DE69116563T2 - Durch protoonkogenischen Proteinkomplex AP-1 kontrollierte Verfahren - Google Patents

Durch protoonkogenischen Proteinkomplex AP-1 kontrollierte Verfahren

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft Steroidhormone, Steroidhormon- ähnliche Verbindungen, Steroidhormonrezeptoren, Rezeptoren für Steroidhormon-ähnliche Verbindungen und verwandte Spezies. Gemäß einem besonderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Prozesse, die durch Steroide und verwandte Hormone vermittelt werden. Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung Prozesse, die durch den Proto-onkogenen Proteinkomplex AP-1 vermittelt werden.
    • Hintergrund der Erfindung
  • Steroide und verwandte Hormone spielen eine wichtige Rolle bei der Regulation von Entwicklung, Differentiation und Homeostase. Die Hormone üben ihre regulatorischen Wirkungen durch Bindung an eine Superfamilie von intrazellulären Rezeptoren aus, die direkte Modulatoren der Gentranskription sind. Durch Mutationsanalysen von Hormonrezeptoren sind funktionelle Domänen identifiziert worden, die für transkriptionale Aktivierung, nukleare Lokalisierung, DNA-Bindung und Hormonbindung verantwortlich sind.
  • Hormonrezeptoren können sowohl hinsichtlich einer Aktivierung der Transkription als auch einer Repression der Expression einer Reihe von Genen wirken. Es ist postuliert worden, daß eine derartige Repression durch Bindung des Hormonrezeptors an regulatorische DNA-Sequenzen, die als negative Hormon-Reaktions-Elemente bezeichnet werden, vermittelt wird, wobei transkriptionale Aktivatoren verdrängt werden.
  • Es wäre wünschenswert, imstande zu sein, den Grad, bis zu dem Hormone entweder direkt oder indirekt die Transkription aktivieren und/oder den Grad, bis zu dem Hormone entweder direkt oder indirekt die Expression bestimmter Gene reprimieren, zu kontrollieren, und zwar für Zwecke, wie die Behandlung von krankhaften Zuständen, die Entwicklung von Behandlungsmitteln mit einem verringerten Auftreten von Nebenwirkungen und dergl.
  • Der Proteinkomplex AP-1 ist ein Mitglied einer Klasse von nuklearen Proteinen, die von Proto-Onkogenen codiert werden, für die ein Zusammenhang mit verschiedenen Aspekten von Zellwachstum, Differentiation und Entwicklung hergestellt worden ist. Die AP-1-Bindungsstelle wird von c- Jun-Homodimeren und c-Jun/c-Fos-Heterodimeren erkannt. Die Bindung von c- Fos an die AP-1-Stelle hängt von der Bildung von Heterodimeren mit c-Jun ab. Die Bildung von Homodimeren und Heterodimeren wird durch nicht kovalente Wechselwirkungen vermittelt, die durch eine Struktur erleichtert wird, die als Leucin-Reißverschluß ("leucine zipper") bezeichnet wird. Außer daß er positive regulatorische Wirkungen auf mehreren Wegen ausübt, ist auch gezeigt worden, daß der AP-1-Komplex für eine negative Regulation bei mehreren Genen sorgt.
  • Bis jetzt hat man angenommen, daß die Wirkung eines gegebenen Proteins auf die Genregulation das Ergebnis der Wechselwirkung zwischen dem Protein und einem regulatorischen Element innerhalb der Promotorregion des Gens, das reguliert wird, ist. So nimmt man an, daß Verbindungen, die eine Wirkung auf mehr als einem Weg ausüben, ein Reaktionselement erkennen, das mehr als einem Weg gemeinsam ist. Übereinstimmend damit beschreiben Diamond et al. [in Science, Bd. 249 (1990), S. 1266-1272] Studien, bei denen ein "zusammengesetztes" Glucocorticoid-Reaktions-Element (GRE), das selektiv in vitro sowohl an den Glucocorticoid-Rezeptor als auch c-Jun und c-Fos (Komponenten des Phorbolester-aktivierten AP-1-Transkriptionsfaktors) bindet, eingesetzt wird. Die Autoren schlagen dann ein allgemeines Modell für die Wirkung eines zusammengesetzten GRE vor, das die DNA-Bindung für die Wechselwirkung zwischen Rezeptor (d. h. dem Glucocorticoid-Rezeptor) und Nicht-Rezeptor-Faktoren (d. h. c-Jun oder c- Fos) erfordert.
  • Auf der Basis des vorstehend erläuterten Verständnisses des Mechanismus, durch den regulatorische Proteine ihre Wirkungen ausüben, ist es nicht möglich, eine regulatorische Wirkung eines gegebenen Proteins zu ändern, ohne gleichzeitig einige weitere regulatorische Wirkungen des Proteins zu ändern. Daher besteht bei jeder günstigen Wirkung, die durch die Verabreichung eines Hormons oder eines Hormonanalogons erzielt wird, eine große Wahrscheinlichkeit, daß eine ungünstige Nebenwirkung auftritt, d. h. die Förderung unerwünschter Prozesse und/oder die Hemmung erwünschter Prozesse. Dementsprechend gab es für den Fachmann keinen Beweggrund, nach Verbindungen zu suchen, die imstande sind, einen bekannten Weg zu unterbrechen, ohne gleichzeitig in unerwünschter Weise andere regulatorische Wege zu beeinflussen.
    • Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
  • Erfindungsgemäß haben wir festgestellt, daß Hormonrezeptoren und der Transkriptionsfaktor AP-1 in reziproker Weise die transkriptionale Aktivierungsaktivität des jeweils anderen Bestandteils reprimieren können. In ähnlicher Weise haben wir festgestellt, daß Hormonrezeptoren und der Transkriptionsfaktor AP-1 in reziproker Weise die Fähigkeit des jeweils anderen Bestandteils, die Expression bestimmter Gene zu hemmen, dereprimieren können. Man nimmt an, daß dies über einen neuen Mechanismus verläuft, der unabhängig von der DNA-Bindung ist.
  • Die vorliegende Erfindung stellt daher Mittel zur Kontrolle der Transkriptionsaktivierung von auf Hormonen ansprechenden Genprodukten und/oder auf AP-1 ansprechenden Genprodukten bereit. Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung Mittel bereit, um Verbindungen abzusuchen, die das Zellwachstum hemmen, die jedoch nicht die Differentiation dieser Zellen fördern.
    • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Fig. 1 zeigt die Repression der Glucocorticoid-vermittelten Induktion der Transkription durch den Transkriptionsfaktor c-Jun.
  • Fig. 2 zeigt die Repression des Collagenase-Promotors durch den Glucocorticoid-Rezeptor.
  • Fig. 3 zeigt die Repression eines AP-1-induzierten Collagenase-Promotor-CAT-Reporters durch den Glucocorticoid-Rezeptor.
  • Fig. 4 faßt die Ergebnisse einer Deletionsstudie zusammen, um Domänen des Glucocorticoid-Rezeptors zu bestimmen, die die durch AP-1 induzierte Expression reprimieren und die Glucocorticoid-vermittelte Transkription induzieren.
  • In Fig. 5 wird eine Deletionsanalyse des c-Jun-Gens vorgelegt, und zwar mit einem Hinweis auf die Fähigkeit der verschiedenen Deletionsmutanten, die Glucocorticoid-vermittelte Transkriptionsaktivierung zu reprimieren.
  • In Fig. 6 wird ein Gelretardationsassay vorgelegt, der durchgeführt wurde, um die Fähigkeit von c-Jun zu untersuchen, die Bindung des Glucocorticoid-Rezeptors an ein Glucocorticoid-Reaktions-Element zu reprimieren.
  • Fig. 7 zeigt die Repression der RAR-vermittelten Repression von Collagenase-Promotoraktivität.
  • Fig. 8 zeigt die Repression des Collagenase-Promotors durch den Retinsäure-Rezeptor alpha.
  • Fig. 9 faßt die Ergebnisse einer Deletionsstudie zusammen, um Domänen des Retinsäure-Rezeptors zu bestimmen, die die durch AP-1 induzierte Expression durch den Collagenase-Promotor reprimieren.
  • In Fig. 10 werden Gelretardationsassays vorgelegt, die durchgeführt wurden, um die Fähigkeit von RAR zu bestimmen, die Bindung von c-Jun an eine AP-1-Bindungsstelle zu reprimieren.
  • In Fig. 11 werden Gelretardationsassays vorgelegt, die durchgeführt wurden, um die Fähigkeit von RAR zu untersuchen, die Bindung von AP-1 an eine AP-1-Bindungsstelle zu reprimieren.
    • Ausführliche Beschreibung der Erfindung
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur Identifizierung einer/mehrerer Verbindung(en), die sich für die Behandlung anormaler Zellen eignet/eignen, bereitgestellt, wobei das Verfahren die Auswahl einer Verbindung umfaßt, die die beiden folgenden Eigenschaften zeigt:
  • (a) die Fähigkeit, die Funktion von AP-1 zu unterbrechen, wenn die Verbindung in einem ersten Assaysystem eingesetzt wird, das eine Zellinie umfaßt, die imstande ist,
  • (i) einen Rezeptor für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon- ähnliche Verbindung ("steroid hormone or steroid-hormone like receptor"),
  • (ii) AP-1 und
  • (iii) einen auf AP-1 ansprechenden Reporter zu exprimieren; und
  • (b) im wesentlichen keine Fähigkeit zur Förderung der transkriptionalen Aktivierung von auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Genen, wenn die Verbindung in einem zweiten Assaysystem eingesetzt wird, das eine Zellinie umfaßt, die imstande ist,
  • (i) einen Rezeptor für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon- ähnliche Verbindung und
  • (ii) einen auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Reporter zu exprimieren.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung/mehrerer Verbindungen bereitgestellt, die den AP-1-Reaktionsweg unterbrechen, die jedoch im wesentlichen keine Wirkung auf Steroidhormon- oder Steroidhormon-ähnliche Reaktionswege ausüben, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:
  • (a) Test der Verbindung in einem ersten Assaysystem, um die Wirkung der Verbindung auf den AP-1-Reaktionsweg zu bestimmen; wobei das erste Assaysystem eine Zellinie umfaßt, die imstande ist,
  • (i) einen Rezeptor für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon- ähnliche Verbindung,
  • (ii) AP-1 und
  • (iii) einen auf AP-1 ansprechenden Reporter zu exprimieren; und
  • (b) Test der Verbindung in einem zweiten Assaysystem, um die Wirkung der Verbindung auf die transkriptionale Aktivierung von auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Genen zu bestimmen; wobei das zweite Assaysystem eine Zellinie umfaßt, die imstande ist,
  • (i) einen Rezeptor für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon- ähnliche Verbindung und
  • (ii) einen auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Reporter zu exprimieren; und anschließend
  • Auswahl derjenigen Verbindungen, die eine hemmende Wirkung beim Test von Teil (a) und im wesentlichen keine Wirkung beim Test von Teil (b) haben.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein in vitro durchgeführtes Verfahren bereitgestellt, um in einem Expressionssystem die Transkriptionsaktivierung eines auf Steroidhormone ansprechenden oder auf Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Gens/von auf Steroidhormone ansprechenden oder auf Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Genen durch Steroidhormone oder eine Steroidhormon-ähnliche Verbindung/Steroidhormon-ähnliche Verbindungen zu reprimieren, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
  • das System wird einer Verbindung/mehreren Verbindungen und/oder einer Bedingung/mehreren Bedingungen ausgesetzt, die die AP-1-Expression induzieren und wirksam hinsichtlich der Repression der Expression des auf Steroidhormone ansprechenden oder auf Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Gens/der auf Steroidhormone ansprechenden oder auf Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Gene sind.
  • Es ist wünschenswert, daß die Expressionssysteme, die in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechen, während sie gleichzeitig im wesentlichen nicht auf das Vorhandensein von c-Jun, c-Fos oder AP-1 ansprechen.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein in vitro durchgeführtes Verfahren bereitgestellt, um in einem Expressionssystem die Transkriptionsaktivierung eines auf Steroidhormone ansprechenden oder auf Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Gens/von auf Steroidhormone ansprechenden oder auf Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Genen durch eine Steroidhormon- oder Steroidhormon-ähnliche Verbindung/Steroidhormon- oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen oder Analoga davon zu reprimieren, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
  • dem System wird ein Peptid zugeführt, das die Leucin-Reißverschluß- Region von c-Jun oder ein funktionelles Analogon davon umfaßt, und zwar in einer Menge, die wirksam hinsichtlich der Repression der Expression des auf Steroidhormone ansprechenden oder auf Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Gens/der auf Steroidhormone oder Steroidhormon- ähnliche Verbindungen ansprechenden Gene ist.
  • Wie bei der vorhergehenden Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es im Hinblick auf die Expressionssysteme, die in dieser Ausführungsform in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, wünschenswert, daß sie auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechen, während sie im wesentlichen nicht auf das Vorhandensein von c- Jun, c-Fos oder AP-1 ansprechen.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein in vitro durchgeführtes Verfahren bereitgestellt, um in einem Expressionssystem die Transkriptionsaktivierung eines auf AP-1 ansprechenden Gens/mehrerer auf AP-1 ansprechender Gene durch AP-1 oder Analoga davon zu reprimieren, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
  • dem System wird eine Zusammensetzung, die
  • (i) eine funktionelle Liganden-bindende Domäne eines Rezeptors für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon-ähnliche Verbindung oder ein Analogon davon und
  • (ii) eine funktionelle DNA-bindende Domäne eines Rezeptors für ein Steroid oder eine Steroid-ähnliche Verbindung oder Analoga davon umfaßt,
  • zugeführt, und zwar in einer Menge, die wirksam hinsichtlich der Repression der Expression des auf AP-1 ansprechenden Gens/der auf AP-1 ansprechenden Gene ist.
  • Es ist wünschenswert, daß die bei dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingesetzten Expressionssysteme auf c-Jun, c-Fos oder AP-1 ansprechen, während sie im wesentlichen nicht auf das Vorhandensein von Steroidhormonen oder Steroidhormon-ähnlichen Verbindungen ansprechen.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein in vitro durchgeführtes Verfahren bereitgestellt, um in Gegenwart eines Steroidhormons oder einer Steroidhormon-ähnlichen Verbindung oder eines Analogons davon die Repression der Expression des Genprodukts/der Genprodukte von Genen zu überwinden, die einer negativen Regulation durch Rezeptoren für Steroidhormone, Steroidhormon-ähnliche Verbindungen oder Analoga davon unterliegen, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
  • das System wird einer Verbindung/mehreren Verbindungen und/oder einer Bedingung/mehreren Bedingungen ausgesetzt, die die AP-1-Expression induzieren, und zwar in einer Menge, die wirksam hinsichtlich der Suppression der Repression der Expression des Genprodukts/der Genprodukte ist.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein in vitro durchgeführtes Verfahren bereitgestellt, um die Hemmung der Proliferation und Funktion von Lymphoid-Zellen durch ein Steroidhormon, eine Steroidhormon-ähnliche Verbindung oder ein Analogon davon in Gegenwart eines Rezeptors für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon-ähnliche Verbindung oder eines Analogons davon zu überwinden, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
  • das System wird einer Verbindung/mehreren Verbindungen und/oder einer Bedingung/mehreren Bedingungen ausgesetzt, die die AP-1-Expression induzieren, und zwar wirksam hinsichtlich der Suppression der Hemmung der Proliferation und Funktion der Lymphoid-Zellen.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Verbindung bereitgestellt, die einen ersten Komplex mit einem Rezeptor für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon-ähnliche Verbindung bildet; wobei der erste Komplex in Gegenwart von AP-1 die Funktion von AP-1 unterbricht; und wobei der erste Komplex im wesentlichen nicht imstande ist, die transkriptionale Aktivierung von auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Genen zu fördern.
  • Die Hormon-vermittelte transkriptionale Aktivierung ist für viele Hormone aufgeklärt worden; und für einige Hormone kann diese Art der Aktivierung viele verschiedene Gene betreffen. Es ist manchmal wünschenswert, diese transkriptionale Aktivierung zu modulieren. Erfindungsgemäß kann dies erreicht werden, indem entweder das System einer Verbindung/mehrerer Verbindungen und/oder einer Bedingung/mehreren Bedingungen ausgesetzt wird, die die AP-1-Expression induzieren, oder indem dem System ein Peptid zugeführt wird, das die Leucin-Reißverschluß-Region von c-Jun oder Analoga davon umfaßt, und zwar in einer Menge, die wirksam hinsichtlich der Repression der Expression des auf das Hormon ansprechenden Genprodukts ist.
  • Verbindungen, die zur Induktion der Expression von AP-1 imstande sind, umfassen Verbindungen, die die Tumorbildung induzieren (z. B. Phorbolester), Wachstumsfaktoren (z. B. EGF, FGF, CSF), Cytokine (z. B. IL-1, IL-2), Neuropeptide (z. B. Somatostatin), Neurotransmitter (z. B. Acetylcholin), Proteinkinase c (und Verbindungen, die zur Induktion von Proteinkinase c imstande sind, z. B. EGF, Insulin, aus Blutplättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor, α-1-andronergische Mittel, IL-1, IL-2 und dergl.) und dergl.
  • Zu den Bedingungen, die geeignet sind, die Expression von AP-1 zu induzieren, gehört es, das System ultravioletter Strahlung, Gammastrahlung, Wärmeschock, Streß und dergl. auszusetzen.
  • Alternativ dazu kann anstelle der Induktion der Expression von endogenem (oder exogenem) AP-1 das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt werden, indem wirksame Mengen der c-Jun-Leucin-Reißverschluß-Region dem System zugeführt werden. Die Zufuhr eines Peptids, das diese Komponente umfaßt, kann auf einer Reihe von Wegen durchgeführt werden, z. B. durch direkte Einführung einer gereinigten oder halbgereinigten Peptidzusammensetzung, die die gewünschte Komponente enthält; durch Induktion der Expression eines Genkonstrukts, das für die Leucin-Reißverschluß-Region codiert; und dergl.
  • Die Leucin-Reißverschluß-Region ist ein Fragment von mindestens 29 Aminosäuren, die sich selbst in einer α-Helix orientieren, wobei jede siebte Aminosäure der Aminosäurekette ein Leucin ist, so daß die Leucin- Reste einer α-Helix fingerartig mit den Leucin-Resten einer zweiten α- Helix, z. B. einer weiteren c-Jun-Gruppe (unter Bildung eines Homodimeren), einer c-Fos-Gruppe (unter Bildung eines Heterodimeren) und dergl., in Wechselwirkung treten können.
  • Das molare Verhältnis von Protein, das die c-Jun-Leucin-Reißverschluß-Region umfaßt, bezogen auf die molare Menge an Steroidhormon-Rezeptor, der im Expressionssystem vorhanden ist, kann stark variieren. Allgemein eignen sich ein Verhältnis im Bereich von etwa 0,5 bis zu 100:1. Vorzugsweise liegt das Verhältnis der AP-1-Komponente (oder des Derivates davon) zum Steroidhormon-Rezeptor im Bereich von etwa 1 bis zu 20:1; wobei ein molares Verhältnis im Bereich von etwa 5 bis zu 15:1 gegenwärtig am stärksten bevorzugt wird.
  • Auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechende Gene, die für die Verwendung bei dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen werden, umfassen auf Glucocorticoid ansprechendes Gen/ansprechende Gene, auf Retinsäure ansprechendes Gen/ansprechende Gene, auf Vitamin D&sub3; ansprechendes Gen/ansprechende Gene, auf Thyroidhormon ansprechendes Gen/ansprechende Gene, auf Mineralcorticoid ansprechendes Gen/ansprechende Gene, auf Östrogen ansprechendes Gen/ansprechende Gene, auf Östrogen-verwandte Hormone ansprechendes Gen/ansprechende Gene, auf Androgen ansprechendes Gen/ansprechende Gene, auf Progesteron ansprechendes Gen/ansprechende Gene, auf Retinoid ansprechendes Gen/ansprechende Gene, auf Arylkohlenwasserstoff ansprechendes Gen/ansprechende Gene und dergl.
  • Verbindungen, die unter Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert wurden, können zur Behandlung eines Individuums eingesetzt werden, das einen krankhaften Zustand zeigt. Krankhafte Zustände, die einer derartigen Behandlung zugänglich sind, umfassen Anorexia nervosa, Alkoholismus, schwere Depression, chronisches Streßsyndrom (wobei diese Krankheiten mit der Suppression des Immunsystems verbunden sind, die durch anormal hohe Spiegel an Glucocorticoiden hervorgerufen wird) und dergl.
  • Es ist auch bekannt, daß Hormone eine negative Regulation auf bestimmte Prozesse ausüben. Es ist manchmal wünschenswert, diese negative Regulation zu modulieren. Erfindungsgemäß kann dies erreicht werden, indem entweder das System einer Verbindung/mehreren Verbindungen und/oder einer Bedingung/mehreren Bedingungen ausgesetzt wird, die die AP-1-Expression induzieren, oder indem dem System ein Peptid, das die Leucin- Reißverschluß-Region von c-Jun oder Analoga davon umfaßt, zugeführt wird, und zwar in einer Menge, die wirksam hinsichtlich der Suppression der Hormon-vermittelten Repression der Expression von Genprodukten ist.
  • Gene, die einer negativen Regulation durch Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen unterliegen, umfassen das Pro-Opiomelanocortin-Gen, das Prolactin-Gen, das Proliferin-Gen, das chorionische Gonadotropin-α-Untereinheit-Gen, das Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Gen und/oder das Collagenase-Gen.
  • Eine AP-1-vermittelte transkriptionale Aktivierung ist ebenfalls für zahlreiche Genprodukte erkannt worden. Es ist manchmal wünschenswert, diese transkriptionale Aktivierung zu modulieren. Erfindungsgemäß kann dies erreicht werden, indem eine Zusammensetzung, die
  • (i) eine funktionelle Liganden-bindende Domäne eines Rezeptors für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon-ähnliche Verbindung oder ein Analogon davon und
  • (ii) eine funktionelle DNA-bindende Domäne eines Rezeptors für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon-ähnlichen Verbindung oder ein Analogon davon in einer Menge, die wirksam hinsichtlich der Repression der Expression der Genprodukte ist, umfaßt, dem auf AP-1 ansprechenden System zugeführt wird.
  • Die bei dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eingesetzte Zusammensetzung kann als ein einzelnes Protein, das sowohl die Liganden-bindende Domäne als auch die DNA-bindende Domäne enthält, oder als zwei getrennte Proteine, die jeweils eine der gewünschten Funktionen bereitstellen, erfolgen. Es ist gegenwärtig aufgrund der einfachen Handhabung bevorzugt, daß die beiden gewünschten Funktionen als Teil eines einzigen Proteins bereitgestellt werden.
  • Unabhängig davon, ob die bei dieser Ausführungsform der Erfindung eingesetzte Zusammensetzung als eine oder als zwei Proteinspezies zugeführt wird, kann die Zusammensetzung in das System, das moduliert werden soll, auf einer Reihe von Wegen eingeführt werden. Zum Beispiel können gereinigtes oder halbgereinigtes Protein/gereinigte oder halbgereinigte Proteine direkt dem System zugeführt werden. Alternativ dazu können ein Expressionsvektor/Expressionsvektoren, die für das gewünschte Protein/die gewünschten Proteine codieren, zur Expression derartiger Produkte induziert werden.
  • Das molare Verhältnis der Zusammensetzung, die die Liganden-bindende Domäne und die DNA-bindende Domäne umfaßt, bezogen auf das AP-1, das im Expressionssystem vorhanden ist, kann stark variieren. Allgemein eignen sich Verhältnisse im Bereich von etwa 0,5 bis zu 100:1. Vorzugsweise liegt das Verhältnis der Zusammensetzung zu AP-1 im Bereich von etwa 1 bis zu 20:1; wobei ein molares Verhältnis im Bereich von etwa 5 bis zu 15:1 gegenwärtig am stärksten bevorzugt wird.
  • Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auf einer Reihe von Wegen eingesetzt werden, z. B. zur Behandlung von krankhaften Zuständen, die durch AP-1 stimuliert werden. Derartige krankhafte Zustände umfassen die Tumorbildung (z. B. Bildung von Lymphomen), Arthritis, Asthma, Allergien, Hautausschläge und dergl.
  • Hormonrezeptoren, deren Verwendung bei der Ausführung der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogen wird, umfassen intrazelluläre Steroid- Rezeptoren, wie z. B. Glucocorticoid-Rezeptor(en), Retinsäure-Rezeptor(en), Vitamin D&sub3;-Rezeptor(en), Thyroid-Rezeptor(en), Mineralcorticoid- Rezeptor(en), Östrogen-Rezeptor(en), Rezeptor(en) für Östrogen-verwandte Verbindungen, Retinoid-Rezeptor(en), Androgen-Rezeptor(en), Progesteron- Rezeptor(en), Arylkohlenwasserstoff-Rezeptor(en) und dergl. Gegenwärtig bevorzugte Rezeptoren umfassen Glucocorticoid-Rezeptor(en), Thyroid-Rezeptor(en), Mineralcorticoid-Rezeptor(en), Östrogen-Rezeptor(en), Rezeptor(en) für Östrogen-verwandte Verbindungen, Retinoid-Rezeptor(en), Androgen-Rezeptor(en) und Progesteron-Rezeptor(en). Der gegenwärtig am stärksten bevorzugte Rezeptor für die Ausführung der vorliegenden Erfindung ist der Glucocorticoid-Rezeptor, da dieser Rezeptor besonders gründlich charakterisiert worden ist.
  • Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann eine Verbindung, die sich zur Behandlung anormaler Zellen eignet, durch Absuchen auf Verbindungen identifiziert werden, die die beiden Kriterien der Unterbrechung der Funktion von AP-1 erfüllen, jedoch nicht die transkriptionale Aktivierung von auf Steroidhormone ansprechenden Genen fördern.
  • Ein zweckmäßiges Mittel, um die Fähigkeit einer Testverbindung zu bewerten, die Funktion von AP-1 zu unterbrechen, besteht darin, die Testverbindung in einem Assaysystem einzusetzen, daß eine Zellinie umfaßt, die imstande ist, einen Steroidhormon-Rezeptor, AP-1 und einen auf AP-1 ansprechenden Reporter zu exprimieren. Zellen, die einen endogenen Rezeptor, AP-1 und einen auf AP-1 ansprechenden Reporter exprimieren, oder Zellen, die über eine exogene Quelle für einen oder mehrere der vorstehenden Bestandteile verfügen, können eingesetzt werden. Bevorzugte Zellen, die für diesen Zweck eingesetzt werden, sind Zellen, die kein mit dem auf AP-1 ansprechenden Reporter assoziiertes "Hormon-Reaktions-Element" aufweisen.
  • Wenn die Verbindung wirksam hinsichtlich der Unterbrechung der Funktion des AP-1-Weges ist, dann wird der auf AP-1 ansprechende Reporter (ein Genprodukt, das durch herkömmliche Methoden ohne weiteres gemessen werden kann) nicht exprimiert. Wenn umgekehrt die Verbindung nicht in der Lage ist, den auf AP-1 ansprechenden Weg zu unterbrechen, dann wird der auf AP-1 ansprechende Reporter exprimiert und kann ohne weiteres gemessen werden.
  • Ein zweckmäßiges Mittel, um die Fähigkeit einer Testverbindung zu bewerten, die transkriptionale Aktivierung von auf Steroidhormone ansprechenden Genen zu fördern (oder nicht zu fördern), besteht darin, die Testverbindung in einem Assaysystem einzusetzen, das eine Zellinie umfaßt, die imstande ist, einen Hormon-Rezeptor und einen auf ein Hormon ansprechenden Reporter zu exprimieren. Zellen, die einen endogenen Steroidhormon-Rezeptor und/oder auf Steroidhormone ansprechenden Reporter exprimieren, können eingesetzt werden. Alternativ dazu können Zellen, die mit einer exogenen Quelle für einen Steroidhormon-Rezeptor und/oder einen auf Steroidhormone ansprechenden Reporter transfiziert sind, eingesetzt werden. Wenn die Testverbindung die transkriptionale Aktivierung fördert, dann wird der auf Steroidhormone ansprechende Reporter exprimiert und kann ohne weiteres gemessen werden. Wenn umgekehrt die Testverbindung die transkriptionale Aktivierung nicht fördert, dann wird der auf Steroidhormone ansprechende Reporter nicht exprimiert.
  • Die Erfindung wird nachstehend ausführlicher durch Bezug auf die folgenden nicht beschränkenden Beispiele erläutert.
    • Beispiele
  • Experimentelle Verfahren, die in den in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Beispielen angewandt wurden, sind nachstehend angegeben.
    • Rekombinante Plasmide
  • Die Collagenase-CAT-Konstrukte und das Plasmid (AP-1)&sub5;-TKCAT wurden von Angel et al. (vgl. Mol. Cell. Biol., Bd. 1 (1987), S. 2256-2266) beschrieben.
  • Die rekombinanten GR-Mutanten wurden von Hollenberg et al. (vgl. Cell, Bd. 49 (1987), S. 39-46 und Cell, Bd. 55 (1988), S. 899-906), Giguere et al. (Nature, Bd. 330 (1987), S. 624-629) und Umosono und Evans (Cell, Bd. 57 (1989), S. 1139-1146) beschrieben.
  • Die RAR-Mutante RARαDeltal-80 wurde durch Ersatz des NotI-BamHI- Fragments von GR13 mit dem von RARNX [vgl. Hollenberg und Evans in Cell, Bd. 86 (1988), S. 899-906] erzeugt. Die Mutante RARαDeltaNX wurde erzeugt, indem das NotI-XhoI-Fragment von RARαNX durch ein synthetisches Oligonucleotid, das die NotI-XhoI-Restriktionsstellen enthielt, ersetzt wurde.
  • Die rekombinanten Maus-c-Jun-Konstrukte wurden von Lamph et al. (Nature, Bd. 334 (1988), S. 629-631) und Ransone et al. (vgl. Genes and Devel., Bd. 3 (1989), S. 770-781 und Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 87 (1990), S. 3806-3810) beschrieben. Das Konstrukt SVTLZJun wurde durch Amplifikation von DNA-Sequenzen, die für die Aminosäuren 282 bis 334 von Maus-c-Jun (Lamph et al., a.a.0.) codieren, durch Polymerase-Kettenreaktion und anschließende Ligation stromabwärts von einem SV40-Kerntranslokationssignal (Kalderon et al., Cell, Bd. 39 (1984), S. 499-509) in einem pRS-Expressionsvektor (Giguere et al., Cell, Bd. 46 (1986), S.645-652) erzeugt. Die Sequenz wurde gemäß Taboe und Richardson (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), S. 4767-4771) bestätigt.
    • Transfektionen und Reporter-Assays
  • Die Transfektion von Plasmid-DNA in HeLa-, NIH3T3- oder CV-1-Zellen wurde unter Anwendung der Standard-Calciumphosphat-Copräzipitationstechnik, die von Gorman et al. in Mol. Cell. Biol., Bd. 2 (1982), S. 1044- 1051 beschrieben wurde, mit geringfügigen Modifikationen, die von Schüle et al. in Nature, Bd. 332 (1988), S. 87-90 beschrieben wurden, durchgeführt. Die Zellen wurden in DMEM-Medium, das mit 10 % Rinderkälberserum (BCS) angereichert war, gehalten. 24 Stunden vor der Transfektion wurden 7 × 10&sup5; Zellen/100 mm-Schale in Phenolrot-freiem DMEM, das mit 10 % Aktivkohle-behandeltem Rinderkälberserum (BCS) angereichert war, plattiert. Typischerweise wurden 2 µg Reporter-Plasmid und 2 µg eines RAS-β-Galactosidase-Expressionsplasmids (interne Kontrolle für den Transfektionswirkungsgrad) (Umesono und Evans, a.a.0.) verwendet. Die Cotransfektion von zusätzlichen Expressionskonstrukten ist in den einzelnen Beispielen angegeben. Die Gesamtmenge an transfizierter DNA wurde stets auf 20 µg mit pUC18 eingestellt. Die Zellen wurden dem Präzipitat für 16 bis 20 Stunden ausgesetzt. Sofern nichts anderes angegeben ist, wurden die Zellen erneut mit Phenolrot-freiem DMEM und 10 % Aktivkohle-behandeltem BCS versorgt, und 10&supmin;&sup7; m DEX (oder 10&supmin;&sup6; m RA) wurden zugegeben. Für die TPA-Induktion von Col-CAT-Reporterkonstrukten wurden HeLa-Zellen mit Phenolrot-freiem DMEM, das mit 0,5 % Aktivkohle-behandeltem BCS angereichert war, versorgt und gleichzeitig mit 100 ng/ml TPA und 10&supmin;&sup7; m DEX inkubiert.
    • Protein-DNA-Bindungsassays
  • 3 µl an frisch in vitro translatierten Proteinen wurden in Bindungspuffer [10 millimolar HEPES, pH-Wert: 7,8/4 millimolar MgCl&sub2;/0,1 millimolar EDTA/4 millimolar Spermidin/2 millimolar Dithiothreit, Rinderserumalbumin bei 100 µg/ml/Poly(dI-dC) bei 1 µg/ml/15 % (Vol./Vol.) Glycerin] auf Eis für 10 Minuten vorinkubiert. Sodann wurden 2 ng ³²P-markierte Oligonucleotidsonden (4 x 10&sup4; dpm) zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Für den Konkurrenzassay wurden verschiedene Mengen an bakteriell exprimiertem GR, RARα oder nicht-transformiertem bakteriellem BL-21-Lysat gleichzeitig mit den Jun-Proteinen zugegeben. Die Jun-Proteine wurden entweder in vitro translatiert oder aus HeLa-Zellextrakten erhalten. Nach weiterer Inkubation auf Eis für 15 Minuten wurden die Protein-DNA-Komplexe erneut mit 4 % PAGE in 45 millimolar Tris/32,3 millimolar Borsäure/1,25 millimolar EDTA, pH-Wert: 8,3, gelöst. Das getrocknete Gel wurde dann mit einem Verstärkerschirm bei -70ºC einem Kodak-XAR-Film exponiert.
    • Beispiel 1: Jun reprimiert die GR-vermittelte Aktivierung
  • c-Jun- und GR-Expressionsplasmide wurden in NIH3T3-Zellen cotransfiziert und Assays unterzogen, um festzustellen, ob c-Jun imstande ist, die GR-vermittelte Aktivierung eines GRE&sub2;-TKCAT-Reporterplasmids [Schüle et al., Science, Bd. 242 (1988), S. 1418-1420] zu hemmen. In diesem Experiment wurden NIH3T3-Zellen verwendet, da sie endogenen GR enthalten und bei Nährstoffmangel nur Restmengen des AP-1-Komplexes exprimieren. Wie in Fig. 1 gezeigt ist, induzierte GR bei Zugabe des synthetischen Glucocorticoids Dexamethason die Reporteraktivität stark.
  • Die Cotransfektion wurde mit konstanten Mengen an GR-Expressionsplasmid und variierenden Mengen an c-Jun-Expressionsplasmid durchgeführt; DeltaJun, ein Konstrukt, dem die c-Jun-codierenden Sequenzen fehlen, und DeltaRKJun, ein Konstrukt, dem die c-Jun-DNA bindende Domäne fehlt, wurden bei dem Experiment ebenfalls berücksichtigt. In Fig. 1 sind die Zellen entweder als unbehandelt (schwarze Balken) oder als mit DEX behandelt (gestreifte Balken) gezeigt. In der Figur angegebene Zahlen bedeuten µg an cotransfizierter Plasmid-DNA. Wie in Fig. 1A gezeigt ist, induziert GR stark die Reporteraktivität bei Zugabe des synthetischen Glucocorticoids Dexamethason (DEX) (Fig. 1A, Spur 1). Die Cotransfektion von steigenden Mengen an c-Jun-Expressionsplasmiden hemmte die Hormon-induzierte Reporteraktivität in einer konzentrationsabhängigen Weise (Fig. 1A, vgl. Spur 1 mit Spuren 2-5). Im Gegensatz dazu änderte die Transfektion mit dem Elternplasmid DeltaJun, dem die c-Jun-codierenden Sequenzen fehlen, die Aktivität von GRE&sub2;-TKCAT nicht (Fig. 1A, Spur 7). Da dem GRE&sub2;-TKCAT-Reporter eine intrinsische AP-1-Stelle fehlt, scheint die Hemmung nicht die Bindung von c-Jun an DNA zu erfordern. Dies wurde durch eine Mutante, nämlich DeltaRKJun, der eine funktionelle DNA-bindende Domäne fehlt, bestätigt (Fig. 1A, Spur 6). Diese Mutante führte zu Graden der Repression ähnlich denen des Wildtyp-c-Jun-Proteins (Fig. 1A, vgl. Spuren 5 und 6). Die Expression des Kontrollplasmid TKCAT, dem das GRE fehlt, wurde weder durch die Hormonbehandlung noch durch die Überexpression von c-Jun beeinflußt. c-Jun reprimierte auch die hormonabhängige Aktivierung von GRE&sub2;- TKCAT durch endogenen GR, der in NIH3T3-Zellen vorhanden ist (Fig. 1B, vgl. Spuren 1 und 2).
  • Um weiter zu zeigen, daß die durch c-Jun vermittelte Repression nicht spezifisch für ein bestimmtes GRE oder eine bestimmte Promotorsequenz ist, haben wir das Reporterplasmid DeltaMGREp-CAT (Thompson und Evans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 86 (1989), S. 3494-3498), das ein palindromes GRE in einem Maus-Brusttumor-Viruspromotor enthält, in NIH3T3-Zellen transfiziert. Die transkriptionale Aktivität von GRE&sub2;- TKCAT, DeltaMGREp-CAT und des Kontrollplasmids DeltaM-CAT in NIH3T3-Zellen in Abwesenheit (schwarze Balken) oder Gegenwart (gestreifte Balken) von DEX ist in Fig. 1B gezeigt. Die transkriptionale Aktivität wurde mit endogener Reporteraktivität, die in NIH3T3-Zellen (Spuren 1 und 2) oder in Zellen, die mit 0,5 µg an GR-Expressionsplasmiden (Spuren 3-6) transfiziert worden waren, vorhanden ist, analysiert. Wo (+) angegeben ist, wurden 5 µg an c-Jun-Expressionsplasmiden cotransfiziert. Die NIH3T3-Zellen wurden bei einem geringen Serumgehalt (0,5 %) kultiviert. Die Aktivität dieses Konstrukts wurde in wirksamer Weise durch GR in Gegenwart von Hormon (Fig. 1B, Spur 3) induziert und durch Überexpression von c-Jun (Fig. 1B, Spur 4) reprimiert. Weder eine Hormonbehandlung noch die Überexpression von c-Jun änderte in signifikanter Weise die Aktivität des Kontrollplasmids DeltaM-CAT (Fig. 1B, Spuren 5 und 6).
    • Beispiel 2:
  • Die Collagenase-AP-1-Stelle ist für die DEX-Repression erforderlich
  • In diesem Beispiel wurde die Fähigkeit des GR untersucht, die Induktion eines auf AP-1 ansprechenden Promotors zu hemmen. Das durch AP-1 induzierbare Reporterkonstrukt (AP-1)&sub5;-TKCAT wurde in GR-negative CV-1-Zellen, die bei geringem Serumgehalt (0,5 %) kultiviert wurden, transfiziert (Fig. 2A). Fig. 2A faßt die Aktivität des Reporterkonstrukts (AP-1)&sub5;- TKCAT und des Kontrollplasmids TKCAT in unbehandelten (gezeigt als schwarze Balken) oder mit DEX behandelten (gezeigt als gestreifte Balken) CV-1-Zellen, die entweder mit dem GR-Expressionsplasmid oder dem Elternvektor DeltaGR, dem die GR-codierenden Sequenzen fehlen, und Jun/Fos-Expressionsplasmiden cotransfiziert wurden. Die CV-1-Zellen wurden bei geringem Serumgehalt (0,5 %) kultiviert. Dieser Promotor weist eine hohe Basisaktivität auf, die durch die Cotransfektion von Jun/Fos-Expressionsvektoren weiter stimuliert wird (Fig. 2A, Spur 2). Die Gegenwart von DEX und GR führt zu einer wirksamen Hemmung dieser Induktion (Spur 2), während das Kontrollplasmid DeltaGR, dem die GR-codierenden Sequenzen fehlen, keinen Einfluß auf die Jun/Fos-Induktion in Gegenwart von DEX hat (Spur 3). Wie für die TKCAT-Kontrolle (Spuren 4 und 5) gezeigt wird, hängt die Induktion vom Vorhandensein der AP-1-Stellen ab, und in Abwesenheit dieser Stellen haben Glucocorticoide allein keine Wirkung.
  • Der Collagenase-Promotor bot die Möglichkeit, diese potentielle Regulation eines zellulären Gens durch einen GR zu untersuchen. Dieses Gen wurde gewählt, da gezeigt wurde, daß Glucocorticoide seine Expression negativ regulieren [vgl. Brinckerhoff et al., Biochemistry, Bd. 25 (1988), S. 6378-6384]. Während von Jun/AP-1 und Faktoren, die den Jun/AP-1-Weg stimulieren, bekannt ist, daß sie seine Aktivität positiv induzieren, wurden verschiedene Collagenase-Promotor-CAT-Reporterplasmide in HeLa- oder CV-1-Zellen transfiziert. HeLa- und CV-1-Zellen wurden verwendet, da in beiden Zellinien Collagenase exprimiert wird [Angel et al., Mol. Cell. Biol., Bd. 7 (1987), S. 2256-2266]. Außerdem exprimieren HeLa-Zellen endogene GR-Aktivität. Fig. 2B zeigt die transkriptionale Aktivität von verschiedenen Collagenase-Promotor-CAT-Selektionsmutanten und heterologen Reportern in HeLa-Zellen, die in 10 % Serum in Abwesenheit (schwarze Balken) oder Gegenwart von DEX (gestreifte Balken) kultiviert wurden. In der Figur bezieht sich "TK" auf das Thymidinkinase-CAT-Konstrukt; "(AP-1)&sub5;TK" bezieht sich auf ein Konstrukt, das 5 Kopien der Collagenase AP-1-Stelle vor TK-CAT enthält; und "DeltaMGREp" bezieht sich auf ein Konstrukt, das ein Consensus-GRE umfaßt, das in DMCAT kloniert ist. Wie in Fig. 2B (Spuren 1-3) gezeigt ist, führte die Zugabe von DEX zu HeLa-Zellen zu einer 4-5-fachen Repression von 1200 Col-CAT- und 73 Col-CAT-Reporter-Aktivität, während die Aktivität des Reporterplasmids 63 Col-CAT unverändert blieb. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Repression durch DNA-Sequenzen vermittelt wird, die sich zwischen Position -73 und -63 auf dem Collagenase-Promotor befinden. Es wurde gezeigt, daß diese Region einen TPA- induzierbaren Verstärker enthält, der durch den AP-1-Komplex erkannt wird. Der auf DEX ansprechende Reporter DeltaMGREp-CAT wurde in einer hormonabhängigen Weise aktiviert, was zeigt, daß die Repression des Collagenase-Promotors oder eines heterologen Reporters vom Vorhandensein der AP-1-Stelle abhängt (Fig. 2B, Spur 6).
  • Um zu zeigen, daß die Repression nicht für den Zelltyp spezifisch ist, wurde der GR-Expressionsvektor zusammen mit den Col-CAT-Reporterplasmiden in GR-negative CV-1-Zellen cotransfiziert. Fig. 2C zeigt die transkriptionale Aktivität von Collagenase-Promotor-Deletionsmutanten und DeltaMGREp-CAT in CV-1-Zellen, die in 10 % Serum kultiviert und entweder mit dem GR-Expressionsplasmid oder dem Kontrollplasmid (DeltaGR) in Abwesenheit (schwarzer Balken) oder in Gegenwart von DEX (gestreifter Balken) cotransfiziert wurden. Spur 1 von Fig. 2C zeigt, daß die Zugabe von DEX zu CV-1-Zellen, die mit den Elternplasmiden transfiziert wurden, denen die codierende Sequenz für GR fehlt, die Col-CAT-Aktivität nicht veränderte. Im Gegensatz dazu wurden in Gegenwart des Rezeptors 1200 Col-CAT und 73 Col-CAT wirksam in einer hormonabhängigen Weise (Fig. 2C, Spuren 2 und 3) reprimiert, während 63 Col-CAT nur geringfügig durch den aktivierten GR beeinflußt wurde (Fig. 2C, Spur 4).
  • Um weiter die Wechselwirkung zwischen GR und Jun/AP-1 zu untersuchen, wurde die Col-CAT-Reporteraktivität entweder durch Behandlung mit TPA oder alternativ durch Überexpression der Jun- und Fos-Proteine erhöht. Die Expression von Collagenase-CAT-Deletionsmutanten wurde in unbehandelten HeLa-Zellen gemessen, die entweder mit TPA, DEX oder einer Kombination von beiden inkubiert wurden. Die transkriptionale Aktivität von Collagenase-CAT-Deletionsmutanten wurde in unbehandelten (schwarze Balken) oder DEX-behandelten (gestreifte Balken) CV-1-Zellen gemessen, die mit dem GR-Expressionsplasmid, dem Elternvektor DeltaGR, dem die GR-codierenden Sequenzen fehlen, oder Jun/Fos-Expressionsplasmiden cotransfiziert wurden. Sowohl HeLa- als auch CV-1-Zellen wurden bei geringem Serumgehalt (0,5 %) kultiviert. Wie in Fig. 3A gezeigt ist, erhöht die Zugabe von TPA zu HeLa-Zellen, die bei geringem Serumgehalt (0,5 %) kultiviert wurden, stark die 1200 Col-CAT-Aktivität (vgl. Spuren 1 und 3). Diese Induktion wurde um ein Mehrfaches durch die Stimulation der endogenen GR-Rezeptoren durch DEX-Zugabe verringert (Fig. 3A, Spur 4). Die Expression von 63 Col-CAT wurde durch diese Behandlungen nur wenig beeinflußt (Fig. 3A, Spuren 5-8). Die Expression von 1200 Col-CAT kann durch Cotransfektion der Jun/Fos-Expressionsplasmide in CV-1-Zellen, die bei geringem Serumgehalt (0,5 %) kultiviert werden, erhöht werden (Fig. 3B, Spur 2). Diese induzierten Spiegel wurden in wirksamer Weise durch DEX- aktivierten GR reprimiert (Fig. 3B, vgl. Spuren 1 und 2). Es wurde keine Repression beobachtet, wenn das Elternplasmid DeltaGR, dem die GR-codierenden Sequenzen fehlen, verwendet wurde (Fig. 3B, Spur 3). Weder die Hormonbehandlung noch die Überexpression von Jun/Fos veränderte die Aktivität des Kontrollplasmids 63 Col-CAT in signifikanter Weise (Fig. 3B, Spuren 4 und 5).
  • Die in den Figuren 2 und 3 vorgelegten Daten zeigen, daß sowohl die Aktivierung als auch die Repression des Collagenase-Promotors und des TK- Reporters vom Vorhandensein von transkriptionaler Aktivität der AP-1- Stelle abhängen. Die AP-1-Stelle ist der hauptsächliche Verstärker in dem Promotor des Collagenase-Gens und der einzige Verstärker von (AP-1)&sub5;- TKCAT. Glucocorticoide können also als allgemeine Modulatoren von auf AP- 1 ansprechenden Genen dienen.
    • Beispiel 3:
  • Die GR-DNA-bindende Domäne ist erforderlich, jedoch nicht ausreichend für die Repression von Jun/AP-1-Aktivität
  • Die vorstehenden Experimente zeigen, daß die Jun/AP-1-Aktivierung wirksam durch GR in einer hormonabhängigen Weise reprimiert werden kann. Um Regionen des Rezeptors zu definieren, die an der Repression beteiligt sind, wurden mehrere GR-Mutanten in Cotransfektions-Studien in CV-1-Zellen auf ihre Fähigkeit untersucht, 1200 Col-CAT-Reporter-Aktivität zu reprimieren. In Fig. 4 wurden GR-Mutanten, die zuvor im Hinblick auf die transkriptionale Aktivierung, die Kernlokalisation, die DNA-Bindung und die Liganden-Bindung charakterisiert wurden, auf ihre Fähigkeit untersucht, die Aktivität des 1200 Col-CAT-Reporters zu reprimieren oder den MTV-CAT-Reporter zu aktivieren. Der Wildtyp-Rezeptor besteht aus zwei Aktivierungsdomänen (τ1 und τ2), der DNA-bindenden Domäne (DNA) und einer Liganden-bindenden Domäne (Ligand). In Fig. 4 bezeichnet der Maßstab über den angegebenen Mutanten Aminosäurepositionsnummern. Die deletierten Aminosäuren sind auf der linken Seite angegeben. Bei einigen Mutanten ist die GR-DNA-bindende Domäne durch die DNA-Domänen von GAL4 (GgalG), TR (GTG) oder RAR (GRG) ersetzt. Die rekombinante Mutante RGR besteht aus der GR-DNA-bindenden Domäne plus RAR-Amino- und Carboxy-Termini. Die Mutante GTG3A enthält drei Punktmutationen (EG--G) in der P-Box der GR-DNA- bindenden Domäne. Die Repression der 1200 Col-CAT-Reporteraktivität, die mit dem Wildtyp-GR erzielt wurde, wurde zu 100 % gesetzt. Alle Mutanten wurden in der Zelle gemäß Western-Blot-Analyse in ähnlichen Mengen exprimiert. Die in den Zeilen 13 bis 17 gezeigten Hybridrezeptoren aktivieren ihre entsprechenden Reaktionselemente in einer hormonabhängigen Weise. Die meisten aminoterminalen Deletionsmutanten zeigen verringerte Glucocorticoid-vermittelte Repression (Fig. 4, vgl. Spur 1 mit Spuren 2 bis 5). Interessanterweise reprimierte die Mutante Delta240-290 (Spur 3), die eine kurze Deletion in einer transkriptionalen Aktivierungsdomäne aufweist und als τ&sub1; bezeichnet wird, die Reporteraktivität stärker als der Wildtyp-GR. Die Carboxy-terminal verkürzten Mutanten 550* und 515* zeigten beide eine merklich verringerte hormonunabhängige Repressionsaktivität (Spuren 6 und 8). Diese Daten zeigen, daß die Liganden-bindende Domäne und, in einem geringeren Ausmaß, der Aminoterminus zur Repressoraktivität beitragen.
  • Die Deletion der gesamten DNA-bindenden Domäne führte zu einem vollständigen Verlust der Repression (Spur 10, Mutante Delta428-490). Die weitere Analyse zeigte, daß die Deletion des ersten Zinkfingers (Spur 11, Mutante Delta420-451) oder des zweiten Zinkfingers (Spur 12, Mutante Delta450-487) des GR die Repression vollständig ausschaltete. Die DNA- bindende Domäne ist zwar für die Repression erforderlich, jedoch nicht ausreichend, da Mutanten, die nur diese Region exprimieren (Spur 7, Mutante Delta9-385/550* und Spur 9, Mutante Delta9-385/515*) ebenfalls inaktiv sind. Die Substitution der GR-DNA-bindenden Domäne gegen die des Hefetranskriptionsfaktors GAL4 führte zu einer Mutante, die nicht reprimierte (Spur 13, Mutante GgalG), obwohl sie imstande ist, auf GAL4 ansprechende Promotoren in einer hormonabhängigen Weise zu aktivieren. Die Bedeutung der GR-DNA-bindenden Domäne ist unerwartet, da GR nicht an die Collagenase-AP-1-Stelle bindet (wie in Fig. 6 gezeigt ist).
  • Um weitere Belege dafür bereitzustellen, daß die DNA-Bindung für die GR-vermittelte Repression nicht erforderlich ist (im Gegensatz zum Erfordernis der DNA-Bindung, damit die von Diamond et al., a.a.0., beobachtete Wechselwirkung auftritt), wurde ein mutierter Rezeptor mit einer veränderten Zielgenspezifität untersucht, um sicherzustellen, daß er seine Fähigkeit zur Repression verloren hatte. Diese GR-Mutante, die durch Punktmutationen in der P-Box der DNA-bindenden Domäne erzeugt wurde, erkennt TRE oder ERE anstelle von GRE. Diese Mutante ist noch in der Lage, zu reprimieren, und zwar nur mit geringfügig verringertem Wirkungsgrad (Fig. 4, Spur 14). In ähnlichen Experimenten waren Mutanten, bei denen die GR- DNA-bindende Domäne gegen die von RAR oder TR (Mutanten GRG und GTG) ausgetauscht worden war, imstande, 1200 Col-CAT-Expression zu reprimieren (Fig. 4A, Spuren 15 und 16). Schließlich reprimierte eine Mutante (RGR), in der die GR-Amino- und Carboxytermini gegen die von RAR ausgetauscht worden war, ebenfalls in wirksamer Weise (Spur 17).
  • Zusammen zeigen diese Ergebnisse, daß die GR-DNA-bindende Domäne und eine intakte Fingerstruktur für eine wirksame Repression erforderlich sind. Die Zielgenspezifität der DNA-bindenden Domäne scheint jedoch nicht von Bedeutung zu sein, da die Substitution der DNA-bindenden Domänen mehrerer Steroidhormon-Rezeptoren gegen die von GR die Repressionsaktivität nicht beendete. Außerdem behielt ein mutierter Rezeptor, der aus RAR- Amino- und Carboxytermini und der GR-DNA-bindenden Domäne bestand, noch Repressionsaktivität.
    • Beispiel 4:
  • Der c-Jun-Leucin-Reißverschluß ist für die Repression von GR-Aktivität erforderlich
  • Um festzustellen, welche Region des c-Jun-Proteins für die Repression der GR-vermittelten Aktivierung verantwortlich ist, wurde eine Reihe von mutierten c-Jun-Proteinen in NIH3T3-Zellen, die bei geringem Serumgehalt (0,5 %) kultiviert wurden, auf ihre Fähigkeit zur Repression von GRE&sub2;-TKCAT-Aktivität untersucht. GRE&sub2;-TKCAT- oder TKCAT-Reporterkonstrukte wurden in NIH3T3-Zellen mit 0,5 µg GR-Expressionsplasmid mit oder ohne 5 µg einer der angegebenen Mutanten cotransfiziert. Die Zellen wurden bei geringem Serumgehalt (0,5 %) kultiviert.
  • Fig. 5 zeigt Reporteraktivität als -fache Induktion. Das c-Jun-Protein ist als aus einem Aminoterminus (NH&sub2;), einer DNA-bindenden Region (BR), einem Leucin-Reißverschluß (LZ) und einem Carboxyterminus (C) bestehend gezeigt. Die Zahlen über den angegebenen Mutanten bezeichnen Positionen von Aminosäuren am Beginn oder Ende der entsprechenden Region. Die Mutante SVTLZJun enthält ein SV40-Kerntranslationssignal, das vor den Leucin-Reißverschluß kloniert wurde. Die c-Jun-Mutanten wurden in ähnlichen Mengen exprimiert. Die Deletion der c-Jun-DNA-bindenden Domäne (Fig. 5, Spur 3) oder des gesamten Aminoterminus (Fig. 5, Spur 5) änderte nicht die Fähigkeit des c-Jun-Proteins, GRE&sub2;-TKCAT-Reporteraktivität zu reprimieren. Die Deletion des Leucin-Reißverschlusses beendete jedoch die Fähigkeit des Proteins, zu reprimieren (Fig. 5, Spur 4).
  • Um weiter die Fähigkeit des c-Jun-Leucin-Reißverschlusses zu untersuchen, die GR-vermittelte Aktivierung zu reprimieren, wurde eine Mutante konstruiert, bei der der Leucin-Reißverschluß plus 23 Carboxy-terminale Aminosäuren an ein SV40-Kernlokationssignal fusioniert waren. Wie in Fig. 5, Spur 6, gezeigt ist, reprimierte diese Mutante Reporteraktivität in ähnlichem Ausmaß wie Wildtyp-c-Jun. Die Aktivität des Kontrollplasmid TKCAT wurde weder durch Hormonbehandlung noch durch Überexpression von c- Jun verändert (Fig. 5, Spuren 7 und 8).
  • Die Ergebnisse in den Figuren 4 und 5 zeigen, daß c-Jun imstande ist, in wirksamer Weise die GR-vermittelte Aktivierung zu reprimieren und daß die Carboxy-terminale Region von c-Jun, die den Leucin-Reißverschluß enthält, für diese Wirkung ausreichend ist.
    • Beispiel 5:
  • AP-1 hemmt die GR-GRE-Komplexbildung
  • Um eine mögliche physikalische Wechselwirkung zwischen c-Jun und GR zu untersuchen, wurden Gelretardationsassays durchgeführt. Diese Assays wurden mit einem ³²P-markierten Oligonucleotid, das ein palindromes GRE enthielt, und Extrakten, die aus COS-Zellen hergestellt wurden, die mit Konstrukten transfiziert worden waren, die GR (Fig. 6A, Spuren 1, 3 und 4) oder β-Galactosidase (Fig. 6A, Spur 2) exprimieren, durchgeführt. Konkurrenzreaktionen wurden unter Verwendung eines 50-fachen Überschusses an unmarkiertem Oligonucleotid, das das GREP (Fig. 6A, Spur 3) oder die Collagenase-AP-1-Bindungsstelle (Fig. 6A, Spur 4) enthielt, durchgeführt.
  • GR (erhalten durch Überexpression in COS-Zellen) bildete einen spezifischen, retardierten Komplex mit einem Oligonucleotid, das einen palindromen GR enthält (Fig. 6A, Spur 1). Der GR-GRE-Komplex wurde, während er in wirksamer Weise einer Konkurrenz durch einen 50-fachen Überschuß an unmarkiertem GRE (Spur 3) unterlag, nicht durch Konkurrenz mit einem 50- fachen Überschuß eines Oligonucleotids, das die AP-1-Stelle enthielt, die sich im Collagenase-Promotor findet (Spur 4), beeinflußt. Dieses Ergebnis zeigt, daß der GR nicht an die Collagenase-AP-1-Bindungsstelle bindet.
  • Gelretardationsassays wurden mit ³²P-markierten Oligonucleotiden, die einen palindromen GRE (Fig. 6B, Spuren 1-8) oder eine NF-1-Bindungsstelle (Fig. 6B, Spuren 9-12) enthielten, und Extrakten, die aus COS-Zellen, die GR exprimierten, hergestellt wurden, durchgeführt. Reaktionen wurden in Abwesenheit (Fig. 6B, Spuren 1, 5 und 9) oder in Gegenwart von 63 ng (Fig. 6B, Spuren 2, 6 und 10), 130 ng (Fig. 6B, Spuren 3, 7 und 11) oder 250 ng (Fig. 6B, Spuren 4, 8 und 12) von gereinigtem, bakteriell exprimiertem c-Jun (Fig. 6B, Spuren 1-4 und 9-12) oder bakteriellen BL21- Lysaten (Kontrolle, Spuren 5-8) durchgeführt.
  • Es ist ersichtlich, daß die Zugabe von steigenden Mengen an gereinigtem, bakteriell exprimiertem c-Jun zu einer starken Verringerung der Menge an gebildetem GR-GRE-Komplex führte (Fig. 6B, Spuren 2-4). Im Gegensatz dazu beeinträchtigte die Zugabe von Lysaten von zur Kontrolle transformierten Bakterien die GR-GRE-Komplexbildung nicht (Fig. 6B, Spuren 5-8).
  • Um die Spezifität der Wirkung von c-Jun auf GR-GRE-Wechselwirkungen zu zeigen, wurden Gelretardationsassays unter Verwendung von COS-Zellextrakten (mit einem Gehalt an GR) und einem Oligonucleotid, das eine NF-1- Bindungsstelle enthielt, durchgeführt. Die Zugabe steigender Mengen an c- Jun hatte keinen Einfluß auf die NF-1-Bindungsaktivität (Fig. 6B, Spuren 9-12).
  • Um weiter diese in vitro-Daten mit in vivo-Ergebnissen zu korrelieren, wurde eine verkürzte c-Jun-Mutante, die als DeltaNJun bezeichnet wurde (vgl. Fig. 5, Spur 5) auf ihre Fähigkeit untersucht, die GR-GRE- Wechselwirkungen zu unterbrechen. DeltaNJun, bei der die Aminosäuren 1-249 deletiert sind, behält den Leucin-Reißverschluß und die Grunddomäne des c-Jun-Proteins. Übereinstimmend mit den in vivo-Ergebnissen war die verkürzte Mutante zur Unterbrechung der Bildung des GR-GRE-Komplexes imstande (Fig. 6C; wobei die Gelretardationsassays mit einem ³²P-markierten Oligonucleotid, das ein palindromes GRE enthielt, und Extrakten, die aus COS-Zellen, die den GR exprimieren, hergestellt wurden, durchgeführt wurden). Die Reaktionen wurden in Abwesenheit (Spuren 1 und 5) oder Gegenwart von 200 ng (Spuren 2 und 6), 400 ng (Spuren 3 und 7) oder 800 ng (Spuren 4 und 8) an gereinigter, bakteriell exprimierter Mutante DeltaNJun (Spuren 1-4) oder bakteriellen BL21-Lysaten (Kontrolle; Spuren 5-8) durchgeführt.
    • Beispiel 6:
  • RAR vermittelt die Repression von Collagenase-Promotor- Aktivität
  • Ein Reporterplasmid, das einen 1,2 Kilobasen umfassenden Abschnitt des Collagenase-Promotors in Fusion mit dem bakteriellen Chloramphenicolacetyltransferasegen (CAT-Gen) (1200 Col-CAT) enthielt, wurde in HeLa- Zellen zusammen mit 0,1 µg Expressionsplasmiden, die für RARα, RARβ und RARgamma (Fig. 7, Balken 2-4) codierten, cotransfiziert, in 10 % Serum kultiviert und untersucht, um festzustellen, ob das Reportergen durch Retinsäure (RA) beeinflußt wird. HeLa-Zellen wurden in diesem Experiment verwendet, da sie endogenen RAR enthalten und das Collagenase-Gen sowie das Jun-Protein exprimieren. Wie in Fig. 7 gezeigt ist, reprimiert endogener RAR 1200 Col-CAT-Aktivität um etwa 50 % bei RA-Zugabe (Fig. 7, Balken 1). Die Cotransfektion eines beliebigen der Expressionsplasmide RARα, RARβ oder RARgamma hemmte weiter die 1200 Col-CAT-Reporteraktivität auf etwa 15 % der nicht mit RA behandelten Kontrollen (Fig. 7, Balken 2-4). Im Gegensatz dazu wurde das Kontrollplasmid βRE-TKCAT (das ein bekanntes RA-Reaktionselement, nämlich βRARE, enthält [(vgl. Sucov et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 87 (1990), S. 5392-5396]) durch RA induziert, was zeigt, daß die RA-vermittelte Repression spezifisch für den Collagenase-Promotor ist (Fig. 7, Balken 5).
    • Beispiel 1:
  • Die AP-1-Stelle im Collagenase-Promotor ist für die RA- vermittelte Repression erforderlich
  • In diesem Beispiel wurden diejenigen DNA-Sequenzen im Collagenase- Promotor (d. h. einen auf AP-1-ansprechenden Promotor), die die Repression durch RA vermitteln, untersucht. So wurden verschiedene Collagenase- CAT-Reporterplasmide zusammen mit RARα-Expressionsvektoren in HeLa-Zellen cotransfiziert, die in 10 % Serum in Abwesenheit (Fig. 8, schwarze Balken) oder Gegenwart von RA (Fig. 8, gestreifte Balken) kultiviert wurden.
  • Fig. 8 (Balken 1-3) zeigt, daß die Zugabe von RA zu HeLa-Zellen zu einer etwa 6-fachen Repression sowohl von 1200 Col-CAT- als auch 73 Col- CAT-Reporteraktivität führte, während die Aktivität des Reporterplasmids 63 Col-CAT unverändert blieb.
  • Diese Ergebnisse zeigen, daß die Repression durch DNA-Sequenzen vermittelt wird, die sich zwischen Position -73 und -63 im Collagenase-Promotor befinden. RAR kann also ähnlich wie GR die Induktion eines auf AP-1 ansprechenden Promotors hemmen.
  • Um die Fähigkeit von RAR weiter zu untersuchen, die Induktion eines auf AP-1 ansprechenden Promotors zu hemmen, wurde das durch AP-1 induzierbare Reporterkonstrukt (AP-1)&sub5;-TKCAT in HeLa-Zellen transfiziert. Die hohe Basisaktivität dieses Promotors wird ebenfalls in Gegenwart von RA und RARα (Fig. 8, Balken 4) reprimiert, während die Expression des TK- Kontrollpromotors durch RA nicht beeinflußt wird (Fig. 8, Balken 5). Wie möglicherweise zu erwarten war, wurde der auf RA ansprechende Reporter βRE-TKCAT in einer hormonabhängigen Weise aktiviert (Fig. 8, Balken 6).
  • Die in Fig. 8 vorgelegten Daten zeigen, daß die Repression des Collagenase-Promotors oder des heterologen Reporters durch RA vom Vorhandensein der AP-1-Stelle abhängt.
    • Beispiel 8:
  • Die RAR-DNA-bindende Domäne und eine Region nahe dem C- Terminus sind erforderlich, jedoch nicht ausreichend für die Repression von Jun/AP-1-Aktivität
  • Die vorstehenden Experimente zeigen, daß die Jun-AP-1-Aktivierung wirksam durch RARα in einer hormonabhängigen Weise reprimiert werden kann. Um Regionen des Rezeptors zu definieren, die an der Repression beteiligt sind, wurden mehrere RAR-Mutanten in Cotransfektionsstudien in CV-1-Zellen auf ihre Fähigkeit, (AP-1)&sub5;-TKCAT-Reporteraktivität zu reprimieren, untersucht. In Fig. 9 bezeichnet der Maßstab oberhalb der einzelnen Rezeptoren Aminosäurezahlen. Der Wildtyp-RARα besteht aus dem N-Terminus (Aminosäuren 1-80), der DNA-bindenden Domäne (Aminosäuren 81-153) und der Liganden-bindenden Domäne (Aminosäuren 154-462). Die deletierten Aminosäuren sind auf der linken Seite angegeben. Die RA-abhängige Repression von 1200 Col-CAT-Reporteraktivität, die durch Cotransfektion mit 0,1 µg RARα-Expressionsplasmiden erzielt wurde, wurde zu 100 % gesetzt.
  • Die Deletion des gesamten N-Terminus des RAR beeinträchtigte nicht die Fähigkeit des Rezeptors, die CAT-Aktivität zu reprimieren (Fig. 9, vgl. Balken 1 mit Balken 2). Die Deletion der DNA-bindenden Domäne führte jedoch in einem vollständigen Verlust der Repression (Fig. 9, Balken 3).
  • Die weitere Analyse zeigte, daß eine Mutante, in der die RARα-DNA- bindende Domäne gegen die von GR ausgetauscht worden war (RGR), noch zur vollständigen Repression imstande war (Fig. 9, Balken 4). Diese Ergebnisse zeigen, daß eine Steroidrezeptor-DNA-bindende Domäne für eine wirksame Repression erforderlich ist. Die Zielgenspezifität der DNA-bindenden Domäne ist jedoch relativ unwichtig.
  • Weitere Analysen zeigten, daß beide C-terminal verkürzten Mutanten 403* und 203* ihre Fähigkeit zur Repression vollständig verloren hatten (Fig. 9, Balken 5 und 6). Als weiteres Mittel, um die Bedeutung der Liganden-bindenden Domäne des Rezeptors zu zeigen, wurde der C-Terminus von RAR gegen den des Oncogens v-erbA ausgetauscht. Die erhaltene Mutante RRerbA reprimierte ebenfalls nicht (Fig. 9, Balken 7).
    • Beispiel 9:
  • RAR stört die AP-1-Bindungsaktivität
  • Um mögliche physikalische Wechselwirkungen zwischen RAR und AP-1 zu untersuchen, wurden Gelretardationsassays durchgeführt. Bakteriell exprimierter RARα war nicht imstande, einen retardierten Komplex mit einem ³²P-markierten Oligonucleotid zu bilden, das die Collagenase-AP-1-Stelle enthielt (Fig. 10, Spur 2), was zeigt, daß RAR die Collagenase-Expression nicht durch direkte Bindung an diese Sequenz hemmt. Im Gegensatz dazu bildete in vitro translatiertes c-Jun einen spezifischen retardierten Komplex (Fig. 10, Spur 3). Die Zugabe von steigenden Mengen an bakteriell exprimiertem RARα verringerte stark die Menge an Komplex, die in dosisabhängiger Weise gebildet wurde (Fig. 10, Spuren 4-7), während BL21-Lysat von zur Kontrolle transformierten Bakterien die Bindung von c-Jun an DNA nicht beeinträchtigte (Fig. 10, Spuren 8-11).
  • Bakteriell exprimierter RARα hemmte auch die AP-1-DNA-Bindung, wenn HeLa-Zellextrakt als AP-1-Quelle verwendet wurden (Fig. 11, vgl. Spur 1 mit Spuren 2-4). Die Zugabe von BL21-Lysat von zur Kontrolle transformierten Bakterien beeinträchtigte die Komplexbildung nicht (Fig. 11, Spuren 5-8). Als Kontrolle wurden Gelretardationsassays unter Verwendung von NF-1-Aktivität, die in HeLa-Zellextrakten vorhanden ist, und eines Oligonucleotids, das eine NF-1-Bindungsstelle enthielt, durchgeführt. Die Zugabe an steigenden Mengen an bakteriell exprimiertem RARα hatte keinen Einfluß auf die NF-1-Bindungsaktivität, was die Spezifität der hemmenden Wirkung von RARα auf die AP-1-DNA-Bindung zeigt.

Claims (24)

1. Verfahren zur Identifizierung einer/mehrerer Verbindung(en), die sich für die Behandlung anormaler Zellen eignet/eignen, wobei das Verfahren die Auswahl einer Verbindung umfaßt, die die beiden folgenden Eigenschaften zeigt:
(a) die Fähigkeit, die Funktion von AP-1 zu unterbrechen, wenn die Verbindung in einem ersten Assaysystem eingesetzt wird, das eine Zellinie umfaßt, die imstande ist,
(i) einen Rezeptor für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon- ähnliche Verbindung,
(ii) AP-1 und
(iii) einen auf AP-1 ansprechenden Reporter zu exprimieren; und
(b) im wesentlichen keine Fähigkeit zur Förderung der transkriptionalen Aktivierung von auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Genen, wenn die Verbindung in einem zweiten Assaysystem eingesetzt wird, das eine Zellinie umfaßt, die imstande ist,
(i) einen Rezeptor für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon- ähnliche Verbindung und
(ii) einen auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Reporter zu exprimieren.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung zur Bildung eines ersten Komplexes mit einem Rezeptor für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon-ähnliche Verbindung imstande ist; wobei der erste Komplex in Gegenwart von AP-1 imstande ist, die Funktion von AP-1 zu unterbrechen; und wobei der erste Komplex im wesentlichen nicht imstande ist, die transkriptionale Aktivierung von auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Genen zu fördern.
3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Rezeptor unter Glucocorticoid-Rezeptor(en), Retinsäure-Rezeptor(en), Vitamin D&sub3;-Rezeptor(en), Thyroid-Rezeptor(en), Mineralcorticoid-Rezeptor(en), Östrogen-Rezeptor(en), Rezeptor(en) für Östrogen-verwandte Verbindungen, Retinoid-Rezeptor(en), Androgen-Rezeptor(en) oder Progesteron-Rezeptor(en) ausgewählt ist.
4. Verfahren zur Identifizierung einer Verbindung/mehrerer Verbindungen, die den AP-1-Reaktionsweg unterbrechen, die jedoch im wesentlichen keine Wirkung auf Steroidhormon- oder Steroidhormon-ähnliche Reaktionswege ausüben, wobei das Verfahren folgende Stufen umfaßt:
(a) Test der Verbindung in einem ersten Assaysystem, um die Wirkung der Verbindung auf den AP-1-Reaktionsweg zu bestimmen; wobei das erste Assaysystem eine Zellinie umfaßt, die imstande ist,
(i) einen Rezeptor für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon- ähnliche Verbindung,
(ii) AP-1 und
(iii) einen auf AP-1 ansprechenden Reporter zu exprimieren; und
(b) Test der Verbindung in einem zweiten Assaysystem, um die Wirkung der Verbindung auf die transkriptionale Aktivierung von auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Genen zu bestimmen; wobei das zweite Assaysystem eine Zellinie umfaßt, die imstande ist,
(i) einen Rezeptor für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon- ähnliche Verbindung und
(ii) einen auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Reporter zu exprimieren; und
anschließend Auswahl derjenigen Verbindungen, die eine hemmende Wirkung beim Test von Teil (a) und im wesentlichen keine Wirkung beim Test von Teil (b) haben.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Rezeptor unter Glucocorticoid-Rezeptor(en), Retinsäure-Rezeptor(en), Vitamin D&sub3;-Rezeptor(en), Thyroid-Rezeptor(en), Mineralcorticoid-Rezeptor(en), Östrogen-Rezeptor(en), Rezeptor(en) für Östrogen-verwandte Verbindungen, Retinoid-Rezeptor(en), Androgen-Rezeptor(en) oder Progesteron-Rezeptor(en) ausgewählt ist.
6. In vitro durchgeführtes Verfahren, um in einem Expressionssystem die Transkriptionsaktivierung eines auf Steroidhormone ansprechenden oder auf Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Gens/von auf Steroidhormone ansprechenden oder auf Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Genen durch Steroidhormone oder eine Steroidhormon-ähnliche Verbindung/Steroidhormon-ähnliche Verbindungen zu reprimieren, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
das System wird einer Verbindung/mehreren Verbindungen und/oder einer Bedingung/mehreren Bedingungen ausgesetzt, die die AP-1-Expression induzieren und wirksam hinsichtlich der Repression der Expression des auf Steroidhormone ansprechenden oder auf Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Gens/der auf Steroidhormone ansprechenden oder auf Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Gene sind.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechende Gene auf Glucocorticoid ansprechend, auf Retinsäure ansprechend, auf Vitamin D&sub3; ansprechend, auf Thyroidhormon ansprechend, auf Mineralcorticoid ansprechend, auf Östrogen ansprechend, auf Östrogen-verwandte Hormone ansprechend, auf Androgen ansprechend, auf Progesteron ansprechend oder auf Retinoid ansprechend ist.
8. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechende Gene auf Glucocorticoid ansprechend, auf Thyroidhormon ansprechend, auf Mineralcorticoid ansprechend, auf Östrogen ansprechend, auf Östrogen-verwandte Hormone ansprechend, auf Androgen ansprechend, auf Progesteron ansprechend oder auf Retinoid ansprechend ist.
9. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Verbindung(en) und/oder die Bedingung(en), die die Expression von AP-1 induzieren, unter Verbindungen, die die Tumorbildung induzieren, Wachstumsfaktoren, Cytokinen, Neuropeptiden, Neurotransmittern, Proteinkinase c oder Verbindungen, die zur Induktion von Proteinkinase c imstande sind; oder Bedingungen von ultravioletter Strahlung, Gammastrahlung, Streß oder Wärmeschock ausgewählt sind.
10. Verwendung einer Verbindung, wie sie durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5 identifiziert wird, zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels gegen die Überexpression eines auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Gens/mehrerer auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechender Gene.
11. In vitro durchgeführtes Verfahren, um in einem Expressionssystem die Transkriptionsaktivierung eines auf Steroidhormone ansprechenden oder auf Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Gens/von auf Steroidhormone ansprechenden oder auf Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Genen durch eine Steroidhormon- oder Steroidhormon-ähnliche Verbindung/Steroidhormon- oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen oder Analoga davon zu reprimieren, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
dem System wird ein Peptid zugeführt, das die Leucin-Reißverschluß- Region von c-Jun oder ein funktionelles Analogon davon umfaßt, und zwar in einer Menge, die wirksam hinsichtlich der Repression der Expression des auf Steroidhormone ansprechenden oder auf Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Gens/der auf Steroidhormone oder Steroidhormon- ähnliche Verbindungen ansprechenden Gene ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei das molare Verhältnis von Leucin-Reißverschluß-Region von c-Jun zu Steroidhormon-Rezeptor oder Rezeptor für Steroidhormon-ähnliche Verbindungen oder Analoga davon im Bereich von etwa 0,5 bis zu 100:1 liegt.
13. In vitro durchgeführtes Verfahren, um in einem Expressionssystem die Transkriptionsaktivierung eines auf AP-1 ansprechenden Gens/mehrerer auf AP-1 ansprechender Gene durch AP-1 oder Analoga davon zu reprimieren, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
dem System wird eine Zusammensetzung, die
(i) eine funktionelle Liganden-bindende Domäne eines Rezeptors für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon-ähnliche Verbindung oder ein Analogon davon und
(ii) eine funktionelle DNA-bindende Domäne eines Rezeptors für ein Steroid oder eine Steroid-ähnliche Verbindung oder ein Analogon davon umfaßt,
zugeführt, und zwar in einer Menge, die wirksam hinsichtlich der Repression der Expression des auf AP-1 ansprechenden Gens/der auf AP-1 ansprechenden Gene ist.
14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das auf AP-1 ansprechende Gen/die auf AP-1 ansprechenden Gene unter Collagenase-Gen, c-Jun-Gen, c- Fos-Gen, Immunantwortgenen (z.B. T-Zellrezeptor-Gen, IL-1-Gen, IL-2-Gen und IL-2-Rezeptor-Gen) oder Retinsäure-Rezeptor-alpha-Gen ausgewählt sind.
15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zusammensetzung
(i) eine funktionelle Liganden-bindende Domäne eines Rezeptors für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon-ähnliche Verbindung oder ein Analogon davon und
(ii) eine funktionelle DNA-bindende Domäne eines Rezeptors für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon-ähnliche Verbindung oder ein Analogon davon umfaßt,
ausgewählt unter Glucocorticoid-Rezeptor(en), Retinsäure-Rezeptor(en), Vitamin D&sub3;-Rezeptor(en), Thyroid-Rezeptor(en), Mineralcorticoid- Rezeptor(en), Östrogen-Rezeptor(en), Rezeptor(en) für Östrogen-verwandte Verbindungen, Retinoid-Rezeptor(en), Androgen-Rezeptor(en) oder Progesteron-Rezeptor(en).
16. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zusammensetzung
(i) eine funktionelle Liganden-bindende Domäne eines Rezeptors für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon-ähnliche Verbindung oder ein Analogon davon und
(ii) eine funktionelle DNA-bindende Domäne eines Rezeptors für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon-ähnliche Verbindung oder ein Analogon davon umfaßt,
ausgewählt unter Glucocorticoid-Rezeptor(en), Thyroid-Rezeptor(en), Mineralcorticoid-Rezeptor(en), Östrogen-Rezeptor(en), Rezeptor(en) für Östrogen-verwandte Verbindungen, Retinoid-Rezeptor(en), Androgen-Rezeptor(en) oder Progesteron-Rezeptor(en).
17. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das molare Verhältnis der Zusammensetzung zu AP-1 im Bereich von etwa 0,5 bis zu 100:1 liegt.
18. Verwendung einer Zusammensetzung, die
(i) eine funktionelle Liganden-bindende Domäne eines Rezeptors für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon-ähnliche Verbindung oder ein Analogon davon und
(ii) eine funktionelle DNA-bindende Domäne eines Rezeptors für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon-ähnliche Verbindung oder ein Analogon davon umfaßt,
zur Herstellung eines pharmazeutischen Mittels, das wirksam bei der Repression der Expression von auf AP-1 ansprechenden Genen ist.
19. In vitro durchgeführtes Verfahren, um in Gegenwart eines Steroidhormons/mehrerer Steroidhormone oder einer Steroidhormon-ähnlichen Verbindung/mehrerer Steroidhormon-ähnlicher Verbindungen oder eines Analogons/mehrerer Analoga davon die Repression der Expression des Genprodukts/der Genprodukte von Genen zu überwinden, die einer negativen Regulation durch Rezeptoren für Steroidhormone, Steroidhormon-ähnliche Verbindungen oder Analoga davon unterliegen, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
das System wird einer Verbindung/mehreren Verbindungen und/oder einer Bedingung/mehreren Bedingungen ausgesetzt, die die AP-1-Expression induzieren, und zwar in einer Menge, die wirksam hinsichtlich der Suppression der Repression der Expression des Genprodukts/der Genprodukte ist.
20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Gen, das einer negativen Regulation in Gegenwart eines Steroidhormons, einer Steroidhormon-ähnlichen Verbindung und eines Analogons davon unterliegt, unter dem Pro-Opiomelanocortin-Gen, dem Prolactin-Gen, dem Proliferin-Gen, dem chorionischen Gonadotropin-α-Untereinheit-Gen, dem Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Gen oder dem Collagenase-Gen ausgewählt ist.
21. In vitro durchgeführtes Verfahren, um die Hemmung der Proliferation und Funktion von Lymphoid-Zellen durch ein Steroidhormon/Steroidhormone, eine Steroidhormon-ähnliche Verbindung/Steroidhormon-ähnliche Verbindungen oder ein Analogon/Analoga davon in Gegenwart eines Rezeptors/mehrerer Rezeptoren für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon-ähnliche Verbindung oder eines Analogons/mehrerer Analoga davon zu überwinden, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
das System wird einer Verbindung/mehreren Verbindungen und/oder einer Bedingung/mehreren Bedingungen ausgesetzt, die die AP-1-Expression induzieren, und zwar wirksam hinsichtlich der Suppression der Hemmung der Proliferation der Lymphoid-Zellen.
22. Verbindung, die einen ersten Komplex mit einem Rezeptor für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon-ähnliche Verbindung bildet; wobei der erste Komplex in Gegenwart von AP-1 die Funktion von AP-1 unterbricht; und wobei der erste Komplex im wesentlichen nicht imstande ist, die transkriptionale Aktivierung von auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Genen zu fördern.
23. Verfahren zur Auswahl einer Verbindung, die sich für die Behandlung anormaler Zellen eignet, wobei das Verfahren die Auswahl einer Verbindung umfaßt, die die Funktion von AP-1 unterbricht, wenn die Verbindung in einem Assaysystem eingesetzt wird, das eine Zellinie umfaßt, die imstande ist,
(i) einen Rezeptor für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon- ähnliche Verbindung,
(ii) AP-1 und
(iii) einen auf AP-1 ansprechenden Reporter zu exprimieren.
24. Verfahren zur Auswahl einer Verbindung, die sich für die Behandlung anormaler Zellen eignet, wobei das Verfahren die Auswahl einer Verbindung umfaßt, die die Funktion von AP-1 unterbricht, die jedoch im wesentlichen keinen Einfluß auf die transkriptionale Aktivierung von auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Genen hat, wenn die Verbindung in einem Assaysystem eingesetzt wird, das eine Zellinie umfaßt, die imstande ist,
(i) einen Rezeptor für ein Steroidhormon oder eine Steroidhormon- ähnliche Verbindung und
(ii) einen auf Steroidhormone oder Steroidhormon-ähnliche Verbindungen ansprechenden Reporter zu exprimieren.
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