DE69634638T2 - Transkriptioneller Korepressor, welcher mit Hormonrezeptoren des Zellkerns wechselwirkt, und dessen Anwendungen - Google Patents

Transkriptioneller Korepressor, welcher mit Hormonrezeptoren des Zellkerns wechselwirkt, und dessen Anwendungen Download PDF

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft intrazelluläre Rezeptoren, Verfahren für die Modulation davon, und Verfahren zur Identifizierung neuartiger Liganden dafür. In einem besonderen Gesichtspunkt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die als Liganden (oder Ligandenvorstufen) für intrazelluläre Rezeptoren fungieren. In einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung neuartige chimäre Konstrukte und Verwendungen dafür.
  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Ein zentrales Problem in der eukaryotischen Molekularbiologie besteht nach wie vor in der Aufklärung von Molekülen und Mechanismen, die spezifische Genregulation vermitteln. Als Teil dieser wissenschaftlichen Herangehensweise an dieses Problem wurde ein grosser Arbeitseinsatz in Anstrengungen aufgewendet, um Liganden (d. h. exogene Induktoren) zu identifizieren, die imstande sind, spezifische Genregulation zu vermitteln. Weitere Arbeit wurde für Versuche aufgewendet, um andere, bei spezifischer Genregulation eingebundene Moleküle zu identifizieren.
  • Obwohl noch noch viel über die Eigenarten der Genregulation zu lernen verbleibt, ist es bekannt, dass Liganden Gentranskription durch Zusammenwirken mit intrazellulären Komponenten modulieren, einschliesslich intrazellulärer Rezeptoren und diskreter DNA-Sequenzen, die als Hormon-Response-Elemente (HREs) bekannt sind.
  • Die Identifikation von Verbindungen, die direkt oder indirekt mit intrazellulären Rezeptoren zusammenwirken und dabei die Transkription von auf Hormone ansprechenden Genen beeinflussen, würde von erheblichem Wert sein, z. B. für therapeutische Anwendungen.
  • Die von Zellkernrezeptoren vermittelte transkriptionelle Hemmung spielt eine wichtige Rolle in der Entwicklung, Zelldifferenzierung und, direkt damit verbunden, onkogenen Aktivität von v-erbA. Der dieser Wirkung zugrundeliegende Mechanismus ist unbekannt, aber ein Schlüssel zum Verständnis der molekularen Grundlage der Hormonwirkung. Demgemäss würde die Identifizierung der in transkriptioneller Hemmung einbezogener Komponenten einen grossen Fortschritt im gegenwärtigen Verständnis der Mechanismen bedeuten, die spezifische Genregulation vermitteln.
  • Weitere für das Verstehen und die Ausführung der vorliegenden Erfindung hilfreiche Informationen können im gemeinsamen US-Patent Nr. 5,071,773 und 4,981,784; und US-Patentanmeldungen Nr. 325,240, eingereicht am 17. März 1989; 370,407, eingereicht am 22. Juni 1989; und 438,757, eingereicht am 16. November 1989 gefunden werden.
  • KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäss der vorliegenden Erfindung haben wir einen neuartigen, mit Rezeptoren zusammenwirkenden Faktor entdeckt, der hier als "SMRT" bezeichnet wird, d. h. einen Hemmungs- (Silencing) Vermittler (Korepressor) für Retinsäurerezeptoren (RAR) und Schilddrüsenhormon-Rezeptoren (TR). SMRT ist ein neuartiges Protein, dessen Verbindung mit RAR und TR sowohl in Lösung als auch auf DNA-Response-Elementen durch Liganden destabilisiert ist. Das Zusammenwirken von SMRT mit mutierten Rezeptoren korreliert mit den transkriptionellen Hemmungsaktivitäten von Rezeptoren.
  • In vivo, wirkt SMRT als ein kräftiger Korepressor. Eine GAL4-DNA-Bindungsdomäne (DBD)-Fusion von SMRT verhält sich wie ein freier Repressor eines GAL4-anhängigen Reporters. Zusammen identifizieren diese Daten eine neuartige Klasse von Ko-Faktoren, von der angenommen wird, einen wichtigen Vermittler der Hormonwirkung darzustellen.
  • KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 zeigt die Quantifizierung durch Phosphoimager einer dosisabhängigen Dissoziation von SMRT aus PAR oder TR durch all-trans-Retinsäure (atRA) oder Schilddrüsenhormon (Triiodothyronin oder T3).
  • 2 stellt Aminosäure(aa)-Sequenzen von SMRT (Genbank-Zugangsnummer XXXXX) dar. Die in Klammern dargestellte aa-Sequenz (d. h. Reste 1330–1376) ist ein wechselweise gespleißter Einschub, der im original Zweihybrid-Klon (C-SMRT, aa 981 zum C-Terminalende) nicht vorliegt. Die prolinreiche N-Terminaldomäne (aa 1–160) und der glutaminreiche Bereich (aa 1061–1132), als auch die ERDR- und SG-Regionen sind ebenfalls angedeutet. Der C-Terminalbereich von SMRT (aa 1201 zum C-Terminalende) zeigt 48% aa-Identität zu RIP13 (Seol et al., Molecular Endocrinology 9: 72–85 (1995)). Der Rest der Sequenz von RIP13 zeigt 22% aa-Identität zu SMRT (aa 819–1200).
  • 3 stellt die Vermittlung des Hemmungseffekts von hRARα und hTRβ durch SMRT in vivo dar.
  • 3(A) zeigt, dass v-erbA den Hemmungseffekt von GAL-RAR (GAL4 DBD-hRARα 156–462) reversiert, während SMRT den Hemmungseffekt wiederherstellt.
  • 3(B) zeigt, dass die RAR403-Trunkationsmutante den Hemmungseffekt von GAL-TR (GAL4 DBD-hTRβ 173–456) reversiert, während SMRT den Hemmungseffekt wiederherstellt.
  • 3(C) zeigt, dass v-erbA und Volllängen-SMRT oder C-SMRT keine Wirkung auf GAL-VP16 Aktivität besitzen.
  • 3(D) zeigt, dass eine GAL4-DBD-Fusion von Volllängen-SMRT die Thymidinkinase-Basalpromotoraktivität mit vier GAL4-Bindungsstellen unterdrückt. Der Repressionsgrad wurde durch Dividieren der normalisierten, mit der GAL4-DBD allein transfizierten Luciferaseaktivität durch jene, die mit angedeuteter Menge an GAL-DBD-Fusionkonstrukten transfiziert wurde.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden isolierte Cosuppressoren von Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität bereitgestellt, die die gleiche Sequenz wie die Reste 1–1329 plus 1376–1495, wie in SEQ ID NO: 1 dargelegt, aufweisen und ferner optional die Aminosäure-Reste, wie in SEQ ID NO: 2 dargelegt, (d. h. Reste 1330–1375 von SEQ ID NO: 1) enthalten.
  • Arten, die substanziell gleich sind, werden als äquivalent zu den offenbarten Sequenzen angesehen und sind als solche innerhalb des Schutzumfanges der beiliegenden Ansprüche. In dieser Hinsicht bedeutet "leichte und nicht-konsequentiale Sequenzvariationen", dass Sequenzen, die substanziell gleich wie die hier offenbarten und beanspruchten DNA, RNA, oder Proteine sind, funktionell äquivalent zu den hier offenbarten und beanspruchten Sequenzen sind. Funktionell äquivalente Sequenzen werden substanziell in gleicher Weise wirken, um im Wesentlichen dieselben Verbindungen wie die Nukleinsäure und hier offenbarte und beanspruchte Aminosäureverbindungen zu produzieren. Insbesondere enkodieren funktionell äquivalente DNAs Proteine, die gleich zu den hier offenbarten sind oder die konservative Aminosäurevariationen aufweisen, wie Substitution eines nicht-polaren Restes durch einen anderen nicht-polaren Rest oder eines geladenen Restes durch einen ähnlich geladenen Rest. Diese Änderungen schließen solche sein, die durch Fachleute erkannt werden, da diese die Tertiärstruktur des Proteins nicht substanziell verändern.
  • Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung werden Antikörper bereitgestellt, die gegen den oben beschriebenen Cosuppressor erzeugt werden. Solche Antikörper können zum Studieren von Gewebelokalisierungen der erfindungsgemäßen Korepressoren, der Struktur von funktionalen Domänen, der Reinigung von Rezeptoren, als auch bei diagnostischen Anwendungen, therapeutischen Anwendungen und dergleichen verwendet werden. Vorzugsweise werden die Antikörper für therapeutische Anwendungen als monoklonale Antikörper verwendet.
  • Die oben beschriebenen Antikörper können unter Anwendung von Standardtechniken, wie sie Fachleuten wohl bekannt sind, und Einsatz des erfindungsgemäßen Korepressors oder Abschnitten davon als Antigene zur Antikörperproduktion hergestellt werden. Sowohl Anti-Peptide als auch Anti-Fusionsprotein-Antikörper können verwendet werden [vgl. zum Beispiel, Bahouth et al. (1991) Trends Pharmacol Sci. vol. 12: 338–343; Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Hrsg.) John Wiley & Sons, New York (1989)]. Zu berücksichtigende Faktoren beim Auswählen von Abschnitten des erfindungsgemäßen Korepressors zum Einsatz als Immunogen (entweder als ein synthetisches Peptid oder ein rekombinant erzeugtes bakterielles Fusionsprotein) beinhalten Antigenizität, Zugänglichkeit (d. h. woraus der ausgewählte Abschnitt abgeleitet wird, z.B. die Ligandenbindungsdomäne, DNA-Bindungsdomäne, Dimerisationsdomäne und dergleichen), Einzigartigkeit des besonderen, ausgewählten Abschnitts (relativ zu bekannten Rezeptoren und Cosuppressoren hierfür) und dergleichen.
  • Die Verwendung einer effektiven Menge eines hierin beschriebenen Antikörpers zur Herstellung eines Medikaments zum Blockieren des Repressionseffekts der erfindungsgemäßen Cosuppressoren wird ebenfalls beschrieben. Alternativ kann auch eine Hemmungsdomäne eines Zellkernrezeptors verwendet werden. Fachleute können einfach geeignete Verfahren zur Verabreichung dieser Antikörper und geeignete Mengen zur Verabreichung bestimmen, welche von zahlreichen Faktoren abhängen, wie die zu behandelnde Indikation, der Zustand des Patienten und dergleichen.
  • Gemäß einem noch weiteren Gesichtspunkt der Erfindung werden isolierte Polynucleinsäuren, die den oben beschrieben Cosuppressor codieren, bereitgestellt. Zudem werden auch Vektoren geschaffen, die die oben beschriebene Polynucleinsäure enthalten.
  • Gemäß einem noch weiteren Gesichtspunkt der Erfindung werden Komplexe bereitgestellt, die den oben beschriebenen Cosuppressor und ein homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren umfasst, wobei dieses Mitglied eine Hemmungsdomäne enthält, welche die Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen reprimiert. Homodimere oder heterodimere Mitglieder der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, die hierbei verwendet werden sollen, umfassen Schilddrüsenhormonrezeptor-Homodimer, Schilddrüsenhormonrezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, Retinsäurerezeptor-Homodimer, Retinsäurerezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, Retinoid-X-Rezeptor-Homodimer und dergleichen.
  • Die oben beschriebenen Komplexe umfassen ferner optional ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren. Solche Response-Elemente sind im Fachgebiet wohlbekannt. Somit werden zum Beispiel RAR-Response-Elemente aus wenigstens einer direkten Wiederholung von zwei oder mehr Halbstellen, die durch einen Abstandshalter von fünf Nucleotiden getrennt sind, zusammengesetzt. Die Abstandsnucleotiden können unabhängig voneinander jeweils aus A, C, G oder T ausgewählt werden. Jede Halbstelle der Response-Elemente, die zur Ausführung der Erfindung eingesetzt werden sollen, enthält die Sequenz
    -RGBNNM-,
    wobei
    R ausgewählt ist aus A oder G;
    B ausgewählt ist aus G, C, oder T;
    jedes N unabhängig voneinander ausgewählt ist aus A, T, C, oder G; und
    M ausgewählt ist aus A oder C;
    mit der Bedingung, dass wenigstens 4 Nucleotide dieser -RGBNNM-Sequenz identisch sind zu den Nucleotiden an entsprechenden Positionen der Sequenz -AGGTCA-. Den in der Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendeten Response-Elementen kann optional Nx vorangehen, wobei x in den Bereich von 0 bis zu 5 fällt.
  • In ähnlicher Weise können TR-Response-Elemente aus den gleichen Halbstellen-Wiederholungen mit einem Abstandshalter aus vier Nucleotiden zusammengesetzt sein. Alternativ sind auch Palindromkonstrukte, wie sie im Fachgebiet beschrieben wurden, als TR-Response-Elemente funktional.
  • Die oben beschriebenen Korepressor/Dimer-Rezeptorkomplexe können durch Kontaktieren des Komplexes mit einem Liganden für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren dissoziiert werden.
  • Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Ligand (oder Ligandenvorstufe) für ein Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren" (d. h. intrazellulärer Rezeptor) auf eine Substanz oder Verbindung, welche sich in ihrer unmodifizierten Form (oder nach Umwandlung zu ihrer "aktiven" Form) innerhalb einer Zelle an Rezeptorproteine bindet, wodurch ein Ligand/Rezeptorkomplex entsteht, der wiederum ein entsprechendes Hormon-Response-Element aktivieren kann. Ein Ligand ist daher eine Verbindung, die dazu dient, Gentranskription für ein Gen unter Steuerung eines Hormon-Response-Elements zu vermitteln, und Verbindungen, wie Hormone, Wachstumssubstanzen, Nicht-Hormon-Verbindungen, die Wachstum vermitteln, und dergleichen umfassen. Liganden beinhalten Steroid- oder steroidähnliche Hormone, Retinoide, Schilddrüsenhormone, pharmazeutisch aktive Verbindungen und dergleichen. Einzelne Liganden können die Fähigkeit besitzen, mehrere Rezeptoren zu binden.
  • Dementsprechend bezieht sich, wie hierin verwendet, "möglicher Ligand" (auch als "Testverbindung" bezeichnet) auf Verbindungen, wie Steroid- oder steroidähnliche Hormone, pharmazeutisch aktive Verbindungen und dergleichen, von denen erwartet wird, dass sie die Fähigkeit besitzen, sich an den interessanten Rezeptor zu binden und Gentranskription unter der Steuerung von Response-Elementen zu vermitteln, die von solch einem Rezeptor erkannt werden.
  • Beispiele bekannter Liganden umfassen all-trans-Retinsäure (Ligand für Retinsäurerezeptor), 9-cis-Retinsäure (Ligand für Retinoid-X-Rezeptor), Schilddrüsenhormon (Ligand für Schilddrüsenhormon-Rezeptor), 1,25-dihydroxy-Vitamin D3 (Ligand für Vitamin D3-Rezeptor) und dergleichen.
  • Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Reprimieren der Aktivität eines Mitglieds der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, das eine Silencerdomäne enthält, welche die Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen reprimiert, geschaffen, wobei dieses Verfahren Kontaktieren dieses Mitglieds der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren mit einer ausreichenden Menge eines oben beschriebenen Cosuppressors umfasst, um die Aktivität dieses Mitglieds zu reprimieren. Mitglieder der Superfamilie, die zur Repression gemäß diesem Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung dienen sollen, beinhalten Schilddrüsenhormon-Rezeptor, Retinsäurerezeptor, Vitamin-D-Rezeptor, Peroxisomproliferator aktivierten Rezeptor und dergleichen.
  • Entsprechend einem noch weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen bereitgestellt, das die Suppression der durch einen hierin beschriebenen Cosuppressor bewirkte Steroid-/Schilddrüsenhormon-Rezeptoraktivität erleichtert, wobei dieses Verfahren das Vergleichen der Größe des oben beschriebenen Cosuppressor/Dimer-Rezeptorkomplexes (d. h. Komplexe, die den oben beschriebenen Cosuppressor und ein homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren enthalten) nach Testverbindungs-Exposition umfasst, relativ zur Größe des Komplexes bei Fehlen der Testverbindung. Eine beobachtete Größe entsprechend einem intakten Komplex zeigt eine inaktive Verbindung, während eine beobachtete Größe, die die Komplexdissoziation widerspiegelt, eine Verbindung anzeigt, die den Komplex spaltet, wobei die hierdurch bewirkte Suppression erleichtert wird. Optional enthält der in dieser Bestimmung verwendete Komplex ferner ein Response-Element für dieses Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren.
  • Die Größe des oben beschriebenen Komplexes kann einfach unter Verwendung verschiedener im Fachgebiet verfügbarer Techniken bestimmt werden. Zum Beispiel können elektrophoretische Mobilitätsveränderungstests (EMSA) angewendet werden (wobei ein Rezeptor allein oder ein Rezeptor-Cosuppressor-Komplex an Ziel-DNA gebunden wird und die relative Mobilität davon bestimmt wird). Die Fachleute können leicht andere Verfahrenstechniken angeben, die zur Größenbestimmung des Komplexes als ein Ergebnis der Exposition an möglichen Liganden verwendet werden können.
  • Entsprechend einem weiteren Gesichtpunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen geschaffen, das die Suppression der durch einen hierin beschriebenen Cosuppressor bewirkte Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität erleichtert, ohne den Rezeptor substanziell zu aktivieren, wobei das Verfahren umfasst:
    Vergleichen des Reportersignals, das durch zwei unterschiedliche Expressionssysteme in Abwesenheit und Anwesenheit einer Testverbindung erzeugt wird,
    wobei das erste Expressionssystem einen Komplex enthält, der umfasst:
    ein homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren ausgewählt aus Schilddrüsenhormonrezeptor-Homodimer, Schilddrüsenhormonrezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, Retinsäurerezeptor-Homodimer oder Retinsäurerezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer,
    ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei das Response-Element mit einem Reporter operativ verbunden ist, und
    optional den erfindungsgemäßen Cosuppressor, und
    wobei das zweite Expressionssystem einen Komplex enthält, der umfasst:
    eine homodimere oder heterodimere Form desselben Mitglieds der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren wie in dem ersten Expressionssystem verwendet, wobei das Mitglied derart mutiert ist, dass es hormonabhängige Aktivierungsaktivität behält, aber seine Fähigkeit zum Reprimieren der Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen verloren hat,
    dieselbe Response-Element/Reporter-Kombination wie im ersten Expressionssystem verwendet, und
    optional den erfindungsgemäßen Cosuppressor, und danach Auswählen jener Verbindungen, die bereitstellen:
    ein höheres Reportersignal, wenn die Verbindung dem ersten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, und
    substanziell dasselbe Reportersignal, wenn die Verbindung dem zweiten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung,
    wobei die ausgewählten Verbindungen imstande sind, die durch einen Cosuppressor mit einer für den Silencermediator für Retinsäure und Schilddrüsenrezeptoren charakteristischen Struktur und Funktion bewirkte Suppression der Steroid- /Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu erleichtern, aber substanziell die Fähigkeit fehlt, Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu aktivieren.
  • Das Hinzufügen des erfindungsgemäßen Cosuppressors ist in der oben beschriebenen Bestimmung optional, da dieser in den meisten für solche Tests verwendeten Wirtszellen endogen vorliegt. Es ist bevorzugt, die Anwesenheit einer etwa konstanten Menge des Cosuppressors sicherzustellen und zu sichern, dass der Cosuppressor keine begrenzende Reagenz ist und dass der Cosuppressor exogen zu oben beschriebenen Tests zugeführt werden kann.
  • Die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendeten mutierten Rezeptoren werden in brauchbarer Weise durch Expressionsplasmide erzeugt, die durch Transfektion in die Wirtszelle eingesetzt werden. Die hierin zur Anwendung vorgesehenen mutierten Rezeptoren umfassen RAR403-Homodimere, RAR403 enthaltende Heterodimere, TR160-Homodimere, TR160 enthaltende Heterodimere und dergleichen.
  • Die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung vorgesehenen Reporterkonstrukte umfassen:
    • (a) einen Promotor, der in der Wirtszelle wirkt,
    • (b) ein Hormon-Response-Element, und
    • (c) ein DNA-Segment, das ein Reporterprotein encodiert,

    wobei das das Reporterprotein encodierende DNA-Segment operativ mit dem Promotor zur Transkription des DNA-Segments verbunden ist, und
    wobei das Hormon-Response-Element operativ mit dem Promotor zu dessen Aktivierung verbunden ist.
  • Die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung vorgesehenen Hormon-Response-Elemente sind im Fachgebiet wohlbekannt, wie obenstehend angemerkt wurde.
  • Beispielsweise umfassen Reportergene Chloramphenicoltransferase (CAT), Luciferase (LUC), beta-Galactosidase (β-gal) und dergleichen. Beispiele von Promotoren sind der Affenvirus (SV) Promotor oder modifizierte Form davon (z. B. ΔSV), der Thymidinkinase (TK) Promotor, der Brustkrebsvirus (MTV) Promotor oder modifizierte Form davon (z.B. ΔMTV) und dergleichen [vgl. zum Beispiel, Mangelsdorf et al., in Nature 345: 224–229 (1990), Mangelsdorf et al., in Cell 66: 555–561 (1991), und Berger et al., in J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 41: 733–738 (1992)].
  • Bei dem hierin verwendeten Ausdruck "operatives Response-Element, das funktionell mit einem operativen Reportergen verbunden ist" meint das Wort "operativ", dass die entsprechenden DNA-Sequenzen (dargestellt durch die Ausdrücke "GAL4-Response-Element" und "Reportergen") operational sind, d. h. für ihre beabsichtigten Zwecke arbeiten; das Wort "funktionell" bedeutet, dass nach Verbindung der zwei Segmente und entsprechender Aktivierung durch einen Ligand-Rezeptorkomplex das Reportergen als Ergebnis der Tatsache, dass das "GAL4-Response-Element angeschaltet" oder auf andere Weise aktiviert ist, exprimiert wird.
  • Bei Durchführung des oben beschriebenen, funktionellen Biotests werden das Expressionsplasmid und das Reporterplasmid zusammen in geeignete Wirtszellen übertragen. Die transfizierten Wirtszellen werden dann in der Anwesenheit und Abwesenheit einer Testverbindung kultiviert, um zu bestimmen, ob die Testverbindung geeignet ist, eine Aktivierung des Promotors zu erzeugen, der operativ mit dem Response-Element des Reporterplasmids verbunden ist. Danach werden die transfizierten und kultivierten Wirtszellen auf Induktion (d. h. die Anwesenheit) des Produktes der Reportergensequenz überwacht.
  • Jegliche Zelllinie kann als geeigneter "Wirt" für den funktionellen Biotest zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung vorgesehenen Zellen beinhalten daher transformierte Zellen, nicht-transformierte Zellen, neoplastische Zellen, Primärkulturen von unterschiedlichen Zelltypen und dergleichen. Beispiele von Zellen zur Durchführung der vorliegenden Erfindung beinhalten Schneider-Zellen, CV-1 Zellen, HuTu80 Zellen, F9 Zellen, NTERA2 Zellen, NB4 Zellen, NL-60 Zellen, 293-Zellen, Hela-Zellen, Hefezellen und dergleichen. Bevorzugte Wirtszellen zur Verwendung im funktionellen Biotestsystem sind COS Zellen und CV-1 Zellen. COS-1 (bezeichnet als COS) Zellen sind Affennieren-Zellen, die das SV40 T-Antigen (Tag) exprimieren, während CV-1 Zellen SV40-Tag nicht exprimieren. Die Anwesenheit von Tag in den COS-1 Derivativlinien erlaubt es dem eingesetzten Expressionsplasmid zu replizieren und schafft eine relative Steigerung in der während der Testperiode erzeugten Rezeptormenge. CV-1 Zellen werden gegenwärtig bevorzugt, da sie besonders passend für Gentransferstudien sind und ein sensitives und gut beschriebenes Wirtszellensystem liefern.
  • Die oben beschriebenen Zellen (oder Teile davon) werden unter physiologischen Bedingungen gehalten, wenn sie mit physiologisch aktiver Verbindung in Kontakt gebracht werden. "Physiologische Bedingungen" werden von Fachleuten einfach so verstanden, dass ein isotonisches, wässriges Nährmedium bei einer Temperatur von etwa 37°C vorliegt.
  • Gemäß einem noch weiteren Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen geschaffen, welche die Steroid-/Schilddrüsenhormon-Rezeptoraktivität aktivieren, aber denen im Wesentlichen die Fähigkeit fehlt, die durch den hierin beschriebenen Cosuppressor bewirkte Suppression zu erleichtern, wobei das Verfahren umfasst:
    Vergleichen des Reportersignals, das durch zwei unterschiedliche Expressionssysteme in Abwesenheit und Anwesenheit einer Testverbindung erzeugt wird,
    wobei das erste Expressionssystem einen Komplex enthält, der umfasst:
    ein homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren ausgewählt aus Schilddrüsenhormonrezeptor-Homodimer, Schilddrüsenhormonrezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, Retinsäurerezeptor-Homodimer oder Retinsäurerezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer,
    ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei das Response-Element operativ mit einem Reporter verbunden ist, und
    optional den erfindungsgemäßen Cosuppressor, und
    wobei das zweite Expressionssystem einen Komplex, der umfasst:
    eine homodimere oder heterodimere Form desselben Mitglieds der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren wie im ersten Expressionssystem verwendet, wobei das Mitglied derart mutiert ist, dass es hormonabhängige Aktivierungsaktivität behält, aber seine Fähigkeit zum Reprimieren von Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen verloren hat,
    dieselbe Response-Element/Reporter-Kombination wie im ersten Expressionssystem verwendet, und
    optional den erfindungsgemäßen Cosuppressor, und danach Auswählen jener Verbindungen, die bereitstellen:
    ein höheres Reportersignal, wenn die Verbindung dem zweiten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, und
    substanziell dasselbe Reportersignal, wenn die Verbindung dem ersten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung,
    wobei die ausgewählten Verbindungen imstande sind, Steroid-/Schilddrüsenhormon-Rezeptoraktivität zu aktivieren, aber substanziell die Fähigkeit fehlt, die durch einen Cosuppressor mit einer für den Silencermediator für Retinsäure und Schilddrüsenrezeptoren charakterischen Struktur und Funktion bewirkte Suppression zu erleichtern.
  • Entsprechend einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen geschaffen, welche die durch den hierin beschreibenen Cosuppressor bewirkte Suppression von Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität erleichtern und den Rezeptor aktivieren, wobei das Verfahren umfasst:
    Vergleichen des Reportersignals, das durch zwei unterschiedliche Expressionssysteme in der Abwesenheit und Anwesenheit einer Testverbindung erzeugt wird,
    wobei das erste Expressionssystem einen Komplex enthält, der umfasst:
    ein homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, ausgewählt aus Schilddrüsenhormonrezeptor-Homodimer, Schilddrüsenhormonrezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, Retinsäurerezeptor-Homodimer oder Retinsäurerezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer,
    ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei das Response-Element mit einem Reporter operativ verbunden ist, und
    optional den erfindungsgemäßen Cosuppressor, und
    wobei das zweite Expressionssystem einen Komplex aufweist, der umfasst:
    eine homodimere oder heterodimere Form desselben Mitglieds der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren wie im ersten Expressionssystem verwendet, wobei das Mitglied derart mutiert ist, dass es hormonabhängige Aktivierungsaktivität behält, aber seine Fähigkeit zum Reprimieren der Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen verloren hat,
    dieselbe Response-Element/Reporter-Kombination wie im ersten Expressionssystem verwendet, und
    optional den erfindungsgemäßen Cosuppressor, und danach Auswählen jener Verbindungen, die bereitstellen:
    erhöhtes Reportersignal, wenn die Verbindung dem zweiten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, und
    substanziell erhöhtes Reportersignal, wenn die Verbindung dem ersten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung,
    wobei die ausgewählten Verbindungen imstande sind, die durch den Cosuppressor nach Anspruch 1 bewirkte Suppression von Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu erleichtern und den Rezeptor zu aktivieren.
  • Gemäß einer noch anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden modifizierte Formen des oben beschriebenen Cosuppressors geschaffen, einschließlich:
    Volllängen-Silencermediator für Retinsäure und Schilddrüsenrezeptoren nach Anspruch 1 plus GAL4-DNA-Bindungsdomäne,
    Volllängen-Silencermediator für Retinsäure und Schilddrüsenrezeptoren nach Anspruch 1 plus GAL4-Aktivierungsdomäne,
    Volllängen-Silencermediator für Retinsäure und Schilddrüsenrezeptoren nach Anspruch 1 plus Glutathion-S-Transferase (GST) Anhang.
  • Die oben beschriebenen modifizierten Formen des erfindungsgemäßen Cosuppressors können in vielfältiger Weise eingesetzt werden, z. B. in den hierin beschriebenen Tests.
  • Ein besonders bevorzugter, modifizierter Cosuppressor gemäß der Erfindung enthält einen Volllängen-Silencermediator für Retinsäure und Schilddrüsenrezeptoren plus GAL4-Aktivierungsdomäne.
  • Entsprechend einer noch weiteren Ausführung der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen geschaffen, welche die Fähigkeit eines hierin beschriebenen Cosuppressors mit Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoren zu komplexieren, unterbrechen, ohne den Rezeptor im Wesentlichen zu aktivieren, wobei das Verfahren umfasst:
    Vergleichen des Reportersignals, das durch zwei unterschiedliche Expressionssysteme in der Abwesenheit und Anwesenheit einer Testverbindung erzeugt wird,
    wobei das erste Expressionssystem einen Komplex enthält, der umfasst:
    einen modifizierten Cosuppressor, wie oben beschrieben,
    ein homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, ausgewählt aus Schilddrüsenhormonrezeptor-Homodimer, Schilddrüsenhormonrezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, Retinsäurerezeptor-Homodimer oder Retinsäurerezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, und
    ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei das Response-Element mit einem Reporter operativ verbunden ist, und
    wobei das zweite Expressionssystem einen Komplex enthält, der umfasst:
    den modifizierten Cosuppressor,
    eine homodimere oder heterodimere Form desselben Mitglieds der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren wie im ersten Expressionssystem verwendet, wobei das Mitglied derart mutiert ist, dass es hormonabhängige Aktivierungsaktivität behält, aber seine Fähigkeit zum Reprimieren der Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen verloren hat, und
    diesselbe Response-Element/Reporter-Kombination wie in dem ersten Expressionssystem verwendet, und danach Auswählen jener Verbindungen, die bereitstellen:
    ein niedrigeres Reportersignal, wenn die Verbindung dem ersten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in der Abwesenheit der Verbindung, und
    substanziell dasselbe Reportersignal, wenn die Verbindung dem zweiten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in der Abwesenheit der Verbindung,
    wobei die ausgewählten Verbindungen imstande sind, die Fähigkeit des Cosuppressors nach Anspruch 1, mit Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoren zu komplexieren, zu unterbrechen, ohne den Rezeptor im Wesentlichen zu aktivieren.
  • Die zur Durchführung dieser Ausführung der vorliegenden Erfindung vorgesehenen mutierten Rezeptoren beinhalten RAR403-Homodimere, RAR403 enthaltende Heterodimere, TR160-Homodimere, TR160 enthaltende Heterodimere und dergleichen.
  • Geeignete Wirtszellen zur Verwendung bei dieser Ausführung der vorliegenden Erfindung umfassen Säuger-Zellen als auch Hefezellen. Hefezellen werden gegenwärtig bevorzugt, da sie keinen Hintergrund mit sich bringen, weil SMRT (d. h. Silencermediator (Korepressor) für Retinsäurerezeptor (RAR) und Schilddrüsenhormon-Rezeptor (TR)) nicht endogen zu Hefe ist.
  • Gemäß noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen geschaffen, welche die Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität aktivieren, aber im Wesentlichen die Fähigkeit fehlt, einen Komplex auseinander zu brechen, der einen Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor und einen hierin beschriebenen Cosuppressor umfasst, wobei das Verfahren umfasst:
    Vergleichen des Reportersignals, das durch zwei unterschiedliche Expressionssysteme in der Abwesenheit und Anwesenheit einer Testverbindung erzeugt wird,
    wobei das erste Expressionssystem einen Komplex enthält, der umfasst:
    einen modifizierten Cosuppressor, wie oben beschrieben,
    ein homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, ausgewählt aus Schilddrüsenhormonrezeptor-Homodimer, Schilddrüsenhormonrezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, Retinsäurerezeptor-Homodimer oder Retinsäurerezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, und
    ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei das Response-Element mit einem Reporter operativ verbunden ist, und
    wobei das zweite Expressionssystem umfasst:
    den modifizierten Cosuppressor,
    eine homodimere oder heterodimere Form desselben Mitglieds der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren wie im ersten Expressionssystem verwendet, wobei das Mitglied derart mutiert ist, dass es hormonabhängige Aktivierungsaktivität behält, aber seine Fähigkeit zum Reprimieren der Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen verloren hat, und
    dieselbe Response-Element/Reporter-Kombination wie im ersten Expressionssystem verwendet, und danach Auswählen jener Verbindungen, welche bereitstellen:
    ein höheres Reportersignal, wenn die Verbindung dem zweiten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, und
    substanziell dasselbe Reportersignal, wenn die Verbindung dem ersten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung,
    wobei die ausgewählten Verbindungen imstande sind, Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu aktivieren, aber im Wesentlichen nicht die Fähigkeit haben, den Komplex aus einem Cosuppressor nach Anspruch 1 und einem Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor auseinander zu brechen.
  • Geeignete Wirtszellen zur Verwendung in dieser Ausführung der vorliegenden Erfindung beinhalten Säugerzellen als auch Hefezellen. Hefezellen werden gegenwärtig bevorzugt, da sie keinen Hintergrund mit sich bringen, weil SMRT nicht endogen zu Hefe ist.
  • Entsprechend einem noch weiteren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen geschaffen, die einen Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor aktivieren und die Fähigkeit eines hierin beschriebenen Cosuppressors mit dem Rezeptor zu komplexieren, unterbrechen, wobei das Verfahren umfasst:
    Vergleichen des Reportersignals, das durch zwei unterschiedliche Expressionssysteme in der Abwesenheit und Anwesenheit einer Testverbindung erzeugt wird,
    wobei das erste Expressionssystem einen Komplex enthält, der umfasst:
    einen modifizierten Cosuppressor wie oben beschrieben,
    ein homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, ausgewählt aus Schilddrüsenhormonrezeptor-Homodimer, Schilddrüsenhormonrezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, Retinsäurerezeptor-Homodimer oder Retinsäurerezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, und
    ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei das Response-Element mit einem Reporter operativ verbunden ist, und
    wobei das zweite Expressionssystem einen Komplex enthält, der umfasst:
    den modifizierten Cosuppressor,
    dasselbe homodimere oder heterodimere Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wie im ersten Expressionssystem verwendet, wobei das Mitglied derart mutiert ist, dass es hormonabhängige Aktivierungsaktivität behält, aber seine Fähigkeit zum Reprimieren der Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen verloren hat, und
    dieselbe Response-Element/Reporter-Kombination wie im ersten Expressionssystem verwendet, und danach Auswählen jener Verbindungen, die bereitstellen:
    eine Verringerung des Reportersignals, wenn die Verbindung dem ersten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, und
    ein erhöhtes Reportersignal, wenn die Verbindung dem zweiten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung,
    wobei die ausgewählten Verbindungen imstande sind, einen Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor zu aktivieren und einen Komplex, der einen Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor und den Cosuppressor nach Anspruch 1 umfasst, auseinander zu brechen.
  • Geeignete Wirtszellen zur Verwendung bei dieser Ausführung der vorliegenden Erfindung beinhalten Säugerzellen als auch Hefezellen. Hefezellen werden gegenwärtig bevorzugt, da sie keinen Hintergrund mit sich bringen, weil SMRT nicht endogen zu Hefe ist.
  • Gemäß einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen geschaffen, die einen Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor aktivieren und/oder die Fähigkeit eines hierin beschreibenen Cosuppressors mit dem Rezeptor zu komplexieren, unterbrechen, wobei das Verfahren umfasst:
    Vergleichen des Reportersignals, das durch ein Kombinationsexpressionssystem in der Abwesenheit und Anwesenheit einer Testverbindung erzeugt wird,
    wobei das Kombinationsexpressionssystem umfasst:
    ein erstes homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, ausgewählt aus Schilddrüsenhormonrezeptor-Homodimer, Schilddrüsenhormonrezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, Retinsäurerezeptor-Homodimer oder Retinsäurerezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer,
    eine zweite homodimere oder heterodimere Form desselben Mitglieds der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren wie im ersten Homodimer oder Heterodimer verwendet, wobei das Mitglied derart mutiert ist, dass es hormonabhängige Aktivierungsaktivität behält, aber seine Fähigkeit zum Reprimieren der Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen verloren hat (d. h. Grundniveauexpression bereitstellt),
    wobei entweder das erste Homodimer (oder Heterodimer) oder das zweite Homodimer (oder Heterodimer) mit einer GAL4-DNA-Bindungsdomäne operativ verbunden ist,
    ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei das Response-Element mit einem ersten Reporter operativ verbunden ist,
    ein GAL4-Response-Element, wobei das Response-Element mit einem zweiten Reporter operativ verbunden ist, und
    optional einen Cosuppressor mit Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität, wobei der Cosuppressor eine Struktur und Funktion aufweist, die charakteristisch für den Silencermediator für Retinsäure und Schilddrüsenrezeptoren ist, und danach Identifizieren als imstande, die Suppression von durch den Cosuppressor nach Anspruch 1 bewirkter Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu erleichtern, aber im Wesentlichen nicht die Fähigkeit besitzt, Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu aktivieren, wobei jene Verbindungen bereitstellen:
    ein höheres Reportersignal von dem auf das erste Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem ersten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit dieser Verbindung, und
    im Wesentlichen dasselbe Reportersignal von dem auf das zweite Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem zweiten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit dieser Verbindung, oder
    Identifizieren als imstande, Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu aktivieren, aber im Wesentlichen ohne die Fähigkeit, die durch den Cosuppressor nach Anspruch 1 bewirkte Suppression zu erleichtern, wobei jene Verbindungen bereitstellen:
    ein höheres Reportersignal von dem auf das zweite Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem zweiten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit dieser Verbindung, und
    im Wesentlichen dasselbe Reportersignal von dem auf das erste Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem ersten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit dieser Verbindung, oder
    Identifizieren als imstande, die Suppression der durch den Cosuppressor nach Anspruch 1 bewirkten Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu erleichtern und den Rezeptor zu aktivieren, wobei jene Verbindungen bereitstellen:
    ein höheres Reportersignal von dem auf das zweite Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem zweiten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit dieser Verbindung, und
    eine größere Steigerung des Reportersignals von dem auf das erste Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem ersten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit dieser Verbindung.
  • Somit kann die Änderung im Expressionspegel von den zwei unterschiedlichen, in einer einzigen Transfektion eingesetzten Reportern gleichzeitig überwacht werden. Basierend auf den Ergebnissen dieser einzigen Transfektion kann man einfach die Art der Interaktion einer Testverbindung mit dem Rezeptor/SMRT-Komplex identifizieren.
  • Beispiele von GAL4-Response-Elementen sind jene, die das palindromische 17-mer enthalten:
    5'-CGGAGGACTGTCCTCCG-3' (SEQ ID NO: 3),
    wie zum Beispiel 17MX, beschrieben von Webster et al., in Cell 52: 169–178 (1988), ebenso wie Derivate davon. Weitere Beispiele geeigneter Response-Elemente beinhalten jene, die von Hollenberg und Evans in Cell 55: 899–906 (1988); oder Webster et al. in Cell 54: 199–207 (1988) beschrieben wurden.
  • Gemäß einem noch anderen Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen geschaffen, die einen Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor aktivieren und/oder die Fähigkeit eines hierin beschriebenen Cosuppressors mit dem Rezeptor zu komplexieren, unterbrechen, wobei das Verfahren umfasst:
    Vergleichen der Reportersignale, die durch ein Kombinationsexpressionssystem in der Abwesenheit und Anwesenheit einer Testverbindung erzeugt werden,
    wobei das Kombinationsexpressionssystem umfasst:
    einen modifizierten Cosuppressor wie oben beschrieben,
    ein erstes homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, ausgewählt aus Schilddrüsenhormonrezeptor-Homodimer, Schilddrüsenhormonrezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, Retinsäurerezeptor-Homodimer oder Retinsäurerezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer,
    eine zweite homodimere oder heterodimere Form desselben Mitglieds der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren wie im ersten Homodimer oder Heterodimer verwendet, wobei das Mitglied derart mutiert ist, dass es hormonabhängige Aktivierungsaktivität behält, aber seine Fähigkeit zum Reprimieren der Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen verloren hat,
    wobei entweder das erste Homodimer (oder Heterodimer) oder das zweite Homodimer (oder Heterodimer) mit einer GAL4-DNA-Bindungsdomäne operativ verbunden ist,
    ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei das Response-Element mit einem erstem Reporter operativ verbunden ist,
    ein GAL4-Response-Element, wobei das Response-Element mit einem zweiten Reporter operativ verbunden ist, und danach
    Identifizieren als imstande, die Fähigkeit des Cosuppressors nach Anspruch 1 mit einem Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor zu komplexieren, zu unterbrechen, ohne den Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor im Wesentlichen zu aktivieren, wobei jene Verbindungen bereitstellen:
    ein niedrigeres Reportersignal vom auf das erste Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem ersten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit dieser Verbindung, und
    im Wesentlichen dasselbe Reportersignal vom auf das zweite Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem zweiten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit dieser Verbindung, oder
    Identifizieren als imstande, Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu aktivieren, aber im Wesentlichen ohne die Fähigkeit, einen Komplex auseinander zu brechen, der einen Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor und einen Cosuppressor mit einer für den Silencermediator für Retinsäure- und Schilddrüsenrezeptoren charakteristischen Struktur und Funktion umfasst, wobei jene Verbindungen bereitstellen:
    ein höheres Reportersignal vom auf das zweite Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem zweiten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit dieser Verbindung, und
    im Wesentlichen dasselbe Reportersignal vom auf das erste Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem ersten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit dieser Verbindung, oder
    Identifizieren als imstande, einen Komplex, umfassend einen Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor und einen Cosuppressor mit einer für den Silencermediator für Retinsäure- und Schilddrüsenrezeptoren charakteristischen Struktur und Funktion auseinander zu brechen, und den Rezeptor zu aktivieren, wobei jene Verbindungen bereitstellen:
    eine Verringerung im Reportersignal vom auf das erste Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem ersten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit dieser Verbindung, und
    ein erhöhtes Reportersignal vom auf das zweite Mitglied ansprechenden Reporter, wenn diese Verbindung dem zweiten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zum Reportersignal in Abwesenheit dieser Verbindung.
  • Entsprechend einem noch weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen geschaffen, welche die durch einen vorstehend beschriebenen Cosuppressor bewirkte Suppression der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Rezeptoraktivität erleichtern, wobei dieses Verfahren die Bestimmung der Wirkung des Zufügens von Testverbindung zu einem Expressionssystem beinhaltet, umfassend:
    ein modifiziertes Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei das modifizierte Mitglied eine Aktivierungsdomäne enthält, die den Rezeptor konstitutiv aktiv macht,
    ein Fusionsprotein, das die Rezeptor-Wechselwirkungsdomäne von SMRT umfasst, die mit der GAL4-DNA-Bindungsdomäne operativ verbunden ist, und
    ein GAL4-Response-Element, das mit einem Reporter operativ verbunden ist.
  • Vor der Hinzugabe eines effektiven Liganden für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von hierin verwendeten Rezeptoren, wird die Verbindung des modifizierten Mitglieds und des Fusionsproteins wirksam werden, um das GAL4-Response-Element zu binden und die Transkription des Reporters zu aktivieren. Die Anwesenheit eines effektiven Liganden wird angezeigt durch eine Verringerung des Reportersignals beim Aussetzen an den Liganden, der die Zusammenwirkung des modifizierten Mitglieds und Fusionsproteins unterbricht.
  • Die zur Durchführung der vorliegenden Erfindung vorgesehenen Aktivierungsdomänen sind im Fachgebiet wohl bekannt und können durch Fachleute leicht bestimmt werden. Beispiele beinhalten die GAL4-Aktivierungsdomäne, BP64 und dergleichen.
  • Zusammenfassend wurde ein neuartiger Kernrezeptor-Korepressor identifiziert, der das transkriptionelle Silencing von RAR und TR vermittelt. Diese Entdeckung ist von großem Interesse, da sich zeigte, dass das transkriptionelle Silencing eine wichtige Rolle in der Entwicklung, Zelldifferenzierung und der onkogenen Aktivität von v-erbA (Baniahmad et al., EMBO J. 11: 1015–1023 (1992)); Gandrillon et al., Cell 49: 687–697 (1989)); Zenke et al., Cell 61: 1035–1049 (1990); Barlow et al., EMBO J. 13: 4241–4250 (1994); Levine und Manley, Cell 59: 405–408 (1989); Baniahmad et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10633–10637 (1992); und Saitou et al., Nature 374: 159–162 (1995)) spielt. Tatsächlich unterdrücken v-erbA-Mutanden, die den Pro160- zu Arg-Wechsel in der TR beherbergen, weder basale Transkription noch sind sie zu onkogenen Transformation imstande (Damm und Evans, (1993) supra.
  • Die Funktion von SMRT als ein Silencermediator (Korepressor) von RAR und TR ist analog zu mSin3 im Mad-Max-Sin3-Ternärkomplex (Schreiber-Agus et al., Cell 80: 777–786 (1995); und Ayer et al., Cell 80: 767–776 (1995)). Da GAL-SMRT als ein kräftiger Repressor wirkt, wenn an DNA gebunden, ist es vernünftig anzunehmen, dass die Funktion der unligandierten Rezeptoren mit sich bringt, SMRT über Protein-Protein-Interaktion zu vervielfältigen. Daher ist die Repressorfunktion bei SMRT intrinsisch, im Gegensatz zu TR oder RAR selbst. (Baniahmad et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8832–8836 (1993); und Fondell et al., Genes Dev 7: 1400–1410 (1993)). Es wird hierin aufgezeigt, dass der Ligand eine SMRT-Dissoziation vom Rezeptor auslöst, was zu einem Initialschritt beim Aktivierungsprozess führen würde. Dies würde gefolgt von (oder übereinstimmend mit) einem induzierten, konformen Wechsel in der Carboxy-Terminal-Transaktivationsdomäne (τc, auch AF-2 genannt), was die Anbindung von Coaktivatoren bei der Transkriptionsanlage erlaubt (Douarin et al., EMBO J. 14: 2020–2033 (1995); Halachmi et al., Science 264: 1455–1458 (1994); Lee et al., Nature 374: 91–94 (1995); und Cavailles et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10009–10013 (1994)). Daher würde, wie früher vorgeschlagen wurde (Damm und Evans (1993) supra), die Liganden abhängige Aktivierung von TR zwei trennbare Verfahren darstellen, einschließlich der Befreiung von Repression und Netzaktivierung. Die Isolierung von SMRT bietet nun eine Basis zur Zergliederung der Molekularbasis der Transrepression.
  • Die Erfindung wird nun in größerer Einzelheit mit Bezug auf die nachfolgenden, nicht-einschränkenden Beispiele beschrieben.
  • Beispiel 1
  • Isolierung von SMRT
  • Unter Verwendung eines GAL4-DBD-RXR-Fusionsproteins (vgl. zum Beispiel, USSN 08/177,740, die hierin insgesamt miteinbezogen wird) als Ausgangspunkt in einen Hefe-Zweihybrid-Screeningsystem (Durfee et al. Genes Dev 7: 555–569 (1993)), wurden mehrere cDNA-Klone isoliert, die Rezeptor interaktive Proteine encodieren. Eines dieser Proteine, SMRT, wirkt stark mit unligandierten RAR und TR zusammen, aber nur schwach mit RXR oder anderen Rezeptoren in Hefe. Dieses Protein wurde zur weiteren Charakterisierung ausgewählt.
  • Beispiel 2
  • Far-Western-Blotting-Verfahren
  • Alle Bakterienextrakte, die GST-Fusionen von hRARα (aa 156–462) oder hRXRα LBD (aa 228–462) exprimieren, und Kontrollextrakte, die GST allein oder GST-PML-Fusionsproteine exprimieren, wurden SDS/PAGE unterzogen und auf Nitrozellulose in Transferpuffer (25 mM Tris, pH 8,3/192 mM Glycin/0,01% SDS) elektrogeblottet. Nach Denaturierung/Renaturierung von 6 M auf 0,187 M Guanidinhydrochlorid in HB-Puffer (25 mM Hepes, pH 7,7/25 mM NaCl/5 mM MgCl2/1 mM DTT) wurden Filter bei 4°C in Blockierungspuffer (5% Milch, dann 1% Milch in HB-Puffer plus 0,05% NP40) gesättigt. In vitro translatierte 35S-markierte Proteine wurden in H-Puffer (20 mM Hepes, pH 7,7/75 mM KCl/0,1 mM EDTA/2,5 mM MgCl2/0,05% NP40/1% Milch/1 mM DTT) verdünnt und die Filter wurden über Nacht bei 4°C mit (1 μM) oder ohne Ligand hybridisiert. Nach drei Waschgängen mit H-Puffer, wurden die Filter getrocknet und zur Autoradiographie exponiert oder durch Phosphoimager quantifiziert.
  • GST-SMRT ist eine GST-Fusion von C-SMRT, encodiert durch das Hefe-Zweihybrid-Klon. GST-SMRT wurde gereinigt, aber enthält einige Degradationsprodukte.
  • Zum Hefe-Zweihybrid-Screening wurde ein Konstrukt, das das GAL4-DBD-hRXRα-LBD (aa 198–462) Fusionsprotein exprimiert, verwendet, um eine menschliche Lymphozyten-cDNA-Bank, wie beschrieben (Durfee et al., (1993) supra) zu screenen. Volllängen-SMRT-cDNA wurde aus einer menschlichen HeLa-cDNA-Bank (Clontech) unter Verwendung des Zweihybridinserts als Sonde isoliert.
  • Bei Verwendung des oben beschriebenen Far-Western-Blotting-Verfahrens komplexiert 35S-markiertes SMRT vorzugsweise mit bakteriellen Extrakten, die RAR exprimieren, bindet sich marginal mit RXR und zeigt keine Bindung mit Kontrollextrakten. Im Gegensatz dazu bindet sich 35S-PPAR selektiv mit seinem Heterodimerpartner, RXR, aber nicht mit RAR. In einer ähnlichen Prüfung wirkt 35S-markiertes RAR oder TR stark mit SMRT und ihrem Heterodimerpartner, RXR, zusammen, aber nicht mit abgebauten GST-Produkten, während 35S-RXR nur schwach mit SMRT zusammenwirkt. Die Ligandenbindung an RAR oder TR reduziert deren Interaktionen mit SMRT, aber nicht mit RXR, während die Ligandenbindung an RXR nur einen geringen Effekt aufweist. 1 zeigt die Quantifizierung einer dosisabhängigen SMRT-Dissoziation von RAR oder TR durch all-trans-Retinsäure (atRA) oder Schilddrüsenhormon (Triiodothyronin oder T3), was aufzeigt, dass die Ligandenmenge, die zur 50% Dissoziation in beiden Fällen erforderlich ist, nahe an der "kds" für beide Liganden ist (Munoz et al. EMBO J. 7: 155–159 (1988); Sap et al., Nature 340: 242–244 (1989); und Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3559–3563 (1991)).
  • Volllängen-SMRT encodiert ein Polypeptid mit 1495 Aminosäuren, reich an Prolin- und Serin-Resten (vgl. 2 und SEQ ID NO: 1). Ein Genbankdatenvergleich enthüllt Ähnlichkeiten der C-Terminal-Domäne von SMRT zu einer partiellen cDNA, die ein anderes rezeptorinteraktives Protein, RIP13 encodiert (Seol et al., (1995) supra), dessen Rolle bei der Rezeptorsignalgabe unbekannt ist. In diesem Bereich können mehrere potentielle Heptadwiederholungen identifiziert werden, die Protein-Protein-Interaktion mit der "ahelikalen Sandwich"-Struktur (Bourguet et al., Nature 375: 377–382 (1995)) der Ligand-Bindungsdomäne (LBD) von Rezeptoren vermitteln könnten.
  • Beispiel 3
  • Charakterisierung von SMRT
  • Im Gegensatz zu anderen Kernrezeptoren besitzen unligandierte RAR und TR eine starke Silencerdomäne, die die Grundniveau-Promotoraktivität ihrer Zielgene (Damm et al., Nature 339: 593–597 (1989); Brent et al., New Biol. 1: 329–336 (1989); Baniahmad et al., Cell 61: 505–514 (1990); und Baniahmad et al., EMBO J. 11: 1015–1023 (1992)) reprimiert. Die bevorzugte Interaktion von SMRT mit RAR und TR in der Abwesenheit von Hormonen deutet an, dass SMRT eine Rolle bei Vermittlung des transkriptionellen Silencingeffekts des Rezeptors spielen kann.
  • Um die Einbindung von SMRT beim Silencing weiter zu untersuchen, wurde die Interaktion von SMRT mit mutierten Rezeptoren, die unterschiedliche Silencing- und/oder Transaktivationsaktivitäten zeigen, wie folgt getestet. 35S-Methionin markierte Rezeptoren wurden als Sonden benutzt, um immobilisierte GST-SMRT in der Anwesenheit (10 μM) oder Abwesenheit von all-trans-Retinsäure (atRA) zu hybridisieren. Das gesamte Bakterienextrakt, das GST-RXR exprimiert, wurde als Kontrolle einbezogen.
  • Bei Quantifizierung durch Phosphoimager zeigt RAR403 eine 4-fach bessere Interaktion mit SMRT als Wildtyp-RAR. Sowohl Volllängen-RAR oder auch eine Deletionsmutante, die nur die Ligandbindungsdomäne (LBD, bezeichnet als ΔΔR) exprimiert, binden sich mit SMRT; diese Bindung wird durch Liganden blockiert.
  • Diese Ergebnisse bestätigen, dass die LBD allein in der Interaktion ausreichend ist. Die Carboxy-Terminal-Deletionsmutante RAR403 ist ein kräftiger, dominant negativer Suppressor der Grundniveau-Promotoraktivität von RAR-Zielgenen (Damm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2989–2993 (1993); Tsai und Collins, Proc. Nati. Acad. Sd. USA 90: 7153–7157 (1993); und Tsai et al., Genes Dev 6: 2258–2269 (1992)). Aus den vorstehenden Studien könnte vorhergesagt werden, dass RAR403 und seine Aminoterminal-Deletionsderivate, ΔΔR403, entweder in Anwesenheit oder Abwesenheit von Liganden stark mit SMRT zusammenwirken, entsprechend der SMRT-Vermittlung der Repressoraktivität dieser Mutanten.
  • Beispiel 4
  • Interaktion von SMRT mit TR Mutanten
  • Die Interaktion von SMRT mit zwei unterschiedlichen Klassen von TR-Mutanten wurde als nächstes analysiert. Die zuerst verwendete Mutante ist das natürlich auftretende Onkogen, v-erbA, das eine starke Silencing-Fähigkeit, aber keine Transaktivationsaktivität besitzt (Sap et al., (1989) supra; Sap et al., Nature 15 324: 635–640 (1986); Weinbergen et al., Nature 318: 670–672 (1985); und Weinbergen et al., Nature 324: 641–646 (1986)). Die zweite verwendete Mutante ist ein Einzel-Aminosäurewechsel (Pro160 zu Arg) von rTRa (TR160), für die früher nachgewiesen wurde, die Fähigkeit bei der Grundniveausuppression zu verlieren, aber hormonabhängige Transaktivation zu behalten (Thompson et al., Science 237: 1610–1614 (1987); sowie Damm und Evans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10668–10672 (1993)). Wenn SMRT beim Silencing miteinbezogen ist, würde erwartet werden, dass SMRT mit v-erbA zusammenwirken sollte, aber zeigte geringe oder keine Bindung mit der TR160-Mutanten ohne Silencing.
  • Die Interaktion des onkogenen v-erbA und der rTRα R160 Mutante (TR160) mit GST-SMRT wurde in einer Far-Western-Prüfung bestimmt, wie oben beschrieben (vgl. Beispiel 2). Bei Quantifizierung durch Phosphoimager zeigt das v-erbA eine 18-fach bessere Interaktion mit SMRT als hTRβ, und die TR160-Mutante zeigt ein 10-fach geringeres Signal als rTRα.
  • Wie man erwarten könnte, wirkt v-erbA stark mit SMRT zusammen, sowohl in Anwesenheit oder auch Abwesenheit von Liganden. Im Gegensatz dazu wirkt die Volllängen-TR160-Mutante oder LBD von TR160 (ΔΔTR160) nicht signifikant mit SMRT zusammen, verglichen mit dem Wildtyp-Rezeptor.
  • Diese Daten zeigen, dass SMRT eine wichtige Rolle bei der Vermittlung transkriptioneller Silencingeffekte sowohl von RAR als auch TR spielt. Diese Daten schlagen auch vor, dass die Freisetzung von SMRT aus Rezeptoren ein vorauszusetzender Schritt bei der ligandenabhängigen Transaktivation durch Kernrezeptoren sein könnte.
  • Beispiel 5
  • Bildung von Ternärkomplexen mit SMRT
  • RAR und TR bilden Heterodimere mit RXR, was einen Komplex mit hoher DNA-Bindungsfähigkeit ergibt (Bugge et al., EMBO J. 11: 1409–1418 (1992); Yu et al., Cell 67: 1251–1266 (1991); und Kliewer et al., Nature 355: 446–449 (1992)). Da SMRT mit RAR und TR zusammenwirkt, wurden Tests durchgeführt, um zu bestimmen, ob SMRT auch mit dem Rezeptor-DNA-Komplex zusammenwirken kann. Daher wurde die Interaktion von SMRT mit RXR-RAR-Heterodimer auf einem DR5-Element (d. h. eine AGGTCA-Direktwiederholung, beabstandet durch fünf Nucleotide) in einer Gelverzögerungsprüfung bestimmt, die wie folgt ausgeführt wurde. In vitro translatierte Rezeptoren oder unprogrammiertes Retikulozytlysat (URL) wurde mit 1 μg poly-dIdC auf Eis für 15 Minuten in einer Gesamtmenge von 20 μl mit 75 mM KCl, 7,5% Glycerol, 20 mM Hepes (pH 7,5), 2 mM DTT und 0,1% NP-40, mit oder ohne Ligand (im Bereich von etwa 10–100 nM verwendet) inkubiert. Eine 32P markierte, doppelsträngige Oligonucleotidsonde wurde in die Bindungsreaktion zugefügt (10000 cpm pro Reaktion) und die Reaktion wurde für 20 Minuten bei Raumtemperatur weiter inkubiert. Der Protein-DNA-Komplex wurde auf einem 5%-nativen Polyacrylamidegel bei 150 Volt separiert.
  • Es zeigte sich bei der Gelverzögerungsprüfung, dass SMRT einen Ternärkomplex mit dem RXR-RAR-Heterodimer an einem DNA-Reponseelement bildet. Die Zugabe von Liganden setzt SMRT aus diesem Komplex in einer dosisabhängigen Weise frei.
  • In ähnlicher Weise zeigte sich, dass SMRT einen Ternärkomplex mit dem RXR-TR Heterodimer an einem TR-Responseelement bildet; die Zugabe von T3 unterbricht die Bildung dieses Komplexes.
  • Diese Daten zeigen, dass SMRT zu DNA-Responseelementen über Protein-Protein- Interaktion mit RAR oder TR in der Abwesenheit von Hormonen ergänzt werden kann. Die Bindung von Hormonen unterbricht die Rezeptor-SMRT-Interaktion und setzt SMRT aus dem Rezeptor-DNA-Komplex frei.
  • Beispiel 6
  • Vorübergehende Transfektionsprüfung
  • CV-1 Zellen wurden in 24-Well-Platten mit einer Dichte von 50,000 Zellen pro Vertiefung plattiert. Expressionsplasmide wurden in Zellen durch Lipofektion unter Verwendung von DOTAP transfiziert. Bei jeder Transfektion wurde 5 ng GAL-RAR und 15 ng v-erbA oder SMRT zusammen mit 150 ng an Reporterkonstrukt verwendet, das 4 Kopien von GAL4 Bindungsstellen vor einem minimalen Thymidinkinasepromoter und ein CMX-β-gal Konstrukt als interne Kontrolle enthält. Die relative Luciferaseaktivität wurde durch Normalisierung zur β-gal Aktivität berechnet.
  • Beispiel 7
  • Reversierung von transkriptionellem Silencing
  • Kürzlich wurde aufgezeigt, dass Überexpression von RAR oder TR den transkriptionellen Silencingeffekt der GAL4-DBD-Fusion von TR (GAL-TR) oder RAR (GAL-RAR) reversieren könnte (Baniahmad et al., Mol Cell Biol 15: 76–86 (1995); und Casanova et al., Mol Cell Biol 14: 5756–5765 (1994)), vermutlich durch Wettbewerb nach einer Grenzmenge eines Korepressors. Ein ähnlicher Effekt wird hierin beobachtet, wenn für Überexpression von v-erbA oder RAR403-Mutanten gezeigt wird, dass der Silencingeffekt von GAL-RAR und GAL-TR auf die Basalaktivität eines Luciferasereporters reversiert wird (vgl. 3A und 3B).
  • Prinzipiell sollte Überexpression von SMRT die Repressoraktivität bei Coexpression mit v-erbA oder RAR403-Wettbewerbern wiederherstellen. Tatsächlich zeigen die in 3C dargestellten Resultate, dass sowohl die Volllängen- als auch die C-Terminal-Domäne von SMRT (C-SMRT) v-erbA oder RAR403-Wettbewerber-Aktivität austitrieren und GAL-RAR und GAL-TR wieder mit Silencingaktivität ausstatten können. Im Gegensatz dazu zeigt weder v-erbA noch SMRT eine Wirkung auf die Transaktivationsaktivität der GAL-VP16 Fusion. Daher ist SMRT fähig, den Titrationseffekt von v-erbA und RAR403 zu blockieren und funktionell den möglichen Korepressor in diesem System zu ersetzen.
  • Beispiel 8
  • Direktes Ergänzen von SMRT zu einem heterologen Promotor
  • Wenn SMPT der Vermittler von Transkriptionssilencing von TR und RAR durch Interaktion mit matrizengebundenen, unligandierten Rezeptoren ist, dann sollte direktes Ergänzen von SMRT zu einem heterologen Promotor zu Repression der Grundniveauaktivität führen. Dies wurde durch Fusionieren von Volllängen-SMRT mit der GAL4 DBD (GAL-SMRT) getestet. Die Wirkung des resultierenden Fusionsproteins auf die Aktivität des Thymidinkinase-Promotors mit vier GAL4-Bindungsstellen wurde analysiert. 3D zeigt, dass GAL-SMRT, wie GAL-TR, die basale Promotoraktivität in einer dosisabhängigen Weise hemmen können. Im Gegensatz dazu zeigt GAL-PXR keine Suppression.
  • Diese Daten deuten an, dass SMRT beim Ergänzen zu einem Promotor durch direkte DNA-Anbindung oder über Bindung mit einem unligandierten Rezeptor als ein kräftiger transkriptioneller Repressor wirkt.
  • Obwohl die Erfindung mit Bezug auf bestimmte bevorzugte Ausführungsformen detailliert beschrieben wurde, wird verstanden werden, dass Modifikationen und Variationen im Schutzbereich der anhängenden Ansprüche liegen.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00260001
  • Figure 00270001
  • Figure 00280001
  • Figure 00290001
  • Figure 00300001
  • Figure 00310001
  • Figure 00320001

Claims (30)

  1. Isolierter Cosuppressor von Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität mit derselben Sequenz wie die Reste 1–1329 plus 1376–1495, wie in SEQ ID NO 1 dargelegt, oder mit einer Sequenz, die konservative Aminosäurevariationen der Reste 1–1329 plus 1376–1495 von SEQ ID NO 1 enthält, die ein Protein definiert, das zum Protein von SEQ ID NO 1 funktionell äquivalent ist.
  2. Cosuppressor gemäß Anspruch 1, der ferner die in SEQ ID NO 2 dargelegten Aminosäure-Reste umfasst, d. h. die Reste 1330–1375 von SEQ ID NO 1.
  3. Antikörper, der gegen den Cosuppressor nach Anspruch 1 unter Verwendung des Cosuppressors erzeugt wird, der aus derselben Sequenz wie die Reste 1–1329 plus 1376–1495 besteht, wie in SEQ ID NO 1 dargelegt, oder aus einer Sequenz besteht, die konservative Aminosäurevariationen der Reste 1–1329 plus 1376–1495 von SEQ ID NO 1 enthält, die ein Protein definiert, das zum Protein von SEQ ID NO 1 oder zu Abschnitten davon als Antigen zur Antikörperproduktion funktionell äquivalent ist.
  4. Isolierte Polynucleinsäure, die den Cosuppressor nach Anspruch 1 codiert.
  5. Vektor, der Polynucleinsäure gemäß Anspruch 4 enthält.
  6. Komplex, der den Cosuppressor nach Anspruch 1 und ein homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren umfasst, wobei das Mitglied eine Silencerdomäne enthält, welche die Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen reprimiert.
  7. Komplex gemäß Anspruch 6, in welchem das homodimere oder heterodimere Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren aus Schilddrüsenhormonrezeptor-Homodimer, Schilddrüsenhormonrezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, Retinsäurerezeptor-Homodimer, Retinsäurerezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer oder Retinoid-X-Rezeptor-Homodimer ausgewählt ist.
  8. Komplex gemäß Anspruch 6, der ferner ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren umfasst.
  9. Verfahren zum Aufspalten des Komplexes nach Anspruch 6, wobei das Verfahren Kontaktieren des Komplexes mit einem Liganden für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren umfasst.
  10. Verfahren zum Reprimieren der Aktivität eines Mitglieds der Steroid-/ Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, das eine Silencerdomäne enthält, welche die Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen reprimiert, wobei das Verfahren Kontaktieren des Mitglieds der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren mit einer ausreichenden Menge des Cosuppressors nach Anspruch 1 umfasst, um die Aktivität des Mitglieds zu reprimieren.
  11. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren aus Schilddrüsenhormon-Rezeptor, Retinsäurerezeptor, Vitamin-D-Rezeptor oder Peroxisomproliferator-aktiviertem Rezeptor ausgewählt wird.
  12. Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, welche die durch den Cosuppressor nach Anspruch 1 bewirkte Suppression von Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität erleichtern, wobei das Verfahren Vergleichen der Größe des Komplexes nach Anspruch 8 bei Testverbindungsexposition mit der Größe des Komplexes in Abwesenheit der Testverbindung umfasst.
  13. Verfahren gemäß Anspruch 12, wobei der Komplex ferner ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren umfasst.
  14. Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, welche die durch den Cosuppressor nach Anspruch 1 bewirkte Suppression von Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität erleichtern, ohne den Rezeptor im Wesentlichen zu aktivieren, wobei das Verfahren umfasst: – Vergleichen des durch zwei unterschiedliche Expressionssysteme in Abwesenheit und Anwesenheit einer Testverbindung erzeugten Reportersignals, wobei das erste Expressionssystem einen Komplex umfasst, der umfasst: – ein homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren ausgewählt aus Schilddrüsenhormonrezeptor-Homodimer, Schilddrüsenhormonrezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, Retinsäurerezeptor-Homodimer oder Retinsäurerezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, – ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei das Response-Element mit einem Reporter operativ verbunden ist, und – den Cosuppressor nach Anspruch 1, und wobei das zweite Expressionssystem einen Komplex umfasst, der umfasst: – eine homodimere oder heterodimere Form desselben Mitglieds der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren wie in dem ersten Expressionssystem verwendet, wobei das Mitglied derart mutiert ist, dass es hormonabhängige Aktivierungsaktivität behält, aber seine Fähigkeit zum Reprimieren der Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen verloren hat, – dieselbe Response-Element/Reporter-Kombination wie in dem ersten Expressionssystem verwendet, und – den Cosuppressor nach Anspruch 1, und danach – Auswählen derjenigen Verbindungen, die bereitstellen: – ein höheres Reportersignal, wenn die Verbindung dem ersten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, und – im Wesentlichen dasselbe Reportersignal, wenn die Verbindung dem zweiten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, wobei die ausgewählten Verbindungen imstande sind, die durch den Cosuppressor nach Anspruch 1 bewirkte Suppression von Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu erleichtern, aber im Wesentlichen nicht die Fähigkeit haben, Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu aktivieren.
  15. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei der mutierte Rezeptor aus RAR403-Homodimeren, RAR403 enthaltenden Heterodimeren, TR160-Homodimeren oder TR160 enthaltenden Heterodimeren ausgewählt wird.
  16. Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität aktivieren, aber im Wesentlichen nicht die Fähigkeit haben, die durch den Cosuppressor nach Anspruch 1 bewirkte Suppression zu erleichtern, wobei das Verfahren umfasst: – Vergleichen des durch zwei unterschiedliche Expressionssysteme in Abwesenheit und Anwesenheit einer Testverbindung erzeugten Reportersignals, wobei das erste Expressionssystem einen Komplex umfasst, der umfasst: – ein homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren ausgewählt aus Schilddrüsenhormonrezeptor-Homodimer, Schilddrüsenhormonrezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, Retinsäurerezeptor-Homodimer oder Retinsäurerezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, – ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei das Response-Element mit einem Reporter operativ verbunden ist, und – den Cosuppressor nach Anspruch 1, und wobei das zweite Expressionssystem einen Komplex umfasst, der umfasst: – eine homodimere oder heterodimere Form desselben Mitglieds der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren wie in dem ersten Expressionssystem verwendet, wobei das Mitglied derart mutiert ist, dass es hormonabhängige Aktivierungsaktivität behält, aber seine Fähigkeit zum Reprimieren der Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen verloren hat, – dieselbe Response-Element/Reporter-Kombination wie in dem ersten Expressionssystem verwendet, und – den Cosuppressor nach Anspruch 1, und danach – Auswählen derjenigen Verbindungen, die bereitstellen: – ein höheres Reportersignal, wenn die Verbindung dem zweiten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, und – im Wesentlichen dasselbe Reportersignal, wenn die Verbindung dem ersten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, wobei die ausgewählten Verbindungen imstande sind, Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu aktivieren, aber im Wesentlichen nicht die Fähigkeit haben, die durch den Cosuppressor nach Anspruch 1 bewirkte Suppression zu erleichtern.
  17. Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, welche die durch den Cosuppressor nach Anspruch 1 bewirkte Suppression von Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität erleichtern und den Rezeptor aktivieren, wobei das Verfahren umfasst: – Vergleichen des durch zwei unterschiedliche Expressionssysteme in Abwesenheit und Anwesenheit einer Testverbindung erzeugten Reportersignals, wobei das erste Expressionssystem einen Komplex umfasst, der umfasst: – ein homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren ausgewählt aus Schilddrüsenhormonrezeptor-Homodimer, Schilddrüsenhormonrezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, Retinsäurerezeptor-Homodimer oder Retinsäurerezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, – ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei das Response-Element mit einem Reporter operativ verbunden ist, und – den Cosuppressor nach Anspruch 1, und wobei das zweite Expressionssystem einen Komplex umfasst, der umfasst: – eine homodimere oder heterodimere Form desselben Mitglieds der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren wie in dem ersten Expressionssystem verwendet, wobei das Mitglied derart mutiert ist, dass es hormonabhängige Aktivierungsaktivität behält, aber seine Fähigkeit zum Reprimieren der Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen verloren hat, – dieselbe Response-Element/Reporter-Kombination wie in dem ersten Expressionssystem verwendet, und – den Cosuppressor nach Anspruch 1, und danach – Auswählen derjenigen Verbindungen, die bereitstellen: – ein erhöhtes Reportersignal, wenn die Verbindung dem zweiten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, und – ein im Wesentlichen erhöhtes Reportersignal, wenn die Verbindung dem ersten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, wobei die ausgewählten Verbindungen imstande sind, die durch den Cosuppressor nach Anspruch 1 bewirkte Suppression von Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu erleichtern und den Rezeptor zu aktivieren.
  18. Modifizierte Form des Cosuppressors nach Anspruch 1, ausgewählt aus: – Volllängen-Silencermediator für Retinsäure- und Schilddrüsenrezeptoren nach Anspruch 1 plus GAL4-DNA-Bindungsdomäne, – Volllängen-Silencermediator für Retinsäure- und Schilddrüsenrezeptoren nach Anspruch 1 plus GAL4-Aktivierungsdomäne, oder – Volllängen-Silencermediator für Retinsäure- und Schilddrüsenrezeptoren nach Anspruch 1 plus Glutathion-S-Transferase-(GST-)Anhang.
  19. Modifizierter Cosuppressor gemäß Anspruch 18, wobei der modifizierte Cosuppressor einen Volllängen-Silencermediator für Retinsäure- und Schilddrüsenrezeptoren plus GAL4-Aktivierungsdomäne umfasst.
  20. Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, welche die Fähigkeit des Cosuppressors nach Anspruch 1, mit Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoren zu komplexieren, unterbrechen, ohne den Rezeptor im Wesentlichen zu aktivieren, wobei das Verfahren umfasst: – Vergleichen des durch zwei unterschiedliche Expressionssysteme in Abwesenheit und Anwesenheit einer Testverbindung erzeugten Reportersignals, wobei das erste Expressionssystem einen Komplex umfasst, der umfasst: – einen modifizierten Cosuppressor gemäß Anspruch 19, – ein homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren ausgewählt aus Schilddrüsenhormonrezeptor-Homodimer, Schilddrüsenhormonrezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, Retinsäurerezeptor-Homodimer oder Retinsäurerezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, und – ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei das Response-Element mit einem Reporter operativ verbunden ist, und wobei das zweite Expressionssystem einen Komplex umfasst, der umfasst: – den modifizierten Cosuppressor, – eine homodimere oder heterodimere Form desselben Mitglieds der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren wie in dem ersten Expressionssystem verwendet, wobei das Mitglied derart mutiert ist, dass es hormonabhängige Aktivierungsaktivität behält, aber seine Fähigkeit zum Reprimieren der Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen verloren hat, und – dieselbe Response-Element/Reporter-Kombination wie in dem ersten Expressionssystem verwendet, und danach – Auswählen derjenigen Verbindungen, die bereitstellen: – ein niedrigeres Reportersignal, wenn die Verbindung dem ersten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, und – im Wesentlichen dasselbe Reportersignal, wenn die Verbindung dem zweiten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, wobei die ausgewählten Verbindungen imstande sind, die Fähigkeit des Cosuppressors nach Anspruch 1, mit Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoren zu komplexieren, zu unterbrechen, ohne den Rezeptor im Wesentlichen zu aktivieren.
  21. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei der mutierte Rezeptor aus RAR403-Homodimeren, RAR403 enthaltenden Heterodimeren, TR160-Homodimeren oder TR160 enthaltenden Heterodimeren ausgewählt wird.
  22. Verfahren gemäß Anspruch 20, wobei der Wirt eine Säuger- oder Hefezelle ist.
  23. Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die Steroid-/Schilddrüsenhormon rezeptoraktivität aktivieren, aber im Wesentlichen nicht die Fähigkeit haben, einen Komplex auseinander zu brechen, der einen Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor und den Cosuppressor nach Anspruch 1 umfasst, wobei das Verfahren umfasst: – Vergleichen des durch zwei unterschiedliche Expressionssysteme in Abwesenheit und Anwesenheit einer Testverbindung erzeugten Reportersignals, wobei das erste Expressionssystem einen Komplex umfasst, der umfasst: – einen modifizierten Cosuppressor gemäß Anspruch 19, – ein homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren ausgewählt aus Schilddrüsenhormonrezeptor-Homodimer, Schilddrüsenhormonrezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, Retinsäurerezeptor-Homodimer oder Retinsäurerezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, und – ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei das Response-Element mit einem Reporter operativ verbunden ist, und wobei das zweite Expressionssystem umfasst: – den modifizierten Cosuppressor, – eine homodimere oder heterodimere Form desselben Mitglieds der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren wie in dem ersten Expressionssystem verwendet, wobei das Mitglied derart mutiert ist, dass es hormonabhängige Aktivierungsaktivität behält, aber seine Fähigkeit zum Reprimieren der Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen verloren hat, und – dieselbe Response-Element/Reporter-Kombination wie in dem ersten Expressionssystem verwendet, und danach – Auswählen derjenigen Verbindungen, die bereitstellen: – ein höheres Reportersignal, wenn die Verbindung dem zweiten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, und – im Wesentlichen dasselbe Reportersignal, wenn die Verbindung dem ersten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, wobei die ausgewählten Verbindungen imstande sind, Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu aktivieren, aber im Wesentlichen nicht die Fähigkeit haben, den Komplex des Cosuppressors nach Anspruch 1 und eines Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptors auseinander zu brechen.
  24. Verfahren gemäß Anspruch 23, wobei der Wirt eine Säuger- oder Hefezelle ist.
  25. Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die einen Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor aktivieren und die Fähigkeit des Cosuppressors nach Anspruch 1, mit dem Rezeptor zu komplexieren, unterbrechen, wobei das Verfahren umfasst: – Vergleichen des durch zwei unterschiedliche Expressionssysteme in Abwesenheit und Anwesenheit einer Testverbindung erzeugten Reportersignals, wobei das erste Expressionssystem einen Komplex umfasst, der umfasst: – einen modifizierten Cosuppressor gemäß Anspruch 19, – ein homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren ausgewählt aus Schilddrüsenhormonrezeptor-Homodimer, Schilddrüsenhormonrezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, Retinsäurerezeptor-Homodimer oder Retinsäurerezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, und – ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei das Response-Element mit einem Reporter operativ verbunden ist, und wobei das zweite Expressionssystem einen Komplex umfasst, der umfasst: – den modifizierten Cosuppressor, – dasselbe homodimere oder heterodimere Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren wie in dem ersten Expressionssystem verwendet, wobei das Mitglied derart mutiert ist, dass es hormonabhängige Aktivierungsaktivität behält, aber seine Fähigkeit zum Reprimieren der Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen verloren hat, und – dieselbe Response-Element/Reporter-Kombination wie in dem ersten Expressionssystem verwendet, und danach – Auswählen derjenigen Verbindungen, die bereitstellen: – eine Reduktion des Reportersignals, wenn die Verbindung dem ersten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, und – ein erhöhtes Reportersignal, wenn die Verbindung dem zweiten Expressionssystem ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, wobei die ausgewählten Verbindungen imstande sind, einen Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor zu aktivieren und einen Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor und den Cosuppressor nach Anspruch 1 umfassenden Komplex auseinander zu brechen.
  26. Verfahren gemäß Anspruch 25, wobei der Wirt eine Säuger- oder Hefezelle ist.
  27. Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die einen Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor aktivieren und/oder die Fähigkeit des Cosuppressors nach Anspruch 1, mit dem Rezeptor zu komplexieren, unterbrechen, wobei das Verfahren umfasst: – Vergleichen der durch ein Kombinationsexpressionssystem in Abwesenheit und Anwesenheit einer Testverbindung erzeugten Reportersignale, wobei das Kombinationsexpressionssystem umfasst: – ein erstes homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren ausgewählt aus Schilddrüsenhormonrezeptor-Homodimer, Schilddrüsenhormonrezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, Retinsäurerezeptor-Homodimer oder Retinsäurerezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, – eine zweite homodimere oder heterodimere Form desselben Mitglieds der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren wie in dem ersten Homodimer oder Heterodimer verwendet, wobei das Mitglied derart mutiert ist, dass es hormonabhängige Aktivierungsaktivität behält, aber seine Fähigkeit zum Reprimieren der Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen verloren hat, wobei entweder das erste Homodimer (oder Heterodimer) oder das zweite Homodimer (oder Heterodimer) mit einer GAL4-DNA-Bindungsdomäne operativ verbunden ist, – ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei das Response-Element mit einem ersten Reporter operativ verbunden ist, – ein GAL4-Response-Element, wobei das Response-Element mit einem zweiten Reporter operativ verbunden ist, und danach – Identifizieren derjenigen Verbindungen als imstande, die Suppression von durch den Cosuppressor nach Anspruch 1 bewirkter Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu erleichtern, aber im Wesentlichen nicht die Fähigkeit aufweisend, Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu aktivieren, die bereitstellen: – ein höheres Reportersignal von dem auf das erste Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem ersten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, und – im Wesentlichen dasselbe Reportersignal von dem auf das zweite Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem zweiten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, oder – Identifizieren derjenigen Verbindungen als imstande, Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu aktivieren, aber im Wesentlichen nicht die Fähigkeit aufweisend, die durch den Cosuppressor nach Anspruch 1 bewirkte Suppression zu erleichtern, die bereitstellen: – ein höheres Reportersignal von dem auf das zweite Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem zweiten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, und – im Wesentlichen dasselbe Reportersignal von dem auf das erste Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem ersten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, oder – Identifizieren derjenigen Verbindungen als imstande, die Suppression der durch den Cosuppressor nach Anspruch 1 bewirkten Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu erleichtern und den Rezeptor zu aktivieren, die bereitstellen: – ein erhöhtes Reportersignal von dem auf das zweite Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem zweiten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, und – ein im Wesentlichen erhöhtes Reportersignal von dem auf das erste Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem ersten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung.
  28. Verfahren gemäß Anspruch 27, wobei das Kombinationsexpressionssystem ferner den Cosuppressor nach Anspruch 1 umfasst.
  29. Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, die einen Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor aktivieren und/oder die Fähigkeit des Cosuppressors nach Anspruch 1, mit dem Rezeptor zu komplexieren, unterbrechen, wobei das Verfahren umfasst: – Vergleichen der durch ein Kombinationsexpressionssystem in Abwesenheit und Anwesenheit einer Testverbindung erzeugten Reportersignale, wobei das Kombinationsexpressionssystem umfasst: – einen modifizierten Cosuppressor gemäß Anspruch 19, – ein erstes homodimeres oder heterodimeres Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren ausgewählt aus Schilddrüsenhormonrezeptor-Homodimer, Schilddrüsenhormonrezeptor/Retinoid-X- Rezeptor-Heterodimer, Retinsäurerezeptor-Homodimer oder Retinsäurerezeptor/Retinoid-X-Rezeptor-Heterodimer, – eine zweite homodimere oder heterodimere Form desselben Mitglieds der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren wie in dem ersten Homodimer oder Heterodimer verwendet, wobei das Mitglied derart mutiert ist, dass es hormonabhängige Aktivierungsaktivität behält, aber seine Fähigkeit zum Reprimieren der Grundniveau-Promotoraktivität von Zielgenen verloren hat, wobei entweder das erste Homodimer (oder Heterodimer) oder das zweite Homodimer (oder Heterodimer) mit einer GAL4-DNA-Bindungsdomäne operativ verbunden ist, – ein Response-Element für das Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei das Response-Element mit einem ersten Reporter operativ verbunden ist, – ein GAL4-Response-Element, wobei das Response-Element mit einem zweiten Reporter operativ verbunden ist, und danach – Identifizieren derjenigen Verbindungen als imstande, die Fähigkeit des Cosuppressors nach Anspruch 1, mit Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor zu komplexieren, zu unterbrechen, ohne den Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor im Wesentlichen zu aktivieren, die bereitstellen: – ein niedrigeres Reportersignal von dem auf das erste Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem ersten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, und – im Wesentlichen dasselbe Reportersignal von dem auf das zweite Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem zweiten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, oder – Identifizieren derjenigen Verbindungen als imstande, Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität zu aktivieren, aber im Wesentlichen nicht die Fähigkeit aufweisend, einen Komplex umfassend einen Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor und einen Cosuppressor mit einer für den Silencermediator für Retinsäure- und Schilddrüsenrezeptoren charakteristischen Struktur und Funktion auseinander zu brechen, die bereitstellen: – ein höheres Reportersignal von dem auf das zweite Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem zweiten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, und – im Wesentlichen dasselbe Reportersignal von dem auf das erste Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem ersten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, oder – Identifizieren derjenigen Verbindungen als imstande, einen Komplex umfassend einen Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptor und den Cosuppressor nach Anspruch 1 auseinander zu brechen und den Rezeptor zu aktivieren, die bereitstellen: – eine Reduktion des Reportersignals von dem auf das erste Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem ersten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung, und – ein erhöhtes Reportersignal von dem auf das zweite Mitglied ansprechenden Reporter, wenn die Verbindung dem zweiten Mitglied ausgesetzt wird, relativ zu dem Reportersignal in Abwesenheit der Verbindung.
  30. Verfahren zum Identifizieren von Verbindungen, welche die durch den Cosuppressor nach Anspruch 1 bewirkte Suppression der Steroid-/Schilddrüsenhormonrezeptoraktivität erleichtern, wobei das Verfahren Bestimmen der Wirkung des Zufügens von Testverbindung zu einem Expressionssystem umfasst, das umfasst: – ein modifiziertes Mitglied der Steroid-/Schilddrüsenhormon-Superfamilie von Rezeptoren, wobei das modifizierte Mitglied eine Aktivierungsdomäne enthält, die den Rezeptor konstitutiv aktiv macht, – ein Fusionsprotein, das die Rezeptor-Wechselwirkungsdomäne von SMRT umfasst, die mit der GAL4-DNA-Bindungsdomäne operativ verbunden ist, und – ein GAL4-Response-Element, das mit einem Reporter operativ verbunden ist.
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