JP2015532587A - Lsr抗体およびがんの治療のためのその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
免疫分子であって、
配列番号229、235、242〜243、245〜249、258、274〜278、264〜272、251〜256、280、287、284、285、290〜292、287、288、259、295、297〜302および306〜307からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する抗原結合領域を含み、
該抗原結合領域が、配列番号10のアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合するように改変されていることを特徴とする免疫分子が提供される。
配列番号227、228、229の少なくとも1つと、配列番号233、234、235の少なくとも1つとを含んでいてもよく;
配列番号245、246、247、248、249の少なくとも1つと、配列番号239、240、241、252、256、287、288、242、243の少なくとも1つとを含んでいてもよく;
配列番号303、304、261、306、262の少なくとも1つと、配列番号251、252、253、254、255、256、257、258、259の少なくとも1つとを含んでいてもよく;
配列番号274、275、276、277、278の少なくとも1つと、配列番号264、265、266、267、268、269、270、271、272の少なくとも1つとを含んでいてもよく;
配列番号274、275、276、277、282の少なくとも1つと、配列番号264、265、266、267、268、269、280、271、272の少なくとも1つとを含んでいてもよく;
配列番号303、304、305、306、307の少なくとも1つと、配列番号239、240、241、252、256、287、288、284、285の少なくとも1つとを含んでいてもよく;
配列番号290、291、305、306、292の少なくとも1つと、配列番号251、252、253、254、256、287、288、258、259の少なくとも1つとを含んでいてもよく;
配列番号303、304、305、306、307の少なくとも1つと、配列番号294、295、296、297、298、299、300、301、302の少なくとも1つとを含んでいてもよい。
さらに、上記の免疫分子は、配列番号227〜229、239〜243、251〜299、264〜272、280、284〜285、287〜288、293〜301、302の少なくとも1つと、
配列番号233〜235、245〜249、261〜262、274〜278、282、290〜292、303〜306、307の少なくとも1つとを含んでいてもよい。
配列番号244のアミノ酸配列および配列番号238のアミノ酸配列もしくはこれらと95%の相同性を有する配列を有するタンパク質を含んでいてもよく;
配列番号260のアミノ酸配列および配列番号259のアミノ酸配列もしくはこれらと95%の相同性を有する配列を有するタンパク質を含んでいてもよく;
配列番号273のアミノ酸配列および配列番号263のアミノ酸配列もしくはこれらと95%の相同性を有する配列を有するタンパク質を含んでいてもよく;
配列番号281のアミノ酸配列および配列番号279のアミノ酸配列もしくはこれらと95%の相同性を有する配列を有するタンパク質を含んでいてもよく;
配列番号308のアミノ酸配列および配列番号283のアミノ酸配列もしくはこれらと95%の相同性を有する配列を有するタンパク質を含んでいてもよく;
配列番号289のアミノ酸配列および配列番号286のアミノ酸配列もしくはこれらと95%の相同性を有する配列を有するタンパク質を含んでいてもよく;
配列番号308のアミノ酸配列および配列番号293のアミノ酸配列もしくはこれらと95%の相同性を有する配列を有するタンパク質を含んでいてもよく;
配列番号245もしくは246のアミノ酸配列と、配列番号247もしくは248のアミノ酸配列と、配列番号249のアミノ酸配列と、配列番号239、240、241、252のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号256、287、288のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号242もしくは243のアミノ酸配列とを有するタンパク質を含んでいてもよく;
配列番号303もしくは304のアミノ酸配列と、配列番号261もしくは306のアミノ酸配列と、配列番号262のアミノ酸配列と、配列番号251、252、253、254のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号255、256、257のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号258もしくは259のアミノ酸配列とを有するタンパク質を含んでいてもよく;
配列番号274もしくは275のアミノ酸配列と、配列番号276もしくは277のアミノ酸配列と、配列番号278のアミノ酸配列と、配列番号264、265、266、267のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号268、269、270のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号271もしくは272のアミノ酸配列とを有するタンパク質を含んでいてもよく;
配列番号274もしくは275のアミノ酸配列と、配列番号276もしくは277のアミノ酸配列と、配列番号282のアミノ酸配列と、配列番号264、265、266、267のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号268、269、280のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号271もしくは272のアミノ酸配列とを有するタンパク質を含んでいてもよく;
配列番号303もしくは304のアミノ酸配列と、配列番号305もしくは306のアミノ酸配列と、配列番号307のアミノ酸配列と、配列番号239、240、241、252のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号256、287、288のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号284もしくは285のアミノ酸配列とを有するタンパク質を含んでいてもよく;
配列番号290もしくは291のアミノ酸配列と、配列番号305もしくは306のアミノ酸配列と、配列番号292のアミノ酸配列と、配列番号251、252、253、254のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号256、287、288のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号258もしくは259のアミノ酸配列とを有するタンパク質を含んでいてもよく;
配列番号303もしくは304のアミノ酸配列と、配列番号305もしくは306のアミノ酸配列と、配列番号307のアミノ酸配列と、配列番号294、295、296、297のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号298、299、300のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号301もしくは302のアミノ酸配列とを有するタンパク質を含んでいてもよい。
上記のベクターを細胞に導入して組換え細胞を作製すること、および
該組換え細胞から免疫分子を産生させることを含む方法が提供される。
該抗体が、配列番号10の30番目〜110番目のアミノ酸に特異的に結合するが配列番号10の他の部分には特異的に結合しない抗原結合領域を有し、
該配列番号10の他の部分が、配列番号10の1番目〜29番目のアミノ酸または111番目〜234番目のアミノ酸を含む、抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
該抗原結合領域が配列番号215に特異的に結合する場合、該配列番号10の他の部分は、配列番号10の1番目〜80番目のアミノ酸または99番目〜234番目のアミノ酸を含んでいてもよく、
該抗原結合領域が配列番号216に特異的に結合する場合、該配列番号10の他の部分は、配列番号10の1番目〜117番目のアミノ酸または136番目〜234番目のアミノ酸を含んでいてもよい。
これらを検出するマーカーは、放射性同位元素、金属キレート剤、酵素、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物のいずれであってもよい。
該1以上の増強手段は、放射線療法、抗腫瘍免疫応答を増強する標準的/古典的抗がん療法、抗腫瘍免疫応答を増強する標的療法、Tregおよび/またはMDSCを標的とする治療薬、免疫刺激抗体、サイトカイン療法、がん治療ワクチンならびに養子細胞移入からなる群から選択されてもよい。
(a)サイトカインのアップレギュレーション、(b)T細胞増殖/拡大の増加、(c)T細胞によるインターフェロン−γ産生の増加、(d)IL−2分泌の増加、(e)抗体応答の刺激、(f)がん細胞増殖の抑制、(g)抗原特異的T細胞免疫の促進、(g)CD4+および/またはCD8+T細胞活性化の促進、(i)T細胞抑制の軽減、(j)がん細胞のアポトーシスまたは溶解の軽減、(k)がん細胞に対する細胞傷害作用または細胞増殖抑制作用のうちの1以上を対象において実施し、疾患の治療を行うことを特徴とする使用が提供される。
該疾患が、がんおよび自己免疫疾患からなる群から選択されること、
該診断方法がエクスビボで実施されること、ならびに
該診断方法が、対象から得た組織試料と上記の免疫分子または抗体とをエクスビボで接触させること、および該免疫分子または抗体との特異的結合を検出することを含むこと
を特徴とする診断方法が提供される。
該疾患が、がん、自己免疫疾患および感染症からなる群から選択されること、
該診断方法がインビボで実施されること、ならびに
該診断方法が、上記の免疫分子または抗体を対象に投与すること、および上記の免疫分子または抗体と対象の組織との特異的結合を検出することを含むこと
を特徴とする診断方法が提供される。
上記の組織を、上記の抗体または免疫分子と接触させること、および
該抗体または免疫分子との特異的結合を検出することを含んでいてもよい。
上記の免疫分子または抗体と、がん、自己免疫疾患および感染症からなる群から選択される疾患を診断するための少なくとも1の試薬とを含むアッセイが提供される。
上記がんは、乳がん、子宮頸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、悪性黒色腫、膀胱がん、肺がん、膵臓がん、結腸がん、前立腺がん、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病、甲状腺がん、濾胞性甲状腺がん、骨髄異形成症候群(MDS)、線維肉腫および横紋筋肉腫、悪性黒色腫、ぶどう膜悪性黒色腫、奇形癌、神経芽腫、神経膠腫、神経膠芽腫、皮膚良性腫瘍、角化棘細胞腫、腎臓がん、未分化大細胞リンパ腫、食道扁平上皮細胞癌、肝細胞癌、濾胞性樹状細胞癌、腸がん、筋層浸潤がん、精嚢腫瘍、表皮癌、脾臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、胃がん、肝臓がん、骨がん、脳がん、網膜がん、胆道がん、小腸がん、唾液腺がん、子宮がん、精巣がん、結合組織がん、前立腺肥大症、脊髄形成異常症、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、鼻咽頭癌、神経内分泌がん、骨髄異形成症候群、中皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド、食道胃癌、ファローピウス管がん、腹膜がん、漿液性乳頭状ミュラー管がん、悪性腹水、消化管間質腫瘍(GIST)、リー・フラウメニ症候群ならびにフォンヒッペル・リンダウ症候群(VHL)(ただし、上記がんが卵巣がんである場合、卵巣顆粒膜細胞腫を除き、上記がんが脳がんである場合、グレード2の星状細胞腫を除く)からなる群から選択されてもよい。
該免疫病態は、自己免疫疾患、移植拒絶反応および移植片対宿主病からなる群から選択されてもよい。
該感染症は、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染および/または他の寄生虫感染によって引き起こされる疾患から選択されてもよい。
乳管腺癌、浸潤性乳管癌、小葉癌、粘液性腺癌、乳管内癌と浸潤性乳管癌との混合型、硬性腺癌、中〜低分化型盲腸腺癌、高分化型、中分化型および低分化型結腸腺癌、管状腺癌(好ましくはグレード2の上行結腸管状腺癌)、デュークスステージC1の結腸腺癌、浸潤性腺癌、直腸腺癌(好ましくはグレード3の直腸腺癌)、中分化型直腸腺癌、中分化型直腸粘液性腺癌、高〜低分化型非小細胞癌、扁平上皮細胞癌(好ましくは中分化型扁平上皮細胞癌)、中〜低分化型扁平上皮癌、中等度によく分化した角化型扁平上皮細胞癌、大細胞腺癌、小細胞肺がん、グリーソングレード5〜9の腺癌、浸潤性腺癌、高悪性度前立腺上皮内腫瘍、未分化癌、中分化型胃腺癌、漿液性乳頭状嚢胞癌、漿液性嚢胞腺癌、浸潤性漿液性乳頭状癌、多形膠芽腫、星状細胞腫、グレード4の星状細胞腫、腎明細胞癌、肝細胞癌、低悪性度肝細胞癌、線維層板状肝細胞癌、大細胞型リンパ腫、ならびに高悪性度および低悪性度非ホジキンリンパ腫(ただし、上記がんが卵巣がんである場合、卵巣顆粒膜細胞腫を除き、上記がんが脳がんである場合、グレード2の星状細胞腫を除く)からなる群から選択される疾患に罹患している対象の治療または診断を行うための使用が提供される。
乳管腺癌、浸潤性乳管癌、小葉癌、粘液性腺癌、乳管内癌と浸潤性乳管癌との混合型、硬性腺癌、中〜低分化型盲腸腺癌、高分化型、中分化型および低分化型結腸腺癌、管状腺癌(好ましくはグレード2の上行結腸管状腺癌)、デュークスステージC1の結腸腺癌、浸潤性腺癌、直腸腺癌(好ましくはグレード3の直腸腺癌)、中分化型直腸腺癌、中分化型直腸粘液性腺癌、高〜低分化型非小細胞癌、扁平上皮細胞癌(好ましくは中分化型扁平上皮細胞癌)、中〜低分化型扁平上皮癌、中等度によく分化した角化型扁平上皮細胞癌、大細胞腺癌、小細胞肺がん、グリーソングレード5〜9の腺癌、浸潤性腺癌、高悪性度前立腺上皮内腫瘍、未分化癌、中分化型胃腺癌、漿液性乳頭状嚢胞癌、漿液性嚢胞腺癌、浸潤性漿液性乳頭状癌、多形膠芽腫、星状細胞腫、グレード4の星状細胞腫、腎明細胞癌、肝細胞癌、低悪性度肝細胞癌、線維層板状肝細胞癌、大細胞型リンパ腫、ならびに高悪性度および低悪性度非ホジキンリンパ腫(ただし、上記がんが卵巣がんである場合、卵巣顆粒膜細胞腫を除き、上記がんが脳がんである場合、グレード2の星状細胞腫を除く)からなる群から選択される疾患に罹患している対象を治療するための医薬組成物が提供される。
該1以上の増強手段は、放射線療法、抗腫瘍免疫応答を増強する標準的/古典的抗がん療法、抗腫瘍免疫応答を増強する標的療法、Tregおよび/またはMDSCを標的とする治療薬、免疫刺激抗体、サイトカイン療法ならびに養子細胞移入からなる群から選択されてもよい。
上記の診断方法を実施することを含む方法が提供される。
該抗体が、LSRタンパク質に特異的に結合すること、ならびに
該抗体が、特に本明細書に記載の特定のがんの治療および/または診断のための治療薬および/または診断薬として使用できるように改変された抗体(特に、LSRによって誘導された活性を促進または抑制する抗体を包含するヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラモノクローナル抗体)であること
を特徴とする、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、そのフラグメントおよび/もしくは複合体、ならびに/またはこれらを含む医薬組成物および/もしくは診断組成物に関する。
該抗体が1×10−8M以下のKDでヒトLSRに結合してもよく、そのようなKDでヒトLSRに結合することが好ましいこと、および
該抗体が、B7関連共刺激の調節、T細胞活性化の増強、T細胞抑制の軽減、サイトカイン分泌の増強、IL−2分泌の増強、T細胞によるインターフェロン−γの産生の増強、Th1応答の増強、Th2応答の減弱、M2型マクロファージの減少または除去、M2型マクロファージの腫瘍形成促進活性の低下、がんのエピトープ拡大の促進、T細胞活性化の抑制の減弱、哺乳動物におけるT細胞応答の増強、抗原特異的メモリー応答の刺激、がん細胞のアポトーシスまたは溶解の誘導、がん細胞に対する細胞傷害作用または細胞増殖抑制作用の刺激、がん細胞の直接殺傷の誘導、ならびに補体依存性細胞傷害作用および/または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害の誘導のうちの少なくとも1つの特性を示すこと
を特徴とする抗体およびフラグメントを提供する。
・乳がん、好ましくは、乳管腺癌、浸潤性乳管癌、小葉癌、粘液性腺癌、乳管内癌と浸潤性乳管癌との混合型のいずれか、好ましくは硬性腺癌;
・結腸直腸がん、好ましくは、中〜低分化型盲腸腺癌、高分化型、中分化型および低分化型結腸腺癌、管状腺癌(好ましくはグレード2の上行結腸管状腺癌)、デュークスステージC1の結腸腺癌、浸潤性腺癌、直腸腺癌(好ましくはグレード3の直腸腺癌)、中分化型直腸腺癌、中分化型直腸粘液性腺癌のいずれか;
・肺がん、好ましくは、高〜低分化型非小細胞癌、扁平上皮細胞癌(好ましくは中分化型扁平上皮細胞癌)、中〜低分化型扁平上皮癌、中等度によく分化した角化型扁平上皮細胞癌、大細胞腺癌、小細胞肺がんのいずれか;
・前立腺がん、好ましくは、グリーソングレード5〜9の腺癌、浸潤性腺癌、高悪性度前立腺上皮内腫瘍、未分化癌のいずれか;
・胃がん、好ましくは、中分化型胃腺癌;
・卵巣がん、好ましくは、漿液性乳頭状嚢胞癌、漿液性嚢胞腺癌、浸潤性漿液性乳頭状癌のいずれか;
・脳がん、好ましくは、星状細胞腫(好ましくはグレード4の星状細胞腫)、多形膠芽腫のいずれか;
・腎臓がん、好ましくは腎明細胞癌;
・肝臓がん、好ましくは、肝細胞癌(好ましくは低悪性度肝細胞癌)、線維層板状肝細胞癌のいずれか;
・血液がん、好ましくは、大細胞型リンパ腫、高悪性度および低悪性度非ホジキンリンパ腫のいずれか
該がんが、がん細胞上または腫瘍浸潤免疫細胞上に、配列番号10〜18、21、22、31、32、47〜50、62〜69、95、102、143、211〜212に含まれるLSRポリペプチド、配列番号12、14および47〜50からなる群から選択される、該ポリペプチドの細胞外ドメイン、ならびに/またはこれらのフラグメント(たとえば配列番号237)および/もしくはエピトープを発現していることを特徴とする、治療方法ならびに抗体および医薬組成物の使用が提供される。
(a)本明細書に記載の配列;
(b)(a)に記載のCDRアミノ酸配列において、重鎖CDR3に存在する100A番目(Kabatナンバリングシステム)のセリン残基以外の、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個以上のアミノ酸が保存的に置換された配列;
(c)(a)または(b)に記載の配列と90%以上、95%以上、98%以上、または99%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列;および
(d)上記アミノ酸をコードする核酸配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチド
からなる群から選択されるCDRアミノ酸配列を含んでいてもよい。
1)MHCに関連して提示される抗原ペプチドとT細胞受容体(TCR)との連結(シグナル1)
2)種々の共刺激受容体とリガンドとが接触してペアを形成するときに伝達される抗原非依存性の第2のシグナル(シグナル2)
単一の仮説に拘束されることを望むものではないが、この「第2のシグナル」は、T細胞応答のタイプ(活性化または抑制)やT細胞応答の強度および持続期間を決定するのに重要な役割を果たしており、B7ファミリータンパク質などの共刺激分子からの正のシグナルと負のシグナルの両方の調節を受ける。
(i)Fabフラグメント(軽鎖Vドメイン、重鎖Vドメイン、および軽鎖定常ドメイン(CLおよびCH1)からなる1価のフラグメント);
(ii)F(ab’)2フラグメント(ヒンジ領域のジスルフィド架橋によって連結された2つのFabフラグメントを含む二価のフラグメント);
(iii)VHドメインおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;
(iv)抗体の1つの腕のVLドメインおよびVHドメインからなるFvフラグメント;
(v)VHドメインからなるdAbフラグメント(Ward et al., (1989) Nature 341:544-546);ならびに
(vi)単離された相補性決定領域(CDR)
が挙げられる。さらに、Fvフラグメントの2種のドメイン(VLおよびVH)は別々の遺伝子によってコードされているが、これらのドメインを1つのタンパク質鎖とすることが可能な合成リンカーでこれらのドメインを組換え法により連結することができ、これによって、一対のVL領域およびVH領域から1価の分子が形成される(一本鎖Fv(scFv)として知られている;たとえば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426;およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい)。このような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」に包含される。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の慣用の技術を使用して得られ、完全な抗体と同様の方法で有用性についてスクリーニングされる。
(a)ヒト免疫グロブリン遺伝子が導入されたトランスジェニック動物もしくはトランスクロモソミック動物(たとえばマウス)またはこれらの動物より調製されたハイブリドーマから単離された抗体(さらに詳しくは後述する);
(b)ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞(たとえばトランスフェクトーマ)から単離された抗体;
(c)組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから単離された抗体;および
(d)ヒト免疫グロブリン遺伝子配列のスプライシングによる別のDNA配列の形成などを含む他の方法により調製、発現、作製、または単離された抗体
が挙げられる。このような組換えヒト抗体の可変領域のフレームワーク領域およびCDR領域は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。しかしながら、特定の実施形態では、このような組換えヒト抗体は、インビトロ突然変異誘発(または、ヒトIg配列を導入したトランスジェニック動物を使用した場合はインビボ体細胞突然変異誘発)に付することができることから、組換え抗体のVH領域およびVL領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のVH配列およびVL配列に由来し、かつこれらの配列に関連するものではあるが、ヒト生殖細胞系のインビボ抗体レパートリーには本来存在しない配列であってもよい。
特定の実施形態において、本発明の抗体は、特定の生殖細胞系重鎖免疫グロブリン遺伝子由来の重鎖可変領域および/または特定の生殖細胞系軽鎖免疫グロブリン遺伝子由来の軽鎖可変領域を含む。
さらに別の実施形態において、本発明の抗体は、好ましい抗LSR抗体から単離された抗LSRアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、かつ親抗LSR抗体の所望の機能特性を保持している。
特定の実施形態において、本発明の抗体は、CDR1配列、CDR2配列およびCDR3配列を含む重鎖可変領域と、CDR1配列、CDR2配列およびCDR3配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体であって、これらのCDR配列の1つ以上が、本明細書に記載の方法を使用して単離および調製された好ましい抗LSR抗体に基づく特定のアミノ酸配列またはこのアミノ酸配列が保存的に修飾された配列を含むこと、ならびに当該抗体が、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗LSR抗体の所望の機能特性を保持していることを特徴とする。
別の実施形態において、本発明は、共刺激の調節およびこれに関連する機能などの所望の機能特性を有する、ヒトLSR上の好ましいエピトープに結合する抗体を提供する。所望のエピトープ特異性を有する他の抗体を選択してもよく、このような抗体は、LSR抗原との結合において所望の抗体と交差競合する能力を有するであろう。
本発明の実施形態の少なくともいくつかにおいて、出発物質としての抗LSR抗体に由来するVH配列および/またはVL配列を1つ以上有する抗体を使用して、遺伝子操作により修飾抗体を作製することができ、このような修飾抗体は、出発抗体に由来する特性が改変されたものであってもよい。抗体は、片方または両方の可変領域(すなわちVHおよび/またはVL)の1つ以上の残基を修飾することによって遺伝子操作することができ、たとえば1つ以上のCDR領域および/または1つ以上のフレームワーク領域の1つ以上の残基を修飾することによって抗体を遺伝子操作することができる。上記に加えてまたは別法として、たとえば抗体のエフェクター機能を改変する目的で、定常領域の残基を修飾して抗体を遺伝子操作することができる。
上述したように、本明細書に開示されているVH配列およびVK配列を有する抗LSR抗体のVH配列および/もしくはVL配列またはこれらの配列に結合した定常領域を修飾することによって、新たな抗LSR抗体を作製することができる。したがって、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる別の一態様においては、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗LSR抗体の構造上の特徴を利用して、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体の少なくとも1つの機能特性(たとえばヒトLSRに対する結合性など)を保持する構造的に関連した抗LSR抗体を作製する。たとえば、上述したように、1つのLSR抗体またはその突然変異体の1つ以上CDR領域と、公知のフレームワーク領域および/または他のCDRとを組換え技術により組み合わせることによって、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる遺伝子操作された別の組換え抗LSR抗体を作製することができる。他のタイプの修飾としては上述の章に記載したものが挙げられる。上記の遺伝子操作方法における出発物質は、本明細書に記載のVH配列および/またはVK配列の1つ以上、またはこれらのCDR領域の1つ以上である。遺伝子操作された抗体を作製するためには、本明細書に記載のVH配列および/もしくはVK配列の1つ以上またはこれらの配列のCDR領域の1つ以上を有する抗体を実際に調製することは必要とされない(すなわちタンパク質として発現させることは必要とされない)。このような抗体を実際に調製するのではなく、これらの配列に含まれている情報を出発物質として使用して、元の配列に由来する「第二世代」の配列を作製し、次いでこの「第二世代」の配列をタンパク質として調製および発現させる。
本発明の別の一態様は、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体をコードする核酸分子に関する。核酸は、細胞中または細胞溶解物中に含まれていてもよく、部分的に精製された形態であっても実質的に純粋な形態であってもよい。核酸は、アルカリ/SDS処理、CsClバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、当技術分野でよく知られている他の方法などの標準的な技術によって、他の細胞成分または他の汚染物質(たとえば他の細胞核酸またはタンパク質)を除去する精製工程を経た場合に「単離された」または「実質的に純粋である」と言える。F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照されたい。本発明の実施形態の少なくともいくつかによる核酸は、たとえばDNAであってもRNAであってもよく、イントロン配列を含んでいても含んでいなくてもよい。好ましい実施形態では、核酸はcDNA分子である。
本発明のモノクローナル抗体(mAb)は慣用のモノクローナル抗体方法論(たとえば、Kohler and Milstein (1975) Nature 256:495に記載の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術など)を包含する様々な技術によって作製することができる。原則として、体細胞ハイブリダイゼーション法が好ましいが、モノクローナル抗体を作製するための他の技術(たとえば、Bリンパ球のウイルス形質転換または発がん性形質転換など)を使用することもできる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによるヒト抗体を作製するためにヒトIgマウスを使用する場合、このマウスを、LSR抗原および/または組換えLSRもしくはLSR融合タンパク質の精製調製物または濃縮調製物で免疫することができ、このような方法は、Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851;ならびにPCT国際公開WO 98/24884およびWO 01/14424に記載されている。6〜16週齢のマウスに最初の注入を行うことが好ましい。たとえば、LSR抗原の精製調製物または組換え調製物(5〜50μg)を腹腔内投与することによりヒトIgマウスを免疫することができる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによるヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、免疫したマウスから脾細胞および/またはリンパ節細胞を単離し、マウスミエローマ細胞株などの適切な不死化細胞株と融合させることにより作製することができる。このようにして得られたハイブリドーマから抗原特異的抗体産生ハイブリドーマをスクリーニングすることができる。たとえば、免疫したマウスから得られた脾リンパ球の単一細胞懸濁液と、6分の1の細胞数のP3X63-Ag8.653マウス非分泌型ミエローマ細胞(ATCC、CRL 1580)とを50%PEGを用いて融合させることができる。平底マイクロタイタープレートに約2×105個の細胞を播種し、次いで、20% fetal Clone Serum、18%「653」調整培地、5% origen(IGEN)、4mM L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウム、5mM HEPES、0.055mM 2−メルカプトエタノール、50単位/mLペニシリン、50mg/mLストレプトマイシン、50mg/mLゲンタマイシンおよび1×HAT(Sigma;HATは融合の24時間後に添加する)を含む選択培地中で2週間インキュベートする。約2週間後、HATの代わりにHTを添加した培地中で細胞を培養することができる。次いで、各ウェルをヒトモノクローナルIgM抗体およびIgG抗体についてELISAによってスクリーニングすることができる。ハイブリドーマが広範に増殖してから、通常10〜14日後に培地を観察することができる。抗体を分泌するハイブリドーマを再び播種して、再度スクリーニングを行い、ヒトIgGがなお陽性であれば、このモノクローナル抗体を限界希釈法により少なくとも2回サブクローニングすることができる。次いで、安定なサブクローンを特性評価用の組織培養培地でインビトロ培養して少量の抗体を産生させることができる。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体は、たとえば当技術分野においてよく知られているような組換えDNA技術と遺伝子導入技術との組み合わせなどを使用して、宿主細胞であるトランスフェクトーマから作製することもできる(たとえばMorrison, S. (1985) Science 229:1202を参照されたい)。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体は、たとえば標準的なELISAなどによって、LSRに対する結合性を評価することができる。簡単に述べると、PBS中0.25μg/mLの精製LSRでマイクロタイタープレートをコーティングし、PBS中5%ウシ血清アルブミンでブロッキングする。希釈した抗体(たとえば免疫したマウスから得た血漿を希釈したもの)を各ウェルに加え、37℃で1〜2時間インキュベートする。プレートをPBS/Tweenで洗浄し、次いで、アルカリホスファターゼ標識第2試薬(たとえば、ヒト抗体に対しては、ヤギ抗ヒトIgG Fc特異的ポリクローナル試薬)とともに37℃で1時間インキュベートする。洗浄後、プレートをpNPP基質(1mg/mL)で発色させ、OD405〜650で分析する。最も高い力価を示したマウスを融合に使用することが好ましい。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、特異的抗体と類似した特異性および親和性を有する足場タンパク質に関する。実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、1つ以上のエピトープ結合ドメインに連結した足場タンパク質を含む抗原結合コンストラクトに関する。遺伝子操作されたこのような足場タンパク質は、通常、ループ領域またはそれ以外の許容される表面部位に突然変異を誘発させたランダムライブラリーを設計し、次いで、ファージディスプレイまたはその関連技術を使用して任意の標的に結合するバリアントを選択することによって得られる。実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は代替足場に関し、代替足場としては、アンチカリン(anticalin)、DARPin、アルマジロリピートタンパク質、プロテインA、リポカリン、フィブロネクチンドメイン、アンキリンコンセンサスリピートドメイン、チオレドキシン、化学的に束縛されたペプチドなどが挙げられるが、これらに限定されない。実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明は、がん、自己免疫疾患および感染症の治療薬ならびにインビボ診断薬として使用される代替足場に関する。
本発明は、LSR抗原およびその可溶性部分(細胞外ドメイン、一部分、バリアントなど)を含む、免疫療法に使用される複合体を包含する。たとえば、本発明は、LSR抗原のECDが免疫グロブリンまたはそのフラグメントに結合された複合体を包含する。本発明は、LSR抗原の活性(たとえば免疫共刺激など)を促進または抑制するための上記複合体の使用、ならびに本明細書に記載の移植片拒絶の兆候、自己免疫疾患の兆候、およびがんの兆候の治療における上記複合体の使用を意図したものである。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本発明はさらに多重特異性抗体を包含する。多重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる部位に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。別の一態様において本発明は、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗LSR抗体またはそのフラグメントを含む二重特異性分子を特徴とする。本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体またはその抗原結合部分を誘導体化するか、または別の機能分子、たとえば別のペプチドもしくはタンパク質(たとえば、別の抗体、受容体に対するリガンドなど)と連結することによって、少なくとも2つの異なる結合部位または標的分子と結合する二重特異性分子を作製することができる。また、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる抗体を誘導体化するか、または2種以上の他の機能分子に連結することによって、3つ以上の異なる結合部位および/または標的分子と結合する多重特異性分子を作製してもよく、このような多重特異性分子も本明細書の「二重特異性分子」に包含される。本発明の実施形態の少なくともいくつかによる二重特異性分子は、抗体を1以上の他の結合分子に(たとえば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合性会合などにより)機能的に連結することによって作製することができ、該他の結合分子としては、たとえば、別の抗体、抗体フラグメント、ペプチド、結合ミメティックなどが挙げられる。特定の実施形態では、二重特異性抗体の結合特異性の1つはLSRに対するものであり、もう1つは別の抗原に対するものである。特定の実施形態では、二重特異性抗体はLSRの2つの異なるエピトープに結合してもよい。二重特異性抗体は、LSRを発現している細胞に細胞傷害薬を送達するために使用してもよい。二重特異性抗体は完全長抗体または抗体フラグメントとして調製することができる。
(1)主として免疫エフェクター細胞(たとえば、単球、PMN、マクロファージ、樹状細胞)上に発現されること;
(2)高レベル(たとえば細胞1個あたり5,000〜100,000)に発現されること;
(3)細胞傷害活性(たとえば、ADCC、食作用)を媒介すること;
(4)これらの受容体にターゲティングされた抗原提示(自己抗原を含む)の増強を媒介すること
が挙げられる。
「治療」は治療処置および予防手段の両方を指し、本願実施例においてはがんの治療に関する。しかしながら、後述するように、抗体および医薬組成物の使用は、感染症および/または自己免疫病態の治療にも適用される。治療を必要とする対象としては、既にがんを発症している対象およびがんの予防処置がなされる対象が挙げられる。したがって、本明細書において治療対象となる哺乳動物は、がんを有すると診断されたもの、がんの素因を有するもの、がんに罹患しやすいもののいずれであってもよい。本明細書において「治療する」は、上記がん疾患、障害または状態の、予防、発症の遅延、治癒、改善、減弱、緩和、最小化、抑制、悪影響の阻止、または識別可能な症状の安定化を行うことを指す。さらに、「治療する」は上記のがんの管理を行うことを含む。「管理」は、疾患の重症度の低減、疾患のエピソード出現頻度の低減、疾患のエピソード出現期間の短縮、疾患のエピソードの重症度の低減、がん細胞の成長または増殖の遅延/抑制、少なくとも1つの症状の進行の遅延、少なくとも1つの測定可能な身体的パラメータの改善などを意味する。
1)Treg細胞表面受容体を認識することによってTregを直接標的とする除去抗体または殺傷抗体、たとえば、抗CD25モノクローナル抗体であるダクリズマブ、バシリキシマブなど、
2)リガンド標的毒素、たとえば、デニロイキン ディフィトックス(オンタック)(ヒトIL−2とジフテリア毒素との融合タンパク質)、LMB−2(CD25に対するscFvと緑膿菌外毒素との融合物)など、
3)Treg細胞表面受容体を標的とする抗体、たとえば、CTLA4、PD−1、OX40、GITRなど
が挙げられる。
1)全腫瘍細胞ワクチン
外科手術により採取したがん細胞を処理して免疫原性を増強し、このがん細胞を患者に注射して、腫瘍細胞の抗原に対する免疫応答を誘導する。腫瘍細胞ワクチンは、自家すなわち患者自身の腫瘍であってもよく、通常2種または3種の特性評価された任意の種類のヒト樹立腫瘍細胞株を含む同種異系であってもよい(たとえばGVAXワクチンプラットフォームなど)。
2)腫瘍抗原ワクチン
通常タンパク質またはペプチドである単一の腫瘍抗原(またはいくつかの腫瘍抗原の組み合わせ)は、免疫系をブーストするために投与される(必要に応じてアジュバントおよび/または免疫調節薬もしくは樹状細胞の誘引物質(GM−CSFなど)を併用する)。腫瘍抗原は特定の種類のがんに特異的であってもよいが、特定の患者向けに作製されるわけではない。
3)ベクターベースの腫瘍抗原ワクチンおよびDNAワクチン
これらは、抗原を安定して供給することにより抗腫瘍免疫応答を刺激する方法として使用することができる。腫瘍抗原をコードするベクターは患者体内に注射された後(必要に応じてGM−CSFなどの炎症促進性誘引物質または他の誘引物質を併用する)、インビボにおいて細胞に取り込まれて特定の抗原を産生し、該抗原によって所望の免疫応答が引き起こされる。一度に2種以上の腫瘍抗原をベクターにより送達して、免疫応答を増加させてもよい。さらに、組換えウイルスベクター、組換え細菌ベクターまたは組換え酵母ベクターは、自体に対する免疫応答を誘起すると考えられ、これによって全体的な免疫応答を増強してもよい。
4)腫瘍溶解性ウイルスワクチン(OncoVex/T−VECなど)
選択的にがん細胞に感染する条件複製単純ヘルペスウイルスの腫瘍内投与を行うものである。このウイルスは、GM−CSFを発現するようにさらに遺伝子操作されるが、がん細胞内で複製することによってがん細胞の溶解を引き起こすことができ、これによって新たなウイルスおよび様々な腫瘍抗原が放出され、さらにこの過程においてGM−CSFが分泌される。したがって、このような腫瘍溶解性ウイルスワクチンは腫瘍微小環境においてDCの機能を増強し、それにより抗腫瘍免疫応答を刺激する。
5)樹状細胞ワクチン(PaluckaおよびBanchereau,2012):
樹状細胞(DC)は、腫瘍細胞を貪食して腫瘍特異的T細胞に腫瘍抗原を提示する。このアプローチでは、DCはがん患者から単離された後にプライミングされ、腫瘍特異的T細胞が得られる。この目的のためにいくつかの方法を使用することができ、DCに腫瘍細胞または溶解物を取り込ませたり;DCに腫瘍抗原の融合タンパク質または融合ペプチドを取り込ませたり;DCを標的とするモノクローナル抗体に腫瘍抗原を結合させることができる。DCは、刺激因子(GM−CSFなど)の存在下で処理され、エクスビボで活性化および成熟化された後、点滴により患者に戻され、がん細胞に対する免疫応答を引き起こす。樹状細胞は、刺激性サイトカイン(GM−CSFなど)を分泌するように遺伝子操作した放射線照射全腫瘍細胞を患者に注射することによって、インビボでプライミングすることもできる。また、単球を用いて類似の方法を実施することができる。Sipuleucel-T(Provenge)(進行前立腺がんの治療用として承認されたがん治療ワクチン)は、樹状細胞ワクチンの一例である。
腫瘍関連抗原(TAA)に対する免疫化は、がんを治療および予防するための有望な方法の一つであるが、たとえば、腫瘍細胞によって発現される自己抗原に関連する寛容機構などのいくつかの困難な問題および制限を抱えている。B7.1(CD80)およびB7.2(CD86)などの共刺激分子は、動物モデルにおいて遺伝子ベースのワクチンおよび細胞ベースのワクチンの有効性を改善することが報告されており、これらの共刺激分子はアジュバントとして臨床試験中である。このようなアジュバント活性は、共刺激シグナルを増強することによって、あるいは腫瘍細胞によって発現される負の共刺激因子により伝達される抑制性シグナルを阻害することによって発揮されうる(Neighbors et al., 2008 J Immunother. ;31(7):644-55)。
1.がんの治療
本明細書において提供される治療薬は、通常、免疫応答を刺激する治療薬としてインビボおよびエクスビボにおいて有用である。本明細書において開示された治療薬組成物は、通常、免疫系によって免疫応答が惹起される任意の疾患もしくは障害を有する対象、またはこのような疾患もしくは障害の素因を有する対象を治療するのに有用である。本発明の治療薬によってLSR免疫シグナルが調節されることから、より強力な免疫応答を起こすことが可能となる。本発明の実施形態の少なくともいくつかによる治療薬は、T細胞などの免疫細胞が関与する免疫応答を刺激または増強するのに有用である。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる治療薬は、単独または他の適切な治療と組み合わせて投与される。一実施形態において、本発明の治療薬は、上述したように、ワクチン組成物と組み合わせて、あるいはワクチン組成物の一成分として投与することができる。本発明の実施形態の少なくともいくつかによる治療薬は、ワクチンの投与前、投与と同時または投与後に投与することができる。一実施形態において、治療薬はワクチンの投与と同時に投与される。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本明細書に記載の抗体および医薬組成物は、免疫系関連疾患の治療のために使用してもよい。
実施形態の少なくともいくつかによれば、本明細書に記載の抗体および医薬組成物は、感染症の治療のために使用してもよい。
別の態様において本発明は、本発明の実施形態の少なくともいくつかによる治療薬のいずれか1つまたはそれらの組み合わせを含む組成物(たとえば医薬組成物)を提供する。
(1)水溶性抗酸化剤、たとえば、アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど;
(2)油溶性抗酸化剤、たとえば、アスコルビルパルミタート、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど;および
(3)金属キレート剤、たとえば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸など
が挙げられる。
(1)水溶性抗酸化剤、たとえば、アスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど;
(2)油溶性抗酸化剤、たとえば、アスコルビルパルミタート、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど;および
(3)金属キレート剤、たとえば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸など
が挙げられる。本発明の実施形態の少なくともいくつかによる医薬組成物において使用してもよい適切な水性および非水性の担体としては、水、エタノール、ポリオール類(たとえばグリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど)、これらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルが挙げられる。適切な流動性を一定に保つためには、たとえば、レシチンなどのコーティング剤を使用したり、分散液の場合は粒子径を必要な大きさに保ったり、界面活性剤を使用したりすることができる。
(i)4週ごとに1回の投与を計6回行い、以降3ヶ月ごとに1回投与;
(ii)3週ごとに1回投与;
(iii)3mg/kg体重を1回投与後、1mg/kg体重を3週ごとに1回投与
から選択される投薬スケジュールのうちの1つを使用して、1mg/kg体重または3mg/kg体重の抗体を静脈内投与することを含むことが好ましい。
さらなる実施形態では、本明細書に開示の組成物(ペプチドまたはポリペプチドを含む組成物を包含する)は、水溶液の形態で非経口注射により投与される。この製剤は、懸濁液であっても乳液であってもよい。通常、本発明により提供される医薬組成物は、有効量のペプチドまたはポリペプチドを含み、薬学的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび/または担体をさらに含んでいてもよい。このような組成物は、希釈剤;滅菌水;様々な緩衝剤成分(たとえば、Tris-HCl、酢酸塩、リン酸塩)、pHおよびイオン強度の緩衝食塩水;ならびに添加剤から選択される1以上を含んでいてもよく、該添加剤としては、洗浄剤および可溶化剤(たとえば、TWEEN 20(ポリソルベート20)、TWEEN 80(ポリソルベート80))、抗酸化剤(たとえば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤;アスコルビルパルミタート、ブチル化ヒドロキシアニソール(BHA)、ブチル化ヒドロキシトルエン(BHT)、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなどの油溶性抗酸化剤;およびクエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸などの金属キレート剤)、保存剤(たとえば、チメロサール、ベンジルアルコール)ならびに増量成分(たとえばラクトース、マンニトール)が挙げられる。非水性溶媒またはビヒクルとしては、エタノール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油(オリーブ油、トウモロコシ油など)、ゼラチン、および注射用有機エステル(オレイン酸エチルなど)が挙げられる。上記の製剤は、凍結乾燥または真空乾燥されていてもよく、使用の直前に再溶解/再懸濁してもよい。上記の製剤の滅菌は、たとえば、細菌捕集フィルターを通した濾過、組成物への滅菌剤の添加、組成物への放射線照射、または組成物の加熱によって行ってもよい。
本明細書に開示のLSRポリペプチド、フラグメント、融合ポリペプチド、核酸およびベクターは、局所適用することができる。ペプチド製剤は局所投与しても効果を発揮しないものが多いが、特に肺、鼻、口腔(舌下、頬側)、膣、または直腸粘膜に適用すると効果を発揮する場合がある。
本明細書に開示のLSRポリペプチド、フラグメント、融合ポリペプチド、核酸およびベクターは、放出制御製剤の形態で投与してもよい。放出制御ポリマーデバイスは、ポリマーデバイス(棒状、円柱状、フィルム状、円盤状)を移植または注射(マイクロパーティクル状)した後、長期間にわたり薬物が全身に放出されるように製剤化してもよい。マトリックスは、マイクロスフェアなどのマイクロパーティクルの形態であってもよく、ペプチドは固体のポリマーマトリックス内またはマイクロカプセル内に分散されている。このようなマイクロパーティクルは、それぞれの材質が異なるコアとポリマーシェルとからなり、自然な状態で液体であっても固体であってもよいコアにペプチドが分散または懸濁されている。本明細書に特に記載されていない限り、マイクロパーティクル、マイクロスフェアおよびマイクロカプセルという用語は同じ意味で用いられる。別の方法として、ポリマーは、ナノメーター単位〜4cmの薄い板状またはフィルム状に流延してもよく、粉砕または他の標準的な技術により粉末にしてもよく、さらには、ヒドロゲルなどのゲルにしてもよい。非生物分解性マトリックスと生物分解性マトリックスのいずれを使用してもポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸を送達することができるが、生物分解性マトリックスを使用することが好ましい。これらのマトリックスは天然ポリマーであっても合成ポリマーであってもよいが、分解性および放出特性に優れていることから合成ポリマーが好ましい。ポリマーは所望の放出時間に基づいて選択される。直線性の放出挙動が最も有益である場合もあれば、パルス放出または「バルク放出」がより効果的である場合もある。ポリマーは、ヒドロゲル(通常、最大約90重量%の水を吸収している)の形態であってもよく、多価イオンまたはポリマーで架橋されていてもよい。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによれば、上記の抗体(たとえば、ヒトモノクローナル抗体、多重特異性分子、二重特異性分子および組成物)を使用して、LSRレベルまたは膜表面上にLSRを含む細胞の濃度を検出することができ、検出されたレベルまたは濃度を特定の疾患の症状と関連付けることができる。あるいは、上記の抗体を使用してLSRの機能を抑制または阻害することにより、がんの予防または改善を行うことができる。これらの方法は、LSRとこれに対応する抗体との間で複合体を形成することが可能な条件下において、試料またはコントロール試料と抗LSR抗体と接触させることよって行うことができる。LSRと抗体との間で形成された複合体であればどのようなものでも試料中およびコントロール中において検出および比較することができる。
(a)臓器または組織のイメージングを必要とする対象に標識ポリペプチドを投与すること;および
(b)標識ポリペプチドが対象のどこで濃縮されているのかを決定するために標識ポリペプチドを検出すること
を含む方法を提供する。
本発明の実施形態の少なくともいくつかによる標識ポリペプチドをイメージング用途に使用する場合、通常、造影剤を標識ポリペプチドに共有結合または非共有結合を介して結合させる。適切な造影剤としては、放射性核種、検出可能なタグ、発蛍光団、蛍光タンパク質、酵素タンパク質などが挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチドに造影剤を結合するための他の方法は、当業者によく知られているであろう。たとえば、造影剤は部位特異的な結合を介してポリペプチドに結合させることができ、たとえば、Fc融合分子のカルボキシル末端に付加された5〜7個のアルギニンを有するポリアルギニン部分などのようなペプチドリンカーに造影剤を共有結合させることができる。また、造影剤は非部位特異的結合を介してポリペプチドに直接結合させることもでき、たとえば、ポリペプチドに存在する第一級アミン基に造影剤を共有結合させることができる。非共有結合性相互作用(たとえば、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、双極子−双極子結合など)を介して造影剤をタンパク質に結合することも可能であることは、当業者によって容易に理解されるであろう。
本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体と生体試料とを接触させること、および
これらの相互作用を検出することを含み、
該相互作用の存在と生体試料中のポリペプチドの存在とが相関していること
を特徴とする検出方法を提供する。
本発明の別の実施形態では、イムノアッセイを使用して、試料中のマーカーを定性的または定量的に検出および分析することができる。この方法は、マーカーに特異的に結合する抗体を提供すること;該抗体と試料とを接触させること;および試料中のマーカーに抗体が結合した複合体の存在を検出することを含む。
この方法の一形態は所望の基質を沈殿させることを含み、本明細書において後述される方法では、アガロースビーズなどの沈殿可能な担体上に固相化された放射性標識抗体結合タンパク質(たとえば125Iで標識したプロテインA)と特異的抗体とを使用して所望の基質を沈殿させる。沈殿ペレット中のカウント数は基質の量と比例する。
この方法は、マイクロタイタープレートのウェルなどの表面に、タンパク質基質を含む試料を固定すること(たとえば固定した細胞またはタンパク質溶液)を含む。酵素とカップリングさせた基質特異的抗体を添加し、基質と結合させる。次いで、抗体にカップリングさせた酵素を利用した比色反応により、抗体の存在を検出しその量を定量する。この方法において一般的に使用される酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられる。較正が適切であり、かつ反応が直線領域内にある場合、試料中に存在する基質の量は呈色の量に比例する。通常、定量精度を向上させるために標準基質を使用する。
この方法は、アクリルアミドゲルを用いて他のタンパク質からの基質を分離し、次いで膜(たとえばナイロンまたはPVDF)に基質を転写することを含む。次いで、基質に特異的な抗体を用いて基質の存在を検出した後、抗体結合試薬を用いて抗体を検出する。抗体結合試薬は、たとえばプロテインAであっても他の抗体であってよい。上述したように、抗体結合試薬は放射性標識してもよく、酵素と結合させてもよい。検出はオートラジオグラフィ、比色反応、化学発光のいずれによって行ってもよい。この方法では、基質の定量と、アクリルアミドゲル上での電気泳動の際の泳動距離を示す膜上の相対位置からの基質の同定との両方を行うことができる。
この方法は、基質特異的抗体を用いて、固定された細胞中の基質をインサイチューで検出することを含む。基質特異的抗体は、酵素に結合されていてもよく、発蛍光団に結合されていてもよい。検出は顕微鏡観察および主観評価による。酵素を結合させた抗体を使用する場合、比色反応が必要とされうる。
この方法は、基質特異的抗体を用いて、細胞中の基質をインサイチューで検出することを含む。基質特異的抗体は発蛍光団に結合される。検出は、細胞が光線を通過する際にそれぞれの細胞から発せられる光の波長を読み取るセルソーティング装置を用いて行う。この方法では2種以上の抗体を同時に使用してもよい。
この方法は、ポジトロン放射断層撮影(PET)およびシングルフォトンエミッションコンピュータ断層撮影(SPECT)含むが、これらに限定されない。これらの技術はいずれも非侵襲性であり、様々な組織事象および/または組織機能を検出および/または測定するために使用することができ、たとえば、がん細胞の検出などを行うことができる。PETとは異なり、SPECTでは2種の標識を同時に使用してもよい。SPECTは他にも利点をいくつか有し、たとえば、コストおよび使用可能な標識の種類の点で有利である。たとえば、米国特許第6,696,686号には、乳がんを検出するためのSPECTの使用が記載されており、この文献はその全体が本明細書の一部を構成するものとして援用される。
セラノスティクス(theranostics)は、診断検査を使用して、疾患を診断し、診断検査の結果に応じて適切な治療計画を選択し、かつ/または診断検査の結果に応じた治療法に対する患者の応答をモニターすることを指す。セラノスティクス試験を使用することによって、患者に対して特に有益であり、副作用を起こさないと考えられる治療法を患者のために選択することができる。さらに、セラノスティクス試験は、個々の患者における治療効果の早期かつ客観的な指標を示すことができるため、治療を最小限の遅れで(必要に応じて)変更することができる。たとえば、DAKO社とジェネンテック社は共同で、乳がんの治療のためのHercepTestおよびハーセプチン(トラスツズマブ)を開発したが、これは初めてのセラノスティクス試験であり、新規の治療薬と同時に承認された。HercepTest(免疫組織化学的試験)に加えて、従来の臨床化学、イムノアッセイ、細胞に基づいた技術および核酸試験を使用した他のセラノスティクス試験も現在開発中である。PPGx社は最近TPMT(チオプリン−S−メチルトランスフェラーゼ)試験を上市したが、医師がこの試験を実施することにより、6−メルカプトプリン(白血病の治療において用いられる薬物)に対して致命的な副作用を起こす危険性のある患者を識別することが可能となる。さらに、Nova Molecular社は、アルツハイマー病患者のコリン様作用薬療法に対する応答を予測するための、アポリポ蛋白質E遺伝子のSNP遺伝子型決定法を先駆けて開発しており、現在、新薬の臨床試験においてこの指標を得るために広く利用されている。このように、セラノスティクス分野は、治療に対する患者の応答を予測する診断検査情報と、その特定の患者のための適切な治療の選択とが融合したものである。
代理マーカーは、研究所において検出可能かつ/または患者の身体的兆候または症状に応じて検出可能であり、臨床的意義のあるエンドポイントの代わりとして治験において使用されるマーカーである。代理マーカーは、患者の知覚、身体機能、生存率を具体的に示す直接的な尺度であり、治療法の効果を予測するものであると考えられている。代理マーカーは、患者に対する治療効果を示す目的のエンドポイント(臨床エンドポイントと呼ばれる)よりも代理マーカーの方が早期に、簡便にまたは頻回に測定可能である場合に主として使用される。理想的には、代理マーカーは生物学的に妥当性があり、疾患の進行を予測でき、標準化されたアッセイ(従来の臨床化学、イムノアッセイ、細胞に基づいた技術、核酸試験および画像診断法を含むが、これらに限定されない)によって測定可能であるべきである。
A.LSR_T1_P5a ORFのクローニング
以下のように、LSR_T1_P5aオープンリーディングフレーム(ORF)(配列番号154)をPCRによりクローニングして、LSR_P5aタンパク質(配列番号11)を作製した。
以下のようにして、ワンステップ部位特異的突然変異誘発PCRにより627番目のアラニンをグリシンに置換して、LSR_WTオープンリーディングフレーム(ORF)をクローニングし、LSR_WTタンパク質(配列番号154)を作製した。
GenWiz社(米国)において、C末端にFlagタグを付加してヒトLSR(配列番号201)のエクソン4スキッピングバリアントの全長cDNAを合成し、pUC57ベクターにクローニングした。次いで、以下のようにして、このcDNAをpRp3哺乳動物発現ベクター(pcDNA3.1)にクローニングし、発現コンストラクトを作製した。
以下のようにして、C末端にFlagタグを付加してマウスWT LSR(配列番号202)の全長cDNAを合成し、GenScriptを用いてpUC57ベクターにクローニングし、哺乳動物発現ベクター(pcDNA3.1)にサブクローニングして発現コンストラクトを作製した。
以下のように、サルLSR_WTオープンリーディングフレーム(ORF)(配列番号203)をPCRによりクローニングして、サルLSR_WTタンパク質(配列番号203)を作製した。
以下のように、サルLSR_skip4オープンリーディングフレーム(ORF)(配列番号208)をPCRによりクローニングして、サルLSR_skip4タンパク質(配列番号208)を作製した。
1.LSR_P5a_FLAG_Mタンパク質を発現する組換えHEK293T細胞の安定なプールの作製
以下のようにして、LSR_T1_P5a_Flag_m(配列番号146)ベクタープラスミドまたはpIRESpuro3空ベクタープラスミドをHEK293T細胞に安定にトランスフェクトした。
Fugene6トランスフェクション試薬(ロシュ、カタログNo.111-988-387)を使用して、上記のヒトもしくはサルLSR(配列番号154、201、203、208)のLSR pRp3コンストラクトまたはネガティブコントロールとしての空ベクター(pRp3)をHEK293T(ATCC、CRL-11268)細胞にトランスフェクトした。ピューロマイシン耐性コロニーを選択して、安定なプールの作製に使用した。マウスLSR WT(配列番号202)については、別の発現ベクターおよび別の細胞株を使用して、安定なトランスフェクタントプールを作製した(以下を参照されたい)。
WTマウスLSR-Flagタンパク質(配列番号202)を発現する安定なトランスフェクタント細胞プールは、GeneScript社(米国)において作製した。C末端にFlagタグを付加したマウスWT LSR配列(配列番号202)を合成し、pUC57ベクターにクローニングし、哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1にサブクローニングした。得られた組換えプラスミドをCHO-K1(ATCC、カタログNo.CCL-61)細胞およびHEK293(ATCC、カタログNo.CRL-1573(登録商標))細胞にトランスフェクトした。G418を使用して安定なトランスフェクタント細胞プールをスクリーニングし、抗Flag抗体を使用してウエスタンブロットにより分析した。
A.安定にトランスフェクトされたHEK293T細胞におけるLSR_P5a_FLAG_Mの異所性発現の分析
安定にトランスフェクトされたHEK293T細胞におけるLSR_P5a_Flag_m(配列番号144)の発現を、表1に示す抗LSR抗体および抗flag抗体を使用した、細胞溶解物のウエスタンブロット分析によって測定した。
表1に示す抗LSR抗体および抗flag抗体を使用して細胞溶解物のウエスタンブロット分析を行うことにより、安定にトランスフェクトされたHEK293T細胞またはCHO-K1細胞におけるヒト、サルおよびマウスのLSR_WTおよびLSR skip4の発現を測定した。
以下のようにして、様々な細胞株における内因性LSRタンパク質の発現をウエスタンブロットにより分析した。
ヒトLSR_WT(配列番号11)タンパク質に特異的なsiRNA(サーモサイエンティフィック、カタログNo.M-009672-00-0005)の機能の確認とその特異性のバリデーションを行うために、ヒトLSR_WT(配列番号11)を安定に発現するHEK293T細胞においてLSRタンパク質のノックダウンを行った。
LSR(配列番号11)に特異的なsiRNAを一時的にトランスフェクトすることによって、HT29細胞またはHepG2/C3A細胞におけるLSRタンパク質(配列番号11)の内因性発現をノックダウンした。Lipofectamine(登録商標)RNAiMAXトランスフェクション試薬(インビトロジェン、カタログNo.13778-150)を使用して、LSR特異的siRNA(サーモサイエンティフィック、カタログNo.M-009672-00-0005)またはネガティブコントロールとしてのスクランブルsiRNA(サーモサイエンティフィック、カタログNo.D-001810-01-05)を(HT29細胞に対しては)30pmol(10nM)または(HepG2/C3Aに対しては)50pmolの量で細胞にトランスフェクトした。72時間(HT29細胞)または48時間(HepG2/C3A細胞)インキュベートした後、抗LSR(配列番号11)モノクローナル抗体8C8のハイブリドーマ上清を使用したFACS、または表1に記載の市販抗LSRポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロットによって細胞を分析した。
A.HEK293T細胞における異所性LSR_P5a_FLAG_mの細胞内局在の決定
安定にトランスフェクトされた細胞におけるLSR_P5a_Flag_mタンパク質(配列番号144)の細胞内局在を共焦点顕微鏡法によって決定した。
安定にトランスフェクトされた細胞におけるLSR_WT(配列番号11、211、31)およびskip4タンパク質(配列番号13、212)の細胞内局在を共焦点顕微鏡法によって決定した。
A.安定発現細胞のFACS分析によるヒトおよびサルLSRタンパク質の細胞表面発現の確認
様々なLSRタンパク質(WTおよびskip4)(配列番号11、13、211、212および31)を過剰発現する安定にトランスフェクトされたHEK293T細胞およびCHO_K1細胞を、8C8ハイブリドーマクローンを使用したフローサイトメトリー(FACS)によって分析した。図14に示すように、LSRタンパク質(ヒトWT(配列番号11)、サルWT(配列番号211)、マウスWT(配列番号31)ならびにヒトおよびサルSkip4バリアント(配列番号13および212))を安定に発現する細胞に対する様々な濃度の8C8モノクローナル抗体の結合性は、空ベクターをトランスフェクトした細胞やコントロール培地で染色した細胞で観察されたものよりも顕著に高く、これによって、これら5種のLSRタンパク質が細胞膜上に発現することが明らかとなった。
以下のようにして、様々ながん細胞株(表3に記載の卵巣、肝臓、乳房、子宮頸部および結腸に由来)における内因性LSRタンパク質の発現をウエスタンブロットにより分析した。
ヒトLSRタンパク質(配列番号10)の細胞外ドメインに対するマウスモノクローナル抗体は、BIOTEM社(Parc d'activite Bievre Dauphine, 885 rue Alphonse Gourju, 38140 APPRIEU, France)においてペプチド免疫化により作製した。免疫化に使用したペプチドはヒトLSRタンパク質(配列番号10)の細胞外ドメインに由来するものである。これについて以下に説明する。
TRIzol(登録商標)Plus RNA Purification System(インビトロジェン、カタログNo.15596-026)の技術マニュアルに準じて、凍結したハイブリドーマ細胞からトータルRNAを抽出した。アガロースゲル電気泳動でトータルRNAを分析した。SuperScript(登録商標)III First-Strand Synthesis System(インビトロジェン、カタログNo.18080-051)の技術マニュアルに準じて、アイソタイプ特異的アンチセンスプライマーまたはユニバーサルプライマーを用いて、トータルRNAからcDNAに逆転写した。次いでRT-PCRを行い、抗体の重鎖および軽鎖を増幅した。GenScript社のRACEの標準作業手順書に準じて、VH抗体フラグメントおよびVL抗体フラグメントを増幅した。
キャリブレーション研究
LSRの発現を評価するための適切な抗体濃度および抗原賦活法を確立するために、キャリブレーション研究を行った。
本研究は、本発明の実施形態の少なくともいくつかによるLSR特異的抗体を使用して、様々な癌性組織におけるLSRの発現を測定することを目的とした。ホルマリン固定/パラフィン包埋(FFPE)切片におけるLSRの分布は免疫組織化学(IHC)を使用して試験した。
指定のポジティブコントロール組織および空ベクター細胞株においてLSRウサギポリクローナル抗体が最適化され、かつ検出されたことを以下のデータセットにより示す。アッセイ実施の内部条件および抗体のバリデーションを示すアッセイポジティブコントロールを図19に示す。図19(×60)は、pH9.0においてAR(抗原賦活)を行ったLSR陽性細胞の切片を示す。パネルAは、2μg/mLのLSR抗体を使用してインキュベートしたスライドを示す。パネルBは、「no primary」条件でインキュベートした、パネルAに隣接する切片を示す。パネルAはLSR免疫反応性が陽性であり、抗体反応条件が適切であることが示された。これに隣接するno primary切片(パネルB)では明らかな免疫反応性は示されなかった。特異的な免疫反応性は、正常肝臓試料、腫瘍肝臓試料および乳房腫瘍試料のポジティブコントロール組織で検出された。LSR抗体は、2名の正常肝臓ドナーおよび1名の腫瘍ドナーにおいて細胞膜染色性および細胞質染色性を示した。
乳房腫瘍セットでは、染色強度は1〜2+の範囲で変動し、そのうち2例の腫瘍がスコア2+を示した。アレイに含まれる乳房腫瘍のうち、1コアのみが0〜25%の免疫反応性を示したが、大部分は75〜100%の免疫反応性を示した。スコア2+を示した腫瘍はいずれも浸潤性乳管癌(IDC)であった。
大腸コホートでは、8例の試料が中分化型腺癌性腫瘍であった。6例の試料が2+または3+のスコアを示し、1例の試料が最も強いレベルである3+の免疫反応性を示し、1例の試料が0〜1+のスコアを示した。試料はいずれも75〜100%の免疫反応性を示した。1例の正常試料では、上皮側に向かう粘膜上皮部分において特異的な免疫反応性が細胞質に見られたのに対し、陰窩側に向かう粘膜上皮部分においてはスコア2〜3の染色性を示す細胞膜結合性の表現型が見られた。
前立腺腫瘍では、免疫反応性レベルは1〜2+の範囲で変動した。8例の腺癌コホートのうち、1例の腫瘍でスコア2+(グリーソンスコア9)が記録され、2例の腫瘍でスコア1〜2(グリーソンスコア9および7)が記録され、3例の腫瘍でスコア1+が記録された。前立腺腫瘍はいずれもLSR免疫反応性を示すと見られた。これらのコアでは、顕著な膜表現型が腫瘍上皮内に観察された例外を除き、免疫反応性は細胞質に見られた。正常前立腺試料では、腺上皮において染色性が見られ、平滑筋領域においても時折染色性が見られ、その染色強度は+1〜+2であった。
リンパ腫試料では、染色レベルはより低く、3例のNHL(非ホジキンリンパ腫)試料でスコア1+が示され、5例のNHL(非ホジキンリンパ腫)およびHL(ホジキンリンパ腫)試料でスコア0〜1+が示され、これらのコアは75〜100%の免疫反応性を示した(HL試料はIHCスコア0〜1であった)。しかしながら、1名のドナー(15052)では、ばらけた腫瘍細胞集団においてより高い染色レベルが示された。2例の正常リンパ節試料のうちの1例の試料では、胚中心内において細胞質染色性が見られた。他の試料においては、ばらけた免疫細胞のいくつかが免疫反応性を示した。
肺腫瘍セットでは、12例の腫瘍試料のうちの8例の試料が特異的なLSR免疫反応を示した。観察された染色強度および免疫反応性は、腫瘍の種類によって異なった。1例のNSCL(非小細胞肺)腺癌試料では、腫瘍はスコア2+〜3+の強い免疫反応性を示したのに対し、2例の扁平上皮癌試料では2+および1+〜2+の強度スコアが示された。2例のNSCLC(非小細胞肺がん)試料では、1+〜2+の強度レベルが示され、いずれも低〜中程度分化型であった。3例の腺癌試料では、2例の試料はスコア2+の染色強度を示したが、1例の試料は1+の染色スコアを示したに過ぎず、この試料は低分化型であった。腫瘍の大部分は75〜100%の免疫反応性を示した。小細胞癌試料のコホートでは、腫瘍細胞に明らかな免疫反応性は見られず、マクロファージと推定される細胞に免疫反応性が時折見られた。正常肺試料では、気道上皮において細胞質免疫反応性が陽性であった。肺細胞においても時折+1〜+2の強度の免疫反応性が見られた。
胃腫瘍では、4例の腺癌試料(中程度分化型)が、腫瘍内に明らかなLSR発現を示し、各コアにおいて75〜100%の免疫反応性が示された。全体を通してスコアレベルは試料によって異なり、1例の試料はスコア2+〜3+を示し、残りの試料はスコア1+または2+を示した。特定の組織においては、細胞膜に関連する顕著な染色性が時折見られるとともに、さらにマクロファージと推定される浸潤細胞においても免疫反応性が見られた。正常胃組織においては、粘膜上皮において明らかな特異的細胞質免疫反応性が見られた。1名の特定のドナー(2874)では、細胞質染色性および核染色性が見られ、その染色強度は+1〜+2であった。
卵巣癌コホートでは、腫瘍内において特異的なびまん性の細胞質免疫反応性が示され、コアは75〜100%の免疫反応性を示した。染色強度は腫瘍の種類によって異なった。2例の漿液性乳頭状癌試料はそれぞれスコア0〜1+および2+を示し、色の濃い強染色パターンを示す腫瘍細胞がいくつか見られた(ドナー13003)。顆粒膜細胞腫では比較的低いスコア(0〜1+)が示されたが、漿液性嚢胞腺癌試料では2+の強い染色性が示されるとともに、細胞膜に関連する免疫反応性が示された(ドナー9407)。正常卵巣組織では、1例の試料のみにおいて、ある程度の特異的免疫反応性が間質領域で示され、その染色強度は+2であった。
皮膚悪性黒色腫では、弱い染色性(0〜1+)が示され、腫瘍細胞の25〜50%に免疫反応性が見られた。この組織においては、細胞膜に関連する明らかな染色性は観察されなかった。正常皮膚では表皮内に免疫反応性は見られなかった。皮膚リンパ球のみが時折陽性に染色された。
脳腫瘍では、(グレード4の星状細胞腫の)2例の試料において腫瘍細胞の75〜100%が免疫反応性を示した。具体的には、1名のドナー(ドナー9516)において核膜染色性(2+)が示されたのに対し、ドナー13845では染色性はそれほど強くなかった(0〜1+)。グレード2の星状細胞腫を有する1名の患者はIHCスコア0を示した。腫瘍の種類と免疫反応性レベルとの間には相関性はないと考えられる。正常脳では、1例の試料が神経網内の細胞において明らかな特異的細胞質免疫反応性を示し、他にも神経線維において観察された。
腎臓癌では、3例の明細胞腫瘍および1例の非明細胞癌がLSR免疫反応性を示した。染色強度レベルは1+〜2+の範囲で変動し、各コアにおいて腫瘍細胞の75〜100%が免疫反応性を示した。また、明細胞癌は、分化度がより低い細胞型と比較して細胞膜に特異的な辺縁染色パターンを示したことが確認された。正常腎臓試料では、集合管において特異的な細胞質染色性が見られた。
肝腫瘍では、3例の試料はいずれも腫瘍細胞に顕著な免疫反応性を示し、各コアにおいて腫瘍細胞の75〜100%が染色性を示した。ドナー19115は、アレイにおいて最も強く染色されたコアであったため、スコア3+とした(この染色強度レベルを基準として他のコアのスコアリングを行った)。また、細胞サブセットでは、周囲の腫瘍と比較して強いレベルの細胞質染色性が観察され、細胞膜に関連する免疫反応性が時折示された。正常肝臓では特異的な細胞膜免疫反応性が見られた。
正常リンパ節、扁桃腺および脾臓のfull-face切片では、これら3種の組織セットの大部分において胚中心に細胞質染色性陽性が確認され、さらにマクロファージと推定される細胞のいくつかが免疫反応性を示した。リンパ節では、リンパ濾胞内においていくつかの細胞が細胞膜染色性を示したことが確認され、平滑筋も時折染色された。
「Top 4」TMAは4種の組織に由来するコアから構成されていた(乳房(4例の正常組織および26例の腫瘍組織)、大腸(4例の正常組織および26例の腫瘍組織)、肺(4例の正常組織および26例の腫瘍組織)ならびに前立腺(4例の正常組織および26例の腫瘍組織))。TMAの配置を表9に示す。HEK293T LSR細胞株のFFPE切片(4μm)および「Top4」multi-tumor TMAを使用した。特に記載がない限り、インキュベーションはすべて室温で行った。PT Link装置においてpH9.0 Flex+ 3-in-1抗原賦活バッファーを使用し、95℃、20分間の設定で自動的に加温および冷却しながら、切片の脱パラフィン、抗原賦活、親水化を行った。抗原賦活後、切片をFlex(TBST)バッファーで2×5分間洗浄し、ダコAutostainer Plusにセットした。Flex+ パーオキシダーゼブロッキング試薬とともに切片を10分間インキュベートし、50mM Tris-HCl、150mM NaCl、0.1%Tween20、pH 7.6(TBST)中で2回リンスし、Protein Block試薬(ダコ、X0909)とともに10分間インキュベートした。ダコEnvision Flex抗体希釈液(DAKO Cytomation、カタログNo.K8006)で希釈した一次抗体とともに切片を30分間インキュベートした。6μg/mLの抗LSRポリクローナル抗体(Abcam ab169583)を反応させた。1μg/mLの抗フォン・ヴィレブランド因子(VWf)抗体を反応させた。ネガティブコントロール切片は、6μg/mLおよび1μg/mLの非免疫ウサギIgG抗体(ダコ、カタログNo.0936)またはダコEnvision Flex抗体希釈液(「no primary」コントロール)とともにインキュベートした。一次抗体とともにインキュベートした後、切片をFLEXバッファー中で2回リンスし、抗マウス/ウサギFlex+ HRPとともに20分間インキュベートし、FLEXバッファー中で2回リンスし、次いでジアミノベンジジン(DAB)基質とともに10分間インキュベートした。蒸留水でスライドをリンスすることにより発色反応を停止させた。発色後、ヘマトキシリンで切片を対比染色し、エタノールの上昇系列(90%→99%→100%)で脱水し、キシレンを3回交換して透徹し、DePeXを用いてカバースリップをかけた。ライカDFC290カメラを備えたオリンパスBX51顕微鏡を使用して、染色した切片を分析し、適切なデジタル画像を撮影した。
B7/CD28ファミリー受容体のいくつか(たとえばCTLA4、PD-1および未知のB7-H4受容体)の発現はT細胞の活性化に依存するため、この実験では、LSRのカウンター受容体が活性化T細胞上に発現されるかどうかを試験した。この目的のため、可溶性抗CD28抗体の存在下においてプレート結合抗CD3抗体を使用して、あるいはコンカナバリンA(Con A)を使用した一般的な活性化法によって、マウス初代CD4 T細胞を活性化した。
1.コンカナバリンA(Con A)による刺激−精製したCD4+T細胞を平底96ウェルプレートに1ウェルあたり2×105個播種した。Con A(3μg/mL、Sigma、カタログNo.C5275)を加え、細胞を37℃で48時間インキュベートした。
2.抗CD3+抗CD28による刺激−抗CD3を固定化するため、平底96ウェルプレートに5μg/mL抗CD3(0.5mg/mL、カタログNo.553058、BD)を1ウェルあたり75μL加え、室温で少なくとも2時間インキュベートした。ウェルをPBS200μLで3回洗浄した。2μg/mL可溶性抗CD28(eBioscience、カタログNo.16-0281-85)とともに、精製したCD4+T細胞を1ウェルあたり2×105個播種して、37℃で48時間インキュベートした。
Con Aまたは抗CD3/CD28で刺激したCD4+T細胞1×105個を結合に使用した。マウスIgG2a Fc M:Mに融合させたマウスLSR ECD(バッチNo.35)(配列番号221)をこの結合アッセイに使用した。ポジティブコントロールとして、マウスIgG2a Fc H:Mに融合させたヒトILDR2 ECDの非グリコシル化誘導体(FcにN297A変異を有する、バッチNo.23)(配列番号223)を平行して試験した。T細胞株への結合を検出するために、上述したようにタンパク質の結合を検出した。
マウスIgG2a Fcに融合させたマウスLSR-ECD(配列番号221)の結合をより高いタンパク質濃度でも検出することができるかどうかについて、KARPAS-299細胞(ACC31、DSMZ)を使用して試験した。マウスIgG2a Fcに融合させたマウスLSR-ECD(配列番号221)をビオチン標識した濃度上昇系列を使用して、KARPAS-299細胞の染色を行った。
本研究は、マウスLSR TaqManプローブ(アプライドバイオシステムズ;カタログNo.Mm00660290_m1)を使用して、マクロファージの分化におけるmRNAレベルでのLSR mRNAの発現に対して極性化シグナル(M1型への極性化:IFNg、LPS、IFNg+LPS;M2型への極性化:IL-4、TGFb、グルココルチコイド、腫瘍上清)が及ぼす影響を評価することを目的とした。
実験系のバリデーションを行うために、典型的なM1型およびM2型マーカーの発現レベルを上述の様々な刺激下で評価した。図22に示すように、典型的なM1型マーカーであるINOSの発現は(M1型へと極性化させる)LPS+INFγの刺激によって上昇した。図23に示すように、典型的なM2型マーカーであるALOX15の発現は(M2型へと極性化させる)IL4および腫瘍上清の刺激によって上昇した。
本研究の結果から、選択的に活性化されたM2型マクロファージにおけるLSR mRNAの発現のアップレギュレーションが示された。
1)インビボ概念実証
a)マウスがん同系モデル:
(i)LSRタンパク質または無関係なコントロールタンパク質を過剰発現する腫瘍細胞を、遺伝的に適合するマウスに移植する。次いで、腫瘍の体積(およびマウス屠殺後の腫瘍の重量)を測定して腫瘍増殖の遅延を評価する(すなわち、LSRを過剰発現する腫瘍は、無関係なコントロールタンパク質を過剰発現する腫瘍よりも早く成長する)。腫瘍の所属リンパ節から得た免疫細胞をエクスビボ分析することによって、制御性T細胞とエフェクターT細胞の比率を評価する。
腫瘍細胞を遺伝的に同一のマウスに移植する。この担癌マウスに、LSRタンパク質に対する中和抗体を様々な用量で注射する。LSRタンパク質に特異的な中和抗体を使用した治療の結果、腫瘍の拒絶が増強する(すなわち、LSRタンパク質に対する中和抗体で治療したマウスの腫瘍は、無関係な抗体で治療したマウスの腫瘍よりも成長が遅くなる)。腫瘍の所属リンパ節から得た免疫細胞をエクスビボ分析することによって、制御性T細胞とエフェクターT細胞の比率を決定する。
腫瘍細胞を遺伝的に同一のマウスに移植する。腫瘍を樹立した後、LSRタンパク質に対する中和抗体をマウスに様々な用量で腹腔内注射し、その際に慣用の化学療法(たとえばシクロホスファミド、Mkrtichyan et al. Eur. J immunol. 2011; 41, 2977-2986に記載された方法に準じる)と組み合わせたり、他の免疫チェックポイント阻害薬(たとえばPD1およびCTLA4、Curran et al.; Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Mar 2; 107(9):4275-80に記載された方法に準じる)と組み合わせたり、他の免疫調節薬(たとえば抗IL-18、Terme et al.; cancer res. 2011; 71:5393-5399に記載された方法に準じる)と組み合わせたり、がんワクチン(Hurwitz et al. Cancer Research 60, 2444-2448, May 1, 2000に記載された方法に準じる)と組み合わせたり、あるいは放射線療法(Verbrugge et al. Cancer Res 2012;72:3163-3174に記載された方法に準じる)と組み合わせる。
内因性にLSRを発現するヒトがん細胞株を免疫欠損マウスに移植する。抗LSR抗体で治療したマウスの腫瘍体積と、アイソタイプが一致する無関係な抗体で治療したマウスの腫瘍体積とを比較評価する。この実験では、抗LSR抗体に毒素を結合させて(Luther N et al. Mol Cancer Ther. 2010 Apr;9(4):1039-46に記載された方法に準じる)、抗体-薬物複合体(ADC)の活性を評価しつつ、これとは別に、LSRに対するヒトIgG1またはマウスIgG2aアイソタイプ抗体でマウスを治療する(Holbrook E. Kohrt et al. J Clin Invest. 2012 March 1; 122(3):1066-1075に記載された方法に準じる)。これらの抗体アイソタイプは抗体依存性細胞傷害(ADCC)を介した腫瘍除去を評価するために使用される。
a)結合アッセイ:
(i)J Immunol 2005;174;6692-6701の記載に準じ、活性化された初代培養NK細胞に対する結合アッセイをヒトLSR ECD-FCタンパク質を用いて行う。NK細胞上にLSRのカウンター受容体が発現されていれば、LSR ECD-Fcの結合が観察される。
(ii)PNAS, 2009, vol. 109; 17858-17863の記載に準じ、活性化された初代培養NK細胞に対する結合アッセイをLSRタンパク質のいずれか1つに対する特異的抗体を用いて行う。NK細胞上にLSRのいずれか1つが発現されていれば、LSR特異的抗体の結合が観察される。
(iii)J Immunol 2006;176;6762-6769の記載に準じ、NK殺傷の標的細胞になりうる様々なヒトがん細胞株に対する結合アッセイをヒトLSR ECD-FCタンパク質を用いて行う。標的がん細胞上にLSRのいずれか1つのカウンター受容体が発現されていれば、LSR ECD-Fcの結合が観察される。
(i)killing assayは、過剰発現システム(LSRタンパク質のいずれか1つを過剰発現しているNK細胞または標的がん細胞)を使用して行う。PNAS, 2009, vol. 109; 17858-17863の記載に準じ、 NK細胞(effector;e)と放射性(S35)標識された標的がん細胞(target;t)とを様々なe:t比で共培養する。次いで、放射線放射を測定することによって、NK殺傷活性による標的細胞の溶解を評価する。標的がん細胞および/またはNK細胞株におけるLSRタンパク質のいずれか1つの過剰発現によって、NK媒介性殺傷活性がダウンレギュレートされる。
(ii)PLoS ONE; 2010; Vol. 5; p. 1-10の記載に準じ、ヒトLSR ECD-FCタンパク質の存在下においてkilling assayを行う。LSRのいずれか1つのECD-Fcを用いて処理を行うことによって、LSRとそのカウンター受容体との相互作用が阻害され、それによってLSRの抑制活性が低下し、殺傷活性が増強される。
(iii)PNAS, 2009, vol. 109; 17858-17863の記載に準じ、LSRタンパク質のいずれか1つに対する中和抗体の存在下においてkilling assayを行う。LSRのいずれか1つに対する中和抗体を用いて処理を行うことによって、NK殺傷活性が増強される。
(iv)「Re-directed killing assay」は以下のように行う。PNAS, 2009, vol. 109; 17858-17863の記載に準じ、Fc受容体を高密度に発現する標的がん細胞を、LSRタンパク質のいずれか1つに対する活性化抗体でコーティングし、(選択したLSRタンパク質を発現する)NK細胞と接触させる。LSRのいずれか1つと活性化抗体との架橋によって、NK媒介性殺傷活性が低減される。
a)悪性黒色腫細胞株におけるLSRタンパク質の発現
様々な悪性黒色腫細胞株におけるLSRの発現をフローサイトメトリーによって評価する。
機能アッセイは、MART-1(悪性黒色腫の特異的抗原)に特異的なF4 TCRを発現する初代ヒトリンパ球を使用して行う。Morgan et al, Science, 2006に記載されているように、TCRはHLA-A2+/MART1+悪性黒色腫細胞を認識する。OKT3で刺激した初代ヒトリンパ球(地域の血液銀行から入手)に、F4-TCRをコードするレトロウイルスベクターを形質導入する。次いで、この初代ヒトリンパ球をOKT3(抗CD3)で刺激し、リンパ球培地(IL-2を含む)中で培養する。前刺激したこのリンパ球を、完全長LSRを過剰発現する悪性黒色腫細胞株とともにインキュベートする。3つの異なる時間点においてサイトカイン分泌、活性化マーカー、細胞傷害性などを測定する。
a)ヒト腫瘍生検から単離した腫瘍細胞および免疫細胞におけるLSRタンパク質の発現
(i)腫瘍から得た別々の細胞集団におけるLSRタンパク質の発現は、LSRタンパク質に対する特異的抗体を使用して確認する。Kryczek I. et al., J. Exp. Med.; 2006; Vol. 203; p.871-881およびCancer res. 2007; 67; 8900-8905の記載に準じて、様々な細胞集団(たとえば、腫瘍細胞、内皮、腫瘍関連マクロファージ(TAM)、ならびにDC、B細胞および様々なT細胞サブセット(CD4、CD8およびTreg))を腫瘍生検から新たに単離し、腫瘍細胞、腫瘍間質および浸潤免疫細胞におけるLSRの発現を評価する。
(ii)腫瘍から得た別々の細胞集団に対する結合アッセイは、ヒトLSR ECD-FCタンパク質を使用して行う。J. Exp. Med.; 2006; Vol. 203; p.871-881およびCancer res. 2007; 67; 8900-8905の記載に準じて、腫瘍生検によって腫瘍からの様々な細胞集団(たとえば、腫瘍細胞、内皮、腫瘍関連マクロファージ(TAM)、ならびにDC、B細胞、および様々なT細胞(CD4、CD8およびTreg))を新たに単離し、腫瘍細胞、腫瘍間質および免疫細胞における、LSRのカウンター受容体の発現を評価する。
(i)担癌C57マウスの上皮がん細胞および腫瘍の所属リンパ節から得た免疫細胞におけるLSRタンパク質の発現は、M Rocha et al., Clinical Cancer Research 1996 Vol. 2, 811-820の記載に準じて、LSRタンパク質に対する特異的抗体を使用し脾臓と比較することによって確認する。B16(悪性黒色腫)、ID8(卵巣がん)およびMC38(結腸がん)の3つの異なるタイプのがんを試験に使用して、腫瘍細胞上および腫瘍の所属リンパ節から得た免疫細胞上におけるLSRの発現を評価する。
(ii)上述のように、担癌C57マウスの上皮がんから単離した細胞および腫瘍の所属リンパ節から得た免疫細胞に対する結合アッセイをマウスLSR ECD-FCタンパク質を使用して実施し、これらの細胞における発現を脾臓と比較することによって、腫瘍細胞上および腫瘍の所属リンパ節から得た免疫細胞上における、LSRのカウンター受容体の発現を評価する。
(i)M2型マクロファージにおけるLSRの発現の評価は、Biswas SK, Nat. Immunol. 2010; Vol. 11; p. 889-896の記載に準じて、末梢血から単離した初代単球をマクロファージへと分化させ、「M2誘導刺激」(たとえば、IL-4、IL-10、グルココルチコイド、TGF-β)に暴露することによってマクロファージをM2型に分化させ、このM2型マクロファージにおけるLSRタンパク質の発現をLSRタンパク質に対する特異的抗体を使用して確認することによって行う。
(ii)上述のように、末梢血から初代単球を単離し、マクロファージへと分化させ、「M2誘導刺激」(たとえば、IL-4、IL-10、グルココルチコイド、TGF-β)に暴露することによってマクロファージをM2型に分化させ、このM2型マクロファージに対してヒトLSR ECD-FCタンパク質を使用した結合アッセイを実施することによって、M2型マクロファージにおける、LSRのカウンター受容体の発現を評価する。
(i)担癌マウスから単離した初代MDSCにおけるLSRタンパク質の発現は、Int Immunopharmacol. 2009 Jul;9(7-8):937-48. Epub 2009 Apr 9の記載に準じ、LSRタンパク質に対する特異的抗体を使用して確認する。
(ii)担癌マウスから単離した初代MDSCに対する結合アッセイは、本願と同じ出願人が所有するPCT/IB2012/051868に記載のヒトLSR ECD-Fcタンパク質を使用して行う。
免疫細胞上の抑制性受容体は、がんの免疫回避における中心的な調節因子である。このような抑制性受容体として、CTLA4、PD-1、LAG-3などの免疫チェックポイントが知られている。単一の免疫チェックポイントを阻害することによって、しばしば腫瘍へのエフェクターT細胞の浸潤が増強されるが、阻害されていない他の負の受容体においてもエフェクターT細胞がアップレギュレートされるという代償性反応も起こりうる。しかしながら、2つ以上の抑制性経路を阻害すると、T細胞がより効果的な腫瘍応答を発揮し、制御性T細胞(Treg)に対するエフェクターT細胞(Teff)の比が増加する。具体的には、このような抑制性受容体の二重阻害は動物腫瘍モデルにおいて相乗的な治療効果を発揮することが示されている(Curran et al 2010 PNAS 107:4275-4280; Woo et al 2011 Cancer Res. 72:917-927)。これらの知見を元に、抗CTLA-4阻害抗体と抗PD-1阻害抗体との併用が、転移性悪性黒色腫患者において臨床試験中である。
シクロホスファミドは、直接的な細胞傷害作用と活発に細胞分裂している細胞に対する抑制活性とを有することから、特定の充実性腫瘍およびリンパ腫に対する標準的なアルキル化化学療法薬として使用されている。高用量のシクロホスファミドによって免疫細胞が除去されうるのに対し、低用量のシクロホスファミドは、主として免疫抑制性Treg細胞の数およびその機能を低下させることによって、免疫応答を増強し、かつ抗腫瘍免疫媒介性作用を誘導することが報告されている(Brode and Cooke 2008 Crit. Rev. Immunol. 28:109-126)。シクロホスファミド以外の古典的化学療法薬を使用した定期的な治療法も免疫刺激作用を有することが示されており、このような古典的化学療法薬として、ゲムシタビン;オキサリプラチン、シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金系化合物;ドキソルビシンなどのアントラサイクリン類;パクリタキセルおよびドセタキセルなどのタキサン類;ビンクリスチンなどの微小管阻害薬などが挙げられる。
がん治療ワクチンは、抗腫瘍応答を増強する薬物として機能することによって、T細胞のプライミングの増強および抗原提示の増強を行うことができる。がん治療ワクチンとしては、抗原の供給源または抗原を送達するプラットフォームとして細胞全体または細胞溶解物を使用した腫瘍細胞ワクチンが挙げられる。樹状細胞(DC)ベースのワクチンは、エクスビボにおいてDCに抗原を送達することに焦点を当てている。他のがん治療ワクチンは、免疫刺激性サイトカインまたは増殖因子(たとえば、GM-CSF(顆粒球マクロファージコロニー刺激因子)またはFlt3リガンドなど)を分泌するように遺伝子修飾された腫瘍細胞からなり、免疫刺激性のインビボ環境において内因性DCに腫瘍抗原を送達することを目的としている。
放射線療法は、強力な抗増殖作用および細胞死誘導作用を有することから抗がん療法として長年使用されてきた。しかしながら、最近の前臨床データおよび臨床データから、immunogenic cell deathは電離放射線の照射によって引き起こされる重要な効果のひとつでもある可能性、ならびに局所放射線療法によって抗腫瘍免疫応答の惹起および/または調節が引き起こされている可能性が示唆されている(Reits et al 2006 J. Exp. Med. 203:1259-1271)。前臨床試験では、抗4-1BB抗体の活性化などのさらなる免疫療法の非併用下または併用下における、免疫療法(CTLA4およびPD-1などの免疫チェックポイントに対する阻害抗体の使用など)と放射線療法との併用療法により治療効果が増強されることが示されている(Demaria et al 2005 Clin. Can. Res. 11:728-734; Verbruge et al 2012 Can. Res. 72:3163-3174)。
Tregは、腫瘍免疫の回避に寄与する免疫抑制ネットワークにおいて極めて重要な役割を果たしている。Tregへの分化に対する抗LSR抗体の阻害能を評価するために、LSR融合タンパク質とナイーブT細胞との相互作用がナイーブT細胞からiTregへの分化に影響を及ぼすかどうかを試験した。この目的のために、mLSR ECD-マウスIgG2a融合タンパク質(配列番号221)およびhLSR ECD-ヒトIgG1融合タンパク質(配列番号222;236)を使用し、制御性T細胞への分化に対するこれらの融合タンパク質の効果を評価する。具体的には、iTreg誘導条件下でインキュベートしたときの、精製したCD4+CD25+T細胞における制御性T細胞マーカーFoxP3の発現を試験することによって評価する。
特異的なTh誘導条件下において活性化させたマウスおよびヒトのCD4+T細胞を使用して、Thへの分化に対してLSR-Ig融合タンパク質が及ぼす影響を試験する。マウスT細胞の活性化は抗原特異的またはポリクローナルである。単一の仮説に拘束されることを望むものではないが、マウス細胞またはヒト細胞を使用したこれらの実験系による結果では、T細胞に対するLSRの免疫調節作用が示され、この免疫調節作用によって、抗炎症性サイトカイン(Th2由来サイトカインおよびIL-10)の分泌が促進される一方、Th1およびTh17誘導性応答(Th1およびTh17誘導条件下の炎症性サイトカインの分泌および細胞増殖)が抑制される。
LSR抗原に対するヒトモノクローナル抗体の作製
マウスIgG2 Fcポリペプチドに連結されたLSR細胞外ドメインからなる融合タンパク質を標準的な組換え方法によって作製し、免疫化のための抗原として使用する。
ヒト抗体遺伝子を発現するトランスジェニックHuMabマウスのHCo7株マウスを使用して、LSRに対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製する。このマウス株は、Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820に記載された方法によって内因性マウスκ軽鎖遺伝子がホモ欠損しており、PCT公開WO 01/09187の実施例1に記載された方法によって内因性マウス重鎖遺伝子がホモ欠損している。さらに、このマウス株は、Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851に記載された方法によってヒトκ軽鎖遺伝子(KCo5)が導入されており、米国特許第5,545,806号;第5,625,825号;および第5,545,807号に記載された方法によってヒト重鎖遺伝子(HCo7)が導入されている。
LSRに対する完全ヒトモノクローナル抗体を作製する目的で、組換えLSR融合タンパク質をコードする遺伝子を含む発現ベクターをトランスフェクトした哺乳動物細胞から得られた精製組換えLSR融合タンパク質を用いて、HCo7 HuMabマウス株のマウスを免疫することができる。HuMabマウスの一般的な免疫化スキームは、Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851およびPCT公開WO 98/24884に記載されている。6〜16週齢のマウスに最初の抗原の点滴を行う。組換えLSR抗原の精製調製物(5〜50μg;LSR融合タンパク質を発現するトランスフェクトされた哺乳動物細胞から精製したもの)を使用して、HuMabマウスを腹腔内投与により免疫する。
免疫したマウスからLSR血清に結合する抗体を産生するHuMabマウスを選択するために、Fishwild, D.ら(1996)によって報告されたELISA変法を用いて、免疫したマウスを試験する。簡単に述べると、PBS中1〜2μg/mLの精製した組換えLSR融合タンパク質を1ウェルあたり50μL加えて4℃で一晩インキュベートすることによりマイクロタイタープレートをコーティングし、次いで、PBS中5%BSAを1ウェルあたり200μL加えてブロッキングする。LSRで免疫したマウスから得た血漿を希釈したものを各ウェルに加え、環境温度で1〜2時間インキュベートする。プレートをPBS/Tweenで洗浄し、アルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトκ軽鎖ポリクローナル抗体とともに室温で1時間インキュベートする。洗浄後、プレートをpNPP基質で発色させ、OD415〜650において分光光度計で分析する。最も高い抗LSR抗体力価を示したマウスを融合に使用する。下記のように融合を行い、ハイブリドーマ上清の抗LSR活性をELISAによって試験する。
標準的なプロトコルに準じ、HuMabマウスから単離したマウス脾細胞を、PEGを使用してマウスミエローマ細胞株に融合させる。次いで、生じたハイブリドーマの抗原特異的抗体産生能をスクリーニングする。すなわち、免疫したマウスから得た脾リンパ球の単一細胞懸濁液を、50%PEG(Sigma)を使用して、4分の1の細胞数のP3X63 Ag8.6.53(ATCC CRL 1580)非分泌性マウスミエローマ細胞と融合させる。細胞を平底マイクロタイタープレートに約1×105個/ウェルで播種し、RPMI中origen(IGEN)、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、HEPES、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、1×HATおよびβ-メルカプトエタノールを添加した10%ウシ胎仔血清含有選択培地中で約2週間インキュベートする。1〜2週間後、HATをHTで置き換えた培地中で細胞を培養する。次いで、各ウェルのヒト抗LSRモノクローナルIgG抗体の産生を(上述の)ELISAによってスクリーニングする。ハイブリドーマが広範に増殖してから、通常10〜14日後に培地をチェックする。抗体を分泌するハイブリドーマを再び播種して、再度スクリーニングを行い、ヒトIgGがなお陽性であれば、抗LSRモノクローナル抗体を限界希釈法により少なくとも2回サブクローニングする。次いで、安定なサブクローンを組織培養培地においてインビトロで培養し、少量の抗体を産生させ、特性評価を行う。
得られた抗LSRモノクローナル抗体の重鎖可変領域をコードするcDNA配列および軽鎖可変領域をコードするcDNA配列は、上記で得られたハイブリドーマから標準的なPCR技術を使用して得られ、標準的なDNAシークエンシング技術を使用して配列が決定される。
抗LSR抗体の結合親和性、結合動態、結合特異性および交差競合性をBiacore分析によって試験する。さらに、結合特異性をフローサイトメトリーによって試験する。
本発明に従って作製された抗LSR抗体の親和性および結合動態を、Biacore分析(Biacore AB、スウェーデン国ウプサラ)によって評価する。標準的なアミンカップリング化学およびBiacore社の提供のキットを使用して、精製された組換えヒトLSR融合タンパク質を第一級アミンを介してCM5チップ(カルボキシメチルデキストランでコーティングされたチップ)に共有結合させる。結合は、267nMの濃度の上記抗体を(BIAcore AB提供の)HBS EPバッファー中に50μL/分の流速で流すことによって測定する。抗原結合抗体の結合動態は3分間追跡し、解離動態は7分間追跡する。結合曲線および解離曲線は、BlAevaluationソフトウェア(Biacore AB)を使用して1:1ラングミュア結合モデルに適合させる。結合定数の推定に及ぼされるアビディティの影響を最小限にするため、結合相および解離相に相当する最初のセグメントのデータのみを適合に使用する。
Biacoreを使用して、得られた種々の抗LSRヒトモノクローナル抗体(HuMAb)のエピトープ分類を決定する。得られた抗LSR抗体を使用して、これらの抗体が認識するLSR抗原上エピトープのマッピングを行う。得られた種々の抗LSR抗体をそれぞれ、同じチップ上の3つの異なる表面に8000RUまでコーティングする。各モノクローナル抗体の希釈系列を10μg/mLから作製し、Fc融合LSR(50nM)とともに1時間インキュベートする。インキュベートした複合体を、流速20μL/分で1.5分間にわたり3つの表面すべて(およびブランク面)に対して同時にインジェクトする。1.5分間の終了時に各表面からシグナルを得て、そこから適切なブランクを差し引き、複合体中のモノクローナル抗体の濃度に対してシグナルをプロットする。データの分析後、エピトープマッピングの結果に基づいて、様々な抗LSR抗体を種々のエピトープ群に分類する。該抗体の機能特性も比較する。
抗体または抗体フラグメント(たとえば抗原結合部位)をコードするDNAを、ファージディスプレイライブラリーなどの抗体ライブラリーから得てもよいことも、当業者によって容易に理解されるであろう。具体的には、そのようなファージは、レパートリーライブラリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー(たとえばヒトまたはマウス)から発現される抗原結合ドメインを提示するために利用することができる。目的の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、たとえば、標識抗原や、固体表面またはビーズに結合または捕捉させた抗原などの抗原を使用して選択または同定することができる。これらの方法において使用されるファージは、通常、線維状ファージあり、線維状ファージは、組換え技術によってファージgeneIIIタンパク質またはファージgeneVIIIタンパク質に融合されたFab、Fv OE DAB(軽鎖または重鎖由来の個々のFv領域)またはジスルフィド安定化Fv抗体ドメインとともにファージから発現されるfd結合ドメインおよびM13結合ドメインを含む。典型的な方法は、たとえば、欧州特許第368 684 B1号;米国特許第5,969,108号;Hoogenboom, H.R. and Chames, Immunol. Today 27:371 (2000);Nagy et al Nat. Med. 5:801 (2002);Huie et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA 95:2682 (2001);Lui et al, J. MoI. Biol. 5/5:1063 (2002)に記載されており、これらの文献は本明細書の一部を構成するものとして援用される。いくつかの文献(たとえばMarks et al, Bio/Technology 70:779-783 (1992))には、大きなファージライブラリーを構築するための戦略として、chain shuffling、コンビナトリアル感染およびインビボ組換えによる高親和性ヒト抗体の作製が記載されている。別の実施形態では、ディスプレイプラットフォームとしてバクテリオファージの代わりにリボソームディスプレイを使用することができる(たとえば、Hanes et al, Nat. Biotechnol. 75:1287 (2000); Wilson et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA 98:3750 (2001);またはIrving et al, J. Immunol. Methods 248:31(2001)を参照されたい)。さらに別の実施形態では、細胞表面ライブラリーをスクリーニングすることによって抗体を得ることができる(Boder et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA 97:10701 (2000); Daugherty et al, J. Immunol. Methods 243:21 1 (2000))。このような手法は、モノクローナル抗体を単離し次いでクローニングするための従来のハイブリドーマ技術に代わるものである。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインをコードするポリヌクレオチド配列を有するファージ粒子の表面に該機能的抗体ドメインが提示される。たとえば、VH領域をコードするDNA配列およびVL領域をコードするDNA配列は、動物のcDNAライブラリー(たとえばヒトまたはマウスのリンパ系組織のcDNAライブラリー)または合成cDNAライブラリーから増幅されるか、あるいは単離される。特定の実施形態では、VH領域をコードするDNAおよびVL領域をコードするDNAをPCRによりscFvリンカーで連結し、ファージミドベクター(たとえばp CANTAB 6またはpComb 3 HSS)にクローニングする。このベクターを大腸菌にエレクトロポレートし、この大腸菌にヘルパーファージを感染させる。これらの方法で使用されるファージは、通常、fdおよびM13などの線維状ファージであり、通常、組換え技術によってファージgeneIIIまたはgeneVIIIにVH領域またはVL領域が融合されている。目的の抗原(すなわちLSRポリペプチドまたはそのフラグメント)に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、たとえば、標識抗原や、固体表面またはビーズに結合または捕捉させた抗原などの抗原を使用して選択または同定することができる。抗体作製に使用することができるファージディスプレイ法のさらなる例としては、Brinkman et al, J. Immunol. Methods 752:41-50 (1995);Ames et al, J. Immunol. Methods /£4:177-186 (1995);Kettleborough et al, Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994);Persic et al, Gene 757:9-18 (1997);Burton et al, Advances in Immunology 57:191-280 (1994);PCT出願PCT/GB91/01 134;PCT公開WO 90/02809;WO 91/10737;WO 92/01047;WO 92/18619;WO 93/11236;WO 95/15982;WO 95/20401;ならびに米国特許第5,698,426号;第5,223,409号;第5,403,484号;第5,580,717号;第5,427,908号;第5,750,753号;第5,821,047号;第5,571,698号;第5,427,908号;第5,516,637号;第5,780,225号;第5,658,727号;第5,733,743号および第5,969,108号に開示されたものが挙げられ、これらの文献は本明細書の一部を構成するものとしてその全体が援用される。上記の文献に記載されているように、ファージを選択した後、抗体をコードする領域をファージから単離し、この領域を使用して抗体全体(ヒト抗体)や他の所望の抗原結合フラグメントを作製し、所望の宿主(哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、細菌など)において発現させることができる。
XOMA 031ヒトFabライブラリーからのファージディスプレイスクリーニングにより、LSRに対するヒトIgG1抗体、すなわち、S11-01.E02、S11-01.F08、S11-04.C11、S11-04.D11、S11-04.H07、S11-04.H09、およびS32-03.G11を作製した。
ビオチン化LSRの調製:
溶液ベースのファージパニングの実施を容易にするため、ヒトLSR抗原(マウスIgG2a Fc領域に融合させたLSR細胞外ドメイン)およびネガティブコントロールタンパク質(「コントロール抗原」、mIgG2a Fc融合タンパク質より構成される)をビオチン化した。タンパク質はいずれもPBS500μLで1mg/mLに希釈した後、メーカーの説明書(ピアス、イリノイ州ロックフォード)に準じてSulfo-NHS-LC-Biotin kitを使用して、ビオチン:タンパク質=3:1の比率で標識した。0.5 mL 3500 MWCO Slide-A-Lyzer cassettes(ピアス)を使用して、PBS pH 7.4に対して試料を一晩透析することにより遊離ビオチンを除去した。透析したタンパク質を-80℃で保存した。
ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズを使用して溶液中でパニング反応を行い、ビオチン化抗原を捕捉した。洗浄工程および溶出工程はすべて、磁気ビーズ(プロメガ、ウイスコンシン州マディソン)を捕捉するために磁気ラックを使用して行った。インキュベーション工程はすべて、室温においてチューブローテーター(BioExpress、ユタ州ケイズビル)上でゆるやかに混和することによって行った。表1に概要を示すようにパニング実験を行った。
ファージパニング実験はいずれもXOMA031ヒトfab抗体ファージディスプレイライブラリー(XOMA Corporation、カリフォルニア州バークレー)を使用して行った。ライブラリーを50倍過剰発現する十分量のファージを、PBS中10%スキムミルク粉末(スキムミルクの最終濃度:5%)と1:1で混合し、これを1時間インキュベートすることによってブロッキングした。
各ラウンドのパニング反応を実施するため、Dynalストレプトアビジンコーティング磁気ビーズ(ライフテクノロジーズ)を100μLずつ分けて3つのアリコートとし、アリコートそれぞれをブロッキングバッファー(PBS中5%スキムミルク粉末)1mL中に懸濁し、ファージライブラリーのブロッキングと平行してインキュベートすることによってブロッキングした。上記のパニングラウンドおよび反応条件(表1)に従い、ブロッキングしたビーズのアリコート1つを一定量のビオチン化LSRと混合した。他の2つのアリコートは「除去」コントロール抗原100pmolと混合した。ビオチン標識抗原を室温で1時間かけてビーズと結合させた。ビーズをPBSで2回洗浄して遊離抗原を除去し、ブロッキングバッファー100μL中に再懸濁した。
ファージパニングを開始する前に、LSRのFc領域に結合する不要な物質の除去が必要であった。この目的のため、ブロッキングしたファージを、コントロール抗原を結合させたビーズと混合し、1時間インキュベートした。次いで、ビーズ(およびmIgG2a Fcに結合する不要な物質と推定されるもの)を廃棄した。「除去を行った」ファージライブラリーの上清を使用して、LSR抗原に対するパニングを3ラウンド行った。
3ラウンド目のパニングから溶出されたファージプールを希釈し、TG1大腸菌細胞(Lucigen、ウイスコンシン州ミドルトン)に感染させて、2YTCG寒天平板に播種することにより単一コロニーを得た。
LSRを発現する細胞株:
カニクイザルLSR、GFP発現ベクターまたは空ベクターをそれぞれ単独で発現するHEK293T細胞を上記と同様にして作製した。トランスフェクトしたHEK293T細胞を完全培地(CM)(10%FBSおよびグルタミン−Penstrepを添加したDMEM中5μg/mLピューロマイシン)で培養した。
抗体:
本明細書の記載に従い、LSRに対するヒトIgG1抗体、すなわち、S11-01.E02(VL:配列番号244およびVH:配列番号238)、S11-01.F08(VL:配列番号260およびVH:配列番号250)、S11-04.C11(VL:配列番号273およびVH:配列番号263)、S11-04.D11(VL:配列番号281およびVH:配列番号279)、S11-04.H07(VL:配列番号308およびVH:配列番号283)、S11-04.H09(VL:配列番号289およびVH:配列番号286)ならびにS32-03.G11(VL:配列番号308およびVH:配列番号293)を作製した。ヒトIgG1アイソタイプコントロール(カタログNo.ET-901)はEureka Therapeutics社(米国)から購入した。ヒトLSRに対するマウスIgG2aモノクローナル抗体(8C8)はBiotem社(フランス)において作製した。マウスIgG2aアイソタイプコントロール(クローンMOPC-173(カタログNo.400224))はBiolegend社(米国)から購入した。
(1)Kabatの定義(配列の可変性に基づいており、最も一般的に使用されている);
(2)Chothiaの定義(構造のループ領域の位置に基づく);
(3)AbMの定義(上記2つの方法の折衷法であり、Oxford Molecular's AbM antibody modelling softwareによって使用されている)
これら3つの方法の詳細はhttp://www.bioinf.org.uk/abs/に記載されている。他にも、CDRを定義するための商標登録された方法がいくつか存在する(たとえば(4)SeqAgent(登録商標)ソフトウェアプログラム(XOMA(米国)LLC(カリフォルニア州バークレー)によって開発された。その原理はhttp://www.imgt.org/IMGTScientificChart/Nomenclature/IMGT-FRCDRdefinition.htmlに記載されている。))。最も一般的に使用される上記の3つ方法を以下の表に要約する。
S11-01.E02、配列番号245 (1〜3)、246 (4)に示す軽鎖CDR1、配列番号247 (1〜3)、248 (4)、に示す軽鎖CDR2、配列番号249 (1〜4)に示す軽鎖CDR3、配列番号239 (3)、240 (4)、241 (1)、252 (2)に示す重鎖CDR1、配列番号256 (4)、287 (2〜3)、288 (1)に示す重鎖CDR2、配列番号242 (1〜3)、243 (4)に示す重鎖CDR3
S11-01.F08、配列番号303 (1〜3)、304 (4)に示す軽鎖CDR1、配列番号261 (1〜3)、306 (4)に示す軽鎖CDR2、配列番号262 (1〜4)に示す軽鎖CDR3、配列番号251 (3)、252 (2)、253 (4)、254 (1)に示す重鎖CDR1、配列番号255 (2〜3)、256 (4)、257 (1)に示す重鎖CDR2、配列番号258 (1〜3)、259 (4)に示す重鎖CDR3
S11-04.C11、配列番号274 (1〜3)、275 (4)に示す軽鎖CDR1、配列番号276 (1〜3)、277 (4)に示す軽鎖CDR2、配列番号278 (1〜4)に示す軽鎖CDR3、配列番号264 (3)、265 (2)、266 (4)、267 (1)に示す重鎖CDR1、配列番号268 (2〜3)、269 (4)、270 (1)に示す重鎖CDR2、配列番号271 (1〜3)、272 (4)に示す重鎖CDR3
S11-04.D11、配列番号274 (1〜3)、275 (4)に示す軽鎖CDR1、配列番号276 (1〜3)、277 (4) に示す軽鎖CDR2、配列番号282 (1〜4)に示す軽鎖CDR3、配列番号264 (3)、265 (2)、266 (4)、267 (1)に示す重鎖CDR1、配列番号268 (2〜3)、269 (4)、280 (1)に示す重鎖CDR2、配列番号271 (1〜3)、272 (4)に示す重鎖CDR3
S11-04.H07、配列番号303 (1〜3)、304 (4)に示す軽鎖CDR1、配列番号305 (1〜3)、306 (4)に示す軽鎖CDR2、配列番号307 (1〜4)に示す軽鎖CDR3、配列番号239 (3)、240 (4)、241 (1)、252 (2)に示す重鎖CDR1、配列番号256 (4)、 287 (2〜3)、 288 (1)に示す重鎖CDR2、配列番号284 (1〜3)、285 (4) に示す重鎖CDR3
S11-04.H09、配列番号290 (1〜3)、291 (4)に示す軽鎖CDR1、配列番号305 (1〜3)、306 (4) に示す軽鎖CDR2、配列番号292 (1〜4)に示す軽鎖CDR3、配列番号251 (3)、252 (2)、253 (4)、254 (1)に示す重鎖CDR1、配列番号256 (4)、287 (2〜3)、288 (1)に示す重鎖CDR2、配列番号258 (1〜3)、259 (4)に示す重鎖CDR3
S32-03.G11、配列番号303 (1〜3)、304 (4)に示す軽鎖CDR1、配列番号305 (1〜3)、306 (4)に示す軽鎖CDR2、配列番号307 (1〜4)に示す軽鎖CDR3、配列番号294 (3)、295 (2)、296 (4)、297 (1)に示す重鎖CDR1、配列番号298 (2〜3)、299 (4)、300 (1)に示す重鎖CDR2、配列番号301 (1〜3)、302 (4)に示す重鎖CDR3
精製ウサギ補体(カタログNo.CL-3441)はCedarlane laboratories社(カナダ)から購入した。CellTiter-Glo試薬はプロメガ社(米国)から購入した。
サルLSRまたはコントロールGFPを異所性に発現するHEK293に対するLSR抗体のCDC活性は、CellTiter-Glo試薬を使用して評価した。1ウェルあたり50μLの完全培地(CM)を含む96ウェル白色組織培養プレートに細胞を2.5×104個/ウェルの密度で播種した。細胞を2時間静置した後、抗体の2倍段階希釈系列、アイソタイプまたは培地単独をそれぞれのウェルに等容量で加えた。室温で10分間静置後、新たに再構成した補体4μLをコントロールウェル以外の各試験ウェルに加え、プレートを37℃で1時間インキュベートした。10分間かけてプレートを室温に戻し、CellTiter-Glo試薬を1ウェルあたり100μL加え、室温で10分間インキュベートした。Victor2プレートリーダー(パーキンエルマー)でルミネセンスをRLU(相対的ルミネセンス単位)として測定した。データをExcelで分析し、GraphPad Prismでプロットした。CDC(%)は以下の式により算出した。
100 −[(実験ウェルのRLU/コントロールウェルのRLU)×100]
実験は各条件につき3連で行った。示したデータは1つの実験の代表的な値である。
空ベクターをトランスフェクトしたHEK293またはサルLSRを発現するHEK293細胞を洗浄し、FACSバッファー(PBS(ライフテクノロジーズ)、0.5%BSA(Sigma Aldrich))中の様々な濃度のLSR抗体またはアイソタイプコントロール50μL中で細胞を4℃で60分間染色した。細胞をFACSバッファーで1回洗浄し、10μg/mLのビオチン化抗マウスIgG(GE、カタログNo.RPN1001V)またはビオチン化抗ヒトFc(Jackson、カタログNo.109-065-097)50μL中に細胞を再懸濁し、4℃で30分間静置した。細胞をFACSバッファーで洗浄し、SA-PE(Jackson、カタログNo.016-110-084)をFACSバッファーで1:100に希釈したもの50μL中に細胞を再懸濁し、30分間静置した。細胞を2回洗浄し、最終容量が100μLとなるようにFACSバッファー中に再懸濁した。試料をIntellicyt HTFCで測定した。データはFCS Express(DeNovo)で分析し、Excelにエクスポートし、GraphPad Prismでプロットした。
図25に示すように、LSRヒトIgG1抗体は、LSRを異所性に発現するHEK293に対してCDC活性を示すことが示された。
天然細胞の表面に発現されたLSRタンパク質がT細胞の活性化に及ぼす影響を評価するために、LSRを過剰発現するHEK293T細胞と、プレート結合抗CD3抗体で活性化したJurkat細胞(ヒトT細胞白血病に由来)との共培養アッセイを行った。
CD69の発現により測定した抗CD3媒介性Jurkat T細胞の活性化
1日目:
1.1×PBSで希釈した抗CD3(クローンOKT3、eBioscience、カタログNo.:16-0037-85;またはクローンUCHT1、BDバイオサイエンス、カタログNo.555329)を、指定の濃度で1ウェルあたり75μL使用して96ウェル平底プレート上に固相化した。
2.プレートをパラフィルムで覆い、4℃で一晩インキュベートした。
3.LSRもしくは(ネガティブコントロールとしての)CD20をコードするpRp3プラスミド発現コンストラクトまたは空ベクターpRp3を安定にトランスフェクトしたHEK293T細胞プールをそれぞれT75プレートに12×106個/ウェルの濃度で播種し、10%FBS、L-グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したDMEM培地中で湿潤インキュベーターにおいて一晩培養した。
2日目:
1.抗CD3でコーティングしたウェルを×1 PBS200μLで3回洗浄した。洗浄液は無菌環境でデカントした。最後の洗浄後、プレートに残った洗浄液を滅菌吸収紙に吸収させて除去した。
2.前日に播種したHEK293T細胞をマイトマイシンC(Sigma、M4287)で処理した。すなわち、H2O中で新たに調製した0.5mg/mLのマイトマイシンC溶液900μLを8.1mLの増殖培地に直接加えてその最終濃度を50μg/mLとした。細胞をマイトマイシンCとともに37℃で1時間インキュベートした。
3.マイトマイシンCで処理したHEK293T細胞を1×PBS10mLで3回洗浄し、cell dissociation buffer(Gibco;カタログNo.:13151-014)2mLを加えて細胞を回収した。
4.剥離したHEK293T細胞を、10%FBS、L-グルタミン、ペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したRPMI(Jurkat細胞用増殖培地)8mL中に再懸濁した。
5.ベックマン・コールター社のカウンターを使用して細胞を計数した後、細胞を希釈して0.5×106個/mLの濃度とした。
6.細胞を段階希釈し、100μL/ウェルの(上述の)Jurkat細胞用増殖培地中に指定の濃度で播種した。
7.2時間インキュベートしてHEK293T細胞を結合させた。
8.(上述の)Jurkat細胞用増殖培地中50,000個のJurkat細胞(ATCC、クローンE6-1、TIB-152)を100μL/ウェルで各ウェルに加えた。
9.細胞を湿潤インキュベーターにおいて37℃で一晩共培養した。
3日目:
1.細胞をU字底型プレートに移し、4℃、1500rpmで5分間遠心分離し、上清をデカントした。
2.抗CD69抗体(Biolegend、PE-anti human CD69、クローンFN50、カタログNo.:310906、10μg/mL、2μL/ウェル)およびFc-blocker(Miltenyi Biotec、ヒトFcRブロッキング試薬、カタログNo.:120000-442、1μL/ウェル)を、氷冷FACSバッファー(1×PBS+0.5%BSA+2mM EDTA+0.05%アジ化物)で希釈して各ウェルに加え、各ウェルの最終容量を50μLとした。
3.(気泡が入らないように)ピペッティングして各ウェルの内容物を優しく混合した。
4.プレートを氷上で30分間インキュベートした。
5.細胞をFACSバッファー200μLで1回洗浄後、プレートを4℃、1500rpmで5分遠心分離した。上清をデカントで捨てた。
6.細胞をFACSバッファー200μLに再懸濁し、FACSバッファー100μLで満たしたFACSチューブに移した。
7.Jurkat細胞におけるCD69の細胞表面発現(平均蛍光強度(MFI)または全T細胞のうちCD69を発現する細胞のパーセンテージ)をフローサイトメトリーで分析した。Jurkat細胞は前方散乱(FSC)vs側方散乱(SSC)プロット上でゲーティングした。ゲーティング操作のバリデーションは、抗CD2抗体(Biolegend、クローンRPA-2.10、カタログNo.:300206)で細胞を染色し、Jurkat T細胞を同定することにより行った。
CD69の発現により測定した抗CD3媒介性Jurkat T細胞活性化に対する抑制
MatおよびMethによる報告に準じて、完全長LSRタンパク質を発現するHEK293Tトランスフェクタントを、プレート結合抗CD3抗体によって活性化したJurkat T細胞と共培養した。ネガティブコントロールとして、ベクター(pRp3)のみをトランスフェクトしたHEK293T細胞を使用した。図27に示す代表的な結果では、CD69(T細胞の活性化の初期マーカー)のアップレギュレーションの低下によって示されているように、LSR発現HEK293T細胞の存在下において抗ヒトCD3抗体の2種のクローン(OKT3またはUCHT1)でJurkat T細胞を刺激すると、ベクターのみ(pRp3)をトランスフェクトしたHEK293T細胞による影響と比較してJurkat T細胞の活性化が低下したことが示されている。このLSRの抑制効果は、1ウェルあたり50,000個のHEK293Tトランスフェクト細胞を使用した場合に最もよく検出される。図28に類似した実験の結果を示す。この実験では、抗CD3抗体クローンUCHT1を使用し、結果はCD69を発現するJurkat細胞のパーセンテージで示した。結果は、何ら影響が認められなかったCD20タンパク質発現HEK293T細胞で得られた結果と比較した。
HEK293T細胞上に発現されたLSRはJurkat細胞の活性化を抑制する。0.25μg/mL抗CD3(OKT3クローン)(AおよびB)または2μg/mL抗CD3(UCHT1クローン)(CおよびD)であらかじめコーティングしたウェルに、LSRまたはpRp3空ベクターを発現するHEK293T細胞を1ウェルあたり25,000個(AおよびC)または50,000個(BおよびD)播種した。2時間後に1ウェルあたり50,000個のJurkat細胞を加え、一晩インキュベートすることにより共培養した。細胞のCD69の発現をフローサイトメトリーによって分析した。対照として、処理していない(すなわち抗CD3で処理していない)Jurkat細胞(UT)のCD69値を示す。50,000個のHEK293トランスフェクト細胞の存在下における、処理していないJurkat細胞と抗CD3で処理したJurkat細胞との間のCD69のΔMFI値を(E)に示す。*(アスタリスク)は、空ベクターとの有意差を表す(p<0.05、Studentのt検定)。
CD20を発現するHEK293T細胞とは異なり、LSRを発現するHEK293T細胞は抗CD3で活性化されたJurkat細胞を抑制する。2μg/mL抗CD3(UCHT1クローン)であらかじめコーティングしたウェルに、LSR、CD20またはpRp3空ベクターを発現するHEK293T細胞を1ウェルあたり25,000個(A)または50,000個(B)播種した。2時間後に1ウェルあたり50,000個のJurkat細胞を加え、一晩インキュベートすることにより共培養した。細胞のCD69の発現をフローサイトメトリーによって分析した。CD69を発現するJurkat細胞のパーセンテージを(A)および(B)に示す。活性化細胞と活性化していない細胞との間の%CD69の差(ΔCD69%)を(C)に示す。CD69のアップレギュレーションの抑制のパーセンテージを(D)に示す。*(アスタリスク)は、空ベクターとの有意差を表す(p<0.05、Studentのt検定)。
T細胞の活性化に対するLSR特異的抗体の機能的効果を評価するために、本明細書に記載の様々なLSR hIgG1抗体の存在下において、上記と同様にして共培養アッセイを行った。
Claims (89)
- 免疫分子であって、
配列番号229、235、242〜243、245〜249、258、274〜278、264〜272、251〜256、280、287、284、285、290〜292、287、288、259、295、297〜302および306〜307からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する抗原結合領域を含み、
該抗原結合領域が、配列番号10のアミノ酸配列を有するタンパク質に特異的に結合するように改変されていることを特徴とする免疫分子。 - 配列番号227、228、229の少なくとも1つと、配列番号233、234、235の少なくとも1つとを含むこと;
配列番号245、246、247、248、249の少なくとも1つと、配列番号239、240、241、252、256、287、288、242、243の少なくとも1つとを含むこと;
配列番号303、304、261、306、262の少なくとも1つと、配列番号251、252、253、254、255、256、257、258、259の少なくとも1つとを含むこと;
配列番号274、275、276、277、278の少なくとも1つと、配列番号264、265、266、267、268、269、270、271、272の少なくとも1つとを含むこと;
配列番号274、275、276、277、282の少なくとも1つと、配列番号264、265、266、267、268、269、280、271、272の少なくとも1つとを含むこと;
配列番号303、304、305、306、307の少なくとも1つと、配列番号239、240、241、252、256、287、288、284、285の少なくとも1つとを含むこと;
配列番号290、291、305、306、292の少なくとも1つと、配列番号251、252、253、254、256、287、288、258、259の少なくとも1つとを含むこと;または
配列番号303、304、305、306、307の少なくとも1つと、配列番号294、295、296、297、298、299、300、301、302の少なくとも1つとを含むこと
を特徴とする請求項1に記載の免疫分子。 - 配列番号227〜229、239〜243、251〜299、264〜272、280、284〜285、287〜288、293〜301、302の少なくとも1つと、
配列番号233〜235、245〜249、261〜262、274〜278、282、290〜292、303〜306、307の少なくとも1つとを含むことを特徴とする請求項1に記載の免疫分子。 - 抗体フラグメントである請求項1〜3のいずれかに記載の免疫分子。
- 配列番号239〜243、245〜249、251〜259、261〜262、264〜272、274〜278、280〜281、282、284〜285、287〜288、290〜292および294〜307からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する抗原結合領域を少なくとも2つ含む、請求項1〜3のいずれかに記載の免疫分子。
- 配列番号227、228、229、245、246、247、248、249、261、262、274、275、276、277、278、282、303、304、305、306、307、290、291および292からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する抗原結合領域を少なくとも1つ含む、請求項5に記載の免疫分子。
- 配列番号233、234、235、239、240、241、287、288、242、243、251、252、253、254、255、256、257、258、259、264、265、266、267、268、269、270、271、272、280、294、295、296、297、298、299、300、301、302、284、285、287、288、258および259からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する抗原結合領域を少なくとも1つ含む、請求項5または6に記載の免疫分子。
- 配列番号220、244、260、273、281、289、308のいずれかに示すアミノ酸配列またはこれらと95%の相同性を有する配列を有するタンパク質を含む、前記請求項のいずれかに記載の免疫分子。
- 配列番号218、238、250、263、279、283、286、293のいずれかに示すアミノ酸配列またはこれらと95%の相同性を有する配列を有するタンパク質を含む、前記請求項のいずれかに記載の免疫分子。
- 配列番号220のアミノ酸配列および配列番号218のアミノ酸配列もしくはこれらと95%の相同性を有する配列を有するタンパク質を含むこと;
配列番号244のアミノ酸配列および配列番号238のアミノ酸配列もしくはこれらと95%の相同性を有する配列を有するタンパク質を含むこと;
配列番号260のアミノ酸配列および配列番号259のアミノ酸配列もしくはこれらと95%の相同性を有する配列を有するタンパク質を含むこと;
配列番号273のアミノ酸配列および配列番号263のアミノ酸配列もしくはこれらと95%の相同性を有する配列を有するタンパク質を含むこと;
配列番号281のアミノ酸配列および配列番号279のアミノ酸配列もしくはこれらと95%の相同性を有する配列を有するタンパク質を含むこと;
配列番号308のアミノ酸配列および配列番号283のアミノ酸配列もしくはこれらと95%の相同性を有する配列を有するタンパク質を含むこと;
配列番号289のアミノ酸配列および配列番号286のアミノ酸配列もしくはこれらと95%の相同性を有する配列を有するタンパク質を含むこと;
配列番号308のアミノ酸配列および配列番号293のアミノ酸配列もしくはこれらと95%の相同性を有する配列を有するタンパク質を含むこと;
配列番号245もしくは246のアミノ酸配列と、配列番号247もしくは248のアミノ酸配列と、配列番号249のアミノ酸配列と、配列番号239、240、241、252のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号256、287、288のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号242もしくは243のアミノ酸配列とを有するタンパク質を含むこと;
配列番号303もしくは304のアミノ酸配列と、配列番号261もしくは306のアミノ酸配列と、配列番号262のアミノ酸配列と、配列番号251、252、253、254のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号255、256、257のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号258もしくは259のアミノ酸配列とを有するタンパク質を含むこと;
配列番号274もしくは275のアミノ酸配列と、配列番号276もしくは277のアミノ酸配列と、配列番号278のアミノ酸配列と、配列番号264、265、266、267のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号268、269、270のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号271もしくは272のアミノ酸配列とを有するタンパク質を含むこと;
配列番号274もしくは275のアミノ酸配列と、配列番号276もしくは277のアミノ酸配列と、配列番号282のアミノ酸配列と、配列番号264、265、266、267のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号268、269、280のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号271もしくは272のアミノ酸配列とを有するタンパク質を含むこと;
配列番号303もしくは304のアミノ酸配列と、配列番号305もしくは306のアミノ酸配列と、配列番号307のアミノ酸配列と、配列番号239、240、241、252のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号256、287、288のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号284もしくは285のアミノ酸配列とを有するタンパク質を含むこと;
配列番号290もしくは291のアミノ酸配列と、配列番号305もしくは306のアミノ酸配列と、配列番号292のアミノ酸配列と、配列番号251、252、253、254のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号256、287、288のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号258もしくは259のアミノ酸配列とを有するタンパク質を含むこと;または
配列番号303もしくは304のアミノ酸配列と、配列番号305もしくは306のアミノ酸配列と、配列番号307のアミノ酸配列と、配列番号294、295、296、297のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号298、299、300のいずれかのアミノ酸配列と、配列番号301もしくは302のアミノ酸配列とを有するタンパク質を含むこと
を特徴とする前記請求項のいずれかに記載の免疫分子。 - 前記請求項のいずれかに記載の免疫分子をコードするポリヌクレオチド。
- 配列番号224、225、226、230、231、232、217、219、およびこれらの縮重バリアントからなる群から選択される核酸配列を含む、請求項11に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項11または12に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項13に記載のベクターを含み、前記請求項のいずれかに記載の免疫分子を発現することが可能な組換え細胞。
- 前記請求項のいずれかに記載の免疫分子の製造方法であって、
請求項13に記載のベクターを細胞に導入して組換え細胞を作製すること、および
該組換え細胞から免疫分子を産生させることを含む方法。 - 抗体またはその抗原結合フラグメントであって、
該抗体が、配列番号10の30番目〜110番目のアミノ酸に特異的に結合するが配列番号10の他の部分には特異的に結合しない抗原結合領域を有し、
該配列番号10の他の部分が、配列番号10の1番目〜29番目のアミノ酸または111番目〜234番目のアミノ酸を含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。 - 前記抗体が、配列番号215または配列番号216に特異的に結合するが配列番号10の他の部分には特異的に結合しない抗原結合領域を有し、
該抗原結合領域が配列番号215に特異的に結合する場合、該配列番号10の他の部分が、配列番号10の1番目〜80番目のアミノ酸または99番目〜234番目のアミノ酸を含み、
該抗原結合領域が配列番号216に特異的に結合する場合、該配列番号10の他の部分が、配列番号10の1番目〜117番目のアミノ酸または136番目〜234番目のアミノ酸を含む、請求項16に記載の抗体または抗原結合フラグメント。 - 前記抗体が、完全ヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または霊長類化抗体である、前記請求項のいずれかに記載の免疫分子、抗体またはフラグメント。
- 前記抗体が、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab’)2フラグメント、F(ab’)フラグメント、F(ab)フラグメント、Fvフラグメント、scFvフラグメントおよび最小認識単位からなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の免疫分子、抗体または抗原結合フラグメント。
- 前記抗体が、薬物、放射性核種、発蛍光団、酵素、毒素、治療薬および化学療法薬から選択される治療薬と結合されており、
これらを検出するマーカーが、放射性同位元素、金属キレート剤、酵素、蛍光化合物、生物発光化合物または化学発光化合物である、前記請求項のいずれかに記載の免疫分子、抗体または抗原結合フラグメント。 - 前記請求項のいずれかに記載の免疫分子、抗体または抗原結合フラグメントを含む医薬組成物。
- がん、免疫病態および感染症からなる群から選択される疾患をこれらの治療を必要とする対象において治療するための、前記請求項のいずれかに記載の免疫分子、抗体、抗体結合フラグメントまたは医薬組成物の使用。
- 前記抗体またはフラグメントが、免疫細胞の活性を調節すること、T細胞の活性化を増加すること、T細胞の抑制を軽減すること、免疫抑制サイトカインの分泌を減少させること、炎症性サイトカインの分泌を増加させること、IL−2の分泌を増加させること、T細胞によるインターフェロン−γの産生を増強すること、がんのエピトープ拡大を促進すること、哺乳動物におけるT細胞応答を増強すること、M2型マクロファージを減少または除去すること、M2型マクロファージの腫瘍形成促進活性を低下させること、抗原特異的メモリー応答を増強すること、がん細胞のアポトーシスを亢進すること、がん細胞に対する細胞傷害作用または細胞増殖抑制作用を増強すること、がん細胞に対する直接殺傷を増強すること、ならびに/または補体依存性細胞傷害および/もしくは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害を誘導することを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の免疫分子、抗体、抗体結合フラグメント、組成物または使用。
- 前記抗体またはフラグメントが、がんに対する免疫応答を増強する、請求項23に記載の免疫分子、抗体、抗体結合フラグメント、組成物または使用。
- 前記治療を、がんの治療に有用な別の治療薬または治療法と組み合わせることを特徴とする、請求項24に記載の免疫分子、抗体、抗体結合フラグメント、組成物または使用。
- 前記治療法が、放射線療法、凍結療法、抗体療法、化学療法、光線力学療法、外科手術、ホルモン除去療法、および慣用の薬物との併用療法の1以上を含む、請求項25に記載の免疫分子、抗体、抗体結合フラグメント、組成物または使用。
- 前記治療薬が、細胞傷害薬、腫瘍ワクチン、抗体、ペプチド、ペプチボディ、小分子、化学療法薬、細胞傷害・細胞増殖抑制薬、免疫調節薬、インターフェロン、インターロイキン、免疫刺激薬、成長ホルモン、サイトカイン、ビタミン、無機質、アロマターゼ阻害薬、RNAi、ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬およびプロテアソーム阻害薬からなる群から選択される、請求項25に記載の免疫分子、抗体、抗体結合フラグメント、組成物または使用。
- 治療効果を得るために1以上の増強手段と組み合わせて、該増強手段と同時にまたは連続して対象に投与され、
該1以上の増強手段が、放射線療法、抗腫瘍免疫応答を増強する標準的/古典的抗がん療法、抗腫瘍免疫応答を増強する標的療法、Tregおよび/またはMDSCを標的とする治療薬、免疫刺激抗体、サイトカイン療法、がん治療ワクチンならびに養子細胞移入からなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の免疫分子、抗体、抗体結合フラグメント、組成物または使用。 - 前記標準的/古典的抗がん薬が、白金系化合物、抗がん活性を有する抗生物質、アントラサイクリン類、アントラセンジオン類、アルキル化薬、代謝拮抗薬、抗有糸分裂薬、タキサン類、タキソイド類、微小管阻害薬、ビンカアルカロイド類、葉酸拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害薬、抗エストロゲン薬、抗アンドロゲン薬、アロマターゼ阻害薬、GnRhアナログ、5α−還元酵素阻害薬およびビホスホネート類から選択される、請求項28に記載の免疫分子、抗体、抗体結合フラグメント、組成物または使用。
- 前記標的療法薬が、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害薬、プロテアソーム阻害薬、mTOR経路阻害薬、JAK2阻害薬、チロシンキナーゼ阻害薬(TKI)、PI3K阻害薬、プロテインキナーゼ阻害薬、セリン/トレオニンキナーゼ阻害薬、細胞内シグナル伝達阻害薬、Ras/Rafシグナル伝達阻害薬、MEK阻害薬、AKT阻害薬、生存シグナル伝達タンパク質阻害薬、サイクリン依存性キナーゼ阻害薬、治療用モノクローナル抗体、TRAIL経路アゴニスト、抗血管新生薬、メタロプロテイナーゼ阻害薬、カテプシン阻害薬、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体機能阻害薬、免疫複合体、抗体−薬物複合体、抗体フラグメント、二重特異性抗体およびbispecific T cell engager(BiTE)からなる群から選択される、請求項28に記載の免疫分子、抗体、抗体結合フラグメント、組成物または使用。
- 前記抗体療法が、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、アレムツズマブ、ラベツズマブ(labetuzumab)、アデカツムマブ(adecatumumab)、オレゴボマブ(oregovomab)、オナルツズマブ(onartuzumab)、アポマブ(apomab)、マパツムマブ(mapatumumab)、レクサツムマブ(lexatumumab)、コナツムマブ(conatumumab)、ティガツズマブ(tigatuzumab)、カツマキソマブ(catumaxomab)、ブリナツモマブ(blinatumomab)、イブリツモマブ チウキセタン、トシツモマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、クリバツズマブテトラキセタン(clivatuzumab tetraxetan)、ペムツモマブ(pemtumomab)、トラスツズマブ エムタンシン、ベバシズマブ、エタラシズマブ(etaracizumab)、ボロシキシマブ(volociximab)、ラムシルマブおよびアフリベルセプトから選択される、請求項26に記載の免疫分子、抗体、抗体結合フラグメント、組成物または使用。
- 免疫抑制細胞であるTregおよび/またはMDSCを標的とする前記治療薬が、抗有糸分裂薬、シクロホスファミド、ゲムシタビン、ミトキサントロン、フルダラビン、サリドマイド、サリドマイド誘導体、COX−2阻害薬、Treg細胞表面受容体を認識してTregを直接標的とする除去抗体または殺傷抗体、抗CD25であるダクリズマブおよびバシリキシマブ、リガンド標的毒素であるデニロイキン ディフィトックス(オンタック)(ヒトIL−2とジフテリア毒素との融合タンパク質)およびLMB−2(CD25に対するscFvと緑膿菌外毒素との融合物)、Treg細胞表面受容体を標的とする抗体、TLR調節薬、アデノシン作動経路を阻害する薬物、エクトヌクレオチダーゼ阻害薬、A2Aアデノシン受容体阻害薬、TGF−β阻害薬、ケモカイン受容体阻害薬、レチノイン酸、オールトランス型レチノイン酸(ATRA)、ビタミンD3、ホスホジエステラーゼ5阻害薬、シルデナフィル、ROS阻害薬、ならびにニトロアスピリンから選択される、請求項28に記載の免疫分子、抗体、抗体結合フラグメント、組成物または使用。
- 前記免疫刺激抗体が、CTLA4、PD−1、PDL−1、LAG−3、TIM−3、BTLA、B7−H4、B7−H3およびVISTAの1以上を標的とするアンタゴニスト抗体、ならびに/またはCD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28およびICOSの1以上を標的とするアゴニスト抗体から選択される、請求項28に記載の免疫分子、抗体、抗体結合フラグメント、組成物または使用。
- 前記がん治療ワクチンが、腫瘍抗原に対する免疫原性応答を開始するためのタンパク質またはペプチド、腫瘍抗原をコードする組換えウイルスベクターおよび組換え細菌ベクター、腫瘍抗原をコードするDNAベースのワクチン、樹状細胞を標的とするタンパク質、樹状細胞ベースのワクチン、全腫瘍細胞ワクチン、GM−CSF、ICOSおよび/またはFlt3リガンドを発現する遺伝子修飾腫瘍細胞、ならびに腫瘍溶解性ウイルスワクチンを包含する外因性がんワクチンから選択される、請求項28に記載の免疫分子、抗体、抗体結合フラグメント、組成物または使用。
- 前記サイトカイン療法が、IL−2、IL−7、IL−12、IL−15、IL−17、IL−18、IL−21、IL−23、IL−27、GM−CSF、IFNα(インターフェロン−α)、IFNα−2b、IFNβおよびIFNγを含むサイトカインの1以上、ならびにこれらのサイトカインの様々な送達方法から選択される、請求項28に記載の免疫分子、抗体、抗体結合フラグメント、組成物または使用。
- 前記養子細胞移入療法を実施する前に、患者から得た天然の腫瘍特異的自家T細胞の増殖および腫瘍抗原特異性を付与するためのT細胞の遺伝子修飾から選択されるエクスビボ処理を行うことを特徴とする、請求項28に記載の免疫分子、抗体、抗体結合フラグメント、組成物または使用。
- 前記請求項のいずれかに記載の抗体、免疫分子または医薬組成物の使用であって、
(a)サイトカインのアップレギュレーション、(b)T細胞増殖/拡大の増加、(c)T細胞によるインターフェロン−γ産生の増加、(d)IL−2分泌の増加、(e)抗体応答の刺激、(f)がん細胞増殖の抑制、(g)抗原特異的T細胞免疫の促進、(g)CD4+および/またはCD8+T細胞活性化の促進、(i)T細胞抑制の軽減、(j)がん細胞のアポトーシスまたは溶解の軽減、(k)がん細胞に対する細胞傷害作用または細胞増殖抑制作用のうちの1以上を対象において実施し、疾患の治療を行うことを特徴とする使用。 - 対象において疾患を診断するための診断方法であって、
該疾患が、がんおよび自己免疫疾患からなる群から選択されること、
該診断方法がエクスビボで実施されること、ならびに
該診断方法が、対象から得た組織試料と前記請求項のいずれかに記載の免疫分子または抗体とをエクスビボで接触させること、および該免疫分子または抗体との特異的結合を検出することを含むこと
を特徴とする診断方法。 - 対象において疾患を診断するための診断方法であって、
該疾患が、がん、自己免疫疾患および感染症からなる群から選択されること、
該診断方法がインビボで実施されること、ならびに
該診断方法が、前記請求項のいずれかに記載の免疫分子または抗体を対象に投与すること、および前記請求項のいずれかに記載の免疫分子または抗体と対象の組織との特異的結合を検出することを含むこと
を特徴とする診断方法。 - 前記免疫分子、抗体または医薬組成物を対象に投与する前に、請求項38または39に記載の診断方法を実施することを特徴とする、前記請求項のいずれかに記載の使用。
- 前記免疫分子、抗体または医薬組成物を対象に投与する前に、対象の組織のLSRレベルを測定することをさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の使用。
- 前記LSRレベルが十分な場合においてのみ、前記免疫分子、抗体または医薬組成物を対象に投与することを特徴とする、請求項41に記載の使用。
- 前記LSRレベルとしてLSRの発現レベルを測定することをさらに含む請求項42に記載の使用。
- 前記発現レベルの測定において、対象の組織のIHC(免疫組織化学)アッセイまたは遺伝子発現アッセイを実施することを含む請求項43に記載の使用。
- 前記IHCアッセイを実施する際に、発現レベルが0〜3の段階評価において1以上であるかどうかを判定することを含む請求項44に記載の使用。
- 前記組織が、がん細胞または免疫浸潤細胞を含む請求項42〜45のいずれかに記載の使用。
- 前記組織の前記LSRレベルの測定において、
前記組織を、前記請求項のいずれかに記載の抗体または免疫分子と接触させること、および
該抗体または免疫分子との特異的結合を検出することを含む、請求項42〜46のいずれかに記載の使用。 - 対象から得た組織試料を用いて疾患を診断するためのアッセイであって、
前記請求項のいずれかに記載の免疫分子または抗体と、がん、自己免疫疾患および感染症からなる群から選択される疾患を診断するための少なくとも1の試薬とを含むアッセイ。 - 疾患のスクリーニング、疾患の存在もしくは重症度の検出、疾患の予後の予測、疾患の進行もしくは再発のモニタリング、疾患、障害もしくは状態の治療効果および/もしくは再発の評価、疾患の治療法および/もしくは処置の選択、疾患に対する特定の治療法の最適化、疾患に対する治療のモニタリング、特定の患者もしくは亜集団に対する治療法の適合性の予測、ならびに/または患者もしくは亜集団に対する治療薬の適切な用量の決定のための、前記請求項のいずれかに記載の使用または請求項48に記載のアッセイの使用。
- 前記がん、前記腫瘍浸潤免疫細胞のいずれかまたはその両方が、十分なレベルのLSRを発現しており、
前記がんが、乳がん、子宮頸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、悪性黒色腫、膀胱がん、肺がん、膵臓がん、結腸がん、前立腺がん、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、B細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、骨髄性白血病、急性骨髄性白血病(AML)、慢性骨髄性白血病、甲状腺がん、濾胞性甲状腺がん、骨髄異形成症候群(MDS)、線維肉腫および横紋筋肉腫、悪性黒色腫、ぶどう膜悪性黒色腫、奇形癌、神経芽腫、神経膠腫、神経膠芽腫、皮膚良性腫瘍、角化棘細胞腫、腎臓がん、未分化大細胞リンパ腫、食道扁平上皮細胞癌、肝細胞癌、濾胞性樹状細胞癌、腸がん、筋層浸潤がん、精嚢腫瘍、表皮癌、脾臓がん、膀胱がん、頭頸部がん、胃がん、肝臓がん、骨がん、脳がん、網膜がん、胆道がん、小腸がん、唾液腺がん、子宮がん、精巣がん、結合組織がん、前立腺肥大症、脊髄形成異常症、ワルデンシュトレーム・マクログロブリン血症、鼻咽頭癌、神経内分泌がん、骨髄異形成症候群、中皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、カルチノイド、食道胃癌、ファローピウス管がん、腹膜がん、漿液性乳頭状ミュラー管がん、悪性腹水、消化管間質腫瘍(GIST)、リー・フラウメニ症候群ならびにフォンヒッペル・リンダウ症候群(VHL)(ただし、前記がんが卵巣がんである場合、卵巣顆粒膜細胞腫を除き、前記がんが脳がんである場合、グレード2の星状細胞腫を除く)からなる群から選択される、前記請求項のいずれかに記載の使用。 - 前記がんが、乳管腺癌、浸潤性乳管癌、乳房小葉癌、乳房粘液性腺癌、乳管内癌と浸潤性乳管癌との混合型、中〜低分化型盲腸腺癌、高〜低分化型結腸腺癌、グレード2の上行結腸管状腺癌、デュークスステージC1の結腸腺癌、浸潤性結腸腺癌、直腸腺癌、グレード3の直腸腺癌、中分化型直腸腺癌、中分化型直腸粘液性腺癌、高〜低分化型非小細胞癌、中〜低分化型肺扁平上皮癌、中等度によく分化した肺角化型扁平上皮細胞癌、肺大細胞腺癌、グリーソングレード7〜9の前立腺腺癌、浸潤性前立腺腺癌、中分化型前立腺腺癌、漿液性乳頭状卵巣嚢胞癌、漿液性卵巣嚢胞腺癌、グレード4の星状細胞腫、多形膠芽腫、腎明細胞癌、肝細胞癌、ならびに低悪性度肝細胞癌(ただし、前記がんが卵巣がんである場合、卵巣顆粒膜細胞腫を除き、前記がんが脳がんである場合、グレード2の星状細胞腫を除く)からなる群から選択される、請求項50に記載の使用。
- 前記乳がんが、乳管腺癌、浸潤性乳管癌、小葉癌、粘液性腺癌、および乳管内癌と浸潤性乳管癌との混合型からなる群から選択される、請求項50に記載の使用。
- 前記乳がんが硬性腺癌である請求項52に記載の使用。
- 前記結腸がんが、中〜低分化型盲腸腺癌、高分化型、中分化型および低分化型結腸腺癌、管状腺癌(好ましくはグレード2の上行結腸管状腺癌)、デュークスステージC1の結腸腺癌、浸潤性腺癌、直腸腺癌(好ましくはグレード3の直腸腺癌)、中分化型直腸腺癌、ならびに中分化型直腸粘液性腺癌からなる群から選択される、請求項50に記載の使用。
- 前記肺がんが、高〜低分化型非小細胞癌、扁平上皮細胞癌(好ましくは中分化型扁平上皮細胞癌)、中〜低分化型扁平上皮癌、中等度によく分化した角化型扁平上皮細胞癌、大細胞腺癌および小細胞肺がんからなる群から選択される、請求項50に記載の使用。
- 前記前立腺がんが、グリーソングレード5〜9の腺癌、浸潤性腺癌、高悪性度前立腺上皮内腫瘍および未分化癌からなる群から選択される、請求項50に記載の使用。
- 前記胃がんが、中分化型胃腺癌である請求項50に記載の使用。
- 前記卵巣がんが、漿液性乳頭状嚢胞癌、漿液性嚢胞腺癌および浸潤性漿液性乳頭状癌からなる群から選択される、請求項50に記載の使用。
- 前記脳がんが、多形膠芽腫、および星状細胞腫(ただしグレード2の星状細胞腫を除く)からなる群から選択される、請求項50に記載の使用。
- 前記星状細胞腫がグレード4の星状細胞腫である請求項59に記載の使用。
- 前記腎臓がんが腎明細胞癌である請求項50に記載の使用。
- 前記肝臓がんが肝細胞癌である請求項50に記載の使用。
- 前記肝細胞癌が低悪性度肝細胞癌または線維層板状肝細胞癌である請求項62に記載の使用。
- 前記血液がんが、大細胞型リンパ腫ならびに高悪性度および低悪性度非ホジキンリンパ腫からなる群から選択される請求項50に記載の使用。
- 前記疾患が免疫病態であり、
該免疫病態が、自己免疫疾患、移植拒絶反応および移植片対宿主病からなる群から選択される、請求項22〜49のいずれかに記載の使用、方法またはアッセイ。 - 前記自己免疫疾患が、多発性硬化症、乾癬;関節リウマチ;乾癬性関節炎、全身性エリテマトーデス(SLE);潰瘍性大腸炎;クローン病;良性リンパ球性血管炎、血小板減少性紫斑病、特発性血小板減少症、特発性自己免疫性溶血性貧血、赤芽球癆、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患、結合組織疾患、炎症性リウマチ、変形性リウマチ、非関節性リウマチ、若年性関節リウマチ、尿酸性関節炎、筋肉リウマチ、慢性多発性関節炎、クリオグロブリン血管炎、ANCA関連血管炎、抗リン脂質症候群、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、ギラン・バレー症候群、慢性免疫性多発ニューロパチー、自己免疫性甲状腺炎、インスリン依存性糖尿病、1型糖尿病、アジソン病、膜性糸球体腎症、グッドパスチャー病、自己免疫性胃炎、自己免疫性萎縮性胃炎、悪性貧血、天疱瘡、尋常性天疱瘡、肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、皮膚筋炎、多発性筋炎、線維筋炎、筋硬症、セリアック病、免疫グロブリンA腎症、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、エバンス症候群、アトピー性皮膚炎、乾癬、関節症性乾癬、グレーブス病、グレーブス眼症、強皮症、全身性強皮症、進行性全身性強皮症、喘息、アレルギー、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、交感性眼炎、自己免疫性ぶどう膜炎、肝炎、慢性活動性肝炎、膠原病、強直性脊椎炎、肩関節周囲炎、結節性汎動脈炎、軟骨石灰化症、ヴェーゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、慢性じんま疹、水疱性皮膚疾患、類天疱瘡、アトピー性湿疹、デビック病、小児自己免疫性溶血性貧血、難治性または慢性自己免疫性血球減少症、後天性血友病Aにおける抗第VIII因子自己抗体の産生の予防、寒冷凝集素病、視神経脊髄炎、全身硬直症候群、歯肉炎、歯周炎、膵炎、心筋炎、脈管炎、胃炎、痛風、痛風性関節炎、炎症性皮膚疾患、正補体血症性蕁麻疹様血管炎、心膜炎、筋炎、抗合成酵素症候群、強膜炎、マクロファージ活性化症候群、ベーチェット症候群、PAPA症候群、Blau症候群、痛風、成人および若年性スティル病、クリオピリン周期熱症候群、マックル・ウェルズ症候群、家族性寒冷自己炎症性症候群、新生児期発症多臓器性炎症性疾患、家族性地中海熱、慢性乳児期発症神経皮膚関節症候群、全身型若年性特発性関節炎、高IgD症候群、シュニッツラー症候群、自己免疫性網膜症、加齢黄斑変性、アテローム性動脈硬化症、慢性前立腺炎、ならびにTNF受容体関連周期性症候群(TRAPS)からなる群から選択される、請求項65に記載の使用。
- 前記治療を、免疫関連病態の治療に有用な別の成分と組み合わせることを特徴とする請求項65に記載の使用。
- 前記疾患が感染症であり、
該感染症が、細菌感染、ウイルス感染、真菌感染および/または他の寄生虫感染によって引き起こされる疾患から選択される、請求項22〜49のいずれかに記載の使用、方法またはアッセイ。 - 前記感染症が、B型肝炎、C型肝炎、伝染性単核症、EBV、サイトメガロウイルス、AIDS、HIV−1、HIV−2、結核、マラリアおよび住血吸虫症から選択される、請求項68に記載の使用、方法またはアッセイ。
- 前記治療を、感染症の治療に有用な別の成分と組み合わせることを特徴とする請求項68に記載の使用、方法またはアッセイ。
- 疾患に罹患している対象の治療または診断を行うための、配列番号10に特異的に結合する抗体またはフラグメントの使用であって、
乳管腺癌、浸潤性乳管癌、小葉癌、粘液性腺癌、乳管内癌と浸潤性乳管癌との混合型、硬性腺癌、中〜低分化型盲腸腺癌、高分化型、中分化型および低分化型結腸腺癌、管状腺癌(好ましくはグレード2の上行結腸管状腺癌)、デュークスステージC1の結腸腺癌、浸潤性腺癌、直腸腺癌(好ましくはグレード3の直腸腺癌)、中分化型直腸腺癌、中分化型直腸粘液性腺癌、高〜低分化型非小細胞癌、扁平上皮細胞癌(好ましくは中分化型扁平上皮細胞癌)、中〜低分化型扁平上皮癌、中等度によく分化した角化型扁平上皮細胞癌、大細胞腺癌、小細胞肺がん、グリーソングレード5〜9の腺癌、浸潤性腺癌、高悪性度前立腺上皮内腫瘍、未分化癌、中分化型胃腺癌、漿液性乳頭状嚢胞癌、漿液性嚢胞腺癌、浸潤性漿液性乳頭状癌、多形膠芽腫、星状細胞腫、グレード4の星状細胞腫、腎明細胞癌、肝細胞癌、低悪性度肝細胞癌、線維層板状肝細胞癌、大細胞型リンパ腫、ならびに高悪性度および低悪性度非ホジキンリンパ腫(ただし、前記がんが卵巣がんである場合、卵巣顆粒膜細胞腫を除き、前記がんが脳がんである場合、グレード2の星状細胞腫を除く)からなる群から選択される疾患に罹患している対象の治療または診断を行うための使用。 - 配列番号10に特異的に結合する抗体またはフラグメントを含む医薬組成物であって、
乳管腺癌、浸潤性乳管癌、小葉癌、粘液性腺癌、乳管内癌と浸潤性乳管癌との混合型、硬性腺癌、中〜低分化型盲腸腺癌、高分化型、中分化型および低分化型結腸腺癌、管状腺癌(好ましくはグレード2の上行結腸管状腺癌)、デュークスステージC1の結腸腺癌、浸潤性腺癌、直腸腺癌(好ましくはグレード3の直腸腺癌)、中分化型直腸腺癌、中分化型直腸粘液性腺癌、高〜低分化型非小細胞癌、扁平上皮細胞癌(好ましくは中分化型扁平上皮細胞癌)、中〜低分化型扁平上皮癌、中等度によく分化した角化型扁平上皮細胞癌、大細胞腺癌、小細胞肺がん、グリーソングレード5〜9の腺癌、浸潤性腺癌、高悪性度前立腺上皮内腫瘍、未分化癌、中分化型胃腺癌、漿液性乳頭状嚢胞癌、漿液性嚢胞腺癌、浸潤性漿液性乳頭状癌、多形膠芽腫、星状細胞腫、グレード4の星状細胞腫、腎明細胞癌、肝細胞癌、低悪性度肝細胞癌、線維層板状肝細胞癌、大細胞型リンパ腫、ならびに高悪性度および低悪性度非ホジキンリンパ腫(ただし、前記がんが卵巣がんである場合、卵巣顆粒膜細胞腫を除き、前記がんが脳がんである場合、グレード2の星状細胞腫を除く)からなる群から選択される疾患に罹患している対象を治療するための医薬組成物。 - 前記がんが、乳管腺癌、浸潤性乳管癌、乳房小葉癌、乳房粘液性腺癌、乳管内癌と浸潤性乳管癌との混合型、中〜低分化型盲腸腺癌、高〜低分化型結腸腺癌、グレード2の上行結腸管状腺癌、デュークスステージC1の結腸腺癌、浸潤性腺癌、直腸腺癌、グレード3の直腸腺癌、中分化型直腸腺癌、中分化型直腸粘液性腺癌、高〜低分化型非小細胞癌、扁平上皮細胞癌、中分化型および中〜低分化型扁平上皮癌、中等度によく分化した角化型扁平上皮細胞癌、大細胞腺癌、グリーソングレード7〜9の腺癌、浸潤性腺癌、中分化型腺癌、漿液性乳頭状嚢胞癌、漿液性嚢胞腺癌、グレード4の星状細胞腫、多形膠芽腫、腎明細胞癌、肝細胞癌、ならびに低悪性度肝細胞癌(ただし、前記がんが卵巣がんである場合、卵巣顆粒膜細胞腫を除き、前記がんが脳がんである場合、グレード2の星状細胞腫を除く)からなる群から選択される、請求項71または72に記載の使用または組成物。
- 前記治療を、がんの治療に有用な別の治療薬または治療法と組み合わせることを特徴とする、請求項71〜73のいずれかに記載の使用または組成物。
- 前記治療法が、放射線療法、凍結療法、抗体療法、化学療法、光線力学療法、外科手術、ホルモン除去療法、および慣用の薬物との併用療法の1以上を含む、請求項74に記載の使用または組成物。
- 前記治療薬が、細胞傷害薬、腫瘍ワクチン、抗体、ペプチド、ペプチボディ、小分子、化学療法薬、細胞傷害・細胞増殖抑制薬、免疫調節薬、インターフェロン、インターロイキン、免疫刺激薬、成長ホルモン、サイトカイン、ビタミン、無機質、アロマターゼ阻害薬、RNAi、ヒストン脱アセチル化酵素阻害薬およびプロテアソーム阻害薬からなる群から選択される、請求項74に記載の使用または組成物。
- 治療効果を得るために1以上の増強手段と組み合わせて、該増強手段と同時にまたは連続して対象に投与され、
該1以上の増強手段が、放射線療法、抗腫瘍免疫応答を増強する標準的/古典的抗がん療法、抗腫瘍免疫応答を増強する標的療法、Tregおよび/またはMDSCを標的とする治療薬、免疫刺激抗体、サイトカイン療法ならびに養子細胞移入からなる群から選択される、請求項71〜76のいずれかに記載の使用または組成物。 - 前記標準的/古典的抗がん薬が、白金系化合物、抗がん活性を有する抗生物質、アントラサイクリン類、アントラセンジオン類、アルキル化薬、代謝拮抗薬、抗有糸分裂薬、タキサン類、タキソイド類、微小管阻害薬、ビンカアルカロイド類、葉酸拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害薬、抗エストロゲン薬、抗アンドロゲン薬、アロマターゼ阻害薬、GnRhアナログ、5α−還元酵素阻害薬およびビホスホネート類から選択される、請求項77に記載の使用または組成物。
- 前記標的療法薬が、ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害薬、プロテアソーム阻害薬、mTOR経路阻害薬、JAK2阻害薬、チロシンキナーゼ阻害薬(TKI)、PI3K阻害薬、プロテインキナーゼ阻害薬、セリン/トレオニンキナーゼ阻害薬、細胞内シグナル伝達阻害薬、Ras/Rafシグナル伝達阻害薬、MEK阻害薬、AKT阻害薬、生存シグナル伝達タンパク質阻害薬、サイクリン依存性キナーゼ阻害薬、治療用モノクローナル抗体、TRAIL経路アゴニスト、抗血管新生薬、メタロプロテイナーゼ阻害薬、カテプシン阻害薬、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子受容体機能阻害薬、免疫複合体、抗体−薬物複合体、抗体フラグメント、二重特異性抗体およびbispecific T cell engager(BiTE)からなる群から選択される、請求項77に記載の使用または組成物。
- 前記抗体が、セツキシマブ、パニツムマブ、ニモツズマブ、トラスツズマブ、ペルツズマブ、リツキシマブ、オファツムマブ、ベルツズマブ、アレムツズマブ、ラベツズマブ(labetuzumab)、アデカツムマブ(adecatumumab)、オレゴボマブ(oregovomab)、オナルツズマブ(onartuzumab)、アポマブ(apomab)、マパツムマブ(mapatumumab)、レクサツムマブ(lexatumumab)、コナツムマブ(conatumumab)、ティガツズマブ(tigatuzumab)、カツマキソマブ(catumaxomab)、ブリナツモマブ(blinatumomab)、イブリツモマブ チウキセタン、トシツモマブ、ブレンツキシマブ ベドチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、クリバツズマブテトラキセタン(clivatuzumab tetraxetan)、ペムツモマブ(pemtumomab)、トラスツズマブ エムタンシン、ベバシズマブ、エタラシズマブ(etaracizumab)、ボロシキシマブ(volociximab)、ラムシルマブおよびアフリベルセプトから選択される、請求項75に記載の使用または組成物。
- 免疫抑制細胞であるTregおよび/またはMDSCを標的とする前記治療薬が、抗有糸分裂薬、シクロホスファミド、ゲムシタビン、ミトキサントロン、フルダラビン、サリドマイド、サリドマイド誘導体、COX−2阻害薬、Treg細胞表面受容体を認識してTregを直接標的とする除去抗体または殺傷抗体、抗CD25であるダクリズマブおよびバシリキシマブ、リガンド標的毒素であるデニロイキン ディフィトックス(オンタック)(ヒトIL−2とジフテリア毒素との融合タンパク質)およびLMB−2(CD25に対するscFvと緑膿菌外毒素との融合物)、Treg細胞表面受容体を標的とする抗体、TLR調節薬、アデノシン作動経路を阻害する薬物、エクトヌクレオチダーゼ阻害薬、A2Aアデノシン受容体阻害薬、TGF−β阻害薬、ケモカイン受容体阻害薬、レチノイン酸、オールトランス型レチノイン酸(ATRA)、ビタミンD3、ホスホジエステラーゼ5阻害薬、シルデナフィル、ROS阻害薬、ならびにニトロアスピリンから選択される、請求項77に記載の使用または組成物。
- 前記免疫刺激抗体が、CTLA4、PD−1、PDL−1、LAG−3、TIM−3、BTLA、B7−H4、B7−H3およびVISTAの1以上を標的とするアンタゴニスト抗体、ならびに/またはCD40、CD137、OX40、GITR、CD27、CD28およびICOSの1以上を標的とするアゴニスト抗体から選択される、請求項77に記載の使用または組成物。
- 前記がん治療ワクチンが、腫瘍抗原に対する免疫原性応答を開始するためのタンパク質またはペプチド、腫瘍抗原をコードする組換えウイルスベクターおよび組換え細菌ベクター、腫瘍抗原をコードするDNAベースのワクチン、樹状細胞ベースのワクチンを標的とするタンパク質、全腫瘍細胞ワクチン、GM−CSF、ICOSおよび/またはFlt3リガンドを発現する遺伝子修飾腫瘍細胞、ならびに腫瘍溶解性ウイルスワクチンを包含する外因性がんワクチンから選択される、請求項77に記載の使用または組成物。
- 前記サイトカイン療法が、IL−2、IL−7、IL−12、IL−15、IL−17、IL−18、IL−21、IL−23、IL−27、GM−CSF、IFNα(インターフェロン−α)、IFNα−2b、IFNβおよびIFNγを含むサイトカインの1以上、ならびにこれらのサイトカインの様々な送達方法から選択される、請求項77に記載の使用または組成物。
- 前記養子細胞移入療法を実施する前に、患者から得た天然の腫瘍特異的自家T細胞の増殖および腫瘍抗原特異性を付与するためのT細胞の遺伝子修飾から選択されるエクスビボ処理を行うことを特徴とする、請求項77に記載の使用または組成物。
- 請求項71〜85のいずれかに記載の組成物を使用または投与するべきかどうかを判断するための診断方法であって、
請求項38〜49のいずれかに記載の方法または使用に従って診断方法を実施することを含む方法。 - 前記がんが非転移性である、前記請求項のいずれかに記載の使用または組成物。
- 前記がんが浸潤性である、前記請求項のいずれかに記載の使用または組成物。
- 前記がんが転移性である、前記請求項のいずれかに記載の使用または組成物。
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