JP2004533226A - Ｂ７−４に対するｐｄ−１、ａレセプター、およびその使用 - Google Patents

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Abstract

ＰＤ−１によるシグナリングを調節する化合物を同定するためのアッセイを開示する。

Description

【０００１】
本明細書に開示される発明は、ナショナル インスティテュート オブ ヘルスにより授与されるＡＩ３９６７１、ＡＩ４４６９０、ＣＡ８４５００、およびＡＩ４１５８４下にサポートされた。合衆国政府はそれゆえ、本発明の所定の権利を有し得る。
【０００２】
本発明は、２００１年４月２日に提出されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／２８１，０６４について優先権を主張する。この出願は本明細書中に、その全体が引用により組み込まれる。
Ｔ細胞が外来タンパク質に対して反応するためには、２つのシグナルが抗原提示細胞（ＡＰＣ）により静止Ｔリンパ球に提供されなければならない（Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．およびＳｃｈｕｗａｒｔｚ，Ｒ．（１９８７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６５：３０２−３１９；Ｍｕｅｌｌｅｒ，Ｄ．Ｌ．ら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：３７０１−３７０９）。免疫反応に対する特異性を賦与する第一シグナルは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）との関連で提示される外来抗原性ペプチドを認識した後にＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を経て変換される。副刺激と称される第二のシグナルは、Ｔ細胞を増殖させ、機能的にする（Ｌｅｎｓｃｈｏｗら、（１９９６）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：２３３）。副刺激は、抗原特異性でも、ＭＨＣ制限性でもなく、ＡＰＣにより発現される１以上の別個の細胞表面分子により提供させると考えられる（Ｊｅｎｋｉｎｓ，Ｍ．Ｋ．ら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：３３２４−３３３０；Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．ら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０；Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．ら１９９１ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８；６５７５−６５７９；Ｙｏｕｎｇ，Ｊ．Ｗ．ら（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：２２９−２３７；Ｋｏｕｌｏｖａ，Ｌ．ら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７５９−７６２；Ｒｅｉｓｅｒ．Ｈ．ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２７１−２７５；ｖａｎ−Ｓｅｖｅｎｔｅｒ，Ｇ．Ａ．ら（１９９０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：４５７９−４５８６；ＬａＳａｌｌｅ，Ｊ．Ｍ．ら（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：７７４−８０；Ｄｕｓｔｉｎ，Ｍ．Ｉ．ら（１９８９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６９：５０３；Ａｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ３５７：８０−８２；Ｌｉｕ，Ｙ．ら（１９９２）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：４３７−４４５）。
【０００３】
ＡＰＣ上で発現されるＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）タンパク質は重要な副刺激分子である（Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：６２５；Ｆｒｅｅｍａｎら（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：２７１４；Ａｚｕｍａら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６６：７６；Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２：９０９）。Ｂ７−２は一次免疫反応中に主な役割を果たすと考えられるが、免疫反応の過程において後の方でアップレギュレートされるＢ７−１は、一次Ｔ細胞反応の延長または二次Ｔ細胞反応の副刺激において重要であり得る（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ２：５５５）。
【０００４】
Ｂ７−１およびＢ７−２が結合する１つのレセプターであるＣＤ２８は本質的に静止Ｔ細胞上で発現され、活性化後発現が増大する。Ｔ細胞レセプターによるシグナリング後、ＣＤ２８のライゲーションおよび副刺激シグナルの変換はＴ細胞を増大させ、ＩＬ−２を分泌させる（Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．ら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：７２１−７３０；Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．ら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：６５７５−６５７９；Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．ら（１９９０）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ１１：２１１−６；Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．Ａ．ら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ３５６：６０７−６０９）。ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）と称する二次レセプターはＣＤ２８と相同性であるが、静止Ｔ細胞上で発現されず、Ｔ細胞活性化後に現れる（Ｂｒｕｎｅｔ，，Ｊ．ら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２８：２６７−２７０）。ＣＴＬＡ４はＴ細胞反応の負の制御において重要であるように思われる（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：９８５）。ＣＴＬＡ４のブロックは、抑制シグナルを除去することが見いだされ、一方ＣＴＬＡ４の凝集はＴ細胞反応をダウンレギュレートする抑制シグナルを提供することが見いだされている（ＡｌｌｉｓｏｎおよびＫｒｕｍｍｅｌ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：９３２）。Ｂ７分子はＣＤ２８についてよりもＣＴＬＡ４についてより高い親和性を有し（Ｌｉｎｓｌｅｙ，Ｐ．Ｓ．ら（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４：５６１−５６９）、Ｂ７−１およびＢ７−２はＣＴＬＡ４分子の別個の領域に結合し、ＣＴＬＡ４に対する結合の異なる反応の仕組みを有することが判明している（Ｌｉｎｓｌｅｙら（１９９４）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１：７９３）。ＣＤ２８およびＣＴＬＡ４に関連する新規分子であるＩＣＯＳが同定され、新規Ｂ７ファミリーのメンバーであるそのリガンドを有するために（Ａｉｃｈｅｒ，Ａら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１０４０−７；Ｂｒｏｄｉｅ Ｄ．ら（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．１０：３３３−６；Ｌｉｎｇ Ｖ．ら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１６５３−７；Ｙｏｓｈｉｎａｇａ Ｓ．Ｋ．ら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ４０２：８２７−３２））、ＩＬ−１０の産生において重要であると考えられる（Ｈｕｔｌｏｆｆら（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ３９７：２６３；ＷＯ９８／３８２１６）。Ｔ細胞がさらなる副刺激シグナルを受容することなくＴ細胞レセプターによってのみ刺激されるならば、これらは非反応性になるか、アネルギーになるか、または死に、その結果、免疫反応のダウンレギュレーションに至る。
【０００５】
Ｂ７：ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４副刺激経路の重要性は、インビトロといくつかのインビボモデルシステムにおいて証明されている。この副刺激経路をブロックすると、ネズミおよびヒト系において抗原特異的な耐性が発生する（Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｆ．Ａ．ら（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ３５６：６０７−６０９；Ｌｅｎｓｃｈｏｗ，Ｄ．Ｊ．ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：７８９−７９２；Ｔｕｒｋａ，Ｌ．Ａ．ら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１１１０２−１１１０５；Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６５８６−６５９０；Ｂｏｕｓｓｉｏｔｉｓ，Ｖ．ら（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：１７５３−１７６３）。反対に、Ｂ７ネガティブなネズミ腫瘍細胞によるＢ７の発現は、腫瘍拒絶および腫瘍攻撃に対する長期間持続する防御を伴うＴ細胞により媒介される特異的免疫を誘発する（Ｃｈｅｎ，Ｌ．ら（１９９２）Ｃｅｌｌ７１：１０９３−１１０２；Ｔｏｗｎｓｅｎｄ，Ｓ．Ｅ．およびＡｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５９：３６８−３７０；Ｂａｓｋａｒ，Ｓ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ９０：５６８７−５６９０）。従って、副刺激経路の操作は、ヒトにおける免疫反応を刺激または抑制するための非常に大きな可能性をもたらす。
【０００６】
発明の概要
本発明は、少なくとも一部は、ＰＤ−１が、抗原提示細胞上に発現されるＢ７−４分子のレセプターであるという発見に基づく。ＰＤ−１はＣＴＬＡ４と同様に負のシグナルを免疫細胞に伝達する。Ｂ４−７分子は抗原提示細胞の表面上に発現され、副刺激シグナルを免疫細胞に提供し、これらが結合する分子に応じて、免疫細胞に下方調節シグナルを伝達することができる。従って、ＰＤ−１、Ｂ７−４および／または、Ｂ７−４とＰＤ−１間の相互作用の結果、免疫応答が調節される。
【０００７】
従って、一態様において、本発明は免疫反応を調節する方法であって、免疫細胞をＰＤ−１によるシグナリングを調節する化学物質と接触させ、これにより免疫反応を調節することを含む方法に関する。免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、または骨髄細胞であってよい。一態様において、接触ステップはインビボで起こる。もう一つ別の態様において、接触ステップはインビトロで起こる。
１つの具体例では、免疫反応がダウンレギュレートされる。これは、例えば、ＰＤ−１を認識する活性化抗体、抑制性レセプターに結合するＢ７−４形態、およびＰＤ−１に結合する小分子から成る群から選択される試薬を用いてＰＤ−１を経るシグナリングを刺激することにより生じてよい。
１つの具体例において、ＰＤ−１を経るシグナリングの刺激により、免疫細胞において、免疫細胞においてアネルギーが誘導される。
該方法は、免疫細胞を、免疫反応をダウンレギュレートするさらなる試薬と接触させることをさらに含んでよい。
【０００８】
さらに他の具体例においては、免疫反応がＰＤ−１を経るシグナリングの阻害によりアップレギュレートされる。ＰＤ−１を経するシグナリングは、ＰＤ−１を認識するブロッキング抗体、Ｂ７−４の非活性化形態、Ｂ７−４を認識する抗体、およびＰＤ−１の溶解形態から成る群から選択される試薬を用いて阻害されてよい。
【０００９】
他の態様では、本発明は、免疫細胞における抑制性レセプターとのＢ７−４の相互作用を調節する方法であって、免疫細胞上の抑制性レセプターとのＢ７−４の相互作用が調節されるように、Ｂ７−４を発現する抗原提示細胞と、Ｂ７−４形態、ＰＤ−１形態、Ｂ７−４とＰＤ−１の相互作用を調節する試薬から成る群から選択される試薬とを接触させることを含む方法を含む。免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、または骨髄細胞であってよい。１つの具体例において、接触させるステップはインビトロで行う。他の具体例では、接触させるステップはインビボで行う。本方法は、免疫細胞または抗原提示細胞を、免疫反応を調節するさらなる試薬と接触させることをさらに含んでよい。
【００１０】
他の態様において、本発明は、非アポトーシス機構により免疫細胞の活性化を阻害する方法であって、免疫細胞の活性化が阻害されるように、免疫細胞におけるＰＤ−１の活性または発現を増すことを含む方法を含む。
他の態様において、本発明は、免疫細胞においてＰＤ−１を経るシグナリングを阻害する抗原および試薬を含むワクチンを含む。
他の態様において、本発明は、免疫細胞におけるＰＤ−１を経るシグナリングを促進する抗原および試薬を含む組成物を含む。
【００１１】
他の態様において、本発明は、免疫反応のアップレギュレーションから利益を得るであろう疾患を有する対象を治療する方法であって、免疫反応のアップレギュレーションから利益を得るであろう疾患が治療されるように、対象の免疫細胞におけるＰＤ−１を経るシグナリングを阻害する試薬を投与することを含む方法を含む。疾患は、例えば、腫瘍、神経学的疾患、または免疫抑制疾患であってよい。１つの具体例において、ＰＤ−１を経るシグナリングを阻害する試薬には、ＰＤ−１またはＢ７−４の溶解形態が含まれる。１つの具体例では、方法は、免疫反応をアップレギュレートする第２の試薬を対象に投与することをさらに含む。
【００１２】
他の態様においては、発明は、免疫反応のダウンレギュレーションから利益を得るであろう疾患を有する対象を治療する方法であって、免疫反応のダウンレギュレーションから利益を得るであろう疾患が治療されるように、対象の免疫細胞においてＰＤ−１を経するシグナリングを刺激する試薬を投与することを含む方法を含む。疾患は、例えば、移植、アレルギー、または自己免疫疾患であってよい。１つの具体例においては、ＰＤ−１を経るシグナリングを刺激する試薬は、ＰＤ−１を経るシグナリングを刺激する抗体、二重特異性抗体、または溶解Ｂ７−４である。方法は、免疫反応をダウンレギュレートする第２の試薬を対象に投与することをさらに含んでよい。
【００１３】
他の態様では、本発明は、Ｂ７−４またはＰＤ−１の活性を調節する化合物をスクリーニングするための細胞に基くアッセイであって、Ｂ７−４標的分子またはＰＤ−１標的分子を発現している細胞を試験化合物と接触させて、試験化合物がＢ７−４またはＰＤ−１標的分子の活性を調節する能力を決定することを含むアッセイを含む。
【００１４】
さらに他の態様において、発明は、Ｂ７−４またはＰＤ−１の標的分子に対する結合を調節する化合物をスクリーニングするためのセルフリーのアッセイであって、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質または生物学的活性なその部分を試験化合物と接触させること、および試験化合物がＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質または生物学的に活性なその部分と結合する能力を決定することを含むアッセイを含む。
【００１５】
図面の簡単な説明
図１は、ヒトの分泌Ｂ７−４、Ｂ７−４Ｓをエンコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を表す。
図２は、ヒトＢ７−４、Ｂ７−４Ｍをエンコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を表す。
図３は、ヒトＢ７−４Ｓのアミノ酸配列（配列番号２）を示し、シグナル、ＩｇＶ、ＩｇＣ、および疎水性末端ドメインを示す。
図４は、ヒトＢ７−４Ｍのアミノ酸配列（配列番号４）を示し、シグナル、ＩｇＶ、ＩｇＣ、および膜貫通および細胞質を示す。
図５Ａ−５Ｂは、ネズミのＢ７−４のヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す。
図６は、ネズミのＢ７−４のアミノ酸配列（配列番号２３）を示す。
図７は、ヒトＢ７−ＭおよびネズミＢ７−４アミノ酸配列のアライメントを示す（それぞれ、配列番号４および２３）。
図８は、Ｂ７−４Ｍ−トランスフェクトＣＯＳ細胞によるＣＤ２８Ｉｇ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、およびコントロールＩｇの結合のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
図９は、Ｂ７−４Ｍ−トランスフェクトＣＯＳ細胞によるＩｇＧおよびネズミＩＣＯＳ−ヒス融合タンパク質の結合のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
図１０は、Ｂ７−４Ｍ−トランスフェクトＣＯＳ細胞に対するＩｇＭ、ＢＢ１および１３３抗体の結合の、ＦＡＣＳ分析の結果を示す。
図１１は、Ｂ７−４Ｍ（２９２）でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞がＴ細胞の増殖を副刺激することができることを示す。
図１２は、Ｂ７−４Ｍ（２９２）でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞がＴ細胞の増殖を副刺激することができることを示す。
図１３Ａ−１３Ｄは、Ｂ７−４ＭトランスフェクトＣＯＳ細胞へのＰＤ−１の結合を示す。
図１４Ａ−１４Ｆは、追加されたＰＤ−１の、およびＦｌｔ４でないの、ＰＤ−１のＢ７−４トランスフェクトＣＯＳ細胞への結合を完了する能力を示す。
図１５Ａ−１５Ｌは、フローサイトメトリーにより決定される、Ｂ７−４トランスフェクトＣＨＯ細胞へ結合するＰＤ−１の能力を示す。
図１６は、ＢＩＡＣＯＲＥ分析により決定される、Ｂ７−４トランスフェクトＣＨＯ細胞へ結合するＰＤ−１の能力を示す。
図１７は、Ｔ細胞へネガティブシグナルを伝達するＢ７−４Ｍの能力を示す。
図１８Ａ−１８Ｃは、Ｂ７−４の存在下に刺激されたヒトＴ細胞におけるＴ細胞増殖およびサイトカイン産生の阻害を示す。
図１９Ａ−１９Ｂは、ＣＤ２８副刺激の存在下でのＴ細胞レセプター／Ｂ７−４の活性化がＴ細胞の増殖の阻害を生じることを示す。
図２０Ａ−２０Ｉは、Ｂ７−４を発現しているＣＨＯ細胞に対するＰＤ−１の結合を示す。
図２１Ａ−２１Ｄは、ＣＤ２８シグナルの阻害におけるＢ７−４の活性を示す。
図２２Ａ−２２Ｄは、サイトカインＥＬＩＳＡにより測定される、ＰＤ−１：Ｂ７−４経路によるサイトカイン産生の阻害を示す。
図２３Ａ−２３Ｃは、サイトカインｍＲＮＡレベルにより測定される、ＰＤ−１：Ｂ７−４経路によるサイトカイン産生の阻害を示す。
図２４Ａ−２４Ｃは、ＰＤ−１：Ｂ７−４経路の活性のメカニズムが細胞周期の停止であることを示す。
図２５Ａ−２５Ｂは、Ｂ７−４およびＰＤ−１の間の相互作用を阻害する、Ｂ７−４に対する抗体の能力を示す。
図２６はＰＤ−１に対する抗体がＢ７−４とＰＤ−１間の相互作用を阻害する能力を表す。
図２７は実験的自己免疫脳脊髄炎のネズミモデルにおいて溶解性Ｂ７−４Ｆｃが疾患を悪化させる能力を表す。
図２８Ａ〜２８Ｂは、有糸細胞分裂に関するＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用の影響を表す。Ｔ細胞をＣＳＦＥで標識し、ｃｔｒｌ．ＦｃまたはｍＢ７−４Ｆｃｂビーズで刺激した。表示した時点で、ＦＡＣＳ分析を行った。Ｌｉｖｅ−ｇａｔｅｄ事象を図示する。図２８Ａ：ＣＤ４＋Ｔ細胞。図２８Ｂ：ＣＤ８＋Ｔ細胞。ＰＤ−１：Ｂ７−４相互用の結果、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の有糸分裂が減少する。
図２９Ａから２９ＣはＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用によるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の阻害を表す。図２９Ａは細胞系および実験デザインを概略的に表す。安定な抗原提示細胞（ＡＰＣ）系を、レトロウイルステクノロジーを用いてＧＦＰまたはｍＢ７−４／ＧＦＰを発現するように操作する。ＴＣＲトランスジェニック（Ｔｇ）マウスから得られる５×１０４の精製ＬＮ Ｔ細胞をＡＰＣ；ペプチドで２、２〜３、３、または４日間刺激した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む実験に関して、ＡＰＣ：Ｔ細胞比は１０μＭ ＰＣＣＦペプチドで１：１０であった。ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む実験に関して、ＡＰＣ：Ｔ細胞比は１ｍＭｐ２Ｃａペプチドで１：１であった。図２９ＢはＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用によるＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の阻害を表す。図２９ＣはＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用によるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の阻害を表す。
図３０Ａ〜３０Ｂは、ＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用によるＣＤ４＋（ＣＤ８＋でない）Ｔ細胞増殖の阻害を克服するための副刺激の能力を表す。図３０Ａ：ＣＤ４＋Ｔ細胞 図３０Ｂ：ＣＤ８＋Ｔ細胞。
図３１Ａ〜３１ＢはＰＤ−１シグナリング経路において関与するタンパク質を同定するために用いられるスクリーニングアッセイを概略的に表す。図３１Ａはアッセイのステップの概略図を表す。図３１ＢはヒトＰＤ−１のフラグメント（配列番号２４）、マウスＰＤ−１のフラグメント（配列番号２５）およびアッセイにおいて用いられるペプチドの配列を表す。アッセイにおいて用いられるペプチドはＩＴＩＭペプチド：ＰＤ−１＿Ｐｙ１（配列番号２６）；ＰＤ−１＿Ｙ１Ｆ（配列番号２７）；ＰＤ−１＿Ｙ１（配列番号２８）；ＰＤ−１＿Ｐｙ２（配列番号２９）；ＰＤ−１＿Ｙ２Ｆ（配列番号３０）；ＰＤ−１＿Ｙ２（配列番号：３１）；および他のペプチド：ＰＤ−１＿Ｋ２１２＿（配列番号３２）；ＰＤ−１＿Ｋ２１２Ｄ（配列番号３３）；ＰＤ−１＿Ｋ３３５（配列番号３４）；ＰＤ−１＿Ｋ３３５Ｄ（配列番号３５）；ＰＤ−１＿Ｃｔａｉｌ１（配列番号３６）；およびＰＤ−１＿Ｃｔａｉｌ２（配列番号３７）であった。
図３２は、ＰＤＬ１．Ｉｇ融合タンパク質の存在下または不在下での、刺激されていない、または５分、３０分、または９０分間刺激されたヒトＴ細胞の分画細胞抽出物を含んでいるウェスタンブロットの写真である。ブロットをリン酸化ＥＲＫ１および２に特異的な抗体でプローブした。
図３３はＢ７−４．Ｉｇ融合タンパク質の存在（＋）または不在（−）下での、刺激されていない、または５分、３０分、９０分、または２時間刺激されたヒトＴ細胞の分画細胞抽出物を含んでいるウェスタンブロットの写真である。ブロットは、リン酸化ＰＫＣ−θ（抗−ホスホ−ＰＫＣ−θ）を特異的に検出する、リン酸化ＰＫＣ−θに特異的な抗体でプローブした。ゲルを細長く切り、リン酸化および非リン酸化ＰＫＣ−θ（抗−ＰＫＣ−θ）の両方を認識する抗体でプローブした。
【００１６】
発明の詳細な記載
すでに特徴づけられたＢリンパ球活性化抗原、たとえばＢ７−１およびＢ７−２に加えて、免疫細胞の副刺激を調節する抗原提示細胞の表面上に他の抗原が存在する。例えば、Ｂ７−４ポリペプチドは、ケラチン生成細胞および胎盤ｃＤＮＡライブラリーから単離されている。Ｂ７−４は、Ｔ細胞を副刺激または阻害することも見出されている。本発明は、Ｂ７−４に対するレセプターとしてＰＤ−１を同定する。
【００１７】
免疫細胞は、活性化シグナルを伝達するレセプターを有する。たとえば、Ｔ細胞はＴ細胞レセプターおよびＣＤ３複合体を有し、Ｂ細胞はＢ細胞レセプターを有し、脊髄細胞はＦｃレセプターを有する。加えて、免疫細胞は、副刺激シグナルまたはレセプター媒介性シグナリングを阻害するシグナルを伝達するレセプターを提供するシグナルを伝達するレセプターを有する。たとえば、ＣＤ２８はＴ細胞に副刺激シグナルを伝達する。Ｔ細胞レセプターのライゲーション後、ＣＤ２８のライゲーションの結果、たとえばＩＬ−２ｒα、ＩＬ−２ｒβ、およびＩＬ−２ｒγレセプターのアップレギュレーションにより特徴づけられる副刺激シグナルが生じ、ＩＬ−２メッセンジャーＲＮＡの転写が増大し、サイトカイン遺伝子（ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦ−αを含む）の発現が増大する。副刺激シグナルの伝達により、細胞が細胞サイクルを進行し、こうしてＴ細胞増殖が増大する（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄら（１９９８）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８：３８９）。Ｂ７ファミリー分子、たとえばＢ７−４による副刺激シグナルを細胞に伝達するＴ細胞上のレセプターの結合（たとえば、サイトカイン分泌および／またはＴ細胞の増殖に至る副刺激レセプターのライゲーション）の結果、副刺激が生じる。従って、Ｂ７ファミリー分子、たとえばＢ７−４と免疫細胞上の副刺激シグナルを伝達するレセプター間の相互作用の阻害の結果、免疫応答および／または特異的非同調性（免疫細胞アネルギーと称する）がダウンモジュレートされる。この相互作用の阻害は、抗ＣＤ２８Ｆａｂフラグメント、Ｂ７−１、Ｂ７−２および／またはＢ７−４に対する抗体、またはＢ７ファミリーメンバー分子が競合的インヒビターとして結合出来るレセプターの溶解形態を用いることにより達成できる。
【００１８】
副刺激分子と結合する阻害レセプターはさらに免疫細胞上でも同定された。ＣＴＬＡ４の活性化は、たとえば負のシグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＴＬＡ４の関与はＩＬ−２産生を阻害し、細胞サイクル阻止を誘発できる（ＫｒｕｍｍｅｌおよびＡｌｌｉｓｏｎ（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２５３３）。加えて、ＣＴＬＡ４が欠失したマウスはリンパ組織増殖疾患を発症する（Ｔｉｖｏｌら（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ３：５４１；Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：９８５）。ＣＴＬＡ４の抗体でのブロックは、阻害シグナルをブロックし、一方ＣＴＬＡ４の抗体との凝集は阻害シグナルを伝達する。従って、副刺激分子が結合するレセプターに応じて（すなわち、副刺激レセプター、たとえば、ＣＤ２８または阻害レセプター、たとえばＣＴＬＡ４）、Ｂ７−４を含むある種のＢ７分子はＴ細胞副刺激または阻害を促進できる。
ＰＤ−１は分子のイムノグロブリンファミリーのメンバーである（Ｉｓｈｉｄａら（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：３８８７；Ｓｈｉｎｏｈａｒａら（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２３：７０４）。ＰＤ−１はプログラムされた細胞死のモジュレーターを同定するためにデザインされたサブトラクションクローニングに基づく方法を用いてすでに同定された（Ｉｓｈｉｄａら（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：３８８７−９５；Ｗｏｒｏｎｉｃｚら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００：１３７）。ＰＤ−１はリンパ球生存において、たとえばクローン選択中に役割を果たすと考えられる（Ｈｏｎｊｏ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５８：５９１；Ａｇａｔａら（１９９６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．８：７６５；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９９６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．８：７７３）。ＰＤ−１はＢ細胞応答のレギュレーターとしても関与した（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１０：１５６３）。Ｔ細胞上にのみ見いだされるＣＴＬＡ４と違って、ＰＤ−１はＢ細胞および骨髄細胞上においても見いだされる。
【００１９】
ＰＤ−１がＢ７−４と結合するという事実から、ＰＤ−１はＣＴＬＡ４に関する阻害レセプターのファミリーに帰属される。副刺激レセプターの関与（活性化を生じるための）の結果、免疫細胞において副刺激シグナルが生じ、一方阻害レセプター、例えばＣＴＬ４またはＰＤ−１の関与（例えば、架橋または凝集による）は、免疫細胞における阻害シグナルの伝達に至り、その結果、免疫細胞応答および／または免疫細胞アネルギーがダウンモジュレーションされる。阻害シグナルの伝達は免疫細胞応答のダウンモジュレーションに至り（その結果として全体的な免疫応答がダウンモジュレートされる）、免疫細胞における阻害シグナルの（例えば、ＰＤ−１に対する非活性化抗体を用いることによる）防止は、免疫細胞応答のアップモジュレーションに至る（その結果、免疫応答がアップモジュレートされる）。
本発明は、ＰＤ−１の活性および／または発現；ＰＤ−１とその天然のリガンド間の相互作用の調節に有用な化学物質、およびＰＤ−１とその天然リガンド、例えばＰＤ−１としても知られるＢ７−４間の相互作用の調節により免疫応答を調節する化学物質を利用する。これらの方法において使用される調節剤の例を次にさらに記載する。
【００２０】
Ｂ７−４およびＰＤ−１核酸およびポリペプチド分子
一態様において、ＰＤ−１の活性および／または発現の調節に有用な調節剤はＢ７−４および／またはＰＤ−１核酸分子、好ましくはヒトＢ７−４および／またはＰＤ−１核酸分子である。
一態様において、本発明の単離された核酸分子は、真核生物Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドをエンコードする。分子のＢ７−４ファミリーは、シグナルドメイン、ＩｇＶドメインおよびＩｇＣドメインを含む多くの保存されたドメインを共有する。ＩｇＶドメインおよびＩｇＣドメインは当該分野で認知されるＩｇスーパーファミリーメンバードメインである。これらのドメインは、Ｉｇフォールドと呼ばれる独立したフォールディングパターンを有する構造単位に対応する。Ｉｇフォールドは２つのβシートのサンドイッチからなり、それぞれ、全部ではないがほとんどのドメインにおいて２シート間に保存されたジスルフィド結合がある、５〜１０個のアミノ酸の平行でないβ鎖からなる。ＩｇのＩｇＣドメイン、およびＭＨＣ分子は同じタイプの配列パターンを共有し、Ｉｇスーパーファミリー内のＣ１−セットと呼ばれる。他のＩｇＣドメインは他のセットに含まれる。ＩｇＶドメインも配列パターンを共有し、Ｖセットドメインと呼ばれる。ＩｇＶドメインはＣ−ドメインよりも長く、β鎖のさらなる対を形成する。
ヒトＢ７−４分子の２つの形態が同定されている。一の形態は天然に存在するＢ７−４可溶性ポリペプチド、すなわち短い親水性ドメインを有し、貫膜ドメインを有さず、本明細書においてはＢ７−４Ｓと称する（配列番号２に示す）。第二の形態は、細胞関連ポリペプチド、すなわち貫膜および細胞質ドメインを有し、Ｂ７−４Ｍと称するものである（配列番号４に示す）。
【００２１】
Ｂ７−４タンパク質は、シグナル配列、ならびにＩｇＶドメインおよびＩｇＣドメインを含む。配列番号２のシグナル配列は、およそアミノ酸１ないしおよそアミノ酸１８までで示される。配列番号４のシグナル配列は、およそアミノ酸１ないしおよそアミノ酸１８までで示される。配列番号２のＩｇＶドメインはおよそアミノ酸１９ないしおよそアミノ酸１３４間で示され、配列番号４のＩｇＶドメインはおよそアミノ酸１９ないしおよそアミノ酸１３４間で示す。配列番号２のＩｇＣドメインをおよそアミノ酸１３５ないしおよそアミノ酸２２７まで示され、配列番号４のＩｇＣドメインはおよそアミノ酸１３５ないしおよそアミノ酸２２７まで示される。配列番号２において例示されるＢ７−４の親水性テールは、およそアミノ酸２２８からおよそアミノ酸２４５まで示される親水性テールを含む。配列番号４に例示されるＢ７−４ポリペプチドは、配列番号４のおよそアミノ酸２３９からおよそアミノ酸２５９に示す貫膜ドメインと配列番号４のおよそアミノ酸２６０からおよそアミノ酸２９０までに示す細胞質ドメインを含む。
【００２２】
ネズミＢ７−４分子も同定された。ネズミｃＤＮＡ配列を図５Ａから５Ｂに示し、ネズミＢ７−４アミノ酸配列を図６に示す。本発明はさらにこれらのネズミＢ７−４分子に関する。
【００２３】
ＰＤ−１分子は、Ｂ７−４に結合するレセプターとして本明細書中に同定される。ＰＤ−１分子は、イムノグロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーである。ＰＤ−１（Ｉｓｈｉｄａら（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：３８８７；Ｓｈｉｎｏｈａｒａら（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２３：７０４；米国特許第５６９８５２０号）は、イムノグロブリンスーパーファミリードメイン、貫膜ドメイン、およびイムノレセプターチロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内領域を含む。これらの特性は、免疫阻害レセプターと呼ばれるさらに大きな分子のファミリーを定義し、これらはｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、およびキラー阻害レセプター（ＫＩＲ）も含む（ＶｉｖｉｅｒおよびＤａｅｒｏｎ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ １８：２８６）。これらのレセプターのチロシルリン酸化ＩＴＩＭモチーフがホスファターゼを含むＳＨ−２ドメインと相互作用し、これが阻害シグナルを生じると考えられる。これらの免疫阻害レセプターのサブセットはＭＨＣ分子、例えば、ＫＩＲと結合し、ＣＴＬＡ４はＢ７−１およびＢ７−２と結合する。ＭＨＣとＢ７遺伝子の間には系統発生論的関係があることが提案されている（Ｈｅｎｒｙら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ２０（６）：２８５−８）。
【００２４】
本ＰＤ−１のヌクレオチド配列を配列番号１０および１１に示し、ＰＤ−１のアミノ酸配列を配列番号１２に示す（Ｉｓｈｉｄａら（１９９２）ＥＭＢＯ Ｊ．１１：３８８７；Ｓｈｉｎｏｈａｒａら（１９９４）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２３：７０４；米国特許第５６９８５２０号参照）。ＰＤ−１は、アポトーシス細胞死に関連するタンパク質を選択するためのサブトラクションクローニングベースの方法を用いてすでに同定されている。ＰＤ−１は本明細書において、Ｂ７−４と結合するその能力に基づいて分子のＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーのメンバーとして同定されている。ＣＴＬＡ４と同様に、ＰＤ−１は抗ＣＤ３に応答してＴ細胞の表面上で迅速に誘発される（Ａｇａｔａら（１９９６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７６５）。しかしながらＣＴＬＡ４と対照的に、ＰＤ−１はＢ−細胞の表面上でも誘発される（抗ＩｇＭに応答して）。ＰＤ−１はさらに、胸腺細胞および骨髄細胞のサブセット上でも発現される（Ａｇａｔａら（１９９６）前出；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９９６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７７３）。本発明は、ＰＤ−１のリガンドとしてＢ７−４を同定する。
本発明の様々な態様を次のサブセクションにおいてさらに詳細に記載する。
【００２５】
１．定義
本明細書において用いられる「免疫細胞」なる用語は、造血起源のものであり、免疫応答において役割を果たすものを包含する。免疫細胞は、リンパ球、例えばＢ細胞およびＴ細胞；ナチュラルキラー細胞；骨髄細胞、例えば単球、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、好塩基球、および顆粒球を包含する。
本明細書において用いられる「Ｔ細胞」なる用語は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）を有する細胞を包含する。好ましくは、「Ｔ細胞」なる用語は、ＣＤ４＋Ｔ細胞および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞を包含する。Ｔ細胞なる用語はさらに、Ｔヘルパー１タイプＴ細胞およびＴヘルパー２タイプＴ細胞の両方を包含する。
【００２６】
「抗原提示細胞」なる用語は、プロフェッショナル抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞）ならびに他の抗原提示細胞（例えば、ケラチン生成細胞、内皮細胞、星状細胞、繊維芽細胞、乏突起膠細胞）を包含する。
【００２７】
本明細書において用いられる「免疫応答」なる用語は、Ｔ細胞副刺激の調節により影響を受けるＴ細胞性および／またはＢ細胞性免疫応答を包含する。免疫応答の例は、Ｔ細胞応答、例えば、サイトカイン産生、および細胞毒性を包含する。加えて、免疫応答なる用語は、Ｔ細胞活性化、例えば抗体産生（体液性応答）およびサイトカイン反応性細胞、例えばマクロファージの活性化により間接的に影響を受ける免疫応答を包含する。
【００２８】
本明細書において用いられる場合、「副刺激レセプター」なる用語は、免疫細胞に副刺激シグナルを伝達するレセプター、例えばＣＤ２８を包含する。本明細書において用いる場合、「阻害レセプター」なる用語は、負のシグナルを免疫細胞に伝達するレセプター（例えば、ＣＴＬＡ４またはＰＤ−１）を包含する。阻害レセプターにより変換される阻害シグナルは、副刺激レセプター（例えばＣＤ２８）が免疫細胞上に存在しなくても、従って阻害レセプターと副刺激分子の間の副刺激分子の結合に関する競合の関係でなくとも生じ得る（Ｆａｌｌａｒｉｎｏら（１９９８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：２０５）。阻害シグナルの免疫細胞への伝達は、免疫細胞における非反応性またはアネルギーまたはプログラムされた死になり得る。好ましくは、阻害シグナルの伝達は、アポトーシスに関与しないメカニズムにより作動する。
【００２９】
本明細書において用いる場合、「アポトーシス」なる用語は、当該分野において公知の技術を用いて特徴づけることができるプログラムされた細胞死を包含する。アポトーシス細胞死は、例えば、細胞収縮、膜水疱および細胞フラグメンテーションにおいて最高に達しているクロマチン縮合により特徴づけることができる。アポトーシスを受ける細胞は、ヌクレオソーム間ＤＮＡ開裂の特徴的なパターンも示す。
レセプターと結合するＢ７−４分子の形態に応じて、いずれかのシグナルが（例えば、レセプターの架橋を生じるＢ７−４分子の多価形態により）伝達または刺激され、またはシグナルが（例えば、Ｂ７−４の可溶性多価形態により）、例えばレセプターとの結合について活性化形態Ｂ７−４分子と競合することにより、阻害され得る。しかしながら、溶解性分子が刺激性であり得る例もある。様々な調節剤の効果は、本明細書に記載するような慣例的なスクリーニングアッセイを用いて容易に証明することができる。
【００３０】
本明細書において用いる場合、活性化された免疫細胞に関する「副刺激」なる用語は、副刺激分子が、増殖またはエフェクター機能を誘発する第二の非活性化レセプター性シグナル（「副刺激シグナル」）を提供する能力を包含する。例えば、副刺激シグナルの結果、サイトカインが例えばＴ細胞レセプター性シグナルを受容したＴ細胞において分泌され得る。細胞−レセプター性シグナル、例えば活性化レセプターを受容した免疫細胞は、本明細書において「活性化免疫細胞」と称する。
【００３１】
本明細書において使用する場合、「活性化レセプター」なる用語は、抗原、複合化抗原（例えばＭＨＣ分子に関連して）を結合するか、または抗体と結合する免疫細胞レセプターを包含する。かかる活性化レセプターは、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）、Ｂ細胞レセプター（ＢＣＲ）、サイトカインレセプター、ＬＰＳレセプター、補体レセプター、およびＦｃレセプターを包含する。
例えば、Ｔ細胞レセプターはＴ細胞上に存在し、ＣＤ３分子と関連する。Ｔ細胞レセプターは、ＭＨＣ分子に関連する抗原により（ならびにポリクローナルＴ細胞活性化試薬により）刺激される。ＴＣＲを介したＴ細胞活性化の結果、環状ヌクレオチド変化、ＲＮＡ転写変化、タンパク質合成変化、および細胞体積変化が生じる。
【００３２】
Ｂ細胞レセプターは、Ｂ細胞上に提示される。Ｂ細胞抗原レセプターはメンブランＩｇ（ｍＩｇ）と他のトランスメンブランポリペプチド（例えば、ＩｇαおよびＩｇβ）間の複合体である。ｍＩｇのシグナル変換機能は、オリゴマーまたはマルチマー抗原によるレセプター分子の架橋により引き起こされる。Ｂ細胞は、抗イムノグロブリン抗体によっても活性化できる。ＢＣＲ活性化により、Ｂ細胞においてチロシンリン酸化を含む多くの変化が起こる。
Ｆｃレセプターは、免疫応答に関与する多くの細胞上で見いだされる。Ｆｃレセプター（ＦｃＲ）はイムノグロブリン分子（Ｉｇ）のＦｃ部分の細胞表面レセプターである。現在のところ同定されているヒトＦｃＲには、ＩｇＧ（ＦｃγＲと称する）、ＩｇＥ（ＦｃεＲ１）、ＩｇＡ（Ｆｃα）、および重合ＩｇＭ／Ａ（ＦｃμαＲ）を認識するものが含まれる。ＦｃＲは次の細胞タイプにおいて見いだされる：ＦｃεＲＩ（肥満細胞）、ＦｃεＲ．ＩＩ（多くのリンパ球）、ＦｃαＲ（好中球）、およびＦｃμαＲ（腺上皮、肝細胞）（Ｈｏｇｇ，Ｎ．（１９８８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ９：１８５−８６）。広く研究されているＦｃγＲは細胞性免疫防御の中心であり、炎症のメディエーターおよび自己免疫疾患の発生機序に関与する加水分解酵素の放出の刺激の原因である（Ｕｎｋｅｌｅｓｓ，Ｊ．Ｃ．ら（１９８８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２５１−８１）。マクロファージ／単球、多形核白血球、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞ＦｃγＲはＩｇＧにより媒介される特異的認識の要素を賦与するので、ＦｃγＲはエフェクター細胞とＩｇを放出するリンパ球間の非常に重要な結合を提供する。ヒト白血球はＩｇＧ：ｈＦｃγＲＩ（単球／マクロファージ上に見いだされる）、ｈＦｃγＲＩＩ（単球、好中球、好酸球、血漿板、おそらくはＢ細胞、およびＫ５６２細胞系上）、およびＦｃγＩＩＩ（ＮＫ細胞、好中球、好酸球、およびマクロファージ上）の少なくとも３つの異なるレセプターを有する。
【００３３】
Ｔ細胞に関して、Ｔ細胞に対する副刺激シグナルの伝達は、シクロスポリンＡにより阻害されないシグナリング経路を含む。加えて、副刺激シグナルはＴ細胞においてサイトカイン分泌（例えば、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１０）および／または抗原に対する非反応性の誘発、アネルギーの誘発、Ｔ細胞における細胞死の誘発を防止することができる。
【００３４】
本明細書において使用する場合、「阻害シグナル」なる用語は、免疫細胞上の分子の阻害レセプター（例えばＣＴＬＡ４またはＰＤ−１）により伝達されるシグナルを意味する。かかるシグナルは、活性化レセプター（例えば、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＢＣＲ、またはＦｃ分子による）により産生されるシグナルを拮抗し、その結果、例えば第二のメッセンジャー生成の阻害；増殖の阻害；免疫細胞におけるエフェクター機能の阻害、たとえば食作用の低下、抗体産生の低下、細胞毒性の低下、免疫細胞がメディエーター（例えば、サイトカイン（例えばＩＬ−２）および／またはアレルギー反応のメディエーター）を産生できないこと；またはアネルギーの発生が起こる。
【００３５】
本明細書において用いられる場合、「非反応性」なる用語は、刺激、例えば活性化レセプターまたはサイトカインによる刺激に対する免疫反応の不応性を包含する。非反応性は例えば、免疫抑制物質への暴露または高用量の抗原への暴露のために起こり得る。本明細書において用いられる場合、「アネルギー」または「耐性」なる用語は、活性化レセプター媒介性刺激に対する不応性を包含する。かかる不応性は、一般に抗原特異性であり、耐性化している抗原への暴露が終わった後にも存続する。例えば、Ｔ細胞におけるアネルギー（非反応性に対して）はサイトカイン、例えばＩＬ−２がないことにより特徴づけられる。Ｔ細胞アネルギーは、Ｔ細胞が抗原に暴露され、第二シグナル（副刺激シグナル）の不在下で第一シグナル（Ｔ細胞レセプターまたはＣＤ−３媒介性シグナル）を受容する場合に起こる。これらの条件下で、細胞を同じ抗原に再暴露すると（暴露が副刺激分子の存在下で起こる場合でも）、結果としてサイトカインが産生されず、従って増殖しない。しかしながら、アネルギーＴ細胞は、関連しない抗原に対する応答を起こし、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）とともに培養するならば増殖し得る。例えば、Ｔ細胞アネルギーは、ＥＬＩＳＡにより測定されるようなＴリンパ球によるＩＬ−２産生がないこと、あるいはインジケーター細胞系を用いる増殖分析によりを観察できる。別法として、レポーター遺伝子構築物を用いることができる。例えば、アネルギーＴ細胞は、５’ＩＬ−２遺伝子エンハンサーの制御下でヘテロローガスなプロモーターによるか、またはエンハンサー内に見いだすことができるＡＰ１配列のマルチマーにより誘発されるＩＬ−２遺伝子転写を開始しない（Ｋａｎｇら、（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：１１３４）。
【００３６】
Ｂ７−４タンパク質および核酸分子は、ある種の保存された構造的および機能的特徴を有する分子のファミリーを含む。同様に、ＰＤ−１タンパク質および核酸分子は、保存された構造的および機能的特徴を有する分子のファミリーのメンバーである。「ファミリー」なる用語は、タンパク質および核酸分子についていう場合、共通の構造的ドメインまたはモチーフを有し、本明細書において定義するような十分なアミノ酸またはヌクレオチド配列相同性を有する２以上のタンパク質または核酸分子を意味することを意図される。かかるファミリーメンバーは、天然に存在するかまたは天然に存在せず、同じまたは異なる種のいずれかから得ることができる。例えば、ファミリーはヒト起源の第一のタンパク質、ならびに他のヒト起源の異なるタンパク質を含むことができるか、あるいは別に、ヒト以外の起源の相同物を含むことができる。ファミリーのメンバーはさらに共通の機能的特徴を有し得る。本明細書において記載するＢ７−４分子は分子のＢ７ファミリーのメンバーである。本明細書において用いられる「Ｂ７ファミリー」または「Ｂ７分子」なる用語は、Ｂ７ポリペプチド、例えばＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−（抗体ＢＢ−１により認識される）、Ｂ７ｈ（Ｓｗａｌｌｏｗら（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ１１：４２３）、および／またはＢ７−４と配列相同性を共有する副刺激分子を含む。例えば、デフォルトのパラメータを用いてＮＣＢＩのＢＬＡＳＴプログラム（ギャップペナルティーが存在１１および拡張１に設定されたＢｌｏｓｕｒｍ６２マトリックス（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ））を用いて比較した場合に、ヒトＢ７−１およびＢ７−２は約２６％のアミノ酸配列同一性を共有する。
【００３７】
好ましいＢ７ポリペプチドは、免疫細胞に副刺激または阻害シグナルを提供でき、これにより免疫細胞応答を促進または阻害できる。例えば、副刺激レセプターと結合した場合に、Ｂ７−４は免疫細胞の副刺激を誘発できるか、または例えば溶解形態において存在する場合に免疫細胞副刺激を阻害できる。阻害レセプターと結合する場合、Ｂ７−４分子は阻害シグナルを免疫細胞に伝達することができる。一態様において、Ｂ７ファミリーメンバーは免疫細胞上の１以上のレセプター、好ましいＢ７ファミリーのメンバーには、Ｂ７−４、Ｂ７−２、Ｂ７−３（抗体ＢＢ−１により認識される）、Ｂ７ｈ、およびＢ７−４、および溶解性フラグメントまたはその誘導体が含まれる。例えばＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１および／または他のレセプターと結合し、レセプターに応じて、免疫細胞、好ましくはＴ細胞に阻害シグナルまたは副刺激シグナルを伝達する能力を有する。
【００３８】
好ましいＰＤ−１分子は免疫細胞に阻害シグナルを伝達でき、これにより免疫細胞エフェクター機能を阻害するか、あるいは例えば溶解性モノマー形態において存在する場合に免疫細胞の副刺激を（例えば、競合的阻害により）促進することができる。ＰＤ−１誘導性シグナリング（本明細書中ではＰＤ−１を経るシグナリングとも呼ばれる）は、本明細書中、その細胞表面上でＰＤ−１を発現する免疫細胞において、レセプターの、ＰＤ−１を活性化するリガンドまたは他の分子への結合により直接的または間接的に誘導される１またはそれ以上の細胞現象と定義される。ＰＤ−１の活性化により、細胞の変化を生じる二次的なシグナリング現象が誘発される。そのような細胞現象は、例えば、Ｔ細胞活性化アッセイにおける副刺激の阻害により、またはＳＨＰ−１分子の増加したリン酸化、ＥＲＫ１／２分子の低下したリン酸化、またはＰＫＣ−θ分子の低下したリン酸化により検出することができる。適当な条件下で、ＰＤ−１誘導性のシグナリングは、免疫細胞による免疫反応のダウンレギュレーションを生じる。
【００３９】
好ましいＰＤ−１ファミリーメンバーは、１以上のレセプター、例えばＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−４、および／または抗原提示細胞上の他の分子と結合し、ＰＤ−１と配列同一性を共有する。
加えて、一態様において、あるタンパク質ファミリーのメンバーであるタンパク質は、１以上の他のファミリーメンバーのタンパク質に対して生じる抗体により結合される。例えば、抗ＢＢ１抗体は、Ｂ７−４分子を認識する。
【００４０】
本明細書において用いられる場合、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドに関する「活性」なる用語は、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の構造に固有の活性を包含する。Ｂ７−４に関して、「活性」なる用語は、免疫細胞副刺激を、例えば免疫細胞において副刺激シグナルを調節することにより調節することにより、または免疫細胞における阻害シグナルを、例えば免疫細胞上のナチュラルレセプターを束縛することより調節する能力を包含する。Ｂ７−４分子の活性化形態が副刺激レセプターと結合する場合、副刺激シグナルは免疫細胞において生じる。Ｂ７−４分子の活性化形態が阻害レセプターと結合する場合、阻害シグナルは免疫細胞において生じる。
【００４１】
副刺激シグナルを調節すると、免疫細胞のエフェクター機能が調節される。従って、「Ｂ７−４活性」なる用語は、Ｂ７−４ポリペプチドがその天然のレセプターと結合する能力、免疫細胞副刺激または阻害シグナルを調節する能力、および免疫細胞応答を調節する能力を包含する。
ＰＤ−１に関して、「活性」なる用語は、ＰＤ−１ポリペプチドが免疫細胞において、例えば抗原提示細胞上の天然のリガンドを束縛することにより阻害シグナルを調節する能力を包含する。ＰＤ−１は阻害シグナルをＣＴＬＡ４と同様の方法で免疫細胞に伝達する。免疫細胞において阻害シグナルを調節すると、免疫細胞の増殖および／または免疫細胞によるサイトカイン分泌が調節される。ＰＤ−１はさらに、Ｂ７分子の結合に関して副刺激レセプターと競合することにより副刺激シグナルを調節することができる。従って、「ＰＤ−１活性」なる用語は、ＰＤ−１ポリペプチドがその天然のリガンドと結合する能力、免疫細胞副刺激または阻害シグナルを調節する能力、および免疫応答を調節する能力を包含する。
【００４２】
本明細書において用いられる「天然に存在する」核酸分子なる用語は、天然に存在するヌクレオチド配列を有する（例えば、天然のタンパク質をエンコードする）ＲＮＡまたはＤＮＡ分子を意味する。
本明細書において用いられる場合、「アンチセンス」核酸分子は、タンパク質をエンコードする「センス」核酸配列と相補性、例えば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコーティング鎖と相補性、ｍＲＮＡ配列と相補性、または遺伝子のコーティング鎖と相補性であるヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸分子は、センス核酸分子と水素結合できる。
【００４３】
本明細書において用いられる場合、「コーティング領域」とは、アミノ酸残基中に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を意味し、一方、「非コーディング領域」なる用語は、アミノ酸中に翻訳されないヌクレオチド配列の領域（例えば、５’および３’非翻訳領域）を意味する。
本明細書において用いられる場合、「ベクター」なる用語は、これが結合しているもう一つの核酸分子を輸送できる核酸分子を意味する。ベクターの一のタイプは「プラスミド」であり、これはその中に別のＤＮＡセグメントをライゲートできる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。もう一つ別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここにおいては別のＤＮＡセグメントをウイルスゲノム中にライゲートできる。ある種のベクターはこれらが導入される宿主細胞において自己複製できる（例えば、細菌性複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は宿主細胞中へ導入されると宿主細胞のベクター中に組み入れられ、これにより宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターは操作可能に結合される遺伝子の発現を行うことができる。さらに、かかるベクターは本明細書において「組み換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と称する。一般に、組み換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態であることが多い。本明細書において、プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形態であるので、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いられる。しかしながら、本発明はかかる他の発現ベクターの形態、例えばウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）を包含し、これらは同等の機能を果たす。
【００４４】
本明細書において用いる場合、「宿主細胞」なる用語は、本発明の組み換え発現ベクターなどの本発明の核酸分子がその中に導入されている細胞を意味する。「宿主細胞」または「組み換え宿主細胞」なる用語は本明細書において交換可能に用いられる。かかる用語は特定の対象細胞のみでなく、かかる細胞の子孫または可能性のある子孫も意味すると理解されるべきである。ある種の修飾が突然変異または環境的影響のために次の世代において起こり得るので、かかる子孫は実際には親細胞と同一でないが、それでも本明細書において用いられる用語の範囲内に含まれる。
本明細書において用いられる場合、「トランスジェニック動物」なる用語は、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはマウスを意味し、該動物の１以上の細胞は「トランス遺伝子」を含む。「トランス遺伝子」なる用語は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノム中に組み入れられ、成体動物のゲノム中に残存する外因性ＤＮＡ、例えばトランスジェニック動物の１以上のセルタイプまたは組織においてエンコードされた遺伝子産物の発現を行うものを意味する。
【００４５】
本明細書において用いられる場合、「相同性組み換え動物」なる用語は、ある種のヒト以外のトランスジェニック動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはマウスを意味し、ここにおいて外因性遺伝子は、動物の発生前の外因性遺伝子と動物の細胞中に導入された外因性ＤＮＡ分子、例えば動物の胚細胞の間のホモローガスな組み換えにより変更されている。
本明細書において用いられる場合、「単離されたタンパク質」な用語は、細胞から単離されるかあるいは組み換えＤＮＡ技術により産生されるか場合は他のタンパク質、細胞物質および培地、あるいは化学的に合成される場合には化学的前駆体または他の化学物質が実質的にないタンパク質を意味する。「単離された」または「精製された」タンパク質または生物学的に活性なタンパク質それ自体は、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質が由来する細胞または組織源から得られる細胞物質または他の汚染タンパク質の調製物を含む。「細胞物質が実質的にない」なる用語には、タンパク質が、それが単離または組換え産生される細胞の細胞成分から単離される、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の調製物が含まれる。「細胞物質が実質的にない」とは、約３０％（乾燥重量）未満の非Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質、さらに好ましくは約２０％未満の非Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質、なおさらに好ましくは約１０％未満の非Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質、最も好ましくは約５％未満の非Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質を有するＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の調製物を包含する。Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質またはその生物学的に活性なタンパク質が組み換え的に産生される場合、これは好ましくは実質的に培地がない、すなわち、培地がタンパク質調製物の体積の約２０％未満であり、さらに好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満である。
【００４６】
「化学前駆体または他の化学物質が実質的にない」なる言い回しは、タンパク質が、該タンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離されているＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の調製物を包含する。一態様において、「化学前駆体または他の化学物質が実質的にない」なる言い回しは、約３０％（乾燥重量）未満の化学前駆体または非Ｂ７−４またはＰＤ−１化学物質、さらに好ましくは約２０％未満の化学前駆体または非Ｂ７−４またはＰＤ−１化学物質、さらに好ましくは約１０％未満の化学前駆体または非Ｂ７−４またはＰＤ−１化学物質、最も好ましくは約５％未満の化学前駆体または非Ｂ７−４またはＰＤ−１化学物質を有するＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の調製物を包含する。
【００４７】
本明細書において用いられる「抗体」なる用語は、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）も包含する。本明細書において用いられる「抗原結合部分」なる用語は、抗原と特異的に結合する能力を保持する抗体の１以上のフラグメントを意味する（たとえば、Ｂ７−４）。抗体の抗原結合機能は完全長抗体により実施され得ることが証明されている。抗体の「抗原結合タンパク質」なる用語に含まれる結合フラグメントの例は、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィドブリッジにより結合された２のＦａｂフラグメントからなる二価フラグメント）；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）ＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；抗体の１つの腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含する。さらに、Ｆｖフラグメントの２つの領域、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされるが、これらは組み換え法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域対が一価分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）とも呼ばれる；たとえば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：５８７９−５８８３；およびＯｓｂｏｕｒｎら（１９９８）Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７７８）を形成する一つのタンパク質鎖として調製することができる合成リンカーにより結合できる。このような一本鎖抗体はさらに抗体の「抗体結合部分」なる用語に含まれることを意図される。完全ＩｇＧ分子または他のイソタイプをエンコードする発現ベクターを生じるために、特異的ｓｃＦｖの任意のＶＨおよびＶＬ配列はヒトイムノグロブリン定常領域ｃＤＮＡまたはゲノム配列と結合できる。ＶＨおよびＶ１は、タンパク質化学または組み換えＤＮＡ技術のいずれかを用いてＦａｂ、Ｆｖまたはイムノグロブリンの他のフラグメントの生成において用いることができる。一本鎖抗体の他の形態、たとえば、二重特異性抗体（ｄａｉｂｏｄｙ）も含まれる。二重特異性抗体は、二価、二重特異性抗体であり、ここにおいてＶＨおよびＶＬドメインは一本鎖ポリペプチド上に発現されるが、同じ鎖上の２つのドメイン間で対合するには短すぎ、そのために該ドメインは別の鎖の相補性ドメインと対になり、２つの抗原結合部位を形成する（たとえば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ２：１１２１−１１２３参照）。
【００４８】
さらに、抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体部分と１以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有または非共有結合により形成される、より大きなイムノグロブリン分子の一部であり得る。かかる免疫接着（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎ）分子の例は、四量体ｓｃＦｖ分子を作るためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．ら（１９９５）Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ６：９３−１０１）および二価およびビオチニル化ｓｃＦｖ分子を作るためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ−末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍら（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）を包含する。抗体部分、たとえば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、慣例の技術、たとえば、それぞれ完全抗体のパパインまたはペプシン消化を用いて、完全抗体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分および免疫接着分子は、本明細書に記載するような標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて得ることができる。
【００４９】
抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル；外因性、同種異系、または同系；あるいはその修飾された形態、たとえばヒト化、キメラなどであってもよい。好ましくは、本発明の抗体は、Ｂ７−４分子と特異的または実質的に特異的に結合する。本明細書において用いられる「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」なる用語は、抗原の特定のエピトープと免疫反応できる抗原結合部位の１種のみを含む小唄異分子の集団を意味し、一方、「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」なる用語は、特定の抗原と相互作用できる抗原結合部位の複数腫を含む抗体分子の手段を意味する。モノクローナル抗体組成物は、典型的には、これが免疫反応する特定の抗原に対して単一結合親和性を示す。
【００５０】
本明細書において用いられる「ヒト化抗体」なる用語は、ヒト細胞により製造されるさらによく似た抗体に変更されたさまざまな可変および定常領域を有するヒト以外の細胞により製造される抗体を包含することを意図される。たとえば、非ヒト抗体アミノ酸配列を、ヒト生殖細胞系配列において見いだされるアミノ酸を組み入れるように変更することによる。本発明のヒト化抗体は、たとえばＣＤＲにおいて、ヒト生殖細胞系イムノグロブリン配列（たとえば、インビトロでの部位特異性突然変異誘発またはインビボでの体細胞突然変異により導入される突然変異）によりによりエンコードされないアミノ酸残基を含み得る。本明細書において用いられる「ヒト化抗体」なる用語はさらに、マウスなどの別の哺乳動物種から誘導されるＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列上に移植されている抗体も包含する。
【００５１】
本明細書において用いられる「単離された抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体が実質的にない抗体を意味することを意図される（たとえば、Ｂ７−４と特異的に結合する単離された抗体は、Ｂ７−４以外の抗原と特異的に結合する抗体が実質的にない）。さらに、単離された抗体は他の細胞性物質および／または化学物質が実質的にない。
特定のアミノ酸配列とタンパク質をコードするヌクレオチド配列間には、遺伝子コード（後記）により決められる既知の明確な対応が存在する。同様に、特定核酸分子のヌクレオチド配列と核酸分子によりエンコードされるアミノ酸配列の間には、遺伝子コードにより決定されるような既知の明確な対応が存在する。
【００５２】
遺伝子コード
アラニン (Ala, A) GCA, GCC, GCG, GCT
アルギニン (Arg, R) AGA, ACG, CGA, CGC, CGG, CGT
アスパラギン (Asn, N) AAC, AAT
アスパラギン酸 (Asp, D) GAC, GAT
システイン (Cys, C) TGC, TGT
グルタミン酸 (Glu, E) GAA, GAG
グルタミン (Gln, Q) CAA, CAG
グリシン (Gly, G) GGA, GGC, GGG, GGT
ヒスチジン (His, H) CAC, CAT
イソロイシン (Ile, I) ATA, ATC, ATT
ロイシン (Leu, L) CTA, CTC, CTG, CTT, TTA, TTG
リジン (Lys, K) AAA, AAG
メチオニン (Met, M) ATG
フェニルアラニン (Phe, F) TTC, TTT
プロリン (Pro, P) CCA, CCC, CCG, CCT
セリン (Ser, S) AGC, AGT, TCA, TCC, TCG, TCT
トレオニン (Thr, T) ACA, ACC, ACG, ACT
トリプトファン (Trp, W) TGG
チロシン (Tyr, Y) TAC, TAT
バリン (Val, V) GTA, GTC, GTG, GTT
終結シグナル (end) TAA, TAG, TGA
【００５３】
遺伝子コードの重要でよく知られた特性は、その重複性（ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ）であり、これにより、タンパク質を製造するために用いられるほとんどのアミノ酸に関して、１以上のコーディングヌクレオチドトリプレットを用いることができる（前記）。従って、多くの異なるヌクレオチド配列は所定のアミノ酸配列についてコードすることができる。かかるヌクレオチド配列は、結果として全ての生物において同じアミノ酸配列を産生するので、機能的に等価であると考えられる（ある生物はあるアミノ酸配列を他のものよりも有効に翻訳することができるが）。さらに、時折、プリンまたはピリミジンのメチル化変異体を所定のヌクレオチド配列中に見いだすことができる。かかるメチル化は、トリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸間のコーディング関係に影響を及ぼさない。
【００５４】
前記事項を考慮すると、本発明のＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡ分子のヌクレオチド配列（またはその任意の部分）は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子をアミノ酸配列に本湯アクするために遺伝子コードを用いて、Ｂ７−４またはＰＤ−１アミノ酸配列を誘導するために用いることができる。同様に、任意のＢ７−４またはＰＤ−１アミノ酸配列に関して、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質をエンコードできる対応するヌクレオチド配列を遺伝子コード（その重複性のために、所定のアミノ酸配列について複数の核酸配列を産生するであろう）から推測できる。かくして、Ｂ７−４またはＰＤ−１ヌクレオチド配列の本明細書における記載および／または開示は、該ヌクレオチド配列によりエンコードされるアミノ酸配列の記載および／または開示も包含すると考えられるべきである。同様に、本明細書におけるＢ７−４またはＰＤ−１アミノ酸配列の記載および／または開示も、アミノ酸配列をエンコードできるあらゆる可能なヌクレオチド配列の記載および／開示も包含すると考えるべきである。
【００５５】
「小分子」なる用語は、専門用語であり、約１０００分子量未満または約５００分子量未満の分子を包含する。もう一つ別の具体例において、小分子はオリゴマーでない。活性についてスクリーンできる小分子化合物の例は、これらに限定されないが、ペプチド、ペプチド模倣物、核酸、炭水化物、小有機分子（たとえば、ポリケチド（ｐｏｌｙｋｅｔｉｄｅ））（Ｃａｎｅら１９９８ Ｓｃｉｅｎｃｅ２８２：６３）、および天然の生成物抽出物ライブラリーを包含する。もう一つ別の具体例において、化合物は小さな有機非ペプチド化合物である。さらにも一つの具体例において、小分子は生合成物でない。
【００５６】
ＩＩ．単離された核酸分子
一具体例において、特許権を要求する方法において用いられる薬剤は、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質またはその生物学的に活性な部分をエンコードする単離された核酸分子を含む。Ｂ７−４または核酸をエンコードするＰＤ−１エンコーディングを同定するためにハイブリダイゼーションプローブとして使用するために十分な核酸フラグメント（たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡ）およびＢ７−４またはＰＤ−１核酸分子の増幅または突然変異のＰＣＲプライマーとして使用するフラグメントも提供される。本明細書において用いられる場合、「核酸分子」なる用語は、ＤＮＡ分子（たとえば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（たとえば、ｍＲＮＡ）およびヌクレオチド類似体を用いて生じるＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を包含することを意図される。核酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。
【００５７】
「単離された」核酸分子は、核酸分子の天然源において存在する他の核酸から分離されるものである。たとえば、ゲノムＤＮＡに関して、「単離された」なる用語は、ゲノムＤＮＡが自然に結合する染色体から分離される核酸分子を包含する。好ましくは、「単離された」核酸分子は、核酸分子が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて、自然に核酸分子の側面に位置する配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）がない。がない。たとえば、様々な具体例において、単離されたＢ７−４またはＰＤ−１核酸分子は、約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満の、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて自然に核酸の側面に位置する核酸配列を含み得る。さらに、「単離された」核酸分子、たとえばｃＤＮＡ分子は、他の細胞生物質、または組み換え技術により賛成される場合には細胞培地が実質的にないか、あるいは化学的に合成される場合には化学前駆体または他の化学物質が実質的にない。しかしながら、「単離された」Ｂ７−４またはＰＤ−１核酸分子は、通常ゲノムＤＮＡにおいてＢ７−４またはＰＤ−１配列の側面に位置しない他のヌクレオチド配列と結合し得る（たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ヌクレオチド配列はベクター配列と結合することができる）。ある好ましい具体例において、「単離された」核酸分子、たとえば、ｃＤＮＡ分子も他の物質がない。しかしながら、Ｂ７−４またはＰＤ−１核酸分子が、「単離された」とみなされる他の細胞生物質がないものである必要はない（たとえば、他の哺乳動物ＤＮＡから分離され、細菌細胞中に挿入されたＢ７−４またはＰＤ−１ＤＮＡ分子も「単離された」と見なされる）。
【００５８】
本発明の核酸分子、たとえば、配列番号１、３、１０、または１１のヌクレオチド配列を有する核酸分子またはその一部を、標準的分子生物学技術および本明細書において記載する配列情報を用いて単離することができる。たとえば、配列番号１、３、１０、または１１の核酸配列の全部または一部をハイブリダイゼーションプローブとして用いて、Ｂ７−４またはＰＤ−１核酸分子を、標準的ハイブリダイゼーションおよびクローニング技術（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載）を用いて単離することができる。
さらに、配列番号１、３、１０、または１１の全部または一部を含む核酸分子は、それぞれ配列番号１、３、１０、または１１の配列に基づいて設計された合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により単離することができる。
【００５９】
本発明の核酸は、標準的ＰＣＲ増幅技術に従って、テンプレートおよび適当なオリゴヌクレオチドプライマーとして、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは別法としてゲノムＤＮＡを用いて増幅することができる。このようにして増幅された核酸は、適当なベクター中にクローンし、ＤＮＡ配列分析により特徴化することができる。さらに、Ｂ７−４またはＰＤ−１ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的合成技術により、たとえば自動化ＤＮＡ合成器を用いて調製することができる。
好ましい具体例において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、１０、または１１に示すヌクレオチド配列を含む。
【００６０】
もう一つ別の好ましい態様において、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、３、１０、または１１に示す核酸配列の補体、あるいはこれらのヌクレオチド非あれ角任意のものの一部である核酸分子を含む。配列番号１、３、１０、または１１に示すヌクレオチド配列と相補生である核酸分子は、それぞれ配列番号１、３、１０、または１１において示すヌクレオチド配列と十分相補性であるものであるので、これはそれぞれ配列番号１、３、１０、または１１に示すヌクレオチド配列とハイブリッド形成でき、これにより安定な二本鎖を形成する。的確な補体は規定のヌクレオチド配列と１００％相同性である。さらにもう一つ別の好ましい具体例において、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上配列番号１、３、１０、または１１に示すヌクレオチド配列（たとえば、ヌクレオチド配列の完全な長さ）、またはこれらのヌクレオチド配列の任意のものの一部と一致する。
【００６１】
さらに、本発明の核酸分子は、配列番号１、３、１０、または１１の核酸配列の一部のみ、たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の生物学的に活性な部分をエンコードするプローブまたはプライマーまたはフラグメントとして用いることができるフラグメントを含み得る。Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子のクローニングから決定されるヌクレオチド配列は、他のＢ７−４またはＰＤ−１ファミリーメンバー、ならびに他の種から得られるＢ７−４またはＰＤ−１ファミリー相当物の同定および／またはクローニングにおいて用いるために設計されたプローブおよびプライマーの生成を可能にする。プローブ／プライマーは、典型的には実質的に精製されたオリゴヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは典型的には、ストリンジェントな条件下で、少なくとも約１２または１５、好ましくは約２０または２５、さらに好ましくは約３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７５の、配列番号１、３、１０、または１１のセンス配列の連続したヌクレオチドとハイブリッド形成するヌクレオチド配列、あるいは配列番号１、３、１０、または１１の天然に存在する対立遺伝子変異体または突然変異体の領域を含む。一例において、本発明の核酸分子は、少なくとも３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、または８００ヌクレオチドの長さのヌクレオチド配列を含み、配列番号１、３、１０、または１１の核酸分子とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリッド形成する。
【００６２】
もう一つ別の具体例において、第二の核酸分子は、配列番号１、３、１０、または１１の、少なくとも約５００、６００、７００、８００、９００、または１０００の連続したヌクレオチドを含む。
一具体例において、たとえばプローブとして用いられる本発明の核酸分子は、配列番号１のおよそヌクレオチド８１０からおよそ８５０または配列番号１のおよそヌクレオチド３２０から８５４の配列番号１の一部を含まない。もう一つ別の具体例において、本発明の核酸分子は、配列番号３のおよそヌクレオチド３１４からおよそ７３４、またはおよそヌクレオチド８３５からおよそ８６０、またはおよそヌクレオチド１０８５からおよそ１１０５またはおよそヌクレオチド１２８６からおよそ１５３６の配列番号３の一部を含まない。
【００６３】
一具体例において、本発明の核酸分子は、配列番号１または配列番号３の少なくとも約５００の連続したヌクレオチドを含む。好ましい具体例において、本発明の核酸分子は、少なくとも約６００、少なくとも約８００、少なくとも約９００または少なくとも約９５０の配列番号１の連続したヌクレオチドを含む。もう一つ別の具体例において、本発明の核酸分子は、少なくとも約１５００または１５５０の配列番号３のヌクレオチドを含む。
【００６４】
好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１（ヌクレオチド５９〜７９３）または配列番号３（ヌクレオチド５３〜９２２）のコーディング領域の少なくとも一部を含む。もう一つ別の具体例において、Ｂ７−４核酸分子は、配列番号１のおよそヌクレオチド１からおよそヌクレオチド３１９を含む。もう一つ別の具体例において、Ｂ７−４核酸分子は、配列番号１のおよそヌクレオチド８５５からおよそヌクレオチド９６８を含む。もう一つ別の具体例において、Ｂ７−４核酸分子は、配列番号３のおよそヌクレオチド１からおよそヌクレオチド３１４を含む。もう一つ別の具体例において、Ｂ７−４核酸分子は、配列番号３のおよそヌクレオチド９５５からおよそヌクレオチド１２８５を含む。もう一つ別の具体例において、Ｂ７−４核酸分子は、配列番号３のおよそヌクレオチド１５３５からおよそヌクレオチド１５５２を含む。
【００６５】
他の具体例において、本発明の核酸分子は：少なくとも約５００、少なくとも約６００、少なくとも約７００、少なくとも約８００、少なくとも約９００または少なくとも約１０００の連続した配列番号１または配列番号３のヌクレオチドを含む核酸分子と、少なくとも７０％の同一性、さらに好ましくは８０％の同一性、さらにいっそう好ましくは９０％の同一性を有する。
【００６６】
Ｂ７−４またはＰＤ−１ヌクレオチド配列に基づくプローブは、転写物または同一または相同性のタンパク質をエンコードするゲノム配列を検出するために用いることができる。好ましい具体例において、プローブはさらにこれに結合した標識基を含む。たとえば、標識基は、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、または酵素補助因子であり得る。そのようなプローブを、例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１−エンコーディング核酸の対象からの細胞のサンプル中でのレベルを測定すること、例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１のｍＲＮＡレベルを測定することまたは、ゲノムＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子が変異したかまたは欠失したかどうかを測定することにより、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質を誤発現する細胞または組織を同定するための診断試験キットの部分として用いることができる。
【００６７】
「Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の生物活性部分」をコードしている核酸フラグメントは、Ｂ７−４またはＰＤ−１生物活性（Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の生物活性は、本明細書に記載されるものである）を有するポリペプチドをコードする、配列番号１、３、１０、または１１のヌクレオチド配列の部分を単離すること、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質のコードされる部分を（例えば、インビトロで組換え発現により）発現させること、およびＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質のコードされる部分の活性を評価することにより調製することができる。
【００６８】
遺伝子コードの縮重のために配列番号１、３、１０、または１１から異なり、そして、配列番号１、３、１０、または１１によりコードされるものと同じＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質をコードする核酸分子が本発明に包含される。従って他の具体例において、本発明の単離核酸分子は、配列番号２、４、または１２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードしているヌクレオチド配列を有する。他の具体例において、本発明の単離核酸分子は、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質をコードしているヌクレオチド配列を有する。
【００６９】
配列番号１、３、１０、または１１に示すＢ７−４またはＰＤ−１ヌクレオチド配列に加えて、当該分野の専門家には、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質のアミノ酸配列に変化を生じるＤＮＡ配列多型が集団内（例えば、ヒトの集団）に存在し得ることが分かるであろう。Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子におけるそのような遺伝子多型は、天然対立変異により集団内の個人の間に存在してよい。本明細書中に用いられる、「遺伝子」および「組換え遺伝子」なる用語は、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質、好ましくは哺乳動物のＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質をコードしているオープンリーディングフレームを含む核酸分子を意味し、非コーディング調節配列、およびイントロンをさらに含むことができる。そのような天然対立変種には、機能および非機能Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の両方が含まれ、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子のヌクレオチド配列において１−５％の変異を典型的に生じ得る。天然対立変異の結果であり、およびＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の機能活性を変更しないＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子におけるそのようなヌクレオチド変異および生じるアミノ酸多型は、本発明の範囲内にあるものとする。
【００７０】
さらに、他のＢ７−４またはＰＤ−１ファミリーのメンバーをコードしており、すなわち、配列番号１、３、１０、または１１のＢ７−４またはＰＤ−１ファミリーとは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあるものとする。例えば、他のＢ７−４またはＰＤ−１ｃＤＮＡは、ヒトＢ７−４またはＰＤ−１のヌクレオチド配列に基き同定することができる。さらに、異なる種からのＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質をコードしており、つまり配列番号１、３、１０、または１１のＢ７−４またはＰＤ−１配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内にあるものとする。例えば、マウスのＢ７−４またはＰＤ−１ｃＤＮＡは、ヒトのＢ７−４またはＰＤ−１分子のヌクレオチド配列に基いて同定することができる。
【００７１】
本発明のＢ７−４またはＰＤ−１ｃＤＮＡの天然対立変種およびホモログに対応する核酸分子は、本明細書中に開示するＢ７−４またはＰＤ−１核酸に対するそのホモロジーに基き、本明細書中に開示するｃＤＮＡまたはその部分を基準に従いハイブリダイゼーションプローブとして用いて、単離することができる。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ＤＮＡは、配列番号１、３、１０、または１１の全部または部分を用いてヒトゲノムＤＮＡライブラリーから、標準的ハイブリダイゼーション技術（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．らＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載）を用いて、単離することができる。さらに、配列番号１、３、１０、または１１の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子の全部または一部を含む核酸分子を単離することができる。たとえば、ｍＲＮＡは細胞から単離することができ（たとえば、Ｃｈｉｒｇｗｉｎら（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１８：５２９４−５２９９のグアニジニウム−チオシアネート抽出法による）、ｃＤＮＡは逆転写酵素（たとえば、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから入手可能なＭｏｌｏｎｅｙ ＭＬＶ逆転写酵素；またはＳｅｉｋａｇａｋｕ Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ，ＦＬから入手可能なＡＭＶ逆転写酵素）。ＰＣＲ増幅の合成オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号１、３、１０、または１１に示すヌクレオチド配列に基づいて設計できる。本発明の核酸分子は、標準的ｐＣＲ２．１プラスミド増幅技術に従って、テンプレートおよび適当なオリゴヌクレオチドプライマーとしてｃＤＮＡ、あるいは別法としてゲノムＤＮＡを用いて増幅することができる。このようにして増幅された核酸を適当なベクター中にクローンし、ＤＮＡ配列分析により特徴づけることができる。さらに、Ｂ７−４またはＰＤ−１ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、たとえば自動化ＤＮＡ合成器を用いて、標準的合成技術により調製することができる。
【００７２】
もう一つ別の具体例において、本発明の単離された核酸分子は、少なくとも１５、２０、２５、３０またはそれ以上のヌクレオチドの長さであり、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、３、１０、または１１のヌクレオチド配列を含む核酸分子とハイブリッド形成する。他の具体例において、核酸分子は少なくとも３０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、または６００ヌクレオチドの長さである。本明細書において用いられる場合、「ストリンジェントな条件下でハイブリッド形成する」なる用語は、互いに少なくとも３０％、４０％、５０％、または６０％相同性であるヌクレオチド配列が典型的に互いにハイブリッド形成した状態であるハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明することを意図される。好ましくは、互いに少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％の１以上、なおいっそう好ましくは少なくとも約８５％または９０％相同性である配列が互いにハイブリッド形成したままであるような条件である。このようなストリンジェントな条件は、当業者には一般的であり、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、６．３．１−６．３．６において見いだすことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の好ましい非制限的な例は、６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５度でハイブリッド形成し、続いて５０〜６５℃で０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中１回以上洗浄する。好ましくは、ストリンジェントな条件下で配列番号１、３、１０、または１１の配列とハイブリッド形成する本発明の単離された核酸分子は、天然に存在する核酸分子に対応する。
【００７３】
本明細書において用いられる場合、「天然に存在する」核酸分子とは、天然に存在する（たとえば、天然のタンパク質をエンコードする）ヌクレオチド配列を有するＲＮＡまたはＤＮＡ分子を意味する。配列番号１、３、１０、および１１に示すＢ７−４またはＰＤ−１ヌクレオチド配列に加えて、集団内にはＢ７−４またはＰＤ−１のヌクレオチドまたはアミノ酸配列に小さな変化を起こすＤＮＡ配列多形性が存在し得ることは当業者には理解されるであろう。Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子におけるこのような遺伝子多形性は、天然の対立遺伝子バリエーションのために集団内の角固体間に存在し得る。このような天然の対立遺伝子バリエーションの結果、典型的には遺伝子の配列において１〜２％の差異が生じる。このようなヌクレオチドバリエーションと結果として得られる、天然の対立遺伝子バリエーションの結果であり、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの機能的活性を変更しないＢ７−４またはＰＤ−１におけるアミノ酸多形性は本発明の範囲内に含まれる。
【００７４】
集団内に存在し得るＢ７−４またはＰＤ−１配列の天然に存在する対立変異体に加えて、たとえば配列番号１、３、１０、または１１のヌクレオチド配列中への突然変異により小さな変化を導入することができ、これにより、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の機能的活性を変更することなく、エンコードされたタンパク質のアミノ酸配列において変化を生じることは当業者にはさらに理解されるであろう。たとえば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換につながるヌクレオチド置換を配列番号１、３、１０、または１１の配列において行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、Ｂ７−４またはＰＤ−１分子の機能的活性を変更することなく、Ｂ７−４核酸分子の野生型配列（たとえば、配列番号１、３、１０、または１１）から変更できる残基である。好ましくは、Ｂ７−４のレセプターとの結合またはＰＤ−１の天然のリガンドに対する結合に必要であることが見いだされている（たとえば、アラニン走査突然変異誘発スクリーンまたは他の技術的に承認されたスクリーニング分析を用いて同定される）Ｂ７−４またはＰＤ−１の細胞外ドメインにおける残基は変更されない。Ｂ７−４について、非必須で、従って置換を受けやすい残基の例は、Ｂ７ファミリーメンバー（またはＢ７−４ファミリーメンバー）のアミノ酸整列を行い、保存されない残基を決定することにより、当業者により確認され得る。このような残基は、保存されなかったので、置換をより受けやすい。
【００７５】
したがって、本発明のもう一つの態様は、Ｂ７−４またはＰＤ−１活性に必須でない核酸分子に関する。このようなＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質は、配列番号２、４、または１２からのアミノ酸配列が異なり、さらに固有のＢ７−４活性を保持するか、ＰＤ−１の場合において、Ｂ７−４と結合する能力を有する。Ｂ７−４と結合する能力を保持する。Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の天然でない変異体をエンコードする単離された核酸分子は、１以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を配列番号１、３、１０、または１１のヌクレオチド配列中に導入することにより、１以上のアミノ酸置換、付加または欠失がエンコードされたタンパク質中に導入されるように形成することができる。標準的技術、たとえば、部位指向性突然変異誘発およびＰＣＲによる突然変異誘発により、突然変異を配列番号１、３、１０、または１１中に導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は１以上の非必須アミノ酸残基で行われる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似した側鎖有するアミノ酸残基で置換されたものである。塩基性側鎖（たとえば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（たとえば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（たとえば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、巣レオ任、チロシン、システイン）、非極性側鎖（たとえば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐側鎖（たとえば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（たとえば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当該分野において定義されている。従って、Ｂ７−４またはＰＤ−１における非必須アミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。
【００７６】
別法として、もう一つ別の具体例において、突然変異は、たとえば飽和突然変異誘発により、Ｂ７−４またはＰＤ−１コーディング配列の全部または一部と共にランダに導入することができ、結果として得られる突然変異体はＤＮＡと結合および／または転写の活性化の能力についてスクリーンすることができ、機能的活性を保持する突然変異体が同定される。突然変異誘発後、エンコードされたＢ７−４またはＰＤ−１突然変異タンパク質を宿主細胞において組み換え的に発現することができ、突然変異タンパク質の機能的活性をＢ７−４またはＰＤ−１活性を評価するために当該分野において利用可能な分析法を用いて定量できる。
【００７７】
したがって、本発明のもう一つの態様は、活性に必須でないアミノ酸残基において変化を含むＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質をエンコードする核酸分子に関する。
本発明のさらにもう一つの態様は、Ｂ７−４またはＰＤ−１融合タンパク質をエンコードする単離された核酸分子に関する。少なくとも、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質をエンコードする第一ヌクレオチド配列、非Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質をエンコードする第二のヌクレオチド配列と操作可能に結合するポリペプチドまたはペプチド、ポリペプチドまたはペプチドを含むこのような核酸分子を標準的組み換えＤＮＡ技術により調製することができる。
【００７８】
好ましい具体例において、突然変異Ｂ７−４タンパク質を：１）活性化された免疫細胞の増殖および／またはエフェクター機能を副刺激する能力（または、たとえば溶解形態における副刺激を阻害する）；２）抗Ｂ−７ファミリーまたは抗Ｂ７−４抗体と結合する能力；および／または３）Ｂ７−４の天然のレセプター（たとえばＰＤ−１）と結合する能力に関して分析することができる。
好ましい具体例において、突然変異Ｂ７−４タンパク質を：１）活性化された免疫細胞の増殖および／またはエフェクター機能を副刺激する能力（または、たとえば溶解形態）；２）抗ＰＤ−１抗体と結合する能力；および／または３）ＰＤ−１の天然のリガンド（たとえばＢ７−４）と結合する能力に関して分析することができる。
【００７９】
前記のＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質をエンコードする核酸分子に加えて、それに対してアンチセンスである単離された核酸分子を調節剤として用いることができる。「アンチセンス」核酸は、タンパク質をエンコードする「センス」核酸に対して相補性である、たとえば二本鎖ｃＤＮＡ分子のコーディング鎖に対して相補性であるか、またはｍＲＮＡ配列に対して相補性であるヌクレオチド配列を含む。従って、アンチセンス核酸はセンス核酸に水素結合できる。アンチセンス核酸は全Ｂ７−４またはＰＤ−１コーディング鎖に対して、またはその一部に対してのみ相補性であり得る。一具体例において、アンチセンス核酸分子はＢ７−４またはＰＤ−１をエンコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の「コーディング領域」に対してアンチセンスである。「コーディング領域」なる用語は、アミノ酸残基中に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を意味する。もう一つの具体例において、アンチセンス核酸分子は、Ｂ７−４またはＰＤ−１をエンコードするヌクレオチド配列のコーディング鎖の「非コーディング領域」に対してアンチセンスである。「非コーディング領域」なる用語は、アミノ酸中に翻訳されないコーディング領域の側面に位置する５’および３’配列（５’および３’未翻訳領域とも称する）を意味する。
【００８０】
本明細書において開示されているＢ７−４またはＰＤ−１をエンコードするコーディング配列が与えられると、本発明のアンチセンス核酸配列をワトソンとクリックの塩基対合則に従って設計できる。アンチセンス核酸分子は、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡの全コーディング領域に対して相補性であり得るが、さらに好ましくは、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡのコーディングまたは非コーディング領域の一部のみに対してアンチセンスであるオリゴヌクレオチドである。たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはＢ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡの翻訳開始部位を取り巻く領域に対して相補性であり得る。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、たとえば、約５、１０、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドの長さであり得る。本発明のアンチセンス核酸は、当該分野において公知の方法を用いて化学合成および控訴結紮反応を用いて構築することができる。たとえば、アンチセンス核酸分子（たとえば、アンチセンスヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、あるいは分子の生物学的安定性を増大するため、またはアンチセンスとセンス核酸間に形成される二本鎖の物理的安定性を増大させるために設計された様々に修飾されたヌクレオチドを用いて、化学的に合成することができる。たとえばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを用いることができる。アンチセンス核酸を生成するために用いることができる修飾されたヌクレオチドの例は、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン、イノシン、Ｎ６−イドペンテニルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ワイブトキソシン、シュードウラシル、ケオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリンを包含する。別法として、その中に核酸がアンチセンス配向においてサブクローンされた発現ベクターを用いて、アンチセンス核酸を生物学的に産生することができる（すなわち、次のサブセクションにおいてさらに記載するように、挿入された核酸から転写されたＲＮＡは、関心のある標的核酸に対してアンチセンス配向を有するものである）。
【００８１】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には対照に対して投与されるか、またはＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質をエンコードする細胞性ｍＲＮＡおよび／またはゲノムＤＮＡとハイブリッド形成するかまたは結合して、たとえば、転写および／または翻訳を阻害することによりタンパク質の発現を阻害するようにその場で生成される。ハイブリダイゼーションは、慣用のヌクレオチド相補性により、安定な二本鎖を形成するか、または、たとえば、ＤＮＡ二本鎖と結合するアンチセンス核酸分子の場合においては二重らせんの大きな溝における特異的な相互作用による。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例は、組織部位での直接注射を包含する。別法として、アンチセンス核酸分子は、選択された細胞を標的とするために修飾でき、次いで全身的に投与できる。たとえば、全身性投与に関して、アンチセンス分子は、たとえば、アンチセンス核酸分子をペプチドあるい細胞表面レセプターまたは抗原と結合する抗体と結合させることにより、レセプターまたは選択された細胞表面上に発現された抗原と特異的に結合するように修飾できる。アンチセンス核酸分子はさらに、本明細書に記載するベクターを用いて細胞に送達することもできる。十分なアンチセンス分子の細胞内濃度を達成するために、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ ＩＩまたはｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下におかれるベクター構築物が好ましい。
【００８２】
さらにもう一つの具体例において、本発明のアンチセンス核酸はα−アノマー核酸分子である。α−アノマー核酸分子は、相補性ＲＮＡと特異的二本鎖ハイブリッドを形成し、ここにおいて、通常のβ−ユニットと反対に、鎖は互いに平行である（Ｇａｕｌｔｉｅｒら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：６６２５−６６４１）。アンチセンス核酸分子は、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１５：６１３１−６１４８）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Ｉｎｏｕｅら（１９８７）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２１５：３２７−３３０）も含み得る。
【００８３】
さらにもう一つの具体例において、本発明のアンチセンス核酸分子はリボザイムである。リボザイムはリボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡ分子であり、これらが相補性領域を有するｍＲＮＡなどの一本鎖核酸分子を開裂できる。したがって、リボザイム（たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡ転写物を触媒により開裂させ、これによりＢ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡの翻訳を阻害するために、ハンマーヘッド型リボザイム（ＨａｓｅｌｏｆｆおよびＧｅｒｌａｃｈ（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３４：５８５−５９１））を使用できる。Ｂ７−４またはＰＤ−１エンコーディング核酸について特異性を有するリボザイムを、本明細書において開示するＢ７−４またはＰＤ−１ｃＤＮＡのヌクレオチド配列（すなわち、配列番号１、３、１０、または１１）に基づいて設計することができる。たとえば、活性部位のヌクレオチド配列が、Ｂ７−４またはＰＤ−１エンコーディングｍＲＮＡにおいて開裂されるヌクレオチド配列と相補性であるＴｅｔｒａｈｙｍｅｎａ Ｌ−１９ＩＶＳ ＲＮＡの誘導体を構築できる。たとえば、Ｃｅｃｈら、米国特許第４９８７０７１号；およびＣｅｃｈら、米国特許第５１１６７４２号参照。別法として、ＲＮＡ分子のプールから特異的リボヌクレアーゼ活性を有する触媒ＲＮＡを選択するために、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡを用いることができる。たとえば、Ｂａｒｔｅｌ，Ｄ．およびＳｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：１４１１−１４１８参照。
【００８４】
別法として、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子発現は、Ｂ７−４またはＰＤ−１の調節領域（たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１プロモーターおよび／；またはエンハンサー）に対して相補性のヌクレオチド配列を標的にすることにより阻害することができ、標的細胞においてＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子の転写を防止する三重らせん構造が形成される。たとえば、一般に、Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．（１９９１）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．６（６）：５６９−８４；Ｈｅｌｅｎｅ，Ｃ．ｒａ（１９９２）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６０：２７−３６；およびＭａｈｅｒ，Ｌ．Ｊ．（１９９２）Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ１４（１２）：８０７−１５参照。
【００８５】
さらにもう一つの具体例において、本発明のＢ７−４またはＰＤ−１核酸分子は、塩基部分、糖部分、またはホスフェート主鎖部分で、たとえば分子の安定性、ハイブリダイゼーション、または溶解度を向上させるために修飾することができる。たとえば、ペプチド核酸を生成させるために核酸分子のデオキシリボースホスフェート主鎖を修飾することができる（Ｈｙｒｕｐ，Ｂ．およびＮｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．（１９９６）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４（１）：５−２３）。本明細書において用いられる場合、「ペプチド核酸」または「ＰＮＡ」なる用語は、デオキシリボース主鎖がシュードペプチド主鎖により置換され、４の天然の核酸塩基のみが保持されている核酸模倣物、たとえばＤＮＡ模倣物を意味する。ＰＮＡの天然の主鎖は、低イオン強度の条件下で、ＤＮＡおよびＲＮＡと特異的ハイブリダイゼーションを可能にすることが示されている。ＰＮＡオリゴマーの合成は、ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）前出およびＰｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：１４６７０−６７５において記載されているような標準的固相ペプチド合成法を用いて実施することができる。
【００８６】
Ｂ７−４またはＰＤ−１核酸分子のＰＮＡは、治療および診断用途において用いることができる。たとえば、たとえば、転写または翻訳阻止の誘発あるいは複製の阻害により、遺伝子発現の配列特異性調節をするために、アンチセンスまたは抗原剤（ａｎｔｉｇｅｎ ａｇｅｎｔ）として、ＰＮＡを用いることができる。Ｂ７−４またはＰＤ−１核酸分子のＰＮＡは、遺伝子における一塩基対突然変異の分析（たとえば、ＰＮＡ−指向性ＰＣＲクランピング）においても；他の酵素（たとえば、Ｓ１ヌクレアーゼ（ＨｙｒｕｐおよびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）前出））との組み合わせにおいて用いられる場合、「人工の制限酵素」として；またはＤＮＡシーケンシングまたはハイブリダイゼーションのプローブまたはプライマーとして（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．およびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）前出；Ｐｅｒｒｙ−Ｏ’Ｋｅｅｆｅｅら（１９９６）前出）として用いることができる。
【００８７】
もう一つの具体例において、親油性または他のヘルパー基をＰＮＡに結合させるか、ＰＮＡ−ＤＮＡキメラを形成するか、または当該分野において公知のリポソームまたは他のドラッグデリバリー技術により、Ｂ７−４またはＰＤ−１のＰＮＡを修飾することができる（たとえば、その安定性または細胞吸収を向上させるために）。たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１核酸分子のＰＮＡ−ＤＮＡキメラを産生することができ、これはＰＮＡとＤＮＡの利点を兼ね備える。このようなキメラは、ＤＮＡ認識酵素（たとえば、ＲＮＡｓｅＨおよびＤＮＡポリメラーゼ）がＤＮＡタンパク質と相互作用するのを許容し、ＰＮＡタンパク質は高い結合親和性および特異性を提供する。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラは、塩基スタッキング、核酸塩基間の結合の数、および方向の点に関して、選択された適当な長さのリンカーを用いて結合させることができる（Ｈｙｒｕｐ Ｂ．およびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）前出）。ＰＮＡ−ＤＮＡキメラの合成は、Ｈｙｒｕｐ Ｂ．およびＮｉｅｌｓｅｎ（１９９６）前出およびＦｉｎｎ Ｐ．Ｊ．ら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４（１７）：３３５７−６３に記載されているようにして行うことができる。例えば、ＤＮＡ鎖は、標準的ホスホルアミダイトカップリング化学反応を用いて、固体支持体上で合成することができる。修飾されたヌクレオシド類似体（例えば、５’−（４−メトキシトリチル）アミノ−５’−デオキシ−チミジンホスホルアミダイト）を、ＰＮＡおよびＤＮＡの５’末端間のリンカーとして用いることができる（Ｍａｇ，Ｍ．ら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：５９７３−８８）。ＰＮＡモノマーを次に段階的な方法でカップリングさせて、５’ＰＮＡセグメントと３’ＤＮＡセグメントを有するキメラ分子を生成させる（Ｆｉｎｎ Ｐ．Ｊ．ら（１９９６）前出）。別法として、５’ＤＮＡセグメントおよび３’ＰＮＡセグメントを有するキメラ分子を合成することができる（Ｐｅｔｅｒｓｅｒ，Ｋ．Ｈ．ら（１９７５）Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．５：１１１９−１１１２４）。
【００８８】
他の具体例において、オリゴヌクレオチドは、他の付加された基、たとえばペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的にするため）、あるいは細胞膜（例えば、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：６５５３−６５５６；Ｌｅｍａｉｔｒｅら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：６４８−６５２；ＰＣＴ公開番号ＷＯ８８／０９８１０参照）または血液脳関門（例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８９／１０１３４）を貫通する輸送を促進する化学物質を含んでもよい。加えて、オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーション誘発性開裂剤（例えば、Ｋｒｏｌら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：９５８−９７６）または挿入剤（ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）（例えば、Ｚｏｎ（１９８８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．５：５３９−５４９参照）で修飾することができる。この目的のために、オリゴヌクレオチドをもう一つの分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーション誘発性架橋剤、輸送因子、またはハイブリダイゼーション誘発性開裂剤）と結合させることができる。
【００８９】
ＩＩＩ．単離されたＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質および抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体
加えて、単離されたＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質およびその生物学的に活性な部分、ならびに抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体を調節剤として用いることができる。一具体例において、自然のＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質を、標準的タンパク質精製技術を用いて、適当な精製スキームにより、細胞または組織供給源から単離することができる。もう一つ別の具体例において、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質は、組み換えＤＮＡ技術により産生される。組み換え発現の代わりに、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質またはポリペプチドを、標準的ペプチド合成技術を用いて化学的に合成することができる。
本発明のもう一つの態様は、単離されたＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質に関する。好ましくは、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質は、配列番号１、３、１０または１１によりエンコードされるアミノ酸配列を含む。もう一つの好ましい具体例において、タンパク質は配列番号２、４、または１２のアミノ酸配列を含む。他の具体例において、タンパク質は、配列番号２、４、または１２に示すアミノ酸配列と、少なくとも５０％、少なくとも６０％のアミノ酸同一性、さらに好ましくは７０％アミノ酸同一性、さらに好ましくは８０％、なお一層好ましくは９０％または９５％のアミノ酸同一性を有する。
【００９０】
他の具体例において、本発明は、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の単離された部分を提供する。例えば、Ｂ７−４タンパク質は、シグナル配列、ならびにＩｇＶドメインおよびＩｇＣドメインを含む。配列番号２のシグナル配列は、およそアミノ酸１からおよそアミノ酸１８までで示される。配列番号４のシグナル配列は、およそアミノ酸１からおよそアミノ酸１８までで示される。配列番号２のＩｇＶドメインは、およそアミノ酸１９からおよびアミノ酸１３４までで示され、配列番号４のＩｇＶドメインは、およそアミノ酸１９からおよびアミノ酸１３４までで示される。配列番号２のＩｇＣドメインは、およそアミノ酸１３５からおよびアミノ酸２２７までで示され、配列番号４のＩｇＣドメインは、およそアミノ酸１３５からおよびアミノ酸２２７までで示される。配列番号２において例示されるＢ７−４分子は、およそアミノ酸２２８からおよそアミノ酸２４５で示される親水性テールを含む。配列番号４に例示されるＢ７−４ポリペプチドは、配列番号４のおよそアミノ酸２３９からおよそアミノ酸２５９で示される貫膜ドメインと配列番号４のおよそアミノ酸２６０からおよそアミノ酸２９０で示される細胞質ドメインを含む。
【００９１】
ＰＤ−１ポリペプチドは２８８アミノ酸の長さであり、そのドメイン構造は当該分野において公知である（Ｓｈｉｎｏｈａｒａら（１９９４（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ２３：７０４）。予想されるタンパク質の成熟形態は約２６８アミノ酸を含み、細胞外ドメイン（１４７アミノ酸）、貫膜ドメイン（２７アミノ酸）、貫膜領域（２７アミノ酸）および細胞質ドメイン（９４アミノ酸）を含む。４の潜在的なＮ−グリコシル化部位が細胞外ドメインにおいて見いだされている（米国特許代５６９８５２０号）。２つのシステイン残基（ｃｙｓ５４とｃｙｓ１２３）間の６８アミノ酸残基はＶ−セット配列のジスルフィド結合したイムノグロブリンドメインと類似性を有する（米国特許第５６９８５２０号）。
【００９２】
本発明はさらに、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の溶解形態に関する。かかる形態は、例えば配列番号２に示すように天然に存在し得るか、または処理することができ、例えばＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の細胞外ドメインを含み得る。Ｂ７−４細胞外ドメインの例は、配列番号４のアミノ酸１９〜２３８を含む。ＰＤ−１細胞外ドメインの例は、配列番号１２のおよそアミノ酸２１〜２８８を含む。
一具体例において、Ｂ７−４ポリペプチドの細胞外ドメインは、Ｂ７−４ポリペプチドの成熟形態、例えば、ＩｇＶおよびＩｇＣドメインを含むが、Ｂ７−４ポリペプチドの貫膜および細胞質ドメイン（例えば、配列番号４のおよそアミノ酸１９からアミノ酸２３８）または配列番号２のおよそアミノ酸１９からアミノ酸２４５を含まない。
【００９３】
一具体例において、ＰＤ−１ポリペプチドの細胞外ドメインは、ＰＤ−１ポリペプチドの成熟形態、例えば、イムノグロブリンスーパーファミリードメイン（例えば、Ｖ−セット配列）を含むが、ＰＤ−１ポリペプチドの貫膜および細胞質ドメイン（例えば、配列番号１２およそアミノ酸２１〜２８８）を含まない。
Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の生物学的に活性な部分は、完全長Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質よりも少ないアミノ酸を含み、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の少なくとも１つの活性、好ましくは自然の結合パートナーと結合する能力を示す、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質のアミノ酸配列と十分相同性であるかまたはこれに由来するアミノ酸配列を含むペプチドを含む。典型的には、生物学的に活性なタンパク質は、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の少なくとも１つの活性を有するドメインまたはモチーフを含む。Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の生物学的に活性な部分は、例えば少なくとも１０、２５、５０、１００、１５０、２００またはそれ以上のアミノ酸の長さであるポリペプチドであり得る。
【００９４】
２つのアミノ酸または２つの核酸配列間の同一性（％）を決定するために、最適の比較の目的で配列を整列させる（たとえば、最適な整列のために、第一および第二アミノ酸または核酸配列の一方または両方にギャップを導入し、一致しない配列を比較の目的で無視することができる）。好ましい具体例において、比較のために整列された参考配列の長さは、参考配列の長さの、少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、なおさらに好ましくは少なくとも６０％、なおいっそう好ましくは少なくとも７０％、８０％、または９０％のものである。対応する位置での残基または核酸を次いで比較し、一方の配列の位置が他方における対応する位置と同じ残基または核酸で占められているならば、分子はこの位置で同一である。２つの配列間の同一性（％）はしたがって２つの配列により共有される同じ位置の数の関数である（すなわち、同一性（％）＝（同じ位置の数）／（位置の合計数）×１００）。２つの配列間の同一性（％）は、２つの配列の最適な整列のために導入する必要のあるギャップの数、および各ギャップの長さを考慮して、配列により共有される同じ位置の数の関数である。本明細書において用いられる場合、アミノ酸または核酸「同一性」とは、アミノ酸または核酸「相同性」と等しい。
【００９５】
配列の比較および２つの配列間の同一性（％）の決定は、数学アルゴリズムを用いて行うことができる。好ましい具体例において、２つのアミノ酸配列間の同一性は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用い、Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重量および１、２、３、４、５、または６の長さ重量を用いて決定される。さらにもう一つの好ましい具体例において、２つのヌクレオチド配列間の同一性（％）は、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＰＭマトリックス、および４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重量および１、２、３、４、５、または６の長さ重量を用いて決定される。
【００９６】
本発明の核酸およびタンパク質配列はさらに、たとえば、他のファミリーメンバーまたは関連する配列を同定するために公共のデータベースに対して検索を行うための「問い合わせ配列」として用いることができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行うことができ、本発明のＢ７−４またはＰＤ−１核酸と相同性のヌクレオチド配列を得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行うことができ、本発明のＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質分子と相同性のアミノ酸配列を得る。比較の目的でギャップのあるアラインメントを得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９−３４０２に記載されているようにしてＧａｐｐｏｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを用いる場合、それぞれプログラム（たとえばＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。たとえば、デフォルトＢｌａｓｔｉｎマトリックス１〜３（ギャップペナルティーを：イグジステンス１１およびエクステンション１に設定）を用いて本発明のヌクレオチド配列を分析した。デフォルトセッティング：Ｂｌｏｓｕｍ６２マトリックス（ギャップペナルティーを、イグジステンス１１およびエクステンション１に設定）を用いて本発明のアミノ酸配列を分析した。（例えば、ＮＣＢＩウェブ頁を参照）。
【００９７】
本発明はさらにＢ７−４またはＰＤ−１キメラまたは融合タンパク質も提供する。本明細書において用いる場合、Ｂ７−４またはＰＤ−１「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は非Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドと操作可能に結合されたＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドを含む。「Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチド」とは、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味し、一方、「非Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチド」とは、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質、たとえばＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質と異なり、同一または異なる生物から由来するタンパク質と実質的に相同性でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。Ｂ７−４またはＰＤ−１融合タンパク質内で、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドはＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の全部または一部に対応し得る。好ましい具体例において、Ｂ７−４またはＰＤ−１融合タンパク質はＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の少なくとも一つの生物学的に活性な部分、たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の細胞外ドメインを含む。融合タンパク質内で、「操作可能に結合した」なる用語は、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドおよび非Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドは互いにフレーム内で融合することを示すことを意図される。非Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドはＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドのＮ−末端またはＣ−末端と融合させることができる。
【００９８】
たとえば、一具体例において、融合タンパク質は、Ｂ７−４またはＰＤ−１配列がＧＳＴ配列のＣ末端と融合したＧＳＴ−Ｂ７−４またはＧＳＴ−ＰＤ−１融合タンパク質である。もう一つの具体例において、融合タンパク質は、Ｂ７−４またはＰＤ−１ヌクレオチド配列がｐＣＥＰ４−ＨＡなどのベクター（Ｈｅｒｒｓｃｈｅｒ，Ｒ．Ｆ．ら（１９９５）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．９：３０６７−３０８２）中に挿入されているＢ７−４またはＰＤ−１−ＨＡ融合タンパク質であり、したがってＢ７−４またはＰＤ−１配列はインフルエンザ赤血球凝集素エピトープタグにフレーム内で融合する。かかる融合タンパク質は、組み換えＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の精製を促進できる。
【００９９】
Ｂ７−４またはＰＤ−１融合タンパク質は、Ｂ７−４活性を有する第一ペプチドをエンコードするヌクレオチド配列および第一ペプチドの溶解性、親和性、安定性または価を変更する部分、たとえばイムノグロブリン定常領域に対応する第二のペプチドをエンコードするヌクレオチド配列の組み換え発現により産生することができる。好ましくは、第一ペプチドは、配列番号４に示す配列のＢ７−４ポリペプチドの部分（たとえば、免疫細胞の副刺激または阻害を調節するために十分である配列番号４に示す配列のアミノ酸残基１〜２３８または１９〜２３８（シグナル配列の開裂後））からなる。もう一つの好ましい具体例において、第一ペプチドはＰＤ−１ポリペプチドの一部（たとえば、免疫細胞の副刺激または阻害を調節するために十分な配列番号１２に示す配列のアミノ酸残基１〜２８８（またはシグナルペプチドの開裂後の２１〜２８８）の部分）からなる。第二のペプチドは、イムノグロブリン定常領域、たとえば、ヒトＣγ１ドメインまたはＣγ４ドメイン（たとえば、ヒンジ、ヒトＩｇＣγ１のＣＨ２およびＣＨ３、またはヒトＩｇＣγ４、たとえば、Ｃａｐｏｎら、米国特許第５１１６９６４号；第５５８０７５６号；第５８４４０９５号などを参照（これらは出典明示により本発明の一部とする））を含み得る。結果として得られる融合タンパク質は変更されたＢ７−４またはＰＤ−１溶解性、結合親和性、安定性および／または価（すなわち、分子あたりの利用可能な結合部位の数）を有し、タンパク質の精製効率を増大させることができる。組み換え技により産生される融合タンパク質およびペプチドは、該タンパク質またはペプチドを含む細胞および培地の混合物から分泌され、単離することができる。別法として、タンパク質またはペプチドは細胞質に保持され、細胞を収穫し、溶解させ、タンパク質を単離する。細胞培養物は典型的には、宿主細胞、培地および他の副生成物を含む。細胞培養に適した培地は当該分野において周知である。タンパク質およびペプチドを細胞培養培地、宿主細胞、または両方から、タンパク質およびペプチド精製について当該分野において公知の技術を用いて単離することができる。宿主細胞をトランスフェクトし、タンパク質およびペプチドを精製するための技術は当該分野において公知である。
【０１００】
特に好ましいＢ７−４またはＰＤ−１Ｉｇ融合タンパク質は、ヒトＢ７−４またはイムノグロブリン定常領域に結合したＰＤ−１の細胞外ドメイン部分または可変領域様ドメインを包含する。イムノグロブリン定常領域は、イムノグロブリン構造に固有のエフェクター活性を減少または除去する遺伝子修飾を含み得る。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの細胞外部分をエンコードするＤＮＡを、ヒンジ、例えばＷＯ９７／２８２６７に記載されているように部位指向性突然変異誘発により修飾されたヒトＩｇＧγ１および／またはＩｇＧγ４のＣＨ２およびＣＨ３領域をエンコードするＤＮＡと結合させることができる。例えば、Ｂ７−４の融合タンパク質およびイムノグロブリン融合タンパク質を、本明細書においては交換可能に、「Ｂ７−４Ｉｇ」または「Ｂ７−４Ｆｃ」と称する。「Ｉｇ」または「Ｆｃ」を組み入れた他のバリエーションも用いることができる。
【０１０１】
好ましくは、本発明のＢ７−４またはＰＤ−１融合タンパク質は、標準的組み換えＤＮＡ技術により産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントを慣例の技術にしたがって、例えば、結紮のために平滑末端またはスタッガー末端、適当な末端を得るために制限酵素消化、必要に応じて付着末端のフィリングイン、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素結紮を用いて、フレーム内で結紮される。もう一つの具体例において、自動化ＤＮＡ合成器を包含する慣用の技術を用いて融合遺伝子を合成することができる。別法として、２つの連続した遺伝子貫の相補性オーバーハングをもたらすアンカープライマーを用いて、遺伝子フラグメントのＰＣＲ増幅を行うことができ、これを続いてアニールし、再増幅させて、キメラ遺伝子配列が生じる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：１９９２）。さらに、すでに融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチドまたはＨＡエピトープタグ）をエンコードした多くの発現ベクターが商業的に入手可能である。Ｂ７−４またはＰＤ−１エンコーディング核酸を、かかる発現ベクター中にクローンでき、融合部分をＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質にフレーム内で結合させる。
【０１０２】
もう一つの具体例において、融合タンパク質は、そのＮ−末端でヘテロローガスなシグナル配列を含むＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質である。ある宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）、Ｂ７−４またはＰＤ−１の発現および／分泌はヘテロローガスなシグナル配列の使用により増大させることができる。
【０１０３】
本発明のＢ７−４またはＰＤ−１融合タンパク質を医薬組成物中に組み入れ、対象にインビボで投与することができる。Ｂ７−４またはＰＤ−１融合タンパク質は、例えば、自己免疫疾患などの免疫学的障害の治療において、または移植片の拒絶を阻害する場合において、免疫反応の治療的調節に有用である。さらに、本発明のＢ７−４またはＰＤ−１−融合タンパク質（例えば、完全長タンパク質またはその一部）を、対象において抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体を産生するため、Ｂ７−４またはＰＤ−１を精製するため、そしてスクリーニング分析においてはＢ７−４とＢ７−４レセプター、例えばＰＤ−１との相互作用を阻害する分子を同定するために免疫原として用いることができる。
【０１０４】
好ましくは、本発明のＢ７−４またはＰＤ−１キメラまたは融合タンパク質は、標準的組み換えＤＮＡ技術により産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡフラグメントは、慣例の技術にしたがって、例えば結紮のための平滑化またはスタッガー末端、適当な末端を得るための制限酵素消化、必要に応じて付着末端のフィリングイン、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素結紮により、フレーム内で結紮される。もう１つの具体例において、融合遺伝子を、自動化ＤＮＡ合成器を含む慣例の技術により合成することができる。別法として、２つの連続した核酸フラグメントの相補性オーバーハングをもたらすアンカープライマーを用いて核酸（例えば、遺伝子）フラグメントのＰＣＲ増幅を行うことができ、これをその後アニールし、再増幅して、キメラ核酸配列を得る（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ；１９９２参照）。さらに、すでに融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をエンコードした多くの発現ベクターが商業的に入手可能である。Ｂ７−４またはＰＤ−１エンコーディング核酸をかかる発現ベクター中にクローンでき、融合部分をＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質とフレーム内で結合させる。
【０１０５】
本発明はさらに、Ｂ７−４またはＰＤ−１作用物質（模倣物）またはＢ７−４またはＰＤ−１拮抗物質のいずれかとして機能するＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質変異体に対に関する。Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の変異体を、突然変異誘発、例えば不連続点突然変異またはＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の切断により生成させることができる。Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の作用物質は、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性の実質的に同じもの、またはサブセットを保有する。Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の拮抗物質は、例えばＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の細胞活性を拮抗的に調節することにより、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の天然に存在する形態の１以上の活性を阻害できる。かくして、特異的生物学的効果は、制限された機能を有する変異体での処置により惹起できる。一具体例において、タンパク質の天然に存在する形態の生物学的活性のサブセットを有する変異体での対象の治療は、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の天然に存在する形態での治療と比べて、対象における副作用が少ない。
【０１０６】
一具体例において、Ｂ７−４またはＰＤ−１作用物質（模倣物）またはＢ７−４またはＰＤ−１拮抗物質のいずれかとして機能するＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の変異体は、変異体、例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の点変異体または切断型変異体のコンビナトリアルライブラリーを、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質作用物質または拮抗物質活性についてスクリーニングすることにより同定することができる。一具体例において、Ｂ７−４またはＰＤ−１変異体の多様性ライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル突然変異誘発により生成され、多様性遺伝子ライブラリーによりエンコードされる。Ｂ７−４またはＰＤ−１変異体の多様性ライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列中に酵素により結紮することにより産生でき、潜在的なＢ７−４またはＰＤ−１配列の縮退セットが個々のポリペプチド、または別法として、Ｂ７−４またはＰＤ−１配列を含むさらに大きな融合タンパク質（例えば、ファージディスプレー用）のセットとして発現可能である。縮退オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＢ７−４またはＰＤ−１変異体のライブラリーを産生するために用いることができる方法は数多くある。縮退遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡ合成器において行うことができ、合成遺伝子を次いで適当な発現ベクター中に結紮する。１つの混合物において遺伝子の縮退セットの使用は、１つの混合物において、潜在的なＢ７−４またはＰＤ０１配列の所望のセットをエンコードする配列の全ての準備を可能にする。縮退オリゴヌクレオチドを合成する方法は、当該分野において公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ３９：３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３；Ｉｔａｋｕｒａら（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ１９８：１０５６；Ｉｋｅら（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：４７７参照）。
【０１０７】
加えて、スクリーニングとその後のＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の変異体の選択のために、Ｂ７−４またはＰＤ−１フラグメントの多様性集団を生じさせるために、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質コーディング配列のフラグメントのライブラリーを用いることができる。一具体例において、Ｂ７−４またはＰＤ−１コーディング配列の二本鎖ＰＣＲフラグメントを、分子当たりほぼ１回だけニッキングが起こる条件下でヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを変性させて、異なるニック生成物から得られるセンス／アンチセンスを含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、一本鎖タンパク質をＳ１ヌクレアーゼでの処理により改質された二本鎖から除去し、結果として得られるフラグメントライブラリーを発現ベクター中に結紮することにより、コーディング配列フラグメントのライブラリーを生じさせることができる。この方法により、様々なサイズのＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質のＮ−末端、Ｃ−末端および内部フラグメントをエンコードする発現ライブラリーを誘導することができる。
【０１０８】
点突然変異または切断により調製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための技術、および選択された性質を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術がいくつか当該分野において知られている。かかる技術は、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の組み合わせ突然変異誘発により生じる遺伝子ライブラリーの急速なスクリーニングに適合させ得る。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための高スループット分析ができる最も広く用いられている技術は、典型的には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクター中にクローンし、適当な細胞を結果として得られるベクターのライブラリーで形質転換し、コンビナトリアルライブラリーを、所望の活性の検出が、その産物が検出された遺伝子をエンコードするベクターの単離を促進する条件下で発現することを含む。ライブラリーのける機能的変異体の頻度を向上させる新規技術である反復的アンサンブル突然変異誘発（ＲＥＭ）新規技術をＢ７−４またはＰＤ−１変異体を同定するためのスクリーニング分析との組み合わせにおいて用いることができる（ＡｒｋｉｎおよびＹｏｕｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７８１１−７８１５；Ｄｅｌａｇｒａｖｅら（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．６（３）：３２７−３３１）。
【０１０９】
一具体例において、多様性Ｂ７−４またはＰＤ−１ライブラリーを分析するために細胞ベースの分析を利用することができる。例えば、発現ベクターのライブラリーを通常Ｂ７−４またはＰＤ−１を合成し、分泌する細胞系中にトランスフェクトすることができる。トランスフェクトされた細胞を次いで培養すると、Ｂ７−４またはＰＤ−１および特定の変異体Ｂ７−４またはＰＤ−１が分泌され、細胞上清における変異体の発現のＢ７−４またはＰＤ−１活性に対する影響を、例えば多くの機能的分析のいずれかにより検出することができる。プラスミドＤＮＡを次いで阻害、または別法としてＢ７−４またはＰＤ−１活性の増強を行う細胞から回収でき、個々のクローンをさらに特徴づけることができる。
【０１１０】
天然に存在するアミノ酸のみからなるＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドに加えて、Ｂ７−４またはＰＤ−１ペプチド模倣物も提供される。ペプチド類似体は通常製薬業界においてテンプレートペプチドと類似した性質を有する非ペプチド薬剤として使用される。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物」と称し（Ｆａｕｃｈｅｒｅ，Ｊ（１９８６）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．１５：２９；ＶｅｂｅｒおよびＦｒｅｉｄｉｎｇｅｒ（１９８５）ＴＩＮＳ ｐ３９２；およびＥｖａｎｓら（１９８７）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（出典明示により本発明の一部として参照される））、通常コンピューター化された分子モデリングの助けをかりて発展される。等しい治療的または予防的効果を生じるために、治療的に有用なペプチドと構造的に類似しているペプチド模倣物を用いることができる。一般に、ペプチド模倣物は、ヒトＢ７−４またはＰＤ−１などのパラダイムポリペプチド（すなわち、生物学的または薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似しているが、当該分野において公知の方法および次の文献においてさらに記載されている方法により、−ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨ２ＳＯ−からなる群から選択される結合により所望により置換されていてもよい１以上のペプチド結合を有する：Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．“Ｃｈｅｍｉｓｔｙ ａｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”ＷＥｉｎｓｔｅｉｎ，Ｂ．編、Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ｐ２６７（１９８３）；Ｓｐｏｔｌａ，Ａ．Ｆ．、Ｖｅｇａ Ｄａｔａ（１９８３年３月）、第１巻、第３刷、“Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｂａｃｋｂｏｎｅ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ”（概論）；Ｍｏｒｌｅｙ，Ｊ．Ｓ．（１９８０）Ｔｒｅｎｄｓ Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．ｐｐ４６３〜４６８（概論）；Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ら（１９７９）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．１４：１７７〜１８５（−ＣＨ２ＮＨ−、ＣＨ２ＣＨ２−）；Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．ら（１９８６）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．３８：１２４３〜１２４９（−ＣＨ２Ｓ−）；Ｈａｎｎ，Ｍ．Ｍ．（１９８２）Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ Ｔｒａｎｓ．Ｉ．３０７〜３１４（−ＣＨ−ＣＨ−、シスおよびトランス）；Ａｌｍｑｕｉｓｔ，Ｒ．Ｇ．ら（１９０）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２〜１３９８（−ＣＯＣＨ２−）；Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ，Ｃ．ら（１９８２）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．２３：２５３３（−ＣＯＣＨ２−）；Ｓｚｅｌｋｅ，Ｍ．ら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ａｐｐｌｎ．ＥＰ４５６６５（１９８２）ＣＡ：９７：３９４０５（１９８２）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；Ｈｏｌｌａｄａｙ，Ｍ．Ｗ．ら（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．（１９８３）２４：４４０１〜４４０４（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；およびＨｒｕｂｙ，Ｖ．Ｊ．（１９８２）Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．（１９８２）３１：１８９〜１９９（−ＣＨ２−Ｓ−）（それぞれは出典明示により本発明の一部として参照される）。特に好ましい非ペプチド結合は−ＣＨ２ＮＨ−である。かかるペプチド模倣物は、たとえば、より経済的な製造、より高い化学的安定性、向上された薬理学的性質（半減期、吸収、効能、効力など）、変更された特異性（たとえば、広範囲の生物学的活性）、減少した抗原性などを包含する、ポリペプチドの具体例よりも著しく優れた利点を有し得る。ペプチド模倣物の標識は、通常、１以上の標識を、直接またはスペーサー（たとえばアミド基）を介して、定量的構造−活性データおよび／または分子モデリングにより予想されるペプチド模倣物上の干渉しない位置に共有結合させることを含む。このような干渉しない位置は、一般的に治療的効果を生じるためにペプチド模倣物が結合する巨大分子と直接接触しない位置である。ペプチド模倣物の誘導（たとえば標識）は、該ペプチド模倣物の所望の生物学邸または薬理学的活性を実質的に干渉すべきではない。
【０１１１】
さらに安定なペプチドを生じさせるために、Ｂ７−４またはＰＤ−１アミノ酸配列の１以上のアミノ酸の同じタイプのＤ−アミノ酸での系統的な置換（たとえば、Ｌ−リシンの代わりにＤ−リシン）を用いることができる。加えて、Ｂ７−４またはＰＤ−１アミノ酸配列または実質的に同一の配列バリエーションを含む限定されたペプチドは、当該分野において公知の方法（ＲｉｚｏおよびＧｉｅｒａｓｃｈ（１９９２）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７、出典明示により本発明の一部として参照される）；たとえば、ペプチドを環化させる分子内ジスルフィドブリッジを形成できる内部システイン残基を添加することにより得ることができる。
【０１１２】
本発明において同定されたＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドのアミノ酸配列により、当業者らはＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチド配列およびその配列変異体に対応するポリペプチドを産生することが可能になる。かかるポリペプチドはＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドの発現により、原核または真核宿主細胞において、しばしばさらに大きなポリペプチドの一部として、産生することができる。別法として、かかるペプチドは化学的方法により合成することができる。組み換え宿主においてヘテロローガスなタンパク質を発現する方法、ポリペプチドの化学合成、およびインビトロの翻訳は当該分野において一般的であり、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８７）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ，；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．（１９６９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．９１：５０１；Ｃｈａｉｋｅｎ Ｉ．Ｍ．（１９８１）ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．ＢＩｏｃｈｅｍ．１１：２５５；Ｋａｉｓｅｒら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：１８７；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｂ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３２：３４２；Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．（１９８８）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：９５７；およびＯｆｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．（１９８０）Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（出典明示により本発明の一部として参照される）。
【０１１３】
ペプチドは、典型的には直接化学合成により産生することができ、たとえば、Ｂ７−４／ＰＤ−１相互作用の作用物質または拮抗物質として用いることができる。ペプチドは、Ｎ−末端および／またはＣ−末端と共有結合により結合する非ペプチド部分で修飾されたペプチドとして産生することができる。ある好ましい具体例において、カルボキシ末端またはアミノ末端のいずれか、または両方は化学的に修飾される。末端アミノおよびカルボキシ基の最も一般的な修飾は、それぞれアセチル化およびアミド化である。アミノ末端修飾、たとえばアシル化（たとえば、アセチル化）またはアルキル化（たとえば、メチル化）およびカルボキシ末端修飾、たとえばアミド化、ならびに環化を含む他の末端修飾を本発明の様々な具体例に組み入れることができる。あるアミノ末端および／またはカルボキシ末端修飾および／またはコア配列に対するペプチド伸長は、有利な物理的、化学的、生物学的、および薬理学的性質、たとえば向上された安定性、増大した有効性および／または効力、血清プロテアーゼに対する耐性、望ましい薬物動態学的性質などをもたらし得る。たとえば、患者における副刺激を変更することにより、疾患を治療するためにペプチドを治療的に用いることができる。
【０１１４】
単離されたＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質、またはその一部またはフラグメント（またはかかるポリペプチドをエンコードする核酸分子）を、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準的技術を用いてＢ７−４またはＰＤ−１と結合する抗体を生じるために免疫原として用いることができる。完全長Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質を用いることができるか、あるいは本発明は免疫原として用いられるＢ７−４またはＰＤ−１の抗原性ペプチドフラグメントを提供する。Ｂ７−４またはＰＤ−１の抗原性ペプチドは少なくとも８のアミノ酸残基を含み、Ｂ７−４またはＰＤ−１のエピトープを含み、したがって該ペプチドに対して生じる抗体は、Ｂ７−４ＰＤ−１と特異的免疫複合体を形成する。好ましくは、抗原性ペプチドは少なくとも１０のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも１５アミノ酸残基、さらに一層好ましくは少なくとも２０アミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも３０アミノ酸残基を含む。
【０１１５】
別法として、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの抗原性ペプチドフラグメントを免疫原として用いることができる。Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの抗原性ペプチドフラグメントは、典型的に配列番号２、４、１２、または３９に示すアミノ酸配列の少なくとも８アミノ酸残基を含み、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドのエピトープを含むので、該ペプチドに対して生じる抗体はＢ７−４またはＰＤ−１分子と免疫複合体を形成する。抗原性ペプチドにより含まれる好ましいエピトープはタンパク質の表面上に位置するＢ７−４またはＰＤ−１の領域、例えば親水性領域である。一具体例において、抗体はＢ７−４またはＰＤ−１分子の一部（例えば、細胞外部分）を含む分子と実質的に特異的に結合する。もう一つの具体例において、抗体はＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドと特異的に結合する。
【０１１６】
好ましくは、抗原性ペプチドは少なくとも約１０のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも約１５のアミノ酸残基、さらに好ましくは少なくとも約２０のアミノ酸残基、最も好ましくは少なくとも約３０のアミノ酸残基を含む。抗原性ペプチドにより含まれる好ましいエピトープは、タンパク質の表面上に位置し、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドに独特なＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの領域、例えば親水性領域である。一具体例において、かかるエピトープは１つの種、例えばマウスまたはヒトから得られるＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質に特異的であり得る（すなわち、全種にわたって保存されないＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの領域におよぶ抗原性ペプチドが免疫原として用いられ；このような非保存残基を本発明において提供されるアラインメントを用いて決定することができる）。親水性領域を識別するためにＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の標準的疎水性分析を行うことができる。
【０１１７】
Ｂ７−４またはＰＤ−１免疫原は典型的には、適当な対象（たとえば、ウサギ、ヤギ、マウスまたは他の哺乳動物）を免疫源で免疫化することにより抗体を調製するために用いられる。適当な免疫原調製物は、たとえば、組み換えにより発現されたＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質またはペプチドフラグメント、または化学的に合成されたＢ７−４またはＰＤ−１ペプチドフラグメントを含み得る。調製物は、さらにアジュバント、たとえばフロインドの完全または不完全アジュバントまたは類似した免疫刺激剤を含む。適当な対象を免疫原Ｂ７−４またはＰＤ−１調製物で免疫化することにより、ポリクローナル抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体応答が誘発される。
【０１１８】
もう一つの具体例において、核酸ワクチンを様々な手段により、たとえば、注射（たとえば、筋肉内、皮内、または皮膚中に粒子を注入するために粒子加速器または圧縮気体を使用する遺伝子銃を用いた真皮中ＤＮＡコートされた金粒子のバイオリスティック注射（Ｈａｙｎｅｓら（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４：３７））により投与することができる。別法として、核酸ワクチンを非侵襲性手段により投与することができる。たとえば、純粋または脂質処方されたＤＮＡを、呼吸器系または標的とされる他の場所、たとえば、パイエル板にＤＮＡの経口送達により送達することができる（Ｓｃｈｕｂｂｅｒｔ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：９６１）。弱毒化微生物を粘膜表面への送達に用いることができる（Ｓｉｚｅｍｏｒｅら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７０：２９）。
【０１１９】
本発明のさらにもう一つの具体例は、抗Ｂ７−４抗体または抗ＰＤ−１抗体に関する。かかる抗体は、たとえば、動物を免疫原性Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質、あるいはＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドに独特のその免疫原性部分で免疫化し、次いでＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質、またはそのフラグメントと特異的に結合する抗体を動物から単離することにより得られる。
ポリクローナル抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体は、前記のように、適当な対象をＢ７−４またはＰＤ−１免疫原で免疫化することにより調製することができる。免疫化された対象における抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体価を、標準的技術、たとえば固定化Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドを用いた酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、長時間にわたってモニターすることができる。必要に応じて、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドに対する抗体分子を哺乳動物から（たとえば血液から）単離し、プロテインＡクロマトグラフィーなどの周知の技術により精製して、ＩｇＧフラクションを得ることができる。免疫化後の適当な時点で、たとえば、抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体価が最高の時に、抗体産生細胞を対象から得、もともとＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７に記載されている標準的技術、たとえばハイブリドーマ技術（Ｂｒｏｗｎら（１９８１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：５３９−４６；Ｂｒｏｗｎら（１９８０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：４９８０−８３；Ｙｅｈら（１９７６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６：２９２７−３１；およびＹｅｈら（１９８２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ２９：２６９−７５）も参照）、最近のヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、ｐｐ７７−９６）またはトリオーマ技術によりモノクローナル抗体を調製することができる。モノクローナル抗体ハイブリドーマを産生する技術は周知である（一般に、Ｋｅｎｎｅｔｈ Ｒ．Ｈ．ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｎｅｗ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ Ｉｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｅｓ、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９７）Ｓｏｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｇｅｎｅｔ．３：２３１−３６参照）。簡単に説明すると、前記のＢ７−４またはＰＤ−１免疫原で免疫化した哺乳動物から得られる重要な細胞系（典型的には、骨髄腫）をリンパ腫（典型的には脾細胞）と融合させ、結果として得られるハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーンして、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドと好ましくは特異的に結合するハイブリドーマ産生モノクローナル抗体を同定する。
【０１２０】
リンパ球および永久増殖細胞系を融合させるために用いられる多くの一般的なプロトコルのいずれかを、抗Ｂ７−４またはＰＤ−１モノクローナル抗体を生じさせる目的で適用できる（たとえば、Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ２６６：５５０５２；Ｇｅｆｔｅｒら（１９７７）前出；Ｌｅｒｎｅｒ（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔｈ（１９８０）前出参照）。さらに、当業者らは、有用であるこのような方法の多くのバリエーションがあることを理解するであろう。典型的には、永久増殖細胞系（たとえば、骨髄腫細胞系）は、リンパ球と同じ哺乳動物の種から得られる。たとえば、ネズミハイブリドーマは、本発明の免疫原調製物で免疫化されたマウスから得られるリンパ球を永久増殖マウス細胞系と融合することにより調製できる。好ましい永久増殖細胞系は、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培地（「ＨＡＴ培地」）に対して感受性であるマウス骨髄腫細胞系である。多くの骨髄腫細胞系いずれか、たとえば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫細胞系を標準的技術に従って融合パートナーとして用いることができる。これらの骨髄腫細胞系は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（ＲＯｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）から入手可能である。典型的には、ＨＡＴ−感受性マウス骨髄腫細胞を、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を用いてマウス脾臓細胞と融合させる。融合の結果得られるハイブリドーマ細胞を次いでＨＡＴ培地を用いて選択し、これは未融合および非生産的に融合された骨髄腫細胞を殺す（未融合脾細胞は形質転換されないので数日後に死ぬ）。たとえば標準的ＥＬＩＳＡ分析を用いて、Ｂ７−４またはＰＤ−１分子と結合する抗体についてハイブリドーマ培養上清をスクリーンすることにより、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を検出する。
【０１２１】
モノクローナル抗体−分泌ハイブリドーマを調製するための代替法として、組み換え組み合わせイムノグロブリンライブラリー（たとえば、抗体ファージディスプレーライブラリー）をＢ７−４またはＰＤ−１でスクリーンし、これによりＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドと結合するイムノグロブリンライブラリーメンバーを単離することにより、モノクローナル抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体を同定することができる。産生およびスクリーニングファージディスプレーライブラリーのキットは商業的に入手可能である（たとえば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｐｈａｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ＳｕｒｆＺＡＰ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２）。加えて、抗体ディスプレーライブラリーを生じ、スクリーンするのに用いられる方法および試薬の例は、たとえば、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第５２３３４０９；Ｋａｎｇら、国際特許公開番号ＷＯ９２／１８６１９；Ｄｏｗｅｒら、国際特許公開番号ＷＯ９１／１７２７１；Ｗｉｎｔｅｒら、国際特許公開番号ＷＯ９２／２０７９１；Ｍａｒｋｌａｎｄら、国際特許公開番号９２／１５６７９；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら、国際特許公開番号ＷＯ９３／０１２８８；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、国際特許公開番号ＷＯ９２／０１０４７；Ｇａｒｒａｒｄら、国際特許公開番号ＷＯ９２／０９６９０；Ｌａｄｎｅｒら、国際特許公開番号ＷＯ９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３６９−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ３：８１−８５；Ｈｕｓｅら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓら（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｒｋｓｏｎら（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｒｄら（１９９１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）９：１３７３−１３７７；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；Ｂａｒｂａｓら（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：７９７８−７９８２；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ３４８：５５２−５５４において見いだすことが起きる。
【０１２２】
加えて、標準的組み換えＤＮＡ技術を用いて調製できる、ヒトおよび非ヒトタンパク質の両方を含む、組み換え抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体、例えばキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、本発明の範囲内に含まれる。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当該分野において公知の組み換えＤＮＡ技術により、例えば、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら、国際特許公開番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／００２６９；Ａｋｉｒａら、欧州特許出願第１８４１８７号；Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ，Ｍ．ら、欧州特許出願第１７１４９６号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、欧州特許出願第１７３４９４号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒら、ＰＣＴ出願番号ＷＯ８６／０１５３３；Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４８１６５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許出願第１２５０２３号；Ｂｅｔｔｅｒら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０４１−１０４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：３４３９−３４４３；Ｌｉｕら（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３９：３５２１−３５２６；Ｓｕｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：２１４−２１８；Ｎｉｓｈｉｍｕｒａら（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：９９９−１００５；Ｗｏｏｄら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１４：４４６−４４９；およびＳｈａｗら（１９８８）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８０：１５５３−１５５９）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉら（１９８６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ４：２１４；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５２２５５３９号；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２１：５５２−５２５；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４；およびＢｅｉｄｌｅｒら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：４０５３−４０６０に記載されている方法を用いて産生できる。
【０１２３】
加えて、米国特許第５５６５３３２号において開示されたものなどの標準的プロトコルに従ってヒト化抗体を調製することができる。もう一つの具体例において、抗体鎖または特異的結合対メンバーを、特異的結合対メンバーのポリペプチド鎖と複製可能な遺伝子ディスプレーパッケージの成分の融合物をエンコードする核酸分子を含むベクターおよび単一の結合対メンバーの第二のポリペプチド鎖をエンコードする核酸分子を含むベクター間の組み合わせにより、当該分野において公知の技術、例えば米国特許第５５６５３３２号、第５８７１９０７号、または第５７３３７４３号に記載されている技術を用いて産生することができる。細胞におけるタンパク質機能を阻害するために細胞内抗体を使用することも、当該分野において公知である（例えば、Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：２６３８−２６４６；Ｂｉｏｃｃａ，Ｓ．（１９９０）ＥＭＢＯ Ｊ．９：１０１−１０８；Ｗｅｒｇｅ，Ｔ．Ｍ．ら（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２７４：１９３−１９８；Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｊ．Ｒ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：７４２７−７４２８；Ｎａｒａｓｃｏ，Ｗ．Ａ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：７８８９−７８９３；Ｂｉｏｃｃａｌ，Ｓ．ら（１９９４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１２：３９６−３９９；Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｙ．ら（１９９４）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：５９５−６０１；Ｄｕａｎ，Ｌら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：５０７５−５０７９；Ｃｈｅｎ，Ｓ−Ｙ．ら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：５９３２−５９３６；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．ら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２３９３１−２３９３６；Ｂｅｅｒｌｉ，Ｒ．Ｒ．ら（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０４：６６６−６７２；Ｍｈａｓｈｉｋａｒ，Ａ．Ｍ．ら（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：１５４２−１５５１；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ｈ．ら（１９９５）ＰＲｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：３１３７−３１４１；ＰＣＴ公開番号を９４／０２６１０（Ｍａｒａｓｃｏら）；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０３８３２（Ｄｕａｎら））。
【０１２４】
一具体例において、本発明において用いられる抗体は、二重特異性抗体である。二重特異性抗体は１つの抗体分子内に２つの異なる抗原の結合部位を有する。抗原結合は同時または連続的である。トリオーマおよびハイブリッドハイブリドーマは二重特異性抗体を分泌できる細胞系の２つの例である。ハイブリッドハイブリドーマまたはトリオーマにより産生される二重特異性抗体の例は、米国特許第４４７４８９３号に開示されている。二重特異性抗体は化学的手段（Ｓｔａｅｒｚら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１４：６２８、およびＰｅｒｅｚら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１６：３５４）およびハイブリドーマ技術（ＳｔａｅｒｚおよびＢｅｖａｎ（１９８６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：１４５３、およびＳｔａｅｒｚおよびＢｅｖａｎ（１９８６）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ７：２４１）により構築される。二重特異性抗体は、米国特許第５９５９０８４号にも記載されている。二重特異性抗体のフラグメントは米国特許第５７９８２２９号に記載されている。
【０１２５】
二重特異性剤は、ハイブリドーマまたは異なる抗体を調製する他の細胞を融合することによりヘテロハイブリドーマを調製し、続いて両抗体を産生し、コアセンブルするクローンを同定することにより、調製することができる。これらはさらに、完全イムノグロブリン鎖またはその一部、たとえばＦａｂおよびＦｖ配列の化学的または遺伝子結合によっても調製することができる。抗体成分はＰＤ−１またはＢ７−４と結合することができる。
【０１２６】
Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドを標準的技術、例えば、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降により単離するために、抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体（例えば、モノクローナル抗体）を用いることができる。抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体は、細胞からの天然のＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチド、および組み換えにより産生されたＢ７−４または宿主細胞において発現されたＰＤ−１ポリペプチドの精製を促進できる。さらに、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質を検出するために（例えば、細胞溶解物または細胞上清において）、抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体を用いることができる。抗体を検出可能な物質とカップリング（すなわち、物理的結合）させることにより、検出を促進できる。従って、一具体例において、本発明の抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体は、検出可能な物質で標識される。検出可能な物質の例は、様々な酵素、補欠分子、蛍光物質、発光物質および放射性物質を包含する。適当な酵素の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを包含し；適当な補欠分子複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを包含し；適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、アンシルクロリドまたはフィコエリスリンを包含し；発光物質の例はルミノールを包含し；適当な放射性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、および３Ｈを包含する。
【０１２７】
ＩＶ．組み換え発現ベクターおよび宿主細胞
Ｂ７−４またはＰＤ−１ファミリータンパク質（またはその一部）をエンコードする核酸分子は、ベクター、好ましくは発現ベクター中に含まれ得る。本明細書において用いられる場合、「ベクター」なる用語は、それが結合しているもう一つ別の核酸を輸送できる核酸分子を意味する。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これはその中にさあなるＤＮＡセグメントを結紮できる環状二本鎖ＤＮＡループを意味する。もう一つ別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ここにおいてさらなるＤＮＡセグメントはウイルスゲノム中に結紮できる。ある種のベクターは、これらが導入される宿主細胞において自発的に複製できる（例えば、複製の細菌起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞中に導入する際に、宿主細胞のゲノム中に組み入れられ、その結果、宿主細胞ゲノムとともに複製される。さらに、ある種のベクターはこれらが操作可能に結合される遺伝子の発現を行うことができる。かかるベクターを本発明において「発現ベクター」と称する。一般に、組み換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。プラスミドはベクターの最も一般的に用いられる形態であるので、本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は交換可能に用いることができる。しかしながら、本発明は、発現ベクターのこのような他の形態、例えば、相当する役割を果たすウイルスベクター（例えば、複製能欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルス）を包含することを意図される。
【０１２８】
組み換え発現ベクターは、発現、例えば、宿主細胞における核酸分子の指示細胞においてＰＤ−１またはＢ７−４の構成性発現または誘導発現に適した形態の本発明の核酸分子を含み得る。このことは、組み換え発現ベクターは、発現される核酸はいれつに操作可能に結合された、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択される１以上の調節配列を含むことを意味する。組み換え発現ベクター内で、「操作可能に結合した」とは、興味のあるヌクレオチド配列が調節配列と、ヌクレオチド配列の発現を許容する方法で結合することを意味する（例えば、インビトロ転写／翻訳システムまたはベクターが宿主細胞中に導入される場合は宿主細胞において）。「調節配列」なる用語は、プロモーター、エンハンサーおよび他の発現調節エレメント（たとえば、ポリアデニル化シグナル）を包含する。このような調節配列は、たとえば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：３−７に記載されている。調節配列は、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成性発現を行うもの、およびある種の宿主細胞（たとえば、組織特異性調節配列）においてのみヌクレオチド配列の発現を行うものを包含する。発現ベクターのデザインは、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの因子に依存し得る。本発明の発現ベクターを宿主細胞中に導入することができ、結果として、本明細書において記載される核酸（たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ファミリータンパク質、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の変異体、融合タンパク質など）によりエンコードされる融合タンパク質またはペプチドを包含するタンパク質またはペプチドが生じる。
【０１２９】
本発明の組み換え発現ベクターは、原核または真核細胞におけるＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質を発現するために設計できる。たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質は、細菌細胞、たとえば、イー・コリ、昆虫細胞（バクロウイルス発現ベクターを使用）酵母細胞または哺乳動物細胞において発現できる。適当な宿主細胞はＧｏｅｄｄｅｌ（１９９０）前出においてさらに議論されている。別法として、組み換え発現ベクターを、インビトロで、たとえばＴ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて転写し、翻訳することができる。
【０１３０】
原核細胞におけるタンパク質の発現は、融合または非融合タンパク質のいずれかの発現を行う構成性または誘導プロモーターを含むベクターを用いてイー・コリにおいて行われることが最も多い。融合ベクターは多くのアミノ酸をその中でエンコードされるタンパク質、通常組み換えタンパク質のアミノ末端に加える。このような融合ベクターは、典型的には次の３つの目的に役立つ：１）組み換えタンパク質の発現を増大させる；２）組み換えタンパク質の溶解度を増大させる；および３）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより組み換えタンパク質の精製を助ける。しばしば、融合発現ベクターにおいて、原核開裂部位を融合部分と組み換えタンパク質の接合点で導入し、融合タンパク質の精製後、組み換えタンパク質の融合部分からの除去を可能にする。このような酵素、およびその同源認識配列は、ファクターＸａ、トロンビンおよびエンテロキナーゼを含む。典型的な融合発現ベクターは、それぞれグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを標的組み換えタンパク質と融合させるｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｉｎ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．およびＪｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含む。
【０１３１】
精製融合タンパク質は、Ｂ７−４またはＰＤ−１活性分析（たとえば、以下に詳細に記載する直接分析または競合アッセイ）において、あるいはたとえばＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質に対して特異的な抗体を生成するために用いることができる。
適当な誘導非融合イー・コリ発現ベクターの例は、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎら（１９８８）Ｇｅｎｅ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ１１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒら（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０−８９）。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターから宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存する。ｐＥＴ１１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、同時発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ｇｎ１）により影響を受けるＴ７ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存する。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ５プロモーターの転写制御下、Ｔ７ｇｎ１遺伝子を有するレジデントプロファージから宿主下部ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）により供給される。
【０１３２】
イー・コリにおける組み換えタンパク発現を最大にするための一方法は、組み換えタンパク質をタンパク質分解により開裂させる能力が損なわれている宿主細菌においてタンパク質を発現することである。もう一つの方法は、各アミノ酸についての個々のコドンが位・コリにおいて優先的に利用されるものであるように、発現ベクター中に挿入される核酸の核酸配列を変更することである（Ｗａｄａら（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸は配列のこのような変更は、標準的ＤＮＡ合成技術により行うことができる。
【０１３３】
もう一つの具体例において、Ｂ７−４またはＰＤ−１発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母エス・セレビシエにおける発現ベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦあ（ＫｕｒｊａｎおよびＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ（１９８２）Ｃｅｌｌ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９８７）Ｇｅｎｅ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、およびｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を包含する。
【０１３４】
別法として、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドはバクロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞において発現することができる。培養された昆虫細胞（たとえば、Ｓｆ９細胞）におけるタンパク質の発現に利用できるバクロウイルスベクターは、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈら（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｖ．Ａ．およびＳｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．Ｄ．（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７０−：３１−３９）を包含する。
【０１３５】
さらにもう一つの具体例において、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例は、ｐＭｅｘ−ＮｅｏＩ、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎら（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）を包含する。哺乳動物細胞において用いられる場合、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイルス調節エレメントによりもたらされる。たとえば、通常用いられるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびシミアンウイルス４０から得られる。原核および真核細胞の両方の他の適当な発現系については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、１９８９の第１６章および第１７章参照。
【０１３６】
もう一つの具体例において、組み換え哺乳動物発現ベクターは、特定のセルタイプにおいて優先的に核酸を発現できる（たとえば、核酸を発現するために、組織特異性調節エレメントが用いられる）。組織特異性調節エレメントは当該分野において公知である。組織特異性プロモーターの非限定的例は、アルブミンプロモーター（肝臓特異性；Ｐｉｎｋｅｒｔら（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異性プロモーター（ＣａｌａｍｅおよびＥａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞レセプターのプロモーター（ＷｉｎｏｔｏおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＺＢＯ Ｊ．８：７２９−７３３）およびイムノグロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉら（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：７２９−７４０；ＱｕｅｅｎおよびＢａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異性プロモーター（たとえば、神経フィラメントプロモーター；ＢｙｎｅおよびＲｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異性プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異性プロモーター（たとえば、乳清プロモーター；米国特許大４８７３３１６号および欧州特許出願公開番号２６４１６６）を包含する。発展的に調節されるプロモーター、たとえば、ネズミホメオボックスプロモーター（ＫｅｓｓｅｌおよびＧｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（ＣａｍｐｅｓおよびＴｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）も含まれる。
【０１３７】
さらに、哺乳動物細胞において使用される誘導調節システム、たとえば、遺伝子発現が重金属イオンにより調節されるシステム（たとえば、Ｍａｙｏら（１９８２）Ｃｅｌｌ２９：９９−１０８；Ｂｒｉｎｓｔｅｒら（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ２９６：３９−４２；Ｓｅａｒｌｅら（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４８０−１４８９参照）、熱ショック（たとえば、Ｎｏｕｒｅら（１９９１）Ｈｅａｔ Ｓｈｏｃｋ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｎｏｕｅｒ，Ｌ．編、ＣＲＣ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、ＦＬ、ｐｐ１６７−２２０参照）、ホルモン（たとえば、Ｌｅｅら（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ２９４：２２８−２３２；Ｈｙｎｅｓら（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７８：２０３８−２０４２；Ｋｌｏｃｋら（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ３２９：７３４−７３６；ＩｓｒａｅｌおよびＫａｕｆｍａｎ（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１７：２５８９−２６０４；およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９３／２３４３１参照）、ＦＫ５０６関連分子（たとえば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１８３１７参照）またはテトラサイクリン（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．およびＢｕｊａｒｄ，Ｈ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：５５４７−５５５１；Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ら（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：１７６６−１７６９；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２９４４２ｌおよびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／０１３１３）は当該分野において公知である。従って、もう一つの具体例において、本発明はＢ７−４またはＰＤ−１ＤＮＡが誘導真核プロモーターと操作可能に結合する組み換え発現ベクターを提供し、その結果、真核細胞におけるＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の誘導発現を許容する。
【０１３８】
本発明はさらに、アンチセンス配向で発現ベクター中にクローンされた本発明のＤＮＡ分子を含む組み換え発現ベクターを提供する。すなわち、ＤＮＡ分子は、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡに対してアンチセンスであるＲＮＡ分子の発現（ＤＮＡ分子の転写による）を許容する方法で調節配列と操作可能に結合する。さまざまなセルタイプにおいてアンチセンスＲＮＡ分子の連続した発現を行うアンチセンス配向でクローンされた核酸と操作可能に結合する調節配列を選択できる。たとえば、アンチセンスＲＮＡの構成性、組織特異性またはセルタイプ特異性発現を行うウイルスプロモーターおよび／エンハンサー、または調節配列を選択できる。アンチセンス発現ベクターは、アンチセンス核酸が有効性の高い調節領域の制御下で賛成される組み換えプラスミド、ファージミドまたは弱毒化ウイルスの形態であり得、その活性は、ベクターが導入されるセルタイプにより決定できる。アンチセンス遺伝子の遺伝子発現の調節についての議論に関しては、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ら（１９８６）「遺伝子分析の分子ツールとしてのアンチセンスＲＮＡ」Ｒｅｖｉｅｗｓ−Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１（１）巻参照。
【０１３９】
本発明はさらに、本発明の組み換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関する。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、かかる細胞の子孫または可能性のある子孫も意味する。突然変異または環境的影響のいずれかのためにその後の世代においてある修飾が起こりえるので、このような子孫は、実際には親細胞と同一で内科もしれないが、それでも本発明において用いられる用語の範囲内に含まれる。
宿主細胞は、任意の原核または真核細胞である。たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質を細菌細胞、たとえば、イー・コリ、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（たとえば、チャイニーズ・ハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）において発現することができる。他の適当な宿主細胞は当業者には公知である。
【０１４０】
ベクターＤＮＡを、慣用の形質転換またはトランスフェクション技術により原核または真核細胞中に導入することができる。本明細書において用いられる場合、「形質転換」および「トランスフェクション」なる用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストランによるトランスフェクション、リポフェクション（ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ）、またはエレクトロポレーションを含む、外来核酸（たとえば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための様々な当該分野で承認された技術を意味する。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適当な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｎｕａｌ．第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）、および他の実験室マニュアルにおいて見いだすことができる。
【０１４１】
哺乳動物の安定なトランスフェクションに関して、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、細胞の小さなフラクションのみがそのゲノム中に外来ＤＮＡを組み入れることができることが知られている。これらの構成要素を同定し、選択するために、選択マーカー（たとえば、抗生物質に対して耐性）をエンコードする遺伝子は、一般に関心のある遺伝子と共に宿主細胞中に導入される。好ましい選択マーカーは、Ｇ４１８、ヒグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬剤に対して耐性を賦与するものを包含する。選択マーカーをエンコードする核酸は、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質をエンコードするものと同じベクター上で宿主細胞中に導入できるか、または別のベクター上に導入できる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択により同定できる（たとえば、選択マーカー遺伝子を組み入れた細胞は生存し、他の細胞は死ぬ）。
【０１４２】
本発明の宿主細胞、たとえば、培養物における原核または真核宿主細胞を、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質を産生（すなわち、発現）するために用いることができる。したがって、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を用いてＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質を産生するための方法を提供する。一具体例において、方法は、宿主細胞（Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質をエンコードする組み換え発現ベクターが導入されている）を適当な培地中で培養して、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質が産生されるようにすることを含む。もう一つの具体例において、方法はさらに、培地または宿主細胞からＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質を単離することを含む。
【０１４３】
ある宿主細胞は、ヒト以外のトランスジェニック動物を調製するために用いることができる。たとえば、一具体例において、宿主細胞は、その中にＢ７−４またはＰＤ−１コーディング配列が導入された受精卵母細胞または胚幹細胞である。かかる宿主細胞を次いで、外因性Ｂ７−４またはＰＤ−１配列がそのゲノム中に導入されているヒト以外のトランスジェニック動物、または外因性Ｂ７−４またはＰＤ−１配列が変更されているホモローガスな組み換え動物を創るために用いることができる。このような動物は、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの機能および／または活性を研究するため、およびＢ７−４またはＰＤ−１活性の修飾物質を同定および／または評価するために有用である。本明細書において用いられる場合、「トランスジェニック動物」とは、ヒト以外の動物、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくは齧歯類、たとえばラットまたはマウスであって、該動物の１以上の細胞がトランス遺伝子であるものである。トランスジェニック動物の他の例は、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などを包含する。トランス遺伝子は、トランスジェニック動物が発生し、成体動物のゲノムにおいて保持される細胞のゲノム中に組み入れられ、その結果、該トランスジェニック動物の１以上のセルタイプまたは組織においてエンコードされた遺伝子産物の発現が行われる外因性ＤＮＡである。本明細書において用いられる場合、「ホモローガスな組み換え動物」はヒト以外、好ましくは哺乳動物、さらに好ましくはマウスであり、ここにおいて外因性Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子は、該動物の発生前に、該動物の細胞、たとえば該動物の胚細胞中に導入された外因性遺伝子と外因性ＤＮＡ分子巻のホモローガスな組み換えにより変更されている。
【０１４４】
トランスジェニック動物は、たとえば、マイクロインジェクション、レトロウイルス感染、および卵母細胞を偽妊娠したメスの里親動物において発生させることにより、Ｂ７−４またはＰＤ−１エンコーディング核酸分子を受精卵母細胞のオス生殖核中に導入することにより創ることができる。配列番号１、３、１０、または１１のｐＢ７−４またはＰＤ−１ｃＤＮＡ配列をトランス遺伝子としてヒト以外の動物のゲノム中に導入することができる。別法として、マウスまたはラットＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子などのヒトＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子のヒト以外の相同体をトランス遺伝子として用いることができる。別法として、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子相同体、たとえばもう一つのＢ７−４またはＰＤ−１ファミリーメンバーを、配列番号１、３、１０、または１１のＢ７−４またはＰＤ−１ファミリーｃＤＮＡ配列とのハイブリダイゼーションに基づいて単離し（前記第１章においてさらに記載）、トランス遺伝子として用いることができる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルも、トランス遺伝子の発現の有効性を増大させるためにトランス遺伝子中に含めることができる。組織特異性調節配列は操作可能にＢ７−４またはＰＤ−１トランス遺伝子と結合させて、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の特定の細胞への発現を行うことができる。胚操作およびマイクロインジェクションによりトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を調製する方法は、当該分野において一般的になりつつあり、たとえば、米国特許第４７３６８６６号および第４８７０００９号（両方ともＬｅｄｅｒら）、米国特許第４８７３１９１号（Ｗａｇｎｅｒら）およびＨｏｇａｎ，Ｂ．Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ，Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）に記載されている。他のトランスジェニック動物を産生するために類似の方法が用いられる。トランスジェニック創始動物を、その下のっむにおけるＢ７−４またはＰＤ−１トランス遺伝子の存在および／または動物の組織細胞におけるＢ７−４の発現に基づいて同定することができる。トランスジェニック創始動物を次にトランス遺伝子を有するさらなる動物を飼育するために用いることができる。さらに、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質をエンコードするトランス遺伝子を有するトランスジェニック動物をさらに、他のトランス遺伝子を有する他のトランスジェニック動物を飼育するために用いることができる。
【０１４５】
ホモローガスな組み換え動物を創るために、これによりＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子を変更、たとえば機能的に破壊するために欠失、付加または置換が導入されているＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子の少なくとも一部を含むベクターが調製される。Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子はヒト遺伝子（たとえば、配列番号１、３、１０、または１１）であり得るが、より好ましくは、ヒトＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子の非ヒト相同体である（たとえば、配列番号１、３、１０、または１１のヌクレオチド配列でのストリンジェントなハイブリダイゼーションにより単離されるｃＤＮＡ）。たとえば、マウスゲノムにおける外因性Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子を変更するために適したホモローガスな組み換えベクターを構築するために、マウスＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子を用いることができる。好ましい具体例において、ベクターは、ホモローガスな組み換えにより、外因性Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子が機能的に破壊されるように設計される（すなわち、もはや機能的タンパク質をエンコードしない；「ノックアウト」ベクターともいう）。別法として、ベクターは、ホモローガスな組み換えにより、外因性Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子が突然変異するか、または他の方法で変更されるが、それでも機能的タンパク質をエンコードするように設計できる（たとえば、外因性Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の発現を変更するように上流調節領域を変更できる）。ホモローガスな組み換えベクターにおいて、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子の変更された部分は、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子の追加の核酸配列がその５’および３’末端で側面に位置して、ベクターおよび胚幹細胞における外因性Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子により運ばれる外因性Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子間にホモローガスな組み換えが起こる。追加のフランキングＢ７−４またはＰＤ−１核酸配列は外因性遺伝子でのホモローガスな組み換えが成功するために十分な長さを有する。典型的には、数キロベースのフランキングＤＮＡ（５’および３’末端の両方で）はベクター中に含まれる（たとえば、ホモローガスな組み換えベクターの記載についてはＴｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．およびＣａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ５１：５０３参照）。ベクターを胚幹細胞系中に導入し（たとえば、エレクトロポレーションによる）、導入されたＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子が外因性Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子と同様に再結合されている細胞を選択する（たとえば、Ｌｉ，Ｅ．ら（１９９２）Ｃｅｌｌ６９：９１５）。選択された細胞を次いで動物（たとえば、マウス）の胚盤胞中に注入して、凝集キメラを形成する（たとえば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．編（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７）ｐｐ１１３−１５２参照）。動物の全ての細胞がトランス遺伝子の生殖細胞伝達により同様に再結合されたＤＮＡを含む動物を飼育するために、キメラ胚を次いで適当な偽妊娠した里親動物中に移植し、胚を出産させることができる。同様に再結合されたＤＮＡをその胚細胞中に有する子孫を用いることができる。ホモローガスな組み換えベクターおよびホモローガスな組み換え動物を構築する方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．（１９９１）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｔｅｈｎｏｌ．２：８２３−８２９およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／１１３５４（Ｌｅ Ｍｏｕｅｌｌｅｃら；ＷＯ９１／０１１４０（Ｓｍｉｔｈｉｅｓら）；ＷＯ９２／０９６８（Ｚｉｊｌｓｔｒａら）；およびＷＯ９３／０４１６９（Ｂｅｒｎｓら）においてさらに記載されている。
【０１４６】
前記に加えて、当業者は、ホモローガスな組み換えについて当該分野で公知の他の方法を本発明に適用できることを理解するであろう。酵素補助部位特異性組み込みシステムは、Ｃｒｅレコンビナーゼ−ロックス標的システム（たとえば、Ｂａｕｂｏｎｉｓ，Ｗ．およびＳａｕｅｒ，Ｂ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：２０２５−２０２９；およびＦｕｋｕｓｈｉｇｅ，Ｓ．およびＳａｕｅｒ，Ｂ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：７０９５−７９０９に記載）およびＦＬＰレコンビナーゼ−ＦＲＴ標的システム（たとえば、Ｄａｎｇ，Ｄ．Ｔ．およびＰｅｒｒｉｍｏｎ，Ｎ．（１９９２）Ｄｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１３：３６７−３７５；およびＦｉｅｒｉｎｇ，Ｓ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：８４６９−８４７３に記載）を包含する。テトラサイクリン調節誘導ホモローガス組み換えシステム、たとえばＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／２９４４２およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９６／０１３１３に記載されているものも用いることができる。
【０１４７】
たとえば、もう一つの具体例において、トランス遺伝子の規制された発現を許容する選択されたシステムを含むヒト以外のトランスジェニック動物を創ることができる。このようなシステムの一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼシステムの記述に関しては、たとえば、Ｌａｋｓｏら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９：６２３２−６２３６参照。レコンビナーゼシステムのもう一つの例は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＦＬＰレコンビナーゼシステムである（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎら（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５１：１３５１−１３５５）。トランス遺伝子の発現を調節するためにｃｒｅ／ｌｏｘＰレコンビナーゼシステムを使用する場合、Ｃｒｅレコンビナーゼと選択されたタンパク質の両方をエンコードするトランス遺伝子を含む動物が必要とされる。かかる動物は、たとえば２匹のトランスジェニック（一方は選択されたタンパク質をエンコードするトランス遺伝子を含み、他方はレコンビナーゼをエンコードするトランス遺伝子を含む）を交尾させることにより、「ダブル」トランスジェニック動物の構築により提供できる。
【０１４８】
本明細書に記載するヒト以外のトランスジェニック動物のクローンも、Ｗｉｌｍｕｔ，Ｉ．ら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ３８５：８１０−８１３およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９７／０７６６８およびＷＯ９７／０７６６９に記載されている方法に従って創ることができる。簡単に説明すると、トランスジェニック動物から得られる細胞、たとえば、体細胞を単離し、成長周期をでて、Ｇｏ期に入らせることができる。静止細胞を次いで、たとえば電気パルスの使用により、静止細胞が単離された同じ種の動物から得られる核を取り除いた卵母細胞と融合させることができる。再構成された卵母細胞を次いで培養して、桑実胚または未分化胚芽細胞を発生させ、次いで偽妊娠したメス里親動物に移す。このメス里親動物の子孫は、細胞、たとえば体細胞がたん利される動物のクローンである。
【０１４９】
Ｖ．医薬組成物
Ｂ７−４またはＰＤ−１モジュレーター（たとえば、前記のＢ７−４またはＰＤ−１核酸分子、タンパク質、抗体、あるいはＢ７−４またはＰＤ−１活性および／または発現のモジュレーターあるいはＢ７−４およびＰＤ−１の間の相互作用のモジュレーターとして確認されている化合物を含む、Ｂ７−４またはＰＤ−１阻害または刺激剤）を投与に適した医薬組成物中に組み入れることができる。かかる組成物は、典型的には核酸分子、タンパク質、または抗体および医薬的に許容される担体を含む。本明細書において用いられる場合、「医薬的に許容される担体」とは、医薬投与に適合するありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含することを意図される。医薬的に活性な物質のこのような媒体および薬剤の使用は当該分野においては一般的である。慣用の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除いて、その組成物における使用も考慮される。追加の活性化合物も組成物中に組み入れることができる。
【０１５０】
本発明の医薬組成物は、意図される投与経路と適合するように処方される。投与経路の例は、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与を包含する。非経口、皮内、または皮下投与に用いられる溶液または懸濁液は、次の成分を含むことができる：滅菌希釈剤、例えば注射用水、塩溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、ポリプロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤、例えばベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート化剤、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸；緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩および等張性を調節するための薬剤、例えば塩化ナトリウムまたはデキストロース。ｐＨは酸または塩基、例えば塩酸または水酸化ナトリウムで調節することができる。非経口製剤は、アンプル、使い捨て注射器またはガラスまたはプラスチック製の複数回投与用バイアル中に封入できる。
【０１５１】
注射可能な用途に適した医薬組成物は、滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射可能な溶液または分散液の即席調製用滅菌粉末を包含する。静脈内投与に関しては、適当な担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）またはリン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）を包含する。あらゆる場合において、組成物は無菌でなければならず、注射針通過が容易である程度に流動性であるべきである。これは製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、微生物、例えば細菌および真菌の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適当な混合物を含む溶媒または分散液媒体であり得る。流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持および界面活性剤の使用により維持される。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成できる。多くの場合において、等張剤、たとえば、糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましい。注射可能な組成物の長期におよぶ吸収は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンを含めることにより達成できる。
【０１５２】
無菌注射可能な溶液は、活性化合物（例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質または抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体）を必要な量において適当な溶媒中、前記の成分またはその組み合わせと共に組み入れ、必要に応じてその後濾過滅菌することにより調製できる。一般に、活性化合物を、塩基性分散媒体と前記の内の必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に組み入れることにより分散液を調製することができる。無菌注射溶液を調製するための無菌粉末の場合において、好ましい調製法は、真空乾燥およびそのあらかじめ無菌濾過された溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末が得られる凍結乾燥である。
【０１５３】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または可食性担体を含む。これらはゼラチンカプセル中に封入できるか、または圧縮されて錠剤にできる。経口治療的投与の目的に関して、活性化合物を賦形剤と共に組み入れて、錠剤、トローチまたはカプセルの形態において使用することができる。経口組成物はさらに、洗口剤として使用するために液体担体を用いて調製することもでき、ここにおいて、液体担体中の化合物は、経口投与され、くちゅくちゅし、はき出すかまたは飲み込まれる。医薬的に適合性の結合剤、および／またはアジュバント物質を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、トローチなどは、次の成分のうちの任意のもの、または類似した性質を有する化合物を含むことができる：バインダー、例えば微結晶セルロール、トラガカントガムまたはゼラチン；賦形剤、例えばデンプンまたはラクトース、崩壊剤、例えばアルギン酸、プリモゲル、またはコーンスターチ；滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ；潤滑剤、例えばコロイド状二酸化珪素；甘味料、例えばシュークロースまたはサッカリン；あるいはフレーバー、例えばペパーミント、メチルサリチレート、またはオレンジフレーバー。
【０１５４】
吸入による投与に関して、化合物は、適当なプロペラント、例えば二酸化炭素などの気体を含む圧縮された容器またはディスペンサーからエアゾルスプレー、あるいはネブライザーの形態において送達される。
全身性投与は、経粘膜または経皮手段によることもできる。経粘膜または経皮投与に関して、浸透されるバリヤに対して適当な浸透剤が処方において用いられる。このような浸透剤は当該分野において一般的に公知であり、例えば、経粘膜投与については、洗剤、胆汁酸塩、およびフシジン酸誘導体を包含する。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤伸しようにより達成できる。経皮投与については、活性化合物は当該分野において一般的に知られている軟膏、膏薬、ジェル、またはクリームに処方される。
【０１５５】
化合物は、直腸送達のための坐剤（例えば、慣用の坐剤基剤、例えばカカオ脂または他のグリセリドを用いる）または貯留性浣腸剤の形態においても調製できる。
一具体例において、インプランとおよびマイクロカプセル送達システムを含む放出調節型処方などの調節剤は、化合物が体から急速に排除されるのを防ぐ担体を用いて調製される。エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドライド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ酢酸などの生物分解性ポリマーを用いることができる。かかる処方の調製法は、当業者らには自明でなければならない。物質はまた、Ａｌｚａ ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手可能である。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体に感染した細胞を標的とするリポソームを包含する）はさらに、医薬的に許容される担体としても用いることができる。これらは当業者に公知の方法に従って、例えば、米国特許大４５２２８１１号に記載されているようにして調製できる。
【０１５６】
投与の簡便性および投与量の均一性のために、単位投与形態の経口または非経口組成物を処方するのが特に有利である。本発明において用いられる単位投与形態とは、治療される患者についての単一用量として適した物理的に独立した単位を意味し；各単位は、必要とされる医薬担体と組み合わせて所望の治療的効果を生じるために計算されたあらかじめ決められた量の活性成分を含む。本発明の単位投与形態の明細は、活性化合物の独自の特性および達成されるべき特定の治療効果、および個人を治療するためのかかる活性化合物を配合する分野に固有の制限に直接依存し、指示される。
【０１５７】
かかる化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対する致死量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するために、細胞培養または実験動物において標準的製薬法により決定することができる。毒性と治療的効果の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。有毒な副作用を示す化合物を用いることができるが、未感染細胞に対する潜在的なダメージを最小限に抑え、従って副作用を軽減するために、病気に冒された組織の部位に対してかかる化合物を標的とさせるデリバリーシステムを設計するために注意しなければならない。
【０１５８】
細胞培養分析および動物実験から得られるデータをヒトにおいて使用する一連の用量の処方において用いることができる。かかる化合物の用量は、好ましくは、毒性が低いかまたは毒性のないＥＤ５０を含む循環濃度内にある。用量は、用いられる用量および用いられる投与経路に応じてこの範囲内で変化し得る。本発明の方法において用いられる化合物に関して、治療的に有効な用量は、最初は細胞培養分析から評価できる。用量は、細胞培養において決められたＩＣ５０（すなわち、症状の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿濃度を達成するために動物モデルにおいて処方することができる。このような情報は、ヒトにおいて有用な用量をさらに正確に決定するために用いることができる。血漿中のレベルは、たとえば、高性能液体クロマトグラフィーにより測定できる。
【０１５９】
本発明の核酸分子は、ベクター中に挿入でき、遺伝子療法ベクターとして使用できる。遺伝子療法ベクターは、たとえば静脈内注射、局所投与（米国特許第５２３８４７０）または定位注射（たとえば、Ｃｈｅｎら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３０５４−３０５７）により対象に送達できる。遺伝子療法ベクターの医薬調製物は、許容される希釈剤中遺伝子療法ベクターを含むか、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた除法性マトリックスを含み得る。別法として、完全遺伝子送達ベクターが組み換え細胞、たとえばレトロウイルスベクターから完全な状態で産生される場合、医薬組成物は。遺伝子送達系を生じる１以上の細胞を含み得る。
医薬組成物は、容器、パック、またはディスペンサー中、投与の使用説明書とともに同封できる。
【０１６０】
ＶＩ．本発明の使用および方法
Ｂ７−４および／またはＰＤ−１調節剤、たとえば、本明細書に記載された核酸分子、タンパク質、タンパク質相同体、および抗体は、次の方法の１以上において用いることができる：ａ）たとえば、免疫反応の減少調節による治療法；ｂ）スクリーニングアッセイ；ｃ）予測医学（ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（たとえば、診断分析、予知分析、臨床試験のモニタリング、および薬理遺伝学）。本発明の単離された核酸分子は、たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質を発現するため（たとえば、遺伝子療法用途において宿主細胞における組み換え発現ベクターによる）、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡ（たとえば、生物学的サンプルにおいて）またはＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子における遺伝子変更を検出するため、およびＢ７−４またはＰＤ−１活性を調節するために以下にさらに記載するようにして用いることができる。Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質は、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の不十分または過剰の産生により特徴づけられる障害を治療するために用いることができる。加えて、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質は、天然に存在するＢ７−４またはＰＤ−１結合パートナーについてスクリーンするため、Ｂ７−４またはＰＤ−１活性を調節する薬剤または化合物についてスクリーンするため、ならびにＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の不十分または過剰な産生またはＢ７−４またはＰＤ−１野生型タンパク質と比較して減少しているかまたは異常な活性を有するＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質形態の産生により特徴づけられる障害を治療するために用いることができる。さらに、本発明の抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体は、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質を検出し、単離し、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質のバイオアベイラビリティーを調節し、たとえばＢ７−４またはＰＤ−１の相互作用を調節することによりＢ７−４またはＰＤ−１活性を調節するために使用できる。
【０１６１】
Ａ．治療法：
本発明は、異常なＢ７−４またはＰＤ−１発現または活性に関連する障害にかかるおそれがある（またはかかりやすい）か、または障害にかかっている対象を治療するための予防法および治療法の両方を提供する。
【０１６２】
１．予防法
一態様において、本発明は、対象において、異常なＢ７−４またはＰＤ−１発現または活性に関連する疾患または状態を治療する方法であって、該対象にＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドまたはＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドまたはＢ７−４またはＰＤ−１活性の少なくとも一つを調節する薬剤を投与することによる方法を提供する。異常なＢ７−４またはＰＤ−１発現または活性により引き起こされるか、または一因である疾患にかかるおそれのある対象は、たとえば、本明細書に記載する診断または予防法いずれかまたは組み合わせにより確認することができる。予防薬の投与は、疾患または障害が予防されるか、またはその進行が遅れるように、Ｂ７−４またはＰＤ−１以上に特徴的な症状が現れる前に行うことができる。Ｂ７−４またはＰＤ−１以上または状態の種類に応じて、対象を治療するために、たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチド、Ｂ７−４またはＰＤ−１作用物質またはＢ７−４またはＰＤ−１拮抗剤を用いることができる。適当な薬剤は、臨床指標に基づいて決定でき、たとえば本明細書に記載するスクリーニング分析を用いて確認できる。
【０１６３】
２．治療法
本発明のもう一つの態様は、治療目的で、Ｂ７−４またはＰＤ−１発現または活性を調節する方法に関する。Ｂ７−４は、免疫細胞の副刺激および増殖を阻害し、ＰＤ−１により免疫細胞に阻害シグナルを伝達することが証明されている。従って、Ｂ７−４またはＰＤ−１の活性および／または発現ならびにＢ７−４およびＰＤ−１間の相互作用は、免疫反応を調節するために調節できる。Ｂ７−４が副刺激レセプターと結合する具体例において、Ｂ７−４活性の増加調節の結果、免疫反応が増加調節され、一方、Ｂ７−４活性の減少調節の結果、免疫反応が減少調節される。Ｂ７−４が阻害レセプターと結合する具体例において、Ｂ７−４活性の増加調節の結果、免疫反応が減少調節され、一方、Ｂ７−４活性の減少調節の結果、免疫反応が増加調節される。好ましい具体例において、Ｂ７−４は阻害レセプターと結合する。特に好ましい具体例において、Ｂ７−４はＰＤ−１と結合する。
【０１６４】
本発明の調節法は、細胞をＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドのモジュレーター、たとえばＢ７−４および／またはＰＤ−１の発現または活性を調節する薬剤、またはＢ７−４とＰＤ−１の相互作用を調節する薬剤と接触させることを含む。
【０１６５】
Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質活性を調節する薬剤は、本明細書において記載される薬剤、たとえば、核酸またはタンパク質分子、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の天然に存在する標的分子（たとえば、Ｂ７−４の場合はＰＤ−１またはＰＤ−１の場合はＢ７−４）、Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体、Ｂ７−４またはＰＤ−１作用物質または拮抗物質、Ｂ７−４またはＰＤ−１作用物質またはＰＤ−１拮抗物質のペプチド模倣物、または他の小分子である。
【０１６６】
Ｂ７−４またはＰＤ−１の発現を調節する薬剤は、たとえば、アンチセンス核酸分子、三本鎖オリゴヌクレオチド、リボザイムあるいはＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の発現の組み換えベクターである。たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチド翻訳開始部位の周りの領域に対して相補性のオリゴヌクレオチドを合成し、使用できる。１以上のアンチセンスオリゴヌクレオチドを細胞培地に、典型的には２００μｇ／ｍｌで添加できるか、またはＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの合成を防止するために患者に投与できる。別法として、ＤＮＡの巻き戻しおよび転写を防止するために二本鎖ＤＮＡと結合して三本鎖構造を形成するオリゴヌクレオチドを使用できる。いずれかの結果として、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの合成のいずれかがブロックされる。ＰＤ−１発現が調節される場合、好ましくは、このような調節はＰＤ−１遺伝子のノックアウト以外の手段により行う。
【０１６７】
発現を調節する薬剤は、これらが細胞におけるＰＤ−１またはＢ７−４の量を調節するという事実に基づき、細胞におけるＰＤ−１またはＢ７−４活性の合計量も調節する。
一具体例において、Ｂ７−４の阻害活性またはＰＤ−１の阻害活性を刺激する薬剤は、Ｂ７−４またはＰＤ−１の作用物質である。かかる薬剤の例は、活性Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質および細胞中に導入されたＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドをエンコードする発現可能な核酸分子を包含する。もう一つの具体例において、薬剤はＢ７−４の副刺激または阻害活性あるいはＰＤ−１の阻害活性を阻害し、ＰＤ−１のリガンドまたはＰＤ−１の拮抗物質である。かかる薬剤の例は、アンチセンスＢ７−４またはＰＤ−１核酸分子、抗Ｂ７−４または抗ＰＤ−１抗体（たとえば、非活性化抗体）、Ｂ７−４またはＰＤ−１分子の可溶性、非活性化形態、およびＢ７−４またはＰＤ−１阻害剤を包含する。
【０１６８】
調節剤は、インビトロ（たとえば、細胞を薬剤と接触させることによる）、あるいはインビボ（たとえば、薬剤を対象に投与することによる）で投与することができる。従って、本発明は、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の調節から利益を得る疾患または障害、たとえば、免疫反応の減少調節から利益を得るか、またはＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質または核酸分子の異常な発現または活性により特徴づけられる障害に苦しんでいる個体を治療する方法を提供する。一具体例において、方法は、薬剤（たとえば、本明細書に記載するスクリーニングアッセイにより同定される薬剤）、またはＢ７−４またはＰＤ−１発現または活性を調節する（たとえば、増加調節または減少調節する）薬剤の組み合わせを投与することを含む。もう一つの具体例において、方法は、減少しているかまたは異常なＢ７−４またはＰＤ−１発現または活性を埋め合わせる治療法として、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質または核酸分子を投与することを含む。
【０１６９】
Ｂ７−４またはＰＤ−１活性の刺激は、Ｂ７−４またはＰＤ−１が異常に減少調節される状況および／または増加したＢ７−４またはＰＤ−１活性が有益な効果を有する可能性がある状況において望ましい。同様に、Ｂ７−４またはＰＤ−１活性の阻害は、Ｂ７−４またはＰＤ−１が異常に増加調節される状況および／または減少したＢ７−４またはＰＤ−１活性が有益な効果を有する可能性がある状況において望ましい。当業者は、Ｂ７−４が副刺激レセプターと結合する例において、Ｂ７−４の副刺激およびＰＤ−１の副刺激は、免疫細胞副刺激、したがって免疫反応に関して反対の効果を有することを認識するであろう。このような場合において、一つの分子の活性の副刺激が望ましい場合、他の分子の活性の抑制が望ましい。
【０１７０】
Ｂ７−４を減少調節するために用いられる薬剤（Ｂ７−４拮抗物質）の例は、（たとえば）：アンチセンス分子、Ｂ７−４を認識する抗体、Ｂ７−４と免疫細胞上のその天然に存在するレセプターの一つとの相互作用をブロックする化合物（たとえば、可溶性、一価Ｂ７−４、および本明細書において記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定されるＢ７−４または化合物の溶解形態）を包含する。ＰＤ−１を減少調節するために用いられる薬剤（ＰＤ−１拮抗物質）歯（たとえば）：アンチセンス分子、ＰＤ−１と結合するが、免疫細胞に阻害シグナルを形質導入しない抗体（「非活性化抗体」）、およびＰＤ−１の溶解形態を包含する。
【０１７１】
Ｂ７−４を増加調節するために用いられる薬剤（Ｂ７−４作用物質）の例は、（たとえば）：Ｂ７−４ポリペプチドをエンコードする核酸分子、Ｂ７−４の多価分子、Ｂ７−４の発現を増大させる化合物、およびＢ７−４を発現する細胞などを包含する。ＰＤ−１を増加調節するために用いられる薬剤（ＰＤ−１作用物質）の例は、（たとえば）：ＰＤ−１分子と結合し、活性化させる（たとえば架橋させる）ことにより、ＰＤ−１を介して阻害シグナルを伝達する抗体、ＰＤ−１の発現を向上させる化合物、ＰＤ−１をエンコードする核酸分子、およびＰＤ−１を介してシグナルを変換するＢ７−４の形態（特にＢ７−４の二価形態）を包含する。
【０１７２】
３．Ｂ７−４またはＰＤ−１の調節による免疫反応のダウンレギュレーション
Ｂ７−４ポリペプチドの阻害機能を増加調節するか、または副刺激機能を減少調節して、免疫反応を減少調節する本発明の多くの具体例がある。減少調節は、すでに進行中の免疫反応の阻害またはブロックの形態であるか、または免疫反応の誘発の防止を含み得る。
活性化された免疫細胞の機能は、免疫細胞反応の減少調節によるか、または免疫細胞における特異的アネルギーの誘発によるか、またはその両方により阻害できる。
【０１７３】
例えば、抗Ｂ７−４抗体またはＢ７−４ポリペプチド（例えば、Ｂ７−４ＩｇなどのＢ７−４ポリペプチドの可溶性モノマー形態）、および／またはＢ７−４と副刺激レセプターとの相互作用をブロックする抗Ｂ７−４抗体を、副刺激シグナルを阻害するため、従って免疫反応を減少調節するために用いることができる。
加えて、Ｂ７−４が阻害レセプターと結合する具体例において、阻害レセプターと結合し、これを活性化するＢ７−４の形態、例えば、細胞表面上の多価Ｂ７−４を、免疫反応を減少調節するために用いることができる。
【０１７４】
同様に、ＰＤ−１経路は、免疫反応を減少調節するために薬剤を使用することにより刺激できる。これは、Ｂ７−４と免疫細胞上の刺激レセプターとの相互作用の阻害（例えば、ＰＤ−１および／またはＣＴＬＡ４の溶解形態の使用による）またはＰＤ−１の活性化（例えば、ＰＤ−１と架橋する活性化抗体の使用による）により達成され、免疫細胞に負のシグナルを提供する。
本発明の一具体例において、ＰＤ−１活性を刺激するために用いられる活性化抗体は二重特異性抗体である。例えば、かかる抗体はＰＤ−１結合部位と免疫細胞上、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、または脊髄細胞上の細胞表面レセプターを標的とするもう一つの結合部位を含み得る。一具体例において、かかる抗体は、ＰＤ−１結合部位を含むことに加えて、分子に特定の細胞集団を狙わせるために、活性化または阻害レセプター、例えば、Ｂ細胞レセプター、Ｔ細胞レセプター、またはＦｃレセプターに近接した分子と結合する結合部位をさらに含む。例えば、ＣＤ３抗原、Ｔ細胞レセプター鎖、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＴＬＡ−４、イムノグロブリン、Ｂ細胞レセプター、Ｉｇアルファ、Ｉｇベータ、ＣＤ２２、またはＦｃレセプターを用いることができる。かかる抗体（または他の二重特異性剤）は当該分野において承認され、例えば本明細書において記載されるようにして産生することができる。二重特異性抗体についてのこの第二抗体の選択により、阻害のために標的とされる細胞集団の選択に柔軟性がもたらされる。
【０１７５】
もう一つの具体例において、ＰＣ−１の細胞上の活性化または阻害レセプターの同時結紮は、ＰＤ−１による負のシグナルの生成を向上させることができる。このような同時結紮は、例えば、二重特異性剤、例えば、本明細書に記載する、ＰＤ−１とレセプターと関連する分子の両方について特異性を有する二重特異性抗体の使用により達成できる。もう一つの具体例において、ＰＤ−１による負のシグナルの伝達を向上させるために、ＰＤ−１により負のシグナルを伝達する薬剤の多価形態、例えばビーズ上または表面上に提示される薬剤を使用することができる。もう一つの具体例において、このような多価薬剤は、ＰＤ−１およびレセプターとレセプター関連分子（例えば、抗ＣＤ３およびＢ７−４を含むビーズ）の結紮を達成するために２つの特異性を含み得る。
【０１７６】
Ｂ７−４の副刺激レセプターとの相互作用をブロックまたは阻害する薬剤（例えば、Ｂ７−４の溶解形態またはＢ７−４に対するブロッキング抗体）ならびにＢ７−４による阻害シグナルを促進する薬剤またはＰＤ−１を活性化するＰＤ−１の作用物質（例えば、ＰＤ−１活性化抗体またはＰＤ−１活性化小分子）は、免疫細胞増殖および／またはエフェクター機能を阻害する能力またはインビトロアッセイに添加させる場合はアネルギーを誘発する能力により同定することができる。例えば、活性化レセプターによりシグナル変換を刺激する薬剤の存在下で細胞を培養することができる。細胞活性化の当該分野において承認された多くの情報を用いて、阻害、例えば、細胞増殖またはエフェクター機能（例えば、抗体産生、サイトカイン産生、食菌作用）を活性化剤の存在下で測定することができる。試験薬剤がこの活性化をブロックする能力は、該薬剤が測定される増殖またはエフェクター機能の減少に影響を及ぼす能力を測定することにより容易に決定できる。
【０１７７】
本発明の一具体例において、抗原をＰＤ−１作用物質と同時に投与することにより、特異性抗原に対して耐性が生じる。例えば、耐性は特定のタンパク質に対して生じ得る。一具体例において、免疫反応が望ましくないアレルゲンまたは外来タンパク質に対する免疫反応を阻害できる。例えば、ファクターＶＩＩＩを受ける患者は、しばしばこの凝固因子に対して抗体を生じる。Ｂ７−４による副刺激シグナルをブロックする薬剤またはＰＤ−１による阻害シグナルを刺激する薬剤を組み換えファクターＶＩＩＩとの組み合わせで（または物理的にファクターＶＩＩＩと結合させる、例えば架橋することにより）同時投与すると、結果として減少調節される。
【０１７８】
一具体例において、もう一つ別のＢリンパ球抗原の活性を有する第二ペプチドと融合したＢ７−４第一ペプチドを含む融合タンパク質（例えば、Ｂ７−１またはＢ７−２）を、免疫細胞上の副刺激レセプターとＢ７−４との相互作用をブロックし、免疫反応を減少調節するために用いることができる。別法として、２つの別々のペプチド（例えば、Ｂ７−４ポリペプチドとＢ７−２および／またはＢ７−１）、またはブロッキング抗体の組み合わせ（例えば、Ｂ７−４ポリペプチドに対する抗体と抗Ｂ７−２および／または抗Ｂ７−１モノクローナル抗体）を単一の組成物として組み合わせるか、または別々に（同時または連続して）投与して、対象における免疫細胞性免疫反応を減少調節することができる。さらに、治療的に活性な量の１以上の、Ｂ７−４ポリペプチド活性と、Ｂ７−１および／またはＢ７−２活性を有するペプチドを、他の減少調節試薬と併せて使用して、免疫反応に影響を及ぼすことができる。他の免疫調節剤の例は、副刺激シグナルをブロックする抗体（例えば、ＣＤ２８、ＩＣＯＳに対する抗体）、ＣＴＬＡ４により阻害シグナルを活性化する抗体、および／または他の免疫細胞マーカーに対する抗体（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ４０リガンド、またはサイトカインに対する抗体）、免疫抑制剤（例えば、ラパマイシン、シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６）を包含する。
【０１７９】
Ｂ７−４および／またはＰＤ−１ペプチドは、細胞の破壊により免疫細胞機能をブロックする治療薬の構成においても有用である。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの部分をトキシンと結合させて、これが結合している細胞の破壊を引き起こすことができる細胞毒性剤を調製することができる。
細胞毒性剤を調製するために、本発明のポリペプチドを、当該分野で公知の技術を用いて、例えば、架橋または組み換えＤＮＡ技術により、トキシンと結合、または操作可能に結合させることができる。イムノトキシンの調製は、一般に当該分野において周知である（例えば、米国特許第４３４０５３５号およびＥＰ４４１６７（両方とも出典明示により本発明の一部とする）参照）。トキシン部分をポリペプチドと結合させるためにうまく使用できる多くの種類のジスルフィド結合含有リンカーが公知である。一具体例において、立体的に「込み合った」ジスルフィド結合を含むリンカーは、インビボで安定性が高く、従って作用部位で結合の前にトキシン部分の放出を防止するので好ましい。
【０１８０】
本発明のポリペプチドまたは抗体を結合できる広範囲に及ぶトキシンが公知である。例は：多くの有用な植物、真菌または細菌由来のトキシンを包含し、これらは例として、さまざまなＡ鎖トキシン、特にリシンＡ鎖、リボソーム不活性化タンパク質、例えばサポリンまたはゲロニン、アルファ−サルシン、アスペルギリン、レストリクトシン、リボヌクレアーゼ、例えば胎盤リボヌクレアーゼ、血管由来、ジフテリア毒素、およびシュードモナスエクソトキシンを包含する。本発明に関連して使用される好ましいトキシン部分は、炭水化物残基、デグリコシル化Ａ鎖を修飾または除去するために処理されたトキシンＡ鎖である（米国特許第５７７６４２７号）。
かかる細胞毒性剤の１つまたは組み合わせ（例えば、Ｂ７−４リシン（単独またはＢ７−２リシンまたはＢ７−１−リシンとの組み合わせ）を患者に注入すると、特にさらに多量のＢ７−４を発現する活性化免疫細胞はリガンド形成するという事実を考慮すると、免疫細胞が死ぬ。例えば、ＰＤ−１は活性化されたリンパ球の表面上で誘発されるので、Ｆｃ−Ｒ依存性メカニズムまたは細胞毒性剤（例えば、リシン、サポリン、またはカリヘアミシン）を抗体と結合させることにより、これらの特異性細胞の減少を目的とするためにＰＤ−１に対する抗体を使用できる。一具体例において、抗体トキシンは二重特異性抗体であり得る。かかる二重特異性抗体は、たとえばある種類の細胞、例えばＴＣＲ、ＢＣＲ、またはＦｃＲ分子上のみで見いだされるマーカーを用いて、特定の細胞集団を標的とするために有用である。
【０１８１】
Ｂ７−４ポリペプチド副刺激機能の減少調節または防止あるいはＢ７−４またはＰＤ−１阻害機能の活性化（例えば、ＰＤ−１の負のシグナリング機能の刺激による）は、例えば、組織、皮膚または臓器移植、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、または自己免疫疾患、例えば全身性エリテマトーデス、および多発性硬化症などの免疫反応の減少調節において有用である。例えば、免疫細胞機能をブロックすると、組織移植において組織の破壊が軽減される。典型的には、組織移植において、移植片の拒絶は、免疫細胞により異物として認識されることにより開始され、続いて移植片を破壊する免疫反応が起こる。Ｂ７分子の免疫細胞上の副刺激レセプターとの相互作用を阻害またはブロックする分子（例えば、ＰＤ−リガンドまたはＰＤ−１ポリペプチドの可溶性モノマー形態）を、別の減少調節剤とともに、または組み合わせて、移植前または移植時に投与すると、副刺激シグナルの生成を阻害することができる。さらに、Ｂ７−４副刺激シグナルの阻害、またはＢ７−４またはＰＤ−１阻害シグナルの促進は、免疫細胞のアネルギー化に十分であり、したがって対象において寛容性を誘発する。Ｂ７−４による副刺激シグナルのブロックによる長期寛容性の誘発は、これらのブロッキング剤を繰り返し投与する必要性を回避する。
【０１８２】
対象において十分な免疫抑制または寛容性を達成するために、他の分子の副刺激機能をブロックすることも望ましい。例えば、これらの抗原またはこれらの抗原に対するブロッキング抗体のそれぞれの活性を有するペプチドの組み合わせの溶解形態（別々に、または単一組成物において一緒に）を移植前または移植時に投与することにより、Ｂ７−１およびＢ７−４、Ｂ７−２およびＢ７−４、またはＢ７−１およびＢ７−２およびＢ７−４の機能をブロックすることが望ましい。別法として、Ｂ７−４またはＰＤ−１の阻害活性を促進し、Ｂ７−１および／またはＢ７−２の副刺激活性を阻害することが望ましい。本発明の減少調節剤と組み合わせて使用できる他の減少調節剤は、例えば、ＣＴＬＡ４により阻害シグナルを伝達する薬剤、ＣＴＬＡ４の溶解形態、ＣＴＬＡ４により阻害シグナルを活性化する抗体、他の免疫細胞マーカーまたは他のレセプターリガンド対の溶解形態に対するブロッキング抗体（例えば、ＣＤ４０とＣＤ４０リガンド間の相互作用を破壊する薬剤（例えば、抗ＣＤ４０リガンド抗体））、サイトカインに対する抗体、または免疫抑制剤を包含する。もう一つの具体例において、最適のブロッキング活性を達成するために少なくとも２つの異なるＢ７−４抗体の組み合わせを投与することができる。
【０１８３】
Ｂ７−４ポリペプチド副刺激のブロッキングまたはＢ７−４またはＰＤ−１阻害機能の活性化も自己免疫疾患の治療において有用である。多くの自己免疫傷害は、自己の組織に対して反応性であり、サイトカインおよび疾患の病理に関与する自己抗体の産生を促進する免疫細胞の不適切な活性化の結果である。自己反応性免疫細胞の活性化の防止または減少調節は、症状を軽減または除去する。Ｂ７分子と副刺激レセプターのレセプター：リガンド相互作用を破壊することにより免疫細胞の副刺激をブロックする試薬の投与は、免疫細胞活性化の阻害および疾患のプロセスに関与する抗体またはサイトカインの産生の防止に有用である。加えて、Ｂ７−４またはＰＤ−１の阻害機能を促進する薬剤は、疾患からの長期的症状の軽減につながり得る自己反応性免疫細胞の抗原特異性寛容性を誘発できる。試薬の自己免疫疾患の防止または緩和における効力は、多くのヒト自己免疫疾患のよく特徴づけられた動物モデルを用いて決定できる。例は、ネズミ実験的自己免疫日本脳炎、ＭＲＬ／／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスまたはＮＺＢハイブリッドマウスにおける全身性エリテマトーデス、ネズミ自己免疫コラーゲン関節炎、ＮＯＤマウスおよびＢＢラットにおける真性糖尿病、およびネズミ実験的重症性筋無力症を包含する（例えば、Ｐａｕｌ編、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９，ｐｐ８４０−８５６参照）。
【０１８４】
免疫細胞活性化の阻害は、例えばＩｇＥ産生の阻害によるアレルギーおよびアレルギー反応の治療において治療的に有用である。Ｂ７−４またはＰＤ−１阻害機能を促進する薬剤は、患者における免疫細胞によるアレルギー反応を阻害するためにアレルギーの患者に投与することができる。ＰＤ−１分子の活性化はアレルギーの治療においても有用である。免疫細胞のＢ７−４副刺激の阻害あるいはＢ７−４またはＰＤ−１阻害経路の刺激は、適当なＭＨＣ分子と組み合わせたアレルゲンへの暴露を伴う。アレルギー反応は、アレルギーの侵入経路および肥満細胞または好塩基球上のＩｇＥの沈着パターンによって、全身性または局所性である。従って、免疫細胞によるアレルギー反応は、Ｂ７−４の副刺激レセプターあるいはＢ７−４またはＰＤ−１の阻害機能を促進する薬剤との相互作用を阻害する薬剤の阻害形態の投与（例えば、それぞれ、局所または全身性のいずれか）することにより、局所性であるか、全身性である。
【０１８５】
Ｂ７−４副刺激活性のブロックまたはＰＤ−１阻害活性の刺激による免疫細胞活性化の阻害は、免疫細胞のウイルス感染においても治療的に重要である。例えば、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）において、ウイルス複製は免疫細胞活性化により刺激される。Ｂ７−４／副刺激レセプター相互作用またはＢ７−４またはＰＤ−１阻害機能の刺激のブロックの結果、ウイルス複製が阻害され、ＡＩＤＳの進行が改善される。Ｂ７−４活性またはＢ７−４のその天然の結合パートナー、例えばＰＤ−１との相互作用の刺激による免疫反応の減少調節は、通常、妊娠の持続を促進するのにも有用である。Ｂ７−４は、母親と胎児の間の接合部分を形成し、胎児の母性拒絶の防止において役割を果たすと考えられる細胞の層である胎盤栄養膜において高度に発現される。自然流産の危険のある女性（例えば、「予防分析」の項に記載されているように、Ｂ７−４活性についてのスクリーニングにより確認される女性、以前に自然流産したことがある女性または妊娠が困難である女性）は、胚または胎児の免疫学的拒絶のためにＢ７−４またはその天然の結合パートナー、例えばＰＤ−１との相互作用を刺激する薬剤で処理することができる。
【０１８６】
Ｂ７−４活性またはＢ７−４のその天然の結合パートナー、例えばＰＤ−１との相互作用の刺激による免疫反応の減少調節は、自家組織の自己免疫攻撃の治療においても有用である。例えば、Ｂ７−４は通常心臓において高度に発現され、心臓を自己免疫攻撃から防御する。これは、Ｂａｌｂ／ｃＰＤ−１ノックアウトマウスが、血栓症の心臓に対して重い自己免疫攻撃を示すという事実により明らかにされる。従って、自己免疫攻撃により引き起こされるかまたは悪化する状態（例えば、この例においては、心臓病、心筋梗塞またはアテローム性動脈硬化症）は、Ｂ７−４活性またはＢ７−４のその天然の結合パートナー、例えばＰＤ−１との結合を増大させることにより緩和または改善される。従って、Ｂ７−４活性またはＢ７−４のＢ７−４との相互作用を刺激することにより、自己免疫攻撃により悪化する状態、例えば自己免疫傷害（ならびに心臓病、心筋梗塞、およびアテローム性動脈硬化症）を調節することは本発明の範囲内である。
【０１８７】
４．免疫反応のアップレギュレーション
免疫反応をアップレギュレーションする手段としての、Ｂ７−４副刺激活性のアップレギュレーションまたはＰＤ−１またはＢ７−４の抑制性の活性の阻害も治療に有用である。免疫反応のアップレギュレーションは、既存の免疫反応を高めるか、または初期免疫反応を誘発することの形態をとることができる。例えば、Ｂ７−４副刺激活性を刺激することまたはＢ７−４またはＰＤ−１抑制性活性の阻害により免疫反応を高めることは、微生物、例えば、細菌、ウイルス、または寄生虫などでの感染の場合に有用である。例えば、１つの具体例において、免疫細胞において副刺激シグナルを促進するＢ７−４の形態（例えば、多価形態のＢ７−４ペプチド（例えば、溶解性の多価形態または細胞表面で発現される形態））、または抑制性レセプターとのＢ７−４の相互作用を阻害する試薬、またはＰＤ−１を経る抑制性シグナルの伝達を阻害する試薬、例えばＰＤ−１に対する非活性化抗体または小分子（例えば、ペプチドミメティクス）ＰＤ−１アンタゴニストは、微生物のより迅速または完全なクリアランスに至る抗体および細胞媒介性の反応のアップレギュレーションが有用である状況において治療的に有用である。これらの刺激には、制限されるものではなく、帯状疱疹などのウイルス性皮膚疾患、この場合、そのような試薬は皮膚へ局所送達されてよい、が含まれる。加えて、インフルエンザ、一般感冒、および脳炎などの全身性ウイルス疾患は、そのような試薬の全身投与により緩和され得る。
【０１８８】
所定の例において、免疫反応をアップレギュレートする他の試薬、例えば、免疫反応をさらに高めるように副刺激レセプターを経てシグナルを伝達する他のＢ７ファミリーのメンバーの形態をさらに投与することが望まれ得る。
【０１８９】
別法として、免疫反応は、エキソビボアプローチ、例えば、免疫細胞を患者から取りだし、免疫細胞をインビトロで免疫細胞における副刺激シグナルを促進するＢ７−４の形態または抑制性レセプターとＢ７−４の相互作用を阻害する試薬、またはＰＤ−１を経る抑制性シグナルの伝達を阻害する試薬と接触させ、次いでインビとロ刺激免疫細胞を患者へ再度導入することにより、感染した患者において高めることができる。他の具体例においては、免疫反応を高める方法には、患者からの感染細胞（例えばウイルス感染細胞）を単離すること、それらを細胞がＢ７−４分子の全部または部分をその表面上に発現するように、副刺激レセプターに結合するＢ７−４の形態をコードしている核酸分子でトランスフェクトすること、およびトランスフェクトした細胞を患者へ再度導入することが含まれる。トランスフェクトされた細胞は、副刺激シグナルを免疫細胞へと送達することができ、そしてそれにより、免疫細胞をインビボで活性化することができる。
【０１９０】
免疫細胞において副刺激シグナルを促進するＢ７−４形態、またはＢ７−４の抑制性レセプターとの相互作用を阻害する試薬、またはＰＤ−１を経る抑制性シグナルの伝達を阻害する試薬を種々のポリペプチド、例えば病原体由来のポリペプチドに対するワクチンにて予防的に用いることができる。病原体（例えば、ウイルスまたは細菌）に対する免疫性を、適当なアジュバント中の免疫細胞において副刺激シグナルを促進するＢ７−４形態または抑制性レセプターとのＢ７−４の相互作用を阻害する試薬、またはＰＤ−１を経る抑制性シグナルの伝達を阻害する試薬と共に病原体のタンパク質でワクチン予防接種することにより誘導することができる。別法として、病原抗原および副刺激レセプターに結合するＢ７−４形態の両方をコードする遺伝子を含んでいるベクターを、ワクチン予防接種のために用いることができる。核酸ワクチンは、種々の手段、例えば、注入（例えば、ＤＮＡ−コート金粒子の、粒子を皮膚へ注入するための粒子加速器または圧縮ガスを用いる遺伝子銃での表皮への、筋肉内、経皮、またはバイオリスティック注入）により投与されることができる(Haynes et al. (1996) J. Biotechnol. 44:37))。別法として、核酸ワクチンは、非侵入性の手段により投与することができる。例えば、純粋もしくは脂質調製したＤＮＡを、例えば、ＤＮＡの経口送達によるペイヤーパッチ(Peyers patches)など、呼吸器系へと到達することができ、またはいずれかの場所へ標的することができる(Schubbert (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:961)。弱毒化された微生物を粘膜表面への送達のために用いることができる(Sizemore et al. (1995) Science 270:29)。
【０１９１】
１つの具体例において、副刺激シグナルを伝達するＢ７−４ポリペプチド形態を、例えば、Ｂ７−４ポリペプチドおよびＭＨＣクラスＩαタンパク質およびβ２ミクログルブリンを同時発現してＴ細胞を活性化し、感染からの免疫化を提供するべくトランスフェクトした細胞によりクラスＩ ＭＨＣタンパク質と共に投与することができる。ワクチンが有用である病原体には、制限されるものではないが、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、エプスタイン−バー−ウイルス、サイトメガロウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、結核、マラリア、および住血吸虫が含まれる。
【０１９２】
他の適用においては、Ｂ７−４副刺激機能のアップレギュレーションまたは増強が、腫瘍の免疫化の誘導に有用である。腫瘍細胞における野生型のＢ７−４の内因性の発現により、腫瘍細胞に対する免疫反応が抑制される。従って、腫瘍細胞におけるＢ７−４とＰＤ−１の間の相互作用の阻害が腫瘍の免疫を誘導するのに有用である。１つの具体例においては、ＰＤ−１アンタゴニスト（例えば、ＰＤ−１またはＢ７−４に対する非−活性化抗体または小分子ＰＤ−１またはＢ７−４アンタゴニスト）を腫瘍を有するまたはそれに対してリスクのある対象へと投与する。
【０１９３】
他の具体例においては、Ｂ７−４抗原をコードしている核酸分子でトランスフェクトした腫瘍細胞（例えば、肉腫、黒色腫、リンパ腫、白血病、神経芽腫、癌）を対象に投与して、対象における腫瘍特異的耐性を克服する。所望の場合、腫瘍細胞をトランスフェクトして、Ｂ７ポリペプチドの組み合わせ（例えばＢ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−４いずれかの組み合わせ）を発現させることができる。例えば、対象から得た腫瘍細胞をエキソビボで、Ｂ７−４ポリペプチドのみ、またはＢ７−１活性および／またはＢ７−２活性を有するペプチドとの組み合わせの発現を指向する発現ベクターでトランスフェクトすることができる。トランスフェクトされた腫瘍細胞を対象へ戻し、トランスフェクト細胞の表面上でのペプチドの発現を得る。別法として、遺伝子治療法を用いて、インビボでのトランスフェクションのために腫瘍細胞を標的することができる。
【０１９４】
加えて、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子を欠く、またはＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子の十分量を発現しない腫瘍細胞を、ＭＨＣクラスＩα鎖タンパク質およびβ２ミクログルブリンタンパク質またはＭＨＣクラスＩＩαタンパク質およびＭＨＣクラスＩＩβ鎖タンパク質の全部または部分（例えば、細胞質ドメイン切断部位）をコードしている核酸でトランスフェクトし、それにより細胞表面上でＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩタンパク質を発現させることができる。Ｂリンパ球抗原の活性を有するペプチド（例えば、Ｂ７−１、および/またはＢ７−２、および／またはＢ７−４）と組み合わせた適当なクラスＩまたはクラスＩＩＭＨＣの発現により、トランスフェクトした腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介性の免疫反応が誘導される。任意に、ＭＨＣクラスＩＩ関連タンパク質、不変鎖などの発現を遮断するアンチセンス構築物をコードしている遺伝子を、Ｂ７−４ポリペプチドをコードしているＤＮＡと同時トランスフェクトして、腫瘍関連抗原の提示を促進し、腫瘍特異的免疫を誘導することもできる（例えば、本明細書中にその内容を出典明治により組み込む米国特許第５，９１９，６３９号に教示されているように）。Ｂ７ネガティブネズミ腫瘍細胞によるＢ７−１の発現は、腫瘍の拒絶が付随するＴ細胞媒介性の特異的免疫およびおよびマウスにおいて腫瘍攻撃に対する長期保護を誘導することが示されている(Chen, L., et al. (1992) Cell 71:1093-1102; Townsend, S. E. and Allison, J. P. (1993) Science 259:368-370; Baskar, S. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5687-5690)。つまり、ヒト対象における免疫細胞媒介性の免疫反応の誘導が、対象における腫瘍特異的耐性を克服するのに十分であり得る。
【０１９５】
他の具体例において免疫反応は、Ｂ７−４に結合する副刺激レセプターを経るシグナル伝達により、またはＢ７−４に結合する抑制性レセプター、例えばＰＤ−１を経るシグナリングを阻害することにより刺激されて、先在している耐性を克服することができる。例えば、対象が有意な免疫反応を高めることができない抗原、例えば、腫瘍特異的抗原などの自己抗原に対する免疫反応は、ＰＤ−１の抑制性の活性または抑制性のリガンドに結合するＢ７−４の能力を阻害する試薬を投与することにより、誘導することができる。例えば、１つの具体例において、溶解性ＰＤ−１または溶解性Ｂ７−４を用いて（例えば、ＰＤ−１ＦｃまたはＢ７−４Ｆｃ）、例えば腫瘍細胞に対する免疫反応を高めることができる。１つの具体例では、自己抗原、腫瘍特異的抗原などを、ＰＤ−１の抑制性の活性またはＢ７−４の抑制性のリガンドに結合する能力を阻害する試薬と共に同時投与することができる。他の具体例において、免疫反応を抗原（例えば自己抗原）に対して刺激して、神経疾患を治療することができる。他の具体例では、ＰＤ−１アンタゴニストをアジュバントとして用いて、活性免疫化のプロセスにおいて外来抗原への反応をブーストすることができる。
【０１９６】
さらに他の具体例においては、抑制性のレセプターに結合するまたは副刺激レセプターに対するＢ７−４の結合と競合するＢ７−４形態（例えば、ＰＤ−１へ結合するＢ７−４形態または天然に生じる溶解性分子）の細胞における産生は、例えば、免疫反応をアップレギュレートするために、アンチセンスＲＮＡを用いて阻害することができる。例えば、１具体例において、腫瘍細胞による抑制性Ｂ７−４分子の産生を、抗腫瘍免疫を増すために阻害することができる。
【０１９７】
１つの具体例では、免疫細胞を対象から得、エキソビボで、副刺激分子を結合するＢ７−４形態の存在下、またはＢ７−４またはＰＤ−１抑制性シグナルを阻害する試薬の存在下培養して、免疫細胞集団を増殖させる。さらなる具体例において、免疫細胞を次いで対象へ投与する。例えば免疫細胞へ一次活性化シグナルおよび副刺激シグナルを当該分野で公知のごとく提供することにより、免疫細胞を刺激して、インビトロで増殖させることができる。Ｂ７−４タンパク質の種々の形態または副刺激レセプターに結合するまたはＰＤ−１を経るシグナリングを阻害する試薬を用いて、免疫細胞の増殖を副刺激することもできる。１つの具体例においては、免疫細胞をＰＣＴ出願第ＷＯ９４／２９４３６号に記載の方法に従いエキソビボで培養する。副刺激分子は溶解性であってよく、細胞膜結合へ結合する、またはビーズなどの固体表面へ結合することができる。
【０１９８】
Ｂ．Ｂ７−４および／またはＰＤ−１の調節により調節されるサイトカインの同定
本明細書に開示するＢ７−４およびＰＤ−１分子を用いて、Ｂ７−４および／またはＰＤ−１の活性の調節により産生される、またはそれに反応して免疫細胞においてその産生が高められるまたは阻害されるサイトカインを同定することができる。ＰＤ−１を発現している免疫細胞は、インビトロで、一次活性化シグナルで最適下限刺激することができ、例えば、Ｔ細胞は、ホルボールエステル、抗−ＣＤ３抗体または好ましくは抗原で、ＭＨＣクラスＩＩ分子と組み合わせて刺激することができ、および副刺激シグナルの場合は、例えばＢ７ファミリー抗原の刺激形態により、例えばＢ７ポリペプチドをコードしている核酸でトランスフェクトした、およびその表面上にペプチドを発現している細胞により、またはペプチドの溶解性刺激形態により刺激することができる。培地に放出される公知のサイトカインは、ＥＬＩＳＡにより、またはサイトカインを遮断して免疫細胞増殖またはサイトカインにより誘導される他の細胞タイプの増殖を阻害する抗体の能力により同定することができる。例えば、ＩＬ−４ＥＬＩＳＡキットが、ＩＬ−７ブロッキング抗体同様、Genzyme(Cambridge MA)から入手可能である。ＩＬ−９およびＩＬ−１２に対するブロッキング抗体は、Genetics Institute(Cambridge, MA)より入手可能である。サイトカイン側面にてＢ７−４のＰＤ−１との相互作用を刺激または遮断する効果を次いで決定することができる。
【０１９９】
前記のインビトロ免疫細胞副刺激アッセイを、Ｂ７−４および／またはＰＤ−１の調節により調節され得る新規サイトカインを同定するための方法において用いることもできる。例えば、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４経路の刺激がＩＬ−２の分泌を高めると考えられる場合、ＩＣＯＳ経路の刺激はＩＬ−１０の分泌を高めると考えられる(Hutloff et al. 199. Nature 397:263)。副刺激に際して誘導される特定の活性、例えば免疫細胞の増殖が公知のサイトカインへのブロッキング抗体の添加により阻害され得ない場合、活性は、未知のサイトカインの活性から生じている可能性がある。副刺激後に、このサイトカインを培地から常套法により精製し、その活性を、免疫細胞の増殖を誘導するその能力により測定することができる。
【０２００】
耐性の誘導において役割を果たし得るサイトカインを同定するために、前記のごとくインビトロＴ細胞副刺激アッセイを用いることができる。この場合、Ｔ細胞に一次活性化シグナルを与え、選択されたサイトカインと接触させるが、副刺激シグナルは与えない。免疫細胞を洗浄および停止後、細胞を一次活性化シグナルおよび副刺激シグナルの両方で再攻撃する。免疫細胞が反応しない（例えば、サイトカインを増殖または産生しない）場合、それらは耐性となっており、サイトカインは耐性の誘導を妨げてはいない。しかし、免疫細胞が反応する場合、耐性の誘導はサイトカインにより妨げられた。耐性の誘導を妨げることができるこれらのサイトカインを、Ｂリンパ球抗原を遮断する試薬と組み合わせて、移植片レシピエントまたは自己免疫疾患の対象において耐性を誘導するより効果的な手段として、インビボでの妨害のための標的とすることができる。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１抑制性活性を促進する試薬と共に、対象へ、サイトカインブロッキング抗体を投与することができる。
【０２０１】
Ｃ．Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの発現を調節する分子の同定
本発明のタンパク質およびペプチドを用いて産生される抗体を、細胞上でのＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの発現を調節する分子についてのスクリーニングアッセイにおいて使用できる。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの発現いおける変化に至る細胞内シグナリング経路を調節する分子は、細胞表面上での１以上のＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの発現を分析することにより同定できる。分子の存在下で適当な抗体により免疫蛍光染色が減少することは、分子が細胞内シグナルを阻害することを示す。Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチド発現を増加調節する分子は、免疫蛍光染色を増大させる。別法として、ポリペプチドの発現に対する分子の硬化は、本発明のプローブを用いて細胞ｍＲＮＡレベルを検出することにより決定できる。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドを発現する細胞を試験される分子と接触させ、標準的技術、例えばノザンハイブリダイゼーション分析または検出可能なマーカーで標識されたｃＤＮＡプローブを用いたｍＲＮＡまたはポリ（Ａ＋）ＲＮＡの慣例のドットブロットにより検出される細胞においてｍＲＮＡレベルを増大または減少させる。Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの発現を調節する分子は、単独あるいは前記のような可溶性ブロッキングまたは刺激剤とあわせて免疫応答を増加調節または減少調節するために治療的に有用である。例えば、Ｂ７−４の発現を阻害する分子は、第二の薬剤（例えば、免疫抑制剤）と共に投与することができる。例えば、免疫抑制剤またはＰＤ−１の発現を阻害する分子を免疫刺激物質（例えば、アジュバント）と共に投与できる。Ｂ７−４またはＰＤ−１を調節する能力について試験できる分子の例は、ＩＬ−４、γＩＮＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦおよびプロスタグランジンなどのサイトカインを包含する。
【０２０２】
Ｄ.スクリーニングアッセイ
本発明はモジュレーター、すなわち、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質と結合し、例えばＢ７−４またはＰＤ−１発現またはＢ７−４またはＰＤ−１活性に対して刺激または阻害硬化を有する候補または試験化合物または薬剤（例えば、ペプチド、ペプチド模倣物、小分子または他の医薬）を同定するための方法（本明細書において「スクリーニングアッセイ」とも称する）を提供する。
【０２０３】
Ｂ７−４またはＰＤ−１の活性を調節する化合物を同定するための１つのそのようなアッセイは、細胞に基づくアッセイである。アッセイの１つの具体例において、ＰＤ−１を発現している細胞を試験化合物と接触させる。細胞をさらにＰＤ−１のアクチベーター（例えば溶解形態の、または細胞上で発現されるＢ７−４）と接触させ、次いでＰＤ−１の活性をアッセイする。試験化合物の不在下での細胞のＰＤ−１の活性と比較した、試験化合物の存在下での細胞のＰＤ−１の増加または低下した活性が、化合物がＰＤ−１の活性を調節し、即ち、ＰＤ−１のシグナリングを調節することを示す。同様のアッセイを、Ｂ７−４活性のモジュレーターを同定するために行うことができる。例えば、Ｂ７−４の活性化形態（溶解形態または細胞上で発現された形態）を、Ｂ７−４が結合するおよびＢ７−４により活性化されることが知られているレセプターを発現している細胞に、試験化合物の存在下および不在下に添加して、Ｂ７−４の活性を次いでアッセイして、試験化合物が調節活性を有するかどうかを決定することができる。
【０２０４】
一具体例において、本発明は、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質またはポリペプチドまたはその生物学的に活性なタンパク質と結合するか、またはその活性を調節する候補または試験化合物、例えばＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドのその同源結合パートナーまたは相互作用分子と相互作用する能力を調節するものをスクリーニングするための分析法を提供する。
【０２０５】
本発明の試験化合物は、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相または溶液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「１ビーズ１−化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法を含む当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法において多くのアプローチを用いて得ることができる。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーまたは化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。
分子ライブラリーの合成法の例は、例えば：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：１３１３；Ｃａｒｒｅｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ，Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２６０１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３において見いだすことができる。
【０２０６】
化合物のライブラリーは、溶液中（例えば、Ｈｏｕｇｔｈｅｎ（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１３：４１２−４２１）、またはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ３５４：８２−８４）、チップ（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ３６４：５５５−５５６）細菌（Ｌａｎｄｅｒ米国特許第５２２３４０９号）、胞子（Ｌａｎｄｅｒ米国特許第５２３３４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１８６５−１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｉｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：３８６−３９０）；（Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：４０４−４０６）；（Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：６３７８−６３８２）；（Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：３０１−３１０）：（Ｌａｎｄｅｒ前出）で提供できる。
【０２０７】
もう一つの具体例において、分析法は、Ｂ７−４標的分子（細胞内相互作用分子またはＰＤ−１レセプター）またはＰＤ−１標的分子（例えば、Ｂ７−４または細胞内相互作用分子）を発現する細胞を試験化合物と接触させ、該試験化合物がＢ７−４またはＰＤ−１標的分子の活性を調節（例えば、刺激または阻害）する能力を決定することを含む細胞ベースの分析法である。試験化合物がＢ７−４またはＰＤ−１標的分子の活性を調節する能力の決定は、例えば、標的分子と結合するかまたは相互作用する分子は活性をより調節しやすいので、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質がＢ７−４またはＰＤ−１標的分子と結合または相互作用する能力を決定することにより行うことができる。Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質がその結合パートナーと結合または相互作用する能力の決定は、例えば直接結合を測定することにより達成できる。
【０２０８】
直接結合分析において、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質（または他の各標的分子）を放射性同位元素または酵素標識と結合させて、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質とＢ７−４またはＰＤ−１標的分子との結合が複合体において標識されたタンパク質を検出することにより決定されるようにできる。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１分子、例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質を、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈで直接または間接的のいずれかで標識し、放射性同位元素を電波放射の直接計測またはシンチレーションカウンティングにより検出できる。別法として、Ｂ７−４またはＰＤ−１分子を酵素により、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、またはルシフェラーゼで標識し、酵素標識を適当な基質の生成物への変換率を定量することにより検出できる。
【０２０９】
化合物がＢ７−４またはＰＤ−１と標的分子間の相互作用を調節する能力を、相互作用体のいずれも標識することなく定量することも本発明の範囲に含まれる。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１のその標的分子との相互作用を、Ｂ７−４またはＰＤ−１または標的分子のいずれも標識せずに検出するために、ミクロフィジオメーターを使用できる（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ，Ｈ．Ｍ．ら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７：１９０６−１９１２）。本明細書において用いられる場合、「ミクロフィジオメーター」（例えば、Ｃｙｔｏｓｅｎｓｏｒ）とは、細胞がその環境を酸性化する速度を光アドレス可能な電位差センサー（ＬＡＰＳ）を用いて測定する分析装置である。この酸性化速度の変化を、化合物とレセプター間の相互作用のインジケーターとして用いることができる。好ましい具体例においては、Ｂ７−４またはＰＤ−１標的分子と結合または相互作用するＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の能力を測定することは、Ｂ７−４、ＰＤ−１、または適当な標的分子の活性を測定することにより行うことができる。例えば、Ｂ７−４、ＰＤ−１、または適当な標的分子の活性は、細胞の第２メッセンジャー（例えば、セリン／トレオニンまたはチロシンキナーゼ活性）の誘導または誘導の阻害を検出すること、適当な基質の触媒／酵素活性を検出すること、レポーター遺伝子（検出可能なマーカー、例えば、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードしている核酸に作用的に結合している標的反応性調節エレメントを含んでいる）の誘導を検出すること、またはＢ７−４、ＰＤ−１または適当な標的分子により調節される細胞反応を検出することにより、決定することができる。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の、Ｂ７−４またはＰＤ−１標的分子に結合するまたはそれらと相互作用する能力を測定することは、例えば、増殖アッセイにおける免疫細胞の副刺激または阻害を調節する化合物の能力を測定することにより、またはＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの部分を認識する抗体と結合する能力を妨害することにより行うことができる。
【０２１０】
他の例においては、（レセプターのライゲーションによる）ＰＤ−１の活性化により、ＳＨＰ−２分子のリン酸化を生じる。ＳＨＰ−２（Ｓｙｐ、ＳＨＰＴＰ２、ＰＴＰ２Ｃ、ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰ１Ｄ、およびＢＰＴＰ３としても知られる）は、非−膜チロシンホスファターゼのファミリーのメンバーである（Ｕ．Ｓ．特許第５，５８９，３７５号およびＵ．Ｓ．特許第５，８３１，００９号、その内容は本明細書中に出典明示により組み込まれる。）。それは試験した全組織において至るところで発現され、心臓および脳において最もレベルが高い(Ahmad et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 90: 2197-2201(1993); Bastien et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 124-133 (1993); Freeman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89: 11239-11243 (1992))。
【０２１１】
ＳＨＰタンパク質は、ホスホチロシル残基結合によるタンパク質−タンパク質相互作用を促進する、Ｓｒｃタンパク質チロシンキナーゼにおいて本来的に同定される約１００個のアミノ酸の保存された領域である２つのｓｒｃホモロジー２（ＳＨ２）ドメインを含む(Neel, Semin. Cell. Biol. 4: 419-432 (1993))。これら２つのドメインは、ＳＨＰ−２ホスファターゼの調節において異なる機能を示し、その結果異なるシグナリング経路に影響を及ぼすことが示されている。Ｎ−末端ＳＨドメインは、内部触媒ホスファターゼドメインとの分子間相互作用により自己阻害効果を生じる調節および補充ドメインとして作用する。一方、Ｃ末端ＳＨ２ドメインがシグナル伝達に必要な分子間相互作用のための他のタンパク質を補充するべく作用するにすぎない(Pei et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 1141-1145 (1996))。ＳＨＰ−２分子のリン酸化状態により、そのリン酸化活性が調節される。
【０２１２】
ＳＨ２−含有ホスファターゼを含むタンパク質−チロシンホスファターゼは、ヒトを含む哺乳動物などの多様な種から酵母およびツメガエル属に至る真核生物間で高度に保存されている。タンパク質−チロシンホスファターゼの変異および変化した発現が、腫瘍疾患および発生異常などの多くの病理学的症状に関連している(Tonks, N.K., et al., Cell 87:365-368 (1996); Neel, B. G., et al., Curr. Op. Cell Biol. 9:193-204 (1997); Li, J. et al., Science275: 1943-1947 (1997))。ＳＨＰ−２は、異常な免疫反応において重要な役割を果たすことが示されている(例えば、アレルギー反応において（Pazdrak et al., J. Exp. Med. 186: 561-568 (1997))。
【０２１３】
ＳＨＰ−２分子のリン酸化は、ＰＤ−１を経るシグナリングの指標である。ＳＨＰ−２のリン酸化は、制限するものでなく、ＰＡＧＥゲル上でのＳＨＰ−２分子の変化した移動の検出、リン酸化アッセイ、およびＳＨＰ−２分子の活性を測定するアッセイを含む当該分野で公知の方法により容易に検出され得る。ＳＨＰ−２のリン酸化の検出は直接的であってよく、または別法として、例えばダウンストリームの活性または現象の検出など、間接的であってもよい。
【０２１４】
他の実施例において、（レセプターのライゲーションによる）ＰＤ−１の活性化により、Ｔ細胞レセプターの活性化により誘導される、細胞外シグナル調節キナーゼ１および２（ＥＲＫ１および２）のリン酸化の阻害を生じる。ＥＲＫ１およびＥＲＫ２（ＭＡＰＫ１およびＭＡＰＫとしても知られる）はそれ自体がキナーゼである(Boulton, et al., Cell 65: 663-675, (1991))。ＥＲＫ分子の活性化は、セリン／トレオニンリン酸化またはチロシンリン酸化による。つまり、別に活性化されたＴ細胞におけるＰＤ−１シグナリングによるＥＲＫ１および２のリン酸化の阻害は、ＰＤ−１によるＥＲＫ１および２の活性化の阻害を示す。ＥＲＫ１および２の活性化の阻害は、ＥＲＫ１および２分子のアップストリームのリン酸化の阻害から生じ得、またはＥＲＫ１および２を脱リン酸化して活性を減じるホスファターゼの活性化から生じ得る。
【０２１５】
ＥＲＫタンパク質は、二重特異性キナーゼであるＭＥＫ分子によるリン酸化により活性化されることが公知である。活性化に際して、ＥＲＫ１およびＥＲＫ２は核へと移動し、そこで、ｃ−Ｍｙｃ、Ｃ／ＥＢＰβ、ｐ６２、ＴＣＦ／Ｅｌｋ−１、ＡＴＦ−２およびｃ−Ｊｕｎを含む種々の転写因子を直接リン酸化および活性化することができる。
【０２１６】
Ｔ細胞の活性化に際してのＥＲＫ１および２分子のリン酸化状態／活性化状態は、ＰＤ−１を経るシグナリングの指標である。ＥＲＫ１および２のリン酸化状態／活性化状態は、当該分野で容易に利用できるアッセイを用いて当業者により容易に決定され得る。例えば、ＥＲＫ１および２分子のリン酸化状態は、ｐ４２／４４ＥＲＫ１／２タンパク質のリン酸化形態に特異的な（ホスホ−Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４特異的）抗体、そのいくつかは市場入手可能である、を用いて決定することができる。別法として、ＥＲＫ１および２分子のリン酸化状態は、ゲルにおけるその移動により、リン酸化状態に関わらずＥＲＫ１および２を認識する抗体を同定のために用いて決定することができる。別法として、ＥＲＫ１および２の活性化状態は、ＥＲＫ１および２分子のキナーゼ活性をアッセイすることにより測定することができる。ＥＲＫ１および２のリン酸化／活性化状態の決定は、例えばダウンストリーム活性または現象の検出など、間接的な方法によってもよい。
【０２１７】
他の例においては、（レセプターのライゲーションによる）ＰＤ−１の活性化により、Ｔ細胞レセプターの活性化により誘導されるタンパク質キナーゼＣ−θ（ＰＫＣ−θ）分子のリン酸化の阻害を生じる。ＰＫＣイソ酵素は、多くの細胞シグナリング現象において重要な役割を果たす。（ＰＫＣ−θ、ＰＫＣＴ、ＰＲＫＣＴ、ｎＰＫＣ−θ、およびＰＲＫＣＱとしても知られる）ＰＫＣ−θは、セリン−トレオニンキナーゼのＰＫＣファミリーのカルシウム非依存性イソ形態である。新規セリン／トレオニンタンパク質キナーゼＣイソ形態（ｎＰＫＣ）の１つであるＰＫＣ−θは、組織において至るところで発現され、Ｔ−細胞および胸腺細胞を含む造血細胞系統において最高レベルで見出される(Baier et al., J. Biol. Chem. 268: 4997-5004 (1993); Keenan et al., Immunology 90: 557-563 (1997); Meller et al., Cell. Immunol. 193: 185-193 (1999); Wang et al., Biochem.Biophys. Res. Commun. 91: 240-246 (1993))。ネズミの胸腺細胞におけるＰＫＣ−θタンパク質の一過性の過剰発現により、インターロイキン−２−プロモーター駆動性構築物の転写の活性化を生じ(Baier et al., Eur. J. Biochem. 225: 195-203(1994))、Ｔ−細胞シグナリング経路におけるＰＫＣ−θの役割が示される。より最近では、ＰＫＣ−θは、Ｔ細胞レセプター媒介性のＴ細胞の活性化学の間に活性化学されることが示されており、この活性化はＰＫＣ−θ分子の血漿膜へのＡＰＣ接触部位における移動と関連する（Ｕ．Ｓ．特許第６，０４０，１５２号、その内容を出典明示により本明細書中に組み込む）。ＰＫＣ−θは、アポトーシス(Datta et al., J. Biol. Chem. 272: 20317-20320 (1997))、細胞骨格のアレンジメント(Pietromonaco et al., J. Biol. Chem. 273: 7594-7603 (1998) ; Simons et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 253: 561-565 (1998))、増殖(Passalacqua et al., Biochem. J. 337: 113-118 (1999))、および血管形成ならびに創傷治癒(Tang et al., J. Biol. Chem. 272: 28704-28711 (1997))を含む他の細胞プロセスにも関与している。
【０２１８】
Ｔ細胞の活性化に際してのＰＫＣ−θ分子のリン酸化／活性化状態は、ＰＤ−１を経るシグナリングの指標である。リン酸化状態は、ＰＫＣ−θ分子の活性化状態を反映し、リン酸化は活性化を示す。ＰＫＣ−θのリン酸化状態／活性化状態は、当該分野で容易に利用できるアッセイを用いて当業者により容易に測定され得る。例えば、ＰＫＣ−θ分子のリン酸化状態は、市場入手可能な、ＰＫＣ−θタンパク質のリン酸化形態に特異的な抗体（例えば、抗−ホスホＴ５３８）を用いて測定することができる。別法として、ＰＫＣ−θ分子のリン酸化状態は、ゲルにおけるその移動により、ＰＫＣ−θを（リン酸化状態に関わらず）認識する抗体を検出のために用いて、決定することができる。別法として、ＰＫＣ−θの活性化状態は、ＰＫＣ−θ分子のキナーゼ活性をアッセイすることにより(Kupfer et al., U.S. 特許No. 6,040,152号)、またはＡＰＣ接触点における膜への移動をアッセイすることにより(Kupfer et al., U.S. 特許No. 6,040,152号)決定することができる。ＰＫＣ−θリン酸化／活性化状態の測定は、ダウンストリーム活性または現象の検出など、間接的な方法によってもよい。
【０２１９】
さらに他の具体例では、本発明のアッセイは、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質またはその生物活性部分を試験化合物と接触させ、試験化合物がＰ７−４またはＰＤ−１タンパク質またはその生物活性部分に結合する能力を測定するセルフリーアッセイである。試験化合物のＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質への結合は、前記のごとく直接的または間接的のいずれかで決定することができる。好ましい具体例では、アッセイには、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質またはその生物活性部分を、Ｂ７−４またはＰＤ−１を結合してアッセイ混合物形成する公知の化合物と接触させること、アッセイ混合物を試験化合物と接触させること、および試験化合物がＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質と相互作用する能力を測定すること（ここで、試験化合物がＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質と相互作用する能力を測定することは、試験化合物が公知の化合物と比較して選択的にＢ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドまたはその生物活性部分と結合する能力を決定することを含む）が含まれる。
【０２２０】
他の具体例では、アッセイは、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質またはその生物活性部分を試験化合物と接触させ、試験化合物が、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質またはその生物活性部分の活性を調節する能力を決定するセルフリーのアッセイである。試験化合物がＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の活性を調節する能力を決定することは、例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質がＢ７−４またはＰＤ−１標的分子に結合する能力を、直接結合を決定するための前記方法の１つにより決定することにより行うことができる。Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質がその結合パートナーと結合する能力の決定は、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）などの技術を用いて達成できる（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５およびＳｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５）。本明細書において用いられる場合、「ＢＩＡ」は相互作用物質のいずれも標識せずにリアルタイムで生体特異性相互作用を研究する技術である（たとえば、ＢＩＡｃｏｒｅ）。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象における変化を、生物学的分子間のリアルタイムな反応の指標として用いることができる。
【０２２１】
さらにもう一つの具体例において、無細胞分析は、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質またはその生物学的に活性な部分を、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質と結合する公知化合物と接触させて分析混合物を形成し、分析混合物を試験化合物と接触させ、試験化合物がＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質のその結合パートナーとの相互作用を防止する能力を決定することを含む。たとえば、試験化合物がその結合部位でＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質と優先的に相互作用する能力またはＢ７−４またはＰＤ−１標的分子の活性を調節する能力を試験することができる。本発明の無細胞分析は、タンパク質（たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質またはその生物学的に活性な部分、またはＢ７−４またはＰＤ−１が結合する結合パートナー）の可溶性および／または膜結合形態の両方を使用する。膜結合形態のタンパク質が使用される無細胞分析の場合において（たとえば、細胞表面Ｂ７−４またはＰＤ−１レセプター）、膜結合形態のタンパク質が溶液中に維持されるように可溶化剤を利用することが望ましい。かかる可溶化剤の例は、非イオン性界面活性剤、たとえば、ｎ−オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルグルコシド、ｎ−ドデシルマルトシド、オクチル−Ｎ−メチルグルカミド、デカニル−Ｎ−メチルグルカミド、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ＴｒｉｔｏｎＸ−１１４、Ｔｈｅｓｉｔ、イソトリデシポリ（エチレングリコールエーテル）ｎ、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアミニオ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）、またはＮ−ドデシル＝Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アモニオ−１−プロパンスルホネートを包含する。
【０２２２】
本発明の前記分析法の１以上の具体例において、タンパク質の一方または両方の複合体を形成する形態または複合体を形成しない形態の分離を促進するため、ならびに分析の自動化に対応するために、Ｂ７−４またはＰＤ−１またはその適当な標的分子のいずれかを固定化することが望ましい。試験化合物ｍｐＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質との結合、またはＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の標的分子との候補化合物の存在下または不在下での相互作用は、反応物質を入れるのに適した任意の容器中有で行うことができる。このような容器の例は、マイクロタイタープレート、試験管、およびミクロ遠心管を包含する。一具体例において、タンパク質の一方または両方がマトリックスに結合するのを許容するドメインを加えた融合タンパク質を提供できる。たとえば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／Ｂ７−４またはＰＤ−１融合タンパク質またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ／標的融合タンパク質をグルタチオンセファロースビーズ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）またはグルタチオン誘導化マクロタイタープレート上に吸着させることができ、これを次に試験化合物、または試験化合物と未吸着標的タンパク質またはＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質のいずれかと合わせ、混合物を、複合体形成を誘導する条件下（たとえば、塩の生理学的条件およびｐＨ）でインキュベートする。インキュベーション後、前記のような結合していない成分、ビーズの場合は固定化されていないマトリックス、直接または間接的のいずれかで測定された複合体を除去するために、ビーズまたはマイクロタイタープレートウェルを洗浄する。別法として、複合体をマトリックスから解離させることができ、Ｂ７−４またはＰＤ−１の結合または活性のレベルを、標準的技術を用いて決定できる。
【０２２３】
タンパク質をマトリックス上に固定するための他の技術も本発明のスクリーニングアッセイにおいて用いることができる。たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質またはＢ７−４またはＰＤ−１標的分子のいずれかを、ビオチンおよびストレプトアビジンの結合を利用して固定化できる。ビオチニル化Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質または標的分子を、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から当業者に周知の技術（たとえば、ビオチニル化キット、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて調製し、ストレプトアビジンコートされた９６ウェルプレート（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）のウェル中に固定化できる。別法として、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質または標的分子と反応性であるが、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質のその標的分子との結合を妨害しない抗体をプレートのウェルから誘導化し、未結合標的またはＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質を抗体結合によりウェル中にトラップできる。かかる複合体の検出方法は、ＧＳＴ−固定化複合体についてすでに記載した者に加えて、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質と反応性の抗体を用いた複合体の免疫検出、ならびにＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質または標的分子と結合する酵素活性の検出に依存する酵素結合分析を包含する。
【０２２４】
もう一つの具体例において、試験化合物がＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の活性を調節する能力の決定は、試験化合物がＢ７−４を減少調節する分子、たとえば、Ｂ７−４と相互作用する分子、またはＰＤ−１を減少調節する分子の活性を調節する能力を決定することにより、たとえばＰＤ−１の細胞質ドメインと相互作用することにより、達成することができる。たとえば、すでに記載したように、第二のメッセンジャーのレベルを決定できるか、適当な標的上の相互作用分子の活性を決定できるか、または相互作用対の適当な標的との結合を決定できる。
【０２２５】
もう一つの具体例において、Ｂ７−４またはＰＤ−１発現のモジュレーターは、細胞を候補または試験化合物と接触させ、細胞中のＢ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現を決定する方法において同定される。Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡまたはタンパク質の、候補化合物の存在下での発現のレベルを、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡまたはタンパク質の候補化合物の不在下での発現のレベルと比較する。候補化合物を次いでこの比較に基づいてＢ７−４またはＰＤ−１発現のモジュレーターとして同定することができる。たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下での方が不在下よりも大きい（たとえば、再現可能で、統計学的に有意に大きい）場合、該候補化合物は、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の刺激物質として確認される。あるいは、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡまたはタンパク質の発現が、候補化合物の存在下での方が不在下よりも小さい（たとえば、再現可能で、統計学的に有意に小さい）場合、該候補化合物は、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡまたはタンパク質発現の阻害物質として確認される。細胞におけるＢ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡまたはタンパク質発現のレベルは、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡまたはタンパク質の検出に関して本明細書において記載する方法により決定できる。
【０２２６】
本発明のもう一つの具体例において、ＰＤ−１シグナリング経路に関与するペプチドおよび／またはタンパク質（たとえば、ＰＤ−１：Ｂ７−４作用物質または拮抗物質として作用できるタンパク質、ＰＤ−１シグナリングに反応してリン酸化されるタンパク質、および／またはＰＤ−１と結合するタンパク質）は、ペプチド結合／免疫沈降および質量分析により同定できる。たとえば、Ｔ細胞（たとえば、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞）はＢ７−４の存在下または不在下、および過バナジウム酸塩の存在下または不在下で活性化できる。タンパク質を次いでＴ細胞の溶解物から、たとえば抗ＰＤ−１抗体、抗ホスホチロシン（Ｐｔｙｒ）、またはＰＤ−１ペプチドを用いて免疫沈降させることができる。免疫沈降したタンパク質のパターンおよびリン酸化における変化を次いで、たとえばＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動）を用いて比較できる。タンパク質を、次いでＥＳＩ ＭＳ／ＭＳ（質量分析）を用いて分析し、同定できる。前記スクリーニングアッセイを表す概略図を図３１Ａに示す。
【０２２７】
前記スクリーニングアッセイ（たとえば、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を用いた分析法において）を用いて同定されたタンパク質を、ヒトＴ細胞の分析において用いることができる。このようなタンパク質を次いでＰＤ−１作用物質または拮抗物質、たとえば小分子作用物質または拮抗物質を同定するためのシグナリングベースのスクリーニングアッセイにおいて用いることができる。
【０２２８】
本発明のさらにもう一つの態様において、Ｂ７−４またはＰＤ−１と結合または相互作用し、Ｂ７−４またはＰＤ−１活性に関与する他のタンパク質（「Ｂ７−４またはＰＤ−１結合タンパク質」または「Ｂ７−４またはＰＤ−１ｂｐ」）を同定するために、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質、好ましくは膜結合形態のものを、２ハイブリッドアッセイまたは３ハイブリッドアッセイにおいて「おとりタンパク（ｂａｉｔ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」として使用できる（たとえば、米国特許第５２８３３１７号；Ｚｅｒｖｏｓら（１９９３）Ｃｅｌｌ７２：２２３−２２；Ｍａｄｕｒａら（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１２０４６−１２０５４；Ｂａｒｔｅｌら（１９９３）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１４：９２０−９２４；Ｉｗａｂｕｃｈｉら（１９９３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ８：１６９３−１６９６；およびＢｒｅｎｔ、ＷＯ９４／１０３００）。このようなＢ７−４またはＰＤ−１結合タンパク質は、たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１によるシグナリング経路の上流または下流エレメントとしてＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質またはＢ７−４またはＰＤ−１標的によるシグナルの伝播に関与する可能性がある。別法として、このようなＢ７−４またはＰＤ−１結合タンパク質はＢ７−４またはＰＤ−１阻害物質であり得る。
【０２２９】
２ハイブリッドシステムは、ほとんどの転写因子のモジュレーター性質に基づき、これは分離可能なＤＮＡ結合および活性化ドメインからなる。簡単に説明すると、該アッセイは２つの異なるＤＮＡ構築物を利用する。一方の構築物においては、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質をコードする遺伝子を、公知転写因子（たとえば、ＧＡＬ−４）のＤＮＡ結合ドメインをエンコードする遺伝子と融合させる。他の構築物において、同定されていないタンパク質（「えさ（ｐｒｅｙ）」または「サンプル」）をエンコードするＤＮＡ配列のライブラリーから得られるＤＮＡ配列を、公知転写因子の活性化ドメインをコードする遺伝子と融合させる。「おとり」および「えさ」タンパク質がインビボで相互作用でき、Ｂ７−４依存性複合体を形成するならば、転写因子のＤＮＡ結合および活性化ドメインを近接させることができる。このように近接することで、転写因子と反応しやすい転写調節部位に操作可能に結合されたレポーター遺伝子（たとえば、ＬａｃＺ）の転写が可能になる。レポーター遺伝子の発現を検出でき、機能的転写因子を含む細胞クローンを単離でき、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質と相互作用するタンパク質をエンコードするクローンされた遺伝子が得られる。
【０２３０】
本発明はさらに、前記スクリーニングアッセイにより同定される新規薬剤に関する。従って、さらに適当な動物モデルにおいて前記のようにして同定される薬剤を使用することも本発明の範囲内に含まれる。たとえば、本明細書に記載したようにして同定される薬剤（たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１調節剤、アンチセンスＢ７−４またはＰＤ−１核酸分子、Ｂ７−４またはＰＤ−１特異性抗体、またはＢ７−４またはＰＤ−１結合パートナー）を、かかる薬剤での治療の効力、毒性、または副作用を決定するために動物モデルにおいて使用できる。別法として、本明細書に記載したようにして同定される薬剤は、かかる薬剤の作用のメカニズムを決定するために動物モデルにおいて使用できる。さらに、本発明は本明細書に記載するような治療のための前記スクリーニングアッセイにより同定される新規薬剤の使用に関する。
【０２３１】
Ｅ．検出分析
本発明において同定されるｃＤＮＡ配列の一部またはフラグメント（および対応する完全遺伝子配列）をポリヌクレオチド試薬として多くの方法において使用できる。たとえば、これらの配列は：（ｉ）そのそれぞれの遺伝子を染色体上にマップし；従って遺伝子疾患に関連する遺伝子領域の位置を突き止める；（ｉｉ）微小な生物学的サンプル唐子湖を同定する（組織タイピング）；および（ｉｉｉ）生物学的サンプルにおける法医学的確認を助けるために使用できる。これらの用途は、以下のサブセクションにおいて記載する。
【０２３２】
１．染色体マッピング
遺伝子の配列（または配列の部分）が一度単離されたら、この配列を用いて染色体上での遺伝子の位置をマップすることができる。このプロセスは、染色体マッピングと呼ばれる。従って、本明細書中に記載するＢ７−４ヌクレオチド配列の部分またはフラグメントを用いて、染色体上のＢ７−４遺伝子の位置をマップすることができる。Ｂ７−４配列の染色体へのマッピングは、これらの配列を疾患に関連する遺伝子と関連づける重要な最初のステップである。
【０２３３】
簡単には、Ｂ７−４遺伝子は、Ｂ７−４ヌクレオチド配列からＰＣＲプライマー（好ましくは１５−２５ｂｐ長）を調製することにより、染色体へとマップすることができる。Ｂ７−４配列のコンピューター分析を用いて、ゲノムＤＮＡ中の１個以上のエキソンをスパンせず、増幅プロセスを複雑にしているプライマーを予測することができる。これらのプライマーを次いで個々のヒト染色体を含んでいる体細胞ハイブリッドのＰＣＲスクリーニングに用いることができる。Ｂ７−４配列に対応するヒト遺伝子を含んでいるこれらのハイブリッドのみが増幅フラグメントを生じるであろう。
【０２３４】
体細胞ハイブリッドは、別個の哺乳動物（例えば、ヒトおよびマウス細胞）由来の体細胞を融合することにより調製する。ヒトおよびマウス細胞のハイブリッドが増殖し、分裂するにつれ、それらはランダムな順序でヒトの染色体を徐々に失うが、マウスの染色体は保持する。特定の酵素を欠くためにマウス細胞は増殖し得ないがヒト細胞は増殖できる培地を用いることにより、必要とされる酵素をコードしている遺伝子を含む１つのヒト染色体が保持される。種々の培地を用いることにより、ハイブリッド細胞系統のパネルを確立することができる。パネル中の各細胞系統は、単一のヒト染色体または少数のヒト染色体のいずれかおよびマウス染色体の完全なセットを含み、特定のヒトの染色体への個々の遺伝子の容易なマッピングを可能とする(D'Eustachio, P. et al. (1983) Science 220:919-924)。ヒト染色体のフラグメントのみを含んでいる体細胞ハイブリッドは、転座および欠失を有するヒト染色体を用いることにより作製することもできる。
【０２３５】
体細胞のハイブリッドのＰＣＲマッピングは、特定の染色体へ特定の配列を指定するための迅速な方法である。３つまたはそれ以上の配列を、単一の熱サイクラーを用いて１日あたりに指定することができる。オリゴヌクレオチドプライマーを設計するためにＢ７−４ヌクレオチド配列を用いて、サブローカライゼーションを、特定の染色体からのフラグメントのパネルを用いて達成することができる。その染色体へ配列をマップするために同様に用いられ得る他のマッピング戦略には、インサイチュハイブリダイゼーション（Fan, Y. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6223-27に記載されている）、標識されたフローソートされた染色体でのプレ−スクリーニング、および染色体特異ｃＤＮＡライブラリーへのハイブリダイゼーションによるプレ−セレクションが含まれる。
【０２３６】
ＤＮＡ配列の中期染色体展開物へ蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）をさらに用いて、１回のステップで正確な染色体の位置を得ることができる。染色体展開物は、有糸分裂の紡錘体を壊すコルセミドなどの化学物質により分裂が中期で遮断された細胞を用いてなすことができる。染色体は簡単にトリプシンで処理して、次いでギムザで染色することができる。明暗バンドのパターンが各染色体において発生し、その結果、染色体を個々に同定することができる。ＦＩＳＨ法を５００または６００塩基もの長さのＤＮＡ配列を用いて用いることができる。しかし、１０００塩基より長いクローンが簡単な検出のために十分なシグナル強度にてユニークな染色体の位置へ結合するより高い見込みを有する。好ましくは１０００塩基、およびより好ましくは２０００塩基が、妥当な時間で優れた結果を得るのに十分である。この方法のレビューとしては、Verma et al., ヒト染色体: 基本技術マニュアル (Pergamon Press, New York 1988)を参照されたい。
【０２３７】
染色体マッピングのための試薬を個々に用いて、単一の染色体またはその染色体上の単一の部位をマークすることができ、または試薬のパネルを複数の部位および／または複数の染色体をマーキングするのに用いることができる。遺伝子の非コーディング領域に対応する試薬がマッピング目的のために好ましい。コーディング配列は、遺伝子ファミリー内で保存されているようであり、従って、染色体マッピング中の交差はハイブリダイゼーションの機会が増す。
【０２３８】
一度配列が正確な染色体の位置へとマップされたら、染色体における配列の物理的な位置を遺伝子マップデータと関連付けることができる（そのようなデータは、例えば、ジョンス ホプキンス大学ウェルシュメディカルライブラリーよりオンラインで入手可能なMcKusick, V., Mendelian Inheritance in Manに見出される)。遺伝子と同じ染色体領域へマップされる疾患の間の関連性は、例えば、Egeland, J. et al. (1987) Nature 325:783-787に記載されている関連分析（物理的に隣接する遺伝子の共遺伝）により同定することができる。
【０２３９】
さらに、Ｂ７−４遺伝子に関連する疾患に罹患している個人と罹患していない個人の間のＤＮＡ配列の差を決定することができる。変異が罹患した個人の幾人かまたは全員には認められるが、罹患していない個人においてはいずれも認められない場合、変異は特定の疾患の原因であると考えられる。罹患した個人および罹患していない個人の比較は一般に、染色体展開物から認められるまたはＤＮＡ配列に基きＰＣＲを用いて検出される欠失または転座などの染色体における構造変化をまず探すことを含む。最終的には、幾人かの個人からの遺伝子の完全な配列決定を行い、変異の存在を確認し、多型から変異を区別することができる。
【０２４０】
２．組織タイピング
本発明のＢ７−４配列をさらに用いて、少量の生物サンプルから個人を同定することもできる。合衆国軍は、例えば、そのパネルの同定のための制限フラグメント長の多型（ＲＦＬＰ）の使用を考慮している。この方法において、個人のゲノムＤＮＡを１個またはそれ以上の制限酵素で消化し、サザンブロット上にプローブして、同定のためのユニークなバンドを得る。この方法は、失われ、交換され、または転移され、ポジティブな同定を困難にしている「ドッグタグ」の現在の制限を受けない。本発明の配列は、ＲＦＬＰのさらなるＤＮＡマーカーとして有用である（米国特許第５，２７２，０５７号に記載されている）。
【０２４１】
さらに、本発明の配列を用いて、個人のゲノムの選択された位置の実際の塩基−対−塩基ＤＮＡ配列を決定する別法を提供することができる。つまり、本明細書中に記載するＢ７−４ヌクレオチド配列を用いて、配列の５’および３’末端から２つのＰＣＲプライマーを調製することができる。これらのプライマーを次いで用いて、個人のＤＮＡを増幅し、その後それを配列決定することができる。
【０２４２】
この方法で調製された、個人からの対応するＤＮＡ配列のパネルにより、各個人は対立変異によりそのようなＤＮＡ配列のユニークなセットを有するので、ユニークな個人の同定が提供され得る。本発明の配列を用いて、個人および組織からのそのような個人の配列を得ることができる。本発明のＢ７−４ヌクレオチド配列は、ヒトゲノムの部分をユニークに示す。対立変異がこれらの配列のコーディング領域にある程度まで、および非コーディング領域においてより大きな程度まで起こる。個人のヒトの間での対立変異は、各５００塩基あたり約１個の頻度で生じることが見積もられている。個人からのＤＮＡを同定目的のために比較することができる基準として、本明細書中に記載される配列のそれぞれを、ある程度まで用いることができる。より多数の多型が非コーディング領域に起こるので、より少ない配列が個人を分かつために必要である。配列番号１または３の非コーディング配列により、それぞれが１００塩基の非コーディング増幅配列を生じるおそらく１０〜１０００プライマーのパネルを用いてポジティブな個人の同定を容易に提供することができる。予測されるコーディング配列を用いる場合、ポジティブな個人の同定のためのプライマーのより適当な数のは、５００−２０００であろう。
【０２４３】
本明細書中に記載するＢ７−４ヌクレオチド配列からの試薬のパネルを用いて個人に関するユニークな同定データベースを作製する場合、これら同じ試薬を後で用いてそ個人からの組織を同定することができる。ユニークな同定データベースを用いて、生きているまたは死亡した個人のポジティブな同定を、極端に少量の組織サンプルからなすことができる。
【０２４４】
３．法生物学における部分的Ｂ７−４配列の使用
ＤＮＡ−に基く同定法は、法医学においても用いることができる。法生物学は、例えば犯罪の犯人をポジティブに同定するための手段として、犯罪現場で見出される生物学的証拠の遺伝子タイピングを用いる科学分野である。そのような同定をなすために、ＰＣＲ法を用いて、犯罪現場で見出される、例えば、髪または皮膚、または体液、例えば血液、唾液、精液などのごく少量の生物学的サンプルから採取したＤＮＡ配列を増幅することができる。増幅された配列を次いで基準と比較して、それにより生物縛的サンプルの源の同定が可能となる。
【０２４５】
本発明の配列を用いて、例えば、他の「同定マーカー」（即ち、特定の個人にユニークな他のＤＮＡ配列）を提供することによりＤＮＡ−に基く法医学的同定の信頼性を高めることができる、ヒトゲノムにおいて特定の位置に標的される、例えばＰＣＲプライマーなどのポリヌクレオチド試薬を提供することができる。前記のように、実際の塩基配列情報を、制限酵素により作製されたフラグメントにより形成されるパターンに対する適格な代替として、同定のために用いることができる。非コーディング領域に標的される配列は、より多数の多型が非コーディング領域に生じるために特に適当であり、この方法を用いて個人を区別することがより簡単になる。ポリヌクレオチド試薬の例には、Ｂ７−４ヌクレオチド配列または少なくとも２０塩基、好ましくは少なくとも３０塩基の長さを有するその部分が含まれる。
【０２４６】
本明細書中に記載されるＢ７−４ヌクレオチド配列をさらに用いて、特定の組織、例えば脳組織を同定するためのインサイチュハイブリダイゼーション法などにおいて用いることができる、標識または標識可能プローブなどのポリヌクレオチド試薬を提供することができる。これは、法医学病理学者が未知起源の組織を与えられた場合に非常に有用であり得る。そのようなＢ７−４プローブのパネルを用いて、種によりおよび／または器官タイプにより組織を同定することができる。
【０２４７】
同様の方法で、これらの試薬、例えばＢ７−４プライマーまたはプローブを用いて、汚染に関して培養組織をスクリーニングする（即ち、培養物中の異なるタイプの細胞の混合物の存在をスクリーニングする）ことができる。
【０２４８】
Ｆ．予測医薬
本発明は、診断アッセイ、予後アッセイ、および臨床試験をモニターすることを診断（予測）目的のために用いて個人を予防的に治療する予測医薬の分野にも関する。従って、本発明の１態様は、生物学的サンプル（例えば、血液、血清、細胞、組織）の内容物中でのＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質および／または核酸の発現ならびにＢ７−４またはＰＤ−１の活性を測定して、それにより個人が異常なＢ７−４またはＰＤ−１の発現または活性に伴う病気または疾患に罹患しているまたはそれに伴う疾患を進行させる危険にあるかどうかを決定するための診断アッセイに関する。発明によりさらに、個人がＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質、核酸の発現または活性に伴う疾患を進行させる危険にあるかどうかを決定するための診断（または予測）アッセイも提供される。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子における変異を生物学的サンプルにおいてアッセイすることができる。そのようなアッセイを診断または予測目的のために用いて、それによりＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質、核酸発現または活性により特徴づけられる、またはそれに伴う疾患の発症前に個人を予防処置することができる。前記の診断アッセイまたは後述するアッセイなどの本明細書中に記載するアッセイを用いて、自然流産を有する傾向を検出することもできる。
本発明の他の態様は、臨床試験におけるＢ７−４またはＰＤ−１の発現または活性における試薬（例えば、薬物、化合物）の影響をモニターすることを含む。 これらおよび他の試薬を以下のセクションにさらに詳細に記載する。
【０２４９】
１．診断分析
生物学的サンプルにおけるＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質または核酸の存在を検出するための方法の一例は、試験対象から生物学的サンプルを得、該生物学的サンプルを、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質をエンコードし、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の存在を生物学的サンプルにおいて検出するＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質または核酸（たとえばｍＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ）を検出できる化合物または薬剤と接触させることを含む。Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを検出するための試薬は、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡとハイブリッド形成できる標識された核酸プローブである。核酸プローブは、たとえば、ヒトＢ７−４またはＰＤ−１核酸、たとえば、配列番号１、３、１０、１１、または３８の核酸またはその一部、たとえば、少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドの長さで、ストリンジェントな条件下でＢ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと特異的にハイブリッド形成するために十分なオリゴヌクレオチドである。本発明の診断分析において使用される他の適当なプローブは本明細書に記載される。
【０２５０】
Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質を検出するための好ましい試薬は、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質と結合できる抗体、好ましくは検出可能な標識を有する抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体、またはさらに好ましくはモノクローナル抗体である。完全な抗体、またはそのフラグメント（たとえば、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２）を使用できる。プローブまたは抗体に関する「標識された」なる用語は、検出可能な物質をプローブまたは抗体とカップリング（すなわち、物理的結合）させることによるプローブまたは抗体の直接標識、ならびに直接表紙期されたもう一つの試薬との反応性によるプローブまたは抗体の間接的標識を包含することを意図される。直接標識の例は、蛍光標識された第二抗体および蛍光標識されたストレプトアビジンで検出できるようにＤＮＡプローブのビオチンでの末端標識を用いて第一抗体を検出することを包含する。「生物学的サンプル」なる用語は、対象から単離される組織、細胞および生物学的液体、ならびに対象内に存在する組織、細胞および液体を包含することを意図される。すなわち、本発明の検出法は、インビトロならびにインビボで生物学的サンプルにおけるＢ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡ、たんぱくしつ、またはゲノムＤＮＡを検出するために使用できる。たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ｍＲＮＡを検出するためのインビトロ技術は、ノザンハイブリダイゼーションおよびインサイチュハイブリダイゼーションを包含する。Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質を検出するためのインビトロ技術は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、免疫沈降および免疫蛍光を包含する。Ｂ７−４またはＰＤ−１ゲノムＤＮＡを検出するためのインビトロ技術は、サザンハイブリダイゼーションを包含する。さらに、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質を検出するためのインビボ技術は、対象中に標識された抗Ｂ７−４またはＰＤ−１抗体を導入することを含む。たとえば、抗体は、対象におけるその存在および位置が標準的イメージ化技術により検出できる放射性マーカーで標識できる。
【０２５１】
一具体例において、生物学的サンプルは、試験対象から得られるタンパク質分子を含む。あるいは、生物学的サンプルは、試験対象から得られるｍＲＮＡ分子または試験対象から得られるゲノムＤＮＡを含み得る。好ましい生物学的サンプルは、慣用の手段により対象から単離される血清サンプルである。
もう一つの具体例において、方法はさらに、対照から対照生物学的サンプルを得、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの存在が生物学的サンプルにおいて検出されるように、対照サンプルを、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡを検出できる化合物または試薬と接触させ、対照サンプルにおけるＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡを、試験サンプル中のＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質、ｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡと比較することを含む。
【０２５２】
本発明は、生物学的サンプルにおけるＢ７−４またはＰＤ−１の存在を検出するためのキットも包含する。たとえば、キットは、生物学的サンプルにおいてＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質またはｍＲＮＡを検出できる標識された化合物または試薬；サンプル中のＢ７−４またはＰＤ−１の量を定量する手段；およびサンプル中のＢ７−４またはＰＤ−１の量を基準と比較するための手段を含み得る。化合物または試薬は適当な容器中に詰めることができる。キットはさらに、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質または核酸を検出するためのキットを使用するための説明書も含み得る。
【０２５３】
２．診断分析
本明細書に記載する診断法はさらに、異常なＢ７−４またはＰＤ−１発現または活性に関連する疾患または障害にかかっているか、または発症する危険性のある対照を同定するために使用できる。たとえば、本明細書に記載する分析、たとえば前記診断分析または後述の分析を、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質に関連する障害にかかっているかまたは発症する危険性のある患者を確認するために使用できる。従って、本発明は、異常なＢ７−４またはＰＤ−１発現または活性に関連する疾患または障害を確認するための方法であって、試験化合物が対照から得られ、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質または核酸（たとえば、ｍＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ）が検出され、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質または核酸の存在が、異常なＢ７−４またはＰＤ−１発現または活性に関連する疾患または障害にかかっているかまたは発症する危険性のある対象を診断できる者である方法を提供する。本明細書において使用する場合、「試験サンプル」とは、関心のある対象から得られる生物学的サンプルを意味する。たとえば、試験サンプルは、生物学的液体（たとえば、血清）、細胞サンプル、または組織であり得る。
【０２５４】
さらに、本明細書に記載する診断分析は、異常なＢ７−４またはＰＤ−１発現または活性に関連する疾患または障害を治療するために、対象に薬剤（たとえば、作用物質、拮抗物質、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または他の医薬候補）を投与できるかどうかを決定するために使用できる。従って、本発明は、Ｂ７−４またはＰＤ−１発現または活性に関連する障害の薬剤を用いて対象を有効に治療できるかどうかを決定する方法であって、試験サンプルが得られ、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質または核酸発現または活性が検出される（たとえば、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質または核酸発現または活性の発生量が、異常なＢ７−４またはＰＤ−１発現または活性に関連する障害を治療するために薬剤を投与できる患者を診断できる）方法を提供する。
【０２５５】
本発明の方法は、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子における遺伝子変更を検出し、それにより遺伝子が変更されている対象がＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子に関連する障害の危険性がある華道かを決定することができる。好ましい具体例において、該方法は、対象から得られる細胞のサンプルにおいて、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質をエンコードする遺伝子の統合性に影響を及ぼす変更のすくなくとも一つにより特徴づけられる遺伝子の変更の存在または不在、またはＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子の発現の誤りを検出することを含む。たとえば、このような遺伝子変更は、１）Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子からの１以上のヌクレオチドの欠失；２）Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子に対する１以上のヌクレオチドの付加；３）Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子の１以上のヌクレオチドの置換；４）Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子の染色体の再配置；５）Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物のレベルの変更、６）Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子、たとえばゲノムＤＮＡのメチル化パターンの異常な修飾、７）Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子のメッセンジャーＲＮＡ転写物の非野生型スプライシングパターンの存在、８）Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の非野生型レベル、９）Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子の対立遺伝子損失、および１０）Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質の不適当な転写後修飾の少なくとも一つの存在を確認することにより検出できる。本明細書において記載されるように、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子の変更を検出するために用いられる当該分野において公知の技術が多数ある。好ましい生物学的サンプルは、対象から慣用の手段により単離される組織または血清サンプルであり、たとえば心臓組織サンプルである。
【０２５６】
ある具体例において、変更の検出は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（たとえば、米国特許代４６８３１９５号および第４６８３２０２号）、たとえばアンカーＰＣＲまたはＲＡＣＥ ＰＣＲ、あるいは結紮連鎖反応（ＬＣＲ）（たとえば、Ｌａｎｄｅｇｒａｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４１：１０７７−１０８０；およびＮａｋａｚａｗａら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３６０−３６４）におけるプローブ／プライマーの使用を含み、後者はＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子における点突然変異の検出に特に有用である（Ａｂｒａｖａｙａら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：６７５−６８２）。この方法は、患者からの細胞のサンプルを集める工程、サンプルの細胞から核酸（たとえば、ゲノム、ｍＲＮＡまたは両方）を単離する工程、核酸サンプルを、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子（存在するならば）のハイブリダイゼーションおよび増幅が起こるような条件下でＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子と特異的にハイブリッド形成する１以上のプライマーと接触させる工程、および増幅産物の存在または不在を検出する工程、または増幅サンプルのサイズを検出する工程および長さを対照サンプルと比較する工程を含み得る。ＰＣＲおよび／またはＬＣＲは、本明細書に記載される突然変異を検出するために用いられる技術のいずれかと組み合わせて予備増幅工程として使用するのが望ましい。
【０２５７】
別の増幅法は：自立的配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ，Ｊ．Ｃ．ら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ，Ｄ．Ｙ．ら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６；１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ，Ｐ．Ｍ．ら（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌｏｇｙ６：１１９７）、または任意の他の核酸増幅法を含み、それに続いて当業者に周知の技術を用いて増幅された分子を検出する。これらの検出スキームは、このような分子が非常に少数で存在するならば核酸分子の検出に特に有用である。
もう一つの具体例において、サンプル細胞からのＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子の突然変異は、制限酵素開裂パターンにおける変更により同定できる。例えば、サンプルおよび対照ＤＮＡが単離され、（所望により）増幅され、１以上の制限エンドヌクレアーゼで消化され、フラグメント長サイズがゲル電気泳動により決定され、比較される。サンプルと対照ＤＮＡ間のフラグメント長サイズの差は、サンプルＤＮＡにおける突然変異を示す。さらに、配列特異的リボザイム（例えば、米国特許第５４９８５３１号参照）の使用は、リボザイム開裂部位の発生または損失により特異的突然変異の存在を採点するために使用できる。
【０２５８】
他の具体例において、Ｂ７−４またはＰＤ−１における遺伝子突然変異は、サンプルと対照核酸、例えばＤＮＡまたはＲＮＡを、数百または数千のオリゴヌクレオチドプローブを含む高密度アレイとハイブリッド形成することにより同定できる（Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ら（１９９６）Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．７：２４４−２５５；Ｋｏｚａｌ，Ｍ．Ｊ．ら（１９９６）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２：７５３−７５９）。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１における遺伝子突然変異は、Ｃｒｏｎｉｎ，Ｍ．Ｔ．ら（１９９６）前出に記載されているように光生成ＤＮＡを含む二次元アレイにおいて同定できる。簡単に説明すると、プローブのハイブリダイゼーションアレイは、連続した重複プローブの直線状アレイを調製することにより配列間の塩基変化を同定するために、サンプルと対照におけるＤＮＡの長さにわたってスキャンするために使用できる。この工程により、点突然変異の同定が可能になる。この工程に続いて、第二のハイブリダイゼーションアレイを行い、これは検出される全ての変異体または突然変異に対して相補性のより小さな分化したプローブアレイを使用することにより、特的突然変異のキャラクタライゼーションを可能にする。各突然変異アレイは、平行なプローブセットからなり、１つは野生型遺伝子に相補静であり、他は突然変異遺伝子に相補性である。
【０２５９】
さらにもう一つの具体例において、当該分野において公知の様々な配列化反応の任意のものを使用して、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子を直接配列させ、サンプルＢ７−４またはＰＤ−１の配列を対応する野生型（対照）配列と比較することにより突然変異を検出することができる。配列化反応の例は、ＭａｘａｍおよびＧｉｌｂｅｒｔ（（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５６０）またはＳａｎｇｅｒ（（１９７７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７４：５４６３）により開発された技術に基づくものを包含する。質量分析による配列化（例えば、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９４／１６１０１；Ｃｏｈｅｎら（１９９６）Ａｄｖ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．３６：１２７−１６２；およびＧｒｉｆｆｉｎら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３８：１４７−１５９）を含む様々な自動化配列化法の任意のものを、診断分析（（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ１９：４４８）を行う場合に利用できると考えられる。
【０２６０】
Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子における突然変異を検出する他の方法は、ＲＮＡ／ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖におけるミスマッチした塩基を検出するために開裂剤からの保護を使用する方法（Ｍｙｅｒら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３０：１２４２）を包含する。一般に、「ミスマッチ開裂」の技術は、野生型Ｂ７−４またはＰＤ−１配列を含む（標識された）ＲＮＡまたはＤＮＡを組織サンプルから得られる潜在的な突然変異体ＲＮＡまたはＤＮＡとハイブリッド形成させることによりヘテロ二本鎖を提供することにより開始する。二本鎖を、二本鎖の一本鎖領域、例えば対照とサンプル鎖間の塩基対ミスマッチのために存在するものを開裂させる薬剤で処理する。例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖をＲＮＡｓｅで処理し、ＤＮＡ／ＤＮＡハイブリッドをＳ１ヌクレアーゼで処理して、ミスマッチした領域を酵素で消化する。他の具体例において、ミスマッチ領域を消化するために、ＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のいずれかを、ヒドロキシルアミンまたはオスミウムテトロキシドで処理し、ピペリジンで処理できる。ミスマッチ領域の消化後、結果として得られる物質を、変性ポリアクリルアミドゲル上サイズにより分離して、突然変異の部位を決定する。例えば、Ｃｏｔｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：４３９７；Ｓａｌｅｅｂａら（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｚｙｍｏｌ．２１７：２８６−２９５参照）。好ましい具体例において、対照ＤＮＡまたはＲＮＡを検出のために標識できる。
【０２６１】
さらにもう一つの具体例において、ミスマッチ開裂反応は、細胞のサンプルから得られるＢ７−４またはＰＤ−１ｃＤＮＡにおける点突然変異を検出し、マップするために所定のシステムにおいて二本鎖ＤＮＡにおいてミスマッチした塩基対を認識する１以上のタンパク質（いわゆる、「ＤＮＡミスマッチ修復」酵素）を利用する。例えば、イー・コリのｍｕｔＹ酵素は、Ｇ／ＡミスマッチのＡを開裂させ、ＨｅＬａ細胞からのチミジンＤＮＡグリコシラーゼはＧ／ＴミスマッチのＴを開裂させる（Ｈｓｕら（１９９４）Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ１５：１６５７−１６６２）。具体例に従って、Ｂ７−４配列に基づくプローブ、例えば、野生型Ｂ７−４またはＰＤ−１配列を試験細胞から得られるｃＤＮＡまたは他のＤＮＡ産物とハイブリッド形成させる。二本鎖をＤＮＡミスマッチ修復酵素で処理し、開裂産物がもし存在するならば、これを電気泳動プロトコルなどにより検出できる。例えば、米国特許第５４５９０３９号参照。
【０２６２】
他の具体例において、電気泳動移動度の変更をＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子における突然変異を同定するために使用できる。例えば、突然変異体と野生型核酸間の電気泳動移動度における相違を検出するために一本鎖形態（ＳＳＣＰ）を使用できる（Ｏｒｉｔａら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ：８６：２７６６、さらにＣｏｔｔｏｎ（１９９３）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２８５：１２５−１４４；およびＨａｙａｓｈｉ（１９９２）Ｇｅｎｅｔ．Ａｎａｌ．Ｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．９：７３−７９）。サンプルおよび対照Ｂ７−４またはＰＤ−１核酸の一本鎖ＤＮＡフラグメントを変性させ、復元させることができる。一本鎖核酸の第二の構造は、配列によって変化し、結果としての電気泳動移動度における変更により、一塩基の変化でも検出可能になる。分析の感度は、ＲＮＡ（ＤＮＡよりも）を用いることにより向上でき、第二の構造は配列の変化にさらに敏感である。好まし具体例において、主題の方法は、電気泳動移動度における変化に基づく別の二重線状ヘテロ二本鎖分子のヘテロ二本鎖分析を利用する（Ｋｅｅｎら（１９９１）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．７：５）。
【０２６３】
さらにもう一つの具体例において、変性剤の勾配を含むポリアクリルアミドゲルにおける突然変異または野生型フラグメントの移動は、変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）を用いて分析される（Ｍｙｅｒｓら（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ３１３：４９５）。分析法としてＤＧＧＥを使用する場合、ＤＮＡが完全に変性しないことを確実にするために、例えば約４０ｂｐの高融点ＧＣリッチなＤＮＡのＧＣクランプをＰＣＲにより加えることにより、これを修飾することができる。さらにもう一つの具体例において、対照とサンプルの移動度における差異を確認するために、温度勾配を変性剤の代わりに使用する（ＲｏｓｅｎｂａｕｍおよびＲｅｉｓｓｎｅｒ（１９８７）Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２６５：１２７５３）。
【０２６４】
点突然変異を検出するための他の技術の例は、これらに限定されないが、選択的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション、選択的増幅、または選択的プライマーエクステンションを包含する。例えば、公知突然変異が中心におかれるオリゴヌクレオチドプライマーを調製でき、次いで、完全なマッチが見られる場合にのみハイブリダイゼーションを許容する条件下でハイブリッド形成する（Ｓａｉｋｉら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ３２４：１６３）；Ｓａｉｋｉら（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：６２３０）。オリゴヌクレオチドがハイブリッド形成膜と結合し、標識された標的ＤＮＡとハイブリッド形成する場合、かかる対立遺伝子特異性オリゴヌクレオチドをＰＣＲ増幅された標的ＤＮＡまたは多くの異なる突然変異とハイブリッド形成させる。
【０２６５】
別法として、選択的ＰＣＲプラスミド増幅に依存する対立遺伝子特異性増幅技術を本発明とあわせて使用できる。特異性増幅のプライマーとして用いられるオリゴヌクレオチドは分子の中心（したがって、増幅は異なるハイブリダイゼーション依存する）（Ｇｉｂｂｓら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：２４３７−２４４８）または一つのプライマーの３’末端（適当な条件下でミスマッチが防止できるか、またはポリメラーゼエクステンションが軽減される）に興味のある突然変異を有する（Ｐｒｏｓｓｎｅｒら（１９９３）Ｔｉｂｔｅｃｈ１１：２３８）。加えて、開裂に基づいて検出するために、突然変異の領域中に新規制限部位を導入するのが望ましい（Ｇａｓｐａｒｉｎｉら（１９９２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ６：１）。ある具体例において、増幅は増幅のためのＴａｑリガーゼを用いて行うことができると予想される（Ｂａｒａｎｙ（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：１８９）。このような場合において、結紮は完全なマッチが５’配列の３’末端にある場合にのみ起こり、増幅の存在または不在を探すことにより、特異的部位で公知の突然変異の存在を検出できる。
【０２６６】
本明細書において記載される方法は、例えば、少なくとも１つの核酸または本明細書において記載される抗体試薬を含み、例えばＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子を含む疾患または病気の症状または家族歴を示す患者を診断するための臨床条件において都合よく使用できる、あらかじめ包装された診断キットを使用することにより行うことができる。
さらに、Ｂ７−４またはＰＤ−１が発現される任意のセルタイプまたは組織を本明細書に記載される診断分析において利用できる。
【０２６７】
ＶＩＩ．Ｂ７−４またはＰＤ−１の調節剤の投与
本発明のＢ７−４またはＰＤ−１調節剤は、免疫細胞による免疫反応を向上させるかまたは抑制するかのいずれかのために、インビボの医薬的投与に適した生物学的に適合性の形態において患者に投与される。「インビボ投与に適した生物学的に適合性の形態」とは、任意の有毒な影響よりもタンパク質の治療効果の方が重きをなす、投与されるタンパク質の形態を意味する。対象なる用語は、免疫反応を惹起できる生きている生物、例えば、哺乳動物を包含することを意図される。患者の例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、およびそのトランスジェニック種を包含する。本明細書に記載される薬剤の投与は、治療的に活性な量の薬剤単独または医薬的に許容される担体との組み合わせを包含する任意の薬理学的形態であり得る。
【０２６８】
治療的に活性な量の本発明の治療組成物の投与は、所望の結果を達成するために必要な用量および時間で有効な量として定義される。例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチドの治療的に活性な量は、個人の疾患状態、年齢、性別、および体重ならびにペプチドが個人において所望の反応を惹起する能力によって変わり得る。投薬計画は、最適の治療反応を提供するために調節できる。例えば、いくつかに分割された用量を毎日投与できるか、または治療状況の緊急性により必要とされるので、比例して減少させることができる。
【０２６９】
Ｂ７−４またはＰＤ−１調節剤（例えば、ペプチド、核酸分子、抗体、ペプチド模倣物、または小分子）を都合の良い方法、例えば、注射（皮下、静脈内など）、経口投与、吸入、経皮適用、または直腸投与により投与できる。投与経路に応じて、活性化合物は、化合物を酵素、酸、および化合物を不活化し得る他の自然条件の作用から化合物を保護するために物質中でコートできる。例えば、経口投与以外によりＢ７−４またはＰＤ−１調節剤を投与するためには、ペプチドをその不活化を防止する物質でコートする化、またはペプチドを該物質と共に同時投与するのが望ましい。
【０２７０】
Ｂ７−４またはＰＤ−１調節剤は個人に、適当な担体、希釈剤またはアジュバント中で投与できるか、酵素阻害剤と同時投与できるか、またはリポソームなどの適当な担体中で投与できる。医薬的に許容される希釈剤は、塩溶液および水性緩衝溶液を包含する。アジュバントはその最も広い意味で用いられ、任意の免疫刺激化合物、例えばインターフェロンを包含する。本発明において意図されるアジュバントは、レゾルシノール、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンオレイルエーテルおよびｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテルを包含する。酵素阻害剤は、膵トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＥＥＰ）およびトラシロールを包含する。リポソームは、水中油中水エマルジョンならびに慣用のリポソームを包含する（Ｓｔｅｒｎａら（１９８４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．７：２７）。
【０２７１】
活性化合物は、非経口または腹腔内投与できる。分散液は、グリセロール、液状ポリエチレングリコール、およびその混合物および油中でも調製できる。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの製剤は、微生物の成長を防止するための保存料を含んでもよい。
注射可能な用途に適した医薬組成物は、滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散液および滅菌注射溶液または分散液の即席調製用滅菌粉末を包含する。全ての場合において、組成物は無菌でなければならず、容易に注射針通過する程度まで流動性でなければならない。製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、ポリエチレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適当な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用、分散液の場合には必要な粒子サイズの意地、および界面活性剤の使用により維持できる。微生物の作用の防止は、さまざまな抗菌剤および抗進近在、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成できる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物中に含めるのが好ましい。組成物中に、吸収を遅らせる薬剤、例えばアルミニウムものステアレートおよびゼラチンを含めることにより、注射可能な組成物の長期にわたる吸収をもたらすことができる。
【０２７２】
滅菌注射溶液は、必要に応じて、前記の成分の一つまたは組み合わせと共に必要な量の活性化合物（例えば、Ｂ７−４またはＰＤ−１ポリペプチド）を適当な溶媒中に組み入れることにより調製でき、続いて濾過滅菌される。一般に、活性化合物を、塩基性分散媒体および前記のものから必要とされる他の成分を含む滅菌ビヒクル中に組み入れることにより、分散液を調製する。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合において、好ましい調製法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより活性成分（たとえば、ペプチド）の粉末とあらかじめ濾過滅菌された溶液から得られる追加の所望の成分が得られる。
【０２７３】
前記のように、活性化合物が適当に保護される場合、タンパク質を、例えば不活性希釈剤または同化できる可食担体と共に経口投与できる。本明細書において使用する場合、「医薬的に許容される担体」とは、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含する。医薬的活性な物質についてのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野において一般的である。任意の慣用の媒体または薬剤が活性化合物と不適合性である場合を除いては、治療組成物におけるその使用は意図される。追加の活性化合物も組成物中に組み入れることができる。
【０２７４】
投与の簡便性および投与量の均一性のために、単位投与形態の非経口組成物を処方するのが特に有用である。本発明において使用される単位投与形態とは、治療される哺乳動物対象の単位投与量として適した物理的に独立した単位を意味し；。各単位は所望の治療効果を生じるために計算されたあらかじめ決められた量の活性化合物を必要とされる医薬担体と組み合わせて含む。本発明の単位投与形態の明細は、（ａ）活性化合物の独自の特性および達成されるべき特定の治療効果、および（ｂ）個人において敏感性を治療するためのかかる活性化合物を配合する分野に固有の制限により決定され、直接依存する。
【０２７５】
本発明の一具体例において、治療的に有効な量の、Ｂ７−４またはＰＤ−１タンパク質に対する抗体を対象に投与する。本明細書において定義するとおり、抗体の治療的に有効な量（すなわち、有効量）は、約０．００１〜３０ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ（体重）、さらに好ましくは約０．１〜２０ｍ／ｋｇ（体重）、なおいっそう好ましくは約１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２〜９ｍｇ／ｋｇ、３〜８ｍｇ／ｋｇ、４〜７ｍｇ／ｋｇ、または５〜６ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲である。当業者らは、疾患または障害の重さ、以前の治療、対象の全般的健康状態および／または年齢、および存在する他の疾患を包含するが、これらに限定されないある因子が対象を有効に治療するために必要な容量に影響を及ぼし得ることを理解するであろう。さらに、治療的に活性な量の抗体での対象の治療は、一回の治療を包含するか、または好ましくは一連の治療を包含し得る。好ましい例において、対象は約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ（体重）の範囲の抗体で、１週間に１回で約１〜１０週間、好ましくは２〜８週間、さらに好ましくは約３〜７週間、なおいっそう好ましくは約４、５、または６週間投与される。治療に使用される抗体の有効量は、特定の治療の過程にわたって増加または減少し得る。
【０２７６】
薬剤（例えば医薬または化合物）のＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質の発現または活性に対する影響のモニターは、基礎的医薬スクリーニングのみならず、臨床試験においても適用できる。例えば、本明細書に記載するスクリーニングアッセイにより決定される薬剤のＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子発現、タンパク質レベルを増大させるか、またはＢ７−４またはＰＤ−１活性を増加調節する有効性を、減少したＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子発現、タンパク質レベル、または減少調節されたＢ７−４またはＰＤ−１活性を示す対象の臨床試験においてモニターすることができる。別法として、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子発現、タンパク質レベルを減少させるか、またはＢ７−４またはＰＤ−１活性を減少調節するためのスクリーニングアッセイにより決定される薬剤の有効性は、増加したＢ７−４またはＰＤ−１遺伝子発現、タンパク質レベル、または増加調節されたＢ７−４またはＰＤ−１活性を示す対象の臨床試験においてモニターできる。かかる臨床試験において、Ｂ７−４またはＰＤ−１遺伝子、および好ましくは障害に関与する他の遺伝子の発現または活性は、特定の細胞の表現系の「リードアウト」またはマーカーとして使用できる。
【０２７７】
例えば、限定のためではないが、Ｂ７−４またはＰＤ−１を含み、Ｂ７−４またはＰＤ−１活性（例えば、本明細書において記載されるスクリーニングアッセイにおいて同定される）を調節する薬剤（例えば、化合物、医薬または小分子）での治療により細胞において調節される遺伝子を同定できる。従って、薬剤のＢ７−４またはＰＤ−１関連障害の、例えば臨床試験において効果を研究するために、細胞を単離し、ＲＮＡを調製し、それぞれＢ７−４またはＰＤ−１およびＢ７−４またはＰＤ−１に関連障害に関与する他の遺伝子の発現のレベルについて分析することができる。遺伝子発現のレベル（すなわち、遺伝子発現パターン）は、本明細書に記載するようにノザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲによるか、または本明細書において記載する方法の一つにより産生されるタンパク質の量を測定するか、またはＢ７−４またはＰＤ−１または他の遺伝子の活性のレベルを測定することにより定量できる。このように、遺伝子発現パターンは、マーカー、薬剤に対する細胞の生理学的反応の表示としての働きをする。従って、この反応状態は、個人の薬剤での治療前、および治療中の様々な時点で定量できる。
【０２７８】
好ましい具体例において、本発明は対象の薬剤（例えば、作用物質、拮抗物質、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、核酸、小分子、または本明細書に記載されるスクリーニングアッセイにより同定される他の医薬候補）での治療の有効性をモニターする方法であって、（ｉ）薬剤の投与前に対象から投与前サンプルを得；（ｉｉ）投与前サンプルにおいてＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現のレベルを検出し；（ｉｉｉ）１以上の投与後サンプルを対象から得；（ｉｖ）投与後サンプルにおいてＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを検出し；（ｖ）投与前サンプルにおけるＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡの発現または活性のレベルを、投与後サンプルにおけるＢ７−４またはＰＤ−１タンパク質、ｍＲＮＡ、またはゲノムＤＮＡと比較し；（ｖｉ）対象に対する薬剤の投与を適宜変更する工程を含む方法を提供する。例えば、薬剤の投与を増大させることは、Ｂ７−４またはＰＤ−１の発現または活性を検出されるよりも高いレベルまで増大させるため、すなわち、薬剤の有効性を増大させるために望ましい。別法として、薬剤の投与を減少させることは、Ｂ７−４またはＰＤ−１の発現または活性を検出されるより低いレベルまで減少させるため、すなわち薬剤の有効性を低下させるために望ましい。このような具体例に従って、Ｂ７−４またはＰＤ−１発現または活性を、観察できる表現系反応がない場合でさえも、薬剤の有効性のインジケーターとして使用できる。
本発明を以下の限定的と考えるべきでない実施例によりさらに説明する。奔出癌全体にわたって言及される全ての文献、特許および公開特許出願、ならびに図面および配列リストは出典明示により本発明の一部として参照される。
【０２７９】
実施例
実施例１：Ｂ７−４ｃＤＮＡ分子の単離
ホモローガスなポリペプチドをエンコードする核酸分子の公共のデータベースを検索するために、ヒトＢ７−２の細胞外ドメインのタンパク質配列を使用した。ＥＳＴデータベースにおける２つの重複配列、ＡＡ２９２２０１およびＡＡ３９９４１６を同定した。これらの配列は、ヒト活性化角化細胞および胎盤ｃＤＮＡライブラリーから完全長Ｂ７−４ ｃＤＮＡを単離するために使用した；
これらのＥＳＴからの配列5'-CAGCTATGGTGGTGCCGACTACAA-3'（配列番号５）および5'-AGGTGCTAGGGGACAGTGTTAGACA-3'（配列番号６）を有するオリゴヌクレオチドを合成した。これらのオリゴヌクレオチドを、濾胞性リンパ腫の場合には脾臓、活性化Ｂ細胞、ＩＮＦ−γ活性化角化細胞、正常な脾臓、および膵臓から得られるｍＲＮＡの逆転写により調製されたＰＣＲ反応を準備するために使用した。条件は、９５℃、１分；９４℃、３０秒、５６℃、３０秒、６８℃、１分を３５サイクル；６８℃、３分、３分４℃に保持であった。全ての鋳型は３８９ｂｐの予想されるサイズのバンドをもたらした。ＩＮＦ−γ活性化角化細胞のＰＣＲからの３８９ｂｐ生成物を、アガロースゲル電気泳動により精製し、０．１２ｎｇを、０．０５ｍＭビオチン−２１−ｄＵＴＰおよび前記プライマーを含むＰＣＲ反応において鋳型として使用した。条件は、９４℃、１分；９４℃、３０秒、５６℃、３０秒、６８℃、２分を２０サイクル；６８℃、５分、４℃で保持であった。ビオチニル化ＰＣＲ産物をＮｕｃｌｅｏｓｐｉｎカラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）上で精製し、ＣｌｏｎＣａｐｔｕｒｅ ｃＤＮＡ選択法（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）においてプローブとして使用した。６０ｎｇの変性ビオチニル化ＰＣＲ産物を２ｍＭＣｏＣｌ２、１Ｘ ＲｅｃＡ緩衝液、１μｇのＲｅｃＡタンパク質、１Ｘ ＡＴＰで最終体積３０μｌ中でインキュベートした。反応を３７℃で１５分間インキュベートした。この混合物に、０．７μｇの活性化角化細胞ｃＤＮＡライブラリーのプラスミドＤＮＡおよび０．４μｇのヒト胎盤ｃＤＮＡライブラリーを添加し、インキュベーションを２０分間続けた。５０ｎｇのＥｃｏＲＶ消化したラムダＤＮＡを反応に添加し、５分間インキュベートした。０．６μｌの１０％ＳＤＳおよび５．６μｇのプロテイナーゼＫを添加し、３７℃で１０分間インキュベートした。１μｌの０．１Ｍ ＰＭＳＦを添加することにより、プロテイナーゼＫを不活化した。ストレプトアビジン磁気ビーズを５μｇの剪断サケ精子ＤＮＡとともに１０分間プレインキュベートし、ビーズを磁石で捕獲し、上清を除去し、ビーズを３０μｌの結合緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、１Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）中に再懸濁した。ビーズを反応に添加し、反応を３０分間室温で優しく混合しながらインキュベートした。ビーズを磁石で捕獲し、上清を除去した。ビーズを１ｍｌの洗浄緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、２Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５）で洗浄し、ビーズを磁石で捕獲し、上清を除去した。洗浄手順を３回繰り返した。１ｍｌの無菌Ｈ２Ｏを洗浄したビーズに添加し、５分間３７℃でインキュベートし、ビーズを磁石上に捕獲し、上清を除去した。捕獲されたＤＮＡを、０．１ｍｌの溶出緩衝液（１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．１Ｎ ＮａＯＨ）を添加し、５分間室温でインキュベートすることにより溶出し、ビーズを磁石で捕獲し、上清を除去し、新しい試験管中に貯蔵した。２２．５μｌの、担体およびｐＨ中和剤を含む沈殿ミックスを２．５体積のエタノールと共に添加した。プラスミドＤＮＡを遠心分離により濃縮し、Ｈ２Ｏ中に再溶解させた。プラスミドＤＮＡをエレクトロポレーションによりイー・コリＤＨ１８Ｂ／Ｐ３中に再導入し、７．５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび２５μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−寒天プレート上で選択した。コロニーをＮｙｔｒａｎフィルター上にのせ、３２Ｐ−標識されたオリゴヌクレオチドを用いて配列：
5'-CAGCTATGGTGGTGCCGACTACAA-3'（配列番号５）、
5'-AGGTGCTAGGGGACAGTGTTAGACA-3'（配列番号６）、
5'-TCGCTTGTAGTCGGCACCACCATA-3'（配列番号９）、
に関してハイブリッド形成した。全てのオリゴはＡＡ２９２２０１配列からのものである。最終洗浄条件は、２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ ５５℃で２０分間であった。２つのハイブリッド形成コロニーを選び、ｃＤＮＡ挿入物の配列を決定した。
【０２８０】
配列決定は、Ｂ７−４分子の２つの形態を明らかにした。第一の形態、Ｂ７−４分泌（Ｂ７−４Ｓ）は、膜アンカーがない短い親水性ドメインを有するタンパク質をエンコードする。この形態のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１および２に示す。第二の形態、Ｂ７−４膜（Ｂ７−４Ｍ）は、貫膜および短い細胞質ドメインを有するタンパク質をエンコードする。この形態のヌクレオチドおよびアミノ酸配列をそれぞれ配列番号３および４に示す。図３および４に示すように、同定されたＢ７−４ファミリーの両メンバーは、シグナル、ＩｇＶ、およびＩｇＣドメインを有する。Ｂ７−４Ｍ形態は、デフォルトＢｌｏｓｕｍ６２マトリックス（ギャップペナルティーをイグジステンス１１、エクステンション１に設定）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照）を用いて計算すると、Ｂ７−１およびＢ７−２が約２６％の同一性を有する条件下で、ヒトＢ７−１と約２１％のアミノ酸同一性を有し、ヒトＢ７−２と約２０％のアミノ酸同一性を有する。
【０２８１】
実施例２
Ｂ７−４ｍＲＮＡの発現：ノザンブロット分析
Ｂ７−４の溶解形態のｍＲＮＡは約１．２ｋｂであると予想されるが、他のサイズも可能である。第二の形態のｍＲＮＡは約３．８ｋｂであり、わずかのｍＲＮＡは１．６および６．５ｋｂである。
Ｂ７−４ポリペプチドの発現を分析した。ＲＮＡをグアニジンチオシアネート均質化および塩化セシウム遠心分離により調製した。等量のＲＮＡ（約２μｇポリ（Ａ）＋ＲＮＡ）をアガロースゲル上で電気泳動させ、Ｂ７−４ＳおよびＢ７−４Ｍ形態の両方に共通の３２Ｐ標識されたＢ７−４ｃＤＮＡの一部とハイブリッド形成させた。これらのＢ７−４ｍＲＮＡは胎盤、肺、および心臓において高度に発現され、胸腺において中程度に発現される。加えて、これらのＢ７−４ｍＲＮＡは骨格筋、腎臓、膵臓、前立腺、精巣、卵巣、小腸、結腸、および末梢血リンパ球において弱く発現される。これらはまた肝臓または脳において非常に弱く発現されることが見いだされた。Ｂ７−４ｍＲＮＡは刺激されていない単球において発現されないが、ＩＦＮ−γにより強力に誘発された。同様に、これらのポリペプチドの発現は、ＴＰＡ／ＩＦＮ−γにより角化細胞において、ＩＦＮ−γにより樹状細胞において誘発されることが見いだされた。これらのＢ７−４ｍＲＮＡは刺激されていないＢ細胞において発現されなかったが、Ｉｇ架橋により誘発された。
【０２８２】
これらのＢ７−４ｍＲＮＡの発現を様々な細胞系においても調べた。これらはＢ細胞系、例えばＲａｊｉ、Ｒａｍｏｓ、ＬＢＬ、Ｎａｌｍ６、およびＤＨＬ−４においても発現されないことが見いだされた。これらはＴ細胞系、例えばＪｕｒｋａｔ、Ｒｅｘ、ＣＥＭ、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ｐｅｅ４、およびＨ９またはＨＴＬＶ−１形質転換Ｔ細胞系、例えばＳＰＰおよびＭＴ２または骨髄系Ｕ９３７においても発現されなかった。
【０２８３】
実施例３
Ｂ７−４ｍＲＮＡ発現のさらなるキャラクタライゼーション：ノザンブロット分析
マウスおよびヒトの複数の組織ノザンブロット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を３２Ｐ−ｄＣＴＰ放射標識されたｃＤＮＡプローブでＱｕｉｋＨｙｂ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中で製造業者の指示に従ってプローブした。ヒトＢ７−４プローブは、配列番号１のコーディング領域と３’未翻訳領域に及ぶ１ｋｇのＢａｍＨＩ／ＮｏｔＩフラグメントを含んでいた。マウスＢ７−４プローブは、コーディング領域からの３００ｂｐ ｃＤＮＡフラグメントを含んでいた。対照アクチンプローブはＣｌｏｎｔｅｃｈから供給された。ブロットを２回、室温で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で、続いて０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃で洗浄し、オートラジオグラフィーにより調べた。
Ｂ７−４ｍＲＮＡは心臓、ヒト胎盤、およびヒト肝臓において高レベルで発現され、脾臓、リンパ節、胸腺、およびマウス肝臓においては低いレベルで発現された。
【０２８４】
Ｂ７−４ｍＲＮＡを、ＰＵ５−１．８、ＲＡＷ２７４．７、Ｋ−Ｂａｌｂ、Ｍ−ＭＳＶ−Ｂａｌｂ／３Ｔ３、Ｈｅｐａ１−６、Ｒ１．１、Ｌ１２１０、Ｐ３８Ｄ１、Ｐ８１５、およびＮＢ４１Ａ３細胞を含む様々な形質転換されたマウス細胞系において発現した。
【０２８５】
実施例４
Ｂ７−４ｍＲＮＡ発現のさらなるキャラクタライゼーション：定量的ＰＣＲ、遺伝子チップハイブリダイゼーション、およびＲＮＡブロット分析
抗原提示細胞上のＢ７−４ｍＲＮＡ発現を調べ、これらの細胞上のＢ７−１およびＢ７−２の発現と比較した。定量的ＰＣＲ分析に関して、細胞ＲＮＡをデオキシリボヌクレアーゼ処理し、再抽出し、第一鎖ｃＤＮＡに変換した。ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン）標識されたヒトＢ７−４、Ｂ７−１、Ｂ７−２、およびＧＡＰＤＨプローブをＰＥ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｂ７−４から購入した：プライマー5'-GCCGAAGTCATCTGGACAAG-3'（配列番号１３）および5'-TCTCAGTGTGCTGGTCACAT-3'（配列番号１４）、プローブ5'-FAM-CACCACCACCAATTCCAAGA-3'（配列番号１５）：プライマー5'-ACGTGACCAAGGAAGTGAAAGAA-3'（配列番号１６）および5'-TGCCAGCTCTTCAACAGAAACAT-3'（配列番号１７）、プローブ5'-FAM-TGGCAACGCTGTCCTGTGGTCAC-3'（配列番号１８）；Ｂ７−２：プライマー5'-GGGCCGCACAAGTTTTGAT-3'（配列番号１９）および5'-GCCCTTGTCCTTGATCTGAAGA-3'（配列番号２０）、プローブ5'-FAM-CGGACAGTTGGACCCTGAGACTTCACA-3'（配列番号２１）。
【０２８６】
ＰＣＲ反応は、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＴａｑＭａｎ ＥＺキットからの試薬を使用して、製造業者の指示に従って９６ウェルプレート中で始めた。標準曲線を分析した４遺伝子のそれぞれについて作成した。４０サイクルのＰＣＲを、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ７７００シーケンスディテクターで行い、Ｂ７−４、Ｂ７−１、およびＢ７−２結果を標準化するためにＧＡＰＤＨを使用した。
遺伝子チップハイブリダイゼーション分析のためにＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｕ１９ＫｓｕｂＡチップを使用した。このチップ上でＴｈｅ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈの発現された配列タグＴＣ１７７８１によりネズミＢ７−４の一部の配列を再提示する。ＲＮＡ単離、チップハイブリダイゼーションおよびスキャニングを、Ｂｙｒｎｅ，Ｍ．Ｃ．ら（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｓｕｐｐｌ．４９：２２．２．１−２２．２．１３に記載されているようにして行った。
【０２８７】
ＲＮＡブロットハイブリダイゼーションに関して、１．６ｋｂのヒトおよび３．６ｋｂのネズミＢ７−４ｃＤＮＡを、ＸｈａＩでの消化により切り取り、γ−３２Ｐ−ＡＴＰおよびＤＮＡポリメラーゼＩのＫｌｅｎｏｗフラグメントでのランダムプライミングにより標識した。ＲＮＡブロットを、Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ら（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３７９５−３８０１に記載されているようにしてハイブリッド形成した。
【０２８８】
ヒト樹状細胞は末梢血由来であった。単核細胞をＦｉｃｏｌｌ勾配上での分別後に単離した。非接着細胞を除去し、残りの細胞を１５０ｎｇ／ｍｌのヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓおよび１００ｎｇ／ｍｌのヒトＩＬ−４（Ｒ＆Ｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ）中で２日間培養した。非接着樹状細胞を単離し（ＣＤ８０＋ＣＤ８６＋ＨＬＡ−ＤＲ＋ＣＤ５４＋ＣＤ５８＋ＣＤ１ａ＋）、ＧＭ−ＣＳＦ単独中で培養するかまたはＧＭ−ＣＳＦ、２．５μｇ／ｍｌＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、および１０ｎｇ／ｍｌのヒトインターフェロン−γで活性化した。活性化後４時間および２０時間で、細胞を収穫し、ＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを単離した。
【０２８９】
ネズミ骨髄単核細胞から、磁気活性化細胞ソーティングにより顆粒球、リンパ球およびＩａ＋細胞を免疫除去し、ペトリ皿中でＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４とともに培養した。樹状細胞を非接着集団として７日培養後に収穫し、７５〜８０％ＣＤ１１ｃ＋、高ＩＡ＋細胞であることが示された。細胞をＬＰＳおよびヒトインターフェロン−γで活性化した。
ＲＮＡブロットハイブリダイゼーションによるヒト血液単球における発現の分析から、Ｂ７−２は未刺激単球により発現されないが、インターフェロン−γ治療により急速に阿蔵か調節されることが示された。もう一つの炎症性サイトカイン（ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−αでの単球の処置は、培地単独で見られるのと類似した低レベルの誘発に至り、これはおそらくプラスチックへの接着による活性化の結果である。主な４．２ｋｂ Ｂ７−４ｍＲＮＡに加えて、わずかの１．８ｋｂＢ７−４ｍＲＮＡ種もインターフェロン−γ処置された単球において観察された。細胞表面イムノグロブリン架橋により活性化されるが、Ｒａｊｉ細胞系によっては活性化されないヒトＢ細胞によるＢ７−４の発現も観察された。同様に、Ｂ７−１は未刺激単球により発現されないが、Ｂ７−４発現と類似した反応の仕組みでインターフェロン−γに反応して増加調節される。対照的に、Ｂ７−２ｍＲＮＡは単球において本質的に発現され、レベルはインターフェロン−γまたはＴＮＦ−α処置により影響を受けない。
【０２９０】
ヒト樹状細胞によるＢ７−４、Ｂ７−１、およびＢ７−２ｍＲＮＡ発現も定量的ＰＣＲにより調べた。ヒト末梢血由来の樹状細胞を顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）単独で処理するか、またはＧＭ−ＣＳＦ、リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、およびインターフェロン−γで活性化した。ＬＰＳおよびインターフェロン−γで活性化した結果、Ｂ７−４ｍＲＮＡは急速に誘発され、誘発されない細胞と比較して、４時間で１６倍増加し、２０時間で３４倍増加した。Ｂ７−１およびＢ７−２ｍＲＮＡも活性化により誘発された：Ｂ７−１は４時間で２１倍、２０時間で２２倍誘発された。Ｂ７−２は４時間でわずかの誘発を示すが；発現は２０時間で５倍誘発された。ＬＰＳおよびインターフェロン−γで処置されたネズミ骨髄由来の樹状細胞によるＢ７−４の発現を、Ｇｅｎｅｃｈｉｐハイブリダイゼーションを用いて調べた。これらの細胞におけるＢ７−４発現はヒト樹状細胞について観察されたのと類似したパターンをたどる：誘発後６および２０時間で未誘発細胞と比較してＢ７−４ｍＲＮＡの５倍誘発。これらのデータは、Ｂ７−４が抗原提示細胞およびリンパ球により発現され、Ｂ７−１およびＢ７−２と類似した方法で樹状細胞状で誘発されることを示す。ヒト角化細胞のホルボールエステルおよびインターフェロン−γでの処置もＢ７−４を誘発した。
ネズミ組織において、約３．７ｋｂ Ｂ７−４ｍＲＮＡ転写物をノザンブロットハイブリダイゼーションにより検出した。ネズミＢ７−４ｍＲＮＡの分布は、ヒトＢ７−４と非常に類似し、心臓、胸腺および胚で高レベルであり、腎臓、脾臓および肝臓で低レベルであった。
【０２９１】
実施例５
Ｂ７−４の染色体位置測定
Ｂ７−４遺伝子の染色体位置を、Ｑｕａｎｔｕｍ（Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）から商業的に入手可能なモノクロモソーマルブロットキットを用いて決定した。ブロットを、Ｂ７−４ＳおよびＢ７−４Ｍの両方を認識する配列でプローブした。この方法を用いて、Ｂ７−４ポリペプチドはヒト染色体９に位置決定され、一方、Ｂ７−１およびＢ７−２はヒト染色体３に位置決定された。Ｂ７−４ファミリーと限定されたアミノ酸配列同一性を共有するブチロフィリンは染色体６上の主要組織適合性複合体に位置決定された。Ｂ７−４の染色体位置は、Ｑｕａｎｔｕｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｎａｄａ）から入手可能なモノクロモソーマル体細胞ハイブリッドＤＮＡテンプレートのＰＣＲ増幅においてＢ７−４特異性プライマーを用いて確認された。
【０２９２】
実施例６
Ｂ７−４分子のＴ細胞リガンドまたは抗体との結合
ＣＯＳ細胞を、ベクターＤＮＡ（ｐｃＤＮＡＩ）、またはＢ７−４ＭｃＤＮＡを含む発現プラスミドのいずれかでトランスフェクトした。７２時間後、トランスフェクトされたＣＯＳ細胞を、０．５ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で３０分間、３７℃でインキュベートすることにより分離した。
Ｂ７−４Ｍを発現するＣＯＳ細胞が様々なＴ細胞レセプターおよび抗体と結合する能力を試験した。Ｂ７−４トランスフェクトＣＯＳ細胞によるＣＤ２８１ｇ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、および対照Ｉｇの結合のＦＡＣＳ分析は、ＣＤ２８１ＩｇもＣＴＬＡ４−ＩｇもＢ７−４により結合しないことを示した（図８）。Ｂ７−４Ｍを発現するＣＯＳ細胞がＩｇＧおよびネズミＩＣＯＳ−ｈｉｓ融合タンパク質と結合する能力も試験した。ヒトＢ７−４のネズミＩＣＯＳとの結合は検出されなかった（図９）。図１０に示すように、ＦＡＣＳ分析から、ＢＢ１（抗Ｂ７−１および抗Ｂ７−３）抗体Ｂ７−４トランスフェクトＣＯＳ細胞の結合が明らかにされたが、ＩｇＭも１３３（抗Ｂ７）は明らかにされなかった。
【０２９３】
実施例７
Ｂ７−４分子によるＴ細胞増殖の副刺激
Ｂ７−４ポリペプチドのヒトＴ細胞増殖を副刺激する能力を試験した。ヒトＣＤ２８＋Ｔ細胞を、すでに記載されているようにしてＢ細胞に対するモノクローナル抗体、ナチュラルキラー細胞およびマクロファージを使用した免疫磁気ビーズ除去により単離した（Ｇｉｍｍｉ，Ｃ．Ｄ．ら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６５８６−６５９０）。ＣＯＳ細胞でトランスフェクトされたＢ７−４およびベクターを、トランスフェクションの７２時間後に収穫し、２５μｇ／ｍｌのマイトマイシン−Ｃとともに１時間インキュベートし、次いでよく洗浄した。１０５のナイーブＴ細胞をプレート結合抗ＣＤ３ｍＡｂと、インキュベートされたＤＮＡ構築物でトランスフェクトされた２００００マイトマイシン−ｃ処理ＣＯＳ細胞で刺激した。
細胞増殖を、７２時間のインキュベーションの最後の１２時間で取り込まれた３Ｈ−チミジン（１μＣｉ）により測定した。図１１および１２に示すように、Ｂ７−４を発現するＣＯＳ細胞はＴ細胞増殖を副刺激できる。
【０２９４】
実施例８
Ｂ７−４に対するネズミ抗体の生成およびＢ７−４の細胞表面発現の検出における使用
全ネズミまたはヒトＢ７−４ｃＤＮＡを含む哺乳動物発現ベクター（ｐＥＦ６またはｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を調製した。ｃＤＮＡ／ベクター構築物を０．９％塩溶液中、１ｍｇ／ｍｌで溶解させた（ＴＥまたはＰＢＳでない）。
【０２９５】
免疫化前、７８μｌの塩溶液中１ｍｇ／ｍｌカルジオトキシン（Ｓｉｇｍａ ＃Ｃ−１７７７）を免疫化されるマウスの各後肢の前脛骨筋中に注射した。各マウスを次いで５日間放置した。
マウスを麻酔した後、５０μｇの１ｍｇ／ｍｌの精製Ｂ７−４ｃＤＮＡ／ベクター構築物（０．９塩溶液中）を各再生前脛骨筋中有に注射した。
抗体価を、標準的方法、たとえばＥＬＩＳＡ分析を用いて免疫化後約６日に測定した。ｃＤＮＡ免疫化を２〜４週ごとに３サイクル繰り返した（抗体価が１：１００００より大きくなるまで）。マウスを次に、Ｂ７−４でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞で追加免疫した。
【０２９６】
適当な抗体価を有するマウスから単離された脾臓細胞を収穫した。脾臓細胞を融合パートナーＳＰ２−０と融合させて、ハイブリドーマを形成した。ハイブリドーマおよび抗体を、標準的方法で処理した（たとえば、“Ａｎｔｉｂｏｉｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．およびＬａｎｅ，Ｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８８）（出典明示により本発明の一部として参照される）参照）。
抗体２Ａ３、１０Ｄ９、５Ａ９、および１１Ｄ１２はスクリーニングアッセイにおいて選択された者に含まれていた。これらの抗体は、ヒトＢ７−４でトランスフェクトされたＣＯＳまたはＣＯＨ細胞と結合するが、偽トランスフェクトされた細胞またはマウスＢ７−４でトランスフェクトされた細胞とは結合しないことが見いだされた。様々な細胞集団に関してＢ７−４の存在を検出するために抗体を使用した。Ｂ７−４発現は、とりわけ、心臓、腫瘍細胞（肺腫瘍細胞、卵巣腫瘍細胞、胸部腫瘍細胞、上皮腫瘍細胞、および扁平細胞癌を含む）、胎盤、および胸腺上皮上で観察された。
Ｂ７−４の細胞表面発現を調べるために、もう一つの抗体、クローン２９Ｅ．２Ａ３．Ｃ６（マウスＩｇＧ２ｂκ）を使用した。Ｂ７−４はヒト乳ガン細胞系ＭＤＡ−２３１、ＳＫＢＲ−３、およびＭＣＦ−７上で発現される。
【０２９７】
実施例９
Ｂ７−４に対する完全ヒト抗体の生成
この実施例において、Ｂ７−４またはＰＤ−１に対する完全ヒト抗体を、ヒトイムノグロブリン遺伝子についてトランスジェニックであるマウスにおいて調製する。トランスジェニックマウスを、標準的方法を用いて、たとえばＨｏｇａｎら、“Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（出典明示により本発明の一部として参照される）にしたがって調製するか、または商業的に購入する。胚幹細胞を区お買いされた手順に従って処理する（Ｔｅｔｒａｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ａｎｄ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｅ．Ｊ．編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９８７；Ｚｉｊｌｓｔｒａら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ３４２：４３５−４３８；およびＳｃｈｗａｒｔｚｂｅｒｇら（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６：７９９−８０３（それぞれは出典明示により本発明の一部として参照される）。ＤＮＡクローニング法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（出典明示により本発明の一部として参照される）に従って行う。オリゴヌクレオチドを、たとえば製造業者により提供される仕様書に従って、Ｂｉｏ Ｓｙｓｔｅｍｓオリゴヌクレオチド合成器で合成するか、または商業的に購入する。
【０２９８】
トランスジェニックマウスを、精製または組み換えＢ７−４またはＰＤ−１またはＢ７−４の細胞外ドメインの少なくとも免疫原性部分を含む融合タンパク質を用いて免疫化する。１００μｌｎリン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）中約４００μｇのＢ７−４またはＰＤ−１を各マウスに腹腔内注射する。血清サンプルを、眼窩後洞出血により、薬６日後に集める。
Ｂ７−４またはＰＤ−１についての抗体反応性および特異性を、間接的酵素標識免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて評価する。Ｂ７−４またはＰＤ−１についての抗体の抗体特異性を分析するために、いくつかのイムノグロブリンスーパーファミリー分子を対照（たとえば、ＣＴＬＡ４およびＣＤ２８）として試験する。Ｂ７−４またはＰＤ−１と結合するヒト可変領域を有する抗体を、マウスイムノグロブリンと交差反応性のないヒトＩｇＭおよびヒトＩｇＧサブクラスについて特異的な酵素接合体により検出する。簡単に説明すると、ウェルを一夜３７℃で５μｇ／ｍＬのＰＢＳ中Ｂ７−４でコートすることにより、ＰＶＣマイクロタイタープレートをＢ７−４またはＰＤ−１でコートする。血清サンプルを、ＰＢＳ、５％血清、５％Ｔｗｅｅｎ−２０中で希釈し、ウェル中で１時間室温でインキュベートし、続いて同じ希釈剤中で抗ヒトＩｇＧ ＦｃおよびＩｇＧＦ（ａｂ’）ホースラディッシュペルオキシダーゼまたは抗ヒトＩｇＭ Ｆｃ−ホースラディッシュペルオキシダーゼをインキュベートする。室温で１時間後、ＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）の添加により酵素活性を評価し、３０分後、４１５〜４９０ｎｍで読みとる。同じマウスからの免疫化前の血清サンプルにおいて、ヒト抗体の同じ標的抗原に対する力価も試験する。
ネズミ抗体のネズミＶＨおよびＶＬドメインの相補性決定配列を、Ｂ７−４またはＰＤ−１に対するヒト化抗体を生成するためにヒトのフレームワーク中に移植できる（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ３３２：３２３；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ２３９：１５３４）。
【０２９９】
実施例１０
Ｂ７−４またはＰＤ−１と反応性のヒト単鎖Ｆｖｓの生成
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマの調製の別法として、抗Ｂ７−４または抗ＰＤ−１抗体（抗体の単鎖Ｆｖ−様部分）を確認し、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．，Ｍｅｌｂｏｕｒｎ，ＵＫから得られるＭ１３バクテリオファージ上に示されるヒトイムノグロブリン配列のコンビナトリアルライブラリーのスクリーニングにより単離した（Ｗｉｎｔｅｒら（１９９４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４：１）。ＰＤ−１．ＦｃまたはＢ７−４．Ｆｃを使用し、Ｂ７−４またはＰＤ−１と結合するイムノグロブリンラブラリーメンバーを単離した。ファージディスプレーライブラリーの生成およびスクリーニング用キットは商業的に入手可能であり、ｓｃＦｖを生成するために標準的方法を使用した（Ｈｅｌｆｒｉｃｈら（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２３７：１３１−４５；Ｃａｒｄｏｓｏら（２０００）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．５１：３３７−４４）。ＰＤ−１．ＦｃまたはＢ７−４．Ｆｃをプラスチック上に固定化し、パンニングおよび複数回の濃縮により特異的ｓｃＦｖを発現するファージを選択した（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ Ｊ．１２；７２５）。
【０３００】
Ｂ７−４のレセプターの同定
ヒトイムノグロブリンガンマ１またはネズミＩｇガンマ２ａのいずれかのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインと融合したヒトＰＤ−１の細胞外領域の融合タンパク質（ＦｃＲおよび相補性相互作用をブロックする突然変異を有する）を、ＰＤ−１と結合するリガンドを検索するために使用した。この検索の一部として、ガンマ−インターフェロンで刺激された単球の細胞表面の染色を見いだした。Ｂ７−４は、ノザンブロットハイブリダイゼーションにより観察されるように、ガンマインターフェロンで刺激した後の単球において誘発される。
ＰＤ−１−Ｆｃ（ヒトＩｇガンマ１）の一時的にＢ７−４０発現ベクターでトランスフェクトされたＣＯＳ細胞の表面との結合を試験した。ＣＯＳ細胞を、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥトランスフェクト試薬を用いてＢ７−４ＭまたはＢ７−１のいずれかでトランスフェクトした。４８時間後、細胞をヒトＰＤ−１−Ｆｃ、ネズミＰＤ−１−Ｆｃ、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ、Ｆ１ｔ４−Ｆｃ、またはＩｇＧで染色し、続いてフィコエリスリン（ＰＥ）と接合した抗ＩｇＧで染色した。細胞を次いでフローサイトメトリーにより分析した。図１３Ａ〜１３Ｄに示すように、Ｂ７−４を発現するＣＯＳ細胞はヒトＰＤ−１−ＦｃおよびネズミＰＤ−１−Ｆｃの両方を結合したが、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ、Ｆ１ｔ４−Ｆｃ、またはヒトＩｇＧを結合しなかった。正の対照として、ＣＯＳ細胞を発現するＢ７−１がＣＴＬＡ４−Ｆｃを結合するが、ＰＤ−１−ＦｃまたはＩｇＧを結合しないことが示された。
【０３０１】
加えて、トランスフェクトしたＣＯＳ細胞単層のインサイチュ分析を行った。単層をＰＤ−１Ｆｃ、ＣＴＬＡ４ＦｃまたはヒトＩｇＧ１でプローブし、結合をＦｃ部分に対する、アルカリホスファターゼと結合する第二抗体で検出した。結合は、発色基質５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートおよびニトロブルーテトラゾリウムおよび光学顕微鏡で可視化された。平行して、Ｂ７−４でトランスフェクトした細胞はＰＤ−１−Ｆｃと結合するが、ＣＴＬＡ４−Ｆｃ（ヒトＩｇガンマ１）またはＦ１ｔ４−Ｆｃ（ヒトＩｇガンマ１と結合するネズミＦ１ｔ４の細胞外領域）と結合しないことが見いだされた。平行して、ＰＤ−１Ｆｃは偽トランスフェクトされたＢ７−１またはＢ７−２トランスフェクトＣＯＳ細胞の表面と結合しなかった。
もう一つの実験において、ＰＤ−１−ＦｃのＢ７−１またはＢ７−２の溶解形態との結合およびＢ７−４との結合は、ＢＩＡＣＯＲＥベースの分析法を用いて検出されなかった。平行して、ＣＴＬＡ４はＢ７−１と結合するが、Ｂ７−４と結合しないことが示された。ＰＤ−１−ＦｃまたはＣＴＬＡ４−Ｆｃを固定化し、条件は本質的に、Ｆｉｔｚら（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ１５：６１３に記載されている通りであった。完全長Ｂ７−４ＭまたはＢ７−４−Ｆｃでトランスフェクトされた細胞からの濃縮されたＣＯＳ細胞培地を注入し、リアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）を用いて相互作用を測定した（Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ，Ｓ．およびＵｒｂａｎｉｃｚｋｙ，Ｃ．（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５およびＳｚａｂｏら（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５）。ヒトＢ７−４はヒトおよびマウスＰＤ−１と結合することが見いだされたが、この結合は、同時注入されたＰＤ−１−Ｆｃ（ＣＴＬＡ４−ＦＣではなく）との競合により阻害された。これらの実験は、可溶性Ｂ７−４−Ｆｃ融合タンパク質の固定化ＰＤ−１−Ｆｃとの結合だけでなく、Ｂ７−４ＭｃＤＮＡトランスフェクト細胞の順化培地におけるＢ７−４の溶解形態の存在も示し、これはおそらく脱落の結果である。
【０３０２】
図１４Ａ〜１４Ｆは、ＰＤ−１がＰＤ−１のＢ７−４に対する結合を競合的に阻害し、Ｆ１ｔ４（血管内皮成長因子Ｃのレセプター）は阻害しないことを示す。ヒトＰＤ−１ガンマ２ａ融合タンパク質のＢ７−４Ｍを発現するＣＯＳ細胞との結合をパネルＡに示す。結合は、ＰＥと結合する抗ガンマ２ａ特異性試薬で検出した。ＩｇＧ１と結合するヒトＰＤ−１を：５０μｇ／ｍｌ、６．２５μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、または２５μｇ／ｍｌで添加し、結合に関して競合することが見いだされた。対照として、１００μｇ／ｍｌのＦ１ｔ４Ｇ１はＰＤ−１のＢ７−４との結合に関して競合しないことが見いだされた。
【０３０３】
さらにもう一つの実験において、Ｂ７−４がＰＤ−１と結合する能力をフローサイトメトリーおよびＢＩＡＣＯＲＥ結合分析により決定した。フローサイトメトリーで検出すると、ヒトおよびネズミＰＤ−１．ＩＧ融合タンパク質は、ＣＨＯ上で発現されたヒトおよびネズミＢ７−４の両方と結合した（図１５Ａ〜１５Ｆ）。しかしながら、ヒトＣＴＬＡＩｇ、ヒトＣＤ２８．Ｉｇ、またはヒトＩＣＯＳ．ＩｇのいずれもＢ７−４発現細胞系のいずれかと結合しなかった。ＰＤ−１融合タンパク質はベクター単独でトランスフェクトされたＣＨＯ細胞と結合しなかった。さらに、ＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用は、ＢＩＡＣＯＲＥ装置を用いた表面プラズモン共鳴を用いて確認した。ヒトおよびネズミＰＤ−１．Ｉｇタンパク質およびヒトＣＴＬＡ−４．Ｉｇをデキストランチップの流動細胞表面上に固定化し、可溶性ヒトＢ７−４．Ｉｇとの結合に関して試験した。Ｂ７−４．ＩｇはヒトおよびネズミＰＤ−１．Ｉｇの両方と結合するが、ヒトＣＴＬＡ−４．Ｉｇと結合しなかった（図１６）。この結合は、同時注入された可溶性ＰＤ−１．Ｉｇとの競合によりブロックされるが、ＣＴＬＡ−４．Ｉｇによってはブロックされなかった。ヒトＢ７−１およびＢ７−２の溶解形態は、固定化ヒトＰＤ−１を結合しなかった。
【０３０４】
ＢＩＡＣＯＲＥ分析を、ＰＤ−１．Ｆｃ：Ｂ７−４．Ｆｃ結合速度論を分析するためにも用いた。ＢＩＡ２０００、ＣＭ５センサーチップを用いた。５０−１５０ＲＵ ＰＤ−１．Ｆｃをチップと結合させるためにＮＨＳ／ＥＤＣ固定化を用いた。イオン再生緩衝液（３０％１．８３Ｍ ＭｇＣｌ２、０．４６Ｍ ＫＳＣＮ、０．９２Ｍ尿素、１．８３Ｍグアニジン−ＨＣｌ）を２０回注入することにより表面を調整した。流動緩衝液（ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）は、３．４ｍＭ ＥＤＴＡ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０、および１００μｇ／ｍｌＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）（２５℃）を含むＰＢＳ（リン酸塩緩衝液）であった。使用した参考表面は（１）ブランク活性化（ＮＨＳ／ＥＤＣ）とそれに続くエタノールアミンブロック、（２）突然変異ｍＩＧＧ２ａであった。使用したＢ７−４．Ｆｃの濃度（未検出マルチマー、ＳＥＣにより定量）を、ＥＬＩＳＡｏｙｏｂｉＢＣＡタンパク分析（Ｐｉｅｒｃｅ）により定量した。使用したＢ７−４．ｍＦｃの範囲は、２０ｎＭ〜２μＭであった。流速は６０μｌ／分であった。会合は３〜４分で、４分解離した。注射を３回行い、ランダム化した。分析は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒおよび全般的分析）を用いて行った。分析結果から、ＰＤ−１．Ｆｃ：ｈＢ７−４．Ｆｃ結合が１：１モデルに適合することが示された。ＰＤ−１．Ｆｃ：ｈＢ７−４．Ｆｃに関して計算された反応速度定数（ＫＤ）は１８６ｎＭであった（ｋｏｎ＝６．５７±１．２×ｅ４Ｍ−１ｓ−１；ｋｏｆｆ＝０．１２２±０．０００７ｓ−１）。
これらのデータは、ＰＤ−１がＢ７−４と結合し、この相互作用はＰＤ−１の作用を調節することを示す。
【０３０５】
実施例１２
Ｂ７−４は負のシグナルを免疫細胞に伝達できる
この実施例において、１ウェルあたり５×１０５Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞を抗ＣＤ３コートされたビーズ（１：１の比）および可溶性抗ＣＤ２８で刺激した。Ｂ７−４を発現するＣＯＳ細胞またはＥＺＺと称する負の対照をウェル中に滴定した。上清を４８時間で収穫し、ヒトＩＬ−２についてＥＬＩＳＡにより分析した。図１７は、ＣＯＳ Ｂ７−４細胞の数が増大すると（図の右側のバー）、ＩＬ−２産生が減少することを示す。
同様の分析様式、たとえばＰＢＭＣからのヒトＰＨＡ−ブラストが固定化抗ＣＤ３および可溶性抗ＣＤ２８で刺激されるものを用いて、Ｔ細胞増殖における減少を、Ｂ７−４を発現するＣＯＳ細胞において滴定することにより観察した。
【０３０６】
実施例１３
ＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用は、ＣＤ−３によるＴ細胞増殖、サイトカイン増殖、およびＴ細胞活性化マーカーの発現を阻害する
ＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用の機能的重要性を調べるために、Ｂ７−４のそのレセプターとの相互作用の機能的影響もヒトＴ細胞を用いて調べた。末梢血単核細胞をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配遠心分離により単離した。モノクローナル抗体および免疫磁気ビーズ（ＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のカクテルを用いた負の選択により、ＣＤ４＋Ｔ細胞集団（８５〜９０％純度）を精製した。抗ＣＤ３、対照ＩｇＧおよび融合タンパク質をポリウレタンコートされたトシル活性化Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ）に製造業者の指示に従い、すでに記載されているようにして（Ｂｌａｒｉｒ，Ｐ．Ｊ．ら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１２−１５）共有結合させた。表示された濃度の抗ＣＤ３抗体（ＵＣＨＴ１、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を１×１０７ビーズ／ｍｌの０．１Ｍリン酸塩緩衝液ｐＨ７．４に添加した。結合中５μｇ／ｍｌの一定の合計Ｉｇ濃度を維持するために対照ＩｇＧをビーズ懸濁液に添加した。同様に、抗ＣＤ３／Ｂ７−４．Ｉｇ（γ２ａ）ビーズを表示された抗ＣＤ３抗体濃度、合計結合タンパク質（１μｇ／１０７ビーズ）のＢ７−４．Ｉｇ、残りの全結合タンパク質を構成する対照ＩｇＧで調製した。１０５Ｔ細胞を９６ウェル平底プレート中で培養し、ビーズを１細胞に対して１ビーズの比で表示された濃度の抗ＣＤ２８抗体（ＣＤ２８．２、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）の存在下または不在下で添加した。培養物を４日間の分析中の最後の６時間に１μＣｉ３Ｈ−チミジン／ウェルで標識することにより、増殖を定量した。サイトカインＥＬＩＳＡの分析のために、培養を前記のように開始し、上清を表示された時間に収穫した。インターフェロン−γ、ＩＬ−１０およびＩＬ−２濃度を商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（Ｇｅｎｚｙｍｅ）を用いて定量した。
【０３０７】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から得られる精製されたＣＤＲ−Ｔ細胞を抗ＣＤ３ｍＡｂでコートされたビーズおよびヒトＢ７−４．Ｉｇまたは対照Ｉｇのいずれかで活性化した。増殖およびサイトカイン産生を刺激後３６時間に評価した。抗ＣＤ３ｍＡｂ／Ｂ７−４．Ｉｇでコートされたビーズで活性化された細胞は、抗ＣＤ３ｍＡｂ／対照Ｉｇ活性化細胞と比較して増殖において６９％の減少を示した（図１８Ａ）。増殖は、異なる濃度のＢ７−４．Ｉｇでコートされたビーズを使用した場合に（０．２５、０．５、１、および２μｇＢ７−４．Ｉｇ／１０７ビーズ）、用量に依存した方法で阻害された。
さらに、Ｂ７−４の存在下での細胞の活性化も、サイトカイン分泌を弱める。Ｂ７−４の存在下で、インターフェロン−γ（図１８Ｂ）およびＩＬ−１０（図１８Ｃ）分泌はそれぞれ約８０％および６０％減少した。ＩＬ−２産生はこれらの活性化条件下で２４時間および９６時間の両方で検出できなかった。しかしながら、以下の実施例１４のようなビーズを用いたＴ細胞の活性化は、Ｂ７−４がＩＬ−２産生を刺激の２、３、および４日に阻害できることを示した。Ｂ７−４はさらに、ビーズ：細胞比が１；１、１：２、および４：１でＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＩＬ−２産生を阻害した。さらに、可溶性抗ＣＤ２８の形態の副刺激が提供される条件下で、Ｂ７−４の存在下での細胞の活性化も、ＩＬ−２産生における減少につながる。ＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用も、ＩＬ−１０およびＩＦＮ−γ産生の減少につながる。従って、Ｂ７−４の存在下でのネズミおよびヒトＴ細胞の活性化は、増殖およびサイトカイン分泌の両方の阻害につながる。
【０３０８】
さらに別の実験で、Ｂ７−４の存在下でのＴ細胞の活性化の結果、Ｔ細胞活性化マーカーの発現が減少することが示された。たとえば、Ｔ細胞がＢ７−４の存在下で活性化され、初期活性化マーカーＣＤ６９の発現をフローサイトメトリーで調べる場合、結果は次の通りであった（ＣＤ６９発現について陽性（％））
【０３０９】
Figure 2004533226
Ｔ細胞がＢ７−４の存在下で活性化され、ＩＬ−２Ｒ（ＣＤ２５）の発現がフローサイトメトリーにより調べられる場合、結果は次の通りであった（ＩＬ−２Ｒ発現について陽性（％））：
Figure 2004533226
【０３１０】
実施例１４
ＰＤ−１：Ｂ７−４阻害速度論はＰＤ−１発現と相関する
この実施例は、Ｔ細胞活性化中のＰＤ−１発現の時期とＴ細胞増殖を阻害するＰＤ−Ｌａの能力の関係を説明する。Ｔ細胞活性化は、トシル−活性化ビーズ（１０７）でコートされた４μｇ抗ＣＤ３および２μｇの対照Ｆｃ（ｃｔｒｌ．Ｆｃ）またはＢ７−４．Ｆｃ融合タンパク質のいずれかを用いて行った。５×１０４精製Ｂａｌｂ／ｃＬＮ Ｔ細胞を９６ウェルプレートフォーマットにおいて１×１０５ビーズで刺激した。増殖に関しては、プレートを培養期間の最後の１０時間にパルスをかけた。ＩＬ−２ＥＬＩＳＡに関しては、上清を平行ウェルから収穫した。
【０３１１】
Ｔ細胞活性化中のＰＤ−１発現の速度を決定するために、精製Ｂａｌｂ／ｃＬＮ Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＴＲＬ．Ｆｃビーズで刺激した。刺激の０、１、２、３、４、および５日に、細胞を収穫し、洗浄し、ビオチニル化抗ネズミＰＤ−１（Ａｇａｔａ，Ｙ．ら（１９９６）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．８：７６５−７２に記載されているようにして、モノクローナル抗体Ｊ４３から調製）またはビオチニル化ハムスター対照、続いてＰＥ−ストレプトアビジンを用いて染色した。データをｌｉｖｅ−ｇａｔｅｄ細胞について計算し、陽性（％）をアイソトープ対照に対して計算した。ＰＤ−１発現はＴ細胞活性化期間中にわたって次のように増加した：０日（０％）；１日（２７％）；２日（３７％）；３日（４０％）；４日（７４％）；および５日（８３％）。
抗ＣＤ３／ｃｔｒｌ．Ｆｃビーズまたは抗ＣＤ３／ｍＢ７−４．Ｆｃのいずれかを用いて活性化されたＢａｌｂ／ｃＬＮ Ｔ細胞の増殖を比較する場合、Ｔ細胞増殖のＢ７−４阻害の反応速度は、ＰＤ−１の発現速度と相関し、Ｂ７−４がそのＰＤ−１との相互作用によりＴ細胞活性化を阻害するために作用するというさらなる証拠が得られる。
【０３１２】
実施例１５
ＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用の結果はＴ細胞レセプターとＣＤ２８シグナルの強度に依存する
Ｔ細胞レセプター、ＣＤ２８およびＰＤ−１によるシグナル間の関係を調べるために、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を最適以下または最適の濃度の抗ＣＤ３ｍＡｂ、固定された濃度のＢ７−４．Ｉｇおよび濃度が増加する可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂで刺激した。抗ＣＤ３ｍＡｂでコートされたビーズを用いて、最適以下または最適のＴ細胞刺激に必要な濃度を確立した。最適以下のＴ細胞レセプター関与条件下で（抗ＣＤ３ｍＡｂ１μｇ／ｍｌ）、副刺激の不在下で最小の増殖が観察された（図１９Ａ）。濃度が増加する可溶性抗ＣＤ２８ｍＡｂを添加すると、増殖が３０倍まで増加した。これらの条件下で、Ｂ７−４の存在下でのＴ細胞の活性化の結果、増殖が８０％減少した（図１９Ａ）。Ｂ７−４刺激による増殖の阻害を救うためには最大レベルの副刺激（抗Ｃｄ２８、２５０ｎｇ／ｍｌ）が必要であった。対照的に、Ｔ細胞レセプター活性化（抗ＣＤ３ｍＡｂ、２μｇ／ｍｌ）の飽和条件下では、Ｂ７−４によるＴ細胞増殖の阻害は、ＣＤ２８副刺激が存在しない場合にのみ観察された（図１９Ｂ）。
【０３１３】
Ｔ細胞活性化中の異なる時点でのＰＤ−１：Ｂ７−４による増殖の阻害を立て直すための副刺激の能力を調べるために、Ｂａｌｂ／ｃＬＮ Ｔ細胞を実施例１４と同様に１μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８の存在下または不在下で刺激した。増殖を２、３、および４日に測定した。抗ＣＤ２８はＰＤ−１：Ｂ７−４．Ｆｃによる阻害をＴ細胞活性化の初期の時点（２日）で逆転させたが、後期（３日および４日）では逆転させなかった。阻害の逆転は用量に依存し、抗ＣＤ２８濃度の範囲全体（１６０ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、および２０μｇ／ｍｌ）にわたって見られた。しかしながら、強い副刺激（１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ２８）の同じ条件下で、Ｂ７−４．ＦｃはＩＬ−２産生を調べたすべての時点（２日、３日および４日）で阻害する。Ｂ７−４．Ｆｃはまた、ＩＬ−２産生を可溶性抗ＣＤ２８副刺激の広い範囲（１００ｎｇ／ｍｌ、１６０ｎｇ／ｍｌ、５００ｎｇ／ｍｌ、８００ｎｇ／ｍｌ、４μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、および２０μｇ／ｍｌ）にわたって阻害する。
ＩＣＯＳによる副刺激もＰＤ−１：Ｂ７−４による増殖の阻害を立て直す。
【０３１４】
実施例１６
Ｂ７−４のＣＤ２８シグナルおよびサイトカイン産生を阻害する能力
ＰＤ−１：Ｂ７−４経路の阻害効果は、ＴＣＲおよびＣＤ２８によりシグナルの強度を決定するようであり（前記実施例参照）、これにより弱いＣＤ３／ＣＤ２８による反応は容易に減少調節される。ＣＤ２８シグナルとＰＤ−１：Ｂ７−４経路の相互作用を研究するために、予備活性化されたＤＯ１１．１０ＣＤ４＋Ｔ細胞をＣＨＯ−ＩＡｄ／Ｂ７．２またはＣＨＯ−ＩＡｄ／Ｂ７．２／Ｂ７−４により提示されたＯＶＡペプチドで活性化した。
Ｂ７−４の検出のために、５×１０４ＣＨＯ形質転換細胞を５μｇ／ｍｌのヒトＰＤ−１Ｉｇ（ｈＰＤ−１−Ｉｇ）（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）と共にインキュベートし、ヤギ抗ネズミＩｇＧ２ａ−フィコエリスリン（ＰＥ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｉｎｃ．，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）で成長させた。加えて、細胞を５μｇ／ｍｌの抗ＩＡｄ−ＰＥまたはＢ７．２−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で別々に染色した。各工程後に細胞を３回ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．０２％アジ化ナトリウムで洗浄した。最終のインキュベーション後、細胞を１％パラホルムアルデヒドで固定した。１０００００の事象をＦＡＣＳＣａｌｉｂａｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）で分析した。全てのイソタイプ対照をＰａｈｒｍｉｎｇｅｎから入手した。
【０３１５】
脾臓細胞をＤＯ１１．１０マウスから調製し、Ｔｒｉｓ−ＮＨ４Ｃｌで処理して、赤血球を除去した。細胞を１μｇ／ｍｌのＯＶＡペプチドと共に７２時間（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）、１０％ＦＣＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｏｕｉｓ，ＭＯ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、２５０ｎｇ／ｍｌのアンホテリシンＢ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０μＭの２−ＭＥ（すべてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手）および１５ｍｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｂｉｏ Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）で補足されたＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）中で培養した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、磁気活性化細胞選別分離カラム（ＭＩｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ，Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）を用いた正の淘汰により精製し、結果としての純度は９８％より高かった。細胞を再刺激前に一夜静置した。
ＣＨＯ細胞の増殖を、５０μｇ／ｍｌのマイトマイシンＣ（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）とともに１６時間３７℃でインキュベートすることにより阻害した。インキュベーション期間の最後に、細胞を１０ｍＭ ＰＢＳ中ＥＤＴＡで収穫し、２回洗浄し、氷上に１時間放置した。細胞をその後３回洗浄し、培地中に再懸濁させた。１０５の予備活性化されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、様々な濃度のＯＶＡペプチドおよび１０４マイトマイシンＣで処理されたＣＨＯ形質転換体とともに９６ウェルプレート中で培養した。増殖を分析するために、培養物を４８時間インキュベートし、１μＣｉ／ウェルの［３Ｈ］チミジン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）でインキュベーション期間の最後の６時間に適用した。
【０３１６】
Ｂ７およびＩＡｄの発現は、すべてのＣＨＯ形質転換体に関して類似していた（図２０）。予想されるように、Ｂ７．２の導入により、すべての抗原濃度でＴ細胞による増殖反応が増大した（図２１Ａ〜２１Ｄ）。しかしながら、Ｂ７−４は低いペプチド濃度（０．０１μｇ／ｍｌおよび０．００１μｇ／ｍｌ）で反応を阻害した（それぞれ図２１Ｃおよび２１Ｄ）。
ＰＤ−１：Ｂ７−４経路のサイトカイン産生を阻害する能力を扱うために、ＣＨＯ細胞形質転換体により提示されるＯＶＡペプチドで活性化されたＤＯ１１．１０ＣＤ４＋Ｔ細胞からの上清を分析した。上清のアリコートを培養の開始後の様々な時点で収穫した。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−１０レベルを、ｍＡｂおよびＰｈａｒｍｉｎｇｅｎから入手した組み換えサイトカイン標準を用いて分析した。検出限界は次の通りであった：ＩＬ−２、２０ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ−４、４０ｐｇ／ｍｌ、ＩＦＮ０γ、１００ｐｇ／ｍｌおよびＩＬ−１０、２００ｐｇ／ｍｌ。ＩＬ−２（図２２Ａ）。ＩＬ−４（図２２Ｂ）、ＩＦＮ−γ（図２２Ｃ）、およびＩＬ−１０（図２２Ｄ）の産生は、ＤＯ１１．１０ＣＤ４＋Ｔ細胞を０．１μｇ／ｍｌのペプチドおよびＢ７−４とともに培養した場合に著しく阻害された。この濃度で、増殖の弱い阻害しかなかった。しかしながら、Ｂ７−４はサイトカイン産生を０．０１μｇ／ｍｌペプチドで著しく阻害し、これは増殖の阻害と一致した（図２３Ａ〜２３Ｃ）。ＩＬ−１０はこれらの活性化条件下で検出されなかった。従って、Ｂ７−４によるＰＤ−１関与は、Ｔ細胞増殖が影響を受けない場合でもサイトカイン産生を減少調節することができる。
【０３１７】
減少したサイトカイン産生が減少したｍＲＮＡレベルによるかどうかを確かめるために、ＲＮＡ分析を使用した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を様々なＣＨＯ細胞形質転換体および０．０１μｇ／ｍｌのＯＶＡペプチドで再刺激した。４８時間後、細胞を収穫し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてｍＲＮＡを単離した。５μｇのｍＲＮＡを、ＲｉｂｏＱＵａｎｔマルチプローブキットｍＣＫ１を製造業者の指示（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に従ってＲＮａｓｅ保護分析によりサイトカインレベルに関して分析した。ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−２、ＩＬ−６およびＩＦＮ−γｍＲＮＡの転写レベルを、ＣＨＯ−ＩＡｄ／Ｂ７．２により提示された０．０１μｇ／ｍｌのＯＶＡペプチドで刺激した後に予備活性化したＤＯ１１−１０ＣＤ４＋Ｔ細胞において検出した。しかしながら、Ｂ７−４の導入は著しくサイトカインｍＲＮＡレベルを減少させた。未刺激Ｔ細胞培養物またはＣＨＯ−ＩＡｄにより提示されたペプチドで活性化されたＴ細胞におけるサイトカインについてｍＲＮＡの最小の増加調節があった。この結果、少なくとも抗原性刺激が弱いかまたは限定されている場合、ＰＤ−１：Ｂ７−４経路の強力なＢ７／ＣＤ２８シグナルを拮抗する能力、および少なくとも強力な抗原性刺激の条件におけるサイトカイン産生の阻害がさらに証明された。
【０３１８】
実施例１７
ＰＤ−１：Ｂ７−４経路の作用メカニズム
ＣＴＬＡ−４の架橋は、ナイーブＴ細胞における細胞サイクル発達を阻害することが示されている（Ｋｒｕｍｍｅｌ，Ｍ．Ｆ．およびＡｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２５３３−２５４０；Ｗａｌｕｎａｓ，Ｔ．Ｌ．ら（１９９６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：２５４１−１５５０）。ＰＤ−１はアポトーシスを受けるネズミ細胞系から単離されたので、ＰＤ−１：Ｂ７−４経路の作用の可能なメカニズムは、プログラムされた細胞の死を増大させる。この問題を取り扱うために、ＤＯ１１．１０ＣＤ４＋Ｔ細胞を０．０１μｇ／ｍｌのペプチドおよび様々な濃度のＣＨＯ形質転換体で際し激し、細胞サイクル発達を分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を前記のように０．０１μｇ／ｍｌのペプチドで再刺激した。培養の３６時間後、細胞を開趣旨、抗ＣＤ４−ＦＩＴＣで染色した。細胞をＰＢＳ中で洗浄し、７０％エタノール中で１時間氷上で固定し、１０μｇ／ｍｌのＲＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ）および５０μｇ／ｍｌのプロピジウムヨージド（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ中に再懸濁させた。染色の１時間以内に分析を行った。
【０３１９】
４８時間後、細胞を回収し、ＣＤ４−ＦＩＴＣで染色した。浸透後、細胞をプロピジウムヨージドとともにインキュベートして、Ｇ０／Ｇ１、Ｓ／Ｇ２およびサブジプロイド集団を分析した。ＣＨＯ−ＩＡｄにより提示されたペプチドで再刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞はサブジプロイド集団において高い割合の細胞を有し、このことはアポトーシスを示す（図２４Ａ）。ＣＤ４＋Ｔ細胞がＣＨＯ−ＩＡｄ／Ｂ７−２により提示されるペプチドにより刺激される培地においては、Ｓ／Ｇ２期において細胞の数が増大し、サブジプロイド集団において数が減少し（図２４Ｂ）、このことは細胞が循環し、Ｂ７／ＣＤ２８副刺激によりアポトーシスから救済されることを示す。Ｂ７−４の導入は、Ｇ０／Ｇ１期における細胞数の増大につながる（図２４Ｃ）。Ｂ７−４培地におけるアポトーシスのレベルはＣＨＯ−ＩＡｄ／Ｂ７培地に匹敵した。これは、アネキシン染色により確認された。ＰＤ−１：Ｂ７−４経路による細胞発達の阻害は、Ｔ細胞活性化の減少調節におけるその役割を確認する。
【０３２０】
Ｂ７−４．Ｆｃを用いたさらに別の実験で、Ｔ細胞に関するＰＤ−１：Ｂ７−４関与がアポトーシスにつながらないことを確認した。細胞を抗ＣＤ３または抗ＣＤ３／Ｂ７−４．Ｆｃで処理するか、または照射し、プロピジウムヨージドおよびアネキシンで染色し、フローサイトメトリーにより分析した。アポトーシスの細胞を、プロピジウムヨージドおよびアネキシンの両方について陽性であったものとして確認した。平行して行った対照実験は、抗ＣＤ３／Ｂ７．４。Ｆｃ９が４８時間および７２時間で増殖を阻害することを示した。結果は次の通りである：
Figure 2004533226
【０３２１】
ＤＮＡ含量を分析するさらに別の実験は、Ｂ７−４．Ｆｃの存在下でのＴ細胞の活性化は、細胞サイクル阻止をもたらすことを証明した。Ｔ細胞をｃｔｒｌ．ＦｃまたはｍＢ７−４Ｆｃビーズで刺激した。４日に、細胞分裂のパーセンテージをプロピジウムヨージド染色により定量した。ｍＢ７−４．Ｆｃで刺激されたＴ細胞は、半数の細胞（１１％対２１％（対照））でＤＮＡ含量が増大し、このことは細胞分裂を示す。他の２つの実験において、パーセンテージは類似していた：１４％対２８％、および１１％対２４％。
有糸分列の分析も調べた。Ｔ細胞をＣＳＦＥで標識し、実施例１４と同様にｃｔｒｌ．ＦｃまたはｍＢ７−４．Ｆｃビーズで刺激した。１、２、３、および４日に、ＦＡＣＳ分析を行った。ｌｉｖｅ−ｇａｔｅｄ事象のみを分析した。パーセンテージは非分割細胞についてである。次のデータが示すように、Ｂ７−４での処理は細胞分裂を阻害する：
Figure 2004533226
有糸分裂も、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞について別々に調べた（前記）。結果を図２８Ａ（ＣＤ４＋）および図２８Ｂ（ＣＤ８＋）に示す。
【０３２２】
実施例１８
副刺激により誘発されたかまたは外因的に添加されたＩＬ−２は、ＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用により誘発される増殖阻害を克服できる
精製されたＢａｌｂ／ｃＬＮ Ｔ細胞を実施例１４と同様に１μｇ／ｍｌの可溶性抗ＣＤ２８および１０μｇ／ｍｌの抗ＩＬ−２の存在下または不在下で刺激した。増殖を２日に測定した。抗ＣＤ２８による副刺激の存在下で、抗ＩＬ−２の添加は、ＰＤ−１：Ｂ７−４による阻害を回復し、このことは抗ＣＤがＩＬ−２産生を誘発することにより阻害効果を逆転させることを示唆する。抗ＩＬ−２の添加は、ＩＣＯＳリガンドによる副刺激の存在下でＰＤ−１：Ｂ７−４による阻害も回復する。
【０３２３】
もう一つの例において、Ｂａｌｂ／ｃＬＮ Ｔ細胞を実施例１４と同様に外因性ＩＬ−２の添加で刺激した。増殖を３日で測定した場合、外因性ＩＬ−２はＰＤ−１：Ｂ７−４による増殖の阻害を用量に依存した方法で逆転させる（ＩＬ−２濃度範囲：３ｐｇ／ｍｌ、１０ｐｇ／ｍｌ、３０ｐｇ／ｍｌ、１００ｐｇ／ｍｌ、および３００ｐｇ／ｍｌ）。さらに、外因性ＩＬ−２の添加（Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ−２）はＰＤ−１：Ｂ７−４による増殖の阻害をあらゆる時点で逆転させる（２，３、４、および５日に測定された増殖）。
【０３２４】
実施例１９
ＣＤ８＋Ｔ細胞はＢ７−４による阻害を受けやすい
この実施例は、Ｂ７−４に反応したＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞活性化間の差異を説明する。
安定な抗原提示細胞（ＡＰＣ）系を、レトロウイルス技術を用いてＧＦＰまたはｍＢ７−４／ＧＦＰを発現するように操作した。図２９Ａは、使用した細胞の概略図を示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞実験に関して、ＡＰＣ：Ｔ細胞比は１０μＭ ＰＣＣＦペプチドで１：１０であった。ＣＤ８＋Ｔ細胞実験に関して、ＡＰＣ：Ｔ細胞比は１ｍＭ ｐ２Ｃａペプチドで１：１であった。ＴＣＲトランスジェニックマウスから得られる５×１０４の精製ＬＮ Ｔ細胞を、照射ＡＰＣとペプチドで２、３、または４日間刺激した。図２９Ｂおよび２９Ｃに示すように、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は両方ともＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用により阻害された。
抗ＣＤ２８の添加はＰＤ−１：Ｂ７−４によるＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の阻害を克服できるが（図３０Ａ）、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の阻害は克服できない（図３０Ｂ）。さらに、外因性ＩＬ−２またはＩＬ―５（それぞれ２０Ｕ／ｍｌおよび５０ｎｇ／ｍｌ、０日に添加）は、ＰＤ−１：Ｂ７−４によるＣＤ８＋Ｔ細胞の阻害を克服できる（２日に測定した増殖）。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、本質的にＩＬ−２を産生できないので阻害をより受けやすい。
【０３２５】
実施例２０
ＰＤ−１：Ｂ７−４シグナリング経路の関与によるシグナリング分子の補充
Ｔ細胞におけるＰＤ−１：Ｂ７−４経路の作用のメカニズムをさらに調べるために、Ｊｕｒｋａｔベースのシステムを使用した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は本質的に低レベルのＰＤ−１を発現する。Ｊｕｒｋａｔ細胞を抗ＣＤ３／ｃｔｒｌ．Ｉｇまたは抗ＣＤ３／ｈＢ７−４．Ｉｇでコートしたビーズで活性化した。ＰＤ−１とＣＤ３の結紮により、抗ＣＤ３単独で刺激された細胞と比較して、Ｊｕｒｋａｔ細胞によるＩＬ−２分泌が阻害される。細胞を溶解させ、抗ＳＨＰ−２免疫沈降に付し、ゲルにかけ、膜に移した。膜を４Ｇ１０−ＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ接合抗ホスホチロシン抗体）でイムノブロットし、続いて抗ＳＨＰ−２でイムノブロットして、免疫沈降におけるＳＨＰ−２発現を確認した。抗ＣＤ３およびｈＢ７−４．Ｉｇに関して、ＰＤ−１とＴＣＲの結紮は、ＴＣＲ活性化のみと比較して、結果として急速にＳＨＰ−２をリン酸化状態に変換する。ＳＨＰ−１はこれらの条件下でリン酸化されない。このデータは、ＳＨＰ−２の補充がＰＤ−１：Ｂ７−４経路によるＴＣＲシグナリング事象を減少調節するためのメカニズムであることを示唆する。
同様の実験条件下で、抗Ｚａｐ７０免疫沈降の結果、Ｚａｐ７０結合ｐ２３ｐＴｙｒがＣＤ３およびＰＤ−１の同時結紮（抗ＣＤ−３およびＢ７−４．ＩＧを使用）により阻害される。Ｊｕｒｋａｔ溶解物のＣＤ３ζ免疫沈降および抗ｐＴｙｒブロッティングの結果、ＣＤ３とＰＤ−１の同時結紮により（抗ＣＤ３およびＢ７−４．Ｉｇを使用）、ＣＤ３ζリン酸化が阻害される。この系におけるＣＤ３ζの阻害は、ＣＤ２８刺激に関して存続する。
【０３２６】
実施例２１
ビオチニル化ヒトＢ７−４ＦｃのヒトＰＤ−１Ｆｃに対する結合の阻害
ＰＤ−１またはＢ７−４の細胞外領域をネズミＩｇγ２ａのヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインと結合させることにより、Ｆｃ融合タンパク質が生じた。組み換えタンパク質を、一時的にＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ）でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞または安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系において産生し、プロテインＡ−セファロースを用いて順化培地から精製した。
Ｂ７−４またはＰＤ−１に対する抗体がヒトＢ７−４ＦｃおよびヒトＰＤ−１Ｆｃの相互作用を阻害する能力を、標準的ＥＬＩＳＡ法を用いて試験した。簡単に説明すると、ヒトＰＤ−１Ｆｃ分子を、９６ウェルプレート中に固定化し、ブロックし、洗浄した。ビオチニル化ＰＤ−１Ｆｃ分子（１００ｎｇ／ｍｌ）をウェルに約２０００、７００、２００、７０、２５、８、および１．１８ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した（図２５Ａ）。ウェルをストレプトアビジン接合ホースラディッシュペルオキシダーゼとともにインキュベートし、洗浄し、標準的方法を用いて発色させた。Ｂ７−４ＦｃのＥＤ５０は１０８ｎｇ／ｍｌであることが判明した。
【０３２７】
ヒトＢ７−４（１０Ｄ９および１１Ｄ１２）またはヒトイムノグロブリンのｓｃＦｃ部分（Ｂ７−４−１、Ｂ７−４−６、およびＢ７−４−１２）に対するネズミ抗体がビオチニル化ヒトＢ７−４ＦｃのヒトＰＤ−１Ｆｃに対する結合を阻害する能力を７種の阻害剤濃度で試験した。ＩＣ５０は、０．５ｎＭから２４ｎＭの範囲であることが判明し、データを図２５に示す。
【０３２８】
ＰＤ−１特異性ｓｃＦｖも、Ｂ７−４ ＦｃのＰＤ−１ Ｆｃに対する結合を阻害する能力について、前記と同じＥＬＩＳＡ法を用いて試験した。ＰＤ−１と反応性のヒトｓｃＦｖ（ＰＤ１−１７ｓｃＦｖ）は図２６に示すように特定の結合（１０−７から１０−８の間のＥｃ５０）を阻害することが判明した。ＰＤ１−１７ｓｃＦｖのＶＬおよびＶＨドメインを、完全ＩｇＧを生成するために使用した。簡単に説明すると、ＶＨおよびＶＬコーディング領域を発現ベクター中のゲノムＣＨおよびＣＬ遺伝子配列と結合させた。結果として得られるベクターを一時的にヒト２９３細胞でトランスフェクトし、ＩｇＧを順化培地から収穫した。移植された全ＩｇＧ分子の効力は、ｓｃＦｖ抗体についてよりも高かった（１０−８から１０−９の間のＥｃ５０）。
【０３２９】
実施例２２
可溶性Ｂ７−４Ｆｃの投与はネズミモデルにおいて疾患を悪化させる
Ｂ７−４／ＰＤ−１経路の調節がインビボで免疫調節活性を有するかどうかを確認するために、ヒト多発性硬化症と多くの臨床および病理学的特徴を共有する実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおいて、たんぱく質をネズミモデルにおいて評価した。メスＳＪＬ／Ｊマウスを、完全フロインドアジュバント中１００μｇのプロテオリピドタンパク質（ＰＬＰ）で免疫化した。１０日後、脾臓を収穫し、単細胞懸濁液に処理し、次いでインビトロで５μｇのＰＬＰ中に９６時間再懸濁させた。細胞を３回ＰＢＳ中で洗浄し、次いで１５×１０６細胞をナイーブＳＪＬ／Ｊマウスに腹腔内注射により移入した。自己反応性Ｔ細胞の養子移入の結果、受容者マウスの急性麻痺に至り、これは尾の弾力性が失われ、続いて全後肢の麻痺の進行として現れた。この麻痺エピソードは、ＣＮＳにおける活性化Ｔ細胞およびマクロファージの著しい浸潤と一致する。ほとんどの条件下で、これは短期間の麻痺後に自発的に回復が起こる疾患の急性モデルである。Ｂ７−４Ｆｃの評価に関して、マウスに１００μｌの滅菌塩溶液中２００μｇのタンパク質を、細胞移入後の０、２、４、７および１１日に皮下注射した（ｎ＝１０）。対照マウス（ｎ＝１０）は等体積の塩溶液のみを受容した。全ての動物を定期的に疾患の臨床的徴候に関してモニターし、次のように採点した。１尾の弾力性の損失；２後肢虚弱／部分的な後肢麻痺；３完全な後肢麻痺；４後および前肢麻痺；５瀕死。
【０３３０】
図２７に示す実験において、臨床的疾患の発生率および開始は、両群において類似していた。しかしながら、Ｂ７−４Ｆｃで治療されたマウスは重度の疾患を発症し、動物のほとんどは急速に進行して、完全に後および前肢が麻痺した（Ｂ７−４Ｆｃおよび対照マウスについてそれぞれ９／１０および１／１０）。臨床的徴候に関連する死亡率は対照群において１０％であり、Ｂ７−４Ｆｃ処置マウスにおいて７０％であった。加えて、臨床的疾患からの回復は、Ｂ７−４Ｆｃ処置マウスにおいて実質的に遅くなり、このマウスは治療を１１日に中止したにもかかわらず生存した。
結論として、Ｔ細胞による自己免疫の養子移入モデルを使用して、可溶性Ｂ７−４Ｆｃの投与は、疾患の臨床的徴候を悪化させ、結果として、致死率が増大し、麻痺からの回復が遅れる。これらの知見は、ＣＮＳ中への炎症性細胞の活性化／浸潤の向上と一致し、インビボでＢ７−４Ｆｃタンパク質についての免疫調節可能性をはっきりとに示す。
【０３３１】
実施例２３
ＰＤ−１シグナリング分子の同定
この実施例は、ＰＤ−１シグナリング経路に関与するタンパク質を同定するためのスクリーニングアッセイを記載する。スクリーニングアッセイの概略図を図３１Ａに示す。１×１０８（実験１）または５×１０８（実験２）ＪｕｒｋａｔＴ細胞を過バナジウム酸塩の存在下および不在下で処理した。細胞を次いで溶解緩衝液（１％ＮＰ−４０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、Ｔｒｉｓ ｐＨ７．６、プロテアーゼ阻害剤、およびホスファターゼ阻害剤）中で溶解させた。タンパク質を次いで１００μｇのビオチニル化ペプチドで４時間４℃で免疫沈降させた。次のペプチドを免疫沈降に使用した：ＩＴＩＭペプチドＹ（ＰＯ４）、Ｆ、およびＹ、ならびにＣ’（非ＩＴＩＭ）。ペプチドの配列を図３１Ｂに示す。ストレプトアビジンアガロースを３０分間４℃で添加し、サンプルを次いで４回１％溶解緩衝液＋０．４５Ｍ ＮａＣｌ中で洗浄し、ＰＢＳ（リン酸塩緩衝溶液）で２回洗浄した。サンプルを次いでＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で沸騰させ、４〜２０％ｔｒｉｓ−グリシンＮＯＶＥＸ勾配ゲル（減少）上にかけた。ゲルをＤａｉｃｈｉプロトコル（実験１）またはＭａｎｎプロトコル（実験２）を用いて銀染色した。ＰＤ−１相互作用タンパク質をゲルから切り取り、質量分析により分析した。
【０３３２】
次のＰＤ−１相互作用タンパク質を同定した：
実験１（ＩＴＩＭペプチド）
４７ｋＤ ＹおよびｐＹ −過バナジウム酸塩
９５ｋＤ Ｙ、ｐＹ、およびＦ ＋過バナジウム酸塩
実験２（ＩＴＩＭペプチド）
７５ｋＤ ＹおよびｐＹ −過バナジウム酸塩
７０ｋＤ ＹおよびｐＹ ＋過バナジウム酸塩
Ｃ−ペプチド
２２ｋＤ −過バナジウム酸塩
４６ｋＤ ＋過バナジウム酸塩
【０３３３】
実施例２４
【０３３４】
ＰＤ−１；Ｂ７−４シグナリング経路のエンゲージメントによるＥＲＫ１／２リン酸化ＥＲＫ１／２リン酸化の阻害
ＥＲＫ１および２は、Ｔ細胞レセプターの活性化に反応して活性化される。この活性化は、ＥＲＫ１および２分子のリン酸化により検出可能である。ＰＤ−１媒介性のシグナリングに関与するシグナリング経路をさらに解明するために、ＥＲＫ１／２活性化におけるＰＤ−１活性化の効果を調べた。
【０３３５】
Ｔ細胞（他に、Ｔ細胞芽細胞とも呼ばれる）を、ＰＨＡで刺激された末梢血単核細胞から得た。Ｔ細胞を、抗−ＣＤ３（１μｇ／１０７ビーズ）、およびアイソタイプコントロールＩｇ（ＩｇＧ２ａ）またはＰＤＬ１．Ｉｇ融合タンパク質（４μｇ／１０７ビーズ）のいずれかでコートされたトシル−活性化ビーズと溶解性抗−ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）の存在下で、５、３０、または９０分間接触させることにより活性化した。刺激後、細胞およびビーズを氷冷ＰＢＳ上で一度洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶解およびフラクション化した。フラクション化した細胞を次いでニトロセルロースフィルターに移し、これを次いで、リン酸化ＥＲＫ１および２を特異的に認識するウサギポリクローナル抗体（Cell Signaling Technologies）でプローブした。ブロットを次いで二次抗体、ＨＲＰコンジュゲート抗−ウサギＩｇＧ（Santa Cruz Biotechnologies)でプローブした。リン酸化したＥＲＫ１およびＥＲＫ２を示している結合抗体を、化学ルミネセンスを用いて検出した。ニトロセルロースフィルターを次いで細長く切り、リン酸化されたようとされまいとＥＲＫ１およびＥＲＫ２に特異的な抗体で再プローブし、トータルのＥＲＫ１およびＥＲＫ２の等量が細胞抽出物中に存在することを立証した。
【０３３６】
抗−ホスホＥＲＫ特異的抗体でのプロービングの結果を図３２に示す。刺激されていないＴ細胞は、検出可能なリン酸化ＥＲＫ１／２を有しなかった。抗−ＣＤ３およびＣＤ２８で刺激されたＴ細胞は、刺激のわずか５分後に検出可能なリン酸化ＥＲＫ１／２を有した。これに対して、抗−ＣＤ３およびＣＤ２８、およびＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−１を活性化するための）で刺激されたＴ細胞は、ＥＲＫ１／２リン酸化の検出可能な増加を示さなかった。これらの結果は、ＰＤ−１シグナリングがＥＲＫの活性化を抑制することを示す。
【０３３７】
実施例２５：ＰＤ−１；Ｂ７−４シグナリング経路のエンゲージメントによるＰＫＣ−θリン酸化の阻害
ＰＫＣ−θは、Ｔ細胞レセプターの活性化に反応して活性化されることが知られる。ＰＤ−１媒介性のシグナリングに関与するシグナリング経路をさらに解明するために、ＰＫＣ−θの活性化におけるＰＤ−１の活性化の効果を調べた。
実施例２４におけるように単離されたヒトのＣＤ２８＋Ｔ細胞を、抗−ＣＤ３（１μｇ／１０７ビーズ）およびアイソタイプコントロールＩｇ（ＩｇＧ２ａ）またはＰＤＬ１．Ｉｇ融合タンパク質（４μｇ／１０７ビーズ）のいずれかでコートされたトシル−活性化ビーズと、溶解性抗−ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ）の存在下に５分、３０分、または９０分または２時間接触させることにより活性化した。刺激後、細胞およびビーズを１度氷冷ＰＢＳで洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより溶解およびフラクション化した。フラクション化した細胞を次いでニトロセルロースフィルターに移し、これを次いでＴ５３８でリン酸化されるＰＫＣ−θを特異的に認識するウサギポリクローナル抗体（Cess Signaling Technologiesから入手可能な抗−ホスホＴ５３８抗体）でプローブした。ニトロセルロースフィルターを次いで二次抗体、ＨＲＰ−コンジュゲート抗−ネズミＩｇＧ(Transduction Laboratories)でプローブした。リン酸化したＰＫＣ−θを示す結合抗体を化学ルミネセンスを用いて検出した。ニトロセルロースフィルターを次いで細く切り、ＰＫＣ−θに特異的なモノクローナル抗体（等量のＰＫＣ−θを立証するためのSanta Cruz Biotechnologiesから入手可能な抗−ＰＫＣ−θ、Ｅ７）で再プローブし、等量のＰＫＣ−θが細胞抽出物中に存在することを立証した。
【０３３８】
抗−ホスホＰＫＣ−θ特異的抗体でプロービングした結果を図３３に示す。刺激されていないＴ細胞は検出可能なリン酸化されたＰＫＣ−θを有しなかった。抗−ホスホＰＫＣ−θおよびＣＤ２８で刺激されたＴ細胞は、刺激の３０分後に検出可能なリン酸化されたＰＫＣ−θを有した。このリン酸化は、抗−ＣＤ３およびＣＤ２８およびさらにＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−１を活性化するための）で刺激されたＴ細胞のものよりも有意に高かった。等量のトータルのＰＫＣ−θが全細胞抽出物中に存在する事実は、リン酸化されたＰＫＣ−θの増加が、ＰＫＣ−θ分子の存在下での全体的な増加からは生じないが、そのリン酸化の調節キナーゼによる増加または調節ホスファターゼによるその脱リン酸化の低下から生じることを示す。ＰＫＣ−θ分子のこのリン酸化は、ＰＫＣ−θ酵素の増加した活性化コンピテント構造と関連することが報告されている(Liu et al., Biochem. J. 361: 255-265 (2002))。ＰＫＣ−θ分子のＰＤ−１のシグナリングの活性化に反応して低下したリン酸化は、ＰＤ−１シグナリングがＰＫＣ−θの活性化を抑制することを示す。
【０３３９】
均等
当業者らは、慣例の実験のみを用いて、本明細書に記載される本発明の具体例の多くの同等物を認識し、確認することができるであろう。このような均等物は請求の範囲に含まれることを意図される。
【図面の簡単な説明】
【０３４０】
【図１】図１は、ヒトの分泌Ｂ７−４、Ｂ７−４Ｓをエンコードするヌクレオチド配列（配列番号１）を表す。
【図２】図２は、ヒトＢ７−４、Ｂ７−４Ｍをエンコードするヌクレオチド配列（配列番号３）を表す。
【図３】図３は、ヒトＢ７−４Ｓのアミノ酸配列（配列番号２）を示し、シグナル、ＩｇＶ、ＩｇＣ、および疎水性末端ドメインを示す。
【図４】図４は、ヒトＢ７−４Ｍのアミノ酸配列（配列番号４）を示し、シグナル、ＩｇＶ、ＩｇＣ、および膜貫通および細胞質を示す。
【図５】図５Ａ−５Ｂは、ネズミのＢ７−４のヌクレオチド配列（配列番号２２）を示す。
【図６】図６は、ネズミのＢ７−４のアミノ酸配列（配列番号２３）を示す。
【図７】図７は、ヒトＢ７−ＭおよびネズミＢ７−４アミノ酸配列のアライメントを示す（それぞれ、配列番号４および２３）。
【図８】図８は、Ｂ７−４Ｍ−トランスフェクトＣＯＳ細胞によるＣＤ２８Ｉｇ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、およびコントロールＩｇの結合のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図９】図９は、Ｂ７−４Ｍ−トランスフェクトＣＯＳ細胞によるＩｇＧおよびネズミＩＣＯＳ−ヒス融合タンパク質の結合のＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図１０】図１０は、Ｂ７−４Ｍ−トランスフェクトＣＯＳ細胞に対するＩｇＭ、ＢＢ１および１３３抗体の結合の、ＦＡＣＳ分析の結果を示す。
【図１１】図１１は、Ｂ７−４Ｍ（２９２）でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞がＴ細胞の増殖を副刺激することができることを示す。
【図１２】図１２は、Ｂ７−４Ｍ（２９２）でトランスフェクトしたＣＯＳ細胞がＴ細胞の増殖を副刺激することができることを示す。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｄは、Ｂ７−４ＭトランスフェクトＣＯＳ細胞へのＰＤ−１の結合を示す。
【図１４】図１４Ａ−１４Ｆは、追加されたＰＤ−１の、およびＦｌｔ４でないの、ＰＤ−１のＢ７−４トランスフェクトＣＯＳ細胞への結合を完了する能力を示す。
【図１５】図１５Ａ−１５Ｌは、フローサイトメトリーにより決定される、Ｂ７−４トランスフェクトＣＨＯ細胞へ結合するＰＤ−１の能力を示す。
【図１６】図１６は、ＢＩＡＣＯＲＥ分析により決定される、Ｂ７−４トランスフェクトＣＨＯ細胞へ結合するＰＤ−１の能力を示す。
【図１７】図１７は、Ｔ細胞へネガティブシグナルを伝達するＢ７−４Ｍの能力を示す。
【図１８】図１８Ａ−１８Ｃは、Ｂ７−４の存在下に刺激されたヒトＴ細胞におけるＴ細胞増殖およびサイトカイン産生の阻害を示す。
【図１９】図１９Ａ−１９Ｂは、ＣＤ２８副刺激の存在下でのＴ細胞レセプター／Ｂ７−４の活性化がＴ細胞の増殖の阻害を生じることを示す。
【図２０】図２０Ａ−２０Ｉは、Ｂ７−４を発現しているＣＨＯ細胞に対するＰＤ−１の結合を示す。
【図２１】図２１Ａ−２１Ｄは、ＣＤ２８シグナルの阻害におけるＢ７−４の活性を示す。
【図２２】図２２Ａ−２２Ｄは、サイトカインＥＬＩＳＡにより測定される、ＰＤ−１：Ｂ７−４経路によるサイトカイン産生の阻害を示す。
【図２３】図２３Ａ−２３Ｃは、サイトカインｍＲＮＡレベルにより測定される、ＰＤ−１：Ｂ７−４経路によるサイトカイン産生の阻害を示す。
【図２４】図２４Ａ−２４Ｃは、ＰＤ−１：Ｂ７−４経路の活性のメカニズムが細胞周期の停止であることを示す。
【図２５】図２５Ａ−２５Ｂは、Ｂ７−４およびＰＤ−１の間の相互作用を阻害する、Ｂ７−４に対する抗体の能力を示す。
【図２６】図２６はＰＤ−１に対する抗体がＢ７−４とＰＤ−１間の相互作用を阻害する能力を表す。
【図２７】図２７は実験的自己免疫脳脊髄炎のネズミモデルにおいて溶解性Ｂ７−４Ｆｃが疾患を悪化させる能力を表す。
【図２８】図２８Ａ〜２８Ｂは、有糸細胞分裂に関するＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用の影響を表す。Ｔ細胞をＣＳＦＥで標識し、ｃｔｒｌ．ＦｃまたはｍＢ７−４Ｆｃｂビーズで刺激した。表示した時点で、ＦＡＣＳ分析を行った。Ｌｉｖｅ−ｇａｔｅｄ事象を図示する。図２８Ａ：ＣＤ４＋Ｔ細胞。図２８Ｂ：ＣＤ８＋Ｔ細胞。ＰＤ−１：Ｂ７−４相互用の結果、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の有糸分裂が減少する。
【図２９】図２９Ａから２９ＣはＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用によるＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方の阻害を表す。図２９Ａは細胞系および実験デザインを概略的に表す。安定な抗原提示細胞（ＡＰＣ）系を、レトロウイルステクノロジーを用いてＧＦＰまたはｍＢ７−４／ＧＦＰを発現するように操作する。ＴＣＲトランスジェニック（Ｔｇ）マウスから得られる５×１０４の精製ＬＮ Ｔ細胞をＡＰＣ；ペプチドで２、２〜３、３、または４日間刺激した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む実験に関して、ＡＰＣ：Ｔ細胞比は１０μＭ ＰＣＣＦペプチドで１：１０であった。ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む実験に関して、ＡＰＣ：Ｔ細胞比は１ｍＭｐ２Ｃａペプチドで１：１であった。図２９ＢはＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用によるＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖の阻害を表す。図２９ＣはＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用によるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の阻害を表す。
【図３０】図３０Ａ〜３０Ｂは、ＰＤ−１：Ｂ７−４相互作用によるＣＤ４＋（ＣＤ８＋でない）Ｔ細胞増殖の阻害を克服するための副刺激の能力を表す。図３０Ａ：ＣＤ４＋Ｔ細胞 図３０Ｂ：ＣＤ８＋Ｔ細胞。
【図３１】図３１Ａ〜３１ＢはＰＤ−１シグナリング経路において関与するタンパク質を同定するために用いられるスクリーニングアッセイを概略的に表す。図３１Ａはアッセイのステップの概略図を表す。図３１ＢはヒトＰＤ−１のフラグメント（配列番号２４）、マウスＰＤ−１のフラグメント（配列番号２５）およびアッセイにおいて用いられるペプチドの配列を表す。アッセイにおいて用いられるペプチドはＩＴＩＭペプチド：ＰＤ−１＿Ｐｙ１（配列番号２６）；ＰＤ−１＿Ｙ１Ｆ（配列番号２７）；ＰＤ−１＿Ｙ１（配列番号２８）；ＰＤ−１＿Ｐｙ２（配列番号２９）；ＰＤ−１＿Ｙ２Ｆ（配列番号３０）；ＰＤ−１＿Ｙ２（配列番号：３１）；および他のペプチド：ＰＤ−１＿Ｋ２１２＿（配列番号３２）；ＰＤ−１＿Ｋ２１２Ｄ（配列番号３３）；ＰＤ−１＿Ｋ３３５（配列番号３４）；ＰＤ−１＿Ｋ３３５Ｄ（配列番号３５）；ＰＤ−１＿Ｃｔａｉｌ１（配列番号３６）；およびＰＤ−１＿Ｃｔａｉｌ２（配列番号３７）であった。
【図３２】図３２は、ＰＤＬ１．Ｉｇ融合タンパク質の存在下または不在下での、刺激されていない、または５分、３０分、または９０分間刺激されたヒトＴ細胞の分画細胞抽出物を含んでいるウェスタンブロットの写真である。ブロットをリン酸化ＥＲＫ１および２に特異的な抗体でプローブした。
【図３３】図３３はＢ７−４．Ｉｇ融合タンパク質の存在（＋）または不在（−）下での、刺激されていない、または５分、３０分、９０分、または２時間刺激されたヒトＴ細胞の分画細胞抽出物を含んでいるウェスタンブロットの写真である。ブロットは、リン酸化ＰＫＣ−θ（抗−ホスホ−ＰＫＣ−θ）を特異的に検出する、リン酸化ＰＫＣ−θに特異的な抗体でプローブした。ゲルを細長く切り、リン酸化および非リン酸化ＰＫＣ−θ（抗−ＰＫＣ−θ）の両方を認識する抗体でプローブした。

Claims (9)

  1. ＰＤ−１のシグナリングを調節する化合物をスクリーニングするための方法であって、
    ａ）ＰＤ−１リガンドの存在下に活性化されたＴ細胞を試験化合物と接触させること；および、
    ｂ）ＳＨＰ−２のリン酸化を調節する試験化合物の能力を測定すること；
    それにより、ＰＤ−１のシグナリングを調節する化合物を同定すること；
    を含む方法。
  2. 試験化合物がＰＤ−１シグナリングをアップモジュレートし、それによりＳＨＰ−２のリン酸化をアップモジュレートする、請求項１記載の方法。
  3. 試験化合物がＰＤ−１のシグナリングをダウンモジュレートし、それによりＳＨＰ−２のリン酸化をダウンモジュレートする、請求項１記載の方法。
  4. ＰＤ−１のシグナリングを調節する化合物をスクリーニングするための方法であって、
    ａ）ＰＤ−１リガンドの存在下に活性化されたＴ細胞を試験化合物と接触させること；および、
    ｂ）試験化合物がＥＲＫ１またはＥＲＫ２のリン酸化を調節する能力を決定すること；
    それにより、ＰＤ−１のシグナリングを調節する化合物を同定すること、
    を含む方法。
  5. 試験化合物がＰＤ−１のシグナリングをアップモジュレートし、それにより、ＥＲＫ１またはＥＲＫ２のリン酸化をダウンモジュレートする、請求項４記載の方法。
  6. 試験化合物がＰＤ−１のシグナリングをダウンモジュレートし、それによりＥＲＫ１またはＥＲＫ２のリン酸化をアップモジュレートする、請求項４記載の方法。
  7. ＰＤ−１のシグナリングを調節する化合物をスクリーニングする方法であって、
    ａ）ＰＤ−１リガンドの存在下に活性化されたＴ細胞を試験化合物と接触させること；および、
    ｂ）試験化合物がＰＫＣ−θのリン酸化を調節する能力を測定すること；
    それにより、ＰＤ−１のシグナリングを調節する化合物を同定すること、
    を含む方法。
  8. 試験化合物がＰＤ−１のシグナリングをアップモジュレートし、それによりＰＫＣ−θのリン酸化をダウンモジュレートする、請求項７記載の方法。
  9. 試験化合物がＰＤ−１のシグナリングをダウンモジュレートし、それによりＰＫＣ−θのリン酸化をアップモジュレートする、請求項７記載の方法。
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