由以下组成的组的疾病的受试者：B细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、甲状腺癌、甲状腺滤泡癌、骨髓发育不良综合征(MDS)、纤维肉瘤和横纹肌肉瘤、黑素瘤、葡萄膜黑素瘤、畸胎癌、神经母细胞瘤、神经胶质瘤、胶质母细胞瘤癌、角化棘皮瘤、间变性大细胞淋巴瘤、食道鳞状细胞癌、肝细胞癌、滤泡性树突细胞癌、肌肉侵袭性癌、精囊肿瘤、表皮癌、视网膜癌、胆管癌、小肠癌、唾液腺癌、结缔组织癌、骨髓发育不良、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、鼻咽癌、神经内分泌癌、骨髓发育不良综合征、间皮瘤、血管肉瘤、卡波西氏肉瘤、类癌、食管胃癌、输卵管癌、腹膜癌、乳头状浆液性苗勒癌、恶性腹水、胃肠基质肿瘤(GIST)、李-弗劳明综合征和冯希佩尔-林道综合征(VHL)；子宫内膜癌、乳腺癌瘤，优选是导管癌、浸润性导管癌、小叶癌、粘液性腺癌、导管内和侵袭性导管癌和硬癌性腺癌中的任一种，结肠直肠腺癌，优选是不良至充分分化的侵袭性和非侵袭性腺癌、不良至充分分化的盲肠腺癌、充分至不良分化的结肠腺癌、管状腺癌(优选是2级升结肠管状腺癌)、杜克氏分期CI结肠腺癌、侵袭性腺癌、直肠腺癌(优选是3级直肠腺癌、中度分化的直肠腺癌、中度分化的粘液性直肠腺癌)中的任一种；肺癌，优选是充分至不良分化的非小细胞癌、鳞状细胞癌(优选是充分至不良分化的鳞状细胞癌、角质化鳞状细胞癌)、腺癌(优选是不良至充分分化的腺癌、大细胞腺癌)、小细胞肺癌(优选是小细胞肺癌瘤，更优选是未分化的小细胞肺癌瘤)中的任一种；前列腺腺癌，优选是格里森6至9级腺癌、浸润性腺癌、高级前列腺上皮内赘瘤形成、未分化癌中的任一种；胃腺癌，优选是中度分化的胃腺癌；卵巢癌，优选是囊腺癌、浆液性乳头状囊性癌、浆液性乳头状囊性癌、侵袭性浆液性乳头状癌中的任一种；脑癌，优选是星形细胞瘤(条件是它不是2级星形细胞瘤，优选是4级星形细胞瘤)、多形性胶质母细胞瘤中的任一种；肾癌，优选是透明细胞肾细胞癌；肝癌，优选是肝细胞癌(优选是低级肝细胞癌、纤维板层肝细胞癌)中的任一种；淋巴瘤，优选是霍奇金氏淋巴瘤以及高级至低级非霍奇金氏淋巴瘤中的任一种。
条款312.根据条款274所述的药物组合物、如条款200至269中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白、如条款270所述的多核苷酸、如条款271所述的表达载体或病毒、或如条款272所述的重组细胞，其用于治疗罹患免疫病状的受试者的所述免疫病状。
条款313.如条款312所述的药物组合物、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中与用于治疗免疫病状的治疗剂组合向有此需要的所述受试者施用所述药物组合物、经分离多肽、融合蛋白、多核苷酸、表达载体、病毒或细胞。
条款314.如条款312或313所述的药物组合物、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其用于治疗有此需要的受试者的免疫病状。
条款315.如条款312至314中任一项所述的药物组合物、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中所述蛋白质、所述多核苷酸、所述表达载体或病毒、所述重组细胞或所述药物组合物用于治疗免疫相关疾病和/或用于降低在基因或细胞疗法或将细胞、组织和/或器官移植至受试者中之后不合需要的免疫活化，并且能够进行以下中的至少一者：抑制免疫应答，降低T细胞活性，降低NK细胞活性，增强调节性细胞活性，增强T细胞抑制，增强免疫调节性细胞活性，诱导建立免疫耐受性，降低促炎性细胞因子分泌，重建Thl-Th2免疫平衡，降低对自身抗原的免疫记忆应答，降低或消除促炎性免疫细胞，降低或消除自体反应性免疫细胞。
条款316.如条款312至315中任一项所述的药物组合物、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其用于进行以下中的至少一者：(i)降低免疫应答，(ii)降低T细胞活化，(iii)降低细胞毒性T细胞活性，(iv)降低天然杀伤(NK)细胞活性，(v)降低T细胞活性，(vi)降低Thl7活性，(vii)降低促炎性细胞因子分泌，(viii)降低IL-2分泌；(ix)降低由T细胞达成的干扰素-y产生，(x)降低Thl应答，(xi)降低Th2应答，(xii)增加调节性T细胞和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者，(xiii)增加调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者的活性，(xiv)增加M2巨噬细胞，(xv)增加M2巨噬细胞活性，(xvi)增加N2嗜中性白细胞，(xvii)增加N2嗜中性白细胞活性，(xviii)增加对T细胞活化的抑制，(xix)增加对CTL活化的抑制，(xx)增加对NK细胞活化的抑制，(xxi)增加T细胞耗竭，(xxii)降低T细胞应答，(xxiii)降低细胞毒性细胞的活性，(xxiv)降低抗原特异性记忆应答，(xxv)抑制细胞的凋亡或溶解，(xxvi)降低对细胞的细胞毒性或细胞抑制性作用，(xxvii)降低细胞的直接杀灭，和/或(xxviii)降低补体依赖性细胞毒性和/或(xxix)降低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
条款317.如条款312至316中任一项所述的药物组合物、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中所述免疫病状选自由以下组成的组：自体免疫性疾病、移植排斥和移植物抗宿主疾病。
条款318.如条款312至316中任一项所述的药物组合物、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中所述自体免疫性疾病选自由以下组成的组：多发性硬化症、牛皮癣；类风湿性关节炎；牛皮癣性关节炎、全身性红斑狼疮(SLE)；盘状红斑狼疮、炎症性肠病、溃疡性结肠炎；克罗恩氏病；良性淋巴细胞性血管炎、血小板减少性紫癜、特发性血小板减少症、特发性自体免疫溶血性贫血、纯红细胞再生障碍、休格连氏综合征、风湿性疾病、结缔组织疾病、炎症性风湿病、退变性风湿病、关节外风湿病、青少年类风湿性关节炎、痛风性关节炎、肌肉风湿病、慢性多发性关节炎、冷球蛋白血症性血管炎、ANCA相关的血管炎、抗磷脂综合征、重症肌无力、自体免疫溶血性贫血、格林-巴利综合征、慢性免疫多发性神经病变、自体免疫甲状腺炎、胰岛素依赖性糖尿病、I型糖尿病、阿狄森氏病、膜性肾小球性肾病、古德帕斯彻氏病、自体免疫胃炎、自体免疫萎缩性胃炎、恶性贫血、天疱疮、寻常天疱疮、肝硬化、原发性胆汁性硬化、皮肤肌炎、多发性肌炎、纤维肌炎、肌硬结、乳糜泻、免疫球蛋白A肾病变、亨诺克-舍恩来因紫癜、埃文斯综合征、皮炎、异位性皮炎、牛皮癣、关节病性牛皮癣、格雷福斯病、格雷福斯眼病、硬皮病、全身性硬皮病、进行性全身性硬皮病、哮喘、过敏、原发性胆汁性硬化、桥本氏甲状腺炎、原发性粘液性水肿、交感性眼炎、自体免疫葡萄膜炎、肝炎、慢性活动肝炎、胶原性疾病、僵直性脊椎炎、肩周炎、结节性全动脉炎、假性痛风、韦格纳氏肉芽肿病、显微性多血管炎、慢性荨麻疹、大疱性皮肤病症、类天疱疮、播散性神经性皮炎、大疱性类天疱疮、瘢痕性类天疱疮、白癜风、播散性神经性皮炎、湿疹、慢性荨麻疹、自体免疫荨麻疹、正常补体血症性荨麻疹性血管炎、低补体血症性荨麻疹性血管炎、自体免疫淋巴组织增生性综合征、德维克氏病、类肉瘤病、恶性贫血、儿童期自体免疫溶血性贫血、特发性自体免疫溶血性贫血、难治性或慢性自体免疫血细胞减少症、在获得性甲型血友病的情况下防止产生自体免疫抗因子VIII抗体、冷凝集素疾病、视神经脊髓炎、僵人综合征、齿龈炎、牙周炎、胰腺炎、心肌炎、血管炎、胃炎、痛风、痛风性关节炎和炎症性皮肤病症、正常补体血症性荨麻疹性血管炎、心包炎、特发性心包炎、肌炎、抗合成酶综合征、巩膜炎、巨噬细胞活化综合征、贝塞特氏综合征、PAPA综合征、布劳氏综合征、痛风、成人和青少年斯蒂尔氏病、冷炎素病变、马克尔-韦尔斯综合征、家族性寒冷诱发的自体炎症性综合征、新生儿发作型多系统炎症性疾病、家族性地中海热、慢性婴儿神经、皮肤和关节综合征、风湿性疾病、风湿性多肌痛、混合结缔组织疾病、炎症性风湿病、退变性风湿病、关节外风湿病、青少年关节炎、青少年类风湿性关节炎、全身性青少年特发性关节炎、痛风性关节炎、肌肉风湿病、慢性多发性关节炎、反应性关节炎、莱特尔氏综合征、风湿热、复发性多软骨炎、雷诺氏现象、血管炎、冷球蛋白血症性血管炎、颞动脉炎、巨细胞动脉炎、高安动脉炎、贝塞特氏病、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病变、自体免疫甲状腺炎、胰岛素依赖性糖尿病、I型糖尿病、阿狄森氏病、膜性肾小球性肾病、多腺自体免疫综合征、古德帕斯彻氏病、自体免疫胃炎、自体免疫萎缩性胃炎、恶性贫血、天疱疮、寻常天疱疮、肝硬化、原发性胆汁性硬化、特发性肺纤维化、肌炎、皮肤肌炎、青少年皮肤肌炎、多发性肌炎、纤维肌炎、肌硬结、乳糜泻、乳糜泻口炎性腹泻皮炎、免疫球蛋白A肾病变、亨诺克-舍恩来因紫癜、埃文斯综合征、异位性皮炎、牛皮癣、寻常性牛皮癣、关节病性牛皮癣、格雷福斯病、格雷福斯眼病、硬皮病、全身性硬皮病、进行性全身性硬皮病、弥漫性硬皮病、局部化硬皮病、Crest综合征、哮喘、过敏性哮喘、过敏、原发性胆汁性硬化、纤维肌痛、慢性疲劳和免疫功能异常综合征(CFIDS)、自体免疫内耳病、高IgD综合征、史尼兹勒氏综合征、自体免疫视网膜病变、年龄相关的黄斑变性、动脉粥样硬化、慢性前列腺炎、脱发、斑形脱发、全身脱毛、全部脱发、自体免疫血小板减少性紫癜、特发性血小板减少性紫癜、纯红细胞再生障碍和TNF受体相关的周期综合征(TRAPS)。
条款319.如条款312至317中任一项所述的药物组合物、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其用于治疗选自以下的自体免疫性疾病：复发-缓解性多发性硬化症、原发性进行性多发性硬化症、继发性进行性多发性硬化症；进行性复发性多发性硬化症、慢性进行性多发性硬化症、过渡性/进行性多发性硬化症、快速恶化性多发性硬化症、临床确定性多发性硬化症、恶性多发性硬化症，也称为马尔堡氏变体(Marburg's Variant)，急性多发性硬化症、与多发性硬化症相关的病状、牛皮癣性关节炎、痛风和假性痛风、青少年特发性关节炎、斯蒂尔氏病、类风湿性血管炎、与类风湿性关节炎相关的病状、盘状狼疮、狼疮关节炎、狼疮肺炎、狼疮肾炎、与全身性红斑狼疮相关的病状，包括骨关节性结核，抗磷脂抗体综合征、心脏的各个部分的炎症诸如心包炎、心肌炎和心内膜炎，肺和胸膜炎症、胸膜炎、胸腔积液、慢性弥漫性间质性肺病、肺高血压、肺栓子、肺出血和萎缩性肺综合征、狼疮头痛、格林-巴利综合征、无菌性脑膜炎、脱髓鞘性综合征、单神经病、多发性神经炎、脊髓病、颅侧神经病变、多发性神经病变、血管炎、胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转流性结肠炎、贝塞特氏病、未确定型结肠炎、血小板减少性紫癜、特发性自体免疫溶血性贫血、纯红细胞再生障碍、冷球蛋白血症性血管炎、ANCA相关的血管炎、抗磷脂综合征、自体免疫溶血性贫血、格林-巴利综合征、慢性免疫多发性神经病变、自体免疫甲状腺炎、特发性糖尿病、青少年l型糖尿病、年轻人成熟期发作型糖尿病、成人潜伏性自体免疫糖尿病、妊娠性糖尿病、与1型糖尿病相关的病状、膜性肾小球性肾病、自体免疫胃炎、寻常天疱疮、肝硬化、纤维肌炎、乳糜泻、免疫球蛋白A肾病变、亨诺克-舍恩来因紫癜、埃文综合征、异位性皮炎、牛皮癣、格雷福斯眼病、全身性硬皮病、哮喘、过敏、前葡萄膜炎(或虹膜睫状体炎)、中间葡萄膜炎(扁平部睫状体炎)、后葡萄膜炎(或脉络膜视网膜炎)、全葡萄膜炎形式、肝炎、韦格纳氏肉芽肿病、显微性多血管炎、慢性荨麻疹、大疱性皮肤病症、类天疱疮、播散性神经性皮炎、德维克氏病、儿童期自体免疫溶血性贫血、难治性或慢性自体免疫血细胞减少症、在获得性甲型血友病的情况下防止产生自体免疫抗因子VIII抗体、冷凝集素疾病、视神经脊髓炎、僵人综合征、齿龈炎、牙周炎、胰腺炎、心肌炎、血管炎、胃炎、痛风、痛风性关节炎和炎症性皮肤病症，选自由以下组成的组：牛皮癣、非脓疱性牛皮癣(包括寻常性牛皮癣和牛皮癣红皮病(红皮病性牛皮癣)、脓疱性牛皮癣(包括全身性脓疱性牛皮癣(冯聪布施(von Zumbusch)脓疱性牛皮癣)、掌跖脓疱疹(持久性掌跖脓疱病、巴尔伯(Barber)型脓疱性牛皮癣、四肢脓疱性牛皮癣)、环状脓疱性牛皮癣)、连续性肢端皮炎、疱疹样脓疱病、药物诱发的牛皮癣、皮褶性牛皮癣(Inverse psoriasis)、尿布区牛皮癣(Napkin psoriasis)、皮脂溢样牛皮癣、滴状牛皮癣、甲牛皮癣、牛皮癣性关节炎、异位性皮炎、湿疹、红斑痤疮、荨麻疹和粉刺，正常补体血症性荨麻疹性血管炎、心包炎、抗合成酶综合征、巩膜炎、巨噬细胞活化综合征、贝塞特氏综合征、PAPA综合征、布劳氏综合征、痛风、成人和青少年斯蒂尔氏病、冷炎素病变、马克尔-韦尔斯综合征、家族性寒冷诱发的自体炎症性综合征、新生儿发作型多系统炎症性疾病、家族性地中海热、慢性婴儿神经、皮肤和关节综合征、全身性青少年特发性关节炎、高IgD综合征、史尼兹勒氏综合征、自体免疫视网膜病变、年龄相关的黄斑变性、动脉粥样硬化、慢性前列腺炎和TNF受体相关的周期综合征(TRAPS)。
条款320.如条款312至319中任一项所述的药物组合物、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中治疗与用于治疗所述病状的另一部分组合。
条款321.如条款312至320中任一项所述的药物组合物、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中用于治疗免疫相关病状的所述其它部分选自免疫抑制剂，诸如皮质类固醇、环孢菌素、环磷酰胺、泼尼松、咪唑硫嘌呤、甲氨蝶呤、雷帕霉素、他克莫司、来氟米特或其类似物；咪唑立宾；霉酚酸；霉酚酸吗啉乙酯；15-脱氧司加林或其类似物；生物制剂，诸如TNF-α阻断剂或拮抗剂或靶向任何炎症性细胞因子的任何其它生物制剂、非类固醇消炎药物/Cox-2抑制剂、羟氯奎、硫氮磺胺吡啶、金盐、依那西普、英夫利昔单抗、霉酚酸吗啉乙酯、巴利昔单抗、阿塞西普、利妥昔单抗、(环磷酰胺)、干扰素β-la、干扰素β-lb、乙酸格拉默、盐酸米托蒽醌、阿那白滞素和/或生物物质和/或静脉内免疫球蛋白(IVIG)、干扰素诸如IFN-β-la(和)和IFN-β-lb 乙酸格拉默多肽；那他珠单抗米托蒽醌细胞毒性剂、钙调神经磷酸酶抑制剂；环孢菌素A；FK506；免疫抑制性大环内酯；雷帕霉素；雷帕霉素衍生物；40-O-(2-羟基)乙基-雷帕霉素、淋巴细胞归巢剂、FTY720；或FTY720的类似物；皮质类固醇；环磷酰胺；咪唑硫嘌呤；甲氨蝶呤；来氟米特或其类似物；咪唑立宾；霉酚酸；霉酚酸吗啉乙酯；15-脱氧司加林或其类似物；免疫抑制性单克隆抗体、针对白细胞受体的单克隆抗体、针对MHC、CD2、CD3、CD4、CDl la/CD18、CD7、CD25、CD27、B7、CD40、CD45、CD58、CD137、ICOS、CD150(SLAM)、OX40、4-1BB)或它们的配体的单克隆抗体；或其它免疫调节化合物、CTLA4-Ig(阿巴西普、贝拉西普)、CD28-Ig、B7-H4-Ig、或其它共刺激剂或粘附分子抑制剂、mAb或低分子量抑制剂、LFA-1拮抗剂、选择素拮抗剂和VLA-4拮抗剂或另一免疫调节剂。
条款322.根据条款274所述的药物组合物、如条款200至269中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白、如条款270所述的多核苷酸、如条款271所述的表达载体或病毒、或如条款272所述的重组细胞，其用于治疗罹患感染性疾病的受试者的所述感染性疾病。
条款323.如条款322所述的药物组合物、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中所述蛋白质、所述多核苷酸、所述表达载体或病毒、所述重组细胞、所述药物组合物或所述用途用于治疗感染性疾病，并且能够进行以下中的至少一者：(i)增加免疫应答，(ii)增加T细胞活化，(iii)增加细胞毒性T细胞活性，(iv)增加NK细胞活性，(v)增加Thl7活性，(vi)缓和T细胞抑制，(vii)增加促炎性细胞因子分泌，(viii)增加IL-2分泌；(ix)增加由T细胞达成的干扰素-y产生，(x)增加Thl应答，(xi)降低Th2应答，(xii)降低或消除调节性T细胞(Treg)、骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的至少一者，(xiii)降低调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者的活性，(xiv)降低或消除M2巨噬细胞，(xv)降低M2巨噬细胞促肿瘤发生活性，(xvi)降低N2嗜中性白细胞，(xvii)降低N2嗜中性白细胞活性，(xviii)降低对T细胞活化的抑制，(xix)降低对CTL活化的抑制，(xx)降低对NK细胞活化的抑制，(xxi)逆转T细胞耗竭，(xxii)增加T细胞应答，(xxiii)增加细胞毒性细胞的活性，(xxiv)刺激抗原特异性记忆应答，(xxv)引发癌细胞的凋亡或溶解，(xxvi)刺激对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制性作用，(xxvii)诱导癌细胞的直接杀灭，和/或(xxviii)诱导补体依赖性细胞毒性和/或(xxix)诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
条款324.如条款321至323中任一项所述的药物组合物、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中所述感染性疾病是慢性感染性疾病，并且选自由细菌性感染、病毒性感染、真菌性感染和/或其它寄生虫感染引起的疾病。
条款325.如条款321至324中任一项所述的药物组合物、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中所述感染性疾病导致败血症。
条款326.如条款321至324中任一项所述的药物组合物、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中所述感染性疾病选自乙型肝炎、丙型肝炎、感染性单核细胞增多症、AIDS、结核、疟疾和血吸虫病。
条款327.如条款321至326中任一项所述的药物组合物、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中在有此需要的受试者中，治疗与用于治疗感染性疾病的另一部分，或与用于降低在基因疗法之后不合需要的免疫活化的另一部分组合。
条款328.如条款321至327中任一项所述的药物组合物、经分离多肽或融合蛋白、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或用途，其中所述其它部分是用于治疗细菌性感染、病毒性感染、真菌性感染、寄生虫性感染或败血症的治疗剂。
条款329.根据前述条款中任一项所述的化合物、组合物、方法或用途，其进一步包括与VSIG8激动剂或拮抗剂化合物分开或缀合于VSIG8激动剂或拮抗剂化合物的VISTA激动剂或拮抗剂化合物。
条款330.根据前述条款中任一项所述的融合蛋白、药物组合物、经分离多肽、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或方法或用途，其进一步包括与VSIG8激动剂或拮抗剂化合物分开或缀合于VSIG8激动剂或拮抗剂化合物的VISTA激动剂或拮抗剂，所述VSIG8激动剂或拮抗剂化合物优选包括抗VSIG8抗体、VSIG8蛋白或VSIG8融合蛋白。
条款330.一种在疗法中使用根据前述条款中任一项所述的VSIG8融合蛋白、药物组合物、经分离多肽、多核苷酸、表达载体或病毒、重组细胞或方法或用途的方法，其单独或与任何本文公开的其它治疗剂或活性剂尤其是免疫抑制剂组合优选用于抑制T细胞或NK免疫性，例如治疗自体免疫性、过敏、炎症、移植或败血症中的任一者。
实施例
实施例1：初始鉴定Vsig8作为推定Vista受体
VSIG8基于它与VISTA多聚体的结合而被鉴定为V-R
可溶性寡聚或多聚形式的VISTA即重组荧光VISTA19-dex用于筛选由Retrogenix(UK)http://www.retrogenix.com产生的膜蛋白质文库(约3800个独特基因)以在高通量结合测定中鉴定推定结合配偶体。通过促进VISTA寡聚化来设计这个可溶性配体以增强V-R与VISTA的结合。在一系列HEK293细胞中表达基因，并且荧光染料偶联的配体用于检测表达结合配偶体的细胞。
使用这个筛选方法，利用VISTA19-Dex将VSIG8鉴定为VISTA的结合配偶体。基于这个结果，在其它结合和功能性测定中评估VSIG8以确证这个蛋白质是否是VISTA受体。
通过抗VSIG8单克隆抗体来逆转VISTA-Ig介导的T细胞抑制
重组VISTA-Ig融合蛋白以剂量依赖性方式抑制抗CD3(OKT3)介导的体外T细胞增殖和细胞因子产生。因此，在抗VSIG8抗体例如可从Origene商购获得的抗VSIG8抗体(不具有激动性或拮抗性活性的阻断/中和抗体)存在下，VISTA-Fc的抑制作用将被抑制。
在这个测定中，用单独抗CD3抗体(OKT3)或CD3抗体加VISTA-Ig在37℃下涂布96孔板1小时。抗CD3和VISTA-Ig分别在最终浓度2.5和10ug/ml下使用。添加来自健康供给者外周血液的20万个纯化人T细胞至各孔中。
在抗VSIG mAb存在下进行一式两份实验。在37℃下将板孵育5天。在第5天，移除30UL上清液以用于细胞因子(IFN-γ和IL-2)分析，并且添加25UL氚化胸苷至细胞培养物中。再培养细胞8小时，随后通过氚合并来测量细胞增殖。这个测定的结果应揭示抗VSIG8抗体抑制或逆转VISTA-Ig对T细胞活性的抑制。
阻断VSIG8敲除细胞系中的VISTA功能(方法1)
构建VSIG8基因特异性shRNA慢病毒粒子以敲低VSIG8基因(Mission shRNA粒子，TCR文库来自Sigma)。Jurkat细胞用shRNA慢病毒粒子在优化多重性感染下转导以实现靶标基因的大于90％敲低而无非特异性基因缺失。接着在嘌呤霉素药物存在下选择经转导细胞。通过定量PCR确认靶标基因的敲低特异性和水平。接着在存在或不存在VISTA-Ig下用抗CD3刺激细胞。通过流式细胞计量术来评估CD69的水平，并且将通过ELISA来测量在72小时之后培养上清液中的IL-2表达。
这个测定应揭示其中VSIG8基因被敲除的细胞对VISTA-Ig介导的抑制无应答。
阻断VSIG8敲除细胞系中的VISTA功能(方法2)
构建VSIG8基因特异性shRNA慢病毒粒子以敲低VSIG8(Mission shRNA粒子，TCR文库来自Sigma)。来自健康供给者的T细胞用shRNA慢病毒粒子在优化多重性感染下转导以实现靶标基因的大于90％敲低而无非特异性基因缺失。在嘌呤霉素药物存在下选择经转导细胞。通过定量PCR确认靶标基因的敲低特异性和水平。在存在或不存在VISTA-Ig下，如上所述进行抗CD3介导的T细胞增殖测定。接着评估细胞因子和细胞增殖。
这个测定应类似地揭示其中VSIG8基因被敲除的细胞对VISTA-Ig介导的抑制无应答。
通过qPCR来检测VSIG8表达
为进一步确认VSIG8是VISTA的受体，进行检测由T细胞达成的VSIG8表达的测定。特定来说，进行qPCR测定，其将富集的人T细胞群体中的VSIG8的表达相对于总脾细胞的样品进行比较。
由从所指示细胞分离的RNA制备cDNA样品。使用模拟转染的COS7细胞作为对照，计算VSIG8的相对表达。(A)模拟转染的COS7细胞或VSIG8转染的COS7细胞分别用作阴性(-Ve)或阳性(+Ve)对照。在VSIG8转染的COS7细胞中而非在模拟转染的COS7细胞中检测到VSIG8表达。这证实在qPCR测定中的VSIG8鉴定特异性。在总人脾(B)和来自人外周血液的富集的CD3+ T细胞中检测到VSIG8的表达。
使用δCt表达式计算VSIG8的相对表达。如所预期，相较于总脾细胞样品，富集的T细胞群体表达极高水平的VSIG8mRNA。这些结果显示于图1XXX中。
实施例2：确证VSIG8是VISTA受体的实验
材料和方法
确认VSIG8特异性结合VISTA多肽的实验
使293细胞在具有10％FBS(Hyclone)的DMEM(Hyclone)中生长。在用VSIG8转染的前一天，用胰蛋白酶处理细胞，并且以1:4在总体积10ml下拆分至10cm盘中。在转染当天，当293达到60-80％汇合时，移除当前培养基，并且在10cm盘中用5ml新鲜培养基替换。
通过遵循转脂胺3000(Lipofectamine 3000)(Life Technologies)的说明书来进行转染。使5微克DNA与30UL转脂胺3000混合，并且在室温下孵育10分钟，随后添加于293细胞上。在5-6小时之后更换培养基，并且添加10ml新鲜培养基。
在2天之后，移除培养基，并且添加3ml PBS/0.5mM EDTA/0.02％叠氮化物于10cm盘上。在室温下孵育10秒。吸移细胞以制备单细胞混悬液。离心细胞，并且与20μg/mlVISTA-Fc(R&D Systems)或EpoR-Fc(R&D Systems)一起再混悬于具有5％FBS/0.5mM EDTA和0.02％叠氮化钠的PBS中。在冰上孵育细胞30分钟，用缓冲液洗涤，并且如上所述加以离心。接着将所得经孵育细胞再混悬于具有处于1:200下的抗人IgG Fc-APC(Biolegend)的染色缓冲液中，并且在冰上孵育30分钟。然后，接着洗涤细胞，离心并在MACSQuant 8参数流式细胞仪上操作。
对于用抗VSIG8血清阻断，添加1:20大鼠血清，在冰上孵育30分钟，接着洗涤并用如以上所述的VISTA-Ig染色。
为用抗VISTA抗体阻断，添加4μg/ml MAB或2μg/ml Fab至细胞中，随后添加20ug/ml V-Ig或EPO-R-Ig。接着在冰上孵育混合物30分钟。
DNA构建体含有双顺反子GFP。GFP通常与靶标基因表达成比例表达，因此GFP+细胞被门控以进行分析。
细胞-细胞接合研究
将A20细胞在PBS中洗涤一次，接着以1x106/ml再混悬于PBS中。添加1UL远红外或紫色染料(Life Technology，在DMSO中复原)至1ml细胞中。在室温下孵育20分钟。添加6ml具有10％FBS的HBSS，持续5分钟。将细胞以1x106/ml再混悬于HBSS中。
对于结合，使1x105个远红外标记的细胞(0.1ml)与1x105个紫色标记的细胞(0.1ml)在96孔板中组合。将细胞混合，并且在37℃下孵育45至60分钟。使用流式细胞计量术读取细胞荧光(APC通道用于远红外信号，紫色1通道用于紫色信号)。双重阳性群体指示细胞-细胞结合。
通过流式细胞计量术来进行的VSIG8表达分析
从至少18岁，大体上健康，以及从当地人群随机选择的供给者获得血液样品。接着将供给者血液从分离管转移至50ml锥形管中。
将15ml Ficoll 1077(SIGMA，10771)/25ml血液铺在下面，同时注意不与血液混合。接着在室温下在1250g下不间断离心细胞25分钟。
在离心之后，从Ficoll的相间分离白血细胞，并且接着将血清和经分离细胞稀释至40ml亨克斯平衡盐溶液(HBSS)中。然后，在4℃下在453g(1500rpm)下离心细胞混合物10分钟。
接着将含有细胞的所得离心物再混悬于50ml HBSS中，并且通过转移500μl至单独Eppendorf管中来计数。添加1x105个细胞至各孔中，如上所述进行离心。
接着将细胞再混悬于100μL含有10ug/mL兔抗VSIG8(Abcam或Novus)、1:100FcR抑制剂(eBioscience)、1.25ug/mL人IgG、2ug/mL抗CD16(R&D Systems)以及CD14 BV421、CD20PE、CD8 PerCP Cy5.5、CD4 PECy7、CD56 PECy7的谱系标志物的PBS中。
接着在4℃下将细胞于前述物中孵育20分钟，接着用100μL PBS洗涤，并且如上所述加以离心。接着在4℃下将细胞再混悬于100μL含有山羊抗兔IgG APC的PBS中持续15分钟，接着用100μL PBS洗涤，并且再次如上所述加以离心。
接着在Miltenyi MACSQuant流式细胞仪上操作所得样品。
通过RNA-Seq来进行的VSIG8表达分析
进行qPCR测定，其将富集的人T细胞群体中的VSIG8的表达相对于总脾细胞的样品进行比较。
由从所指示细胞分离的RNA制备cDNA样品。使用模拟转染的COS7细胞作为对照，计算VSIG8的相对表达。(A)模拟转染的COS7细胞或VSIG8转染的COS7细胞分别用作阴性(-Ve)或阳性(+Ve)对照。
在VSIG8转染的COS7细胞中而非在模拟转染的COS7细胞中检测到VSIG8表达。这证实在qPCR测定中的VSIG8鉴定特异性。在总人脾(B)和来自人外周血液的富集的CD3+ T细胞中检测到VSIG8的表达。
使用δCt表达式计算VSIG8的相对表达。如所预期，相较于总脾细胞样品，富集的T细胞群体表达极高水平的VSIG8mRNA。
VSIG8抗血清在A20/DO11 10测定中的功能性作用
细胞系产生：扩增全长hVISTA cDNA，并且克隆至来自Blue Sky的双顺反子载体pEF-MCS-IRES-ZsGreen的NheI–EcoRI位点中。使用Nucleofector试剂盒V，根据制造商说明书(Lonza，目录号VACA1003)将3种构建体(hVISTA/GFP和仅GFP)转染到A20小鼠B细胞系中。通过在G418选择(1mg/ml)的情况下生长来分离稳定表达性细胞。分选具有高GFP表达以及在G418选择(1.0mg/ml)下生长的细胞。随后将各细胞系的GFP高表达性细胞进行单细胞分选，并且通过在G418选择下生长和传代来产生克隆群体。将所得细胞汇合物指定为A20-GFP(仅表达GFP)和A20-hVISTA(表达全长人VISTA和GFP)。
培养基方案：组合500ml RPMI 1640(Corning，10-040-CV)与50ml FBS(CorningCellGro，批号103283HI)、5ml青霉素/链霉素(Lonza，17-602E)10,000U/ml、5ml L-谷氨酰胺(100x)(Gibco，25030-081)和5ml HEPES(1M)(Fisher，BP299-100)、50μMβ-巯基乙醇(Fisher，目录号03446-100)。对于各实验，新鲜制备培养基。
分离DO11.10T细胞：直接从转基因DO11.10小鼠分离DO11.10CD4+ T细胞。使小鼠(6-10周龄)安乐死，并且将脾无菌移除。使用2个无菌玻璃载片，将脾处理成于5ml 10％FBS培养基中的单细胞混悬液，并且在453g下离心细胞5分钟。添加10ml 10％FBS培养基，并且经40μM细胞滤网过滤并如上加以离心。通过使用CD4T细胞分离试剂盒II(Miltenyi 130-095-248)，遵循制造商说明书进行阴性选择来进行CD4T细胞分离。
在G418选择培养基(1.0mg/ml)中培养A20-GFP和A20-hVISTA直至它们达到约2-3x106个细胞/ml。细胞用完全全面培养基洗涤，并且在1x106个细胞/ml的浓度下再混悬。用10,000拉德照射细胞。如步骤5.3中所述离心细胞并在2x106个细胞/ml的浓度下再混悬于10％FBS培养基中，并且添加50μl至适当孔中。
添加含4X浓度的对照或VSIG8大鼠血清的50μl完全培养基至A20细胞中，并且在室温下孵育45分钟。血清的最终稀释度是1:200。添加50μl在2x106个细胞/ml的浓度下处于10％FBS培养基中的原代DO11.10T细胞至适当孔中。最后，将OVA肽(ISQ；ISQAVHAAHAEINEAGR，Peptides International，目录号POV-3636-PI)于10％FBS培养基中稀释至4X浓度，并且添加50μl至A20和DO11.10细胞中以实现所需最终浓度。ova肽以最终浓度12.5ng/ml被包括，例外之处是当在图例中指示时。
在37℃和5％CO2下孵育细胞3天。在第3天，如上所述离心96孔板，并且如下所述测定CD25的表达。在453g下离心96孔U形底板5分钟，并且移除上清液(在章节5中用于IFNγ或IL-2分析)。用200μl染色缓冲液(5％FBS于1xHBSS中，无Mg2+和Ca2+)洗涤细胞，并且再次离心。将细胞再混悬于50μl含有以下抗体的染色缓冲液中：CD25-APC 1:200(Biolegend目录号102034)和小鼠FcR结合抑制剂1:200(eBioscience目录号120-003-855)。在冰上在黑暗中孵育20分钟。添加150μl染色缓冲液，并且如上加以离心。用200μl染色缓冲液洗涤细胞并再次离心，并且将再细胞混悬于100μl具有1％BSA的PBS中。
在Miltenyi MACSQuant 8参数流式细胞仪上操作样品，并且使用FlowJo 9.7.5分析CD25在CD4+ T细胞群体上的表达。作为确定一组数值的集中趋势的统计量的几何平均荧光强度(MFI)作为确定性统计量用于比较各处理。
结果
以下提供如上文材料和方法中所述实现的确认VSIG8是VISTA受体的实验的结果。这些实验提供进一步证据确证VSIG8是VISTA受体。
特定来说，这些实验证明VISTA-Ig嵌合蛋白能够以特异性、抗体可逆方式结合VSIG8过表达性细胞；VSIG8mRNA和蛋白表达分析揭示VSIG8由淋巴细胞表达，其中最高表达在NK和CD8+ T细胞的情况下，如将对于推定VISTA受体所预期；并且功能性测定证明对VSIG8具有特异性的抗血清逆转VISTA介导的对T细胞应答的抑制。总之，这些结果证实本发明者的假设，即VSIG8是功能性结合配偶体，即VISTA的受体。
结合结果
将人VSIG8 IRES GFP或PD1 IRES GFP各自转染至293细胞中，接着用VISTA-Ig(R&D)、EpoR-Ig(R&D)、VISTA-Ig 19聚体或hIX-5(来自INX的VISTA-IgG1)染色这些细胞。通过流式细胞计量术来对GFP阳性细胞评估结合。
如图8中所示，VISTA-Ig(R&D)以及VISTA 19聚体两者均强力染色VSIG8过表达性细胞，同时不显示结合PD1过表达性细胞的迹象(参见图8)。此外，hIX-5和EpoR-Ig不显示结合VSIG8或PD1过表达性细胞的迹象(参见图8)。这些结果确证VISTA多肽特异性结合VSIG-8，如对于预测VISTA受体所预期。更具体来说，图8显示VISTA融合蛋白特异性结合VSIG8过表达性293细胞。在这些结合实验中，用含有VSIG8或PD1的IRES GFP双顺反子载体转染293细胞。门控GFP阳性细胞，并且通过流式细胞计量术来评估以下融合蛋白的结合：VISTA Ig(R&D Systems)、EpoR-Ig(R&D Systems)、hIX-5(INX VISTA-Ig)和VISTA 19聚体(INXVISTA多聚体)。使用抗IgG二级抗体检测融合蛋白。
如图8中的实验中所示，VISTA融合蛋白特异性结合VSIG8过表达性293细胞。在这些实验中，用含有VSIG8或PD1的IRES GFP双顺反子载体转染293细胞。门控GFP阳性细胞，并且通过流式细胞计量术来评估以下融合蛋白的结合：VISTA Ig(R&D Systems)EpoR-Ig(R&DSystems)、hIX-5(INX VISTA-Ig)和VISTA 19聚体(INX VISTA多聚体)。使用IgG二级抗体检测融合蛋白。
为进一步测试VISTA-Ig与VSIG8之间的相互作用的特异性，如图9中所描绘进行比较针对VSIG8和VISTA的抗体阻断VISTA Ig与VSIG8之间的相互作用的能力的实验。在这些实验中，如图8中所述转染293细胞，并且用VISTA-Ig(R&D Systems，用于A和B；VISTA 19聚体用于C)染色。来自VSIG8免疫大鼠或对照大鼠的血清用于潜在阻断相互作用(A、C)。另外，也相较于对照抗体来测试VISTA抗体(mAb)和各Fab(Fab)阻断相互作用的能力(B、C)。
如可由图9中的实验所见，在来自VSIG8免疫大鼠而非对照大鼠的抗血清存在下，结合得以极大降低，从而指示VISTA-Ig与VSIG8之间具有特异性相互作用(图9A)。另外，多种抗VISTA抗体和Fab也能够特异性阻断VISTA与VSIG8之间的相互作用(图9B)。此外，当用VISTA 19聚体进行类似研究时，也观察到对VISTA结合的逆转(图9C)。
因为小鼠和人VSIG8具有86％同源性，所以进行实验以评估人VISTA-Ig是否将类似地优先结合小鼠VSIG8。这些实验包含于图10中。在这些实验中，用小鼠VSIG8或PD1转染293细胞，并且如上所述用人VISTA-Ig(R&D Systems)染色。图10中的结果指示VISTA-Ig展现低水平的结合小鼠VSIG8过表达性细胞的能力。相较于PD1对照组，来自mVSIG8组的一小群GFP阳性细胞由VISTA-Ig结合。具体来说，在VISTA-Ig与mVSIG8之间观察到少量结合，而在VISTA-Ig与PD1之间未观察到结合(图10)。
进行图11中所示的额外实验以测定VISTA和VSIG8的结合。这些实验使用不同系统，即细胞-细胞接合测定来检测VISTA过表达性细胞是否结合VSIG8过表达性细胞。PDL1和PD1用作阳性对照，并且VSIG8-VSIG8用作阴性对照。这些实验使用用VISTA、VSIG8、PD-L1或PD1转染，接着用荧光染料标记的A20细胞。将这些经转染细胞一起培养，并且通过流式细胞计量术来检查细胞接合或各细胞群体的结合。双重阳性细胞数指示接合水平。VSIG8/VSIG8用作阴性对照，并且PD1/PD-L1用作阳性对照。如所预期，使用这个系统，相比于用阴性对照样品，VISTA和VSIG8结合显示更高结合水平。然而，基于接合细胞的百分比，相互作用不如同在PD-L1和PD1的情况下所见一样强烈。
进行图12和13中所示的额外实验以通过使用流式细胞计量术(用以检测VSIG8蛋白表达)和RNAseq(用以检测VSIG8mRNA表达)来测定由特定细胞达成的VSIG8表达。使用两种可商购获得的抗体进行这些实验。
在图12中的实验中，显示针对VSIG8的抗体结合CD8+ T细胞和NK细胞。这些实验使用分离并用两种可商购获得即由Abcam和NOVUS销售的抗VSIG8抗体染色的人PMBC。针对CD14、CD4、CD8和CD56的谱系染色用于鉴定结合于抗VSIG8抗体的不同免疫细胞群体。这些实验的结果，特别是人PBMC的染色样式，指示在CD8+ T细胞群体和CD56+NK细胞群体中稳健表达。根据抗体分析，CD14+单核细胞和CD4+ T细胞不呈染色阳性。具体来说，如图12中所示，针对VSIG8的抗体特异性结合于CD8+ T细胞和NK细胞。
进行图13中所示的由本发明者进行的额外实验以使用RNA-seq检测由其它经分离PBMC群体达成的VSIG8mRNA表达。在实验中，通过流式细胞计量术来分离人PBMC，通过对VSIG8的RNA-seq分析来确定mRNA的表达。使用这个技术，在CD4+ T细胞和CD8+ T细胞中，而非在CD20+B细胞或CD14+单核细胞中检测到信息。另外，也检查Jurkat T细胞系的mRNA表达。图13中的结果揭示VSIG8mRNA在人CD4+和CD8+ T细胞中表达。
由本发明者进行额外实验以评估VSIG8/VISTA结合相互作用对VISTA的生物活性的功能性作用。如本申请中所公开，已显示VISTA会抑制T细胞应答。这些实验含于图14中，并且提供确证证据表明VISTA通过VSIG8向T细胞传导信号以抑制T细胞活化。在这些实验中，使表达GFP(对照)或VISTA+GFP的A20细胞与DO11.10T细胞一起在ISQ肽存在下孵育。通过在72小时时的CD25表达来测量T细胞活化。
这些实验使用过表达人VISTA的A20细胞，因为这些细胞能够在体外抑制鼠类T细胞应答。具体来说，在实验中，这些A20细胞用ISQ肽进行脉冲处理。从小鼠的脾分离对ISQ肽具有特异性的DO11.10CD4+ T细胞，并且与经脉冲处理的A20细胞一起孵育。在72小时之后，通过CD25的表达来测量T细胞的活化状况。在这个系统中，在A20细胞上过表达VISTA导致对DO11.10T细胞应答的抑制。
抗VISTA抗体能够逆转抑制(数据未显示)。使用这个系统，我们测试添加VSIG8抗血清是否将类似地逆转或抑制VISTA介导的抑制。如所示，对照血清不逆转VISTA的抑制。相比来说，添加VSIG8抗血清导致T细胞应答增强。这个结果进一步证明VISTA和VSIG8的结合具有功能性作用，即这个结合相互作用引发VISTA相关的生物活性，特别是它对T细胞应答的抑制作用，并且确证VISTA拮抗剂可用于抑制VISTA对免疫性的抑制作用，例如VISTA对T细胞应答的抑制作用。图14中的结果证实VSIG8是VISTA受体，并且VISTA通过VSIG8向T细胞传导信号以诱发抑制性信号。
在VSIG8小鼠的情况下的其它表型数据提供VSIG8和VISTA具有功能关系的次要证据。对VSIG8敲除小鼠的初步分析存在于http://www.mousephenotype.org/处。发现在WT小鼠与VSIG8KO小鼠之间，若干参数在统计上不同，包括对T细胞和NK T细胞区室的变化。变化可见于以下链接处：http://www.mousephenotype.org/data/genes/MGI:3642995# section-associations。
实施例3：A20功能性测定
这个实施例进一步评估VSIG8在同一VSIG表达性A20系统(B细胞)中的功能。一般来说，测定包括以下步骤：
处理A20-VSIG8细胞2或24小时
1.Ig处理：一组用EPOR-Ig，一组用VISTA-Ig
2.活化
·PMA(10ng/ml)/洛诺霉素(0.5ug/ml)
·LPS(10ug/ml)
·aCD40(10ug/ml)/IL-4(10ng/ml)
·不处理
3.读数：
i.细胞计数
ii.流式分析(CD86、CD25、CD69、PD1、MHC-II-1A)
iii.细胞因子(Luminex,32-plex)
iv.RNA Seq
以下所示的这个功能性测定中使用的详细方法和材料。
材料和方法
通过电穿孔将DNA转染至A20中来产生A20-hVSIG8细胞系。用新霉素选择细胞，接着分选GFP+细胞(稳定汇合物)。通过用大鼠抗VSIG8血清染色细胞来确认人VSIG8蛋白表达。
将50万至100万个A20细胞接种至具有EPOR-Ig或VISTA-Ig的24孔板中。使用4种细胞活化方案：1-PMA(10ng/ml)/洛诺霉素(0.5ug/ml)，2-LPS(10ug/ml)，3-抗CD40(10ug/ml)/IL-4(10ng/ml)，4-不处理。在两个时间点-孵育2小时和24小时分别收集细胞。分析包括细胞计数、流式细胞仪(CD86、PD1、MHC-II-1A)、对上清液的蛋白质分析(Luminex)、基因表达分析(RNA seq)。
结果
利用上述方法，使用PMA/洛诺霉素处理以及在较小强度的情况下使用LPS或抗CD40/IL-4使A20-hVISG8细胞活化24小时。这个实验的结果含于图15中。可见在用VISTA-Ig处理这些细胞后，在进行以及不进行活化的情况下，PD1被上调。另外，对照A20-GFP用于确认PD1上调具有特异性，即是VISTA/VSIG8结合相互作用的结果。
本申请中引用的参考文献
本申请中引用以下参考文献。本申请中引用的这些参考文献和所有其它参考文献的内容以引用的方式整体并入本文。
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VSIG8序列
SEQ ID NO：1：智人VSIG8多肽序列
SEQ ID NO：2：小鼠VSIG8多肽序列
SEQ ID NO：3：食蟹猕猴VSIG8多肽序列
SEQ ID NO：4：智人VSIG8核酸序列
SEQ ID NO：5：小鼠VSIG8核酸序列
SEQ ID NO:6：智人VISTA(替代性名称：B7-H5；B7H5；DD1α；GI24；PP2135；SISP1)氨基酸序列
SEQ ID NO:7：小鼠VISTA氨基酸序列
SEQ ID NO:8：小鼠VISTA氨基酸序列
SEQ ID NO:9：智人VISTA(替代性名称：B7-H5；B7H5；DD1α；GI24；PP2135；SISP1)核酸序列
SEQ ID NO:10：智人VISTA(替代性名称：B7-H5；B7H5；DD1α；GI24；PP2135；SISP1)编码核酸序列
SEQ ID NO:11：小鼠VISTA编码核酸序列
 序列表
<110> 伊穆奈克斯特股份有限公司
M·莫洛伊
Y·郭
J·罗斯坦
<120> 鉴定VSIG8作为推定VISTA受体（V-R）及其用以产生VISTA/VSIG8激动剂和拮抗剂的用途
<130> 43260.1213
<140> tba
<141> 2015-12-05
<150> 62/088,058
<151> 2014-12-05
<160> 11
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 414
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Arg Val Gly Gly Ala Phe His Leu Leu Leu Val Cys Leu Ser Pro
1 5 10 15
Ala Leu Leu Ser Ala Val Arg Ile Asn Gly Asp Gly Gln Glu Val Leu
20 25 30
Tyr Leu Ala Glu Gly Asp Asn Val Arg Leu Gly Cys Pro Tyr Val Leu
35 40 45
Asp Pro Glu Asp Tyr Gly Pro Asn Gly Leu Asp Ile Glu Trp Met Gln
50 55 60
Val Asn Ser Asp Pro Ala His His Arg Glu Asn Val Phe Leu Ser Tyr
65 70 75 80
Gln Asp Lys Arg Ile Asn His Gly Ser Leu Pro His Leu Gln Gln Arg
85 90 95
Val Arg Phe Ala Ala Ser Asp Pro Ser Gln Tyr Asp Ala Ser Ile Asn
100 105 110
Leu Met Asn Leu Gln Val Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Glu Cys Arg Val
115 120 125
Lys Lys Thr Thr Met Ala Thr Arg Lys Val Ile Val Thr Val Gln Ala
130 135 140
Arg Pro Ala Val Pro Met Cys Trp Thr Glu Gly His Met Thr Tyr Gly
145 150 155 160
Asn Asp Val Val Leu Lys Cys Tyr Ala Ser Gly Gly Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Tyr Lys Trp Ala Lys Ile Ser Gly His His Tyr Pro Tyr Arg Ala
180 185 190
Gly Ser Tyr Thr Ser Gln His Ser Tyr His Ser Glu Leu Ser Tyr Gln
195 200 205
Glu Ser Phe His Ser Ser Ile Asn Gln Gly Leu Asn Asn Gly Asp Leu
210 215 220
Val Leu Lys Asp Ile Ser Arg Ala Asp Asp Gly Leu Tyr Gln Cys Thr
225 230 235 240
Val Ala Asn Asn Val Gly Tyr Ser Val Cys Val Val Glu Val Lys Val
245 250 255
Ser Asp Ser Arg Arg Ile Gly Val Ile Ile Gly Ile Val Leu Gly Ser
260 265 270
Leu Leu Ala Leu Gly Cys Leu Ala Val Gly Ile Trp Gly Leu Val Cys
275 280 285
Cys Cys Cys Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Arg Gly Ala Phe Gly
290 295 300
Tyr Gly Asn Gly Gly Gly Val Gly Gly Gly Ala Cys Gly Asp Leu Ala
305 310 315 320
Ser Glu Ile Arg Glu Asp Ala Val Ala Pro Gly Cys Lys Ala Ser Gly
325 330 335
Arg Gly Ser Arg Val Thr His Leu Leu Gly Tyr Pro Thr Gln Asn Val
340 345 350
Ser Arg Ser Leu Arg Arg Lys Tyr Ala Pro Pro Pro Cys Gly Gly Pro
355 360 365
Glu Asp Val Ala Leu Ala Pro Cys Thr Ala Ala Ala Ala Cys Glu Ala
370 375 380
Gly Pro Ser Pro Val Tyr Val Lys Val Lys Ser Ala Glu Pro Ala Asp
385 390 395 400
Cys Ala Glu Gly Pro Val Gln Cys Lys Asn Gly Leu Leu Val
405 410
<210> 2
<211> 417
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 2
Met Gly Val Arg Gly Ala Leu His Leu Leu Leu Val Cys Leu Ser Pro
1 5 10 15
Ala Leu Leu Ser Ala Val Arg Ile Asn Gly Asp Gly Gln Glu Val Met
20 25 30
Tyr Leu Ala Glu Gly Asp Asn Val Arg Leu Gly Cys Pro Tyr Leu Leu
35 40 45
Asp Pro Glu Asp Leu Gly Thr Asn Ser Leu Asp Ile Glu Trp Met Gln
50 55 60
Val Asn Ser Glu Pro Ser His Arg Glu Asn Val Phe Leu Thr Tyr Gln
65 70 75 80
Asp Lys Arg Ile Gly His Gly Asn Leu Pro His Leu Gln Gln Arg Val
85 90 95
Arg Phe Ala Ala Ser Asp Pro Ser Gln Tyr Asp Ala Ser Ile Asn Leu
100 105 110
Met Asn Leu Gln Val Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Glu Cys Arg Val Lys
115 120 125
Lys Thr Thr Met Ala Thr Arg Lys Val Ile Val Thr Val Gln Ala Arg
130 135 140
Pro Ala Val Pro Met Cys Trp Thr Glu Gly His Met Ser Lys Gly Asn
145 150 155 160
Asp Val Val Leu Lys Cys Phe Ala Asn Gly Gly Ser Gln Pro Leu Ser
165 170 175
Tyr Lys Trp Ala Lys Ile Ser Gly His Ser His Pro Tyr Arg Ala Gly
180 185 190
Ala Tyr His Ser Gln His Ser Phe His Ser Glu Leu Ser Tyr Gln Glu
195 200 205
Ser Phe His Ser Thr Ile Asn Gln Gly Leu Gly Asn Gly Asp Leu Leu
210 215 220
Leu Lys Gly Ile Asn Ala Asp Asp Asp Gly Leu Tyr Gln Cys Thr Val
225 230 235 240
Ala Asn His Val Gly Tyr Ser Val Cys Val Val Glu Val Lys Val Ser
245 250 255
Asp Ser Gln Arg Val Gly Met Ile Val Gly Ala Val Leu Gly Ser Leu
260 265 270
Leu Met Leu Ala Cys Leu Ala Leu Gly Ile Trp Gly Leu Ile Cys Cys
275 280 285
Cys Cys Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Ala Arg Gly Ala Phe Gly Tyr
290 295 300
Gly Val Gly Gly Gly Val Gly Gly Gly Ala Cys Gly Asp Leu Ala Ser
305 310 315 320
Glu Ile Arg Val Asp Ala Glu Ala Pro Gly Cys Lys Ala Ser Gly Arg
325 330 335
Gly Ser Arg Val Thr His Leu Leu Gly Tyr Pro Thr Gln Asn Val Ser
340 345 350
Arg Ser Leu Arg Arg Lys Tyr Ala Pro Pro Pro Cys Gly Gly Pro Glu
355 360 365
Asp Val Ala Leu Val Pro Arg Thr Ala Ser Ala Ser Cys Glu Ala Gly
370 375 380
Pro Ser Pro Val Tyr Ile Lys Val Lys Ser Ala Glu Pro Ala Asp Cys
385 390 395 400
Ala Asp Cys Ala Gln Val Glu Gln Arg Ser Cys Lys Asp Gly Leu Leu
405 410 415
Val
<210> 3
<211> 414
<212> PRT
<213> 食蟹猕猴
<400> 3
Met Gly Val Gly Gly Ala Phe His Leu Leu Leu Val Cys Leu Ser Pro
1 5 10 15
Ala Leu Leu Ser Ala Val Arg Ile Asn Gly Asp Gly Gln Glu Val Leu
20 25 30
Tyr Leu Ala Glu Gly Asp Asn Val Arg Leu Gly Cys Pro Tyr Val Leu
35 40 45
Asp Pro Glu Asp Tyr Gly Pro Asn Gly Leu Asp Ile Glu Trp Met Gln
50 55 60
Val Asn Ser Asp Pro Ala His His Arg Glu Asn Val Phe Leu Ser Tyr
65 70 75 80
Gln Asp Lys Arg Ile Asn His Gly Asn Leu Pro His Leu Gln Gln Arg
85 90 95
Val Arg Phe Ala Ala Ser Asp Pro Ser Gln Tyr Asp Ala Ser Ile Asn
100 105 110
Leu Met Asn Leu Gln Val Ser Asp Thr Ala Thr Tyr Glu Cys Arg Val
115 120 125
Lys Lys Thr Thr Met Ala Thr Arg Lys Val Ile Val Thr Val Gln Ala
130 135 140
Arg Pro Ala Val Pro Met Cys Trp Thr Glu Gly His Met Thr His Gly
145 150 155 160
Asn Asp Val Val Leu Lys Cys Tyr Ala Asn Gly Gly Ser Gln Pro Leu
165 170 175
Ser Tyr Lys Trp Ala Lys Ile Ser Gly His His Tyr Pro Tyr Arg Ala
180 185 190
Gly Ser Tyr Thr Ser Gln His Ser Tyr His Ser Glu Leu Ser Tyr Gln
195 200 205
Glu Ser Phe His Ser Ser Ile Asn Gln Gly Leu Asn Asn Gly Asp Leu
210 215 220
Val Leu Lys Asp Ile Ser Arg Ala Asp Asp Gly Leu Tyr Gln Cys Thr
225 230 235 240
Val Ala Asn Asn Val Gly Tyr Ser Val Cys Val Val Glu Val Lys Val
245 250 255
Ser Asp Ser Arg Arg Ile Gly Val Ile Ile Gly Ala Ile Leu Gly Ser
260 265 270
Leu Leu Ala Leu Gly Cys Leu Ala Val Gly Ile Trp Gly Leu Val Cys
275 280 285
Cys Cys Cys Gly Gly Ser Gly Ala Gly Gly Ala Arg Gly Ala Phe Gly
290 295 300
Tyr Gly Asn Gly Gly Gly Val Gly Gly Gly Ala Cys Gly Asp Leu Ala
305 310 315 320
Ser Glu Ile Arg Glu Asp Ala Val Ala Pro Gly Cys Lys Ala Ser Gly
325 330 335
Arg Gly Ser Arg Val Thr His Leu Leu Gly Tyr Pro Thr Gln Asn Val
340 345 350
Ser Arg Ser Leu Arg Arg Lys Tyr Ala Pro Pro Pro Cys Gly Gly Pro
355 360 365
Glu Asn Val Ala Leu Ala Pro Cys Thr Ala Ala Ala Ala Cys Glu Ala
370 375 380
Gly Pro Ser Pro Val Tyr Val Lys Val Lys Ser Ala Glu Pro Ala Asp
385 390 395 400
Cys Ala Glu Gly Pro Val Gln Cys Lys Asn Gly Leu Leu Val
405 410
<210> 4
<211> 1437
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
agacggagga aacaccgagc ctagagacat gagagttgga ggagcattcc accttctact 60
cgtgtgcctg agcccagcac tgctgtctgc tgtgcggatc aacggggatg gacaggaggt 120
cctgtacctg gcagaaggtg ataatgtgag gctgggctgc ccctacgtcc tggaccctga 180
ggactatggt cccaatgggc tggacatcga gtggatgcag gtcaactcag accccgccca 240
ccaccgagag aacgtgttcc ttagttacca ggacaagagg atcaaccatg gcagccttcc 300
ccatctgcag cagagggtcc gctttgcagc ctcagaccca agccagtacg atgcctccat 360
caacctcatg aacctgcagg tatctgatac agccacttat gagtgccggg tgaagaagac 420
caccatggcc acccggaagg tcattgtcac tgtccaagca cgacctgcag tgcccatgtg 480
ctggacagag ggccacatga catatggcaa cgatgtggtg ctgaagtgct atgccagtgg 540
gggctcccag cccctctcct acaagtgggc caagatcagt gggcaccatt acccctatcg 600
agctgggtct tacacctccc agcacagcta ccactcagag ctgtcctacc aggagtcctt 660
ccacagctcc ataaaccaag gcctgaacaa tggggacctg gtgttgaagg atatctccag 720
agcagatgat gggctgtatc agtgcacagt ggccaacaac gtgggctaca gtgtttgtgt 780
ggtggaggtg aaggtctcag actcccggcg tataggcgtg atcatcggca tcgtcctggg 840
ctctctgctc gcgctgggct gcctggccgt aggcatctgg gggctcgtct gctgctgctg 900
cgggggctcc ggggctggcg gcgcccgcgg tgccttcggc tacggcaacg gcggcggggt 960
cggcggaggg gcctgcggcg acttggctag tgagatcaga gaggacgccg tggcgcccgg 1020
gtgcaaggcc agcgggcgcg gcagccgcgt cacccacctc ctggggtacc cgacgcagaa 1080
cgtcagccgc tccctgcgcc gcaagtacgc gcctcccccc tgcggcggcc ccgaggacgt 1140
ggccctggcg ccctgcaccg ccgccgccgc ctgcgaagcg ggcccctccc cggtctacgt 1200
caaggtcaag agcgcggagc cggctgactg cgccgagggg ccggtgcagt gcaagaacgg 1260
cctcttggtg tgagcgcgcg cgccgggccg ggctgcgccc cagccaggag gagggcgcgg 1320
ggctctctgt ctgcagctgg ggacacgtcg gggctgggga cgacctcgct cgccccaggc 1380
tgccaggcgg ctgggggtga aggcatttcc ctaaggaaat gcgtagggag gcagagc 1437
<210> 5
<211> 1802
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 5
gactcattgc atcttcctgc caccccgggc agtgtctggg ccctccgctc cccctccctc 60
cacctgcccc ttccacccac caccaccagc ccactggagc ccagctcagg cggaggaaag 120
accaagccta gagacatggg agttcgagga gcactccatc ttctacttgt gtgcctgagc 180
ccagcactgt tgtctgctgt aaggatcaac ggggatggcc aggaggtcat gtacctggca 240
gaaggtgaca atgtgaggct aggctgtccc tacctcctgg atcctgagga tttgggtacc 300
aacagtctgg acattgagtg gatgcaagtc aactcagagc cctcacacag ggagaatgtt 360
tttcttactt atcaagacaa gaggataggt catggcaacc tcccccatct gcagcagagg 420
gtccgctttg cagcctcaga ccccagccag tacgatgcct ccatcaacct catgaacctg 480
caggtatctg acacagcaac ctatgagtgc cgggtgaaga agaccaccat ggccaccagg 540
aaggtcattg tcactgtcca agcacgtcct gcggtgccca tgtgttggac ggaaggccac 600
atgtcaaagg gcaacgatgt ggtgctgaag tgctttgcca acggaggctc tcagcccctc 660
tcctacaagt gggccaagat cagtgggcac agtcacccct accgagctgg ggcttaccac 720
tcacagcaca gcttccactc tgagctttct taccaagagt cattccacag caccatcaac 780
caaggcctgg gcaacggaga cctgctgttg aagggcatca acgcagacga cgatgggctg 840
tatcagtgca cagtggccaa ccatgtgggc tacagcgtct gtgtggtaga ggtgaaagtc 900
tcagactccc agcgagtagg catgatcgtt ggagcagtgc tgggctcttt gctcatgctg 960
gcctgcctgg cactaggcat ctgggggctc atctgctgct gctgcggagg cggcggggcc 1020
ggtggtgccc gaggtgcctt cggctacggg gtcggcggcg gggtcggcgg aggggcctgc 1080
ggcgacttgg ctagtgagat cagagtggac gccgaggcgc ccgggtgtaa ggccagcggg 1140
cgcggcagcc gcgtcaccca cctcctgggg tacccggcgc agaacgtcag ccgctccagg 1200
cgccgcaagt acgcgcctcc gccctgcggc ggccccgagc acgtggccct agtgccccgc 1260
accgcctccg cctcctgcga agcgggtccc tcccccgtct acatcaaggt caagagcgcg 1320
gagccggccg actgcgccga ctgtgcccag gtcgagcagc gctcgtgcaa ggacggcctc 1380
ttagtgtgag cgcacagcac cgggctgcgc cccggctggg aggtggttcg ggggctctct 1440
gcccgcagct ggggacaggt tcgggccagc agacctggct ctctcattgg ccacctagcg 1500
gtggtaagga aatttccctc tgagaagcca agccgggcag accctcctcc cctgtagtgg 1560
gaggagaggc gggggagaca gaaaacagtt cagagctctc cctcacccct ggtttccagg 1620
gagaggaagg gagaggagag ctgtcggtat cccagaaccg cagaggtaca acccagatgt 1680
ccccagccaa ggcgagggcc ccccagccct gggtaggtgg atgtcagggc tgaattgctc 1740
tgtgtgtgag atctgagctc caaggcaaca gtgttagcac aataaagaaa cttaaagact 1800
gg 1802
<210> 6
<211> 311
<212> PRT
<213> 智人
<400> 6
Met Gly Val Pro Thr Ala Leu Glu Ala Gly Ser Trp Arg Trp Gly Ser
1 5 10 15
Leu Leu Phe Ala Leu Phe Leu Ala Ala Ser Leu Gly Pro Val Ala Ala
20 25 30
Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln
35 40 45
Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His
50 55 60
Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val
65 70 75 80
Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu Thr Phe Gln Asp
85 90 95
Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Asn Thr Ser His Asp
100 105 110
Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn
115 120 125
Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr
130 135 140
Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg Val
145 150 155 160
His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro Ser
165 170 175
Asn Cys Val Val Tyr Pro Ser Ser Ser Gln Asp Ser Glu Asn Ile Thr
180 185 190
Ala Ala Ala Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys Leu
195 200 205
Pro Leu Ile Leu Leu Leu Val Tyr Lys Gln Arg Gln Ala Ala Ser Asn
210 215 220
Arg Arg Ala Gln Glu Leu Val Arg Met Asp Ser Asn Ile Gln Gly Ile
225 230 235 240
Glu Asn Pro Gly Phe Glu Ala Ser Pro Pro Ala Gln Gly Ile Pro Glu
245 250 255
Ala Lys Val Arg His Pro Leu Ser Tyr Val Ala Gln Arg Gln Pro Ser
260 265 270
Glu Ser Gly Arg His Leu Leu Ser Glu Pro Ser Thr Pro Leu Ser Pro
275 280 285
Pro Gly Pro Gly Asp Val Phe Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro Asp
290 295 300
Ser Pro Asn Phe Glu Val Ile
305 310
<210> 7
<211> 308
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 7
Met Gly Val Pro Ala Val Pro Glu Ala Ser Ser Pro Arg Trp Gly Thr
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ile Phe Leu Ala Ala Ser Arg Gly Leu Val Ala Ala
20 25 30
Phe Lys Val Thr Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln
35 40 45
Asn Ala Thr Leu Thr Cys Arg Ile Leu Gly Pro Val Ser Lys Gly His
50 55 60
Asp Val Thr Ile Tyr Lys Thr Trp Tyr Leu Ser Ser Arg Gly Glu Val
65 70 75 80
Gln Met Cys Lys Glu His Arg Pro Ile Arg Asn Phe Thr Leu Gln His
85 90 95
Leu Gln His His Gly Ser His Leu Lys Ala Asn Ala Ser His Asp Gln
100 105 110
Pro Gln Lys His Gly Leu Glu Leu Ala Ser Asp His His Gly Asn Phe
115 120 125
Ser Ile Thr Leu Arg Asn Val Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Tyr Cys
130 135 140
Cys Leu Val Ile Glu Leu Lys Asn His His Pro Glu Gln Arg Phe Tyr
145 150 155 160
Gly Ser Met Glu Leu Gln Val Gln Ala Gly Lys Gly Ser Gly Ser Thr
165 170 175
Cys Met Ala Ser Asn Glu Gln Asp Ser Asp Ser Ile Thr Ala Ala Ala
180 185 190
Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys Leu Pro Leu Ile
195 200 205
Leu Leu Leu Val Tyr Lys Gln Arg Gln Val Ala Ser His Arg Arg Ala
210 215 220
Gln Glu Leu Val Arg Met Asp Ser Asn Thr Gln Gly Ile Glu Asn Pro
225 230 235 240
Gly Phe Glu Thr Thr Pro Pro Phe Gln Gly Met Pro Glu Ala Lys Thr
245 250 255
Arg Pro Pro Leu Ser Tyr Val Ala Gln Arg Gln Pro Ser Glu Ser Gly
260 265 270
Arg Tyr Leu Leu Ser Asp Pro Ser Thr Pro Leu Ser Pro Pro Gly Pro
275 280 285
Gly Asp Val Phe Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro Asp Ser Pro Asn
290 295 300
Ser Glu Ala Ile
305
<210> 8
<211> 309
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 8
Met Gly Val Pro Ala Val Pro Glu Ala Ser Ser Pro Arg Trp Gly Thr
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Ile Phe Leu Ala Ala Ser Arg Gly Leu Val Ala Ala
20 25 30
Phe Lys Val Thr Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln
35 40 45
Asn Ala Thr Leu Thr Cys Arg Ile Leu Gly Pro Val Ser Lys Gly His
50 55 60
Asp Val Thr Ile Tyr Lys Thr Trp Tyr Leu Ser Ser Arg Gly Glu Val
65 70 75 80
Gln Met Cys Lys Glu His Arg Pro Ile Arg Asn Phe Thr Leu Gln His
85 90 95
Leu Gln His His Gly Ser His Leu Lys Ala Asn Ala Ser His Asp Gln
100 105 110
Pro Gln Lys His Gly Leu Glu Leu Ala Ser Asp His His Gly Asn Phe
115 120 125
Ser Ile Thr Leu Arg Asn Val Thr Pro Arg Asp Ser Gly Leu Tyr Cys
130 135 140
Cys Leu Val Ile Glu Leu Lys Asn His His Pro Glu Gln Arg Phe Tyr
145 150 155 160
Gly Ser Met Glu Leu Gln Val Gln Ala Gly Lys Gly Ser Gly Ser Thr
165 170 175
Cys Met Ala Ser Asn Glu Gln Asp Ser Asp Ser Ile Thr Ala Ala Ala
180 185 190
Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys Leu Pro Leu Ile
195 200 205
Leu Leu Leu Val Tyr Lys Gln Arg Gln Val Ala Ser His Arg Arg Ala
210 215 220
Gln Glu Leu Val Arg Met Asp Ser Ser Asn Thr Gln Gly Ile Glu Asn
225 230 235 240
Pro Gly Phe Glu Thr Thr Pro Pro Phe Gln Gly Met Pro Glu Ala Lys
245 250 255
Thr Arg Pro Pro Leu Ser Tyr Val Ala Gln Arg Gln Pro Ser Glu Ser
260 265 270
Gly Arg Tyr Leu Leu Ser Asp Pro Ser Thr Pro Leu Ser Pro Pro Gly
275 280 285
Pro Gly Asp Val Phe Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro Asp Ser Pro
290 295 300
Asn Ser Glu Ala Ile
305
<210> 9
<211> 4774
<212> DNA
<213> 智人
<400> 9
gggggcgggt gcctggagca cggcgctggg gccgcccgca gcgctcactc gctcgcactc 60
agtcgcggga ggcttccccg cgccggccgc gtcccgcccg ctccccggca ccagaagttc 120
ctctgcgcgt ccgacggcga catgggcgtc cccacggccc tggaggccgg cagctggcgc 180
tggggatccc tgctcttcgc tctcttcctg gctgcgtccc taggtccggt ggcagccttc 240
aaggtcgcca cgccgtattc cctgtatgtc tgtcccgagg ggcagaacgt caccctcacc 300
tgcaggctct tgggccctgt ggacaaaggg cacgatgtga ccttctacaa gacgtggtac 360
cgcagctcga ggggcgaggt gcagacctgc tcagagcgcc ggcccatccg caacctcacg 420
ttccaggacc ttcacctgca ccatggaggc caccaggctg ccaacaccag ccacgacctg 480
gctcagcgcc acgggctgga gtcggcctcc gaccaccatg gcaacttctc catcaccatg 540
cgcaacctga ccctgctgga tagcggcctc tactgctgcc tggtggtgga gatcaggcac 600
caccactcgg agcacagggt ccatggtgcc atggagctgc aggtgcagac aggcaaagat 660
gcaccatcca actgtgtggt gtacccatcc tcctcccagg atagtgaaaa catcacggct 720
gcagccctgg ctacgggtgc ctgcatcgta ggaatcctct gcctccccct catcctgctc 780
ctggtctaca agcaaaggca ggcagcctcc aaccgccgtg cccaggagct ggtgcggatg 840
gacagcaaca ttcaagggat tgaaaacccc ggctttgaag cctcaccacc tgcccagggg 900
atacccgagg ccaaagtcag gcaccccctg tcctatgtgg cccagcggca gccttctgag 960
tctgggcggc atctgctttc ggagcccagc acccccctgt ctcctccagg ccccggagac 1020
gtcttcttcc catccctgga ccctgtccct gactctccaa actttgaggt catctagccc 1080
agctggggga cagtgggctg ttgtggctgg gtctggggca ggtgcatttg agccagggct 1140
ggctctgtga gtggcctcct tggcctcggc cctggttccc tccctcctgc tctgggctca 1200
gatactgtga catcccagaa gcccagcccc tcaacccctc tggatgctac atggggatgc 1260
tggacggctc agcccctgtt ccaaggattt tggggtgctg agattctccc ctagagacct 1320
gaaattcacc agctacagat gccaaatgac ttacatctta agaagtctca gaacgtccag 1380
cccttcagca gctctcgttc tgagacatga gccttgggat gtggcagcat cagtgggaca 1440
agatggacac tgggccaccc tcccaggcac cagacacagg gcacggtgga gagacttctc 1500
ccccgtggcc gccttggctc ccccgttttg cccgaggctg ctcttctgtc agacttcctc 1560
tttgtaccac agtggctctg gggccaggcc tgcctgccca ctggccatcg ccaccttccc 1620
cagctgcctc ctaccagcag tttctctgaa gatctgtcaa caggttaagt caatctgggg 1680
cttccactgc ctgcattcca gtccccagag cttggtggtc ccgaaacggg aagtacatat 1740
tggggcatgg tggcctccgt gagcaaatgg tgtcttgggc aatctgaggc caggacagat 1800
gttgccccac ccactggaga tggtgctgag ggaggtgggt ggggccttct gggaaggtga 1860
gtggagaggg gcacctgccc cccgccctcc ccatccccta ctcccactgc tcagcgcggg 1920
ccattgcaag ggtgccacac aatgtcttgt ccaccctggg acacttctga gtatgaagcg 1980
ggatgctatt aaaaactaca tggggaaaca ggtgcaaacc ctggagatgg attgtaagag 2040
ccagtttaaa tctgcactct gctgctcctc ccccaccccc accttccact ccatacaatc 2100
tgggcctggt ggagtcttcg cttcagagcc attcggccag gtgcgggtga tgttcccatc 2160
tcctgcttgt gggcatgccc tggctttgtt tttatacaca taggcaaggt gagtcctctg 2220
tggaattgtg attgaaggat tttaaagcag gggaggagag tagggggcat ctctgtacac 2280
tctgggggta aaacagggaa ggcagtgcct gagcatgggg acaggtgagg tggggctggg 2340
cagaccccct gtagcgttta gcaggatggg ggccccaggt actgtggaga gcatagtcca 2400
gcctgggcat ttgtctccta gcagcctaca ctggctctgc tgagctgggc ctgggtgctg 2460
aaagccagga tttggggcta ggcgggaaga tgttcgccca attgcttggg gggttggggg 2520
gatggaaaag gggagcacct ctaggctgcc tggcagcagt gagccctggg cctgtggcta 2580
cagccaggga accccacctg gacacatggc cctgcttcta agccccccag ttaggcccaa 2640
aggaatggtc cactgagggc ctcctgctct gcctgggctg ggccaggggc tttgaggaga 2700
gggtaaacat aggcccggag atggggctga cacctcgagt ggccagaata tgcccaaacc 2760
ccggcttctc ccttgtccct aggcagaggg gggtcccttc ttttgttccc tctggtcacc 2820
acaatgcttg atgccagctg ccataggaag agggtgctgg ctggccatgg tggcacacac 2880
ctgtcctccc agcactttgc agggctgagg tggaaggacc gcttaagccc aggtgttcaa 2940
ggctgctgtg agctgtgttc gagccactac actccagcct ggggacggag caaaactttg 3000
cctcaaaaca aattttaaaa agaaagaaag aaggaaagag ggtatgtttt tcacaattca 3060
tgggggcctg catggcagga gtggggacag gacacctgct gttcctggag tcgaaggaca 3120
agcccacagc ccagattccg gttctcccaa ctcaggaaga gcatgccctg ccctctgggg 3180
aggctggcct ggccccagcc ctcagctgct gaccttgagg cagagacaac ttctaagaat 3240
ttggctgcca gaccccaggc ctggctgctg ctgtgtggag agggaggcgg cccgcagcag 3300
aacagccacc gcacttcctc ctcagcttcc tctggtgcgg ccctgccctc tcttctctgg 3360
acccttttac aactgaacgc atctgggctt cgtggtttcc tgttttcagc gaaatttact 3420
ctgagctccc agttccatct tcatccatgg ccacaggccc tgcctacaac gcactaggga 3480
cgtccctccc tgctgctgct ggggaggggc aggctgctgg agccgccctc tgagttgccc 3540
gggatggtag tgcctctgat gccagccctg gtggctgtgg gctggggtgc atgggagagc 3600
tgggtgcgag aacatggcgc ctccaggggg cgggaggagc actaggggct ggggcaggag 3660
gctcctggag cgctggattc gtggcacagt ctgaggccct gagagggaaa tccatgcttt 3720
taagaactaa ttcattgtta ggagatcaat caggaattag gggccatctt acctatctcc 3780
tgacattcac agtttaatag agacttcctg cctttattcc ctcccaggga gaggctgaag 3840
gaatggaatt gaaagcacca tttggagggt tttgctgaca cagcggggac tgctcagcac 3900
tccctaaaaa cacaccatgg aggccactgg tgactgctgg tgggcaggct ggccctgcct 3960
gggggagtcc gtggcgatgg gcgctggggt ggaggtgcag gagccccagg acctgctttt 4020
caaaagactt ctgcctgacc agagctccca ctacatgcag tggcccaggg cagaggggct 4080
gatacatggc ctttttcagg gggtgctcct cgcggggtgg acttgggagt gtgcagtggg 4140
acagggggct gcaggggtcc tgccaccacc gagcaccaac ttggcccctg gggtcctgcc 4200
tcatgaatga ggccttcccc agggctggcc tgactgtgct gggggctggg ttaacgtttt 4260
ctcagggaac cacaatgcac gaaagaggaa ctggggttgc taaccaggat gctgggaaca 4320
aaggcctctt gaagcccagc cacagcccag ctgagcatga ggcccagccc atagacggca 4380
caggccacct ggcccattcc ctgggcattc cctgctttgc attgctgctt ctcttcaccc 4440
catggaggct atgtcaccct aactatcctg gaatgtgttg agagggattc tgaatgatca 4500
atatagcttg gtgagacagt gccgagatag atagccatgt ctgccttggg cacgggagag 4560
ggaagtggca gcatgcatgc tgtttcttgg ccttttctgt tagaatactt ggtgctttcc 4620
aacacacttt cacatgtgtt gtaacttgtt tgatccaccc ccttccctga aaatcctggg 4680
aggttttatt gctgccattt aacacagagg gcaatagagg ttctgaaagg tctgtgtctt 4740
gtcaaaacaa gtaaacggtg gaactacgac taaa 4774
<210> 10
<211> 1055
<212> DNA
<213> 智人
<400> 10
ctcgccgcgc tgagccgcct cgggacggag ccatgcggcg ctgggcctgg gccgcggtcg 60
tggtccccct cgggccgcag ctcgtgctcc tcgggggcgt cggggcccgg cgggaggcac 120
agaggacgca gcagcctggc cagcgcgcag atccccccaa cgccaccgcc agcgcgtcct 180
cccgcgaggg gctgcccgag gcccccaagc catcccaggc ctcaggacct gagttctccg 240
acgcccacat gacatggctg aactttgtcc ggcggccgga cgacggcgcc ttaaggaagc 300
ggtgcggaag cagggacaag aagccgcggg atctcttcgg tcccccagga cctccaggtg 360
cagaagtgac cgcggagact ctgcttcacg agtttcagga gctgctgaaa gaggccacgg 420
agcgccggtt ctcagggctt ctggacccgc tgctgcccca gggggcgggc ctgcggctgg 480
tgggcgaggc ctttcactgc cggctgcagg gtccccgccg ggtggacaag cggacgctgg 540
tggagctgca tggtttccag gctcctgctg cccaaggtgc cttcctgcga ggctccggtc 600
tgagcctggc ctcgggtcgg ttcacggccc ccgtgtccgg catcttccag ttctctgcca 660
gtctgcacgt ggaccacagt gagctgcagg gcaaggcccg gctgcgggcc cgggacgtgg 720
tgtgtgttct catctgtatt gagtccctgt gccagcgcca cacgtgcctg gaggccgtct 780
caggcctgga gagcaacagc agggtcttca cgctacaggt gcaggggctg ctgcagctgc 840
aggctggaca gtacgcttct gtgtttgtgg acaatggctc cggggccgtc ctcaccatcc 900
aggcgggctc cagcttctcc gggctgctcc tgggcacgtg agggcgccca ggggggctgg 960
cgaggagctg ccgccggatc ccggggaccc tcctactgat gcccgtggtc accacaataa 1020
agagccctcc accctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1055
<210> 11
<211> 1055
<212> DNA
<213> 小鼠
<400> 11
ctcgccgcgc tgagccgcct cgggacggag ccatgcggcg ctgggcctgg gccgcggtcg 60
tggtccccct cgggccgcag ctcgtgctcc tcgggggcgt cggggcccgg cgggaggcac 120
agaggacgca gcagcctggc cagcgcgcag atccccccaa cgccaccgcc agcgcgtcct 180
cccgcgaggg gctgcccgag gcccccaagc catcccaggc ctcaggacct gagttctccg 240
acgcccacat gacatggctg aactttgtcc ggcggccgga cgacggcgcc ttaaggaagc 300
ggtgcggaag cagggacaag aagccgcggg atctcttcgg tcccccagga cctccaggtg 360
cagaagtgac cgcggagact ctgcttcacg agtttcagga gctgctgaaa gaggccacgg 420
agcgccggtt ctcagggctt ctggacccgc tgctgcccca gggggcgggc ctgcggctgg 480
tgggcgaggc ctttcactgc cggctgcagg gtccccgccg ggtggacaag cggacgctgg 540
tggagctgca tggtttccag gctcctgctg cccaaggtgc cttcctgcga ggctccggtc 600
tgagcctggc ctcgggtcgg ttcacggccc ccgtgtccgg catcttccag ttctctgcca 660
gtctgcacgt ggaccacagt gagctgcagg gcaaggcccg gctgcgggcc cgggacgtgg 720
tgtgtgttct catctgtatt gagtccctgt gccagcgcca cacgtgcctg gaggccgtct 780
caggcctgga gagcaacagc agggtcttca cgctacaggt gcaggggctg ctgcagctgc 840
aggctggaca gtacgcttct gtgtttgtgg acaatggctc cggggccgtc ctcaccatcc 900
aggcgggctc cagcttctcc gggctgctcc tgggcacgtg agggcgccca ggggggctgg 960
cgaggagctg ccgccggatc ccggggaccc tcctactgat gcccgtggtc accacaataa 1020
agagccctcc accctcaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1055

Claims (51)

1.一种化合物，其激动或拮抗VISTA和V-R(VSIG8)的相互作用。
2.如权利要求1所述的化合物，其是激动性抗VSIG8抗体或抗体片段。
3.如权利要求1所述的化合物，其是拮抗性抗VSIG8抗体或抗体片段。
4.如权利要求1所述的化合物，其包含至少一个拷贝的引发对T细胞免疫性的抑制作用的包含VSIG8的细胞外区域的多肽、其片段或所述VSIG8多肽的衍生物，所述衍生物与VSIG8的所述细胞外区域或与SEQ ID NO:1、2或3具有至少80、90、95、96、97、98或99％序列同一性。
5.如权利要求4所述的化合物，其包含至少一个包含人、非人灵长类动物或鼠类VSIG8的整个细胞外区域的多肽。
6.如权利要求4或5所述的化合物，其是融合蛋白。
7.如权利要求6所述的化合物，其是Ig融合蛋白。
8.如权利要求7所述的化合物，其包含任选被诱变以消除FcR或补体结合的人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区或其片段。
9.一种分离的复合物，其包含VISTA和VSIG8。
10.如权利要求9所述的复合物，其中所述VISTA和/或VSIG8是寡聚的或多聚的。
11.一种抗体或抗体片段，其特异性结合如权利要求10所述的VISTA-VSIG8复合物。
12.一种药物组合物，其包含至少一种根据上述权利要求中任一项所述的化合物。
13.一种疫苗组合物，其包含至少一种根据上述权利要求中任一项所述的化合物和抗原。
14.一种含有根据前述权利要求中任一项所述的VSIG8或VSIG8/VISTA激动剂或拮抗剂的组合物用于诊断或治疗使用的治疗和/或诊断方法或用途，所述方法或用途包括向有此需要的受试者施用至少一个剂量或包含治疗或诊断有效量的至少一种根据前述权利要求中任一项所述的VSIG8或VSIG8/VISTA激动剂或拮抗剂的组合物或根据上述权利要求中任一项所述的含有其的组合物。
15.一种抗体或抗原结合片段或含有其的组合物检测个体是否患有与VSIG8和/或VISTA介导的对免疫性的作用增加或降低相关的病状的诊断方法或用途，其中所述方法或用途包括使来自所述个体的组织样品与根据前述权利要求中任一项所述的化合物例如抗体或抗原结合片段或组合物接触，以及检测与所述化合物的特异性结合。
16.一种含有抗VSIG8抗体或抗原结合片段的组合物用于诊断或治疗使用的治疗和/或诊断方法或用途，其包括在有此需要的受试者中促进T细胞免疫性或天然杀伤(NK)免疫性和/或抑制Treg或MDSC，其包括施用治疗或诊断有效量的至少一种根据上述权利要求中任一项所述的抗体、抗原结合片段或含有其的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段抑制、拮抗或阻断具有与SEQ ID NO:1、2或3的多肽至少90％同一的氨基酸序列的VSIG8多肽对免疫性或免疫细胞的至少一种作用。
17.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其使用抑制VSIG8和/或VISTA对T细胞免疫性的抑制作用的VSIG拮抗剂。
18.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其使用促进CTL活性的VSIG拮抗剂。
19.一种含有抗VSIG8抗体或抗原结合片段的组合物用于诊断或治疗使用的治疗和/或诊断和/或诊断方法或用途，其包括促进有此需要的受试者中NK或T细胞免疫性，并且其包括施用治疗或诊断有效量的至少一种根据前述权利要求中任一项所述的抗体、抗原结合片段或含有其的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段抑制具有氨基酸序列SEQ ID NO:1、2或3的多肽(VSIG8)或与所述多肽或与非人VSIG8直系同源物具有至少90％序列同一性的多肽对免疫性或免疫细胞或与人VISTA的至少一种作用。
20.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中所治疗的个体罹患感染性疾病。
21.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其中所治疗的个体罹患癌症。
22.一种根据前述权利要求中任一项所述的任何化合物的方法或用途，所述化合物例如抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白，其介导任何一种以下免疫抑制性作用或至少一种以下免疫抑制作用的组合：(i)降低免疫应答，(ii)降低T细胞活化，(iii)降低细胞毒性T细胞活性，(iv)降低天然杀伤(NK)细胞活性，(v)降低T细胞活性，(vi)降低促炎性细胞因子分泌，(vii)降低IL-2分泌；(viii)降低干扰素-γ产生，(ix)降低Thl应答，(x)降低Th2应答，(xi)增加调节性T细胞的细胞数目和/或活性，(xii)增加调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者，(xiii)增加调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者的活性，(xiii)增加M2巨噬细胞，(xiv)增加M2巨噬细胞活性，(xv)增加N2嗜中性白细胞，(xvi)增加N2嗜中性白细胞活性，(xvii)增加对T细胞活化的抑制，(xviii)增加对CTL活化的抑制，(xix)增加对NK细胞活化的抑制，(xx)增加T细胞耗竭，(xxi)降低T细胞应答，(xxii)降低细胞毒性细胞的活性，(xxiii)降低抗原特异性记忆应答，(xxiv)抑制细胞的凋亡或溶解，(xxv)降低对细胞的细胞毒性或细胞抑制性作用，(xxvi)降低细胞的直接杀灭，(xxvii)降低Thl7活性和/或(xxviii)降低补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，条件是所述抗VSIG8抗体或抗原结合片段可引发(i)-(xxviii)中的一者或多者的相反作用，并且任选用于治疗自体免疫性、过敏、炎症、移植或败血症。
23.一种含有抗VSIG8抗体或抗原结合片段的组合物用于诊断或治疗使用的治疗和/或诊断方法或用途，其包括在有此需要的受试者中抑制T细胞免疫性或天然杀伤(NK)免疫性和/或促进Treg或MDSC，其包括施用治疗或诊断有效量的至少一种根据上述权利要求中任一项所述的抗体、抗原结合片段或含有其的组合物，其中所述抗体或抗原结合片段激动、模拟或促进具有氨基酸序列SEQ ID NO:1、2或3的多肽(VSIG8)或直系同源物对免疫性或免疫细胞的至少一种作用。
24.如权利要求23所述的方法或用途，其用于治疗过敏、自体免疫性、移植、基因疗法、炎症或其组合。
25.根据前述权利要求中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或VSIG8融合蛋白或组合物或方法或用途，其进一步包括选自以下的另一抗体：靶向CTLA4、PD-1、PDL-1、LAG-3、TIM-3、BTLA、B7-H4、B7-H3、VISTA中的一者或多者的拮抗性抗体和/或靶向CD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28或ICOS中的一者或多者的激动性抗体。
26.如前述权利要求中任一项所述的方法或用途，其包括在治疗之前、同时和/或之后，通过所述个体的细胞来测定VSIG8和/或VISTA蛋白。
27.一种用于选择根据前述权利要求中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原片段或适用于根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途中的抗VSIG8抗体的测定方法，其中所述方法包括(i)获得一种或多种抗体，所述抗体推定结合具有选自SEQ ID NO:1、2或3中的任一者所示的氨基酸序列的序列的VSIG8多肽，或结合具有与所述VSIG8多肽具有至少90％序列同一性的多肽，或结合非人VSIG8直系同源物，或含有至少一个VSIG8表位的其片段或变体，所述片段或变体与所述VSIG8多肽或与非人VSIG8直系同源物具有至少90％同一性，(ii)确定所述抗体或抗原结合片段是否特异性结合所述VSIG8多肽，(ii)确定所述抗体或抗原结合片段是否调节(激动或拮抗)VSIG8对免疫性的至少一种作用，和(iv)如果(ii)和(ii)得以满足，那么选择所述抗体作为潜在用于根据前述权利要求中任一项所述的方法或用途中的抗体。
28.如权利要求27中任一项所述的方法，其中所选抗体被证明介导至少一种以下作用：(i)增加免疫应答，(ii)增加T细胞活化，(iii)增加细胞毒性T细胞活性，(iv)增加NK细胞活性，(v)缓和T细胞抑制，(vi)增加促炎性细胞因子分泌，(vii)增加IL-2分泌；(viii)增加干扰素-γ产生，(ix)增加Thl应答，(x)降低Th2应答，(xi)降低或消除调节性T细胞(Treg)、骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的至少一者的细胞数目和/或活性，(xii)降低调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者的活性，(xiii)降低或消除M2巨噬细胞，(xiv)降低M2巨噬细胞促肿瘤发生活性，(xv)降低或消除N2嗜中性白细胞，(xvi)降低N2嗜中性白细胞促炎性活性，(xvii)降低对T细胞活化的抑制，(xviii)降低对CTL活化的抑制，(xix)降低对NK细胞活化的抑制，(xx)逆转T细胞耗竭，(xxi)增加T细胞应答，(xxii)增加细胞毒性细胞的活性，(xxiii)刺激抗原特异性记忆应答，(xxiv)引发癌细胞的凋亡或溶解，(xxv)刺激对癌细胞的细胞毒性或细胞抑制性作用，(xxvi)诱导癌细胞的直接杀灭，(xxvii)增加Thl7活性和/或(xxviii)诱导补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，条件是所述抗VSIG8抗体或抗原结合片段可引发(i)-(xxviii)中的一者或多者的相反作用。
29.如权利要求27所述的方法，其中所选抗体被证明介导至少一种以下作用：(i)降低免疫应答，(ii)降低T细胞活化，(iii)降低细胞毒性T细胞活性，(iv)降低天然杀伤(NK)细胞活性，(v)降低T细胞活性，(vi)降低促炎性细胞因子分泌，(vii)降低IL-2分泌；(viii)降低干扰素-γ产生，(ix)降低Thl应答，(x)降低Th2应答，(xi)增加调节性T细胞的细胞数目和/或活性，(xii)增加调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者，(xiii)增加调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者的活性，(xiii)增加M2巨噬细胞，(xiv)增加M2巨噬细胞活性，(xv)增加N2嗜中性白细胞，(xvi)增加N2嗜中性白细胞活性，(xvii)增加对T细胞活化的抑制，(xviii)增加对CTL活化的抑制，(xix)增加对NK细胞活化的抑制，(xx)增加T细胞耗竭，(xxi)降低T细胞应答，(xxii)降低细胞毒性细胞的活性，(xxiii)降低抗原特异性记忆应答，(xxiv)抑制细胞的凋亡或溶解，(xxv)降低对细胞的细胞毒性或细胞抑制性作用，(xxvi)降低细胞的直接杀灭，(xxvii)降低Thl7活性和/或(xxviii)降低补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，条件是所述抗VSIG8抗体或抗原结合片段可引发(i)-(xxviii)中的一者或多者的相反作用。
30.如权利要求27至29中任一项所述的方法，其中所选抗体被证明与VISTA竞争结合人或啮齿动物VSIG8。
31.根据前述权利要求中任一项所述的所获得的免疫调节抗体或抗原结合物或含有其的药物或诊断组合物。
32.一种根据前述权利要求中任一项所述的所获得的免疫调节抗体或抗原结合物或VSIG8融合或非融合蛋白或含有其的药物或诊断组合物的用途，其用于治疗或诊断选自癌症、感染、败血症、自体免疫性、炎症、过敏性病状或其它免疫病状的疾病，或用以抑制对细胞或基因疗法治疗或移植细胞、组织或器官的非所需免疫反应。
33.一种移植疗法，其包括将细胞、组织或器官移植至接受者中，其中在将所述细胞、组织或器官输注或移植至所述接受者中之前使用含有根据前述权利要求中任一项所述的抗VSIG8抗体或抗原结合片段或组合物或VSIG8融合或非融合蛋白的组合物离体处理所述细胞、组织或器官。
34.一种诊断性或治疗性组合物，其包含诊断或治疗有效量的根据前述权利要求中任一项所述的化合物。
35.根据前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其进一步包含或包括施用PD-1或PD-L1激动剂或拮抗剂或其它免疫调节剂。
36.一种方法，其使免疫细胞与根据前述权利要求中任一项所述的激动剂或拮抗剂化合物接触。
37.一种筛选测定，其包括单独或与VISTA联合使用VSIG8以鉴定VSIG8/VISTA激动剂或拮抗剂。
38.一种包含VSIG8ECD的片段的经分离多肽，其中所述片段基本上由以下组成或由以下组成：如SEQ ID NO:1、2或3中的任一者所示的氨基酸序列或其变体，所述变体与所述氨基酸序列具有至少80、85、90、95、96、97、98或99％序列同一性。
39.如权利要求38所述的经分离多肽，其包含2-10个所述VSIG8ECD多肽片段。
40.根据权利要求37或38所述的经分离多肽，其中所述片段由异源性接头间插，其中所述接头不是VSIG8多肽的片段。
41.一种融合蛋白，其包含如前述权利要求中任一项所述的经分离多肽或接合于异源性多肽和/或半衰期延长部分的SEQ ID NO 1、2或3，条件是所述异源性多肽或所述半衰期延长部分不是VSIG8多肽的片段。
42.如前述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其包含选自由人IgGl、IgG2、IgG3和IgG4组成的组的人免疫球蛋白重链恒定区。
43.如上述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其包含至少一种异源性多肽，所述异源性多肽是受体、激素、细胞因子、抗原、B细胞靶标、NK细胞靶标、T细胞靶标、TNF受体超家族成员、刺猬因子家族成员、受体酪氨酸激酶、蛋白聚糖相关的分子、TGF-β超家族成员、Wnt相关的分子、受体配体、树突细胞靶标、骨髓细胞靶标、单核细胞/巨噬细胞靶标或血管生成靶标。
44.如权利要求43所述的融合蛋白，其中所述抗原是肿瘤抗原、自体抗原、过敏原或感染物抗原。
45.如上述权利要求中任一项所述的融合蛋白，其包含至少一种异源性多肽，所述异源性多肽是免疫调节多肽。
46.根据前述权利要求中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白，其介导至少一种以下作用：(i)降低免疫应答，(ii)降低T细胞活化，(iii)降低细胞毒性T细胞活性，(iv)降低天然杀伤(NK)细胞活性，(v)降低T细胞活性，(vi)降低促炎性细胞因子分泌，(vii)降低IL-2分泌；(viii)降低由T细胞达成的干扰素-y产生，(ix)降低Thl应答，(x)降低Th2应答，(xi)增加调节性T细胞的细胞数目和/或活性，(xii)增加调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者，(xiii)增加调节性细胞活性和/或骨髓源性抑制细胞(MDSC)、iMC、间质基质细胞、TIE2表达性单核细胞中的一者或多者的活性，(xiii)增加M2巨噬细胞，(xiv)增加M2巨噬细胞活性，(xv)增加N2嗜中性白细胞，(xvi)增加N2嗜中性白细胞活性，(xvii)增加对T细胞活化的抑制，(xviii)增加对CTL活化的抑制，(xix)增加对NK细胞活化的抑制，(xx)增加T细胞耗竭，(xxi)降低T细胞应答，(xxii)降低细胞毒性细胞的活性，(xxiii)降低抗原特异性记忆应答，(xxiv)抑制细胞的凋亡或溶解，(xxv)降低对细胞的细胞毒性或细胞抑制性作用，(xxvi)降低细胞的直接杀灭，(xxvii)降低Thl7活性和/或(xxviii)降低补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，条件是所述经分离或重组VSIG8多肽或融合蛋白可引发(i)-(xxviii)中的一者或多者的相反作用。
47.根据上述权利要求中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白，其激动或拮抗VSIG8和/或VISTA对T细胞、天然杀伤(NK)细胞或一种或多种促炎性细胞因子的产生的至少一种作用。
48.根据上述权利要求中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白，其抑制或促进CTL活性、CD4+T细胞活化和/或CD4+T细胞增殖和/或细胞消减或促炎性细胞因子的分泌中的一者或多者。
49.一种药物组合物，其包含如前述权利要求中任一项所述的经分离蛋白质或融合蛋白、或SEQ ID NO:1、2、3中的任一者所示的VSIG8ECD蛋白、或编码其的多核苷酸、表达载体或病毒或含有其的重组细胞。
50.一种例如癌症、感染、过敏、自体免疫性、炎症、移植或败血症的免疫疗法或治疗的方法，其包括任选与选自本申请中鉴定的任何药物或免疫调节剂的另一药物或免疫调节剂组合施用至少一种根据前述权利要求中任一项所述的化合物、融合蛋白VSIG8激动剂或拮抗剂。
51.一种用于诊断或有助于诊断受试者的疾病的诊断方法，其中所述疾病选自由癌症、自体免疫性疾病或感染性疾病组成的组，其中所述诊断方法在体内进行，包括向受试者施用如上述权利要求中任一项所述的经分离多肽或融合蛋白，和/或使用SEQ ID NO:1、2、3中的任一者所示的VSIG8ECD蛋白，以及检测与组织的特异性结合。
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