ES2240962T3

ES2240962T3 - Metodo para estimular selectivamente la proliferacion de celulas t.

Info

Publication number: ES2240962T3
Application number: ES94919346T
Authority: ES
Inventors: Carl H. June; Craig B. Thompson; Gary J. Nabel; Gary S. Gray; Paul D. Rennert
Original assignee: Repligen Corp; University of Michigan; US Department of Navy
Current assignee: Repligen Corp; University of Michigan; US Department of Navy
Priority date: 1993-06-04
Filing date: 1994-06-03
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2014-06-03
Also published as: AU7052194A; EP1553168A2; JP4009618B2; WO1994029436A1; CA2164226C; CA2164226A1; JP2004267220A; EP1553168A3; ATE293686T1; PT700430E; DE69434342D1; HK1014734A1; DK0700430T3; EP0700430A1; JPH08511166A; DE69434342T2; EP0700430B1

Abstract

SE DESCRIBEN METODOS PARA INDUCIR A UNA POBLACION DE CELULAS T A QUE SE PROLIFERE A BASE DE ACTIVAR LA POBLACION DE CELULAS T Y ESTIMULAR UNA MOLECULA AUXILIAR SOBRE LA SUPERFICIE DE LAS CELULAS T CON UN LIGANDO QUE SE ENLAZA A MOLECULA AUXILIAR. LA PROLIFERACION DE LAS CELULAS T TIENE LUGAR EN AUSENCIA DE FACTORES DE CRECIMIENTO EXOGENOS O DE CELULAS AUXILIARES. LA ACTIVACION DE LAS CELULAS T SE CONSIGUE ESTIMULANDO EL COMPLEJO DE RECEPTOR DE CELULAS T (TCR)/CD3 O LA PROTEINA SUPERFICIAL CD2. PARA INDUCIR LA PROLIFERACION DE UNA POBLACION DE CELULAS T ACTIVADAS, SE ESTIMULA UNA MOLECULA AUXILIAR QUE HAY COLOCADA SOBRE LA SUPERFICIE DE LAS CELULAS T, TAL COMO UNA CD28, CON UN LIGANDO QUE SE ENLAZA A LA MOLECULA AUXILIAR. LA POBLACION DE CELULAS T AUMENTADA SEGUN EL METODO DE LA INVENCION SE PUEDE TRANSDUCIR GENETICAMENTE Y UTILIZAR EN UNA INMUNOTERAPIA O SE PUEDE UTILIZAR EN METODOS DE DIAGNOSTICO.

Description

Método para estimular selectivamente la proliferación de células T.

El desarrollo de las técnicas in vitro de propagación de células T ha desempeñado un papel fundamental en muchos de los avances recientes en nuestra comprensión del reconocimiento de antígenos por las células T y de la activación de células T. El desarrollo de los métodos de cultivo para la generación de clones de células T humanas específicas para antígenos ha sido útil para definir los antígenos expresados por patógenos y los tumores reconocidos por las células T para establecer métodos de inmunoterapia para el tratamiento de una variedad de enfermedades humanas. Las células T específicas para antígenos pueden multiplicarse in vitro para el uso en inmunoterapia celular adoptiva en el que infusiones de células T han demostrado tener reactividad antitumoral en un huésped con tumor. La inmunoterapia adoptiva también se ha usado para tratar infecciones virales en individuos inmunocomprometidos.

Las técnicas para multiplicar células T in vitro se han apoyado en el uso de células accesorias y factores de crecimiento exógenos, tales como IL-2. Se sabe que el uso de IL-2 y, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3 para estimular la proliferación de células T expande la subpoblación CD8^{+} de células T. La necesidad de tener células presentadoras de antígenos emparejadas con CPH como células accesorias supone un problema importante para los sistemas de cultivo a largo plazo. Las células presentadoras de antígenos tienen una vida relativamente corta. Por lo tanto, en un sistema de cultivo a largo plazo, las células presentadoras de antígenos tienen que obtenerse continuamente de una fuente y reponerse. La necesidad de tener una fuente renovable de células accesorias representa un problema en el tratamiento de inmunodeficiencias en el que las células accesorias están afectadas. Además, al tratar una infección viral, las células accesorias que pueden llevar el virus pueden contaminar la población entera de células T durante el cultivo a largo plazo. Un método de cultivo alternativo in vitro de clonar y multiplicar las células T humanas en ausencia de un factor de crecimiento exógeno y las células accesorias supondría un beneficio significativo.

La presente invención se refiere a un método in vitro para inducir una población de células T a proliferar, que comprende poner una población de células T en contacto con una superficie sólida sobre la que se ha inmovilizado directamente:

(a): Un primer agente que proporciona una señal de activación principal a las células T, lo que activa las células T; y

(b): Un segundo agente que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células T, estimulando las células T activadas, con lo que el primer y segundo agentes inducen la proliferación de las células T.

Por tanto, la presente invención se refiere a métodos para la inducción selectiva ex vivo de la expansión de una población de células T en ausencia de factores de crecimiento exógenos, tales como linfoquinas, y células accesorias. Además, la proliferación de células T puede inducirse sin la necesidad de antígenos, con lo que se proporciona una población de células T expandida que es policlonal con respecto a la reactividad de los antígenos. El método proporciona la proliferación sostenida de una población seleccionada de células T CD4^{+} o CD8^{+} durante un periodo de tiempo para aumentar en varias veces el número de estas células con respecto a la población original de células T.

Según el método de la invención, se induce una población de células T a proliferar activando las células T y estimulando una molécula accesoria en la superficie de las células T con un ligando que se une a la molécula accesoria. La activación de una población de células T se consigue haciendo que las células T contacten con un primer agente que estimula una señal asociada con el complejo RCT/CD3 en las células T. La estimulación de la señal asociada con el complejo RCT/CD3 en una célula T se consigue o mediante la ligación del complejo del receptor de la célula T con RCT/CD3 o la proteína de superficie CD2, o mediante la estimulación directa de vías de señalización acopladas al receptor. Por tanto, un anticuerpo anti-CD3, un anticuerpo anti-CD2, o un activador de proteína quinasa C junto con un ionoforo de calcio se utiliza para activar una población de células T.

Para inducir la proliferación, una población activada de células T se hace contactar con un segundo agente que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células T. Por ejemplo, una población de células T CD4^{+} puede estimularse para proliferar con un anticuerpo anti-CD28 dirigido contra la molécula CD28 en la superficie de las células T. La proliferación de una población de células T CD8^{+} se consigue mediante el uso de un anticuerpo monoclonal ES5.2D8, que se une a una molécula accesoria con un peso molecular de aproximadamente 27 kD presente en las células T activadas. Alternativamente, la proliferación de una población activada de células T puede inducirse mediante la estimulación de una o más señales intracelulares que resultan de la ligación de una molécula accesoria, tal como CD28.

Después de la activación y estimulación de una molécula accesoria en la superficie de las células T, se vigila el progreso de la proliferación de las células T en respuesta a una exposición continua al ligando u otro agente que actúe de forma intracelular para estimular una vía mediada por la molécula accesoria. Cuando la velocidad de proliferación de células T se reduce, se reactivan y se reestimulan las células T, por ejemplo, con anticuerpos anti-CD3 adicionales y un ligando coestimulador, para inducir aún más la proliferación. En una realización, la velocidad de la proliferación de las células T se vigila examinando el tamaño de las células. Alternativamente, la proliferación de las células T se vigila llevando a cabo un ensayo para detectar la expresión de moléculas de superficie celular en respuesta a la exposición al ligando u otro agente, tal como B7-1 o B7-2. La vigilancia y reestimulación de las células T pueden repetirse con tal de conseguir una proliferación sostenida para producir una población de células T con un aumento en el número desde aproximadamente 100 veces hasta aproximadamente 100.000 veces con respecto a la población original de
células T.

El método de la invención puede usarse para expandir poblaciones seleccionadas de células T para usar en el tratamiento de enfermedades infecciosas o del cáncer. La población resultante de células T puede transducirse genéticamente y usarse para la inmunoterapia o puede usarse para el análisis in vitro de agentes infecciosos tales como el VIH. La proliferación de una población de células CD4^{+} obtenidas de un individuo infectado con VIH puede conseguirse y las células pueden hacerse resistentes a la infección por el VIH. Después de la expansión de una población de células T a unos niveles suficientes, las células T expandidas se reintroducen en el individuo. Asimismo, una población de linfocitos infiltrantes de tumores puede obtenerse de un individuo afectado con cáncer y las células T pueden estimularse para proliferar hasta un número suficiente y luego se reintroducen en el individuo. Además, los sobrenadantes de los cultivos de células T expandidas de acuerdo con el método de la invención son una fuente rica de citoquinas y pueden usarse para sostener las células T in vivo o ex vivo.

La figura 1 representa las curvas de crecimiento in vitro de células T CD4^{+} de sangre periférica en respuesta al cultivo con un anticuerpo anti-CD3 e interleuquina-2 (IL-2) (\bullet - \bullet), un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 mAb 9.3 (\lozenge - \lozenge), o PHA solo (\Delta - \Delta).

La figura 2 representa la curva de crecimiento de células T CD4^{+} de sangre periférica cultivadas en suero fetal bovino y bien un anticuerpo anti-CD3 e interleuquina-2 (IL-2) (\bullet - \bullet), o bien un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 mAb 9.3 (\lozenge - \lozenge).

La figura 3 representa las curvas de crecimiento de células T de sangre periférica CD4^{+} cultivadas en presencia del ácido de forbol miristato (AFM) e ionomicina con o sin IL-2, o con o sin un anticuerpo anti-CD28, mAb 9.3. Los símbolos son los siguientes: AFM e ionomicina (P+I) se representan con (\blacksquare); AFM, ionomicina y IL-2 (P+I+IL-2) se representan con (\bullet); y AFM, ionomicina y anticuerpos anti-CD28 (P+I+9.3) se representan con (\blacklozenge).

La figura 4 es una representación esquemática de la expansión selectiva de células T CD4^{+} después de la estimulación con CD28 en comparación con la estimulación de células T con IL-2.

La figura 5 representa el análisis activado por fluorescencia para clasificación de células (AFCC) en que se tiñen las células después de su aislamiento (día 0, figuras 5A-1 a 5A-4), o después de 26 días de cultivo bien con estimulación con CD3^{+} CD28 (figuras 5B-1 a 5B-4) o con estimulación con CD3^{+} IL-2 (figuras 5C-1 a 5C-4), con anti-CD3, CD4, CD8 conjugado con ficoeritrina o con un anticuerpo monoclonal IgG2a control y con la fluorescencia cuantificada con un citómetro de flujo.

La figura 6 muestra el análisis AFCC del anticuerpo monoclonal EX5.3D10, representando la reactividad con CD28 en comparición con un anticuerpo monoclonal anti-CD28 9.3. Se ensayaron con las siguientes líneas celulares: figuras 6A-1 a 6A-3, células CHO-DG44 no transfectadas; figuras 6B-1 a 6B-3, células CHO-HH; figuras 6C-1 a 6C-3, linfocitos de sangre periférica no activados; y figuras 6D-1 a 6D-3, células Jurkat número 7.

La figura 7 muestra el análisis AFCC del anticuerpo monoclonal ES5.2D8, representando la reactividad de unión con las siguientes líneas celulares: figuras 7A-1 y 7A-2, células CHO-DG44; figuras 7B-1 y 7B-2, células CHO-105A; figura 7C, linfocitos de sangre periférica no activados (hPBLs); y figura 7D, linfocitos de sangre periférica activados con AFM.

La figura 8 es una fotografía que representa el análisis de inmunoprecipitación de lisatos de detergente de células T humanas activadas con marcado en la superficie celular, que indica que el anticuerpo monoclonal ES5.2D8 reacciona con una proteína de superficie celular de 27 kD.

La figura 9 representa los aumentos en el volumen celular medio de las células T CD4^{+} después de la estimulación (S1, S2, S3, S4, S5 y S6) con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 y un anticuerpo monoclonal anti-CD28 a lo largo de los días de cultivo.

La figura 10 representa la expresión cíclica de B7-1 en la superficie de células T CD4^{+} después de la estimulación (S1, S2, S3, S4, S5 y S6) con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 y un anticuerpo monoclonal anti-CD28 a lo largo de los días de cultivo.

La figura 11 es un gráfico que representa la cantidad de IL-2 producido por las células T CD4^{+} después de la estimulación con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 y un anticuerpo monoclonal anti-CD28 o IL-2 a lo largo de los días de cultivo.

La figura 12 es un gráfico de barras que representa la cantidad del factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) producidos por las células T CD4^{+} después de la estimulación con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 y un anticuerpo monoclonal anti-CD28 o IL-2 a lo largo de los días de cultivo.

La figura 13 es un gráfico de barras que representa la cantidad del factor de necrosis tumoral (TNF) producido por las células T CD4^{+} después de la estimulación con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 y un anticuerpo monoclonal anti-CD28 o IL-2 a lo largo de los días de cultivo.

La figura 14 es un gráfico de barras que representa la diversidad de receptores de células T (RCT) en células T CD4^{+} después de la estimulación con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 y un anticuerpo monoclonal anti-CD28 a día 1 y a día 24 de cultivo.

La figura 15 representa la tinción de la superficie celular de las células T CD4^{+} obtenidas de un individuo VIH seronegativo después de la estimulación (S1, S2, S3) con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 y un anticuerpo monoclonal anti-CD28 a lo largo de los días de cultivo.

La figura 16 representa la tinción de la superficie celular de las células T CD4^{+} obtenidas de un individuo VIH seropositivo después de la estimulación (S1, S2, S3) con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 y un anticuerpo monoclonal anti-CD28 a lo largo de los días de cultivo.

La figura 17 representa la expansión de células T CD28^{+} después de la estimulación con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 y un anticuerpo monoclonal ES5.2D8 en el día 4 y en el día 7 de cultivo.

Los métodos de esta invención permiten la estimulación selectiva de una población de células T para proliferar y expandir in vitro a niveles significativos en ausencia de factores de crecimiento exógenos o células accesorias. La interacción entre el complejo de receptor de células T (RCT)/CD3 y el antígeno presentado en conjunción con moléculas de clase I o clase II del complejo de histocompatibilidad principal (CPH) en una célula presentadora de antígenos inicia una serie de acontecimientos bioquímicos denominados la activación de células T específica para antígenos. El término "activación de células T" se emplea en la presente memoria para definir un estado en el que la respuesta de una célula T se ha iniciado o activado mediante una señal principal, por ejemplo, mediante el complejo RCT/CD3, pero dicho estado no se debe necesariamente a una interacción con una proteína antigénica. Una célula T se activa si ha recibido un acontecimiento de señalización principal que inicia una respuesta inmunológica de la célula T.

La activación de células T puede conseguirse mediante la estimulación del complejo de la célula T RCT/CD3 o mediante la estimulación de la proteína de superficie CD2. Un anticuerpo monoclonal anti-CD3 puede usarse para activar una población de células T mediante el complejo RCT/CD3. Aunque varios anticuerpos monoclonales anti-CD3 humanos están disponibles comercialmente, se prefiere OKT3 preparado de células hibridomas obtenidas de la Colección Americana de Cultivos Tipo o el anticuerpo monoclonal G19-4. Asimismo, la unión de un anticuerpo anti-CD2 activará las células T. Se conoce y se dispone de formas estimuladoras de los anticuerpos anti-CD2. La estimulación mediante CD2 con anticuerpos anti-CD2 se consigue típicamente con una combinación de al menos dos anticuerpos anti-CD2 distintos. Las combinaciones estimuladoras de anticuerpos anti-CD2 que se han descrito incluyen los siguientes: el anticuerpo T11.3 en combinación con el anticuerpo T11.1 o T11.2 (Meuer, S.C. et al. (1984) Cell 36: 897-906) y el anticuerpo 9.6 (que reconoce el mismo epitopo que el T11.1) en combinación con un anticuerpo 9-1 (Yang, S.Y. et al. (1986) J. Immunol. 137: 1097-1100). Pueden utilizarse también otros anticuerpos que unen a los mismos epitopos que cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente. Anticuerpos adicionales, o combinaciones de anticuerpos, pueden prepararse e identificarse mediante técnicas estándares.

Aunque la estimulación del complejo RCT/CD3 o la molécula CD2 es necesaria para hacer llegar una señal principal de activación a la célula T, un número de moléculas en la superficie de las células T, denominadas moléculas accesorias o coestimuladoras, se han implicado en la regulación de la transición de una célula T en reposo a transformación en un blasto, con la consiguiente proliferación y diferenciación. De este modo, además de la señal principal de activación proporcionada a través del complejo RCT/CD3, la inducción de respuestas de células T requiere una segunda señal coestimuladora. Se cree que una molécula coestimuladora o accesoria, CD28, inicia o regula una vía de transducción de señal que es distinta a las estimuladas por el complejo RCT.

De acuerdo con esto, para inducir la proliferación de una población activada de células T (es decir, una población de células T que ha recibido una señal principal de activación) en ausencia de factores de crecimiento exógenos o células accesorias, una molécula accesoria en la superficie de la célula T, tal como CD28, se estimula con el ligando que une la molécula accesoria o con un agente que actúe de forma intracelular para estimular una señal en la célula T mediada por la unión de una molécula accesoria. En una realización, la estimulación de una molécula accesoria CD28 se consigue haciendo contactar una población de células T activadas con un ligando que une CD28. La activación de células T con, por ejemplo, un anticuerpo anti-CD3 y la estimulación de una molécula accesoria CD28 resulta en la proliferación selectiva de células T CD4^{+}. Un anticuerpo monoclonal CD28 o un fragmento del mismo capaz de entrelazar con la molécula CD28, o un ligando natural de CD28 (por ejemplo, un miembro de la familia B7 de proteínas, tal como B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86) (Freedman, A.S. et al. (1987) J. Immunol. 137: 3260-3267; Freeman, G.J. et al. (1989) J. Immunol. 143: 2714-2722; Freeman, G.J. et al. (1991) J. Exp. Med. 174: 625-631; Freeman, G.J. et al. (1993) Science 262: 909-911; Azuma, M. et al., (1993) Nature 366: 76-79; Freeman G.J. et al. (1993) J. Exp. Med. 178: 2185-2192)) pueden usarse para inducir la estimulación de la molécula CD28. Además, la unión de homólogos de un ligando natural, bien nativo o sintetizado mediante una técnica química o recombinante, puede utilizarse también de acuerdo con la invención. Los ligandos útiles para la estimulación de una molécula accesoria son, de acuerdo con la presente invención, inmovilizados directamente en una superficie sólida. Anticuerpos anti-CD28 o fragmentos del mismo útiles para estimular la proliferación de células T CD4^{+} incluyen el anticuerpo monoclonal 9.3, un anticuerpo IgG2a (Dr Jeffery Ledbetter, Bristol Myers Squibb Corporation, Seattle, WA), un anticuerpo monoclonal KOLT-2, un anticuerpo IgG1, 15E8, un anticuerpo IgG1, 248.23.2, un anticuerpo IgM, y EX5.3D10, un anticuerpo IgG2a.

Un anticuerpo anti-CD28 preferido es el anticuerpo monoclonal 9.3 o EX5.3D10. El anticuerpo monoclonal EX5.3D10 se produce mediante la inmunización de un ratón Balb/c con células de ovario de hámster chino (CHO) transfectadas con el gen humano de CD28 (denominado CHO-hh). Hibridomas de la fusión se seleccionaron mediante un cribado ELISA de células enteras utilizando transfectantes CD28 (leucemia T humana) designados Jurkat #7. Una confirmación adicional de la reactividad del anticuerpo monoclonal EX5.3D10 con CD28 se obtuvo mediante un análisis activado por fluorescencia para clasificación de células (AFCC) en que se ensayó en paralelo con el anticuerpo monoclonal 9.3 (figura 6). Ningún anticuerpo unido a las células CHO-DG44 no transfectadas ni sus perfiles de unión fueron casi idénticos respeto a las dos líneas transfectantes de CD28, CHO-hh y Jurkat #7, así como respeto a linfocitos normales de sangre periférica humana. Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal EX5.3D10 se ha depositado con la Colección Americana de Cultivos Tipo el 4 de junio de 1993, con número ATCC de depósito HB11373.

En otra realización de la invención, una población activada de células T CD4^{+} se estimula para proliferar haciendo contacto entre células T y un agente que actúa de forma intracelular para estimular una señal en la célula T mediada por la ligación de una molécula accesoria, tal como CD28. El término "agente", tal como se emplea aquí, está pensado para comprender sustancias químicas y otros compuestos farmacéuticos que estimulan una señal coestimuladora u otra señal en una célula T sin necesidad de una interacción entre un receptor de superficie de la célula T y una molécula coestimuladora u otro ligando. Por ejemplo, el agente puede actuar de forma intracelular para estimular una señal asociada con la ligación de CD28. En una realización, el agente es un compuesto no proteínico. Dado que se pretende que el agente utilizado en el método no involucre el receptor natural: mecanismo de estimulación del ligando, no se pretende que el término agente incluya una célula que expresa un ligando natural. Ligandos naturales para CD28 incluyen miembros de la familia B7 de proteínas, tales como B7-1 (CD80) y B7-2 (CD86).

Se sabe que la estimulación del receptor de CD28 conduce a la producción de fosfoinositidos en las células T y que la inhibición de la actividad de fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K) en una célula T puede inhibir respuestas de las células T, tales como la producción de linfoquinas y la proliferación celular. Se ha demostrado también que la fosforilación de proteína tirosina ocurre en células T al ligar CD28 y se ha demostrado que un inhibidor de proteína tirosina quinasa, herbimicina A, puede inhibir la producción de IL-2 inducida por CD28 (Vandenberghe, P, et al., (1992) J. Exp. Med. 175: 951-960; Lu Y. et al. (1992) J. Immunol. 149: 24-29). Por lo tanto, para expandir de forma selectiva una población de células T CD4^{+}, la vía mediada por el receptor CD28 puede estimularse mediante el contacto de las células T con un activador de PI3K o con un agente que estimula la fosforilación de proteína tirosina en la célula T, o con ambos. Un activador de PI3K puede identificarse mediante su capacidad para estimular la producción de al menos un fosfoinositida D-3 en una célula T. Con el término "fosfoinositida D-3", se pretende incluir los derivados de fosfatidilinositol que están fosforilados en la posición D-3 del anillo de inositol y comprende los compuestos fosfatidilinositol(-3)-monofosfato (PtdIns(3)P), fosfatidilinositol(3,4)-difosfato (PtInds(3,4)P_{2}) y fosfatidilinositol(3,4,5)-trifosfato (PtdIns(3,4,5)P_{3}). Por lo tanto, en presencia de un activador de PI3K, la cantidad de fosfoinositida D-3 en la célula T se aumenta con respecto a la cantidad de fosfoinositida D-3 en la célula T en ausencia de la sustancia. La producción de fosfoinositidas D-3 (por ejemplo, PtdIns(3)P, PtdIns(3,4)P_{2} y/o PtdIns(3,4,5)P_{3}) en una célula T puede valorarse con métodos estándares tales como la cromatografía líquida de alta presión o la cromatografía en capa fina, tal como se ha descrito anteriormente. Asimismo, la fosforilación de proteína tirosina puede estimularse en una célula T, por ejemplo, mediante el contacto de una célula T con un activador de proteína tirosina quinasa, tales como pervanadato (ver O'Shea, J.J., et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10306-103101; y Secrist, J.P. (1993) J. Biol. Chem. 268: 5886-5893). Como alternativa, la célula T puede hacerse contactar con un agente que inhibe la actividad de una proteína tirosina fosfatasa celular, tal como CD45, para aumentar la cantidad neta de fosforilación de proteína tirosina en la célula T. Cualquiera de estos agentes puede usarse para expandir una población activada de células T CD4^{+} de acuerdo con los métodos aquí descritos.

Para inducir la proliferación y expandir una población de células T CD8^{+}, una población activada de células T se estimula con una molécula accesoria de 27 kD que se encuentra en la superficie de las células T activadas y que es reconocida por el anticuerpo monoclonal ES5.2D8. Tal como se describe en el ejemplo 9, una población de células T CD8^{+} se expandió de forma preferencial mediante la estimulación con un anticuerpo monoclonal anti-CD3 y el anticuerpo monoclonal ES5.2D8. El anticuerpo monoclonal ES5.2D8 se produjo mediante la inmunización de ratones con linfocitos activados de sangre humana y se potenció con la proteína recombinante humana CTLA4 producida en E. Coli. El anticuerpo monoclonal ES5.2D8 es del isotipo IgG2b y se une específicamente a células transfectadas con CTLA4 humano. Hibridomas que producen anticuerpos específicos para CTLA-4 fueron identificados mediante un cribado ELISA usando la proteína humana CTLA4 y también mediante AFCC diferencial usando células CHO-DG44 salvajes contra células CHO-105a, que se transfectan con el gen humano de CTLA4. Tal como se indica en la figura 7, el clon ES5.2D8 reacciona fuertemente tanto con las células T humanas activadas como con las células CHO-105A pero no con las células CHO-DCA4, lo que indica que sí se une a CTLA4. La inmunoprecipitación de lisados de detergente de células T humanas activadas con marcaje en la superficie mostró que ES5.2D8 reacciona también con una proteína de superficie celular de 27 kD (figura 8). El 4 de junio de 1993, un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal ES5.2D8 se depositó con la Colección Americana de Cultivos Tipo con número de depósito ATCC HB11374.

De acuerdo con esto, para expandir una población de células T CD8^{+}, se puede usar un anticuerpo tal como un anticuerpo monoclonal ES5.2D8, u otro anticuerpo que reconoce el mismo ligando de 27 kD que el anticuerpo monoclonal ES5.2D8. Tal como se describe en el ejemplo 10, el epitopo reconocido por el anticuerpo monoclonal ES5.2D8 se identificó mediante el cribado de una biblioteca de visualización de fagos (PDL). Anticuerpos que unen al mismo epitopo que el anticuerpo monoclonal ES5.2D8 están dentro del alcance de la invención. Se pueden producir dichos anticuerpos mediante la inmunización con un fragmento de péptido, incluido el epitopo, o con un antígeno nativo de 27 kD. El término "epitopo" se emplea aquí para referirse a la porción realmente estructural del antígeno que se une inmunológicamente mediante un sitio de combinación del anticuerpo. El término se emplea de forma intercambiable también con "determinante antigénico". Un epitopo preferido que es unido por el anticuerpo u otro ligando que se utiliza para estimular una población de células T CD8^{+} incluye o contiene una secuencia de aminoácidos:

: (Xaa_{1})_{n}-Gly-Xaa_{2}-Trp-Leu-Xaa_{3}-Xaa_{4}-Asp(Glu)-(Xaa_{5})_{n} (SEC ID NÚM.: 5),

en donde Xaa_{4} puede o no puede estar presente, Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3}, Xaa_{4} y Xaa_{5} son cualquier residuo de aminoácido y n = 0-20, más preferiblemente, n = 0-10, y más preferiblemente aún, n = 0-5, y para lo más preferido, n = 0-3. En una realización preferida, Xaa_{2} es Cys o Ile, Xaa_{3} es Leu o Arg y Xaa_{4}, si está presente, es Arg o Pro. Típicamente, Xaa_{1} y Xaa_{4} son residuos de aminoácido encontrados en el lado bien amino o bien carboxi, o bien tanto el lado amino como el lado carboxi, del núcleo del epitopo en la proteína nativa de 27 kD. Los expertos en la materia reconocerán que en la proteína nativa, residuos de aminoácidos adicionales no contiguos pueden contribuir también al epitopo conformacional reconocido por el anticuerpo. Pueden crearse péptidos sintéticos que comprenden el epitopo que incluye otros residuos de aminoácidos flanqueando los siete residuos de aminoácidos centrales (es decir, como alternativa, Xaa puede ser otros residuos de aminoácidos distintos a los encontrados en la proteína nativa). Estos residuos de aminoácidos flanqueadores pueden funcionar para alterar las propiedades del péptido resultante, por ejemplo, para aumentar la solubilidad, potenciar la inmunogenicidad, o promocionar la dimerización del péptido resultante. Cuando el péptido se usa como un inmunógeno, uno o más aminoácidos con carga eléctrica (es decir, lisina, arginina) pueden incluirse para aumentar la solubilidad del péptido y/o potenciar la inmunogenicidad del péptido. Como alternativa, residuos de cisteína pueden incluirse para aumentar la dimerización del péptido resultante.

Otras realizaciones de la invención se refieren a la expansión de una población de células T CD8^{+} mediante el uso de un agente que actúa de forma intracelular para estimular una señal en la célula T mediada por la ligación de una proteína de 27 kD. Tal como se emplea aquí, el término "agente" comprende sustancias químicas y otros compuestos farmacéuticos que estimulan una señal en una célula T sin necesitar una interacción entre un receptor de superficie de una célula T y un ligando. Por lo tanto, este agente no se une a la porción extracelular de la proteína de 27 kD sino imita o induce una señal intracelular (por ejemplo, un segundo mensajero) asociada con la ligación de una proteína mediante un ligando apropiado. Los ligandos aquí descritos (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal ES5.2D8) pueden utilizarse para identificar una(s) señal(es) intracelular(es) asociada(s) con la expansión de células T mediada por el contacto de la proteína de 27 kD con un ligando apropiado (tal como se describe en los ejemplos) con la determinación de la señalización intracelular resultante que ocurre (por ejemplo, la fosforilación de proteína tirosina, el influjo de calcio, la activación de serina/treonina y/o tirosina quinasas, el metabolismo de fosfatidil inositol, etc.). A continuación, un agente que potencia una señal intracelular asociada con la proteína de 27 kD puede utilizarse para expandir las células T CD8^{+}. Como alternativa, agentes (por ejemplo, moléculas pequeñas, fármacos, etc.) pueden cribarse para su capacidad de potenciar la expansión de células T con un sistema tal como el descrito en los ejemplos.

En otro aspecto adicional de la invención, se proporcionan métodos para la expansión de una población de células T específicos para antígenos. Para producir una población de células T específicas para antígenos, las células T se hacen contactar con un antígeno en una forma apropiada para inducir una señal principal de activación en la célula T, es decir, el antígeno se presenta a la célula T de tal forma que se inicie una señal en la célula T mediante el complejo RCT/CD3. Por ejemplo, el antígeno puede presentarse a la célula T mediante una célula presentadora de antígenos en conjunción con una molécula CPH. Una célula presentadora de antígenos tal como una célula B, macrófago, monocito, célula dendrítica, célula de Langerhan, u otra célula que puede presentar un antígeno a la célula T, puede incubarse con la célula T en presencia de un antígeno (por ejemplo, un antígeno soluble) tal que la célula presentadora de antígenos presente el antígeno a la célula T. Como alternativa, una célula que expresa un antígeno de interés puede incubarse junta con una célula T. Por ejemplo, un célula tumoral que expresa antígenos asociados con tumores puede incubarse junto con una célula T para inducir una respuesta específica para el tumor. Asimismo, una célula infectada con un patógeno, por ejemplo, un virus, que presenta los antígenos del patógeno, puede incubarse con la célula T. Después de la activación específica de una población de células T, las células pueden expandirse más, de acuerdo con los métodos descritos en la invención. Por ejemplo, después de establecer la especificidad de antígenos, las células T pueden expandirse mediante el cultivo de un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, de acuerdo con los métodos aquí descritos.

El término "anticuerpo" tal como se emplea en este documento se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de las moléculas de inmunoglobulina, es decir, a moléculas que contienen un sitio de unión de antígenos que une específicamente (inmunorreacciona con) un antígeno, tal como CD3, CD28. Estructuralmente, el anticuerpo más sencillo encontrado en la naturaleza (es decir, IgG) comprende cuadro cadenas de polipéptidos, dos cadenas largas (H) y dos cadenas cortas (L), enlazadas entre sí mediante puentes de disulfido. Se ha demostrado que la función de unión de antígenos de un anticuerpo puede llevarse a cabo con fragmentos de un anticuerpo encontrado en la naturaleza. Por lo tanto, se pretende que estos fragmentos que unen el antígeno se describan también con el término "anticuerpo". Ejemplos de fragmentos de unión comprendidos por el término anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab que consiste en dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iii) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (iv) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341; 544-546) que consiste de un dominio VH; (v) una región determinante complementaria (CDR) aislada; y (vi) un fragmento F(ab')_{2}, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados con un puente disulfido en la región bisagra. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv se codifican con genes diferentes, puede crearse un enlazador sintético que permita que se produzcan como una sola cadena de proteína (conocida como Fv de una sola cadena (seFv); Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; y Huston et al. (1988) PNAS 85: 5879-5883) mediante métodos recombinantes. Estos anticuerpos de una sola cadena también están dentro del alcance del término "anticuerpo". Fragmentos preferidos de anticuerpos para el uso en la expansión de células T son los que son capaces de entrelazarse con su antígeno diana, por ejemplo, fragmentos bivalentes como los fragmentos F(ab')_{2}. De forma alternativa, un fragmento de anticuerpo que no se entrelaza él mismo con su antígeno diana (por ejemplo, un fragmento Fab) puede usarse en conjunción con un anticuerpo secundario que sirve para entrelazarse con el fragmento de anticuerpo, con lo que el antígeno diana está entrelazado. Los anticuerpos pueden fragmentarse mediante técnicas convencionales tales como las aquí descritas y los fragmentos pueden cribarse para posible utilidad de la misma manera que se ha descrito para anticuerpos enteros. Se pretende además que un anticuerpo de la invención incluya moléculas biespecíficas y quiméricas con la porción deseada de unión (por ejemplo, CD28).

La expresión "una especificad de unión deseada para un epitopo", junto con la expresión más general "un sitio de unión de antígenos que unen específicamente (inmunorreacciona con)" se refiere a la capacidad de anticuerpos individuales de inmunorreaccionar específicamente con una molécula de superficie de la célula T, por ejemplo, CD28. Es decir, se refiere a una reacción de unión no aleatoria entre una molécula de anticuerpo y un determinante antigénico de la molécula de la superficie de la célula T. La especificidad de unión deseada se determina típicamente con el punto de referencia de la capacidad del anticuerpo para unirse diferencialmente a la molécula de superficie de la célula T y a un antígeno no relacionado, y por lo tanto, de distinguir entre dos antígenos distintos, especialmente cuando los dos antígenos tienen epitopos únicos. Se refiere a un anticuerpo que une específicamente a un epitopo particular como un "anticuerpo específico".

Un "sitio de combinación del anticuerpo", tal como se emplea aquí, se refiere a la porción estructural de una molécula de anticuerpo que comprende regiones de cadena larga variable y de cadena corta hipervariable que une específicamente (inmunorreaccionan con) el antígeno. El término "inmunorreaccionar" o "reactivo con" en sus varias formas se utiliza aquí para referirse a la unión entre una molécula que contiene un determinante antigénico y una molécula que contiene un sitio de combinación del anticuerpo tal como una molécula de anticuerpo entero o una porción del mismo.

Según la presente invención, el anticuerpo anti-CD3 se inmoviliza directamente en la superficie de la fase sólida (por ejemplo, perlas). Un anticuerpo puede inmovilizarse directamente o indirectamente mediante, por ejemplo, un anticuerpo secundario, una superficie sólida, tal como un matraz para el cultivo de tejido o una perla. Como una realización ilustrativa, se describe a continuación un protocolo para la inmovilización de un anticuerpo anti-CD3 en perlas. Debe tenerse en cuenta que el mismo protocolo puede utilizarse para inmovilizar otros anticuerpos o fragmentos de los mismos (por ejemplo, un anticuerpo anti-CD28) en perlas.

Protocolos I. La pre-absorción de IgG anti-ratón de cabra con OKT-3

A): Se incuba BioMag IgG anti-ratón de cabra (Advanced Magetics, Inc., número de catálogo 8-4340D) con al menos 200 \mug de OKT-3 por cada 5 x 10^{8} partículas magnéticas en PBS durante 1 hora a 5ºC.

B): Las partículas se lavan tres veces en PBS con la ayuda de una unidad magnética de separación.

: Nota: Advanced Magetics tiene también un anti-CD3 humano directamente conjugado (número de catálogo 8-4703N) que inducirá la estimulación de células T.

II. El pre-marcaje de linfocitos con OKT-3

A): Se incuban 1 x 10^{6} células (PBMC) en PBS con 10 \mug/ml de OKT-3 durante 15 minutos a temperatura ambiente.

B): Las células se lavan dos veces con PBS.

III. La unión de partículas magnéticas a PBMC para la estimulación

A): Las PBMC marcadas en la superficie con OKT-3 se cultivan con IgG anti-ratón de cabra (ver arriba) a una perla por célula después de una incubación de 30 minutos a 20ºC con agitación suave.

B): Las perlas de IgG anti-ratón de cabra a las que previamente se había absorbido OKT-3 se incuban con PBMC (1:1) durante 30 minutos a 20ºC con agitación suave y se cultivan.

IV. La unión de partículas magnéticas a PBMC para su separación

: Lo mismo que antes (la parte III) salvo que la relación de perlas a células se aumenta a 20:1 en vez de 1:1.

Para aplicar el método de la invención, la fuente de células T se obtiene de un sujeto. Con el término sujeto, se pretende incluir organismos vivos en los que se puede conseguir una respuesta inmunológica, por ejemplo, mamíferos. Ejemplos de sujetos incluyen humanos, perros, gatos, ratones, ratas, y especies transgénicas de los mismos. Las células T pueden obtenerse de una variedad de fuentes que incluyen leucocitos de sangre periférica, médula ósea, tejido de nódulos linfáticos, tejido esplénico, y tumores. Preferiblemente, los leucocitos de sangre periférica se obtienen de un individuo mediante leucoferesis. Para aislar las células T de los leucocitos de sangre periférica, puede ser necesario lisar los glóbulos rojos y separar los leucocitos de sangre periférica de los monocitos mediante una centrifugación a través de un gradiente PERCOLL^{TM}, por ejemplo. Una subpoblación de células T, tales como células T CD4^{+} o CD8^{+}, pueden aislarse más mediante técnicas de selección positiva o negativa. Por ejemplo, la selección negativa de una población de células T puede llevarse a cabo con una combinación de anticuerpos dirigidos contra los marcadores de superficie que son únicos para las células negativamente seleccionadas. Un método preferido es la clasificación de células mediante inmunoadherencia magnética negativa que utiliza una mezcla de anticuerpos monoclonales dirigidos contra los marcadores celulares de superficie presentes en las células negativamente seleccionadas. Por ejemplo, para aislar células CD4^{+}, una mezcla de anticuerpos monoclonales típicamente incluye anticuerpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, y CD8. Mezclas adicionales de anticuerpos se proporcionan en la tabla 1.

El proceso de selección negativa resulta en una población esencialmente homogénea de células T CD4^{+} o CD8^{+}. Las células pueden activarse tal como se describe aquí, por ejemplo mediante el contacto con un anticuerpo anti-CD3 inmovilizado en una superficie de fase sólida o un anticuerpo anti-CD2. Para estimular una molécula accesoria en la superficie de las células T, se utiliza un ligando que une la molécula accesoria. Por ejemplo, una población de células CD4^{+} puede contactarse con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, en condiciones apropiadas para estimular la proliferación de las células T. Asimismo, para estimular la proliferación de células T CD8^{+}, puede usarse un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo monoclonal ES5.2D8. Las condiciones indicadas para el cultivo de las células T incluyen un medio apropiado (por ejemplo, el medio mínimo esencial o el medio RPMI 1640) que puede contener factores necesarios para la proliferación y viabilidad, entre otros el suero animal (por ejemplo, suero fetal bovino) y antibióticos (por ejemplo, penicilina estreptomicina). Las células T se mantienen en condiciones necesarias para sostener el crecimiento, por ejemplo a una temperatura indicada (por ejemplo, 37ºC) y bajo una atmósfera indicada (por ejemplo, aire más 5% CO_{2}).

Para mantener la estimulación a largo plazo de una población de células T después de la activación y estimulación inicial, es preciso separar las células T del estímulo de activación (por ejemplo, el anticuerpo anti-CD3) después de un periodo de exposición. Las células T se mantienen en contacto con el ligando co-estimulador durante todo el periodo de cultivo. La velocidad de proliferación de las células T se vigila regularmente (por ejemplo, a diario) determinando, por ejemplo, el tamaño de las células T o midiendo el volumen de dichas células con, por ejemplo, un contador de Coulter. Una célula T en reposo tiene un diámetro medio de aproximadamente 6,8 micrones. Después de la activación y estimulación inicial y en presencia de un ligando estimulador, para el día 4, el diámetro de la célula T habrá aumentado a más de 12 micrones y luego se empezará a reducir aproximadamente en el día 6. Cuando un diámetro medio de las células T se reduce a aproximadamente 8 micrones, las células T están reactivadas y reestimuladas para inducir proliferación adicional de las células T. Como alternativa, la velocidad de la proliferación de las células T y el tiempo para la reestimulación de las células T pueden vigilarse mediante un ensayo para la presencia de moléculas de superficie celular, tales como B7-1 y B7-2, que se inducen en la superficie de células T activadas. Tal como se describe en el ejemplo 5, se determinó que las células T CD4^{+} no expresan inicialmente el receptor B7-1, y que al cultivarlas, se induce la expresión. Es más, se encontró que la expresión de B7-1 es transitoria, y que se pude reinducir con reestimulación repetida con anti-CD3. De acuerdo con esto, cambios cíclicos en la expresión de B7-1 pueden utilizarse como una forma de vigilar la proliferación de células T; donde reducciones en el nivel de expresión de B7-1 con respecto al nivel de expresión después de una estimulación inicial o previa o al nivel de expresión en las células no estimulada indican el tiempo de reestimulación.

Para inducir la estimulación a largo plazo de una población de células CD4^{+} o CD8^{+}, puede ser necesario reactivar o reestimular las células T con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 o anticuerpo monoclonal ES5.2D8 varias veces con tal de producir una población de células CD4^{+} o CD8^{+} con números incrementados por un factor de aproximadamente 10 veces a 1000 veces con respecto a la población original de células T. Siguiendo esta metodología, es posible conseguir aumentos en la población de células T desde aproximadamente 100 veces hasta aproximadamente 100.000 veces con respecto a la población inicial de células T en reposo. Además, tal como se describe en el ejemplo 6, las células T expandidas mediante el método de la invención secretan altos niveles de citoquinas (por ejemplo, IL-2, IFN\gamma, IL-4, GM-CSF y TNF\alpha) a los sobrenadantes de los cultivos. Por ejemplo, en comparición con la estimulación con IL-2, células T CD4^{+} expandidas mediante el uso de co-estimulación de anti-CD3 y anti-CD28 secretan altos niveles de GM-CSF y TNF\alpha al medio de cultivo. Estas citoquinas pueden purificarse del cultivo de sobrenadantes o los sobrenadantes pueden usarse directamente para mantener las células en el cultivo. Asimismo, las células T expandidas mediante el método de la invención junto con el sobrenadante del cultivo y las citoquinas pueden administrarse para sostener el crecimiento de las células in vivo. Por ejemplo, en pacientes con tumores, las células T pueden obtenerse de un individuo, expandirse in vitro, y la población de células T y el sobrenadante resultantes, que incluyen citoquinas tales como el TNF\alpha, pueden readministrarse al paciente con tal de aumentar el crecimiento de células T in vivo.

Aunque los anticuerpos utilizados en los métodos descritos en este documento pueden obtenerse fácilmente de fuentes públicas, tales como la ATCC, los anticuerpos de las moléculas accesorias de superficie de las células T, el complejo CD3 o CD2 pueden producirse con técnicas estándares. Las metodologías para generar los anticuerpos para usar en los métodos de la invención se describen en detalle a continuación.

I. Producción de anticuerpos A. El inmunógeno

El término "inmunógeno" se emplea aquí para describir una composición que contiene un péptido o una proteína como un principio activo utilizado para la preparación de anticuerpos contra un antígeno (por ejemplo, CD3, CD28). Cuando un péptido o una proteína se utiliza para inducir anticuerpos, se entiende que los péptidos pueden emplearse solos, o enlazados con un vehículo tal como un conjugado o como un polímero peptídico.

Para generar anticuerpos apropiados, el inmunógeno debe contener una cantidad inmunológicamente efectiva de un péptido o una proteína, opcionalmente como un conjugado enlazado con un vehículo. La cantidad efectiva de péptido por unidad de dosis depende de, entre otras cosas, la especie de animal que se inocula, el peso corporal del animal y el régimen de inmunización elegido, tal como se conoce en el estado de la técnica. La preparación de inmunógeno típicamente contendrá concentraciones de péptido de aproximadamente 10 microgramos hasta aproximadamente 500 miligramos por dosis de inmunización, preferiblemente aproximadamente 50 microgramos hasta aproximadamente 50 miligramos por dosis. Una preparación de inmunización puede incluir también un adyuvante como parte del diluente. Adyuvantes tales como el adyuvante completo de Freund (CFA), el adyuvante incompleto de Freund (IFA) y alumbre son materiales bien conocidos en el estado de la técnica, y están disponibles en una variedad de fuentes.

Aquellos expertos en la técnica apreciarán que, en vez de las formas del antígeno encontradas en la naturaleza (por ejemplo, CD3, CD28) para inmunización, los péptidos sintéticos pueden emplearse como alternativa, y se pueden producir anticuerpos para estos péptidos para el uso en esta invención. Formas tanto solubles como ancladas en la membrana de la proteína o los fragmentos peptídicos están indicados para el uso como un inmunógeno y pueden aislarse también mediante la purificación por inmunoafinidad. Una forma purificada de proteína, como la que se puede aislar tal como se ha descrito anteriormente o tal como se conoce en el estado de la técnica, puede emplearse directamente como un inmunógeno, o como alternativa, se puede enlazar con un vehículo proteico indicado mediante técnicas convencionales, que incluyen el acoplamiento químico y la ingeniería genética con un gen clonado de la proteína. La proteína purificada puede también estar sujeta a modificaciones covalentes o no covalentes con materiales no proteicos tales como lípidos o hidratos de carbono para potenciar la inmunogenicidad o la solubilidad. Como alternativa, una proteína purificada puede acoplarse con o incorporarse en una partícula viral, un virus replicante, u otro microorganismo con tal de potenciar la inmunogenicidad. La proteína puede, por ejemplo, sujetarse químicamente a la partícula viral o al microorganismo o a la porción inmunogénica del mismo.

En una realización ilustrativa, una proteína CD28 purificada, o un fragmento peptídico del mismo (por ejemplo, producido mediante la técnica de proteolisis limitada o ADN recombinante) se conjuga con un vehículo que es inmunogénico en animales. Los vehículos preferidos incluyen las proteínas tales como las albúminas, las proteínas séricas (por ejemplo, las globulinas y lipoproteínas), y poliaminoácidos. Ejemplos de proteínas útiles incluyen albúmina sérica bovina, albúmina sérica de conejo, tiroglobulina, hemocianina de lapa californiana, ovoalbúmina de huevo, y gama-globulinas bovinas. Los poliaminoácidos sintéticos tales como la polilisina o poliarginina también son vehículos útiles. Con respecto a la sujeción covalente de la proteína CD28 o de fragmentos peptídicos a un vehículo inmunogénico apropiado, existe un número de agentes de entrelazamiento conocidos por los expertos en la técnica, que incluyen succinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohexano-1-carboxilato (SMCC), éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimido (MBS); N-succinimidil (4-iooacetil)aminobenzoato (SIAB), succinimidil 4-(p-maleimidofenil)butirato (SMPB), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimido (EDC); 4-succinimidil-oxicarbonil-a-metil-a-(2-piridilditio)-tolueno (SMPT), n-succinimidil 3-(piridilditio)propionato (SPDP), succinimidil 6-[3-(2-piridilditio)propionato]hexanoato (LC-SPDP).

También puede resultar ventajoso simplemente inmunizar un animal con células enteras que expresen una proteína de interés (por ejemplo, CD28) en su superficie. Varias líneas celulares pueden usarse como inmunógenos para generar anticuerpos monoclonales de un antígeno que incluyen, pero no se limitan a, las células T. Por ejemplo, las células T de sangre periférica pueden obtenerse de un sujeto que expresan CD28 constitutivamente, pero que pueden activarse in vitro con anticuerpos anti-CD3, PHA, o AFM. Como alternativa, un clon de una célula T específica para antígenos (por ejemplo, una célula T aloreactiva) puede activarse para expresar CD28 mediante la presentación de un antígeno, junto con una señal co-estimuladora, a la célula T. Células enteras que pueden emplearse como inmunógenos para producir anticuerpos específicos para CD28 también incluyen transfectantes recombinantes. Por ejemplo, células COS y CHO pueden reconstituirse mediante la transfección con un ADNc CD28 para producir células que expresan CD28 en su superficie. Estas células transfectantes pueden luego emplearse como inmunógenos para producir anticuerpos anti-CD28. Otros ejemplos de células transfectantes son conocidas, especialmente células eucarióticas capaces de glicosilar la proteína CD28, pero cualquier procedimiento que actúe para expresar los genes de CD28 transfectados en la superficie de la célula podría usarse para producir el inmunógeno de la célula entera.

Como alternativa a una célula que expresa el CD28 o una proteína aislada de CD28, fragmentos peptídicos de CD28 u otro antígeno de superficie como el antígeno de 27 kD pueden emplearse como inmunógenos para generar anticuerpos. Por ejemplo, el epitopo unido por el anticuerpo monoclonal ES5.2D8 comprende una secuencia de aminoácidos: (Xaa_{1})_{n}-Gly-Xaa_{2}-Trp-Leu-Xaa_{3}-Xaa_{4}-Asp(Glu)-(Xaa_{5})_{n} (SEC ID Nº: 5), en donde Xaa_{4} puede o no puede estar presente, Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3}, Xaa_{4} y Xaa_{5} son cualquier residuo de aminoácido y n = 0-20, más preferiblemente, n = 0-10, y más preferiblemente aún, n = 0-5, y para lo más preferido, n = 0-3. En una realización preferida, Xaa_{2} es Cys o Ile, Xaa_{3} es Leu o Arg y Xaa_{4}, si está presente, es Arg o Pro. Por tanto, un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de SEC Nº: 5 puede emplearse como un inmunógeno. De acuerdo con esto, la invención también comprende un péptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos (Xaa_{1})_{n}-Gly-Xaa_{2}-Trp-Leu-Xaa_{3}-Xaa_{4}-Asp(Glu)-(Xaa_{5})_{n} (SEC ID Nº: 5), en donde Xaa_{4} puede o no puede estar presente, Xaa_{1}, Xaa_{2}, Xaa_{3}, Xaa_{4} y Xaa_{5} son cualquier residuo de aminoácido y n = 0-20, más preferiblemente, n = 0-10, y más preferiblemente aún, n = 0-5, y para lo más preferido, n = 0-3. En una realización preferida, Xaa_{2} es Cys o Ile, Xaa_{3} es Leu o Arg y Xaa_{4}, si presente, es Arg o Pro. Como alternativa, se ha encontrado que el anticuerpo monoclonal ES5.2D8 reacciona de forma cruzada con un número de otras secuencias peptídicas (determinadas mediante tecnología de visualización de fagos tal como se describe en el ejemplo 3). Ejemplos de estas otras secuencias se muestran a continuación:

2D8#2 (SEC ID Nº 1) H Q F C D H W G C W L L R E T H I F T P

2D8#4 (SEC ID Nº 2) H Q F C D H W G C W L L R E T H I F T P

2D8#10 (SEC ID Nº 3) H Q F C D H W G C W L L R E T H I F T P

2D8#6 (SEC ID Nº 4) L R L V L E D P G I W L R P D Y F F P A

Cualquiera de estos péptidos, u otros péptidos que contienen una región de siete aminoácidos indicados en negrita (que representan el epitopo unido por el anticuerpo) posiblemente flanqueados por residuos de aminoácidos alternativos, pueden usarse también como inmunógenos para producir un anticuerpo para el uso en los métodos de la invención y están en el alcance de la invención. Para el uso como inmunógenos, los péptidos pueden modificarse para aumentar la solubilidad y/o potenciar la inmunogenicidad tal como se ha descrito anteriormente.

B. Anticuerpos policlonales

Los anticuerpos policlonales de una proteína purificada o un fragmento del péptido del mismo pueden generarse generalmente en animales mediante inyecciones múltiples subcutáneas (sc) o intraperitoneales (ip) de un inmunógeno apropiado, tal como el dominio extracelular de la proteína, y un adyuvante. Un antisuero policlonal puede producirse, por ejemplo, tal como se describe en Lindsten T. et al. (1993) J. Immunol. 151: 3489-3499. En una realización ilustrativa, típicamente, los animales se inmunizan contra la proteína, el péptido o el derivado inmunogénico mediante la combinación de aproximadamente 1 \mug a 1 mg de proteína con el adyuvante completo de Freund y la inyección intradermal de la solución en sitios múltiples. Después de un mes, los animales reciben una inyección de recuerdo con 1/5 a 1/10 de la cantidad inicial de inmunógeno en el adyuvante completo de Freund (u otro adyuvante apropiado) mediante la inyección subcutánea en sitios múltiples. Después de siete a 14 días, se extrae sangre de los animales y el suero se ensaya para una fracción anti-proteína o anti-péptido (por ejemplo, mediante ELISA). Los animales reciben inyecciones de recuerdo hasta alcanzar una fracción estable. Además, la adición de agentes tales como alumbre puede usarse para potenciar la respuesta inmunológica.

Estas poblaciones mamíferas de moléculas de anticuerpos se denominan "policlonales" porque la población comprende anticuerpos con inmunoespecifidades y afinidades diferentes para el antígeno. A continuación, las moléculas de anticuerpos se recogen del mamífero (por ejemplo, de la sangre) y se aíslan mediante técnicas conocidas, tales como la cromatografía de proteína A, para obtener la fracción de IgG. Para potenciar la especificad del anticuerpo, los anticuerpos pueden purificarse mediante la cromatografía de inmunoafinidad con inmunógeno sujeto a fase sólida. Se hace contactar el anticuerpo con el inmunogeno sujeto a la fase sólida durante un periodo de tiempo suficiente para que el inmunógeno inmunorreaccione con las moléculas de anticuerpos para formar un inmunocomplejo sujeto a la fase sólida. Los anticuerpos unidos se separan del complejo mediante técnicas estándares.

C. Anticuerpos monoclonales

El término "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpos monoclonales", tal como se emplea aquí, se refiere a una población de moléculas de anticuerpos que contienen sólo un tipo de sitio de unión de antígenos capaz de inmunorreaccionar con un epitopo particular de un antígeno. Por lo tanto, una composición de anticuerpos monoclonales típicamente muestra una afinidad de unión unitaria para una proteína particular con la que inmunorreacciona. Preferiblemente, el anticuerpo monoclonal empleado en el método sujeto de la invención se caracteriza más porque inmunorreacciona con una proteína derivada de humanos.

Los anticuerpos monoclonales útiles en los métodos de la invención se dirigen contra un epitopo de el/los antí-
geno(s) en las células T, tal que la formación de un complejo entre el anticuerpo y el antígeno (también denominado aquí como ligación) induce la estimulación y expansión de las células T. Un anticuerpo monoclonal de un epitopo de un antígeno (por ejemplo, CD3, CD238) puede prepararse mediante una técnica que proporciona la producción de moléculas de anticuerpos con líneas celulares continuas en cultivo. Éstas incluyen, pero no se limitan a, la técnica de hibridomas descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256: 495-497), y, más reciente, la técnica de hibridomas de células B humanas (Kozbor et al., (1983) Immunol. Today 4: 72), la técnica EBV-hibridoma (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., p77-96), y técnicas de triomas. Otros métodos que pueden eficazmente proporcionar anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención incluyen técnicas de display de fagos (Marks et al. (1992) J Biol Chem 16007-16010).

En una realización, la preparación del anticuerpo administrada en el método sujeto de la presente invención es un anticuerpo monoclonal producido por una línea celular hibridoma. Las técnicas hibridomas de fusión fueron introducidas por primera vez por Köhler y Milstein (Köhler et al. Nature (1975) 265: 495-97; Brown et al. (1981) J. Immunol. 127: 539-46; Brown et al. (1980) J. Biol. Chem. 255: 4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76: 2927-31; y Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29: 269-75). Por tanto, las composiciones de anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden producirse mediante el siguiente método, que comprende:

(a) La inmunización de un animal con una proteína (por ejemplo, CD28) o un péptido del mismo. La inmunización típicamente se efectúa administrando una cantidad inmunológicamente efectiva, es decir, una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunológica, del inmunógeno a un mamífero inmunológicamente inmunocompetente. Preferiblemente, el mamífero es un roedor tal como un conejo, una rata, o un ratón. A continuación, el mamífero se mantiene durante un periodo de tiempo suficiente para que produzca células que secretan las moléculas de anticuerpos que inmunorreaccionan con el inmunógeno. La inmunorreacción se detecta mediante un cribado de las moléculas de anticuerpos producidos de este modo con respeto a inmunorreactividad con una preparación de la proteína inmunogénico. Opcionalmente, puede ser deseable cribar las moléculas de anticuerpos con una preparación de la proteína en la forma en que será detectada por las moléculas de anticuerpos en un ensayo, por ejemplo, una forma del antígeno asociada a la membrana (por ejemplo, CD28). Estos métodos de cribado, por ejemplo, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y/o citometría de flujo, son conocidos por los expertos en la materia.

(b) Una suspensión de células que producen anticuerpos extraídos de cada mamífero inmunizado que secreta el anticuerpo deseado se prepara a continuación. Después de un periodo de tiempo suficiente, el ratón se sacrifica para obtener los linfocitos somáticos productores de anticuerpos. Las células productoras de anticuerpos pueden derivarse de los nodos linfáticos, los bazos, y la sangre periférica de animales cebados.

Se prefieren las células esplénicas, que pueden separarse con métodos mecánicos conocidos en el estado de la técnica en células individuales en un medio tolerado fisiológicamente. Los linfocitos del ratón proporcionan un porcentaje más alto de fusiones estables con los mielomas del ratón descritos más adelante. Pueden utilizarse también células somáticas de rata, conejo o rana. Los cromosomas que codifican las inmunoglobulinas deseadas se inmortalizan fusionando las células esplénicas con las células de mieloma, generalmente en presencia de un agente de fusión tal como el polietilenglicol (PEG). Cualquiera de una variedad de líneas celulares de mieloma puede utilizarse como pareja de fusión según las técnicas estándares; por ejemplo, las líneas P3-BS1/1-Ag4-1, P3x63-Ag8.653 o Sp2/0-Ag14 de mieloma. Estas líneas de mieloma están disponibles en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Rockville, Md.

Las células resultantes, que incluyen los hibridomas deseados, se cultivan a continuación en un medio selectivo, tal como el medio HAT, en el que finalmente mueren las células paternas de mieloma o linfocito. Sólo las células hibridomas sobreviven y pueden cultivarse en condiciones de dilución limitantes para obtener los clones aislados. Los sobrenadantes de los hibridomas se criban para la presencia del anticuerpo con la especificidad deseada, por ejemplo, mediante técnicas de inmunoensayo con el antígeno que se ha utilizado para la inmunización. A continuación, los clones positivos pueden subclonarse en condiciones de dilución limitantes y el anticuerpo monoclonal producido puede aislarse. Existen varios métodos convencionales para el aislamiento y la purificación de los anticuerpos monoclonales con tal de librarles de las otras proteínas y otros contaminantes. Los métodos empleados frecuentemente para la purificación de anticuerpos monoclonales incluyen precipitación con sulfato de amonio, cromatografía de intercambio iónico, y cromatografía de afinidad (ver por ejemplo, Zola et al. en Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques And Applications, Burell (ed.) p51-52 (CRC Press 1982)). Los hibridomas producidos según estos métodos pueden propagarse in vitro o in vivo (en el líquido ascítico) con técnicas conocidas en el estado de la técnica.

Generalmente, la línea celular individual puede propagarse in vitro, por ejemplo, en recipientes de cultivo en el laboratorio, y el medio de cultivo que contiene altas concentraciones de un solo anticuerpo monoclonal específico puede recogerse mediante la decantación, filtración o centrifugación. Como alternativa, el rendimiento de un anticuerpo monoclonal puede potenciarse mediante la inyección de una muestra del hibridoma en un animal histocompatible del tipo empleado para proporcionar las células somáticas y de mieloma para la fusión original. Los tumores que secretan el anticuerpo monoclonal específico producidos por el híbrido celular fusionado se desarrollan en el animal inyectado. Los líquidos corporales del animal, tales como el líquido ascítico o el suero, proporcionan los anticuerpos monoclonales en concentraciones altas. Cuando se emplean hibridomas humanos o EBV-hibridomas, es necesario evitar el rechazo del xenoinjerto inyectado en animales tales como ratones. Pueden usarse los ratones inmunodeficientes o lampiños, o el hibridoma puede introducirse primero en un ratón lampiño irradiado como un tumor subcutáneo sólido, cultivarse in vitro y luego inyectarse de forma intraperitoneal en los ratones lampiños irradiados previamente sensibilizados con pristano, que desarrollan tumores ascíticos que secretan altas cantidades de los anticuerpos monoclonales específicos humanos.

Tanto los medios como los animales útiles para la preparación de estas composiciones son conocidos en el estado de la técnica y están disponibles comercialmente, e incluyen medios de cultivo sintéticos, ratones endogámicos, y parecidos. Un ejemplo de un medio sintético es el medio mínimo esencial de Dulbecco (DMEM; Dulbecco et al. (1959) Virol. 8: 396) suplementado con 4,5 gm/l de glucosa, 20 mM de glutamina, y 20% del suero fetal bovino. Un ejemplo de una cepa de ratón endogámico es el Balb/c.

D. Anticuerpos combinatorios

Las composiciones de anticuerpos monoclonales de la invención pueden producirse también con otros métodos conocidos por los expertos en tecnología de ADN recombinante. Un método alternativo, denominado el método de la "visualización combinatoria de anticuerpos", se ha desarrollado para identificar y aislar los fragmentos de anticuerpos que tienen una especificidad antigénica concreta, y que pueden emplearse para producir los anticuerpos monoclonales (para descripciones de la visualización combinatoria de anticuerpos, ver por ejemplo, Sastry et al. (1989) PNAS 86: 5728; Huse et al. (1989) Science 246: 1275; y Orlandi et al. (1989) PNAS 86: 3833). Después de inmunizar un animal con un inmunógeno apropiado (por ejemplo, CD3, CD28) tal como se ha descrito anteriormente, se clona el repertorio del conjunto de células B. Generalmente, se conocen métodos para obtener una secuencia de ADN de las regiones variables de una población diversa de moléculas de inmunoglobulina mediante la mezcla de cebadores oligoméricos y RCP. Por ejemplo, una mezcla de cebadores oligoméricos que corresponden a las secuencias líder 5' (péptido señal) y/o las secuencias del marco 1 (FR1), así como el cebador de un cebador de una región conservada constante 3' puede usarse para la amplificación por RCP de regiones de cadena larga y corta de un número de anticuerpos murinos (Larrick et al. (1991) Biotechniques 11: 152-156). Una estrategia similar puede aplicarse también para la amplificación de regiones variables humanas de cadena larga y corta de anticuerpos humanos (Larrick et al. (1991) Methods: Companion to Methods in Enzymology 2: 106-110).

En una realización ilustrativa, se aísla el ARN de células B activadas de, por ejemplo, células de sangre periférica, la medula ósea, o preparaciones esplénicas, con protocolos estándares (por ejemplo, la patente estadounidense número 4,683,202; Orlando, et al. PNAS (1989) 86: 3833-3837; Sastry et al., PNAS (1989) 86: 5728-5732; y Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281). Se sintetiza la primera hebra de ADN con cebadores específicos para la región constante de la(s) cadena(s) larga(s) y cada una de las cadenas cortas \kappa y \lambda, así como los cebadores de la secuencia señal. Utilizando cebadores de región variable de RCP, las regiones variables de las cadenas tanto largas como cortas se amplifican, bien solas o en combinación, se ligan en los vectores apropiados para manipulación adicional con tal de generar los paquetes de visualización. Los cebadores de oligonucleótidos útiles en protocolos de amplificación pueden ser únicos o degenerados o incorporar inosina en posiciones degeneradas. Secuencias que reconocen endonucleasa de restricción pueden incorporarse también en los cebadores para permitir la clonación del fragmento amplificado en un vector en un marco de lectura predeterminado para la expresión.

La biblioteca de genes V clonada de la gama de anticuerpos derivados de inmunización puede expresarse mediante una población de paquetes de visualización, preferiblemente derivada de un fago filamentoso, para formar una biblioteca de visualización de anticuerpos. Lo ideal es que el paquete de visualización comprenda un sistema que permita el muestreo de bibliotecas variegadas de visualización de anticuerpos muy grandes, una clasificación rápida después de cada paso de separación de afinidad, y un aislamiento fácil del gen del anticuerpo de los paquetes de purificación purificados. Además de los equipos disponibles comercialmente para generar bibliotecas de visualización de fagos (por ejemplo, el Recombinant Phage Antibody System de Pharmacia, número de catálogo 27-9400-01); y el equipo de visualización de fagos SurfZAP^{TM} de Stratagene, número de catálogo 240612), ejemplos de los métodos y reactivos especialmente susceptibles de emplear en la generación de una biblioteca variegada de visualización de fagos pueden encontrarse en, por ejemplo, Ladner et al. patente estadounidense número 5,223,409; Kang et al. Publicación internacional número WO 92/15679; Dower et al. Publicación internacional número WO 91/17271; Winter et al. Publicación internacional número WO 92/20791; Markland et al. Publicación internacional número WO 92/15679; Breitling et al. Publicación internacional número WO 93/01288; McCafferty et al. Publicación internacional número WO 92/01047; Garrard et al. Publicación internacional número WO 92/090690; Ladner et al. Publicación internacional número WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod. Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol Biol 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982.

En ciertas realizaciones, los dominios de la región V de cadenas largas y cortas pueden expresarse en el mismo polipéptido, unido por un enlace flexible para formar un fragmento monocatenario Fv, y el gen scFV puede clonarse a continuación en el vector de expresión deseado o en el genoma del fago. Tal como se describe de forma general en McCafferty et al., Nature (1990) 348: 552-554, los dominios completos V_{H} y V_{L} de un anticuerpo, unidos por un enlace flexible (Gly_{4}-Ser)_{3} pueden utilizarse para producir un anticuerpo monocatenario para permitir la separación del paquete de visualización, basándose en la afinidad antigénica. Anticuerpos scFV aislados que son inmunorreactivos con el antígeno pueden formularse a continuación en una preparación farmacéutica para el uso en el método objeto de la presente invención.

Una vez visualizada en la superficie del paquete de visualización (por ejemplo, el fago filamentoso), la biblioteca de anticuerpos se criba con la proteína, o el fragmento peptídico de la misma, para identificar y aislar los paquetes que expresan un anticuerpo con una especificidad para la proteína. El ácido nucleico que codifica el anticuerpo seleccionado puede recuperarse del paquete de visualización (por ejemplo, del genoma del fago) y subclonarse en otros vectores de expresión mediante técnicas estándares de ADN recombinantes.

E. Hibridomas y métodos de preparación

Los hibridomas útiles en la presente invención son los caracterizados por su capacidad de producir un anticuerpo monoclonal que se inmunorreacciona específicamente con un antígeno de interés (por ejemplo, CD3, CD28). Los métodos para generar los hibridomas que producen, es decir, secretan, las moléculas de anticuerpos con una inmunospecificidad deseada, por ejemplo, con la capacidad de inmunorreaccionar con el antígeno CD28, y/o un epitopo identificable de CD28 son conocidos en el estado de la técnica. Especialmente aplicable es la tecnología hibridoma descrita en Niman et al. (1983) PNAS 80: 4949-4953, y en Galfre et al. (1981) Meth. Enzymol. 73: 3-46.

II. Usos de los métodos de la invención

El método de la invención puede usarse para expandir selectivamente una población de células T CD4^{+} o CD8^{+} para el uso en el tratamiento de enfermedades infecciosas, el cáncer, y la inmunoterapia. Como resultado del método aquí descrito, se puede producir una población de células T que es policlonal con respeto a la reactividad del antígeno, pero esencialmente homogénea con respeto a bien CD4^{+} o CD8^{+}. Además, el método permite la expansión de una población de células T a un número suficiente como para reconstituir la población total de células T CD4^{+} o CD8^{+} de un individuo (la población de linfocitos en un individuo es aproximadamente 10^{11}). La población resultante de células T puede transducirse genéticamente para el uso en la inmunoterapia o se puede usar en métodos de análisis in vitro de agentes infecciosos. Por ejemplo, una población de linfocitos infiltrantes de tumores puede obtenerse de un individuo con cáncer y las células T pueden estimularse para proliferar en un número suficiente. La población de células T resultante puede transducirse genéticamente para expresar el factor tumoral de necrosis (TNF) u otros factores y reintroducirse en el individuo.

Otro uso particular para las células T CD4^{+} expandidas por el método de la invención es en el tratamiento de una infección de VIH en un individuo. Una infección prolongada de VIH puede finalmente derivar en un descenso acusado en el número de linfocitos T CD4^{+}. A su vez, dicho descenso provoca un estado profundo de inmunodeficiencia, lo que deja al paciente susceptible a una variedad de infecciones oportunas que amenazan la vida. Se espera que el hecho de reponer el número de células T para llegar a niveles normales permitirá la recuperación de la función inmunológica en una medida significativa. Así, el método descrito aquí proporciona una forma de expandir las células T selectivamente hasta un número suficiente como para reconstituir dicha población en un paciente infectado con VIH. También puede resultar necesario evitar la infección de células T durante una estimulación a largo plazo o puede ser deseable hacer que las células T tengan una resistencia permanente a la infección con VIH o que sean incapaces de producir el virus antes de reponer las células T en el individuo infectado. Por ejemplo, uno o más agentes anti-retrovirales pueden cultivarse con células T CD4^{+} antes de la expansión para inhibir la replicación de VIH o la producción viral (por ejemplo, fármacos dirigidos contra la transcriptasa inversa y/o otros componentes de la maquinaria viral, ver por ejemplo Chow et al. (1993) Nature 361, 650-653).

Pueden utilizarse varios métodos para transducir células T genéticamente con tal de producir moléculas que inhiben la infección con VIH o su replicación. Por ejemplo, en una realización, las células T pueden transducirse genéticamente para producir inhibidores transdominantes, que son formas mutadas, no funcionales, de los productos normales de VIH. Los inhibidores transdominantes funcionan mediante la oligomerización o la competición para la unión a proteínas VIH de cepas naturales. Varios inhibidores transdominantes se han derivado de las proteínas VIH, e incluyen tat, rev, y gag. La función de tat es potenciar la transcripción de genes virales mediante la unión a un elemento de respuesta a activación trans (tar) que se encuentra en la región promotora de la mayoría de genes de VIH. Rev, mediante la unión al elemento de respuesta a rev (RRE) que se encuentra en el extremo 5' de transcriptos de VIH no empalmados, facilita la transferencia de ARNm no procesado del núcleo al citoplasma para el empaquetamiento en viriones. Gag se sintetiza primero como un solo polipéptido y luego se escinde con una proteasa codificada por el virus para proporcionar tres proteínas estructurales, p15, p17 y p24. Se ha demostrado que inhibidores transdominantes derivados de estos productos génicos pueden inhibir la infección de células cultivadas con aislados de VIH de animales del laboratorio. Un ejemplo de un inhibidor transdominante que aparentemente actúa formando multímeros no funcionales con Rev de fuentes naturales es RevM10. Un constructo de RevM10 ha bloqueado la infección de células CEM con HTLV-IIIB durante hasta 28 días (Malim et al., JEM 176: 1197, Bevec et al., PNAC 89: 9870). En estos estudios, RevM10 no mostró ningún efecto adverso en la función normal de las células T determinada mediante los criterios de velocidad de crecimiento y la secreción de
IL-2.

En otro abordaje, las células T pueden transducirse para producir moléculas conocidas como "señuelos moleculares" que son elementos de unión para proteínas virales críticas para la replicación o el montaje, tales como TAR. Se ha demostrado que alta expresión mediada por el retrovirus de TAR en células CEM SS puede bloquear de forma efectiva el aislado ARV.2 VIH, determinado mediante un ensayo RT (Sullenger et al. Cell 63: 601). Es significativo que también bloqueara la infección con SIV (SIVmac251), lo que sugiere que la inhibición de la infección con VIH con señuelos moleculares puede aplicarse generalmente a varios aislados y así aliviar el problema de supervariabilidad. Es más, se ha demostrado que la expresión de TAR no tiene ningún efecto detectable en la viabilidad celular (Sullenger et al. J. Virol. 65: 6811). Las células T pueden transducirse para producir otro "señuelo molecular", CD4 soluble marcado en el extremo carboxi-terminal con una secuencia KDEL (lisina-ácido aspártico-ácido glutámico-leucina), una señal para la retención de ER (Buonocore y Rose, PNAC 90: 2695) (Nature 345: 625). La expresión del gen SCD4-KDEL se activa con VIH LTR. Las células H9 transducidas con el constructo sCD4-KDEL muestra un aumento en la regulación de la expresión de CD4 intracelular al producirse la infección con VIH. Esta estrategia bloqueó de forma efectiva la producción de VIH MN durante 60 días después de la infección. La ventaja propuesta de este inhibidor es que el virus no puede evitar este efecto mutándose porque la unión de CD4 es esencial para la infectividad de
VIH.

Las células T pueden transducirse también para expresar moléculas antisentido y ribozimas que bloquean la replicación o infección viral. La replicación viral puede inhibirse con una variedad de estrategias antisentido. Un ribozima particular que escinde la integrasa VIH (Sioud y Drlica, PNAS 88: 7303) se ha desarrollado y puede ofrecer una forma de bloquear la infección en vez de sólo la producción viral.

Otro abordaje para bloquear la infección con VIH implica la transducción de células T con toxinas reguladas por VIH. Dos ejemplos de este tipo de abordaje son el gen de la toxina A de difteria (Harrison et al. AIDS Res. Hum. Retro. 8: 39) y el gen de la timidina quinasa del virus herpes simple (Caruso y Klatzmann, PNAS 89: 182). En ambos casos, la transcripción fue controlada por secuencias reguladoras de VIH. Mientras que la toxina de difteria es por sí misma tóxica, HSV TK necesita la adición de aciclovir para matar las células infectadas. Por ejemplo, el uso de HSV TK seguido de la adición de 10 \mum de aciclovir durante 17 días bloquea totalmente la infección con VIH de células HUT 78 durante hasta 55 días en cultivo.

Los métodos para estimular y expandir una población de células T específicas para antígenos son útiles en situaciones terapéuticas donde es deseable aumentar la regulación de una respuesta inmunológica (por ejemplo, inducir una respuesta o potenciar una respuesta existente) al administrar las células T a un sujeto. Por ejemplo, el método puede utilizarse para potenciar una respuesta de células T a antígenos asociados con tumores. Las células tumorales de un sujeto típicamente expresan antígenos asociados con tumores pero pueden ser incapaces de estimular una señal co-estimuladora en las células T (por ejemplo, porque les falta la expresión de moléculas co-estimuladoras). Por tanto, las células tumorales pueden hacerse contactar con células T del sujeto in vitro y las células T específicas para antígenos pueden expandirse de acuerdo con el método de la invención y las células T pueden devolverse al sujeto. Como alternativa, las células T pueden estimularse y expandirse tal como se describe aquí para inducir o potenciar la responsividad a agentes patogénicos, tales como los virus (por ejemplo, el virus de inmunodeficiencia humano), bacterias, parásitos y hongos.

Esta invención se ilustra con más detalle en los siguientes ejemplos que no deben considerarse como limitantes. El contenido de todas las referencias y las solicitudes de patentes publicadas citadas en esta aplicación se incorporan como referencias. Se utilizó la siguiente metodología descrita en la sección de materiales y métodos en todos los ejemplos presentados a continuación.

Métodos y materiales Preparación del anticuerpo anti-CD3 inmovilizado

Los matraces de cultivo de tejidos se revistieron con anticuerpo monoclonal anti-CD3. Aunque existe un número de anticuerpos monoclonales anti-CD3 humano, OKT3 preparado de células hibridomas obtenidas de la Colección Americana de Cultivos Tipo se utilizó en este procedimiento. Para cualquier anticuerpo anti-CD3, típicamente, se determinó que la concentración óptima estuvo en el intervalo de 0,1 a 10 microgramos por mililitro. Para hacer una solución de recubrimiento, el anticuerpo se suspendió en 0,05 M de Tris-HCl, pH 9,0 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Se añadió una cantidad suficiente de solución de recubrimiento (Falcon, Nunc o Costar) para cubrir el fondo del matraz de cultivo de tejido y se incubó durante la noche a 4ºC. Los matraces se lavaron tres veces con una solución salina tamponada con fosfato sin calcio o magnesio (PBS sin Ca o Mg) y tampón de bloqueo (PBS sin Ca o Mg más albúmina de suero bovino 5%) se añadió para cubrir el fondo del matraz y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de esta incubación, los matraces se utilizaron directamente o se congelaron para el almacenamiento, dejando la solución de bloqueo en el matraz.

Aislamiento de leucocitos de sangre periférica (PBLs)

Las muestras se obtuvieron mediante leucoferesis de donantes sanos. Bajo condiciones estériles, los leucocitos se transfirieron a un matraz de cultivo T800. El bolso se lavó con una solución salina equilibrada de Hanks sin calcio o magnesio (HBSS sin) (Whittaker Bioproducts, Inc., Walkersville, MD). Las células se diluyeron con HBSS sin y se mezcló bien. Las células se dividieron por partes iguales entre dos tubos plásticos estériles de cultivo con fondos cónicos de 200 mililitros. Cada tubo se llevó a 200 ml con HBSS sin y se centrifugó a 1800 RPM durante 12 minutos en una centrífuga Beckmann TJ-6. El sobrenadante se aspiró y cada sedimento celular se resuspendió en 50 ml HBSS sin. Las células se transfirieron a dos tubos con fondos cónicos de 50 ml y se centrifugó a 1500 RPM durante 8 minutos. El sobrenadante se aspiró de nuevo.

Para lisar los glóbulos rojos, los sedimentos celulares se resuspendieron en 50 ml de tampón de lisado ACK (Biofluids, Inc., Rockville MD, Catalogo #304) a temperatura ambiente con un mezclado suave durante 3 minutos. Las células se sedimentaron de nuevo centrifugando a 1500 RPM durante 8 minutos. Después de aspirar el sobrenadante, los sedimentos se unieron en un tubo de 50 ml en 32 ml HBSS sin.

La separación de los PBLs de los monolitos se llevó a cabo mediante una centrifugación a través de un gradiente PERCOLL^{TM}. Para preparar 1 litro de solución PERCOLL^{TM} (PERCOLL^{TM}-MO), 716 ml de PERCOLL^{TM} (Pharmacia, Piscataway, NJ, Catalogo #17-0891-01) se combinó con 100 ml de cloruro sódico 1,5M, 20 ml de sodio-HEPES 1M, y 164 ml de agua. Todos los reactivos tienen que ser para el cultivo de tejidos y filtrados estérilmente. Después de mezclar, esta solución se filtró a través de un filtro estéril de 0,2 \mum^{3} y se almacenó a 4ºC. se añadieron 24 ml de PERCOLL^{TM}-MO a cada uno de dos tubos con fondos cónicos de 50 ml. A cada tubo, se le añadieron 16 ml de suspensión celular. La solución se mezcló extensivamente mediante la inversión de los tubos. Los tubos se centrifugaron a 2800 RPM durante 30 minutos de forma continúa. Los tubos se retiraron de la centrífuga cuidadosamente para no mezclar las capas. Los PBLs se encontraban en el fondo de los tubos. A continuación, el sobrenadante se aspiró y los PBLs se lavaron en HBSS sin mediante una centrifugación de 8 minutos a 1500 RPM.

Clasificación de células mediante inmunoadherencia magnética negativa

La clasificación de células mediante inmunoadherencia magnética negativa tiene que llevarse a cabo a 4ºC. Los sedimentos celulares lavados obtenidos de los gradientes de PERCOLL^{TM} descritos anteriormente se resuspendieron en el medio de recubrimiento (RPM1-1640 (Bio Whittaker, Walkersville, MD, Catalogo nº 12-167Y), suero fetal bovino (FCS) (o AB de suero humano 1% o albúmina de suero bovino 5%), 5 mM de EDTA (Quality Bioligical, Inc., Gaithersburg, MD, Catalogo nº 14-117-1), 2 mM de L-glutamina (BioWhittaker, Walkersville, MD, Catalogo nº 17-905C), 20 mM de HEPES (BioWhittaker, Walkersville, MD, Catalogo nº 17-757A), 50 \mug/ml de gentamicina (BioWhittaker, Walkersville, MD, Catalogo nº 17-905C)) a una densidad celular de 20x10^{6} por ml. Una mezcla de anticuerpos monoclonales dirigidos contra los marcadores de superficie celular se añadió a una concentración final de 1 \mug/ml para cada anticuerpo. La composición de esta mezcla se diseña para enriquecer las células T CD4^{+} o CD28^{+}. De este modo, la mezcla típicamente incluirá anticuerpos de CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR y (sólo para las células CD4^{+}) CD8. (Ver la tabla 1 para una lista de mezclas de anticuerpos monoclonales de clasificación.) El tubo que contiene las células y los anticuerpos se agitó a 4ºC durante 30-45 minutos. Al cabo de esta incubación, las células se lavaron tres veces con el medio de recubrimiento para eliminar los anticuerpos no unidos. Perlas magnéticas recubiertas con IgG anti-ratón de cabra (Dynabeads M-450, Catalogo nº 11006, P&S Biochemicals, Gaithersburg, MD) y prelavadas con el medio de recubrimiento se añadieron a una relación de tres perlas por célula. A continuación, las células y perlas se agitaron durante 1-1,5 horas a 4ºC. Las células recubiertas de anticuerpo se retiraron con un concentrador magnético de partículas según las instrucciones del fabricante (MPC-1, Catalogo nº 12001, P&S Biochemicals, Gaithersburg, MD). Las células no adherentes se eliminaron del medio de recubrimiento mediante un lavado y se resuspendieron en un medio apropiado de
cultivo.

TABLA 1 Mezclas de anticuerpos monoclonales de clasificación

1

100

TABLA 1 (continuación)

2

Estimulación a largo plazo

Los matraces de cultivo de tejido recubiertos con anticuerpos monoclonales anti-CD3 se descongelaron y se lavaron tres veces con PBS. Las células T purificadas se añadieron a una densidad de 2 x 10^{6}/ml. El anticuerpo monoclonal anti-CD28 9.3 (Dr. Jeffery Ledbetter, Bristol Myers Squibb Corporation, Seattle, WA) o EX5.3D10, depósito de ATCC nº HB11373 (Repligen Corporation, Cambridge, MA) se añadió a una concentración de 1 \mug/ml y las células se cultivaron a 37ºC durante una noche. A continuación, las células se separaron del matraz mediante un pipeteo vigoroso y se transfirieron a un matraz nuevo sin tratar a una densidad de 0,5 x 10^{6}/ml. De ahora en adelante, las células se resuspendieron cada segundo día mediante pipeteos vigorosos y se diluyeron a 0,5 x 10^{6}/ml. El diámetro medio de las células se vigiló con un Contador Coulter 2M conectado a un Coulter Channelyzer. Las células T en reposo tienen un diámetro medio de 6,8 micras. Con este protocolo de estimulación, el diámetro medio aumentó hasta más de 12 micras antes del día 4 y, después, empezó a reducirse aproximadamente en el día 6. Cuando el diámetro medio se redujo hasta aproximadamente 8 micras, las células se estimularon de nuevo durante una noche con anti-CD3 y anti-CD28 tal como se ha descrito anteriormente. Era importante no permitir que las células volviesen a su diámetro de reposo. El ciclo se repitió durante periodos de hasta tres meses. Se anticipa que el tiempo entre reestimulaciones se reducirá de forma progresiva.

Ejemplo 1 Crecimiento a largo plazo de células CD4^{+} con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28

Los métodos conocidos anteriormente para el cultivo de células T in vitro exigen la adición de células exógenas de alimentación o factores de crecimiento celular (tales como interleuquina 2 o 4) y una fuente de antígenos o lectina mitogénica vegetal. Las células T CD28^{+} de sangre periférica se aislaron mediante la selección negativa con inmunobolitas magnéticas y anticuerpos monoclonales tal como se ha descrito en la anterior sección de Métodos y Materiales. Las células CD4^{+} se aislaron, además, de la población de células T tratando las células con anticuerpos monoclonales anti-CD8 y eliminando las células CD8^{+} con las inmunobolitas magnéticas. En resumen, las células T se obtuvieron de la leucoferesis de un donante normal, y se purificaron con centrifugación de gradiente de densidad FICOLL^{TM}, seguido de una clasificación con inmunobolitas magnéticas. Las células T CD28^{+} y CD4^{+} resultantes se cultivaron en un medio definido (X-Vivo10 con gentamicina y L-glutamina (Whittaker Bioproducts) a una densidad inicial de 2,0 x 10^{6}/ml mediante la adición de células a platos de cultivo que contenían IgG anti-ratón de cabra absorbido en plástico (Kirkegaard and Perry Laboratorios, Gaithersburg, MD) y mAb anti-CD3 G19-4. Después de 48 horas, las células se retiraron y se colocaron en matraces que contenían hIL-2 (5%, CalBiochem) o anti-CD28 mAb (500 ng/ml). Las células cultivadas con IL-2 se alimentaron con IL-2 recién obtenido cada dos días. Medio recién preparado se añadió a todos los cultivos si fuera necesario para mantener una densidad celular de 0,5 x 10^{6}/ml. Las células se reestimularon en intervalos de aproximadamente una semana mediante el cultivo en mAb anti-CD3 absorbido en plástico durante 24 horas, a continuación, las células se retiraron y se colocaron a 1,0 x 10^{6}/ml en medio recién preparado en matraces que contenían bien IL-2 o mAb anti-CD28.

En el ejemplo presentado en la figura 1, el recipiente de cultivo contenía inicialmente 50 x 10^{6} células, y las células se cultivaron en una cantidad óptima de lectina PHA mitogénica, o se cultivaron con una estimulación cíclica de mAb anti-CD3 inmovilizado en plástico en presencia de interleuquina 2 o mAb anti-CD28 9.3. Las células cultivadas en PHA solo no proliferaron, y todas las células se murieron después de aproximadamente 20 días de cultivo, lo que indica la ausencia funcional de células accesorias. Al contrario, las células cultivadas en la presencia de anti-CD3 con IL-2 o anti-CD28 entraron en una fase de crecimiento logarítmico, con velocidades de crecimiento iguales para las primeras tres semanas de cultivo. Sin embargo, las velocidades de crecimiento de los cultivos anti-CD3 empezaron a divergir durante la cuarta semana de cultivo, y las células alimentadas con IL-2 entraron en una fase sin cambios después de una expansión de 2,8log_{10}. Contrariamente, los cultivos que crecieron en presencia de anti-CD28 seguían con un crecimiento logarítmico hasta la sexta semana de cultivo, cuando había tenido una expansión de 3,8log_{10}. De este modo, la estimulación del receptor de CD28, quizás mediante el entrelazamiento de anti-CD28, puede estimular el crecimiento de células CD4^{+} en ausencia del suero fetal bovino o células accesorias, y además, se pueden obtener aproximadamente 10 veces más células con anti-CD28 comparado con la adición de IL-2 exógena. En experimentos repetidos, la expansión de células T CD4^{+} con anticuerpos anti-CD28 proporcionó más células T CD4^{+} de forma consistente que la expansión con IL-2 (por ejemplo, hasta 1000 veces más células). Este sistema tiene la ventaja añadida de que no necesita la presencia de células accesorias lo que puede ser ventajoso en situaciones clínicas donde las células accesorias están limitadas o son defectuosas.

Ejemplo 2 Crecimiento a largo plazo de células T tratadas con anti-CD28 en medio que contiene suero fetal bovino

Otra serie de experimentos comprobaron si la ventaja de crecimiento de la estimulación del receptor de CD28 se debía a la sustitución de factores normalmente presentes en el suero fetal bovino. Las células T se obtuvieron de la leucoferesis de un donante normal, y se purificaron mediante centrifugaciones con un gradiente de densidad FICOLL^{TM}, seguido de una clasificación con inmunobolitas magnéticas. Las células T CD28^{+}, CD4^{+} resultantes se cultivaron a una densidad inicial de 2,0 x 10^{6}/ml en medio (RPM1-1640 que contenía 10% de suero fetal bovino activado por el calor [Hyclone, Logan, UTA] y gentamicina y L-glutamina) añadiendo las células a placas de cultivo que contenían OKT3 absorbido en plástico. Después de 48 horas, las células se retiraron y se colocaron en matraces que contenían bien hIL-2 (concentración final del 10%, CalBiochem) o mAb anti-CD28 9.3 (800 ng/ml). Las células se alimentaron con medio recién preparado según la necesidad para mantener una densidad celular de 0,5 x 10^{6}/ml, y se reestimularon en intervalos de aproximadamente una semana mediante el cultivo en mAb anti-CD3 absorbido en plástico durante 24 horas.

Tal como se muestra en la figura 2, las células entraron en una fase de crecimiento logarítmico, con velocidades de crecimiento iguales durante las primeras tres semanas de cultivo. Sin embargo, las velocidades de crecimiento de los cultivos anti-CD3 empezaron a divergir durante la cuarta semana de cultivo, y las células alimentadas con IL-2 entraron en una fase sin cambios después de una expansión de 4,0log_{10}. Al contrario, los cultivos que crecieron en presencia de anti-CD28 seguían creciendo de forma logarítmica hasta la quinta semana de cultivo, cuando había habido una expansión de 5,1log_{10}. De este modo, la estimulación de CD28 resultó en una expansión de 125.000 veces el cultivo inicial, mientras que la alimentación con IL-2 resultó en una expansión de las células de 10.000 veces.

Ejemplo 3 Crecimiento a largo plazo de células T en éster de forbol, ionomicina y células T estimuladas anti-CD28

Experimentos adicionales comprobaron si los métodos alternativos de activar las células T permitirían también un crecimiento estimulado de CD28. Se cree que la activación farmacológica de las células T con AFM e ionomicina puede imitar el desencadenamiento del receptor de células T mediante el complejo RCT/CD3. Las células T obtenidas de la leucoferesis de un donante normal, y purificadas mediante centrifugaciones secuenciales de gradiente de densidad FICOLL^{TM} y PERCOLL^{TM}, seguido de una clasificación con inmunobolitas magnéticas. Las células T CD28^{+}, CD4^{+} resultantes se cultivaron a una densidad inicial de 2,0 x 10^{6}/ml mediante la adición de células a las placas de cultivo que contenían ácido forbol miristato (AFM 3 ng/ml, Sigma) e ionomicina (120 ng/ml, Calbiochem, lote nº 3710232). Después de 24 horas, las células se diluyeron a 0,5 x 10^{6}/ml y se colocaron en matraces que contenían rIL-2 (50 UI/ml, Boerhinger Mannheim, lote nº 118449900)) o mAb anti-CD28 (1 \mug/ml). Las células se alimentaron con medio recién preparado según la necesidad con tal de mantener una densidad celular de 0,5 x 10^{6}/ml, y se reestimularon cíclicamente en intervalos de aproximadamente una semana mediante la readición de AFM y ionomicina. IL-2 nuevo se añadió en intervalos diarios al cultivo que contenía IL-2.

Los resultados de este experimento se muestran en la figura 3. Las células T que se purificaron de las células accesorias no crecieron en número de células en presencia de AFM (la "P" en la figura) e ionomicina (la "I" en la figura), con o sin IL-2. Las células se agregaron y se aumentaron, tal como se indicó el análisis de tamaño, lo que sugiere que las células se habían inducido a entrar en la fase G1 del ciclo celular pero no pasaron a la síntesis de ADN y la división celular. Al contrario, la adición de mAb CD28 a AFM más ionomicina en células tratadas resultó en un crecimiento celular logarítmico. De este modo, mAb anti-CD3 no es necesario para proporcionar la activación de las células T. Debe tenerse en cuenta que otros activadores de la proteína quinasa C, tales como briostatina o diacilglicerol pueden utilizarse en lugar de AFM.

Ejemplo 4 Inmunofenotipo de células cultivadas con estimulación anti-CD3 y adición de IL-2 or mAb anti-CD28

Para examinar los subgrupos de células T que se expanden, se propagaron linfocitos de sangre periférica durante 16 días con anti-CD3 y IL-2 o con anti-CD3 y anti-CD28. La figura 4 demuestra el enriquecimiento selectivo de células CD4 de linfocitos de sangre periférica. Las células mononucleares se aislaron de la sangre mediante centrifugación con un gradiente de densidad de FICOLL^{TM}-hipaque. Las células se tiñeron con anticuerpos monoclonales CD4 y CD8, y se analizaron para determinar el porcentaje de células positivas en el día 0. A continuación, las células se cultivaron en el anticuerpo monoclonal anti-CD3 inmovilizado en plástico G19-4 más IL-2, o el anticuerpo monoclonal anti-CD3 inmovilizado en plástico G19-4 más anticuerpo monoclonal anti-CD28 9.3 (0,5 \mug/ml). El día 16, las células se aislaron del cultivo, y se llevó a cabo una tinción repetida para antígenos CD4 y CD8 mediante citometría de flujo. Se recogieron datos correspondientes a la población de linfocitos mediante la dispersión de la luz hacia adelante y lateral. Según este análisis, los porcentajes de células CD4 y CD8 fueron 8,0% y 84,5% en las células cultivadas en IL-2, respectivamente, y 44,6% y 52,5% en las células cultivadas en CD28, respectivamente. Estos resultados sugieren que la expansión de CD28 favorece la célula CD4^{+}, al contrario de la observación bien conocida de que las células CD8^{+} predominan en células cultivadas en IL-2 (ver por ejemplo, D.A. Cantrell y K.A. Smith, (1983), J. Exp. Med. 158: 1895 y Gullberg, M. y K.A. Smith (1986) J. Exp. Med. 163, 270).

Para proporcionar una comprobación adicional de esta posibilidad, las células T CD4^{+} se enriquecieron hasta una pureza de 98% con una selección negativa con anticuerpos monoclonales y las inmunobolitas magnéticas tal como se ha descrito anteriormente. El análisis activado por fluorescencia para clasificación de células (AFCC) se empleó para examinar el fenotipo de las células T cultivadas con el anti-CD3 y anti-CD28. Las células se sedimentaron mediante centrifugación y se resuspendieron en PBS/BSA 1%. A continuación, las células se lavaron repitiendo el procedimiento dos veces. Las células se sedimentaron y se resuspendieron en 100 \mul de una solución de anticuerpos primaria, se sometieron a agitación vorticial, y se mantuvieron sobre hielo durante una hora. Después de lavar dos veces en PBS/BSA 1%, las células se resuspendieron en 100 \mul de IgG anti-ratón de cabra marcado en fluoresceína y se incubó durante 30 minutos sobre hielo. Después de esta incubación, las células se lavaron dos veces en PBS y se resuspendieron en 500 \mul de paraformaldehido 1% en PBS. Las células marcadas se analizaron en un Ortho Cytofluorograph. Las células se tiñeron después de su aislamiento, o después de 26 días en cultivo, con anti-CD3 (Leu-4), CD4 (Leu-3ª), CD8 (OKT8) conjugado con ficoeritrina o con anticuerpos monoclonales IgG2a de control y la fluorescencia se cuantificó con un citómetro de flujo. Las células se cultivaron durante un mes con anti-CD3 y bien IL-2 o anti-CD28 para propagar las células. Había una expansión parecida de las células durante los primeros 26 días de cultivo (no mostrado), sin embargo, como se ve en la figura 5, el fenotipo de las células se divergió progresivamente con el tiempo de cultivo tal que en el día 26 de cultivo, la célula predominante en el cultivo anti-CD28 fue CD4^{+} mientras que las células en el cultivo de IL-2 fueron predominantemente CD8^{+}. De este modo, la estimulación del receptor de CD28, quizás mediante un entrelazamiento, es capaz de expandir de forma selectiva las células T del fenotipo CD4 mientras que el método convencional de cultivo in vitro de células T proporciona células del fenotipo CD8. Se han llevado a cabo experimentos adicionales con resultados parecidos, lo que indica que la estimulación con CD28 de poblaciones inicialmente mezcladas de células puede proporcionar cultivos en que predominan o que contienen exclusivamente las células T CD4, y por tanto se pueden expandir y "rescatar" las células CD4 que estaban presentes al inicio en cantidades limitadas.

Ejemplo 5 Uso del tamaño de las células o expresión cíclica de B7 en células T CD4^{+} para vigilar la expansión de células T

Para determinar el tiempo de reestimulación de células T, los cambios en el volumen celular se vigilaron con un Contador Coulter ZM conectado a un Coulter. Las células T CD28^{+}, CD4^{+} se aislaron tal como se ha descrito mediante inmunoselección magnética, y se cultivaron en presencia de mAb anti-CD28 9.3 (0,5 \mug/ml), y se reestimularon con anticuerpo monoclonal anti-CD3 inmovilizado en plástico G19-4 tal como se ha indicado. La figura 9 demuestra los cambios cíclicos en el volumen celular durante seis reestimulaciones consecutivas ("S1" a "S6") realizadas esencialmente como se ha descrito en el ejemplo 1. En resumen, las células se expandieron con anti-CD3 y anti-CD28 durante 3 semanas en cultivo. Las células se cambiaron a medio recién preparado en cada reestimulación con anticuerpo anti-CD3. Hubo una separación de diez días entre las estimulaciones. Las células se reestimularon siempre que el volumen celular se redujo hasta <400 fl.

En otro experimento, la expresión cíclica del antígeno B7-1 se empleó para determinar el tiempo para la reestimulación de las células T. Las células obtenidas del experimento que se muestra en la figura 10 se tiñeron con una proteína de fusión CTLA-4Ig (obtenida de Repligen Corporation; ver también Linsley P.S. et al. (1991) J. Exp. Med. 174, 561-569) y se analizó mediante citometría de flujo para medir la expresión del receptor B7-1. Se determinó que las células T CD4^{+} no expresan inicialmente el receptor B7-1, y que con el cultivo, se induce su expresión. Además, la expresión de B7-1 resultó ser transitoria, y reinducible con reestimulación repetida con
anti-CD3.

Ejemplo 6 Producción de citoquinas por las células T después de la estimulación con anti-CD28

Se realizaron experimentos para analizar las citoquinas producidas por las células T después de la estimulación con anti-CD28. Las células T CD28^{+}/CD4^{+} se aislaron tal como se ha descrito en los ejemplos anteriores. Las células se estimularon con anticuerpo monoclonal anti-CD3 inmovilizado en plástico y IL-2 (200 U/ml) o anti-CD3 y anti-CD28 sin linfoquina añadida. Las células se reestimularon con anticuerpo anti-CD3 según los cambios en el volumen celular tal como se ha descrito en el ejemplo 5. El sobrenadante de cultivo celular se eliminó a los tiempos indicados y se analizó para detectar IL-2 (figura 11), GM-CSF (Figura 12), y TNF-\alpha (figura 13). IL-2 se determinó mediante un bioensayo en células CTLL-2 mientras que TNF-\alpha y GM-CSF se midieron con ELISA según las instrucciones del fabricante (TNF-\alpha, GMCSF: R&D Systems, Minneapolis, MN). Los datos presentados para las diferentes citoquinas proceden de experimentos separados. En otros experimentos (no presentados), se demostró que la estimulación con anti-CD3 más anti-CD28 provocaba altos niveles de IL-4 y IL-5 en los sobrenadantes de cultivo después de aproximadamente el día 10 de cultivo, aunque sólo pequeñas cantidades de estas citoquinas estaban presentes en los primeros tiempos del cultivo.

Los patrones de secreción de citoquinas con células expandidas mediante varias reestimulaciones según el protocolo descrito en los ejemplos se compararon a los de células expandidas con anti-CD3 más IL-2 durante 3 semanas en cultivo. Las células se cambiaron a un medio recién preparado en cada reestimulación con anticuerpo anti-CD3. Hubo un intervalo de 10 días entre las estimulaciones. Después de 24 horas de cultivo adicional, una alícuota de sobrenadante de cultivo celular se retiró para ensayar. Los ensayos ELISA para citoquinas individuales se realizaron con equipos de diferentes proveedores (IL-2: T Cell Diagnostics, Cambridge, MA; IFN-\gamma Endogen, Inc., Boston, MA; IL-4, TNF-\alpha, GMCSF: R&D Systems, Minneapolis, MN) según las instrucciones proporcionadas con los equipos. Como se puede apreciar en los resultados de un experimento representativo presentado en la tabla 2, los dos protocolos proporcionan niveles muy parecidos de secreción de IL-2 y IL-4. Los niveles más altos de secreción de GM-CSF y TNF-\alpha con co-estimulación con anti-CD3 y CD28 sugieren que la capacidad proliferativa de esta combinación de estímulos puede deberse en parte a su capacidad para estimular el bucle
autocrino.

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TABLA 2 Comparación de citoquinas secretadas por células T expandidas con anti-CD3 y IL-2 frente a células T expandidas con anti-CD3 y anti-CD28

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Concentración de linfoquina en pg/ml

3

Ejemplo 7 Policlonalidad de células T después de la estimulación con anti-CD28

La policlonalidad de una población de células T después de la estimulación con un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28 tal como se ha descrito en los ejemplos anteriores se ha determinado. Las células CD28^{+}/CD4^{+} se aislaron tal como se ha descrito en los ejemplos anteriores. Las células se estimularon con mAb anti-CD3 y anti-CD28 inmovilizado en plástico y un análisis AFCC se realizó esencialmente tal como se ha descrito en el ejemplo 4 con un conjunto de anticuerpos anti-RCT (V\beta5a, V\beta5b, V\beta5c, V\beta6a, V\beta8a, V\beta12a y V\alpha2a) obtenidos de Pharmingen. La policlonalidad de la población de células T se determinó antes (día 1) y después (día 24) de estimulación. Como se indica en la figura 14, la diversidad de RCT de una población de células T estimuladas por CD28 se mantiene en el día 24.

Ejemplo 8 Comparación de tinción de la superficie celular de células T de individuos VIH+ y VIH- después de la estimulación con anti-CD28

Se realizó otra serie de experimentos para determinar la expresión de varios marcadores de la superficie de células T en células de individuos VIH seropositivos y seronegativos expandidas de acuerdo con los procedimientos descritos en los ejemplos anteriores. Las células T CD28^{+}/CD4^{+} se obtuvieron tal como se ha descrito en el presente documento. En estos experimentos, mAb anti-CD3 se marcó con un primer marcador (por ejemplo, rodamina) y un segundo anticuerpo apropiado (por ejemplo, anti-CD28, anti-CD4, anti-CD8) y se marcó con un segundo marcador (por ejemplo, fluoresceína). Las células T se estimularon con mAb anti-CD3 y anti-CD28 inmovilizados en plástico tal como se describe en el presente documento y el porcentaje de células T que expresan una variedad de marcadores de la superficie celular con diferentes estimulaciones (es decir, S1, S2 y S3) se determinó mediante el análisis AFCC. Como se aprecia en las figuras 15 y 16, la distribución global de marcadores de superficie celular en las células T obtenidas de individuos VIH seropositivos y seronegativos es aproximadamente la misma durante el ensayo de estimulación. Cabe resaltar que la presencia de un marcador de superficie celular, CD45RA, que es un marcador para células T no expuestas, se reduce durante el curso de la expansión de células T estimuladas por CD28. Al contrario, el porcentaje de células T que expresan el marcador de superficie celular de memoria, CD45RO, aumenta con mayor estimulación. De este modo, la expansión de células T a través de estimulación con CD28 expande de forma preferencial las células T de memoria o convierte células T no expuestas a células T de memoria. Se debe tener en cuenta que la reducción en el porcentaje de células T que expresan CD28 es un artefacto del experimento debido a la presencia de un anticuerpo anti-CD28 en el cultivo de células T a lo largo del ensayo. La presencia de anticuerpos anti-CD28 evita la tinción del antígeno CD28.

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Ejemplo 9 Crecimiento a largo plazo de células T CD8^{+} con anti-CD3 y anticuerpo monoclonal ES5.2D8

Se realizaron experimentos para determinar si una población de células T CD8^{+} podría expandirse de forma preferencial con un mAb anti-CD3 y un anticuerpo monoclonal ES5.2D8. Las células T CD28^{+} se obtuvieron esencialmente tal como se ha descrito en el ejemplo 1. Para ensayar la expresión de CD8, un anticuerpo anti-CD8 primario y un anticuerpo apropiado secundario marcado se emplearon en el análisis AFCC para determinar el porcentaje de células positivas. Como se indica en la figura 17, en el día 7 después de la estimulación de las células T con el mAb anti-CD3 G19-4sp y el mAb ES5.2D8, la fracción CD8^{+} había aumentado desde aproximadamente el 20% hasta más del 40%. Se encontró que otro anticuerpo monoclonal ER4.7G11 (denominado como 7G11) también estimula las células T CD8^{+}. Este anticuerpo se produjo contra CTLA4 recombinante humano y se ha depositado con el ATCC el 3 de junio de 1994, con número de acceso ______. Este resultado indica que la unión de una región diferente de CTLA4 o de una proteína de superficie celular con reactividad cruzada activa selectivamente las células T CD8^{+}.

Ejemplo 10 Definición del epitopo del anticuerpo monoclonal ES5.2D8

Para determinar el epitopo del anticuerpo monoclonal ES5.2D8, el mapeo del epitopo se realizó mediante el cribado de una biblioteca de visualización de fagos (PDL) y se confirmó con péptidos sintéticos. Se preparó un PDL aleatorio de 20 aminoácidos clonando un oligonucleótido degenerado en el vector fUSE5 (Scout, J.K. y Smith G.P. (1990) Science 249: 386-390) tal como se describe en Cwirla, S.E. et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6378-6382. La PDL se utilizó para identificar los péptidos de cadena corta que se unieron específicamente a mAb ES5.2D8 mediante una técnica de microseparación descrito en Jellis, C.L. et al. (1993) Gene 137: 63-68. Clones individuales de fagos se purificaron de la biblioteca gracias a su afinidad para el mAb inmovilizado y el péptido aleatorio se identificó con la secuencia de ADN. En resumen, mAb ES5.2D8 se recubrió en placas de Nuca Maxisorp con 96 pocillos y se incubó con 5 x 10^{10} fagos que representaban 8 x 10^{6} fagos diferentes, visualizando péptidos aleatorios de 20 aminoácidos. Fagos unidos específicamente se eluyeron, se amplificaron y, a continuación, se incubaron con el anticuerpo por segunda vez. Después de la tercera etapa, se aislaron 7 fagos, y se preparó el ADN para secuenciar.

El análisis de la secuencia de estos clones demostró que tres de las siete secuencias eran idénticas y que una cuarta era similar.

ES5.2D8#2 (SEC ID Nº: 1)	H Q F C D H W G C W L L R E T H I F T P

ES5.2D8#4 (SEC ID Nº: 1)	H Q F C D H W G C W L L R E T H I F T P

ES5.2D8#10 (SEC ID Nº: 1)	H Q F C D H W G C W L L R E T H I F T P

ES5.2D8#6 (SEC ID Nº: 1)	L R L V L E D P G I W L R P D Y F F P A

En base a estos datos, se propuso un epitopo de G X W L X D/E (SEC. ID. Nº: 5).

Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán averiguar con sólo una experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las realizaciones específicas de la invención aquí descrita.

Claims

1. Un método in vitro para inducir la proliferación de una población de células T, que comprende poner una población de células T en contacto con una superficie sólida sobre la que se ha inmovilizado directamente:

(a) un primer agente que proporciona una señal de activación principal a las células T, lo que activa las células T; y

(b) un segundo agente que estimula una molécula accesoria en la superficie de las células T, lo que estimula las células T activadas, con lo que el primer y el segundo agentes inducen la proliferación de las células T.

2. El método de la reivindicación 1 para inducir la proliferación de una población de células T CD4^{+}, que comprende, además, el aislamiento de una población de células T CD4^{+} antes de la etapa (a).

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el primer agente estimula una señal asociada al complejo RCT/CD3 en las células T.

4. El método de la reivindicación 3, en el que el primer agente es un anticuerpo anti-CD3.

5. El método de la reivindicación 4, en el que el anticuerpo anti-CD3 es un anticuerpo monoclonal anti-CD3 humano.

6. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el primer agente es un anticuerpo anti-CD2.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la molécula accesoria en la célula T es CD28.

8. El método de la reivindicación 7, en el que el segundo agente es un anticuerpo anti-CD28.

9. El método de la reivindicación 8, en el que el anticuerpo anti-CD28 es un anticuerpo monoclonal anti-CD28 humano.

10. El método de la reivindicación 8, en el que el anticuerpo anti-CD3 es OKT3 y el anticuerpo anti-CD28 es uno de 9.3 o EX5.3D10.

11. El método de la reivindicación 7, en el que el segundo agente es una forma estimuladora de un ligando natural de CD28.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el ligando natural es B7-1 o B7-2.

13. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, que además comprende: vigilar la proliferación de células T; y reactivar y reestimular las células T con el primer y el segundo agentes cuando la velocidad de proliferación de células T se ha reducido para inducir la proliferación adicional de las células T.

14. El método de la reivindicación 13, en el que la etapa de vigilancia de la proliferación de las células T se realiza examinando el tamaño de las células o determinando el nivel de expresión de una molécula de la superficie celular, y la etapa de reactivación y reestimulación se inicia cuando el tamaño de las células se haya reducido o cuando el nivel de la molécula de la superficie celular se haya reducido.

15. El método según la reivindicación 14, en el que la molécula de la superficie celular es B7-1.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la población de células T puede obtenerse de un individuo infectado con VIH.

17. El método según la reivindicación 16, en el que el método comprende, además, otorgar a las células T resistencia a la infección con VIH.

18. El método de la reivindicación 17, en el que a las células T se les otorga resistencia a la infección con VIH mediante el contacto entre las células T y al menos un agente retro-viral que inhibe la replicación de VIH o la producción viral.

19. El método de la reivindicación 17, en el que a las células T, se les otorga resistencia a la infección con VIH mediante la transducción genética de las células T para producir moléculas que inhiben infección con VIH o replicación.

20. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que las células T de un individuo afectado con inmunodeficiencia asociada con un defecto genético se transducen genéticamente para corregir el defecto.

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21. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que las células T se activan mediante el contacto con un antígeno o una porción del mismo.

22. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, que comprende, además, repetir las etapas (a) - (b) para producir una población de células T con números aumentados desde aproximadamente 100 a aproximadamente 100.000 veces la población original de células T.

23. El método de la reivindicación 1 para inducir la proliferación de una población de células T CD8^{+}.

24. El método de la reivindicación 23, en el que la molécula accesoria en células T activadas tiene un peso molecular de aproximadamente 27 kD.

25. El método de la reivindicación 23 ó 24, que comprende, además, repetir las etapas (a) - (b) para producir una población de células T CD8^{+} con números aumentados desde aproximadamente 100 a aproximadamente 100.000 veces la población original de células T.

26. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 25, en el que el segundo agente es el anticuerpo monoclonal ES5.2D8.

27. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 23 a 26, en el que la población de células T CD8^{+} es linfocitos infiltrantes de tumores, que se pueden obtener de un individuo con cáncer.

28. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que la población de células T se puede obtener de un individuo con cáncer.

29. Una composición que comprende una superficie de fase sólida tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 12, 24 ó 26.

30. La composición de la reivindicación 29 a la que está fijado de forma covalente:

(a) un anticuerpo anti-CD3; y

(b) un anticuerpo anti-CD28.

31. La composición de la reivindicación 29 ó 30, en donde la superficie de fase sólida es una perla o una superficie de un recipiente de cultivo.

32. La composición de la reivindicación 31, en donde la perla es una perla magnética.