DE69334150T2 - Mutierte steroidhormonrezeptoren, methoden für ihre benutzung und molekularer schalter für gentherapie - Google Patents

Mutierte steroidhormonrezeptoren, methoden für ihre benutzung und molekularer schalter für gentherapie Download PDF

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Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • 1. Fachgebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Bereiche der molekularen Endokrinologie und Rezeptor-Pharmakologie. Sie betrifft weiterhin molekulare Schalter für die Gentherapie. Spezifischer betrifft die vorliegende Erfindung eine neuartige in vivo-Methode für die Identifikation von Steroidhormon-Rezeptoragonisten und -antagonisten und einen molekularen Schalter unter Beteiligung eines modifizierten Steroidrezeptors zur Heraufregulierung und Herabregulierung der Synthese von heterologen Nukleinsäuresequenzen, die in Zellen inseriert worden sind.
  • 2. Beschreibung des Stands der Technik
  • Steroidrezeptoren sind für die Regulierung komplexer zellulärer Ereignisse, einschließlich der Transkription, verantwortlich. Die Eierstockhormone, Östrogen und Progesteron, sind zum Teil für die Regulierung der komplexen zellulären Ereignisse, die mit Differenzierung, Wachstum und dem Funktionieren der weiblichen Reproduktionsgewebe zusammenhängen, verantwortlich. Diese Hormone spielen auch wichtige Rollen in der Entwicklung und dem Fortschreiten von Malignitäten des reproduktiven endokrinen Systems.
  • Die biologische Aktivität von Steroidhormonen ist durch einen hormon- und gewebespezifischen intrazellulären Rezeptor direkt vermittelt. Die physiologisch inaktive Form des Rezeptors kann als ein oligomerer Komplex mit Proteinen vorliegen, wie etwa dem Hitzeschockprotein (hsp) 90, hsp 70 und hsp 56. Auf die Bindung seines verwandten Liganden hin verändert der Rezeptor die Konformation und dissoziiert von dem inhibitorischen heterooligomeren Komplex. Anschließend ermöglicht die Dimerisation dem Rezeptor die Bindung an spezifische DNA-Stellen in der regulatorischen Region von Zielgen-Promotoren. Auf die Bindung des Rezeptors an DNA hin ist das Hormon für die Vermittlung einer zweiten Funktion verantwortlich, die dem Rezeptor die spezifische Wechselwirkung mit dem Tanskriptionsapparat erlaubt. Die Verdrängung weiterer inhibitorischer Proteine und die DNA-abhängige Phosphorylierung können die abschließenden Schritte in diesem Aktivierungsweg darstellen.
  • Die Klonierung mehrerer Mitglieder der Steroidrezeptor-Superfamilie hat die Rekonstitution der Hormon-abhängigen Transkription in heterologe Zellsysteme erleichtert. Anschließend haben in vivo- und in vitro-Studien mit mutierten und chimären Rezeptoren gezeigt, dass Steroidhormonrezeptoren moduläre Proteine sind, die zu strukturell und funktionell definierten Domänen organisiert sind. Eine wohl, definierte DNA-Bindungsdomäne (DBD) von 66 Aminosäuren ist identifiziert und unter Anwendung sowohl genetischer als auch biochemischer Ansätze detailliert untersucht worden. Die Liganden-(Hormon)-Bindungsdomäne (LBD), die in der Carboxy-terminalen Hälfte des Rezeptors lokalisiert ist, besteht aus etwa 300 Aminosäuren. Sie ist für eine detaillierte ortsgerichtete Mutagenese nicht zugänglich gewesen, da sich diese Domäne zu einer komplexen Tertiärstruktur zu falten scheint, was eine spezifische hydrophobe Tasche schafft, die das Effektormolekül umgibt. Dieses Merkmal bereitet Schwierigkeiten bei der Unterscheidung von Aminosäureresten, die die Gesamtstruktur dieser Domäne beeinflussen, von solchen, die an einem direkten Kontakt mit dem Liganden beteiligt sind. Die LBD enthält auch Sequenzen, die für die Rezeptor-Dimerisation, hsp-Interaktionen und eine der beiden Transaktivierungssequenzen des Rezeptors verantwortlich sind.
  • Die Genersatztherapie erfordert die Möglichkeit, den Grad der Expression von transfizierten Genen von außerhalb des Körpers zu kontrollieren. Solch ein "molekularer Schalter" sollte Spezifität, Selektivität, Präzisionssicherheit und eine schnelle Clearance ermöglichen. Die Steroidrezeptor-Familie der Gen-regulatorischen Proteine stellt ein ideales Set solcher Moleküle dar. Diese Proteine sind Liganden-aktivierte Transkriptionsfaktoren, deren Liganden von Steroiden bis zu Retinoiden, Fettsäuren, Vitaminen, Schilddrüsenhormonen und anderen derzeit unidentifizierten kleinen Molekülen rangieren können. Diese Verbindungen binden an Rezeptoren und regulieren entweder herauf oder regulieren herab. Diese Verbindungen werden aus dem Körper mittels existierender Mechanismen ausgeschieden, und die Verbindungen sind nichttoxisch.
  • Die Effizienz eines Liganden ist eine Folge aus seiner Wechselwirkung mit dem Rezeptor. Diese Wechselwirkung kann Kontakte einbeziehen, die bewirken, dass der Rezeptor aktiv (Agonist) oder dass der Rezeptor inaktiv (Antagonist) wird. Die Affinität von Antagonist-aktivierten Rezeptoren für DNA ist ähnlich der von Agonist-gebundenem Rezeptor. Nichts desto trotz kann in der Gegenwart des Antagonisten der Rezeptor die Transkription nicht wirksam aktivieren. Folglich ist sowohl die Herauf- als auch die Herabregulierung auf diesem Weg möglich.
  • Die vorliegende Erfindung zeigt, dass Rezeptoren modifiziert werden können, um ihnen die Bindung an verschiedene Liganden zu ermöglichen, deren Struktur von den natürlich vorkommenden Liganden enorm abweicht. Kleine C-terminaie Veränderungen in der Aminosäuresequenz, einschließlich einer Verkürzung, führen zu einer veränderten Affinität und veränderten Funktion des Liganden. Durch Durchmusterung von Rezeptor-Mutanten können Rezeptoren maßgeschneidert werden, um auf Liganden zu reagieren, die die Wirtszell-eigenen Rezeptoren nicht aktivieren. Somit kann die Regulierung eines gewünschten Transgens unter Verwendung eines Liganden erreicht werden, der an einen maßgeschneiderten Rezeptor binden und ihn regulieren wird.
  • Steroidrezeptoren und andere Säuger-Transkriptionsregulatoren können in Hefe ihre Funktion ausüben. Diese Tatsache, gekoppelt mit der Leichtigkeit der genetischen Manipulation von Hefe, machen sie zu einem nützlichen System, um den Mechanismus der Steroidhormon-Wirkung zu untersuchen.
  • Ein lange empfundener Bedarf und Wunsch in diesem Fachgebiet wäre durch die Entwicklung von Methoden zur Identifizierung von Steroidhormon-Rezeptoragonisten und -antagonisten abzudecken. Die Entwicklung solch einer Methode wird die Identifizierung neuer therapeutischer Pharmazeutika erleichtern. Außerdem bietet die vorliegende Erfindung einen neuen Ansatz zur Regulierung der Transkription in der Gentherapie. Unter Verwendung modifizierter Steroidrezeptoren und maßgeschneiderter Liganden kann die Heraufregulierung und Herabregulierung von inserierten Nukleinsäuresequenzen erreicht werden.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in einem modifizierten Steroidhormon-Rezeptorprotein zur Unterscheidung von Hormonantagonisten und -agonisten. Für eine exakte Definition des modifizierten Steroidhormonrezeptors der vorliegenden Erfindung siehe unten.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in einem Plasmid, das einen modifizierten Hormonrezeptor enthält.
  • Eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in transfizierten Zellen, die modifizierte Hormonrezeptoren enthalten.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in einer transformierten Zelle, die modifizierte Hormonrezeptoren enthält.
  • Eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in einer Methode zur Bestimmung der agonistischen Aktivität einer Verbindung für Steroidhormonrezeptoren.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in einer Methode zur Bestimmung der antagonistischen Aktivität einer Verbindung für Steroidhormonrezeptoren.
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in einer Methode zur Bestimmung von endogenen Liganden für Steroidhormonrezeptoren.
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in einem endogenen Liganden für einen modifizierten Steroidrezeptor.
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in einem molekularen Schalter für die regulierte Expression einer Nukleinsäuresequenz in der Gentherapie.
  • Eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in einem molekularen Schalter, der nicht-natürliche Liganden, Anti-Hormone und nicht-native Liganden bindet.
  • Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in einem molekularen Schalter, der sich aus einem modifizierten Steroidrezeptor zusammensetzt.
  • Eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in einer Methode zur Regulierung der Expression der Nukleinsäuresequenz in der Gentherapie.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in einem modifizierten Progesteronrezeptor mit einer nativen Bindungsdomäne, die durch GAL-4-DNA ersetzt ist.
  • Eine zusätzliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in der Hinzufügung einer potenteren Aktivierungsdomäne zu dem Rezeptor.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht in einer Methode zur Behandlung von seniler Demenz oder Parkinson-Krankheit.
  • Somit wird in der Erfüllung der vorangegangenen Aufgaben gemäß eines Aspekts der vorliegenden Erfindung ein mutiertes Steroidhormon-Rezeptorprotein bereitgestellt. Dieses mutierte Steroidhormon-Rezeptorprotein ist zur Unterscheidung eines Steroidhormon-Rezeptorantagonisten von einem Steroidhormon-Rezeptoragonisten fähig.
  • Zu Steroidhormonrezeptoren zählen Östrogen-, Progesteron-, Androgen-, Vitamin D-, COUP-TF-, cis-Retinoesäure-, Nurr-1-, Schilddrüsenhormon-, Mineralkortikoid-, Glukokortikoid-α-, Glukokortikoid-β-, Ecdysteron- und Waisen-(Orphan)-Rezeptoren.
  • Der mutierte Steroidrezeptor der vorliegenden Erfindung weist eine mutierte Progesteronrezeptor-Ligandenbindungsdomäne auf, wobei die Mutation eine Deletion von bis zu 60 Aminosäuren von dem Carboxy-terminalen Ende der Ligandenbindungsdomäne umfasst, die Bindungsfähigkeit verliert an oder keine Transkriptionsaktivität zeigt durch einen Agonisten eines Wildtyp-Progesteron-Hormonrezeptors und die Affinität beibehält zu oder die Transkriptionsaktivität induziert durch ein Anti-Progestin des Wildtyp-Progesteron-Hormonrezeptors.
  • In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird einer Nukleinsäure bereitgestellt, die ein mutiertes Steroidhormon-Rezeptorprotein der Erfindung codiert.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Plasmid bereitgestellt, das eine Nukleinsäure enthält, die ein mutiertes Steroidhormon-Rezeptorprotein codiert. Das Plasmid der vorliegenden Erfindung ist, wenn in eine Zelle transfiziert, in der Bestimmung der relativen antagonistischen oder agonistischen Aktivität einer Verbindung für einen Steroidhormonrezeptor nützlich.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden transfizierte und transformierte Zellen bereitgestellt, die ein Plasmid enthalten, in das eine Nukleinsäure, die ein mutiertes Steroidhormon-Rezeptorprotein der Erfindung codiert, inseriert worden ist. Die transfizierten Zellen der vorliegenden Erfindung sind bei Methoden zur Bestimmung der Aktivität einer Verbindung für einen Steroidhormonrezeptor nützlich.
  • Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst Methoden zur Bestimmung, ob eine Verbindung eine Aktivität als ein Agonist für einen Steroidhormonrezeptor aufweist. Diese Methoden umfassen das Kontaktieren der Verbindung von Interesse mit den transfizierten Zellen der vorliegenden Erfindung und das Messen der Transkriptionshöhen, die durch die Verbindung induziert werden, zur Bestimmung der relativen Agonist-Aktivität des Steroidhormon-Rezeptors.
  • In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung wird eine Methode zur Bestimmung eines Liganden für einen mutierten Steroidhormonrezeptor bereitgestellt. Diese Methode umfasst das Kontaktieren einer Verbindung mit den transfizierten Zellen der vorliegenden Erfindung und das Messen der Transkriptionshöhen, die durch die Verbindung induziert sind.
  • Ebenfalls hierin beschrieben ist die Bereitstellung von endogenen Liganden für modifizierte Steroidhormonrezeptoren, die zur Stimulierung der Transkription in der Gegenwart der transfizierten Zellen der vorliegenden Erfindung fähig sind.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem molekularen Schalter für die Regulierung der Expression einer Nukleinsäuresequenz in der Gentherapie bei Menschen und Tieren. Er ist auch als ein molekularer Schalter in Pflanzen und in transgenen Tieren nützlich. Der molekulare Schalter setzt sich aus einem mutierten Steroidrezeptor der Erfindung zusammen, welcher eine natürliche Progesteronrezeptor-DNA-Bindungsdomäne in Bindung an die mutierte Ligandenbindungsdomäne enthält.
  • Die native DNA-Bindungsdomäne kann in unmodifizierter Form verwendet werden, und die Ligandenbindungsdomäne kann modifiziert werden, um lediglich eine Verbindung zu binden, die ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus nicht-natürlichen Liganden, Anti-Hormonen und nicht-nativen Liganden.
  • Spezifische Beispiele der Verbindungen, die an die Ligandenbindungsdomäne binden, umfassen 5-Alpha-Pregnan-3,20-dion; 11β-(4-Dimethylaminophenyl)-17β- hydroxy-17α-propinyl-4,9-estradien-3-on; 11β-(4-Dimethylaminophenyl)-17α-hydroxy-17β-(3-hydroxypropyl)-13α-methyl-4,9-gonadien-3-on; 11β-(4-Acetylphenyl)17β-hydroxy-17α-(1-propinyl)-4,9-estradien-3-on; 11β-(4-Dimethylaminophenyl)-17β-hydroxy-17α-(3-hydroxy-1(Z)-propenyl-estra-4,9-dien-3-on; (7β,11β,17β)-11-(4-Dimethylaminophenyl)-7-methyl-4',5'-dihydrospiro[ester-4,9-dien-17,2'(3'H)-furan]-3-on; (11β,14β,17α)-4',5'-Dihydro-11-(4-dimethylaminophenyl)-[spiroestra-4,9-dien-17,2'(3'H)-furan]-3-on.
  • In bevorzugten Ausführungsformen des molekularen Schalters sind bei dem modifizierten Steroidrezeptor sowohl die Ligandenbindungsdomäne als auch die DNA-Bindungsdomäne ersetzt. Zum Beispiel ist die natürliche DNA-Bindungsdomäne durch eine DNA-Bindungsdomäne ersetzt, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus GAL-4-DNA, Virus-DNA-Bindungsstelle, Insekten-DNA-Bindungsstelle und eine Nicht-Säuger-DNA-Bindungsstelle.
  • In spezifischen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann der molekulare Schalter außerdem Transaktivierungsdomänen enthalten, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus VP-16, TAF-1, TAF-2, TAU-1 und TAU-2.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform weist der molekulare Schalter einen modifizierten Progesteronrezeptor auf, der eine modifizierte Ligandenbindungsdomäne und eine GAL-4-DNA-Bindungsdomäne enthält. Dieser molekulare Schalter kann auch durch die Hinzufügung einer TAF-1- oder VP16-Transaktivierungsdomäne verstärkt werden.
  • Ebenfalls hierin beschrieben ist eine Methode zur Regulierung der Expression einer Nukleinsäurekassette in der Gentherapie. Die Methode umfasst den Schritt des Bindens des molekularen Schalters an eine in der Gentherapie verwendete Nukleinsäurekassette. Eine ausreichende Dosis der Nukleinsäurekassette mit dem angelagerten molekularen Schalter wird dann in ein zu behandelndes Tier oder Menschen eingeführt. Der molekulare Schalter kann dann durch Dosieren des Tiers oder Menschen mit einem Liganden, der an die modifizierte Bindungsstelle bindet, heraufreguliert oder herabreguliert werden.
  • Andere und weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile werden aus der folgenden Beschreibung der derzeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung erkennbar werden, die zu Zwecken der Beschreibung, wenn in Verbindung mit den begleitenden Zeichnungen betrachtet, angegeben sind.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • 1 zeigt die Mutagenese und die Screening-Strategie, die bei den vorliegenden Experimenten angewendet wurde.
  • 2A, 2B und 2C veranschaulichen die funktionelle und strukturelle Charakterisierung der UP-1-Mutante.
  • 3 zeigt eine Western-Analyse des mutierten humanen Progesteronrezeptors.
  • 4 zeigt die Transkriptionsaktivität und Hormonbindungsanalyse der Wildtyp- und mutierten humanen Progesteronrezeptor-Konstrukte.
  • 5A, 5B und 5C zeigen die Spezifität der Transkriptionsaktivität des mutierten humanen Progesteronrezeptors.
  • 6 zeigt die transiente Transfektion von mutiertem humanem Progesteronrezeptor in Säugerzellen.
  • Die Zeichnungen sind nicht notwendigerweise maßstabsgetreu. Bestimmte Merkmale der Erfindung können in größerem Maßstab oder in schematischer Form im Interesse der Klarheit und Prägnanz gezeigt sein.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Es wird für einen Fachmann des Gebiets ohne weiteres erkennbar sein, dass verschiedene Substitutionen und Modifikationen an der hierin beschriebenen Erfindung vorgenommen werden können.
  • Definitionen:
  • Der Begriff "Steroidhormonrezeptor-Superfamilie", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Superfamilie der Steroidrezeptoren, von denen einige bekannte Steroidrezeptoren sind, deren Primärsequenz nahe legt, dass sie miteinander verwandt sind. Zu repräsentativen Beispielen solcher Rezeptoren zählen die Östrogen-, Progesteron-, Glukokortikoid-α-, Glukokortikoid-β-, Mineralkortikoid-, Androgen-, Schilddrüsenhormon-, Retinoesäure-, Retinoid X-, Vitamin D-, COUP-TF-, Ecdyson-, Nurr-1- und Waisen-Rezeptoren.
  • Die Rezeptoren setzen sich aus einer DNA-Bindungsdomäne und einer Ligandenbindungsdomäne zusammen. Die DNA-Bindungsdomäne enthält die Rezeptorregulierende Sequenz und bindet an DNA, und die Ligandenbindungsdomäne bindet an die spezifische biologische Verbindung (Ligand), um den Rezeptor zu aktivieren.
  • Der Begriff "Waisen-(Orphan)-Rezeptoren", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Familie von etwa 20 Rezeptoren, deren primäre Aminosäuresequenz mit der primären Aminosäuresequenz des Steroidhormonrezeptors eng verwandt ist. Sie werden als Orphan-Rezeptoren bezeichnet, da kein Ligand identifiziert worden ist, der irgendeines der Mitglieder dieser Familie direkt aktiviert.
  • "A- und B-Formen des Progesteronrezeptors" stellen zwei unterschiedliche Formen des Progesteronrezeptors dar, die von demselben Gen abgeleitet sind. Der Vorgang für die Entstehung der Produkte kann eine alternative Initiation der Transkription, können Unterschiede durch alternatives Splicing oder kann auf die Promotorstruktur bezogen sein.
  • "Östrogen-responsives Element" ist eine synthetische oder natürlich vorkommende DNA-Sequenz, die bei Platzierung in einen heterologen Promotor diesem Promotor in der Gegenwart von Östrogen-aktiviertem Östrogenrezeptor eine Östrogenresponsivität verleihen kann.
  • Der Begriff "Ligand" bezieht sich auf jegliche Verbindung, die den Rezeptor aktiviert, gewöhnlich durch Interaktion mit (Bindung) der Ligandenbindungsdomäne des Rezeptors. Ligand kann allerdings auch Verbindungen umfassen, die den Rezeptor ohne Bindung aktivieren.
  • "Agonist" ist eine Verbindung, die mit dem Steroidhormonrezeptor interagiert, um eine transkriptionelle Reaktion zu fördern. Ein Beispiel für das Östrogen ist ein Agonist für den Östrogenrezeptor; Verbindungen, die Östrogen nachahmen, wären als Steroidhormon-Rezeptoragonisten definiert.
  • "Agonist" ist eine Verbindung, die mit einem Steroidhormonrezeptor interagiert oder daran bindet und die Aktivität eines Rezeptoragonisten blockiert.
  • Der Begriff "nicht-natürliche Liganden" bezieht sich auf Verbindungen, die in Tieren oder Menschen normalerweise nicht gefunden werden und die an die Ligandenbindungsdomäne eines Rezeptors binden.
  • Der Begriff "Anti-Hormone" bezieht sich auf Verbindungen, die Rezeptorantagonisten sind. Das Anti-Hormon ist von umgekehrter Aktivität zu einem Hormon.
  • Der Begriff "nicht-native Liganden" bezieht sich auf solche Liganden, die normalerweise nicht in dem spezifischen Organismus (Mensch oder Tier), für den eine Gentherapie erwogen wird, gefunden werden. Zum Beispiel werden bestimmte Insektenhormone, wie etwa Ecdyson, nicht in Menschen gefunden. Dies stellt ein Beispiel eines nicht-nativen Hormons für einen Menschen oder Tier dar.
  • Zu Beispielen der nicht-natürlichen Liganden, Anti-Hormone und nicht-nativen Liganden zählen die Folgenden: 11β-(4-Dimethylaminophenyl)-17β-hydroxy-17α-propinyl-4,9-estradien-3-on (RU38486 oder Mifepriston); 11β-(4-Dimethylaminophenyl)-17α-hydroxy-17β-(3-hydroxypropyl)-13α-methyl-4,9-gonadien-3-on (ZK98299 oder Onapriston); 11β-(4-Acetylphenyl)-17β-hydroxy-17α-(1-propinyl)-4,9-estradien-3-on (ZK112993); 11β-(4-Dimethylaminophenyl)-17β-hydroxy-17α-(3-hydroxy-1(Z)-propenyl-estra-4,9-dien-3-on (ZK98734); (7β,11β,17β)-11-(4-Dimethylaminophenyl)- 7-methyl-4',5'-dihydrospiro[ester-4,9-dien-17,2'(3'H)-furan]-3-on (Org31806); (11β,14β,17α)-4',5'-Dihydro-11-(4-dimethylaminophenyl)-[spiroestra-4,9-dien-17,2'(3'H)-furan]-3-on (Org31376); 5-Alpha-Pregnan-3,20-dion.
  • Der Begriff "genetisches Material", wie hierin verwendet, bezieht sich auf benachbarte Fragmente von DNA oder RNA. Das genetische Material, welches in Zielzellen gemäß den hierin beschriebenen Methoden eingeführt werden kann, kann irgendeine DNA oder RNA sein. Zum Beispiel kann die Nukleinsäure sein: (1) normalerweise in den angezielten Zellen zu finden, (2) normalerweise in den angezielten Zellen zu finden, doch nicht in physiologisch geeigneten Mengen in den angezielten Zellen exprimiert, (3) normalerweise in den angezielten Zellen zu finden, doch nicht in optimalen Mengen bei bestimmten pathologischen Bedingungen exprimiert, (4) neue Fragmente der Gene, die normalerweise in den angezielten Zellen exprimiert oder nicht exprimiert sind, (5) synthetische Modifikationen der Gene, die innerhalb der angezielten Zellen exprimiert oder nicht exprimiert sind, (6) jegliche andere DNA, die zur Expression in den angezielten Zellen modifiziert sein kann, und (7) jegliche Kombination der obigen.
  • Der Begriff "Nukleinsäurekassette", wie hierin verwendet, bezieht sich auf das genetische Material von Interesse, das ein Protein, oder ein Peptid, exprimieren kann, oder RNA nach ihrer transienten, permanenten oder episomalen Aufnahme in eine Zelle. Die Nukleinsäurekassette ist positionell und sequenziell in einem Vektor mit anderen erforderlichen Elementen orientiert, so dass die Nukleinsäure in der Kassette transkripiert, und wenn erforderlich, in die Zellen translatiert werden kann.
  • "Mutante" bezieht sich auf eine Veränderung der Primärsequenz eines Rezeptors, so dass sie von der Wildtyp- oder natürlich vorkommenden Sequenz abweicht. Das mutierte Steroidhormon-Rezeptorprotein, wie in der vorliegenden Beschreibung verwendet, kann eine Mutante irgendeines Mitglieds der Steroidhormonrezeptor-Superfamilie sein. Zum Beispiel kann ein Steroidrezeptor durch Deletion von Aminosäuren an dem Carboxy-terminalen Ende des Proteins mutiert sein. Generell liefert eine Deletion von etwa 1 bis etwa 120 Aminosäuren von dem Carboxy-terminalen Ende des Proteins eine Mutante. Ein Fachmann mit üblicher Sachkenntnis in diesem Gebiet wird jedoch erkennen, dass eine kürzere Deletion der Carboxy-terminalen Aminosäuren erforderlich sein wird, um nützliche Mutanten bestimmter Steroidhormon-Rezeptorproteine zu schaffen. Zum Beispiel wird eine Mutante des Progesteronrezeptor-Proteins eine Carboxy-terminale Aminosäure-Deletion von etwa 1 bis etwa 60 Aminosäuren enthalten. In einer bevorzugten Ausführungsform werden 42 Carboxy-terminale Aminosäuren aus dem Progesteronrezeptor-Protein deletiert.
  • "Nullmutation" ist eine genetische Läsion an einem Genlocus, die das Genprodukt vollständig inaktiviert.
  • Der Begriff "Plasmid", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Konstruktion, die sich aus extrachromosomalem genetischen Material zusammensetzt, gewöhnlich einer zirkulären Doppelhelix der DNA, das unabhängig von der chromosomalen DNA replizieren kann. Plasmide werden beim Gentransfer als Vektoren verwendet. Zu Plasmiden, die bei der vorliegenden Erfindung hilfreich sind, zählen Plasmide, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus UP-1, YEphPR-A879, YEphPR-A891, Y-EphPR-B891, YEphPR-B879, phPR-A879, phPR-A891, phPR-B879 and phPR-B891. Der molekulare Schalter und die Nukleinsäurekassette können als separate Plasmide bereitgestellt werden.
  • Der Begriff "Vektor", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Konstruktion, die sich aus einem genetischen Material zusammensetzt, das zur Steuerung der Transformation einer angezielten Zelle designed ist. Ein Vektor enthält vielfache genetische Elemente, die positionell und sequenziell mit anderen erforderlichen Elementen orientiert sind, so dass die Nukleinsäure in einer Nukleinsäurekassette transkribiert, und wenn erforderlich, in die transfizierten Zellen translatiert werden kann. Bei der vorliegenden Erfindung umfasst der bevorzugte Vektor die folgenden Elemente, die sequenziell in geeignetem Abstand verknüpft sind, um die funktionelle Expression zu ermöglichen: einen Promotor; eine 5'-mRNA-Leader Sequenz, eine Initiationsstelle; eine Nukleinsäurekassette, die die zu exprimierende Sequenz enthält; eine 3'-untranslatierte Region; und ein Polyadenylierungssignal.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Expressionsvektor" auf ein DNA-Plasmid, das all die erforderliche Information enthält, um ein rekombinantes Protein in einer heterologen Zelle zu produzieren.
  • Der Begriff "Vehikel", wie hierin verwendet, bezieht sich auf ein nicht-genetisches Material in Kombination mit dem Vektor in einer Lösung oder Suspension, was die Aufnahme, Stabilität und Expression des genetischen Materials in den angezielten Zellen erhöht. Zu Beispielen eines Vehikels zählen: Sukrose, Protamin, Polybren, Spermidin, Polylysin, weitere Polykationen, Proteine, CaPO4-Präzipitate, lösliche und unlösliche Partikel oder Matrizes für die verzögerte Freisetzung von genetischem Material. Die Proteine können ausgewählt sein aus der Gruppe, umfassend Laktoferrin, Histon, natürliche oder synthetische DNA-bindende Proteine, natürliche oder synthetische DNA-bindende Verbindungen, virale Proteine, nicht-virale Proteine oder jegliche Kombinationen von diesen. Außerdem können sich Vehikel aus synthetischen Verbindungen zusammensetzen, die sowohl an DNA binden, als auch als Liganden für normale Rezeptoren an den angezielten Zeilen fungieren.
  • Der Begriff "transformiert", wie hierin verwendet, bezieht sich auf transiente, stabile oder persistente Veränderungen in den Charakteristika (exprimierter Phänotyp) einer Zelle durch den Mechanismus des Gentransfers. Genetisches Material wird in eine Zelle in einer Form eingeführt, wo es ein spezifisches Genprodukt exprimiert oder die Expression oder Wirkung von endogenen Genprodukten verändert. Ein Fachmann des Gebiets erkennt ohne weiteres, dass die Nukleinsäurekassette in die Zellen durch eine Vielfalt von Verfahrensweisen eingeführt werden kann, einschließlich der Transfektion und Transduktion.
  • Der Begriff "Transfektion", wie hierin verwendet, bezieht sich auf den Prozess der Einführung eines DNA-Expressionsvektors in eine Zelle. Verschiedene Methoden der Transfektion sind möglich, einschließlich der Mikroinjektion, CaPO4-Präzipitation, Liposomenfusion (z.B. Lipofektion) oder Verwendung einer Genpistole.
  • Der Begriff "Transduktion", wie hierin verwendet, bezieht sich auf den Prozess der Einführung von rekombiniertem Virus in eine Zelle durch Infizieren der Zelle mit ei nem Viruspartikel. Bei der vorliegenden Erfindung enthält das rekombinierte Virus eine Nukleinsäurekassette.
  • Der Begriff "transient", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Einführung von genetischem Material in eine Zelle, um spezifische Proteine, Peptide oder RNA etc. zu exprimieren. Das eingeführte genetische Material wird nicht in das Wirtszellgenom integriert oder repliziert und wird daher von der Zelle über einen gewissen Zeitraum hinweg eliminiert.
  • Der Begriff "stabil", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Einführung von genetischem Material in das Chromosom der angezielten Zelle, wo es integriert wird und zu einer permanenten Komponente des genetischen Materials in jener Zelle wird. Die Genexpression nach der stabilen Transduktion kann die Eigenschaften der Zelle permanent verändern, was zu einer stabilen Transformation führt.
  • Der Begriff "persistent", wie hierin verwendet, bezieht sich auf die Einführung von Genen in die Zelle zusammen mit genetischen Elementen, die eine episomale (extrachromosomale) Replikation ermöglichen. Dies kann zu einer offensichtlich stabilen Transformation der Charakteristika der Zelle ohne die Integration des neuen genetischen Materials in das Chromosom der Wirtszelle führen.
  • Der Begriff "pharmakologische Dosis", wie hierin mit einem Vektor/molekularen Schalter-Komplex verwendet, bezieht sich auf eine Dosis des Vektors und eine Höhe der Genexpression, die aus der Wirkung des Promotors auf die Nukleinsäurekassette resultiert, wenn in den entsprechenden Zelltyp eingeführt, was ausreichend Protein, Polypeptid oder Antisense-RNA produzieren wird, um entweder (1) die Menge der Proteinproduktion zu erhöhen, (2) die Produktion eines Protein herabzusetzen oder zu beenden, (3) die Wirkung eines Proteins zu hemmen, (4) die Proliferation oder Anhäufung spezifischer Zelltypen zu hemmen, oder (5) die Proliferation oder Anhäufung spezifischer Zelltypen zu induzieren. Die Dosis wird von dem zu exprimierenden Protein, dem Promotor, der Aufnahme und der Wirkung der Protein-RNA abhängen. Für jegliches gegebene Set von Parametern wird ein Fachmann des Gebiets zur Bestimmung der Dosis in der Lage sein.
  • Der Begriff "pharmakologische Dosis", wie hierin mit einem Liganden verwendet, bezieht sich auf eine Dosis eines Liganden, die ausreichend ist, um entweder die Heraufregulierung oder Herabregulierung der Nukleinsäurekassette zu bewirken. Somit wird eine ausreichende Menge an Ligand vorhanden sein, so dass er an den Rezeptor in den entsprechenden Zellen binden wird, um die Nukleinsäurekassette zu regulieren. Die spezifische Dosis jeglichen Ligands wird von den Eigenschaften des Liganden abhängen, der in die Zelle gelangt, an den Rezeptor bindet und dann an die DNA bindet, und von der Menge an zu exprimierendem Protein und dem erforderlichen Umfang der Heraufregulierung oder Herabregulierung. Für jegliches gegebene Set von Parameter wird ein Fachmann des Gebiets zur Bestimmung der entsprechenden Dosis für jeglichen, als einem molekularen Schalter zu verwendenden Rezeptor fähig sein.
  • Die "Plasmid-Aktivität" stellt eine phänotypische Konsequenz dar, die sich spezifisch auf die Einführung eines Plasmids in ein Assay-System bezieht.
  • "Transkriptionelle Aktivität" stellt ein relatives Mail des Grads der RNA-Polymerase-Aktivität eines bestimmten Promotoren dar.
  • "Rezeptoraktivität" stellt eine phänotypische Konsequenz dar, die sich spezifisch auf die Einführung eines Rezeptors in ein Assay-System bezieht.
  • Die vorliegende Erfindung stellt mutierte Steroidhormon-Rezeptorproteine bereit. Diese mutierten Steroidhormon-Rezeptorproteine sind zur Unterscheidung fähig, und sind bei Methoden zur Unterscheidung eines Steroidhormon-Rezeptorantagonisten von einem Steroidhormon-Rezeptoragonisten nützlich.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem Plasmide bereit, die Nukleinsäuren enthalten, die mutierte Steroidhormon-Rezeptorproteine codieren. Die hierin beschriebenen Plasmide können Nukleinsäuren enthalten, die mutierte Proteine jeglicher der Hormone in der Steroidhormonrezeptor-Superfamilie codieren.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem transfizierte Zellen bereit, die Plasmide mit Nukleinsäuren enthalten, die darin eingeführte mutierte Steroidhormon-Rezeptorproteine codieren. Zu nützlichen Zellen für die Transfektion zählen Hefe-, Säuger- und Insektenzellen.
  • In einer spezifischen Ausführungsform ist die Hefe Saccharomyces cerevisiae. In einer spezifischen Ausführungsform ist die Säugerzelle ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus HeLa, CV-1, COSM6, HepG2, CHO und Ros 17.2. In einer spezifischen Ausführungsform sind die Insektenzellen üblicherweise ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus SF9, Drosophilia, Schmetterling und Biene.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem stabile Zelllinien bereit, die mit den Plasmiden der vorliegenden Erfindung transformiert sind.
  • Die Plasmide und transfizierten Zellen der vorliegenden Erfindung sind bei Methoden zur Bestimmung dessen nützlich, ob eine Verbindung eine antagonistische oder agonistische Aktivität bei einem Steroidhormonrezeptor aufweist. Diese Methode umfasst das Kontaktieren einer Verbindung von Interesse mit einer transfizierten Zelle der vorliegenden Erfindung. Wenn die Verbindung die Transkription induziert, so ist sie ein Steroidhormon-Rezeptorantagonist. Wird keine Transkription induziert, so kann die Verbindung ein Steroidhormon-Rezeptoragonist sein.
  • Die vorliegende Erfindung stellt außerdem eine Methode zur Bestimmung eines endogenen Liganden für ein Steroidhormon-Rezeptorprotein bereit. Diese Methode umfasst das anfängliche Kontaktieren einer Verbindung mit einer transfizierten Zelle der vorliegenden Erfindung. Anschließend wird der durch die Verbindung induzierte Transkriptionsumfang gemessen. Je höher der Transkriptionsumfang, um so stärker der Hinweis, dass die Verbindung ein endogener Ligand des spezifisch getesteten Rezeptors ist.
  • Außerdem werden hierin endogene Liganden für Steroidhormon-Rezeptorproteine beschrieben. Ein endogener Ligand für ein Steroidhormon-Rezeptorprotein ist zur Stimulierung der Transkription in der Gegenwart einer transfizierten Zelle der vorlie genden Erfindung fähig. Der endogene Ligand bindet an den mutierten Steroidrezeptor der vorliegenden Erfindung und stimuliert die Transkription in Zellen, die den mutierten Rezeptor enthalten.
  • Eine andere alternative Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in einem molekularen Schalter zur Regulierung der Expression einer heterologen Nukleinsäuresequenz in der Gentherapie.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst der molekulare Schalter zur Regulierung der Expression einer heterologen Nukleinsäurekassette in der Gentherapie einen modifizierten Steroidrezeptor, der eine natürliche Progesteronrezeptor-DNA-Bindungsdomäne angelagert an eine modifizierte Ligandenbindungsdomäne enthält. In der bevorzugten Ausführungsform des molekularen Schalters bindet die modifizierte Bindungsdomäne gewöhnlich lediglich Ligandverbindungen, die nicht-natürliche Liganden, Anti-Hormone oder nicht-native Liganden sind. Ein Fachmann des Gebiets wird ohne weiteres erkennen, dass die modifizierte Ligandenbindungsdomäne an native Liganden binden kann, doch dass eine insignifikante Bindung erfolgt und somit eine sehr geringe Regulierung, wenn überhaupt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist der modifizierte Steroidrezeptor ein Progesteron-Rezeptor, bei dem die DNA-Bindungsdomäne durch eine DNA-Bindungsdomäne ersetzt ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus GAL-4-DNA, Virus-DNA-Bindungsstelle, Insekten-DNA-Bindungsstelle und einer Nicht-Säuger-DNA-Bindungsstelle.
  • Der molekulare Schalter kann außerdem durch die Hinzufügung einer Transaktivierungsdomäne modifiziert werden. Die Transaktivierungsdomänen, die gewöhnlich verwendet werden, umfassen VP-16, TAF-1, TAF-2, TAU-1 und TAU-2. Ein Fachmann des Gebiets wird ohne weiteres erkennen, dass eine Vielfalt weiterer Transaktivierungsdomänen zur Verfügung steht.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform weist der Progesteron-Rezeptor als der modifizierten Ligandenbindungsdomäne eine GAL-4-DNA-Bindungsdomäne und eine Transaktivierungsdomäne, wie z.B. TAF-1, auf.
  • In einer weiteren Ausführungsform ist bei dem Progesteron-Rezeptor die Ligandenbindungsdomäne durch eine Ecdyson-Bindungsdomäne ersetzt. Auch hier kann die Funktion dieses molekularen Schalters durch Hinzufügung einer TAF-1-Transaktivierungsdomäne verstärkt werden.
  • Ein Fachmann des Gebiets wird ohne weiteres erkennen, dass der molekulare Schalter durch die Wahl der entsprechenden Transaktivierungsdomänen, der Ligandenbindungsdomänen und der DNA-Bindungsdomänen gewebespezifisch gemacht werden kann. Insbesondere erkennt ein Fachmann des Gebiets ohne weiteres, dass durch Hinzufügen einer Transaktivierungsdomäne, die für ein gegebenes Gewebe spezifisch ist, der molekulare Schalter lediglich in jenem Gewebe funktionieren wird. Auch wird die Addition eines gewebespezifischen cis-Elements zu dem Zielgen in der Schaffung der gewebespezifischen Expression hilfreich. sein.
  • Hierin beschrieben ist eine Methode zur Regulierung der Genexpression einer Nukleinsäurekassette in der Gentherapie. Diese Methode umfasst den Schritt des Bindens des molekularen Schalters an eine in der Gentherapie verwendete Nukleinsäurekassette. Vorzugsweise ist die Nukleinsäuresequenz, die exprimiert wird, heterolog. Die kombinierte Nukleinsäurekassette/molekularer Schalter wird dann in einer pharmakologischen Dosis an ein zu behandelndes Tier oder Mensch oder an ein transgenes Tier oder an eine Pflanze verabreicht.
  • Ein Fachmann des Gebiets wird ohne weiteres erkennen, dass die kombinierte Nukleinsäurekassette/molekularer Schalter in die Zelle in einer Vielfalt von Weisen sowohl in vivo als auch ex vivo eingeführt werden kann. Die Einführung kann durch Transfektion oder Transduktion erfolgen. Nachdem die Nukleinsäurekassette/molekularer Schalter in die Zelle eingeführt ist, kann die Kassette in der resultierenden transformierten Zelle entweder heraufreguliert (angeschaltet) oder herabreguliert (abgeschaltet) werden, indem in das Tier oder den Menschen eine pharmakolo gische Dosis eines Liganden eingebracht wird, welcher die modifizierte Ligandenbindungsstelle bindet.
  • Ebenfalls hierin beschrieben ist eine Methode zur Regulierung der Expression der Nukleinsäurekassette in der Gentherapie, umfassend den Schritt des Knöpfens eines molekularen Schalters an eine Nukleinsäureskassette. Dieser molekulare Schalter/Nukleinsäurekassette wird in eine Zelle eingeführt, um eine transformierte Zelle zu bilden. Die transformierte Zelle wird dann in einer pharmakologischen Dosis in einen Menschen oder ein Tier für die Gentherapie eingeführt.
  • Der molekulare Schalter/Nukleinsäurekassette kann direkt in vivo in eine angezielte Zelle für die Gentherapie injiziert werden.
  • Zum Beispiel enthält in der Behandlung von seniler Demenz oder Parkinson-Krankheit eine Nukleinsäurekassette innerhalb dieser Nukleinsäurekassette einen Wachstumsfaktor, Hormon oder Neurotransmitter und ist die Zelle eine Gehirnzelle. Die nackte Gehirnzelle, die die Kassette enthält, kann in eine durchlässige Struktur eingekapselt werden. Die nackte Gehirnzelle oder die durchlässige Struktur, die die Gehirnzelle enthält, wird dann in das zu behandelnde Tier oder den Menschen eingeführt. Die durchlässige Struktur ist dazu in der Lage, den Durchgang nach innen oder nach außen von Aktivatoren des molekularen Schalters und der Wachstumsfaktoren zuzulassen, verhindert aber den Durchgang von Angreiferzellen, die interagieren würden mit den implantierten Gehirnzellen und diese zerstören würden. In diesem Beispiel ist es wichtig, die Gehirnzellen einzukapseln, da die Einführung nackter Gehirnzellen oftmals zu einem Angriff durch das körpereigene Abwehrsystem und zu einer Zerstörung dieser Zellen führt. Ein Fachmann des Gebiets erkennt, dass eine Vielfalt von Einkapselungsverfahren und Strukturen im Fachgebiet zur Verfügung steht.
  • In der Behandlung von seniler Demenz oder Parkinson-Krankheit wird festgestellt, dass der molekulare Schalter in der bevorzugten Ausführungsform einen Progesteron-Rezeptor enthält, bei dem die eingetauschte modifizierte Ligandenbindungsdomäne an eine GAL-4-DNA angelagert ist. Ein Wachstumsfaktor wird in der transfor mierten Zelle durch Verabreichen einer pharmakologischen Dosis eines entsprechenden Liganden zum Anschalten des molekularen Schalters (Heraufregulieren) an das zu behandelnde Tier oder Mensch produziert. Zum Beispiel kann ein Anti-Progesteron, wie etwa RU38486, verabreicht werden. Die Menge an produziertem Wachstumsfaktor ist proportional zu der verabreichten Dosis an Ligand. Ein Fachmann des Gebiets wird zur Bestimmung einer pharmakologischen Dosis in Abhängigkeit von dem verwendeten molekularen Schalter und dem verwendeten Liganden fähig sein.
  • Eine weitere Methode verwendet ein duales System von Agonist/Antagonist-Paaren. Bei diesem System wird ein maßgeschneiderter Heraufregulierungs-Ligand gewählt und wird die gewünschte Rezeptor-Mutation oder die modifizierten Rezeptoren erzeugt. Dann wird eine zweite Runde des Liganden-Screenings und der Mutation vorgenommen, um einen Rezeptor zu entwickeln, der außerdem an einen spezifischen, selektiven Herabregulierungs-Liganden bindet. Vorzugsweise teilen die Liganden einen normalen metabolischen Clearance-Weg der endogenen Liganden des Wirts, wodurch Probleme der Toxizität und einer langen Halbwertszeit vermieden werden. In dem Screening-Prozess können entweder Hefe, Tier- oder Insektenzellen verwendet werden. Vorzugsweise werden Hefezellen verwendet.
  • Über die Wahl der Transaktivierungselemente und Rezeptoren für die Gewebespezifität hinaus erkennt ein Fachmann des Gebiets ebenso, dass eine Gewebespezifität mit spezifischen Liganden erreicht werden kann. Zum Beispiel können Liganden gewählt werden, die lediglich in bestimmten Geweben aufgrund der Anforderungen an die abschließende Umwandlung zu aktiven Metaboliten wirken. Ein synthetisches Androgen, welches an einen transfizierten Androgenrezeptor bindet, wird hergestellt. Dieses Androgen erfordert jedoch den Metabolismus zu der 5-alpha-reduzierten Form, um aktiv zu sein. In dieser Weise sind lediglich klassische Androgen-Endorgane zur Metabolisierung des neuen Liganden zu seiner entsprechenden chemischen Form fähig. Weitere Zellen des Körpers, denen die 5-Alpha-Reduktase fehlt, werden das Transgen über diese Verbindung nicht aktivieren.
  • Alternativ wird ein Ligand, der lediglich dann aktiv ist, wenn er nicht zu der 5-Alpha-reduzierten Form weiter metabolisiert ist, verwendet. In diesem Fall wäre der Ligand lediglich in klassischen Androgen-Endorgang-Zellen aktiv. Da 5-Alpha-Reduktase-Inhibitoren die derzeit verfügbaren therapeutischen Mittel darstellen, können sie in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um eine vollständige Blockierung oder vollständige Aktivierung des Rezeptors, der die Ligandenroute streift, zu ermöglichen, wenn irgendeine Art von Notfall diesen Ansatz erforderlich machen würde.
  • Seitenketten sind gewöhnlich an bestimmten Positionen auf Liganden der Rezeptor-Superfamilie toleriert. Zum Beispiel kann die 7-Alpha-Position bestimmter Liganden, wie etwa Estradiol und Progesteron, an Seitenketten gebunden werden, und die Liganden werden nach wie vor an Rezeptoren binden. Es können geeignete Seitenketten verwendet werden, um die Löslichkeit, den Membrantransfer oder die Zielorgan-Zugänglichkeit entweder zu erhöhen oder einzuschränken. Somit können sogar spezifische Liganden geschaffen werden, die eine Gewebe-Bevorzugung zeigen. Zum Beispiel tritt das synthetische Steroid R5020 (17α,21-Dimethyl-19-nor-pregna-4,9-dien-3,20-dion) nicht in Gewebekulturzellen bei niedrigen Temperaturen ein, bei denen Progesteron freien Zutritt hat. Ein Fachmann des Gebiets erkennt ohne weiteres, dass weitere Modifikationen an den Liganden vorgenommen werden können, um sie auf ihre Verwendung als herauf- oder herabregulierende Mittel in der vorliegenden Erfindung maßzuschneidern.
  • Die folgenden Beispiele sind als Veranschaulichung angegeben und sollen in keinster Weise eine Beschränkung der Erfindung darstellen.
  • BEISPIEL 1
  • Der Homogenisierungspuffer für die Hormonbindungsassys enthielt 10 mM Tris-HCl, 1,5 mM EDTA, 1 mM Dithiothreitol, pH 7,4 (TESH Puffer). Der Homogenisierungspuffer für die Western-Analyse des Rezeptors enthielt 10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, 45 mM Dithiothreitol, 10% Glycerol und 300 mM NaCl (TEDG + Salze).
  • Hefe-Stamm
  • Der Saccharomyces cerevisiae-Stamm BJ3505 (MATα, pep4:HIS3, prb1-Δ1.6R, his3Δ200, lys2-801, trpl-ΔI0I, ura3-52, gal2, (CUP')) wurde verwendet (Yeast Genetic Stock Center, Berkeley, CA). Alle Hefetransformationen wurden gemäß dem Lithiumacetat-Transformationsprotokoll durchgeführt (Ito, et al., J. Bacteriol, 153:163-168, 1983).
  • Die PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung von YEphPR-B DNA-Template (ein YEp52AGSA-abgeleitetes Hefe-Expressionsplasmid, das die cDNA von hPR Form-B enthielt (Misrahi, et al., Biochem. Bioph. Res. Comm. 143:740-748, 1987), die stromabwärts des Hefe-Metallthionein-CUP1-Promotors eingeführt war und unter Verwendung dreier verschiedener Sätze von Primern durchgeführt. Um die genaue Übereinstimmung der Zweitstrang-Polymerisationsreaktion herabzusetzen, wurden Pufferbedingungen von 1,5 mM MgCl2, 0,1 mM dNTPs und pH 8,2 verwendet. Etwa 2000 primäre Transformanten wurden aus jeder Region-spezifischen Bibliothek erhalten.
  • BEISPIEL 2
  • Hefemutanten-Screening
  • Kolonien von jeder Bibliothek der hPR-Moleküle, die in spezifischen Subregionen mutiert waren, wurden gepoolt, große Mengen an DNA wurden präpariert und zur Transformierung der Hefezellen verwendet, die das Reporterplasmid YRpPC3GS+ trugen, welches zwei GRE/PRE-Elemente stromaufwärts des CYC1-Promotors, der geknüpft ist an das Lac-Z-Gen von E. coli, enthält (Mak, et al., J. Biol. Chem. 265:20085-20086, 1989). Die transformierten Zellen wurden auf 1,5 % Agarplatten, enthaltend 2 % Glukose, 0,5 % Casaminosäuren (5 % Lagerlösung von Casaminosäuren wird vor Verwendung immer autoklaviert, um das Tryptophan zu zerstören), 6,7 g/l Hefestickstoffbase (ohne Aminosäuren) und 100 μM CuSO4 (CAA/Cu-Platten) ausplattiert und für 2 Tage bei 30 °C gezüchtet. Diese Kolonien wurden dann auf CAA/Cu-Platten replikaplattiert, die 0,16 g/l an 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid (X-Gal, ein Indikator der β-Galaktosidaseaktivität) mit oder ohne die Hormone enthielten, wie angegeben in 1, und durften für einen Tag bei 30 °C, dann für zwei Tage bei Raumtemperatur im Dunklen, wachsen.
  • BEISPIEL 3
  • Wachstum der Hefekultur für in vitro-Assay
  • Saccharomyces cerevisiae-Zellen, die YEphPRB und das Reporterplasmid enthielten, wurden über Nacht bei 30 °C in Minimalmedium, das 2 % Glukose enthielt, gezüchtet. Die Zellen wurden in frischem Medium subkultiviert und durften bis zur frühen midlog Phase (O.D.600nm = 1,0) wachsen. Die Induktion des Rezeptors wurde durch die Zugabe von 100 μm Kupfersulfat zu der Kultur eingeleitet. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation bei 1.500 × g für 10 Minuten geerntet und in dem entsprechenden Puffer resuspendiert. Dieser und alle anschließenden Schritte der Analyse der Hefeextrakte wurden bei 4 °C vorgenommen.
  • BEISPIEL 4
  • Transkripitions-Assay
  • Hefezellen, die den Reporter und Expressionsplasmide enthielten, wurden über Nacht wie oben in Beispiel 3 beschrieben in der Gegenwart von 100 μm Kupfersulfat gezüchtet. Als die Zelldichte eine O.D.600nm = 1,0 erreichte, wurden die Hormone den Kulturen zugegeben. Nach einer 4-stündigen Inkubation wurden die Hefeextrakte präpariert und auf die β-Galaktosidase-Aktivität untersucht, wie zuvor beschrieben (Miller, J. M. Miller, Hrsg., 352-355, 1972).
  • Generell sind die bei der vorliegenden Erfindung nützlichen Reporter solche, die eine entsprechende Messung der Transkriptionshöhen erlauben. Zu bevorzugten Reportersystemen zählen Reportervektoren, die sich aus dem Hefe-iso-1-Cytochrom C-proximalen Promotorelement, fusioniert an ein Strukturgen, zusammensetzen, wobei das Strukturgen ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus β-Galaktosidase, Galaktokinase und URA3. Bevorzugter setzt sich der Vektor aus einer Insertionsstelle für ein Rezeptor-responsives Element zusammen. Die Vektoren, die β-Galaktokinase als einen Indikator der Transkriptionsaktivität enthalten, sind vom Stammvektor PC2 abgeleitet, wohingegen die Vektoren, die Galaktokinase enthalten, vom YCpR1-Vektor abgeleitet sind. Vorzugsweise stammen die Strukturgene von E. coli.
  • BEISPIEL 5
  • Western Immunoblotting
  • Die Hefezellen wurden wie in Beispiel 4 für den Transkriptions-Assay beschrieben gezüchtet. Die Hefeextrakte für die Western Blot-Analyse wurden durch Resuspendieren des Zellpellets in TEDG+Salzen präpariert. Die Zellsuspension wurde mit einem gleichen Volumen an Glaskügelchen gemischt und durch Vortexen in einem Mikrozentrifugier-Röhrchen aufgebrochen. Das Homogenat wurde bei 12.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde abgenommen, und die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung von Rinderserumalbumin als einem Standard bewertet. Die Hefeextrakte wurden auf einem 0,1 % Natriumdodecylsulfat – 7 % Polyacrylamidgel wieder aufgelöst und auf eine Immobilon-Membran übertragen, wie zuvor beschrieben (McDonnell, et al., Mol. Cell. Biol. 9:3517-3523, 1989). Der Festphasen-Radioimmunoassay wurde unter Verwendung eines monochlonalen Antikörpers (JZB39) vorgenommen, der gegen die N-terminale Domäne der A- und B-Formen des hPR gerichtet war.
  • BEISPIEL 6
  • Hormonbindungs-Kompetitionsassays
  • Die Induktion der PR-Synthese wurde durch die Zugabe von 100 μM CuSO4 zu der Kultur eingeleitet und die Inkubation wurde für 6 Stunden fortgesetzt. Das Zellpellet wurde in TESH-Puffer resuspendiert, der 1 μg/ml Leupeptin, 10 μg/ml PMSF und 10 μg/ml Pepstatin enthielt. Die Zellsuspension wurde mit einem gleichen Volumen an Glaskügelchen gemischt (0,5 mm; B. Braun Instruments) und durch Vortexen in einem Mikrozentrifugier-Röhrchen aufgebrochen. Das Homogenat wurde bei 12.000 × g für 10 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde weiter bei 100.000 × g für 30 Minuten zum Erhalt einer Cytosolfraktion zentrifugiert. Die verdünnten Hefeextrakte (200 μl), die 100 μg an Gesamtprotein enthielten, wurden über Nacht bei 4 °C mit [3H] Ligand in der Abwesenheit (Gesamtbindung) oder Gegenwart (nicht-spezifische Bindung) eines 100-fachen Überschusses an unmarkiertem Liganden inkubiert. Gebundene und freie Steroide wurden durch Zugabe von 500 μl Dextran beschichteter Kohlesuspension (0,5 % Norit A, 0,05 % Dextran, 10 mM Tris HCl, pH 7,4 und 1 mM EDTA) getrennt. Die spezifische Bindung wurde durch Subtrahieren der nicht-spezifischen von der Gesamtbindung bestimmt. Eine Scatchard-Analyse wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben von Mak, et al., J. Biol. Chem. 264:21613:21618 (1989).
  • BEISPIEL 7
  • Ortsgerichtete Mutagenese
  • Die Mutanten YEphPR-B879 und YEphPR-B891 wurde gemäß der Verfahrensweise präpariert, die beschrieben ist bei Dobson, et al., J. Biol. Chem. 264:4207-4211 (1989). CJ236-Zellen wurden mit mpPR90 (ein M13-Plasmid, das hPR cDNA enthält) infiziert. Die resultierende Uridin-enthaltende einzelsträngige DNA wurde mit 20-mer-Oligonukleotiden vereinigt, die ein TGA-Stoppcodon entsprechend den Aminosäuren 880 bzw. 892 enthielten.
  • BEISPIEL 8
  • Konstruktion der Säuger-Expressionsvektoren
  • Der Säuger-Expressionsvektor phPR-B enthielt die SV40 Enhancersequenz stromaufwärts des humanen Wachstumshormon-Promotoren, geknüpft an die hPR-B cDNA. Dieser Vektor wurde mit Salt und EcoRI verdaut. Das 6,1 kb-Fragment (das die Vektorsequenzen und die 5'-1,5 kb des hPR enthielt) wurde gelgereinigt und an das 2,1 kb-Fragment von YEphPR-B891 (das das 3'-Ende des Rezeptors enthielt) ligiert, das zuvor mit Salt und EcoRI geschnitten worden war. Das resultierende Plasmid, phPR-B891, codiert eine verkürzte Version der hPR-Form B von 42 Aminosäuren.
  • BEISPIEL 9
  • Transiente Säugerzell-Transfektionen und CAT-Assays
  • Fünf μg Chloramphenicolacetyltransferase-(CAT)-Reporterplasmid, das zwei Kopien eines PRE/GRE von dem Tyrosin-Aminotransferase-Gen enthielt, geknüpft an den Thymidinkinase-Promotor (PRETKCAT), wurden in transienten Cotransfektions-Experimenten zusammen mit 5 μg der Wildtyp- oder mutierten Rezeptor-DNAs verwendet. Die transienten Cotransfektionen und CAT-Assays wurden vorgenommen, wie beschrieben bei Tsai, et al., Cell 57:443-448 (1989).
  • BEISPIEL 10
  • Mutagenese der Hormonbindungsdomäne von hPR-B
  • Um Aminosäuren innerhalb der hPR HBD zu charakterisieren, die für die Ligandenbindung und die Hormon-abhängige Transaktivierung entscheidend sind, wurden Bibliotheken von mutierten hPR-Molekülen geschaffen und die Mutanten in ein rekonstituiertes Progesteron-responsives Transkriptionssystem in Hefe eingeführt. Dieses System erlaubt das Screening einer großen Anzahl an mutierten Klonen und die direkte, visuelle Identifizierung der Phänotypen.
  • Nur einmal vorkommende Restriktionsstellen für Nael, AvrII und EcoNI wurden in der cDNA von hPR geschaffen, wodurch drei Kassetten von 396, 209 und 400 Nukleotiden erhalten wurden (Regionen 1, 2 bzw. 3). Für die PCR-Mutagenese wurden drei Sätze von Primern (16 + 7 für Region 1, 5 + 4 für Region 2 und 6 + 13 für Region 3) in der Polymerisationsreaktion unter Verwendung von YEphPR-B als der DNA-Template verwendet. Die nach der PCR erhaltenen Fragmente wurden mit den entsprechenden Enzymen verdaut, Gel-gereinigt und in das parentale Plasmid YEphPR-B ligiert. Die Ligationsgemische wurden zur Transformierung der Bakterienzellen und zum Erhalt von Bibliotheken der hPR-Moleküle verwendet, die in der HBD Zufallspunktmutiert waren. 5 μg DNA wurden von jeder Bibliothek zur Transformierung der Hefezellen verwendet, die das Reporterplasmid YRpPC3GS+ trugen, und Transformanten wurden für die Tryptophan- und Uracil-Auxotrophie auf CAA-Platten, die 100 μM CuSO4 enthielten, ausgewählt. Diese wurden dann auf CAA-Platten repliziert, die die Hormone enthielten. Das Screening auf "Herauf-Mutationen" erlaubte die Identifizierung von Rezeptormutanten mit Hormon-unabhängiger Transkriptionsaktivität, oder erhöhter Affinität für den Liganden (diese Klone sollten blau bleiben, wenn sie in 100-mal weniger Hormon gezüchtet werden), oder mit einer veränderten Reaktion auf RU38486 oder ein Glukokortikoid-Analogon. In dem Screening auf die "Herab- Mutation" wurden Rezeptormutanten verwendet, die in der Gegenwart des Liganden transkriptionell inaktiv waren.
  • Aufgrund der Natur der angewendeten Methode zur Generierung der mutierten DNA-Templaten war es zunächst erforderlich, die Qualität der erhaltenen Bibliotheken zu bestimmen. Dies wurde durch Auswertung der Anzahl der Nullmutationen, die durch Mutagenese generiert waren, abgeschätzt. Wir schätzten die Häufigkeit des Auftretens transkriptionell inaktiver Rezeptoren (weiße Kolonien) im Vergleich zur Gesamtzahl der Kolonien ab. Diese Häufigkeit betrug etwa 7 %.
  • Die primären Transformanten wurden auf Platten replikaplattiert, die das Antiprogestin RU38486 enthielten. Der Wildtyp-Rezeptor wird durch dieses Hormon nicht aktiviert (1). Unter Anwendung dieser Screening-Strategie wurde eine einzelne Kolonie identifiziert, die eine beträchtliche Transkriptionsaktivität als Reaktion auf das Antihormon zeigte. Interessanterweise zeigte dieselbe Kolonie keine Transkriptionsaktivität, wenn sie in der Gegenwart von Progesteron replikaplattiert wurde. Die Kolonie wurde gereinigt und der Phänotyp wurde bestimmt. Die Vertreibung des Expressionsvektors aus dem Klon, gefolgt von der Wiedereinführung des unmutierten Rezeptors, wies nach, dass der Phänotyp in der Tat zu dem Expressionsvektor in Bezug stand und nicht das Ergebnis einer sekundären Mutation war. Außerdem wurde das als UP-1 bezeichnete mutierte Plasmid aus Hefe mittels Passage durch E. coli (wie beschrieben bei Ward, Nucl. Acids Res. 18:5319 (1990) sichergestellt und gereinigt. Diese DNA wurde dann in Hefe wieder eingeführt, die lediglich das Reporterplasmid enthielt. Wie erwartet, war der mutierte Phänotyp stabil und stand in direktem Bezug zu dem Rezeptor-Expressionsplasmid.
  • BEISPIEL 11
  • Charakterisierung der UP-1-Mutante
  • Die zur Identifizierung der Rezeptormutanten verwendeten Plattenassays sind in ihrer Natur qualitativ. Um die Eigenschaften von UP-1 weiter zu charakterisieren, wurde die Aktivität der Rezeptormutanten mit der des Wildtyp-Rezeptors in einem Transkriptions-Assay verglichen. Bei dieser Methode wurden Hefezellen, die entwe der mit dem Wildtyp- oder dem mutierten Rezeptor transformiert waren, und ein Progesteron-responsiver Reporter über Nacht in der Gegenwart von 100 μm CuSO4 gezüchtet. Als die Zellen eine O.D.600nm von 1,0 erreicht hatten, wurden sie mit Progesteron oder RU38486 ergänzt und durch Zentrifugation nach vier Stunden geerntet. Die β-Galaktosidase-Aktivität in dem Zellcytosol wurde dann gemessen.
  • Bezugnehmend auf 2A ist, wenn mit dem Wildtyp-Rezeptor untersucht, 1 μM RU38486 ein schwacher Induktor der Transkription, wohingegen Progesteron eine mehr als 60-fache Induktion der Transkription bei 1 μM bewirkte. In 2B jedoch war diese Situation umgekehrt, wenn die Mutante analysiert wurde. In diesem Fall war RU38486 ein extrem potenter Aktivator, wohingegen Progesteron unwirksam war. Interessanterweise war die durch die Mutante in der Gegenwart von RU38486 erzielte Aktivität von derselben Größenordnung wie die des in der Gegenwart von Progesteron untersuchten Wildtyps. Diese Umkehrung in der Spezifität zeigt ganz klar, dass der Mechanismus, mittels dessen diese Liganden mit dem Rezeptor interagieren, grundlegend verschieden ist.
  • 2C zeigt die DNA und Aminosäuresequenzen der Wildtyp- und mutierten DNAs. Das Cytosin bei Position 2636 fehlte in der mutierten DNA, wodurch ein verschobener Leserahmen geschaffen wurde und ein Stoppcodon 36 Nukleotide stromabwärts der C-2636-Deletion erzeugt wurde. Eine Schemastruktur der Wildtyp- und UP-1-Rezeptoren ist ebenfalls gezeigt, mit einer Darstellung der für den Mutanten-Rezeptor einzigartigen 12 C-terminalen Aminosäuren. Konservierte und strukturell ähnliche Aminosäuren sind durch einen Apostroph bzw. ein Sternchen markiert.
  • Die DNA-Sequenzanalyse von UP-1 identifizierte eine einzelne Nukleotid-Deletion bei Base 2636 (2C). Diese Mutation führt zu einer Verschiebung des Leserahmens, was ein Stoppcodon 36 Nukleotide stromabwärts erzeugt. Als einer Folge ist der Wildtyp-Rezeptor um 54 authentische Aminosäuren verkürzt und sind 12 neue Aminosäuren an den C-Terminus addiert.
  • BEISPIEL 12
  • Western Analyse des mutierten humanen Progesteronrezeptors
  • 3 zeigt eine Western Analyse von mutiertem hPR. Hefezellen, die das Reporterplasmid und Wildtyp- (yHPR-B oder mutierte (UP-1) -hPR trugen, wurden über Nacht in CAA-Medium mit (Bahnen 3 bis 5 und 7 bis 9) oder ohne (Bahnen 2 und 6) 100 μM CuSO4 gezüchtet. 1μM Progesteron oder 1 μM RU38486 wurden wie angegeben zugegeben, und die Zellen wurden für weitere 4 Stunden gezüchtet. Die Hefeextrakte wurden wie oben beschrieben präpariert. 50 μg Proteinextrakt wurden auf einem 0,1 % SDS – 7 % Polyacrylamidgel laufen gelassen. 50 μg eines nukleären T47D-Extrakts, der die A- und B-Formen von hPR enthielt, wurden ebenfalls als eine positiven Kontrolle aufgebracht (Bahn 1). Die Positionen der Mulekulargewichts-Marker sind angegeben.
  • Eine Western-Immunoblot-Analyse von UP-1- und Wildtyp-Rezeptoren wurde vorgenommen, um zu verifizieren, dass der mutierte Rezeptor synthetisiert war wie aus seiner DNA-Sequenz vorausgesagt, und um die Möglichkeit auszuschließen, dass einige größere Degradationsprodukte für den mutierten Phänotyp verantwortlich waren. Wie in 3 gezeigt, wanderte der mutierte Rezeptor in dem Gel schneller, was das durch die DNA-Sequenzierung vorausgesagte Molekulargewicht bestätigte. Der Wildtyp-Rezeptor (yhPR-B) lief als ein 114 kDa-Protein, wohingegen der mutierte Rezeptor um 5 kDa kleiner war (vergleiche Bahnen 2 und 3 mit 6 und 7). Die Zugabe von 100 μM CuSO4 zu den Zellkulturen erhöhte die Synthese sowohl des Wildtyp- als auch des mutierten hPR in gleichem Maße. Keine größeren Degradationsprodukte wurden nachgewiesen. In der Gegenwart von Progesteron und RU38486 waren die yhPR-B-Banden aufgrund der Hormon-induzierten Phosphorylierung des Rezeptors herauf verschoben. Im Gegensatz dazu induzierte RU38486 ein Upshifiting des Wildtyp-PR in einem geringeren Maße (Bahnen 4 und 5). Für die UP-1-Mutante war dieses Hormon-abhängige Upshifiting auf die Behandlung mit RU38486 hin erkennbar (Bahnen 8 und 9). Somit kann der C-Terminus von PR für die Inaktivität von RU38486 verantwortlich sein. Folglich würde die Entfernung dieser Sequenz es RU38486 ermöglichen, ein Agonist zu werden.
  • BEISPIEL 13
  • Hormonbindungsanalyse
  • 4 zeigt die transkriptionelle Aktivität und Hormonbindungsanalyse der Wildtyp- und mutierten hPR-Konstrukte. Die hPR-Konstrukte sind auf der linken Seite berichtet, zusammen mit einer schematischen Darstellung der Rezeptormoleküle. Hefezellen wurden in der Gegenwart von 100 μm CuSO4 gezüchtet. Die Transkriptionsanalyse wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die Experimente wurden im Triplikat vorgenommen, und die transkriptionellen Aktivitäten wurden bezüglich des Proteins normalisiert. Die Hormonbindungsassays wurden in der Gegenwart von 20 nM [3H] Progesteron oder 20 nM [3H] RU38486 durchgeführt.
  • Eine Analyse der Sättigungsbindung des UP-1-Mutantenrezeptors wurde vorgenommen, um zu bestimmen, ob seine Affinität für RU38486 und Progesteron verändert war. Die Scatchard-Analyse der Bindungsdaten zeigte, dass sowohl die Wildtyp- als auch die mutierten Rezeptoren eine ähnliche Affinität für RU39386 von 4 bzw. 3 nM aufwiesen. Wie in 4 erkennbar, hatte das mutierte Rezeptormolekül die Fähigkeit zur Bindung an Progesteron verloren. Somit sind die Aminosäure-Kontakte für Progesteron und RU38486 mit hPR verschieden.
  • Generierung von Deletionsmutanten von hPR-B
  • Wie in 2C gezeigt, ergab eine DNA-Sequenzierung, dass die Frameshift-Mutation in dem UP-1-Klon eine Doppelmutation in dem Rezeptorprotein schuf, das heißt, eine modifizierte C-terminale Aminosäuresequenz und eine Verkürzung um 42 Aminosäuren. Um zu identifizieren, welche Mutation schließlich für den beobachteten Phänotyp verantwortlich war, wurden zwei neue Rezeptormutanten in vitro konstruiert: YEphPR-B879, das ein Stoppcodon entsprechend der Aminosäure 880 enthielt, und YEphPR-B891, das ein Stoppcodon bei Aminosäure 892 enthielt. Die Hormonbindungsdaten (siehe 4) zeigten, dass beide verkürzten Rezeptoren an RU38486 binden konnten, nicht jedoch Progesteron. Bei Untersuchung in vivo aktivierten beide mutierten Rezeptoren die Transkription in der Gegenwart von RU38486 auf Höhen, die denen des in Hefe generierten mutierten UP-1 vergleichbar waren. Wie erwartet, waren beide Mutanten in der Gegenwart von Progesteron inaktiv. So mit war der beobachtete Phänotyp nicht auf die Zweitstellen-Mutationen in dem UP-1-Molekül zurückzuführen. Auch waren 12 weitere Aminosäuren, von 880 bis 891, nicht für die Mutantenaktivität verantwortlich. Außerdem ist klar, dass die C-terminalen 42 Aminosäuren für die Bindung von Progesteron an den Rezeptor erforderlich sind, wohingegen die letzten 54 Aminosäuren für die RU38486-Bindung nicht erforderlich sind. Somit steht der Antagonist zu unterschiedlichen Aminosäuren in dem nativen Rezeptormolekül in Kontakt und kann eine unterschiedliche Rezeptorkonformation relativ zu den Agonisten induzieren.
  • BEISPIEL 14
  • Steroidspezifität für die Aktivierung der Transkription der UP-1-Mutante
  • 5 zeigt die Spezifität der Transkriptionsaktivität des mutierten hPR. In Panel (A) wurden die Wildtyp- und UP-1-Mutantenrezeptors in der Gegenwart verschiedener Konzentrationen an Progesteron, RU38486, Org31806 und Org31376 untersucht, wie angegeben.
  • Ein Transkriptionsassay wurde unter Verwendung zweier synthetischer Antagonisten, Org31806 und Org31376, die potente Antiprogestine sind, vorgenommen. Wie in 5A gezeigt, wurde der mutierte Rezeptor durch beide dieser Verbindungen aktiviert. Die Kurve der Konzentrations-abhängigen Aktivität war ähnlich der, die mit RU38486 erhalten wurde, was nahe legt, dass die Affinität dieser beiden Antagonisten für den mutierten Rezeptor ähnlich der von RU38486 ist. Wenn mit dem Wildtyp-Rezeptor untersucht, zeigten diese Verbindungen eine minimale transkriptionelle Aktivität und verhielten sich wie partielle Agonisten (3-10 % Progesteron-Aktivität) lediglich bei Konzentrationen von 1 μM, ebenso wie RU38486. Somit erstreckt sich die inhibitorische Wirkung des C-Terminus von hPR auch auf andere Rezeptor-Antagonisten.
  • In Panel (B) wurden die transkriptionellen Aktivitäten von Wildtyp- und UP-1-Mutantenrezeptoren in der Gegenwart von 1 μM Progesteron (P), RU38486 (RU), R5020 (R), Dexamethason (D), Cortisol (C), Estradiol (E), Tamoxifen (TX) oder Nafoxidin (N) untersucht (siehe 56). Der synthetische Agonist R5020 zeigte keine Wirkung auf die UP-1-Mutante, was nahe legt, dass Agonisten, wie etwa Progesteron und R5020, den C-Terminus des nativen Rezeptors für die Bindung erfordern und folglich darin versagen, den verkürzten UP-1-Rezeptor zu erkennen. Weitere Steroide, die für das Übertreten in Hefezellen bekannt sind, wie etwa Estradiol, die Anti-Östrogene Tamoxifen und Nafoxidin, Dexamethason und Cortisol, könnten möglicherweise den mutierten Rezeptor aktivieren. Alle getesteten Steroide wurden als inaktiv sowohl mit dem Wildtyp- als auch dem mutierten Rezeptor befunden. Somit ist die Aktivierung des mutierten Rezeptors für die Antiprogestine spezifisch.
  • BEISPIEL 15
  • Transkriptionelle Aktivität der mutierten Rezeptoren in Säugerzellen
  • 6 zeigt die transiente Transfektion von mutiertem hPR in Säugerzellen. In Panel (A) wurden HeLa-Zellen mit phPR-B- und phPR-B891-Rezeptoren, zusammen mit PRETKCAT-Rezeptorplasmid unter Anwendung der Polybren-Methode der Transfektion transient transfiziert, wie beschrieben (Tsai, et al. 1989). Die Zellen wurden mit oder ohne 100 nM Progesteron oder RU38486 für 48 Stunden vor der Ernte gezüchtet. CAT-Assays wurden wie oben beschrieben durchgeführt. In Panel (B) wurden CV-1-Zellen wie bei (A) transient transfiziert.
  • Bezüglich der 6 wurde die Mutantenrezeptor-Aktivität sowohl in humanen endometrialen HeLa-Zellen als auch Affennieren-CV-1-Fibroblasten untersucht. Eine Mutante, phPR-891, wurde konstruiert, indem das Volllängen-PR-Insert des phPR-B-Vektors durch die verkürzte PR cDNA von YEphPR-B891 ersetzt wurde. Die resultierende Rezeptormutante, phPR-B891, stellt eine Verkürzung um 42 Aminosäuren der hPR-B-Form dar. Mutierte 891- und Wildtyp-Rezeptoren wurden in HeLa-Zellen zusammen mit dem PRETKCAT-Reporterplasmid transfiziert, das zwei Kopien eines GRE/PRE-Elements enthält.
  • Wie erwartet, aktivierte der Wildtyp-PR die Transkription des CAT-Genreporters in der Gegenwart von 10–7 M Progesteron (6A). Obschon die basale Transkriptionsmenge hoch war, wurde eine 3- bis 4-fache Induktion der Transkription nachgewiesen, wenn dem Medium Progesteron zugegeben wurde. Im Gegensatz dazu trat keine Induktion in der Gegenwart von RU38486 auf. Die hohe Basalmenge der Transkription, wie in diesen Experimenten nachgewiesen, kann eine RU38486-Wirkung auf den Wildtyp-hPR maskieren oder verändern.
  • Dagegen wurde eine Induktion der CAT-Aktivität beobachtet, wenn die 891-Mutante in der Gegenwart von 10–7 M RU38486 inkubiert wurde (6A). Dieselbe Konzentration an Progesteron zeigte keine Aktivität.
  • Zelltyp-spezifische Faktoren können die Aktivität der transaktivierenden Domänen von Steroidrezeptoren beeinflussen. Um diese Möglichkeit auszuwerten, wurden Wildtyp- und mutierte Rezeptoren in CV-1-Zellen transfiziert. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, d.h. Progesteron aktivierte den Wildtyp-Rezeptor, wohingegen RU38486 den 891-Mutantenrezeptor aktivierte (6B).
  • Das aus dem phPR-B891-Plasmid synthetisierte Protein war von dem korrekten Molekulargewicht in Säugerzellen. Der mutierte Rezeptor wurde in COSM6-Zellen transfiziert. Die Western-Analyse an Zellextrakten zeigte, das die 891-Mutante, wie erwartet, als ein Protein von 109 kDa synthetisiert wurde, was einem um 42 Aminosäuren kürzeren Protein als dem Wildtyp-hPR entspricht. Somit wirkt RU38486 als ein Agonist des verkürzten B-Rezeptors in einem Hefe-rekonstituierten System und ebenso in Säugerzellen. Der Mechanismus der Transaktivierung erfordert nicht den C-terminalen Schwanz des mutierten Rezeptors und ist bei den drei getesteten Spezies konserviert.
  • BEISPIEL 16
  • Hühner-Progesteron
  • Hühner- und Säuger-Progesteron sind ohne weiteres verfügbar, und beide wirken durch Bindung an dieselbe regulatorische DNA-Sequenz. Hühner-Progesteron bindet jedoch an ein unterschiedliches Spektrum von Liganden, da diese unterschiedliche Affinitäten gegenüber jenen besitzen, die mit humanem Progesteron interagieren. Somit kann das Hühner-Progesteron als ein transgener Regulator beim Menschen verwendet werden. Ferner kann es zum Screenen auf spezifische Liganden verwendet werden, die Hühner-Progesteron, doch nicht endogenes humanes Progesteron, aktivieren. Ein Beispiel eines Liganden ist 5-Alpha-Pregnan-3,20-dion (Dihydroprogesteron), welches extrem gut an Hühner-Progesteron bindet, doch nicht oder sehr schlecht an humanes Progesteron bindet.
  • Obschon das unmodifizierte Hühner-Progesteron bereits mit einem unterschiedlichen Spektrum der Ligandenaffinität zum Menschen oder anderen Säugern ausgestattet ist und in seiner nativen Form verwendet werden kann, ist es wichtig, die Auswahl zusätzlicher mutierter Progesterone anzustreben, um einen wirksameren Rezeptor zu schaffen. Die Unterschiede zwischen Hühner- und humanen Progesteron-Rezeptoren sind auf einige wenige Aminosäure-Unterschiede zurückzuführen. Folglich könnten weitere Mutationen künstlich eingeführt werden. Diese Mutationen würden die Rezeptor-Unterschiedlichkeiten erhöhen. Das Screening auf Rezeptor-mutationen für die Wirksamkeit des Liganden erzeugt eine Vielfalt von Rezeptoren, bei denen Abweichungen der Affinität auftreten können. Das Ausgangs-Screening der Progesteron-Mutanten wurde unter Verwendung von Zwischenmengen der Liganden durchgeführt. Eine Mutante hatte die Progesteron-Affinität gänzlich verloren, band aber einen synthetischen Liganden RU38486 bei nahezu der Leistung des Wildtyps. RU38486 wird normalerweise als Antagonist der Progesteronfunktion betrachtet, war aber zum Agonisten geworden, wenn unter Verwendung dieser spezifischen Mutante getestet. Da der Ligand synthetisch ist, stellt er keine Verbindung dar, die mit einiger Wahrscheinlichkeit in den mit der Gentherapie zu behandelnden Menschen oder Tieren zu finden ist. Obschon RU38486 in diesem Fall als ein Agonist fungiert, ist er aufgrund seiner potenziellen Nebenwirkungen als ein Anti-Glukokortikoid nicht ideal. Ferner bindet er auch an das humane Wildtyp-Progesteron. Daher weist er die unerwünschte Nebenwirkung einer reproduktiven und endokrinen Dysfunktion auf.
  • Dieser Ansatz ist nicht auf den Progesteron-Rezeptor beschränkt, da angenommen wird, dass alle der Liganden aktivierten Transkriptionsfaktoren durch ähnliche Mechanismen wirken. Ein Fachmann des Gebiets erkennt, dass ein ähnliches Screening der anderen Mitglieder der Steroid-Superfamilie eine Vielfalt von molekularen Schaltern bereitstellen wird. Zum Beispiel aktiviert die Verbindung 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 den Vitamin-D-Rezeptor, die Verbindung 24,25-Dihydroxy-Vitamin D je doch nicht. Mutanten des Vitamin D-Rezeptors können erzeugt werden, die bei Bindung an 24,25-Dihydroxy-Vitamin D heraufreguliert sind, die aber bei Bindung an 1,25-D3 nicht weiter heraufregulieren.
  • Ein Fachmann des Gebiets erkennt, dass die Liganden daraufhin designed sind, dass sie physiologisch tolerierbar, leicht ausscheidbar und nicht-toxisch sind und spezifische Wirkungen auf das transgene System und nicht den gesamten Organismus zeigen.
  • BEISPIEL 17
  • Transgene Tiere
  • Ein molekularer Schalter kann in der Erzeugung transgener Tiere verwendet werden. Eine Vielfalt von Verfahrensweisen ist zur Erzeugung der transgenen Tiere bekannt, einschließlich der, die beschrieben sind bei Leder und Stewart, US-Patent Nr. 4,736,866 , ausgegeben am 12. April 1988, und Palmiter und Bannister Annual Review of Genetics, Bd. 20, S. 465-499. Zum Beispiel kann der molekulare UP-1-Schalter mit der Nukleinsäurekassette kombiniert werden, die das zu exprimierende rekombinante Gen enthält. Zum Beispiel kann Laktoferrin unter die Kontrolle eines basalen Thymidinkinase-Promotors gestellt werden, in den Progesteron-responsive Elemente eingebracht worden sind. Dieser Vektor wird in die Tier-Keimbahnen eingeführt, zusammen mit dem Vektor, der den UP-1-Rezeptor konstitutiv exprimiert. Die beiden Vektoren können auch zu einem Vektor kombiniert werden. Die Expression des rekombinanten Gens in dem transgenen Tier wird durch Verabreichung einer pharmakologischen Dosis an RU38486 an das transgene Tier angeschaltet oder abgeschaltet. Dieses Hormon dient zur spezifischen Aktivierung der Transkription des Transgens. Die Dosis kann zur Regulierung der Expressionshöhe eingestellt werden. Ein Fachmann des Gebiets wird ohne weiteres erkennen, dass dieses Protokoll auf eine Vielfalt von Genen angewendet werden kann und somit in der Regulierung der temporalen Expression jeglichen gegebenen Genprodukts in transgenen Tieren nützlich ist.
  • BEISPIEL 18
  • Pflanzen
  • In diesem Fall kann ein molekularer UP-1-Schalter an die Nukleinsäurekassette gebunden werden, die das zu exprimierende Gen oder rekombinierte Gen enthält. Zum Beispiel kann das Gen für Δ9-Desaturase unter die Kontrolle eines basalen 3-Phospoglycerat-Promotoren gestellt werden, in den ein oder mehrere Kopien der Progesteron-responsiven Elemente eingeführt worden sind. Dieser Vektor wird dann in die Pflanzen-Keimbahn eingeführt, zusammen mit einem Vektor, der den UP-1-Rezeptor konstitutiv exprimiert. Auch diese beiden Vektoren können zu einem Vektor kombiniert werden. Zu dem erforderlichen Zeitpunkt für die Expression der Nukleinsäurekassette wird eine pharmakologische Dosis an RU38486 zur Aktivierung der Transkription eingeführt. Die Dosis kann zur Regulierung der Expressionshöhe eingestellt werden. Daher wird ein Fachmann des Gebiets ohne weiteres erkennen, dass eine Vielzahl von Genen durch die Anwendung der Erfindung der vorliegenden Anmeldung in Pflanzen angeschaltet oder abgeschaltet werden kann.
  • Alle in dieser Beschreibung genannten Patente und Veröffentlichungen sind für den Stand der Technik, zu dem die Erfindung gehört, indikativ.
  • Ein Fachmann des Gebiets wird ohne weiteres anerkennen, dass die vorliegende Erfindung wohl angepasst ist, um die Aufgaben durchzuführen und die genannten Ziele und Vorteile, als auch die diesen inhärenten, zu erreichen. Transformierte Zellen, Vektoren, Zusammensetzungen, molekulare Schalter und Rezeptoren, zusammen mit den hierin beschriebenen Methoden, Verfahrensweisen, Behandlungen und Molekülen sind derzeit für bevorzugte Ausführungsformen repräsentativ, sind beispielhafter Natur und sind nicht als Beschränkungen des Umfanges der Erfindung zu verstehen.
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00390001
  • Figure 00400001
  • Figure 00410001
  • SEQUENZLISTE
    Figure 00420001
  • Figure 00430001

Claims (42)

  1. Mutiertes Steroidhormon-Rezeptorprotein, welches eine mutierte Progesteron-Rezeptorliganden-Bindungsdomäne aufweist, worin die Mutation eine Deletion von bis zu 60 Aminosäuren vom Carboxyl-terminalen Ende der Ligandenbindungsdomäne umfasst, welches die Bindungsfähigkeit verliert an oder keine Transkriptionsaktivität zeigt durch einen Agonisten eines Wildtyp-Progesteron-Hormonrezeptors und die Affinität beibehält zu oder die Transkriptionsaktivität induziert durch ein Anti-Progestin des Wildtyp-Progesteron-Hormonrezeptors.
  2. Protein nach Anspruch 1, worin die Mutation eine Deletion von bis zu 54 Aminosäuren vom Carboxy-terminalen Ende der Ligandenbindungsdomäne umfasst.
  3. Protein nach Anspruch 1, worin die Mutation eine Deletion von bis zu 42 Aminosäuren vom Carboxy-terminalen Ende der Ligandenbindungsdomäne umfasst.
  4. Molekularer Schalter zur Regulierung der Expression einer Nukleinsäurekassette in der Gentherapie, welcher Schalter einen mutierten Steroidhormonrezeptor, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, umfasst, welcher eine natürliche Progesteronrezeptor-DNA-Bindungsdomäne enthält, die an die mutierte Ligandenbindungsdomäne geknüpft ist.
  5. Molekularer Schalter nach Anspruch 4, worin die natürliche Progesteronrezeptor-DNA-Bindungsdomäne durch eine nicht-natürliche Progesteronrezeptor-DNA-Bindungsdomäne oder modifizierte DNA-Bindungsdomäne ersetzt worden ist.
  6. Molekularer Schalter nach Anspruch 5, worin der modifizierte Steroidhormonrezeptor ein Rezeptor ist, bei dem die natürliche DNA-Bindungsdomäne durch eine DNA-Bindungsdomäne ersetzt ist, die eine GAL-4-DNA-Bindungsdomäne, eine Virus-DNA-Bindungsdomäne, eine Insekten-DNA-Bindungsdomäne oder eine Nicht-Säuger-DNA-Bindungsdomäne ist.
  7. Molekularer Schalter nach einem der Ansprüche 4 bis 6, außerdem umfassend eine Transaktivierungsdomäne.
  8. Molekularer Schalter nach einem der Ansprüche 4 bis 7, worin das Anti-Progestin 5-Alpha-Pregnan-3,20-dion; 11β-(4-Dimethylaminophenyl)-17β-hydroxy-17α-propinyl-4,9-estadien-3-on; 11β-(4-Dimethylaminophenyl)-17α-hydroxy-17β-(3-hydroxypropyl)-13α-methyl-4,9-gonadien-3-on; 11β-(4-Acetylphenyl)-17β-hydroxy-17α-(1-propinyl)-4,9-estradien-3-on; 11β-(4-Dimethylaminophenyl)-17β-hydroxy-17α-(3-hydroxy-1(Z)-propenyl-estra-4,9-dien-3-on; (7β,11β,17β)-11-(4-Dimethylaminophenyl)-7-methyl-4',5'-dihydrospiro[ester-4,9-dien-17,2'(3'H)-furan]-3-on; oder (11β,14β,17α)-4',5'-Dihydro-11-(4-dimethylaminophenyl)[spiroestra-4,9-dien-17,2'(3'H)-furan]-3-on ist.
  9. Molekularer Schalter nach Anspruch 7, worin die Transaktivierungsdomäne gewebespezisch ist.
  10. Molekularer Schalter nach Anspruch 7, worin die Transaktivierungsdomäne ausgewählt ist aus VP-16, TAF-1, TAF-2, TAU-1 und TAU-2.
  11. Molekularer Schalter nach Anspruch 10, worin die Transaktivierungsdomäne eine TAF-1-Transaktivierungsdomäne umfasst.
  12. Molekularer Schalter nach Anspruch 7, welcher eine GAL-4-DNA-Bindungsdomäne enthält.
  13. Molekularer Schalter nach Anspruch 4, worin die natürliche Progesteronrezeptor-DNA-Bindungsdomäne durch eine GAL-4-DNA-Bindungsdomäne ersetzt ist und der molekulare Schalter außerdem eine Transaktivierungsdomäne umfasst.
  14. Nukleinsäure, die ein mutiertes Steroidhormon-Rezeptorprotein nach einem der Ansprüche 1 bis 3 oder einen molekularen Schalter nach einem der Ansprüche 4 bis 13 umfasst.
  15. Plasmid, enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 14, welches UP-1, YEphPR-A879, YEphPR-A891, YEphPR-B891, YEphPR-B879, phPR-A879, phPR-A891, phPR-B879 oder phPR-B891 ist.
  16. Transformierte Zelllinie oder transfizierte Zelle, enthaltend eine Nukleinsäure, wie in Anspruch 14 definiert.
  17. Transfizierte Zelle nach Anspruch 16, welche eine Hefezelle ist, die Saccharomyces cerevisiae ist, eine Säugerzelle ist, die eine HeLa-, CV-1-, COSM6-, HepG2-, CHO- oder Ros 17.2-Zelle ist; oder eine Insektenzelle ist, die eine SF9-Zelle, eine Drosophila-Zelle, eine Schmetterlingszelle oder eine Bienenzelle ist.
  18. Verfahren zur Bestimmung der Agonist-Aktivität einer Verbindung für einen mutierten Steroidhormonrezeptor, welches Verfahren umfasst: Kontaktieren der Verbindung mit einer transfizierten Zelle, wie in Anspruch 16 oder 17 definiert; und Messen der Transkriptionsmengen, die durch die Verbindung induziert sind.
  19. Verfahren zur Bestimmung eines Liganden für einen mutierten Steroidhormonrezeptor, welches Verfahren umfasst: Kontaktieren der Verbindung mit einer transfizierten Zelle, wie in Anspruch 16 oder 17 definiert; und Messen der Transkriptionsmengen, die durch die Verbindung induziert sind.
  20. Zusammensetzung, umfassend eine Nukleinsäure, die den molekularen Schalter nach einem der Ansprüche 5 bis 13 codiert, und eine Zielgen-Nukleinsäure kassette, umfassend eine spezifische DNA-Stelle, an die der Rezeptor bindet, und welche ein Protein, Peptid oder RNA von Interesse codiert.
  21. Zusammensetzung nach Anspruch 20, welche gewebespezifisch ist, wie durch Hinzufügen eines gewebespezifischen cis-Elements zu der Nukleinsäurekassette bestimmt.
  22. Zusammensetzung nach Anspruch 20, welche gewebespezifisch ist, wie durch Hinzufügen zu dem molekularen Schalter einer gewebespezifischen Transaktivierungsdomäne, die für ein gegebenes Gewebe spezifisch ist, bestimmt.
  23. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, worin der molekulare Schalter eine GAL-4-DNA-Bindungsdomäne umfasst.
  24. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 23, worin die Nukleinsäure, die den molekularen Schalter und die Nukleinsäurekassette codiert, sich an separaten Plasmiden befinden.
  25. Zusammensetzung, wie in einem der Ansprüche 20 bis 24 definiert, zur Verwendung bei einer Methode zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie.
  26. Transformierte Zelle, gebildet durch Einführen einer Zusammensetzung, wie in einem der Ansprüche 20 bis 24 definiert, in eine Zelle.
  27. Transformierte Zelle nach Anspruch 26, zur Verwendung bei einer Methode zur Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers durch Therapie.
  28. Pharmakologische Zusammensetzung, umfassend eine transformierte Zelle, wie in Anspruch 27 definiert.
  29. Transformierte Zelle nach Anspruch 27, wobei die Zelle eine Gehirnzelle ist und eingekapselt ist in eine durchlässige Struktur, welche den Durchgang von Aktivatoren des molekularen Schalters und des von der Nukleinsäuresequenz expri mierten Proteins zulässt, doch den Durchgang von Angreiferzellen verhindert.
  30. Transformierte Zelle nach Anspruch 27, worin die Nukleinsäurekassette transkribiert wird, um ein Protein zu produzieren, nachdem das Tier oder der Mensch eine pharmakologische Dosis eines Anti-Progesterons erhalten hat, wobei zum Beispiel die Menge an in der transformierten Zelle produziertem Protein proportional zu der Dosis des Anti-Progestins ist.
  31. Verwendung eines Anti-Progestins für ein mutiertes Steroidhormon-Rezeptorprotein nach Anspruch 1 in der Herstellung eines Medikaments zur Stimulierung der Transkription einer Zielzelle, in Zellen eines Individuums, in die eine Nukleinsäure nach Anspruch 14 eingeführt ist.
  32. Verwendung eines Anti-Progestins für ein mutiertes Steroidhormon-Rezeptorprotein nach Anspruch 1 in der Herstellung eines Medikaments zur Regulierung der Expression einer Nukleinsäure, die ein Protein, Peptid oder RNA von Interesse codiert, in Zellen eines Individuums, in die die Nukleinsäure nach Anspruch 14 eingeführt ist, und wobei die Transkription der Nukleinsäure, die das Protein, Peptid oder RNA von Interesse codiert, durch Verabreichung des Medikaments reguliert wird.
  33. Verwendung nach Anspruch 32, wobei die Zellen mit der Nukleinsäure nach Anspruch 14 in vivo transfiziert werden.
  34. Verwendung nach Anspruch 31 bis 33, worin das Anti-Progestin 5-Alpha-Pregnan-3,20-dion; 11β-(4-Dimethylaminophenyl)-17β-hydroxy-17α-propinyl-4,9-estadien-3-on; 11β-(4-Dimethylaminophenyl)-17α-hydroxy-17β-(3-hydroxypropyl)-13α-methyl-4,9-gonadien-3-on; 11β-(4-Acetylphenyl)-17β-hydroxy-17α-(1-propinyl)-4,9-estradien-3-on; 11β-(4-Dimethylaminophenyl)-17β-hydroxy-17α-(3-hydroxy-1(Z)-propenyl-estra-4,9-dien-3-on; (7β,11β,17β)-11-(4-Dimethylaminophenyl)-7-methyl-4',5'-dihydrospiro[ester-4,9-dien-17,2'(3'H)-furan]-3-on; oder (11β,14β,17α)-4',5'-dihydrospiro-11-(4-dimethylaminophenyl)-[spiroestra-4,9-dien-17,2'(3'H)-furan]-3-on ist.
  35. Verwendung nach einem der Ansprüche 31 bis 34, worin das Anti-Progestin zur Regulierung der Transkription in vivo verabreicht wird.
  36. Verfahren zur Regulierung der Nukleinsäure-Expression in einer Zelle, die mit einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 20 bis 25 transformiert ist, welches Verfahren das Verabreichen in vitro einer pharmakologischen Dosis des Anti-Progestins für den molekularen Schalter an die Zelle umfasst, wobei die Expression eines Proteins, Peptids oder RNA von der Nukleinsäure durch den molekularen Schalter auf die Verabreichung des Anti-Progestins hin reguliert wird.
  37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei der molekulare Schalter eine mutierte Progesteron-Rezeptorliganden-Bindungsdomäne und eine GAL-4-DNA-Bindungsdomäne umfasst, die Nukleinsäure transkribiert wird, um ein Protein zu produzieren, nach Verabreichung einer pharmakologischen Dosis eines Anti-Progesterons an die transformierte Zelle, und die Menge an Protein, das in der transformierten Zelle produziert wird, proportional zu der Dosis an Anti-Progestin ist.
  38. Verfahren nach Anspruch 36 oder 37, wobei die Verabreichung des Anti-Progestins zu einer Agonist-abhängigen Expression der Proteins, Peptids oder RNA führt.
  39. Verfahren nach Anspruch 36, wobei sich eine Nukleinsäure, die den molekularen Schalter codiert, und eine Nukleinsäure-Kassette auf separaten Plasmiden befinden und gemeinsam in eine Zielzelle übertragen werden.
  40. Verwendung eines Anti-Progestins für die Herstellung eines Medikaments zur Regulierung des Expression einer Nukleinsäure, die ein Protein, Peptid oder RNA von Interesse codiert, in Zellen eines nicht-menschlichen transgenen Tiers, in die die Nukleinsäure nach Anspruch 14 eingeführt worden ist, wobei die Transkription der Nukleinsäure, die das Protein, Peptid oder RNA von Interesse codiert, durch Verabreichung des Medikaments reguliert wird.
  41. Verwendung nach Anspruch 40, wobei die Nukleinsäure aus Anspruch 14 einen molekularen Schalter codiert, umfassend eine mutierte Progesteron- Rezeptorliganden-Bindungsdomäne und eine GAL-4-DNA-Bindungsdomäne.
  42. Verwendung nach Anspruch 40 oder 41, wobei die Verabreichung des Anti-Progestins zur Agonist-abhängigen Expression des Proteins, Peptids oder RNA führt.
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