JP4309051B2 - 改善したリンカーを有するポリジンクフィンガータンパク質 - Google Patents
改善したリンカーを有するポリジンクフィンガータンパク質 Download PDFInfo
- Publication number
- JP4309051B2 JP4309051B2 JP2000534663A JP2000534663A JP4309051B2 JP 4309051 B2 JP4309051 B2 JP 4309051B2 JP 2000534663 A JP2000534663 A JP 2000534663A JP 2000534663 A JP2000534663 A JP 2000534663A JP 4309051 B2 JP4309051 B2 JP 4309051B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- zinc finger
- protein
- site
- domain
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Description
(関連出願の相互参照)
本出願は、USSN 60/076,454(1998年、3月2日出願、本明細書中においてその全体が参考として援用される)からの優先権を主張する。
【0002】
(連邦政府に援助された研究および開発の下でなされた発明に関する陳述)
本明細書中に記載された研究は、それぞれ、国立衛生研究所、国立科学基金および国立癌研究所からの助成金PO1−CA42063、CDR−8803014およびP30−CA14051によって援助された。米国政府は、本発明に特定の権利を有する。本明細書中に記載される研究はまた、ハワードヒューズ医療研究所により援助された。
【0003】
(発明の背景)
Cys2−His2ファミリーに属するジンクフィンガーは、真核生物に見出される最も一般的なDNA結合モチーフのうちの1つを構成し、そしてこれらのジンクフィンガーは、新規な配列特異性を有するDNA結合タンパク質の設計および選択について非常に魅力的な枠組みを提供した。多数の研究は、ジンクフィンガー−DNA相互作用の特異性を探索し、そして系統的に変更するためにファージディスプレイ法または設計アイデアを使用した(DesjarlaisおよびBerg、Proteins Struct.Funct.Genet.12:101〜104(1992);DesjarlaisおよびBerg、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2256〜2260(1993);RebarおよびPabo、Science 263:671〜673(1994);Jamiesonら、Biochemistry 33:5689〜5695(1994);ChooおよびKlug、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:11163〜11167(1994);Wuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:344〜348(1995);ならびにGreismanおよびPabo、Science 275:657〜661(1997))。
【0004】
構造に基づくコンピュータ設計を使用し、Cys2−His2ジンクフィンガーと他のDNA結合ドメイン(他のジンクフィンガータンパク質を含む)とを連結し、伸長した部位を認識するハイブリッドタンパク質を生成した(Pomerantzら、Science 267:93〜96(1995);Kimら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3616〜3620(1997))。例えば、ジンクフィンガータンパク質をGAL4二量体化ドメインに連結し、新規なホモ二量体およびヘテロ二量体を開発しており(Pomerantzら、Biochemistry 4:965〜970(1997))、そしてヌクレアーゼドメインに連結し、新規な制限酵素を生成している(Kimら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1156〜1160(1996))。ジンクフィンガー/ホメオドメイン融合は、遺伝子治療における潜在的な適用について試験されている(Riveraら、Nature Med.2:1028〜1032(1996))。
【0005】
3つのフィンガータンパク質にさらなるフィンガーを加えることによって(Rebar、(Ph.D.Thesis)、Selection Studies of Zinc Finger−NA Recognition、Massachusetts Institute of Technology(1997);Shi,Y.(Ph.D.Thesis)Molecular Mechanisms of Zinc Finger Protein−Nucleic Acid Interactions、Johns Hopkins University(1995))、または3つのフィンガーのタンパク質を2個タンデムに連結することによって(Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:5525〜5530(1997))、ジンクフィンガータンパク質のアフィニティーおよび特異性を増大させるいくつかの試みもまた存在する。しかし、ポリフィンガータンパク質についてのこれらの以前の設計戦略は全て、さらなるフィンガーを接続するための規範的な「TGEKP」リンカー(アミノ酸配列トレオニン−グリシン−グルタミン酸−リジン−プロリン(配列番号13)を有するリンカー)を使用し、アフィニティーにおいて比較的に適度な増大を生じた。従って、キメラジンクフィンガータンパク質に対して増強したアフィニティーおよび特異性を提供するリンカーを開発する必要性が存在する。
【0006】
(発明の要旨)
本発明は従って、可撓性リンカーを選択し、そしてアフィニティーおよび特異性の増強したキメラジンクフィンガータンパク質を作製するために、構造に基づく設計を使用する方法を提供する。本発明はまた、アフィニティーおよび特異性の増強したキメラジンクフィンガータンパク質を作製するために、5個以上のアミノ酸長の可撓性リンカーを有するキメラジンクフィンガータンパク質を作製する方法を提供する。これらの方法を使用して作製されたジンクフィンガータンパク質は、フェムトモル濃度の範囲の結合アフィニティーを有し、そして例えば、単一の標的部位で高レベル(約70倍を超える)の転写抑制を提供する。このようなジンクフィンガータンパク質は、遺伝子発現の調節(例えば、治療剤、診断剤として)および研究での適用(例えば、機能性ゲノム学)のために使用され得る。
【0007】
1つの局面において、本発明は、近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を含む:(i)キメラジンクフィンガータンパク質の第1および第2のDNA結合ドメインのポリペプチドを選択する工程、ここでこれらのドメインの少なくとも一方がジンクフィンガーのポリペプチドを含み、そしてここで第1のドメインが第1の標的部位に結合し、そして第2のドメインが第2の標的部位に結合し、ここで標的部位が近接している、工程;(ii)第1および第2のドメインが第1の標的部位および第2の標的部位に個々に結合される場合、第1のドメインと第2のドメインとの間の物理的分離を決定するために、構造に基づく設計を使用する工程;(iii)第1のドメインと第2のドメインとの間の物理的分離よりも少なくとも1〜2Å長い可撓性リンカーを選択する工程;ならびに(iv)第1のドメインおよび第2のドメインと可撓性リンカーとを融合し、それによって近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を作製する工程。
【0008】
別の局面において、本発明は、近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を作製する方法を提供し、この方法は、以下の工程を含む:(i)キメラジンクフィンガータンパク質の第1のDNA結合ドメインのポリペプチドおよび第2のDNA結合ドメインのポリペプチドを選択する工程であって、ここでこれらのドメインの少なくとも一方がジンクフィンガーのポリペプチドを含み、ここで第1のドメインが第1の標的部位に結合し、そして第2のドメインが第2の標的部位に結合し、ここで標的部位が近接している、工程;(ii)5個以上のアミノ酸長である可撓性リンカーを選択する工程;ならびに(iv)第1のドメインおよび第2のドメインと可撓性リンカーとを融合し、それによって近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を作製する工程。
【0009】
別の局面において、本発明は、近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を提供し、このキメラジンクフィンガータンパク質は、以下を含む:(i)キメラジンクフィンガータンパク質の第1のDNA結合ドメインのポリペプチドおよび第2のDNA結合ドメインのポリペプチドであって、ここでこれらのドメインの少なくとも一方がジンクフィンガーのポリペプチドを含み、そしてここで第1のドメインが第1の標的部位に結合し、そして第2のドメインが第2の標的部位に結合し、ここで標的部位が近接している、キメラジンクフィンガータンパク質の第1のDNA結合ドメインのポリペプチドおよび第2のDNA結合ドメインのポリペプチド;ならびに(ii)第1のドメインおよび第2のドメインが第1の標的部位および第2の標的部位に個々に結合される場合に、構造に基づくモデリングにより決定されるように、第1のドメインと第2のドメインとの間の物理的分離よりも少なくとも1〜2Å長い可撓性リンカー;ここで第1のドメインおよび第2のドメインは可撓性リンカーに融合される。
【0010】
別の局面において、本発明は、近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を提供し、ここでキメラジンクフィンガータンパク質は、以下を含む:(i)キメラジンクフィンガータンパク質の第1のDNA結合ドメインのポリペプチドおよび第2のDNA結合ドメインのポリペプチドであって、これらのドメインの少なくとも一方がジンクフィンガーのポリペプチドを含み、そしてここで第1のドメインが第1の標的部位に結合し、そして第2のドメインが第2の標的部位に結合し、ここで標的部位が近接している、キメラジンクフィンガータンパク質の第1のDNA結合ドメインのポリペプチドおよび第2のDNA結合ドメインのポリペプチド;ならびに(ii)5個以上のアミノ酸長である可撓性リンカー;ここで第1のドメインおよび第2のドメインは可撓性リンカーに融合される。
【0011】
1つの実施態様において、本発明は、キメラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸を提供する。
【0012】
1つの実施態様において、第1のドメインおよび第2のドメインは、ジンクフィンガーのポリペプチドである。別の実施態様において、このジンクフィンガーのポリペプチドは、Zif268およびNREからなる群から選択される。別の実施態様において、このジンクフィンガーのポリペプチドは、異種である。1つの実施態様において、第1のドメインは、ジンクフィンガーのポリペプチドであり、そして第2のドメインが異種DNA結合ドメインのポリペプチドを含む。別の実施態様において、このキメラジンクフィンガータンパク質はさらに、調節ドメインのポリペプチドを含む。
【0013】
1つの実施態様において、キメラジンクフィンガータンパク質は、近接した標的部位に対してフェムトモル濃度のアフィニティーを有する。別の実施態様において、このキメラジンクフィンガータンパク質は、近接した標的部位に対して約2〜4フェムトモル濃度のアフィニティーを有する。
【0014】
1つの実施態様において、可撓性リンカーは、5個、8個、または11個のアミノ酸長である。別の実施態様において、この可撓性リンカーは、配列RQKDGERP(配列番号14)またはRQKDGGGSERP(配列番号15)を有する。
【0015】
1つの実施態様において、標的部位は、1個または2個のヌクレオチドにより分離される。
【0016】
1つの実施態様において、近接した標的部位は、0個のヌクレオチドにより分離され、そして可撓性リンカーは、5個または6個のアミノ酸長である。別の実施態様において、近接した標的部位は、1個のヌクレオチドにより分離され、そして可撓性リンカーは、7個、8個、または9個のアミノ酸長である。別の実施態様において、近接した標的部位は、2個のヌクレオチドにより分離され、そして可撓性リンカーは、10個、11個、または12個のアミノ酸長である。別の実施態様において、近接した標的部位は、3個のヌクレオチドにより分離され、そして可撓性リンカーは、12個以上のアミノ酸長である。
【0017】
(発明の詳細な説明)
(I.緒言)
本発明は、キメラジンクフィンガータンパク質の2つのDNA結合ドメインを融合させるリンカーについての設計ストラテジーを提供する。これらのリンカーは、可撓性であり、そして以前に使用された正統なリンカーより長く、いかなる緊張も導入することなく、その標的部位へのキメラジンクフィンガータンパク質の結合を可能にする。その標的部位は、代表的には、「複合性の」標的部位であり、0〜5以上のヌクレオチドによって隔てられる2つの近接した標的部位からなる。各々の近接した標的部位は、キメラジンクフィンガータンパク質の1つのDNA結合ドメインによって認識される。このリンカー設計ストラテジーは、2つのDNA結合ドメインの間のリンカーについての最小の長さを決定するための構造に基づく設計を包含し、次いで、リンカーに対する可撓性のさらなる少なくとも約1〜2オングストロームを提供するために、リンカーにさらなるアミノ酸を付加する。本発明は、従って、それらの標的部位についてフェムトモル濃度のアフィニティーを有する、キメラジンクフィンガータンパク質を提供し、これは、効率よく遺伝子発現を抑制する(例えば、単一の部位に標的化された場合、遺伝子発現は約70分の1より低くなる)。
【0018】
構造的および生化学的分析は、ジンクフィンガーペプチドに結合された場合、DNAがしばしばわずかにほどけていることを示す(PavletichおよびPabo、Science 252:809−817(199l);ShiおよびBerg、Biochemistry 35:3845−3848(1996);NekludovaおよびPabo、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:6948−6952(1994))。モデリング研究は、理想的なB DNA上では正統なリンカーは、Zif268の好ましいドッキングを可能にするにはやや短すぎること(Elrod−Ericksonら、Structure 4:1171−1180(1996));DNAは、Zif268複合体中で見られる様式においてジンクフィンガーと相互作用するためにわずかにほどけていなくてはならないことを示した。本質的には、ジンクフィンガーのらせんの周期性は、B−DNAのらせんの周期性とは完全には一致しないようである。より多くフィンガーが存在する(ペプチドおよびDNAのらせんの周期性が、段階的にさらに相からはずれ得る)場合、ほどけた緊張はより重要な問題となり得るので、より長い、より可撓性のリンカーが、ポリフィンガータンパク質の設計において試験された(KimおよびPabo、Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.95:2812−2817(1998)を参照のこと、これは、その全体が本明細書中で参考として援用される)。
【0019】
本発明は、5アミノ酸以上のリンカーが、増強されたアフィニティーを有するキメラジンクフィンガータンパク質を作製するために使用され得ることを実証する。例えば、8アミノ酸のリンカーは、1つの塩基対によって隔てられている近接した標的部位を認識するキメラジンクフィンガータンパク質のために使用された。11アミノ酸のリンカーは、2つの塩基対によって隔てられている近接した標的部位を認識するキメラジンクフィンガータンパク質のために使用された。本発明のリンカーはまた、構造に基づくモデリングを用いて設計され得る。構造に基づくモデリングにおいては、各々のDNA結合ドメインポリペプチドの、そのDNA標的部位への結合を示すモデルが作製される。次いで、そのモデルは、ドメインが近接した標的部位に結合する場合に、そのドメインの物理的分離を決定するために使用される。ドメイン間の物理的分離は、リンカーまたはDNA結合ドメインに対する立体障害なしで、第1のドメインのC−末端アミノ酸を第2のドメインのN−末端アミノ酸と接続するために使用されるリンカーの最小限の長さを決定するために使用される。次いで、キメラジンクフィンガーに緊張を導入することを避ける、わずかに長い可撓性リンカーを作製するために、この長さは1〜2Å増加される。
【0020】
コンピュータープログラムが、しばしば構造に基づくモデリングのために使用されるが、このモデルはまた、物理的にも作製され得る。構造に基づくモデリングのために使用されるコンピュータープログラムの例は、Insight lI (Biosym Technologies, SanDiego)およびQuanta 4.0 (Molecular Simulations(Burlington,MA)を含む。これらのプログラムは、タンパク質についての適切な座標を提供する、DNA結合タンパク質のX線結晶解析由来の情報をしばしば使用する。この情報はまた、公的に利用可能なデータベース(例えば、Brookhaven Protein Data Bank)から得られ得る。この情報はまた、その結晶構造が未知であるDNA結合タンパク質についての距離および座標を外挿するために使用され得る。B DNAのモデルは、当該分野で周知である。関係のある座標(例えば、距離およびサイズ)は、製造者の指示書およびデフォルトのパラメーターを用いて、えり抜きのコンピューターモデリングプログラムとともに使用される。あるいは、カスタマイズされたパラメーターが使用され得る。構造に基づくモデリングは、例えば、KimおよびPabo、Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.95:2812−2817(1998);PavletichおよびPabo、Science 252:809−817(1991);Rebar、博士論文(Massachusetts Institute of Technology,Cambridge MA)(1997);Liuら、Proc.Nat’I.Acad.Sci.U.S.A.94:5525−5530(1997);Pomerantzら、Science 267:93−96(1995);Pomerantzら、Proc.Nat’l.Acad.Sci.U.S.A.92:9752−9756(1995);Liら、Nature Biotechnology 16:190−195(1998);Kimら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3616−3620(1997);ならびにPomerantzら、Biochemistry 4:965−970(1997)において記載されるように行われ得、これらは、本明細書中でそれらの全体が参考として援用される。2つの基本的な規準が、DNA結合ドメインのどのアラインメントがDNAを結合するキメラタンパク質における組み合わせのために潜在能力を有するかを示唆する:(1)ドメイン間の衝突の欠如、および(2)ドメインのカルボキシル末端領域およびアミノ末端領域の矛盾しない位置付け、すなわちドメインが方向付けられて、その結果1つのポリペプチドのカルボキシル末端領域が次のポリペプチドのアミノ末端領域に結合され得る。
【0021】
2つのDNA結合ドメインを連結するために使用されるリンカーは、DNA結合ドメインのそれらの各々の標的部位との相互作用を実質的に妨害しない任意のアミノ酸配列を含み得る。本発明のリンカーのための好ましいアミノ酸残基は、グリシン、アラニン、ロイシン、セリン、バリン、およびスレオニンを含むがこれらに限定されない。一旦アミノ酸配列の長さが選択されたならば、リンカーの配列は、例えば、ファージディスプレイライブラリー技術(例えば、米国特許第5,260,203号を参照のこと)によって、または、スカフォールド(例えば、GTGQKP(配列番号19)およびGEKP(配列番号20)、Liuら、Proc.Nat’l Acad.Sci.U.S.A.94:5525−5530(1997)を参照のこと;Whitlowら、Methods: A Companion to Methods in Enzymology 2:97−105(1991)もまた参照のこと)のような天然に存在するかもしくは合成のリンカー配列を使用することによって選択され得る。代表的には、本発明のリンカーは、リンカーアミノ酸配列を介して融合された、リンカーおよびDNA結合ドメインをコードする組換え核酸を作製することによって作製される。必要に応じて、リンカーはまた、ペプチド合成を用いて作製され得、次いで、ポリペプチドDNA結合ドメインに結合する。
【0022】
本発明のキメラジンクフィンガータンパク質は、2つ以上のDNA結合ドメインからなり、ここで少なくとも1つのDNA結合ドメインが、ジンクフィンガーポリペプチドである。第2のDNA結合ドメインは、同一のドメインか、または異種のドメインのいずれかであるジンクフィンガー結合ドメインであり得る。適切なジンクフィンガータンパク質は、Cys2−His2ファミリー、例えば、SP−1、SP−1C、ZIF268、NRE、Tramtrack、GLI、YYl、またはTFIIIA由来の任意のタンパク質を含む(例えば、Jacobs、EMBO.J.11:4507(1992);DesjarlaisおよびBerg、PNAS 90:2256−2260(1993);Christyら、PNAS 85:7857−7861(l988);GreismanおよびPabo、Science 275:657−661(1997);Fairallら、Nature 366:483(1993);Paveltichら、Science 261:1701(1993)を参照のこと)。
【0023】
第2のDNA結合ドメインはまた、例えば、制限酵素;核ホルモンレセプター;ホメオドメインタンパク質またはヘリックスターンヘリックスモチーフタンパク質(例えば、MAT 1、MAT 2、MAT a1、Antennapedia、Ultrabithorax、Engrailed、Paired、Fushi tarazu、HOX、Unc86、Oct1、Oct2、Pit、λリプレッサー、およびtetリプレッサー);Gal 4;TATA結合タンパク質;ヘリックスループヘリックスモチーフタンパク質(例えば、myc、myo D、Daughterless、Achaete−scute(T3)、El2およびE47);ロイシンジッパー型タンパク質(例えば、GCN4、C/EBP、c−Fos/c−JunおよびJunB);ならびにβシートモチーフタンパク質(例えば、met、arc、およびmntリプレッサー)に由来する異種DNA結合ドメインであり得る。別の実施態様において、ジンクフィンガータンパク質は、以下に記載のように、少なくとも1つ以上の調節ドメインに結合される。好ましい調節ドメインは、転写因子リプレッサードメインまたは転写因子アクチベータードメイン(例えば、KRABおよびVP16、コリプレッサードメインおよびコアクチベータードメイン、DNAメチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、およびFok1のようなエンドヌクレアーゼ)を含む。DNA結合ドメインのアミノ酸配列は、天然に存在してもよく、または天然に存在しなくてもよい(または改変されていてもよい)。
【0024】
キメラジンクフィンガータンパク質の発現はまた、tet調節系およびRU−486系によって代表される系によって制御され得る(例えば、GossenおよびBujard、PNAS 89:5547(1992);Oliginoら、Gene Ther.5:49l−496(l998); Wangら、Gene Ther.4:432−441(1997);Neeringら、Blood 88:1147−1155(1996);およびRendahlら、Nat.Biotechnol.16:757−761(l998)を参照のこと)。これらは、キメラジンクフィンガータンパク質の発現における低分子制御に影響し、従って、目的の標的遺伝子における低分子制御に影響する。この利点となる特徴は、細胞培養モデルにおいて、遺伝子治療において、そしてトランスジェニック動物および植物において使用され得る。
【0025】
キメラDNA結合タンパク質の結合特異性は、これらのタンパク質を特に有用にする。なぜなら、これらのタンパク質は、公知のタンパク質の特性と異なったDNA結合特性を有するからである。このキメラタンパク質は、近接した標的部位を結合することを好み、従って、近接した標的部位を有する遺伝子の発現を調節するために使用され得る。これらのキメラジンクフィンガータンパク質は、フェムトモル濃度範囲、例えば、100フェムトモル、10フェムトモル以下で、いくつかの場合には2〜4フェムトモルまで低く、およびいくつかの場合には1フェムトモル濃度以下で、近接した標的部位に対してアフィニティーを有する。
【0026】
本発明の方法を使用して作製されるジンクフィンガータンパク質は、治療的、診断的、ならびに細胞または動物モデル、および機能的遺伝学におけるような研究的適用を含む、多数の適用を有する。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、遺伝子発現を調節するために使用され得、これは新規のヒトおよび哺乳動物の治療的適用(例えば、遺伝疾患、癌、真菌感染、原生動物感染、細菌感染、およびウイルス感染、虚血、血管疾患、関節炎、免疫障害などの処置)を可能にし、ならびに改変された表現型(疾患耐性、果実成熟、糖および脂質組成、収量、ならびに色を含む)を有する植物を発生させる手段を提供する。さらに、本発明のジンクフィンガータンパク質は、診断アッセイのために、そして機能的遺伝学アッセイのために使用され得る。
【0027】
本明細書中に記載されるように、ジンクフィンガータンパク質は、本明細書中に記載される使用(例えば、真核細胞遺伝子および原核細胞遺伝子、細胞遺伝子、ウイルス遺伝子、原生動物遺伝子、真菌遺伝子、ならびに細菌遺伝子)のいずれかのために、任意の適切な標的部位を認識するように設計され得る。一般的に、調節される適切な遺伝子は、サイトカイン、リンホカイン、成長因子、分裂促進因子、走化因子、癌活性化因子、レセプター、カリウムチャネル、Gタンパク質、シグナル伝達分子、および他の疾患関連遺伝子を含む。
【0028】
転写因子機能における一般的なテーマは、プロモーターへの単純な結合および十分な近接さが、一般的に必要とされているすべてであるということである。プロモーターに対する正確な位置付け、方向、および限度内での距離は、大した問題ではない。この特徴は、ジンクフィンガータンパク質を構築するための部位の選択における顕著な可撓性を可能にする。従って、ジンクフィンガータンパク質によって認識される標的部位は、標的遺伝子中の任意の適切な部位であり得、この標的遺伝子は、ジンクフィンガータンパク質(必要に応じて調節ドメインに連結されている)による遺伝子発現の活性化または抑制を可能にする。
【0029】
好ましい標的部位は、転写開始部位に近接するか、その下流にあるか、またはその上流にある領域を含む。さらに、標的部位は、エンハンサー領域、リプレッサー部位、RNAポリメラーゼ停止部位、および特異的調節部位(例えば、SP−1部位、低酸素症応答エレメント、核レセプター認識エレメント、p53結合部位)、cDNAコード領域中または発現配列タグ(EST)コード領域中の部位に位置する。以下に記載されるように、代表的には、各々のフィンガーは2〜4塩基対を認識し、2フィンガーのジンクフィンガータンパク質は4〜7塩基対の標的部位に結合し、3フィンガーのジンクフィンガータンパク質は6〜10塩基対部位に結合し、そして6フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、2つの近接した標的部位(各々の標的部位は6〜10塩基対を有する)に結合する。
【0030】
本発明のキメラジンクフィンガータンパク質を、単純なアッセイを使用してインビボで活性について試験し得る(Current Protocols in Molecular Biology(Ausubelら、編、1994))。インビボアッセイは、キメラジンクフィンガータンパク質をコードするプラスミドを使用し、これは、キメラジンクフィンガータンパク質の標的部位を有する試験遺伝子、例えばルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)遺伝子、またはヒト成長ホルモン(hGH)遺伝子を含むレポータープラスミドとともに同時発現される。これらの2つのプラスミドが、宿主細胞に一緒に導入される。細胞の第2の群は、コントロール群として働き、そして転写因子をコードするプラスミドおよび転写因子の結合部位を有さないレポーター遺伝子を含むプラスミドを受け取る。
【0031】
レポーター遺伝子転写物の産生または関係するタンパク質の活性の量が測定される;レポーター遺伝子からのmRNA合成、または関係するタンパク質の活性の量がコントロール遺伝子のそれよりも大きかった場合、転写因子は転写の正のレギュレーターである。レポーター遺伝子mRNA合成、または関係するタンパク質の活性の量がコントロールのそれよりも小さかった場合、転写因子は転写の負のレギュレーターである。
【0032】
必要に応じて、アッセイはトランスフェクション効率制御プラスミドを含み得る。このプラスミドは、レポーター遺伝子と独立した遺伝子産物を発現し、そしてこの遺伝子産物の量は、細胞が取り込んでいるプラスミドの数、および細胞に導入されたDNAの効率を大ざっぱに示す。キメラジンクフィンガータンパク質はまた、当業者に公知の方法を用いて、インビボで内在性の遺伝子の調節のために試験され得る。
【0033】
1つの実施態様において、本発明は、3フィンガーのZif268ペプチドが、核ホルモン応答性エレメントを特異的に認識する(GreismanおよびPabo、Science 275:657(1997))、設計された3フィンガーのペプチド(「NRE」と呼ばれる)に連結された融合物を提供する。ゲルシフトアッセイは、この6フィンガーのペプチド268//NREが、フェムトモル濃度範囲の解離定数で複合性の18塩基対DNA部位に結合することを示す。この融合タンパク質において使用されるわずかに長いリンカーは、DNA結合アフィニティーにおいて劇的な改善を提供し、以前の研究で使用されてきた正統な「TGEKP」リンカー(配列番号13)よりもずっと良好に働く。組織培養トランスフェクション実験はまた、268//NREペプチドが、転写開始部位に密接する結合部位に標的化される場合に、72倍の抑制をもたらす非常に効果的なリプレッサーであることを示す。このストラテジーを使用することおよびファージディスプレイを介して選択されるペプチドを連結することは、生物学的適用および遺伝子治療における使用のための、尋常でないアフィニティーおよび特異性を有する新規なDNA結合タンパク質の設計を可能にする。
【0034】
新しい6フィンガーペプチドは、3フィンガーモジュールの2つを結合させるため、または3フィンガータンパク質にさらなるフィンガーを添加するために、従来の「TGEKP」リンカー(配列番号13)を使用する、以前に報告されたポリフィンガータンパク質よりもはるかにより強固に結合する。正統なリンカーを有するポリフィンガータンパク質は、Rebar(Rebar(博士論文)、Selection Studies of Zinc Finger−DNA Recognition,Massachusetts Institute of Technology(1997))、Shi(Shi(博士論文)、Molecular Mechanisms of Zinc Finger Protein−Nucleic Acid Interactions,Johns Hopkins University(1995))、およびLiuら(Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:5525−5530 (l997))によって試験された。各々の研究は、(適切な伸長部位における)新しいポリフィンガータンパク質の結合を、もともとの3フィンガーペプチドの結合と比較した。正統なリンカーを使用した場合、4フィンガーペプチドは、対応する3フィンガーペプチドよりも6.3倍強固に結合し(Rebar(博士論文)Selection Studies of Zinc Finger−DNA Recognition, Massachusetts Institute of Technology(1997))、5フィンガー構築物は、もともとの3フィンガーペプチドを超えてKdの改善を示さず(Shi(博士論文)、Molecular Mechanisms of Zinc Finger Protein−Nucleic Acid Interactions,Johns Hopkins University(1995))、そして6フィンガーペプチドは、対応する3フィンガーペプチドよりも58〜74倍強固に結合した(Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:5525−5530(l997))。
【0035】
対照的に、本明細書中に記載するペプチドは(実施例の項を参照のこと)、もともとの3フィンガーペプチドよりも6,000倍〜90,000倍強固に結合する。268/NREおよび268//NRE構築物中で使用されるより長いリンカーは、より大きなフィンガーのセットがすべて正統なリンカーを用いて連結される場合に、蓄積する緊張をいくらか緩和しなければならないようである。おそらくこれは、DNAのらせんの周期性、およびジンクフィンガーの好ましいらせんの周期性におけるわずかなミスマッチを含み、特に4以上のフィンガーが正統なリンカーを介して連結される場合に、それらがわずかに見当はずれになることを引き起こす。
【0036】
(II.定義)
本明細書中で使用される場合、以下の用語は、別に特定しない限りは、それらに与えられた意味を有する。
【0037】
用語「ジンクフィンガータンパク質」または「ZFP」または「ジンクフィンガーポリペプチド」は、亜鉛によって安定化されているDNA結合ドメインを有するタンパク質をいう。個々のDNA結合ドメインは、代表的には、「フィンガー」として呼ばれる。1つのジンクフィンガータンパク質は、少なくとも1フィンガー、代表的には2フィンガー、3フィンガー、または6フィンガーを有する。各々のフィンガーは、2〜4塩基対のDNA、代表的には3または4塩基対のDNA(「部分配列」)を結合する。1つのジンクフィンガータンパク質は、標的部位または標的セグメントと呼ばれる核酸配列に結合する。各々のフィンガーは、代表的には、約30アミノ酸の、亜鉛がキレートしたDNA結合サブドメインを含む。これらのタンパク質の1つのクラス(C2H2クラス)を特徴付ける例示的なモチーフは、−Cys−(X)2-4−Cys−(X)12−His−(X)3-5−His(配列番号21)(ここで、Xは任意のアミノ酸である)である。研究は、このクラスの単一のジンクフィンガーが、単一のβターンの2つのシステイン残基とともに、亜鉛が配位する2つの不変のヒスチジン残基を含むα−ヘリックスからなることを実証した(例えば、BergおよびShi、Science 27l:1081−1085(1996)を参照のこと)。
【0038】
「キメラ」ジンクフィンガータンパク質とは、少なくとも2つのDNA結合ドメインを有し、そのうちの1つは、ジンクフィンガーポリペプチドであり、可撓性リンカーを介して他のドメインと連結されているタンパク質をいう。これらの2つのドメインは、同じかまたは異種であり得る。両方のドメインが、同じジンクフィンガータンパク質であるか、または異種ジンクフィンガータンパク質であるかのいずれかであるジンクフィンガータンパク質であり得る。あるいは、1つのドメインが異種DNA結合タンパク質であり得る。
【0039】
「標的部位」は、ジンクフィンガータンパク質、または異種DNA結合ポリペプチドによって認識される核酸配列である。ジンクフィンガータンパク質については、単一の標的部位は、代表的には約4〜約10塩基対を有する。代表的には、2フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、4〜7塩基対の標的部位を認識し、3フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、6〜10塩基対の標的部位を認識し、そして6フィンガーのジンクフィンガータンパク質は、2つの近接した9〜10塩基対の標的部位を認識する。
【0040】
「部分部位」は、標的部位の部分配列であり、そして単一のフィンガーによって認識される標的部位の部分、例えば、2〜4塩基対の部分部位、代表的には3塩基の部分部位に対応する。標的部位は、少なくとも2、代表的には3、4、5、6、またはそれより多い部分部位(タンパク質の各フィンガーについて1つ)を含む。
【0041】
用語「近接した標的部位」とは、0〜約5塩基対によって隔てられている重複しない標的部位をいう。
【0042】
2つのDNA結合ドメイン間の「物理的分離」とは、2つのドメインがそれぞれの対応する標的部位に結合する場合の、2つのドメイン間の距離をいう。この距離は、リンカーの最小の長さを決定するために使用される。リンカーの最小の長さとは、ドメインまたはリンカーに立体的な障害を提供することなしに、2つのドメインが連結されることを可能にする長さである(最小リンカー)。最小よりも長い長さを提供するリンカーは、「可撓性リンカー」である。
【0043】
「構造に基づく設計」とは、リンカーのそれぞれの標的部位に結合するDNA結合タンパク質の物理的モデルおよびコンピューターモデルを使用して、最小の長さのリンカーおよび可撓性リンカーを決定する方法をいう。
【0044】
「Kd」とは、化合物の解離定数、すなわち、所定のアッセイ系を使用して測定される場合(例えば、米国特許第5,789,538号を参照のこと)、所定の条件下で(すなわち、[標的]<<Kdの場合)、その標的に対する化合物(例えば、ジンクフィンガータンパク質)の最大結合の半分を与える(すなわち、化合物分子の半分が標的に結合する)化合物の濃度をいう。Kdを測定するために使用されるアッセイ系を選択するべきであり、その結果、それはジンクフィンガータンパク質の実際のKdの最も正確な測定を与える。ジンクフィンガータンパク質の実際のKdの正確な測定を与える限り、任意のアッセイ系が使用され得る。1つの実施態様において、本発明のジンクフィンガータンパク質についてのKdは、本明細書中に記載されるように、電気泳動移動度シフトアッセイ(「EMSA」)を使用して測定される。ジンクフィンガータンパク質の純度または活性について調整しない限りは、Kdの計算は、所定のジンクフィンガータンパク質の真のKdの過小評価を生じ得る。
【0045】
句「転写開始部位に近接した」は、転写開始部位の上流または下流のいずれかの約50塩基以内にある標的部位をいう。転写開始部位の「上流」とは、転写開始部位の5’の約50塩基より多い標的部位をいう(すなわち、遺伝子の非転写領域において)。
【0046】
句「RNAポリメラーゼ停止部位」は、Uptainら、Annu.Rev.Biochem.66:117−172(1997)に記載される。
【0047】
用語「異種」は相対的な用語であり、これは核酸の一部に関して使用される場合、天然では互いに同じ類縁中に見出されない2つ以上の部分配列を含む核酸を示す。例えば、組換え的に産生された核酸は代表的に、新たな機能的核酸を作製するように、合成的に配置された関連のない遺伝子由来の2つ以上の配列を有する(例えば、1つの供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域)。従って、この2つの核酸は、この状況において互いに対して異種である。細胞に対して添加される場合、この組換え核酸はまた、この細胞の内因性遺伝子に対して異種である。従って、染色体において、異種核酸とは、染色体中に組み込まれた非天然の(天然には存在しない)核酸、または非天然の(天然には存在しない)染色体外の核酸を含む。対照的に、天然に転座した染色体の断片は、本特許出願の文脈において異種と見なされない。なぜなら、この断片は、変異細胞に対してネイティブである内因性の核酸配列を含むからである。
【0048】
「調節ドメイン」とは、DNA結合ドメイン(すなわち、ジンクフィンガータンパク質)に連結される場合に、転写調節活性、DNA修飾活性、タンパク質修飾活性などのような活性を有するタンパク質またはタンパク質ドメインをいう。調節ドメインの例としては、タンパク質またはタンパク質のエフェクタードメイン(例えば、転写因子および補因子(例えば、KRAB、MAD、ERD、SID、核因子κBサブユニットp65、初期増殖応答因子1、および核ホルモンレセプター、VP16、VP64)、エンドヌクレアーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ、ヒストンデアセムラーゼなど))が挙げられる。アクチベーターおよびリプレッサーは、コアクチベーターおよびコリプレッサーを含む(例えば、Utleyら、Nature 394:498−502(1998)を参照のこと)。
【0049】
「異種DNA結合ドメイン」とは、ジンクフィンガータンパク質ではないタンパク質(例えば、制限酵素、核ホルモンレセプター、ホメオドメインタンパク質(例えば、エングレイルドまたはアンテナぺディア(antenopedia))、細菌性ヘリックスターンヘリックスモチーフタンパク質(例えば、λリプレッサおよびtetリプレッサー)、Gal 4、TATA結合タンパク質、ヘリックスループヘリックスモチーフタンパク質(例えば、mycおよびmyo D)、ロイシンジッパー型タンパク質(例えば、fosおよびjun)、およびβシートモチーフタンパク質(例えば、metリプレッサ、arcリプレッサ、およびmntリプレッサ)由来のDNA結合ドメインをいう。
【0050】
「ヒト化」とは、代表的には、ポリペプチド配列の機能を実質的に改変することなく、既存のヒト配列を模擬するようにアミノ酸配列を改変することによって、ヒトにおける免疫反応性を最小化するように改変された非ヒトポリペプチド配列をいう(例えば、Jonesら、Nature 321:522−525(1986)、および公開されたUK特許出願番号第8707252号を参照のこと)。ジンクフィンガータンパク質についての骨格配列は、好ましくは既存のヒトC2H2ジンクフィンガータンパク質(例えば、SP−1)から選択される。機能的ドメインは、好ましくは既存のヒト遺伝子(例えば、NF−κBのp65サブユニット由来の活性化ドメイン)から選択される。可能であれば、認識ヘリックス配列を、ヒトゲノムを配列決定することによって提供された数千の既存のジンクフィンガータンパク質DNA認識ドメインから選択する。できる限り多く、ドメインを、同じ既存のタンパク質由来のユニットとして結合する。これらの工程の全ては、キメラジンクフィンガータンパク質中の新たな結合エピトープの導入を最小化し、そして操作したジンクフィンガータンパク質をより低い免疫原性にする。
【0051】
「核酸」とは、一本鎖形態もしくは二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーをいう。この用語は、公知のヌクレオチドアナログまたは改変された骨格残基もしくは連鎖を含む核酸を包含する。これらの核酸は合成的であり、天然に存在し、および天然に存在しない。これらの核酸は参照核酸と類似の結合特性を有し、そして参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される。このようなアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、2−O−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸(PNA)が挙げられ、この例は制限することを伴わない。他に示されない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に改変されたそれらの改変体(例えば、縮重コドン置換)および相補的配列、ならびに明示された配列を内在的に包含する。この用語、核酸は、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドと交換可能に使用される。ヌクレオチド配列は本明細書中において、慣習的な5’−3’方向で示される。
【0052】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中において、アミノ酸残基のポリマーをいうために交換可能に使用される。この用語は、1つ以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸のアナログまたは擬態物であるアミノ酸のポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーに対して適用される。ポリペプチドは、例えば、炭水化物残基の添加により改変されて、糖タンパク質を形成し得る。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、糖タンパク質ならびに非糖タンパク質を含む。ポリペプチド配列は、本明細書中において、慣習的なN末端からC末端への方向で示される。
【0053】
用語「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と類似の様式において機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸擬態物をいう。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるアミノ酸であり、ならびに後に改変されたそれらのアミノ酸(例えば、ヒドロキシプロリン、カルボキシグルタミン酸、およびO−ホスホセリン)である。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を有する化合物(すなわち、水素に結合するα炭素、カルボキシル基に結合するα炭素、アミノ基に結合するα炭素、およびR基に結合するα炭素(例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニン、およびメチルスルホニウム))をいう。そのようなアナログは、改変されたR基(例えば、ノルロイシン)または改変されたペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸擬態物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の様式において機能する化合物をいう。
【0054】
「保存的に改変された改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用する。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする改変された核酸をいうか、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には本質的に同一の配列をいう。特に、縮重コドン置換は、1つ以上の選択された(または全ての)コドンの3番目の位置が混合塩基および/またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって、達成され得る(Batzerら、Nucleic Acids Res.19:5081(1991);Ohtsukaら、J.Biol.Chem.260:2605−2608(1985);Rossoliniら、Mol.Cell.Probes 8:91−98(1994))。遺伝暗号の縮重が理由で、多数の機能的に同一の核酸は、任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUは全て、アミノ酸アラニンをコードする。従って、本明細書中のアミノ酸において、コドンによってアラニンが特定される全ての位置において、このコドンは、コードされるポリペプチドを改変することなく、任意の対応する記載のコドンに改変され得る。そのような核酸の改変は「サイレントな改変」であり、これは保存的に改変された改変の1種である。ポリペプチドをコードする本明細書中のどの核酸配列もまた、核酸の全ての可能なサイレントな改変を記述する。当業者は、核酸中の各コドン(AUG(これは通常、メチオニンついての唯一のコドンである)およびTGG(これは通常、トリプトファンについての唯一のコドンである)を除く)が、改変されて機能的に同一の分子を産生し得ることを認識する。従って、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレントな改変が、各記載の配列中に内在する。
【0055】
アミノ酸配列および核酸配列に関して、配列中の単一のアミノ酸もしくはヌクレオチド、または低い割合のアミノ酸もしくはヌクレオチドを、改変、付加、または欠失する個々の置換、欠失、あるいは付加は、「保存的に改変された改変体」を作製する。ここで、この改変は、化学的に類似のアミノ酸でのアミノ酸の置換を生じる。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当該分野において周知である。そのような保存的に改変された改変体は、本発明の多型性の改変体および対立遺伝子に加えられ、そしてそれらを除外しない。
【0056】
以下の群は各々、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を含む:
1)アラニン(A)、グリシン(G);
2)セリン(S)、トレオニン(T);
3)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);
4)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);
5)システイン(C)、メチオニン(M);
6)アルギニン(R)、リジン(K)、ヒスチジン(H);
7)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、バリン(V);および
8)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。
【0057】
(アミノ酸の特性の議論については、例えば、Creighton、Proteins(1984)を参照のこと)。
【0058】
(III.ジンクフィンガータンパク質の設計)
本発明のキメラジンクフィンガータンパク質は、可撓性リンカーを介して少なくとも第2のDNA結合ドメイン(これは、必要に応じて第2のジンクフィンガーポリペプチドである)に連結した、少なくとも1つのジンクフィンガーポリペプチドを含む。キメラジンクフィンガータンパク質は、2つより多いDNA結合ドメイン、ならびに1つ以上の調節ドメインを含み得る。本発明のジンクフィンガーポリペプチドは、選択した遺伝子中の選択された標的部位を認識するように操作され得る。代表的には、任意の適切なC2H2ZEP(例えば、SP−1、SP−1C、またはZIF268)由来の骨格を、操作したジンクフィンガーポリペプチドのための足場として使用する(例えば、Jacobs、EMBO J.11:4507(1992);DesjarlaisおよびBerg、PNAS 90:2256−2260(1993)を参照のこと)。次いで、多くの方法を使用して、その標的に対して高アフィニティーを有するジンクフィンガーポリペプチドを設計および選択し得る。ジンクフィンガーポリペプチドを、標的遺伝子中の任意の適切な標的部位に対して、高アフィニティーで結合するように設計または選択し得る。同時係属中の米国特許第6,453,242号(1999年1月12日出願)(TTC代理人整理番号第019496−001800、本明細書中で参考として援用される)は、選択された標的部位に対するジンクフィンガーポリペプチドの設計、構築、および発現のための方法を、包括的に記載する。
【0059】
当該分野において公知の任意の適切な方法(例えば、ファージディスプレイ、ランダム変異誘発、コンビナトリアルライブラリー、コンピューター/合理設計、アフィニティー選択、PCR、cDNAライブラリーまたはゲノムライブラリーからのクローニング、合成的構築など)を使用して、ジンクフィンガーポリペプチドをコードする核酸を設計および構築し得る(例えば、米国特許第5,786,538号;Wuら、PNAS 92:344−348(1995);Jamiesonら、Biochemistry 33:5689−5695(1994);RebarおよびPabo、Science 263:671−673(1994);ChooおよびKlug、PNAS 91:11163−11167(1994);ChooおよびKlug、PNAS 91:11168−11172(1994);DesjarlaisおよびBerg、PNAS 90:2256−2260(1993);DesjarlaisおよびBerg、PNAS 89:7345−7349(1992);Pomerantzら、Science 267:93−96(1995);Pomerantzら、PNAS 92:9752−9756(1995);およびLiuら、PNAS 94:5525−5530(1997);GriesmanおよびPabo、Science 275:657−661(1997);DesjarlaisおよびBerg、PNAS 91:11−99−11103(1994)を参照のこと)。
【0060】
好ましい実施態様において、同時係属中の出願USSN (1999年1月12日出願)(TTC代理人整理番号第019496−001800)は、標的遺伝子を選択し、そして1〜6(またはそれ以上)のD型可能部位(下記の定義を参照のこと)を含有する遺伝子内に標的部位を同定する方法を提供する。次いで、これらの方法を使用して、予め選択された部位に結合するジンクフィンガーポリペプチドを合成し得る。標的部位の選択のこれらの方法は、標的セグメントにおける1つ以上のD型可能部位の存在が、D型可能部位を欠失する標的セグメントに結合するジンクフィンガーポリペプチドと相対的に、その部位に結合するように選択または設計されたジンクフィンガーポリペプチドにおいて、より高い結合アフィニティーについての潜在能力を付与するという認識を、一部前提条件とする。
【0061】
D型可能部位または部分部位は、適切に設計された単一のジンクフィンガーが、3つの標的部位によりもむしろ4つの塩基に結合することを可能にする標的部位の領域である。そのようなジンクフィンガーは、二本鎖標的セグメントの内の一本の鎖(標的鎖)上の塩基のトリプレットおよび他方の鎖上の第4の塩基に結合する(同時係属中の出願USSN (1999年1月12日出願)(TTC代理人整理番号第019496−001800の図2を参照のこと)。4塩基の標的セグメントへの単一のジンクフィンガーの結合は、標的鎖の配列上およびジンクフィンガーのアミノ酸配列上の両方への束縛を課す。標的鎖内の標的部位は、「D型可能」部位モチーフ5’NNGK3’(ここで、NおよびKは、慣習的なIUPAC−IUBあいまいコードである)を含むべきである。そのような部位への結合のためにジンクフィンガーは、−1位にアルギニン残基および+2位でアスパラギン酸(または低い程度で好ましくは、グルタミン酸)を含むべきである。−1位のアルギニン残基は、D型可能部位中のG残基と相互作用する。ジンクフィンガーの+2位でのアスパラギン酸(またはグルタミン酸)残基は、D型可能部位中のK塩基に相補的な反対の鎖の塩基と相互作用する。D型可能部位の名前を付与するのは、アスパラギン酸(記号D)と反対の鎖の塩基(第4の塩基)との間の相互作用である。D型可能部位の式から明らかなように、D型可能部位の2つのサブタイプが存在する:すなわち、5’NNGG3’および5’NNGT3’である。前者の部位について、ジンクフィンガーの+2位のアスパラギン酸またはグルタミン酸は、D型可能部位に対して反対の鎖中のCと相互作用する。後者の部位において、ジンクフィンガーの+2位のアスパラギン酸またはグルタミン酸は、D型可能部位に対して反対の鎖中のAと相互作用する。一般的に、NNGGは、NNGTより好ましい。
【0062】
3つのフィンガーを有するジンクフィンガーポリペプチドの設計において、標的部位は、そのタンパク質のうちの少なくとも1つのフィンガー、および必要に応じて2つかまたは3つ全てのフィンガーが、D型可能部位を結合する潜在能力を有するように選択されるべきである。このような選択は、式5’−NNx aNy bNzc−3’を有する、より大きな標的遺伝子内から標的部位を選択することによって達成され得る。ここで、
各々のセット(x、a)、(y、b)および(z、c)は、(N、N)または(G、K)のいずれかであり;
(x、a)、(y、b)および(z、c)のうちの少なくとも1つは(G、K)であり、そして
NおよびKは、IUPAC−IUBあいまいコードである。
【0063】
換言すると、3つのセット(x、a)、(y、b)および(z、c)のうちの少なくとも1つはセット(G、K)であり、このことはこのセットの第1の位置がGであり、そして第2の位置がGまたはTであることを意味する。(G、K)ではない3つのセット(もしあれば)のセットは(N、N)であり、これはこのセットの第1の位置が任意のヌクレオチドによって占められ得、そしてこのセットの第2の位置が任意のヌクレオチドで占められ得ることを意味する。例として、セット(x、a)は(G、K)であり得、そしてセット(y、b)および(z、c)は両方とも(N、N)であり得る。
【0064】
式5’−NNx aNy bNzc−3’において、NNx aNyおよびbNzcのトリプレットは、ジンクフィンガーポリペプチドの3つのフィンガーによって結合される標的鎖上に塩基のトリプレットを示す。x、yおよびzのうちの1つのみがGであり、このGがKに続く場合、標的部位は単一のD型可能部分部位を含む。例えば、xのみがGであり、そしてaがKである場合、この部位は、強調されたD型可能部分部位を有する以下、
【0065】
【化1】
と読める。xおよびyの両方がGであるがzはGでなく、そしてaおよびbがKである場合、この標的部位は、2つの重複するD型可能部分部位を以下のように有する:
【0066】
【化2】
(配列番号22)
これは、ボールドで示される一方のそのような部位、およびイタリックのもう一方を有する。x、yおよびzの3つ全てがGであり、そしてa、b、およびcがKである場合、この標的セグメントは、3つのD型可能部分部位を以下のように含み、
【0067】
【化3】
(配列番号23)
このD型可能部分部位は、ボールド、イタリック、および下線によって示される。
【0068】
従って、これらの方法は、標的遺伝子を選択すること、およびその遺伝子の可能な部分配列内で、上記の式5’−NNx aNy bNzc−3’と合致する標的部位について体系的に検索することによって進む。いくつかのこのような方法において、潜在的な標的遺伝子のいずれかの鎖上の10連続している塩基のあらゆる可能な部分配列を評価して、それが上記の式に合致するか否かを決定し、そして合致する場合には、いくつのD型可能部位が存在するかを決定する。代表的には、そのような比較はコンピューターによって実施され、そしてこの式に合致する標的部位のリストが出力される。必要に応じて、そのような標的部位は、いくつのD型可能部位が存在するかに従って、種々のサブセットに出力され得る。
【0069】
改変において、本発明の方法は、各々が独立に上記の式と合致する第1および第2の標的セグメントを同定する。そのような方法における2つの標的セグメントは、その標的遺伝子において互いの近接または隣接(すなわち、約0〜5塩基内)であることが強制される。隣接の標的セグメントの選択に基づくこのストラテジーは、それぞれ第1および第2の標的セグメントについて特異的である2つの成分のジンクフィンガーポリペプチドの連結によって形成されるジンクフィンガーポリペプチドの設計を可能にすることである。これらの原則は、拡大されて、任意の数の成分フィンガーを有するジンクフィンガーポリペプチドによって結合されるべき標的部位を選択し得る。例えば、9つのフィンガータンパク質についての適切な標的部位は、3つの成分セグメント(各々は上記の式と合致する)を有する。
【0070】
上記の方法によって同定される標的部位は、他の判断基準によるさらなる評価に供され得るか、またはそのような部位について特異的なジンクフィンガーポリペプチドの設計または選択(もし必要であれば)および産生のために直接的に使用され得る。潜在的な標的部位を評価するためのさらなる判断基準は、遺伝子内での特定の領域に対するそれらの隣接度である。ジンクフィンガーポリペプチドをそれ自体で細胞性遺伝子を抑制するように使用する場合(すなわち、抑制部分へジンクフィンガーポリペプチドを連結することを伴わない)、最適な位置は、転写開始の部位、またはその上流50bp内もしくは下流50bp内であるように思われ、転写複合体の形成を阻害する(KimおよびPabo、J.Biol.Chem.272:29795−296800(1997))か、あるいは必須のエンハンサー結合タンパク質と競合するように思われる。しかし、ジンクフィンガーポリペプチドが機能的ドメイン(例えば、KRABリプレッサードメイン、またはVP16アクチベータードメインに融合される場合、結合部位の位置はかなりより柔軟であり、そして既知の調節領域の外側であり得る。例えば、KRABドメインは、KRABが結合する位置から少なくとも3kbpまでのプロモーターで転写を抑制し得る(Margolinら、PNAS 91:4509−4513(1994))。従って、標的遺伝子と共に明白に生物学的に重要なセグメント(例えば、調節配列)を必ずしも含むかまたは重複する必要のない標的部位が選択され得る。標的セグメントをさらに評価するための他の判断基準としては、そのようなセグメントまたは関連のセグメントに結合するジンクフィンガーポリペプチドの事前の有効性、および/または所定の標的セグメントを結合するように新たなジンクフィンガーポリペプチドを設計することの容易さが挙げられる。
【0071】
標的セグメントを選択した後、そのセグメントに結合するジンクフィンガーポリペプチドは、種々のアプローチによって提供され得る。最も単純なアプローチは、その標的部位に結合することが既に公知である既存のコレクションから、予め特徴付けられたジンクフィンガーポリペプチドを提供することである。しかし、多くの例において、そのようなジンクフィンガーポリペプチドは存在しない。新たなジンクフィンガーポリペプチドを設計する代替のアプローチもまた使用され得る。この代替のアプローチは、既存のジンクフィンガーポリペプチドのデータベース中の情報およびそれらの個々の結合アフィニティーを使用する。さらなるアプローチは、上記に議論した置換の法則に基づいてジンクフィンガーポリペプチドを設計することである。なおさらなる代替手段は、ファージディスプレイのような経験的プロセスによって所定の標的に対して特異性を有するジンクフィンガーポリペプチドを選択することである。いくつかのそのような方法において、ジンクフィンガーポリペプチドの各成分フィンガーは、他の成分フィンガーとは独立に設計または選択される。例えば、各フィンガーを異なる先に存在していたジンクフィンガーポリペプチドから獲得し得るか、または各フィンガーを別々の無作為化および選択に供し得る。
【0072】
一旦、ジンクフィンガーポリペプチドが所定の標的セグメントに対して選択され、設計され、またはさもなければ提供されると、そのジンクフィンガーポリペプチドまたはそれをコードするDNAが合成される。ジンクフィンガータンパク質をコードするDNAを合成および発現するための例示的な方法を、以下に記載する。次いで、ジンクフィンガーポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドを、そのジンクフィンガーポリペプチドが結合する標的部位を含む標的遺伝子の発現を調節するため、またはその標的遺伝子の分析のために使用し得る。
【0073】
(IV.本発明の方法を使用して作製されるジンクフィンガータンパク質の発現および精製)
可撓性リンカーを含むキメラジンクフィンガータンパク質およびこのようなキメラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸は、組換え遺伝学の分野で慣用的な技術を使用して作製され得る。本発明における使用の一般的な方法を開示する基本的なテキストとしては、Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第2版、1989);Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual(1990);およびCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubelら編、1994)が挙げられる。さらに、本質的には、任意の核酸は、任意の種々の商業的供給源から注文される注文品であり得る。同様に、ペプチドおよび抗体は、任意の種々の商業的供給源から注文される注文品であり得る。
【0074】
2つの別の方法が代表的に使用されて、新たに設計したDNA結合ポリペプチドおよび可撓性リンカーを発現するのに必要なコード配列が作製される。1つのプロトコルは、PCRに基づくアセンブリ手順であり、これは、(3フィンガーのジンクフィンガーポリペプチドを1つ作成するために)6つの重複オリゴヌクレオチドを利用する。3つのオリゴヌクレオチドは、認識ヘリックスの間のDNA結合ドメインの部分をコードする「普遍」配列に対応する。これらのオリゴヌクレオチドは、全てのジンクフィンガー構築物について一定のままである。他の3つの「特異的な」オリゴヌクレオチドは、認識ヘリックスをコードするように設計される。これらのオリゴヌクレオチドは、認識ヘリックスの主に1、2、3および6位で置換を含み、このことは、これらのオリゴヌクレオチドを、異なるジンクフィンガーの各々に対して特異的にする。
【0075】
3フィンガーのジンクフィンガーポリペプチドを作製するために、PCR合成が2つの工程で行われる。最初に、二本鎖DNAテンプレートが、低温度のアニーリング工程を用いる4つのサイクルのPCR反応において、6つのオリゴヌクレオチド(3つの普遍オリゴヌクレオチド、3つの特異的なオリゴヌクレオチド)を組み合わせることによって作製され、それにより、オリゴヌクレオチドがアニーリングされ、DNA「足場」が形成される。この足場におけるギャップは、高忠実度の熱安定性ポリメラーゼ(TaqポリメラーゼおよびPfuポリメラーゼの組み合わせもまた十分である)によって充填される。構築の第2期において、ジンクフィンガーテンプレートは、設計された外部プライマーによって増幅されて、クローニングのためのいずれかの末端で制限部位をシャトルベクターに取り込むか、または発現ベクターに直接取り込む。
【0076】
新たに設計したDNA結合タンパク質をクローニングする別の方法は、所望のキメラジンクフィンガータンパク質の特定の領域をコードする相補オリゴヌクレオチドをアニールすることに基づく。この特定のアプリケーションは、このオリゴヌクレオチドが、最終連結工程の前にリン酸化されることを必要とする。このことは、通常、アニーリング反応を設定する前に行われるが、リン酸化(kinasing)はまた、アニーリング後にも生じ得る。簡潔には、このタンパク質の定常領域をコードする「普遍」オリゴヌクレオチド(上記のオリゴ1、2および3)は、相補オリゴヌクレオチドとアニールされる。さらに、フィンガー認識ヘリックスをコードする「特異的」オリゴヌクレオチドは、それらのそれぞれの相補オリゴヌクレオチドとアニールされる。これらの相補オリゴは、上記のプロトコルで以前にポリメラーゼによって充填されている領域を充填するように設計される。共通のオリゴ1およびフィンガー3に対する相補オリゴは、選択されるベクターへのクローニングに使用される制限部位に特異的な突出する配列(overhanging sequence)を残すように操作される。第2のアセンブリプロトコルは、以下の局面において開始プロトコルとは異なる:新たに設計されたZFPをコードする「足場」は、全体的に合成DNAから構成され、それによりポリメラーゼ充填工程を排除し、さらにベクターにクローニングされるフラグメントは、増幅を必要としない。最後に、残った配列特異的突出(overhang)の設計は、挿入フラグメントの制限酵素消化の必要性を排除する。
【0077】
新たに設計されたジンクフィンガーポリペプチドをコードする、得られたフラグメントは、発現ベクターに連結される。可撓性リンカーおよび第2のDNA結合ドメイン(必要ならば、ジンクフィンガーポリペプチド)をコードする配列もまたベクターに連結されて、キメラジンクフィンガータンパク質が作製される。代表的には、この可撓性リンカーは、2つのDNA結合ドメインの間の発現ベクターに連結されるオリゴヌクレオチドによってコードされる。第2のDNA結合ドメインは、上記のように作製され得るか、または当該分野で周知の方法(例えば、PCRなど)を使用して、別の供給源からクローニングされ得るか、もしくは別の供給源から得られ得る。通常利用される発現ベクターとしては、改変されたpMAL−c2細菌発現ベクター(New England BioLabs,「NEB」)または真核生物発現ベクターであるpcDNA(Promega)が挙げられるがこれらに限定されない。
【0078】
選択されたキメラジンクフィンガータンパク質をコードする核酸は、代表的には、(例えば、Kdの決定のために)原核生物または真核生物細胞への形質転換についての中間ベクターに、複製および/または発現のためにクローニングされる。中間ベクターは、代表的には、ジンクフィンガータンパク質またはタンパク質産物をコードする核酸の保存または操作のための、原核生物ベクター(例えば、プラスミド)、またはシャトルベクター、または昆虫ベクターである。ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸はまた、代表的には、植物細胞、動物細胞(好ましくは、哺乳動物細胞もしくはヒト細胞)、真菌細胞、細菌細胞、または原生動物細胞への投与のための発現ベクターにクローニングされる。
【0079】
クローニングされた遺伝子または核酸の発現を得るために、キメラジンクフィンガータンパク質は、代表的には、転写を指向するためのプロモーターを含む発現ベクターにサブクローニングされる。適切な細菌プロモーターおよび真核生物プロモーターは当該分野で周知であり、そして例えば、Sambrookら、Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第2版、1989);Kriegler,Gene Transfer and Expression:A Laboratory Manual(1990);およびCurrent Protocols in Molecular Biology(Ausubelら編、1994)に記載される。ジンクフィンガータンパク質を発現するための細菌発現系は、例えば、E.coli、Bacillus sp.、およびSalmonellaにおいて利用可能である(Palvaら、Gene 22:229−235(1983))。このような発現系のためのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞のための真核生物発現系は当該分野で周知であり、そしてまた、市販されている。
【0080】
キメラジンクフィンガータンパク質核酸の発現を指向するために使用されるプロモーターは、特定のアプリケーションに依存する。例えば、強力な構成プロモーターは、代表的には、ジンクフィンガータンパク質の発現および精製のために使用される。対照的に、ジンクフィンガータンパク質が、遺伝子調節のためにインビボで投与される場合、構成プロモーターまたは誘導プロモーターのいずれかが使用され、これは、ジンクフィンガータンパク質の特定の使用に依存する。プロモーターはまた、代表的には、トランス活性化に応答するエレメント(例えば、低酸素応答エレメント、Gal4応答エレメント、lacリプレッサー応答エレメント)および低分子制御系(例えば、tet調節系およびRU−486系)を含み得る(例えば、Gossen&Bujard,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:5547(1992);Oliginoら、Gene Ther.5:491−496(1998);Wangら、Gene Ther.4:432−441(1997);Neeringら、Blood 88:1147−1155(1996);およびRendahlら、Nat.Biotechnol.16:757−761(1998)を参照のこと)。
【0081】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、代表的には、転写ユニットまたは発現カセットを含み、これは、宿主細胞(真核生物または原核生物のいずれか)における核酸の発現に必要な全てのさらなるエレメントを含む。従って、代表的な発現カセットは、例えば、ジンクフィンガータンパク質をコードする核酸配列、および例えば、転写物の効果的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位、または翻訳終結に必要なシグナルに作動可能に連結されたプロモーターを含む。このカセットのさらなるエレメントとしては、例えば、エンハンサー、および異種のスプライスされたイントロンシグナル(heterologous spliced intronic signal)が挙げられ得る。
【0082】
細胞に遺伝情報を輸送するために使用される特定の発現ベクターは、ジンクフィンガータンパク質の意図された使用(例えば植物、動物、細菌、真菌、原生動物などにおける発現)に関して選択される。標準的な細菌発現ベクターとしては、pBR322に基づくプラスミドの、pSKF、pET23D、および市販の融合発現系(例えば、GSTおよびLacZ)ようなプラスミドが挙げられる。好ましい融合タンパク質は、マルトース結合タンパク質「MBP」である。このような融合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質の精製のために使用される。エピトープタグもまた、発現をモニタリングするため、ならびに細胞および細胞成分局在化をモニタリングするために、組換えタンパク質に付加されて、単離の簡便な方法を提供する(例えば、c−mycまたはFLAG)。
【0083】
真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含む発現ベクターは、しばしば、真核生物発現ベクター(例えば、SV40ベクター、乳頭腫ウイルスベクターおよびエプスタインバーウイルスに由来するベクター)において使用される。他の例示的な真核生物ベクターとしては、pMSG,pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo−5、バキュロウイルスpDSVE、および以下のプロモーターの指示下でタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる:SV40初期プロモーター、SV40後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核生物細胞における発現についての効果を示した他のプロモーター。
【0084】
いくつかの発現系は、安定にトランスフェクトされた細胞株の選択のためのマーカー(例えば、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼ)を有する。高収率の発現系もまた、適切である(例えば、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの指示下で配列をコードするジンクフィンガータンパク質とともに、昆虫細胞におけるバキュロウイルスベクターを使用する)。
【0085】
代表的には、発現ベクターに含まれるエレメントはまた、E.coliにおいて機能するレプリコン、組換えプラスミドを保有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および組換え配列の挿入を可能にするプラスミドの非必須領域における唯一の制限部位を含む。
【0086】
標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母または昆虫細胞を産生し、次いでこれを、標準的な技術を使用して精製する(例えば、Colleyら、J.Biol.Chem.264:17619−17622(1989);Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology,第182巻(Deutscherら、1990)を参照のこと)。真核生物および原核生物細胞の形質転換は、標準的な技術に従って行われる(例えば、Morrison,J.Bact.132:349−351(1977);Clark−Curtiss&Curtiss,Methods in Enzymology 101:347−362(Wuら編、1983)を参照のこと)。
【0087】
外来ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための周知の手順はいずれも使用され得る。これらの手順としては、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクション、裸のDNA、プラスミドベクター、ウイルスベクター(エピソーム性および統合性の両方)、ならびにクローニングされたゲノムDNA、cDNA、合成DNAまたは他の外来遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかの使用が挙げられる(例えば、Sambrookら、前出、を参照のこと)。使用される特定の遺伝子操作手順は、少なくとも1つの遺伝子を、選択されるタンパク質を発現し得る宿主細胞に首尾良く導入し得ることが必要であるのみである。
【0088】
当業者に公知のタンパク質精製の任意の適切な方法は、本発明のキメラジンクフィンガータンパク質を精製するために使用され得る(Ausubel、前出、Sambrook、前出、を参照のこと)。さらに、任意の適切な宿主(例えば、細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞など)が使用され得る。
【0089】
1つの実施態様において、細菌株JM109においてマルトース結合タンパク質に融合したジンクフィンガータンパク質(MBP−ジンクフィンガータンパク質)の発現は、アミロースカラム(NEB)による簡単な精製を可能にする。高発現レベルのキメラジンクフィンガータンパク質は、IPTGでの誘導によって得られ得る。なぜなら、pMal−c2発現プラスミドにおけるMBP−ジンクフィンガータンパク質融合は、IPTG誘導性tacプロモーター(NEB)の制御下にあるからである。MBP−ジンクフィンガータンパク質融合プラスミドを含む細菌は、10μM ZnCl2、0.02%グルコースおよび50μg/mlアンピシリンを含む2×YT培地に播種され、そして37℃にて振盪される。中期対数増殖期で、IPTGを0.3mMまで添加して、そしてこの培養物を振盪させる。3時間後、この細菌を遠心分離によって採取し、超音波処理によって破壊し、次いで不溶性物質を遠心分離によって除去する。MBP−ジンクフィンガータンパク質を、アミロース結合樹脂上に捕捉し、20mM Tris−HCl(pH7.5)、200mM NaCl、5mM DTTおよび50μM ZnCl2を含む緩衝液で十分に洗浄し、次いで本質的に同じ緩衝液中でマルトースを用いて抽出する(精製は、NEBからの標準的なプロトコルに基づく)。精製したタンパク質を定量し、そして生化学分析のために保存する。
【0090】
精製したタンパク質の生化学的特徴(例えば、Kd)は、任意の適切なアッセイによって特徴付けられ得る。1つの実施態様において、Kdは、電気泳動移動度シフトアッセイ(「EMSA」)によって特徴付けられる(Buratowski&Chodosh、Current Protocols in Molecular Biology、12.2.1−12.2.7頁(Ausubel編、1996))。
【0091】
(V.調節ドメイン)
本発明の方法を使用して作製されるキメラジンクフィンガータンパク質は、必要に応じて、遺伝子発現の調節のための調節ドメインと結合され得る。このキメラジンクフィンガータンパク質は、1つ以上の調節ドメインと、あるいは2つ以上の調節ドメインと共有結合され得るかまたは非共有結合され得、この2つ以上のドメインは、同じドメインの2つのコピーであるか、または2つの異なるドメインである。この調節ドメインは、例えば、融合タンパク質の一部としてアミノ酸リンカーを介して、キメラジンクフィンガータンパク質に共有結合的に連結され得る。このジンクフィンガータンパク質はまた、非共有二量体化ドメイン(例えば、ロイシンジッパー、STATタンパク質N末端ドメイン、またはFK506結合タンパク質)を介して調節ドメインと結合され得る(例えば、O’Shea,Science 254:539(1991)、Barahmand−Pourら、Curr.Top.Microbiol.Immunol.211:121−128(1996);Klemmら、Annu.Rev.Immunol.16:569−592(1998);Klemmら、Annu.Rev.Immunol.16:569−592(1998);Hoら、Nature 382:822−826(1996);およびPomeranzら、Biochem.37:965(1998)を参照のこと)。この調節ドメインは、任意の適切な位置でキメラジンクフィンガータンパク質と結合され得、この位置としては、このキメラジンクフィンガータンパク質のC末端またはN末端が上げられる。
【0092】
本発明の方法を使用して作製されるキメラジンクフィンガータンパク質への付加のための通常の調節ドメインとしては、例えば、以下が挙げられる:転写因子由来の異種DNA結合ドメイン;転写因子(アクチベーター、リプレッサー、コアクチベーター、コリプレッサー)、サイレンサー、核ホルモンレセプター、癌遺伝子転写因子(例えば、myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mosファミリーメンバーなど)由来のエフェクタードメイン;およびクロマチン関連タンパク質およびその変更因子(例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ)。
【0093】
調節ドメインを入手し得る転写因子ポリペプチドは、調節された転写および基本の転写に関与するものを含む。このようなポリペプチドとしては、転写因子、そのエフェクタードメイン、コアクチベーター、サイレンサー、核ホルモンレセプターが挙げられる(例えば、転写に関与するタンパク質および核酸エレメントの概説については、Goodrichら、Cell 84:825−30(1996)を参照のこと;一般的な転写因子は、Barnes&Adcock,Clin.Exp.Allergy 25、補遺 2:46−9(1995)およびRoeder,Methods Enzymol.273:165−71(1996)に概説される)。転写因子専用のデータベースもまた公知である(例えば、Science 269:630(1995)を参照のこと)。核ホルモンレセプター転写因子は、例えば、Rosenら、J.Med.Chem.38:4855−74(1995)に記載される。転写因子のC/EBPファミリーは、Wedelら、Immunobiology 193:171−85(1995)に概説される。核ホルモンレセプターによって転写調節を媒介するコアクチベーターおよびコリプレッサーは、例えば、Meier,Eur.J.Endocrinol.134(2):158−9(1996);Kaiserら、Trends Biochem.Sci.21:342−5(1996);およびUtleyら、Nature 394:498−502(1998)に概説される。GATA転写因子(これは、造血の調節に関与する)は、例えば、Simon,Nat.Genet.11:9−11(1995);Weissら、Exp.Hematol.23:99−107に記載される。TATAボックス結合タンパク質(TBP)およびその関連するTAFポリペプチド(これは、TAF30、TAF55、TAF80、TAF110、TAF150、およびTAF250を含む)は、Goodrich&Tjian,Curr.Opin.Cell Biol.6:403−9(1994)およびHurley,Curr.Opin.Struct.Biol.6:69−75(1996)に記載される。転写因子のSTATファミリーは、例えば、Barahmand−Pourら、Curr.Top.Microbiol.Immunol.211:121−8(1996)に概説される。疾患に関与する転写因子は、Asoら、J.Clin.Invest.97:1561−9(1996)に概説される。
【0094】
1つの実施態様において、ヒトKOX−1タンパク質由来のKRAB抑制ドメインは、転写リプレッサーとして使用される(Thiesenら、New Biologist 2:363−374(1990);Margolinら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:4509−4513(1994);Pengueら、Nucl.Acids Res.22:2908−2914(1994);Witzgallら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91:4514−4518(1994))。別の実施態様において、KAP−1(KRABコリプレッサー)は、KRABとともに使用される(Friedmanら、Genes Dev.10:2067−2078(1996))。あるいは、KAP−1は、ジンクフィンガータンパク質ともに単独で使用され得る。転写リプレッサーとして作用する他の好ましい転写因子および転写因子ドメインとしては以下が挙げられる:MAD(例えば、Sommerら、J.Biol.Chem.273:6632−6642(1998);Guptaら、Oncogene 16:1149−1159(1998);Quevaら、Oncogene 16:967−977(1998);Larssonら、Oncogene 15:737−748(1997);Lahertyら、Cell 89:349−356(1997);およびCultraroら、Mol Cell.Biol.17:2353−2359(19977)を参照のこと);FKHR(横紋筋肉腫遺伝子におけるフォークヘッド(forkhead);Ginsbergら、Cancer Res.15:3542−3546(1998);Epsteinら、Mol.Cell.Biol.18:4118−4130(1998));EGR−1(初期増殖応答遺伝子産物1;Yanら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:8298−8303(1998);およびLiuら、Cancer Gene Ther.5:3−28(1998);ets2リプレッサー因子リプレッサードメイン(ERD;Sgourasら、EMBO J.14:4781−4793(19095));およびMAD smSIN3相互作用ドメイン(SID;Ayerら、Mol.Cell.Biol.16:5772−5781(1996))。
【0095】
1つの実施態様において、HSV VP16活性化ドメインは、転写アクチベーターとして使用される(例えば、Hagmannら、J.Virol.71:5952−5962(1997)を参照のこと)。活性化ドメインを補充し得る他の好ましい転写因子としては、以下が挙げられる:VP64活性化ドメイン(Seipelら、EMBO J.11:4961−4968(1996));核ホルモンレセプター(例えば、Torchiaら、Curr.Opin.Cell.Biol.10:373−383(1998);核因子κBのp65サブユニット(Bitko&Barik,J.Virol.72:5610−5618(1998)およびDoyle&Hunt,Neuroreport 8:2937−2942(1997));およびEGR−1(初期増殖応答遺伝子産物1;Yanら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:8298−8303(1998);およびLiuら、Cancer Gene Ther.5:3−28(1998))。
【0096】
キナーゼ、ホスファターゼ、および遺伝子調節に関与するポリペプチドを改変するほかのタンパク質はまた、キメラジンクフィンガータンパク質のための調節ドメインとして有用である。このような変更因子は、しばしば、例えばホルモンによって媒介される転写のスイッチのオンまたはオフに関与する。転写調節に関与するキナーゼは、Davis,Mol.Reprod.Dev.42:459−67(1995)、Jacksonら、Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res.28:279−86(1993)、およびBoulikas,Crit.Rev.Eukaryot.Gene Expr.5:1−77(1995)に概説され、一方、ホスファターゼは、例えば、Schonthal&Semin,Cancer Biol.6:239−48(1995)に概説される。核チロシンキナーゼは、Wang,Trends Biochem.Sci.19:373−6(1994)に記載される。
【0097】
記載されるように、有用なドメインもまた、癌遺伝子(例えば、myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mosファミリーメンバー)の遺伝子産物およびそれらの関連因子および変更因子から入手され得る。癌遺伝子は、例えば、Cooper,Oncogenes,第2版、The Jones and Bartlett Series in Biology,Boston,MA,Jones and Bartlett Publishers,1995に記載される。ets転写因子は、Waslylkら、Eur.J.Biochem.211:7−18(1993)およびCrepieuxら、Crit.Rev.Oncog.5:615−38(1994)に概説される。mys癌遺伝子は、例えば、Ryanら、Biochem.J.314:713−21(1996)に概説される。junおよびfos転写因子は、例えば、The Fos and Jun Families of Transcription Factors,Angel&Herrlich編(1994)に記載される。max癌遺伝子は、Hurlinら、Cold Spring Harb.Symp.Quant.Biol.59:109−16.に概説される。myb遺伝子ファミリーは、Kanei−Ishiiら、Curr.Top.Microbiol.Immunol.211:89−98(1996)に概説される。mosファミリーは、Yewら、Curr.Opin.Genet.Dev.3:19−25(1993)に概説される。
【0098】
別の実施態様において、ヒストンアセチルトランスフェラーゼは、転写アクチベーターとして使用される(例えば、Jin&Scotto,Mol.Cell.Biol.18:4377−4384(1998);Wolffe,Science 272:371−372(1996);Tauntonら、Science 272:408−411(1996);およびHassigら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95:3519−3524(1998)を参照のこと)。別の実施態様において、ヒストンデアセチラーゼは、転写リプレッサーとして使用される(例えば、Jin&Scotto,Mol.Cell.Biol.18:4377−4384(1998);Syntichaki&Thireos,J.Biol.Chem.273:24414−24419(1998);Sakaguchiら、Gene Dev.12:2831−2841(1998);およびMartinezら、J.Biol.Chem.273:23781−23785(1998)を参照のこと)。
【0099】
調節ドメインに加えて、しばしば、キメラジンクフィンガータンパク質は、精製、発現のモニタリング、または細胞および細胞成分の局在化のモニタリングの容易さのために、マルトース結合タンパク質(「MBP」)、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)、ヘキサヒスチジン、c−myc、およびFLAGエピトープのような融合タンパク質として発現される。
【0100】
本明細書に引用した全ての刊行物および特許出願を、各々個々の刊行物または特許出願が詳細かつ個々に参照として援用することを示すように、本明細書中で参考として援用する。
【0101】
先に記載の発明を、理解を明瞭にする目的のための例示および例としていくらか詳細に記載してきたが、特定の変更および改変が添付の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱せずになされ得ることは、本発明の教示に照らして、当業者に容易に明らかである。
【0102】
(実施例)
以下の実施例は、例示のためにのみ提供され、限定のためではない。当業者は、本質的に類似の結果を得るように変更または改変し得る種々の重要ではないパラメーターを容易に認識する。
【0103】
(方法)
(プラスミド構築)。トランスフェクション研究において用いられるジンクフィンガー発現プラスミドを、Zif268ペプチドおよび/またはNREペプチドの所望のフィンガーをコードするDNAセグメントのPCR増幅により構築した。これらのDNAセグメントを、以下のオリゴヌクレオチド二重鎖を、pcDNA3(Invitrogen)のHindIII部位およびXbaI部位にサブクローニングすることにより構築されたpCSのHindIII部位およびBamHI部位に挿入した:
【0104】
【化4】
これらの発現プラスミドは、そのN末端で、S−ペプチドタグ(KimおよびRaines,Protein Sci.2:348〜356(1993);KimおよびRaines,i.219:165〜166(1995))およびSV40ラージT抗原からの核局在化シグナル(Kalderonら,Cell 39:499〜509(1984))の両方を有するジンクフィンガーペプチドを作製するために設計した。レポータープラスミドを、QuikChangeTMキット(Stratagene)を用いて部位指向性変異誘発により構築した。変異誘発のためのテンプレートプラスミド(pGL3−TATA/Inr)の構築は、以前に記載されている(KimおよびPabo,J.Biol.Chem.272:29795〜29800(1997))。全ての構築物のDNA配列を、ジデオキシ配列決定により確認した。
【0105】
(タンパク質の産生および精製)。Zif268、NREおよび268/NREのペプチドをコードするDNAセグメントを、PCRにより増幅し、そしてpGEX−6P−3(Pharmacia)にサブクローニングした。このジンクフィンガータンパク質を、グルタチオンSトランスフェラーゼ(GST)との融合物としてE.coli中に発現し、そして製造業者のプロトコールに従ってアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。これらの構築物は、SペプチドタグもSV40核局在化シグナルも有さなかった。GSTを、引き続き、PreScissionTMプロテアーゼ(Pharmacia)での消化により除去した。タンパク質濃度を、標準としてウシ血清アルブミンを用いるSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いることにより評価した(Pomerantzら,Science 267:93〜96(1995))。活性なジンクフィンガータンパク質の濃度を、記載のように(RebarおよびPabo,Science 263:671〜673(1994))本質的に決定した。これらの2つの方法は、匹敵する結果を与え、これはタンパク質のほとんど全てが活性であったことを示した。
【0106】
(ゲルシフトアッセイ)。DNA結合反応は、総容量10mLの、20mMのbis−TrisプロパンpH7.0、100mMのNaCl、5mMのMgCl2、20mMのZnSO4、10%のグリセロール、0.1%のNonidet P40、5mMのDTT、および0.10mg/mLのウシ血清アルブミンの溶液中に適切なジンクフィンガーペプチドおよび結合部位を含んだ。全ての結合実験を、室温で実施した。結合部位のDNA配列は以下である:
【0107】
【化5】
それぞれの場合、9−bpの認識配列に下線を付している。ゲルシフトアッセイにおいて用いられる標識DNAを、クレノウ伸長またはキナーゼ反応により調製した。
【0108】
解離定数を決定するために、Zif268またはNREのペプチドの3倍階段希釈を、1時間、室温で標識化プローブDNA(0.4〜1.4pM)とインキュベートした。次いで、この反応混合物をゲル電気泳動に供した。放射活性シグナルをphosphorimager分析により定量した;明確な解離定数を、記載された(RebarおよびPabo,Science 263:671〜673(1994))ように決定した。
【0109】
on−rateおよびoff−rateもまた、ゲルシフトアッセイにより決定した。on−rate定数を決定する場合、結合反応を開始するために、標識したプローブDNA(最終濃度、約0.4pM)を室温でジンクフィンガーペプチド(最終濃度、5〜10pM)に添加し、そしてアリコートを種種の時点(0〜20分)でゲル電気泳動により分析した。時間tでの結合した割合をゲルのphosphorimager分析により決定した。次いでこのデータを以下の式に適合した(KaleidaGraphTMプログラム(Synergy Software):
F=Ffinal[1−exp(−kobs×t)]
ここで、Fは、時間tでの結合した割合であり、Ffinalは、反応終了時点に結合した、計算した割合であり;そしてkobsは、速度定数である(Hoopesら、J.Biol.Chem.267:11539〜11547(1992))。on−rate定数を以下の式から計算した:
kon=(Ffinal×kobs)/[P]
ここで、[P]は、ジンクフィンガータンパク質の濃度である。off−rate定数を、記載されたように本質的に決定した(Kimら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3616〜3620(1997))。タンパク質(最終濃度、100pM)を標識化プローブDNAと1時間プレインキュベートし、次いで、大過剰の非標識化プローブDNA(最終濃度、20nM)を添加した。アリコートを種々の時点で取り出し、そしてゲル電気泳動により分析した。標識部位の割合を、1時間のプレインキュベーション期間の終わりに見出された割合に対して正規化した。正規化された、結合した割合の自然対数を時間に対してプロットし、そしてoff−rateを傾きから決定した。速いon−rateおよびoff−rate測定のための全てのデータポイントを電気泳動の所用時間について補正した。
【0110】
(競合結合研究)。268//NREペプチド(最終濃度5pM)をまず、種々の量(0、0.05、0.5、5、および50nM)の非放射性の競合DNAと1時間インキュベートし、次いで標識したN/Z部位(6〜8pM)を添加した。サンプルを2、24、48、96、190および600時間後にゲル電気泳動により分析した。速度比(Kdc/Kd)を以下の式から算出した:
kdc/Kd={[C]/[P]t}×(Fo×F)/(Fo−F)(1−F)
ここで、kdcは、競合DNAへの結合に関する解離定数であり;Kdは、インタクトなキメラ部位に対する結合に関する解離定数であり;[C]は、競合DNAの濃度であり;[P]tは、タンパク質の総濃度であり;F0は、競合DNAの非存在下にいて、結合された割合であり、そしてFは、競合DNAの存在下で結合された割合である。この式は、遊離のタンパク質の濃度がDNAに結合するタンパク質の濃度より有意に小さいと仮定する。この基準は、N/Z部位での268//NREペプチドのKdが3.8fMであり、そして5pMの融合ペプチドがこれらの競合実験に用いられるので、容易に満たされるはずである。
【0111】
サケ精子DNAを用いる競合実験は、268//NREまたはZif268ペプチド(200pM)、標識化N/Z部位およびわずかな過剰モルの非標識N/Z部位を含んだ。種々の量のサケ精子DNAを添加し、そしてサンプルをインキュベーション2、24および48時間後、ゲル電気泳動により分析した。速度比を算出する場合、サケ精子DNAのそれぞれの塩基が可能性のある(非特定の)結合部位の開始を示すと仮定した。
【0112】
(一過性の同時トランスフェクションアッセイ)293細胞を記載された(Cepekら、Genes Dev.10:2079〜2088(1996))ようにグリセリンショックを用いるリン酸カルシウム沈降によりトランスフェクションした。トランスフェクション実験は、代表的に細胞を単層培養(6ウェルプレート)で、10〜30%コンフルエンシーで用い、そして以下のプラスミドを添加した:0.2mgの発現が空のプラスミド(pCS)またはジンクフィンガーペプチドをコードする発現プラスミド;0.2mgのレポータープラスミド;1mgの活性化因子プラスミド(GAL4−VP16);0.1mgのβ−ガラクトシダーゼ発現プラスミド(pCMVb;Clontech);および2.5mgのキャリアプラスミド(pUC19)。トランスフェクトされた細胞におけるルシフェラーゼ活性およびβガラクトシダーゼ活性を記載された(Kimら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3616〜3620(1997);KimおよびPabo,J.Biol.Chem.272:29795〜29800(1997))ように測定した。293細胞において発現された全てのジンクフィンガーペプチドを、S.TagTMRapid Assayキット(Novagen)(KimおよびRaines,Protein Sci.2:348〜356(1993);KimおよびRaines,Anal.Biochem.219:165〜166(1995))を用いることにより定量した。
【0113】
(結果)
ポリジンクフィンガーペプチドの構造に基づく設計。設計戦略は、任意の系の導入を回避するため接合部位でより長い(正準でない)リンカーを用いる、2つの3フィンガーペプチドの結合を含む。フィンガー間の妨害または衝突のいずれの危険性をさらに減じるため、このリンカーを設計し、そのためそれらは、個々の9bpの結合部位間に挿入された1または2のさらなる塩基対を有する複合性の結合部位と適合し得た。本明細書において報告した研究は、核のホルモン応答エレメントの部分(5’−AAG GGT TCA−3’;配列番号9)(GreismanおよびPabo,Science 275:657〜661(1997))に対して強固にそして特異的に結合する、3フィンガーZif268ペプチド(これは、5’−GCG TGG GCG−3’部位;配列番号8を認識する)および3フィンガー「NRE」ペプチド(ファージディスプレイを介して以前に選択されたZif268改変体)を用いた。中心に1つのさらなる塩基対を有する複合性の標的部位は、配列5’−AAG GGT TCA G GCG TGG GCG−3’(配列番号10)を有し、そしてN/Z部位と呼ばれる(Nは、NREペプチドについての結合部位を意味し、そしてZは、Zif268についての結合部位を意味する)。中心にさらなる2つの塩基対を有する部位は、配列5’−AAG GGT TCA GT GCG TGG GCG−3’(配列番号11)を有し、そしてN//Z部位と呼ばれる。
【0114】
モデルとして、Zif268複合体を有する構造に基づく設計(PavletichおよびPabo,Science 252:809〜817(1991);Elrod−Ericksonら,Structure 4:1171〜1180(1996)は、それぞれの結合部位を認識し得るポリフィンガータンパク質を作製するための適切な長さのリンカーを決定するために用いられた(図1および2を参照のこと)。N/Z部位で、最初のペプチドのαらせん末端のLeuと次のペプチドの最初のβシートのTyr残基との間に8残基を有することが十分な可撓性を可能にするようであった。正準な「TGEKP」リンカー(配列番号13)は、この領域に4残基(すなわち、Gly−Glu−Lys−Pro;配列番号20)を有する。N/Z部位では、LeuとTyrとの間に11残基を用いることが合理的であるようであった(図1A)。それぞれのリンカー(図1A)は、3フィンガーZif268ペプチドのN末端およびC末端に天然に隣接する配列を含んだ。さらなる可撓性を可能にするため、グリシンを、より短いリンカー(正準リンカーよりなお4残基長い)に含め、そしてGly−Gly−Gly−Ser(配列番号24)配列を、より長いリンカー(正準リンカーより7残基長い)に含めた。結合部位の表記法に類似する表記法を用いて、より短いリンカーを有する融合タンパク質を、268/NREと表示し、そしてより長いリンカーを有する融合タンパク質を268//NREと表記する。
【0115】
タンパク質−DNA複合体の解離定数および半減期を決定するためにゲルシフトをアッセイする。Zif268、NREおよび268//NREジンクフィンガーペプチドを発現し、そしてE.coliから精製し、そしていくつかのセットのゲルシフト実験に用いた。実験の予備的なセットを、簡便に設計し、2つの3フィンガータンパク質が隣接9bp部位で結合し得るか否かを決定した(未結合のペプチドの結合における任意の妨害は、複合性の部位についてポリフィンガータンパク質のアフィニティーを減じ得る)。最初の実験は、直接並列されるNRE結合部位およびZif268結合部位を有するDNAフラグメント(NZ部位と呼ばれる)を用いた(5’−AAG GGT TCA GCG TGG GCG−3’;配列番号12)。種々の量のNREペプチドをZif268の存在下または非存在下で標識化NE部位とインキュベートした(図3)。3フィンガーNREペプチドは、実際に、遊離の部位に対してよりも、事前結合したZif268を有するVZ部位に対してわずかにより強固に結合する。NREペプチドの明確な解離定数(Kd)は、それが単独で結合する場合180pMであるが、Zif268が隣接部位に事前結合する場合、60pMである。同様の結果がN/Z部位で得られた。これらの実験は、隣接部位で結合したペプチド間に衝突が存在しないことを証明し、そしてある程度、穏やかな協同性の効果があり得さえすることを示唆する。ポリフィンガータンパク質のアフィニティーにおける以前の制限(Rebar(博士号論文),Selection Studies of Zinc Finger−DNA Recognition,Massachusetts Institute of Technology(1997);Shi,(博士号論文)、Molecular Mechanisms of Zinc Finger Protein−Nucleic Acid Interactions,Johns Hopkins University(1995);Liuら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:5525〜5530(1997))は、リンカー設計の問題に起因するようである。
【0116】
結合研究の第2のセットは、新しいリンカー設計の有効性を確認する。平衡滴定は、268//NREペプチドが個々の9bp部位についてよりも複合性部位について有意により高いアフィニティーを有することを示す(表1)。この融合タンパク質は、その結合部位についてNREペプチド(180pM)およびZif268ペプチド(14pM)のKdSと類似のKdSを有する単離された9bp部位と結合する。対照的に、268//NRE融合タンパク質は、複合性部位に非常に強固に結合するので、解離定数が小さ過ぎ、タンパク質滴定によって容易に決定できない。少なくとも0.4pMの標識化プローブDNAがこれらのゲルシフト実験において必要であり、これは<1pMのKd値を正確に測定することを困難にした。これらの技術が困難と仮定して、268//NREペプチドの結合についてon−rateおよびoff−rateを測定すること、および平衡結合定数(表1)を推定するためにこれらのrateを用いることを決定した。3フィンガーペプチドを用いる並行する研究は、有用なコントロールを与えた。268//NRE、NREおよびZif268のペプチドについてのon−rateは、速く、そして拡散制御限界(108〜109M−1s−1)に近かった(von HippelおよびBerg,I.264:675〜678(1989))。このoff−rateは、大きな差異を示した:3フィンガーペプチドは、<39秒の半減期を有し、一方、268//NREペプチドは、NZ部位で370次間の半減期を有する。コントロール研究は、268//NREペプチドが単一の9bp部位を有する、より不安定な複合体を形成することを示す(従って、N部位で、半減期=150秒)。NREフィンガーおよびZif268フィンガーの両方は、NZ部位で268//NREペプチドで観察される異常に安定な複合体を形成するように、そのそれぞれ9bpの部分部位に結合するに違いない。
【0117】
並行する測定が実施され得る全ての場合、速度定数の比(koff/kon)から算出したKd値は、平衡研究から決定した値と良好に一致した(表1)。これは、直接滴定が実行不可能な場合において、Kdsを決定するための動態学的データを用いることにおける確実性を示した。計算は、268//NREペプチドがNz部位で2.1×10-15M(2.1fM)、N/Z部位で3.7fM、そしてN//Z部位で3.0fMのKdを有する複合性の結合部位に対するフェムトモル濃度のアフィニティーを有することを示す(これらの3つのKdsの一貫性はまた心強い、なぜなら、より長い可撓性のリンカーがこれらの任意の間隔と容易に適合させるはずであると予期されるからである)。このデータは、新しいリンカー設計がかなり有効であることを示す:268//NRE融合ペプチドは、個々の9bpの部位に対してよりも複合性部位に対してはるかに強固に(5,000〜95,000倍)結合し、そして本来の3フィンガーペプチドのいずれよりもはるかに強固に(6,000〜90,000倍)結合する。
【0118】
【表1】
競合実験をまた、6フィンガー268//NREペプチドのアフィニティーおよび特異性をさらに研究するために用いた(図4A)。直接、9bpのN部位およびZ部位が融合ペプチドに対する結合について複合性N/Z部位とどの程度十分に競合し得るかを実験の1セットで試験した。これらの実験では、種々の量の非放射活性のN部位またはZ部位を、268//NREペプチドの限界量と混合した。インキュベーションの1時間後、わずかに過剰モル(融合タンパク質の総量に比べて)の標識したN/Z部位を添加した。これらの条件下で、約70%の標識化DNAが、競合DNAの非存在下でシフトされる。種々の時間点で採取したサンプルをゲル電気泳動により分析した。この実験における268//NREペプチドの濃度(5pM)は、N/Z部位についてのペプチドの解離定数より数オーダーの規模で高いので、ほとんどすべてのペプチドは、競合DNAが添加されない場合、N/Z部位に結合する。競合DNAの存在下でのシフトしたN/Z部位の量の低下は、競合する部位に対する268//NREペプチドの結合を反映する。
【0119】
これらの実験における平衡には数100時間を要し、そして精製されたタンパク質の安定性は、実際、重大な懸念となる(複合性部位は、最後に添加され、そして平衡には、長時間かかる。なぜなら、融合タンパク質は、それが最初に標識したN/Z部位に衝突する前に、数百回または数千回、非放射活性のZ部位に衝突し得るからである)。高濃度の非放射活性のN部位またはZ部位での事前平衡の後、シフトしたN/Z標識の画分が約600時間までインキュベーション時間を徐々に増加させるにつれて、安定性を増加することが決定された。600時間のインキュベーション後、標識化N/Z部位の有意な画分が、非放射活性のN部位またはZ部位の10,000倍モル過剰の存在下でさえシフトされる。特異性比(上記のように算出した)は、268//NREペプチドが少なくとも3,800+1,600の率でN部位より複合性部位を優先し、そして融合ペプチドが少なくとも320+44の率でZ部位よりも複合性部位を優先することを示す。これらの実験は、6フィンガーペプチドの顕著な特異性を直接確認するが、これらの値は、特異性比にごく低くしか拘束されない。このタンパク質サンプルは、これらの実験に必要とされる長いインキュベーション時間の間に、ある程度の活性を失う(遊離のタンパク質の活性は、これらの条件下で約2日の半減期を有する)、そして変性したタンパク質は、標識したN/Z部位をシフトする機会を決して有さない。
【0120】
サケ精子DNAを用いる競合実験を、268//NREペプチドに対する特異的/非特異的結合定数の比を推測するために用いた(図4B)。これらの実験は、268/NREペプチドが非特異的なDNAに対して非常に効率的に識別し、そして8.8+1.5×106の特異性比(kdns/kd)を示すことを示した。3フィンガーZif268ペプチドを用いる並行する実験は、1.2+0.1×105の特異性比を示す。競合物としてウシ胸腺DNA、およびわずかに異なる条件を用いる以前の研究は、Zif268ペプチドについて0.31×105の特異性比を示した(GreismanおよびPabo,Science 275:657〜661(1997))。同時に得た、6フィンガー268//NRE融合ペプチドのアフィニティーおよび特異性についてのデータは、それが非常に有効なリプレッサーとして働き得ることを示唆し、そして、それがインビボにおけるさらなる分析のための優れた候補物であることを確かに示した。
【0121】
293ヒト細胞株において一過性同時トランスフェクション研究を、新しいポリフィンガーペプチドがレポーター遺伝子からの転写を効果的に抑制し得るか否かを理解するために用いた。以前の研究では、Zif268ペプチドが、Zif268ペプチドがTATAボックスまたは開始エレメント近接部位に結合する場合、基礎の転写およびVP−16活性化転写の両方を効果的に抑制し得ることが示されている(KimおよびPabo,J.Biol.Chem.272:29795〜29800(1997))。本試験では、適切な結合部位(Z、N、N/ZおよびN//Z)が開始エレメント近接の匹敵する位置に組み込まれたルシフェラーゼレポーターおよび類似のプロモーター構築物が用いられた(図1B)。
【0122】
268//NREペプチドがN/Z部位を含むプロモーターでVP−16活性化転写の72倍の抑制を、およびN//Z部位を含むプロモーターで47倍の抑制を示すことが決定された(図5A〜5D)。268/NREペプチドは、N/Z部位で68倍の抑制を示す。明らかに、これらの融合ペプチドは、適切な間隔を有する部位で非常に有効なリプレッサーである。3フィンガーペプチドを用いる並行実験は、抑制を示すが、それらが融合ペプチドよりもかなり有効性が低いことを示す。従って、NREペプチドは、以下を示す:プロモーター内のN部位で1.9倍抑制;N/Z部位で1.8倍抑制;N//Z部位で2.7倍抑制;そして単離されたZ部位では抑制なし。Zif268ペプチドは、以下を示す:Zプロモーターから13倍抑制;N/Zプロモーターから8.9倍抑制;N//Zプロモーターから15倍抑制;そして単離されたN部位では抑制なし。さらなる実験は、N/Z部位で融合タンパク質で得られたかなり高い抑制レベルを達成するために共有結合が必要であることを証明する。
【0123】
従って、別々のポリペプチド鎖としてZif268ペプチドおよびNPEペプチドを(同時トランスフェクションアッセイにおいて両方の発現プラスミドを含むことにより)同時発現することは、N/Z部位で単離されたZif268ペプチドを有する場合に得られた8.9倍抑制に匹敵する(実験誤差内)レベルである、N/Z部位でのわずか8.5倍の抑制を示す。これは、268/NRE融合タンパク質および268//NRE融合タンパク質がN/Z部位で示す68倍および72倍の抑制よりかなり低く、そしてこれらの「相乗的な」効果は共有結合を必要とすることが明白である。
【0124】
融合ペプチドにおけるさらなるフィンガーが、フィンガーの3つのみが特異的に結合し得る場合でさえ、ある程度の穏やかな抑制的効果を有し得ることは注目される。従って、6フィンガーペプチド(268/NREおよび268//NRE)は、Zプロモーターから21〜23倍の抑制を示す。同様の(22倍)抑制レベルがN//Z部位で268/NREペプチドで得られる。モデリングは、リンカーがこの部位ですべての6フィンガーの特異的結合を可能にするには短すぎることを示唆する。これらの抑制レベルは、Z部位で単離されたZif268ペプチドで観察されるレベルより、一貫して、いくらか高い(13倍抑制)。(268//NREペプチドがZ部位に結合する場合)、以下の可能性がある:1)NREフィンガーが自由であり、そしてさらに転写複合体のアセンブリを立体的に妨害しないか、または2)NREフィンガーがDNAと弱い非特異的な接触を形成し、これにより複合体の安定性をわずかに増強する。さらなる研究は、すべてのペプチドが匹敵するレベルで発現されることを示す。
【0125】
293細胞において発現されたジンクフィンガーペプチドは、S−ペプチドタグを有し、そしてペプチドの量は、S−タンパク質での活性化後、リボヌクレアーゼアッセイを用いることにより定量された(KimおよびRaines,Protein Sci.2:348〜356(1993);KimおよびRaines,Anal.Biochem.219:165〜166(1995))。控えめな推測で、細胞におけるペプチドの発現レベルは、3フィンガーペプチドの解離定数より有意に高い(少なくとも100倍)ことを示す。268/NREおよび268//NREペプチドの4フィンガー改変体および5フィンガー改変体をコードするプラスミドもまた構築した。これらを組織培養トランスフェクション研究において試験し、そしてそれらは、代表的に、3フィンガーペプチドで観察されたレベルと6フィンガーペプチドで観察されたレベルとの中間の抑制レベルを示した(図5A〜5D)。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、6個のフィンガーのペプチドである268//NREの構造に基づく設計を示す。Zif268−DNA複合体およびテンプレートB−DNA(連結で使用)の共結晶構造を、ホスフェートを重ね合わせることによって整列した(PavletichおよびPabo、Science 252:809〜817(1991);Elrod−Ericksonら、Structure 4:1171〜1180(1996))。このモデルにおいて、2個の3フィンガーペプチドは、2bpのギャップ(灰色で示される塩基)により分離された対応する9bp部位(白で示される塩基)に結合する。この下巻き(underwound)DNAの1つのヘリックスターンが11bpを含むので、一方の3フィンガーペプチドの配向は、他方の3フィンガーペプチドの配向にほとんど正確に適合することに留意すること。
【図2】 図2は、ジンクフィンガーペプチドおよび本明細書中に記載されるトランスフェクション研究において使用されるレポーター構築物の模式的な描写である。図2Aは、ジンクフィンガーのペプチドを示す。各フィンガーを丸で表す。Zif268ペプチド中のリンカーのアミノ酸配列(これは、規範的な「TGEKP」リンカー(配列番号13)を有する)を示し(配列番号16)、そして3フィンガーペプチドを接続するために使用されるより長いリンカーを以下に示す(配列番号17および18)。各々の場合において、左のボックスは、ヘリックス領域を示し、そしてフィンガーの第2の保存されたHis残基を含む:ジグザグ線は、次のフィンガーの第1のβシートを示し、これは、第1の保存されたCys残基を含む。図2Bは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のプロモーターを例示する。TATAボックス、開始コドン、およびジンクフィンガー結合部位(N/Z=配列番号10;N//Z=配列番号11;N=配列番号9;Z=配列番号8)のヌクレオチド位置を、転写開始部位(+1)について番号付けする。
【図3】 図3は、ゲルシフトアッセイを示す。種々の量(0nM、0.01nM、0.1nM、および1nM)のNREペプチドを、遊離結合部位(レーン1〜4)で、または0.5時間0.1nMのZif268ペプチドと予めインキュベートした結合部位(レーン5〜8)とともに1時間インキュベートした。遊離DNAおよびタンパク質−DNA複合体の位置を示す。
【図4】 図4は、競合結合研究を示す。図4Aにおいて、268//NREペプチド(5pM)を、種々の量(0.05nM、0.5nM、5nMおよび50nM)のコールド競合物DNA(レーン3〜14)と1時間予めインキュベートし、次いで、わずかにモル過剰(ペプチド濃度を超える)の標識したN/Z部位(608pM)を、反応混合物に添加した。アリコートを、種々の時点でゲル電気泳動により分析した。そしてこのゲルは、室温で600時間のインキュベーション時間後に結果を示す。図4Bにおいて、268//NRE(レーン2〜6)またはZif268ペプチド(レーン7〜11)を、標識したN/Z部位と混合し、わずかにモル過剰(ペプチド濃度を超える)の標識していないN/Z部位を添加し(その結果、70%の標識した部位が、サケ精子DNAの非存在下で移動される)、そして種々の量のサケ精子DNA(0μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、および100μg/ml)を含んだ。インキュベーションの24時間後、ゲル電気泳動によってサンプルを分析した。
【図5】 図5は、ジンクフィンガーのペプチドによるインビボでの転写抑制を例示するグラフ(図5A、図5B、図5C、および図5D)を示す。リン酸カルシウム沈澱法を使用して、記載(Cepekら、Genes Dev.10:2079〜2088(1996))されるようにヒト293細胞をトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性およびβガラクトシダーゼ活性を、48時間後に測定した。ルシフェラーゼ活性を対応するβガラクトシダーゼで除算し、相対的なルシフェラーゼ活性を得た。抑制レベル(倍数の抑制)を、1)空の発現プラスミドを用いてトランスフェクトした細胞からの相対的なルシフェラーゼ活性を、2)ジンクフィンガー発現プラスミドを用いてトランスフェクトした細胞からの相対的なルシフェラーゼ活性により除算することによって得た。異なるレポーターに対するグラフにおいて、異なる目盛りを使用する。68/NR、68/NRE、および68//NR、および68//NREペプチドは、1個または2個の末端フィンガーを欠く、6つのフィンガーを有する融合タンパク質の改変体である。従って、68/NRペプチドは、NREペプチドのフィンガー1およびフィンガー2に融合した(2つのリンカーの短い方を介して)Zif268ペプチドのフィンガー2およびフィンガー3を含む。このデータは、3つの独立した実験の平均を表し、そして平均の標準誤差を示す。
Claims (14)
- 近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を作製する方法であって、以下:
(i)該キメラジンクフィンガータンパク質の第1のDNA結合ドメインポリペプチドおよび第2のDNA結合ドメインポリペプチドを選択する工程であって、ここで該ドメインの各々がC2H2ジンクフィンガーのポリペプチドを含み、ここで該第1のドメインが第1の標的部位に結合し、そして該第2のドメインが第2の標的部位に結合し、ここで標的部位が近接している、工程; ならびに
(ii)アミノ酸配列「RQKDGERP(配列番号14)」又は「RQKDGGGSERP(配列番号15)」の何れかからなるリンカーと、該第1のドメインおよび該第2のドメインとを融合する工程であって、それによって近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質を作製する行程、
を含む、方法。 - 前記近接した標的部位が1個のヌクレオチドにより分離される、請求項1に記載の方法。
- 前記近接した標的部位が2個のヌクレオチドにより分離される、請求項1に記載の方法。
- 前記C2H2ジンクフィンガーのポリペプチドがZif268およびNREからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記C2H2ジンクフィンガーのポリペプチドが異種である、請求項1に記載の方法。
- 前記キメラジンクフィンガータンパク質が前記近接した標的部位に対してフェムトモル濃度のアフィニティーを有する、請求項1に記載の方法。
- 前記キメラジンクフィンガータンパク質が前記近接した標的部位に対して2〜4フェムトモル濃度のアフィニティーを有する、請求項6に記載の方法。
- 前記キメラジンクフィンガータンパク質が調節ドメインのポリペプチドをさらに含む、請求項1に記載の方法。
- 近接した標的部位に結合するキメラジンクフィンガータンパク質であって、該キメラジンクフィンガータンパク質が、以下:
(i)該キメラジンクフィンガータンパク質の第1のDNA結合ドメインのポリペプチドおよび第2のDNA結合ドメインのポリペプチドであって、ここで該ドメインの各々がC2H2ジンクフィンガーのポリペプチドを含み、ここで該第1のドメインが第1の標的部位に結合し、該第2のドメインが第2の標的部位に結合し、ここで標的部位が近接している、キメラジンクフィンガータンパク質の第1のDNA結合ドメインのポリペプチドおよび第2のDNA結合ドメインのポリペプチド;ならびに
(ii)アミノ酸配列「RQKDGERP」又は「RQKDGGGSERP」の何れかからなるリンカーと;
を含み、
ここで該第1のドメインおよび該第2のドメインが該リンカーと融合される、タンパク質。 - 前記C2H2ジンクフィンガーのポリペプチドがZif268およびNREからなる群から選択される、請求項9に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。
- 前記C2H2ジンクフィンガーのポリペプチドが異種である、請求項9に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。
- 前記キメラジンクフィンガータンパク質が前記近接した標的部位に対してフェムトモル濃度のアフィニティーを有する、請求項9に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。
- 前記キメラジンクフィンガータンパク質が前記近接した標的部位に対して2〜4フェムトモル濃度のアフィニティーを有する、請求項12に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。
- 前記キメラジンクフィンガータンパク質が調節ドメインのポリペプチドをさらに含む、請求項9に記載のキメラジンクフィンガータンパク質。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US7645498P | 1998-03-02 | 1998-03-02 | |
US60/076,454 | 1998-03-02 | ||
PCT/US1999/004441 WO1999045132A1 (en) | 1998-03-02 | 1999-03-01 | Poly zinc finger proteins with improved linkers |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009025146A Division JP2009136298A (ja) | 1998-03-02 | 2009-02-05 | 改善したリンカーを有するポリジンクフィンガータンパク質 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2002505111A JP2002505111A (ja) | 2002-02-19 |
JP4309051B2 true JP4309051B2 (ja) | 2009-08-05 |
Family
ID=22132131
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2000534663A Expired - Fee Related JP4309051B2 (ja) | 1998-03-02 | 1999-03-01 | 改善したリンカーを有するポリジンクフィンガータンパク質 |
JP2009025146A Withdrawn JP2009136298A (ja) | 1998-03-02 | 2009-02-05 | 改善したリンカーを有するポリジンクフィンガータンパク質 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009025146A Withdrawn JP2009136298A (ja) | 1998-03-02 | 2009-02-05 | 改善したリンカーを有するポリジンクフィンガータンパク質 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (5) | US6479626B1 (ja) |
EP (1) | EP1060261B1 (ja) |
JP (2) | JP4309051B2 (ja) |
AT (1) | ATE466952T1 (ja) |
AU (1) | AU746454B2 (ja) |
CA (1) | CA2321938C (ja) |
DE (1) | DE69942334D1 (ja) |
ES (1) | ES2341926T3 (ja) |
WO (1) | WO1999045132A1 (ja) |
Families Citing this family (362)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7262055B2 (en) | 1998-08-25 | 2007-08-28 | Gendaq Limited | Regulated gene expression in plants |
GB9824544D0 (en) | 1998-11-09 | 1999-01-06 | Medical Res Council | Screening system |
US7285416B2 (en) | 2000-01-24 | 2007-10-23 | Gendaq Limited | Regulated gene expression in plants |
EP2022856B1 (en) | 1994-08-20 | 2011-09-14 | Gendaq Limited | Improvements in or relating to binding proteins for recognition of DNA |
GB9710809D0 (en) | 1997-05-23 | 1997-07-23 | Medical Res Council | Nucleic acid binding proteins |
US6410248B1 (en) | 1998-01-30 | 2002-06-25 | Massachusetts Institute Of Technology | General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites |
EP1060261B1 (en) | 1998-03-02 | 2010-05-05 | Massachusetts Institute of Technology | Poly zinc finger proteins with improved linkers |
US6977154B1 (en) | 1998-03-17 | 2005-12-20 | Gendaq Limited | Nucleic acid binding proteins |
US7070934B2 (en) | 1999-01-12 | 2006-07-04 | Sangamo Biosciences, Inc. | Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression |
US7013219B2 (en) | 1999-01-12 | 2006-03-14 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
US6453242B1 (en) | 1999-01-12 | 2002-09-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites |
US6599692B1 (en) | 1999-09-14 | 2003-07-29 | Sangamo Bioscience, Inc. | Functional genomics using zinc finger proteins |
US6534261B1 (en) | 1999-01-12 | 2003-03-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
US20030104526A1 (en) | 1999-03-24 | 2003-06-05 | Qiang Liu | Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers |
US6794136B1 (en) | 2000-11-20 | 2004-09-21 | Sangamo Biosciences, Inc. | Iterative optimization in the design of binding proteins |
US7030215B2 (en) | 1999-03-24 | 2006-04-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Position dependent recognition of GNN nucleotide triplets by zinc fingers |
US7943731B1 (en) * | 1999-08-11 | 2011-05-17 | Massachusetts Institute Of Technology | Dimerizing peptides |
US7329728B1 (en) * | 1999-10-25 | 2008-02-12 | The Scripps Research Institute | Ligand activated transcriptional regulator proteins |
WO2001040798A2 (en) | 1999-12-06 | 2001-06-07 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods of using randomized libraries of zinc finger proteins for the identification of gene function |
US7462354B2 (en) * | 1999-12-28 | 2008-12-09 | Pharmexa Inc. | Method and system for optimizing minigenes and peptides encoded thereby |
WO2001053480A1 (en) * | 2000-01-24 | 2001-07-26 | Sangamo Biosciences, Inc. | Nucleic acid binding polypeptides characterized by flexible linkers connected nucleic acid binding modules |
WO2001059450A2 (en) | 2000-02-08 | 2001-08-16 | Sangamo Biosciences, Inc. | Cells expressing zinc finger protein for drug discovery |
CA2407695C (en) * | 2000-04-28 | 2015-03-31 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods for binding an exogenous molecule to cellular chromatin |
DE60126483T2 (de) * | 2000-04-28 | 2007-12-06 | Sangamo BioSciences, Inc., Richmond | Gezielte Modifikation der Chromatinstruktur |
ATE374249T1 (de) | 2000-04-28 | 2007-10-15 | Sangamo Biosciences Inc | Datenbanken von regulatorischen sequenzen, methoden zu ihrer herstellung und verwendung |
AU2001257331A1 (en) | 2000-04-28 | 2001-11-12 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods for designing exogenous regulatory molecules |
US7923542B2 (en) | 2000-04-28 | 2011-04-12 | Sangamo Biosciences, Inc. | Libraries of regulatory sequences, methods of making and using same |
WO2001084148A2 (en) | 2000-04-28 | 2001-11-08 | Sangamo Biosciences, Inc. | Pharmacogenomics and identification of drug targets by reconstruction of signal transduction pathways based on sequences of accessible regions |
US20030049649A1 (en) * | 2000-04-28 | 2003-03-13 | Wolffe Alan P. | Targeted modification of chromatin structure |
CN1328040A (zh) * | 2000-06-12 | 2001-12-26 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——人锌指蛋白18.04和编码这种多肽的多核苷酸 |
CN1331219A (zh) * | 2000-06-30 | 2002-01-16 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——人锌指蛋白18.92和编码这种多肽的多核苷酸 |
US7011972B2 (en) | 2000-07-18 | 2006-03-14 | The Scripps Research Institute | Fusion polypeptide comprising two ligand binding domains |
JP2004537260A (ja) * | 2000-12-07 | 2004-12-16 | サンガモ バイオサイエンシーズ, インコーポレイテッド | ジンクフィンガータンパク質による血管新生の調節 |
US7067317B2 (en) | 2000-12-07 | 2006-06-27 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of angiogenesis with zinc finger proteins |
WO2002057308A2 (en) * | 2001-01-22 | 2002-07-25 | Sangamo Biosciences, Inc. | Zinc finger polypeptides and their use |
CA2435394C (en) | 2001-01-22 | 2018-01-09 | Sangamo Biosciences, Inc. | Modified zinc finger binding proteins |
ATE513040T1 (de) * | 2001-08-17 | 2011-07-15 | Toolgen Inc | Zinkfingerdomänenbibliotheken |
EP1451297A4 (en) | 2001-12-07 | 2006-06-28 | Toolgen Inc | PHENOTYPIC SCANNING OF CHIMERIC PROTEINS |
US7262054B2 (en) | 2002-01-22 | 2007-08-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Zinc finger proteins for DNA binding and gene regulation in plants |
US8106255B2 (en) * | 2002-01-23 | 2012-01-31 | Dana Carroll | Targeted chromosomal mutagenasis using zinc finger nucleases |
AU2003218382B2 (en) * | 2002-03-21 | 2007-12-13 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination |
WO2004018632A2 (en) * | 2002-08-23 | 2004-03-04 | Sangamo Biosciences, Inc. | High-throughput screen for modulators of chromatin modifying activity |
US7361635B2 (en) | 2002-08-29 | 2008-04-22 | Sangamo Biosciences, Inc. | Simultaneous modulation of multiple genes |
AU2003298574B2 (en) * | 2002-09-05 | 2008-04-24 | California Institute Of Technology | Use of chimeric nucleases to stimulate gene targeting |
US20050032186A1 (en) * | 2002-12-09 | 2005-02-10 | Kim Jin-Soo | Regulatory zinc finger proteins |
US11311574B2 (en) | 2003-08-08 | 2022-04-26 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
US8409861B2 (en) * | 2003-08-08 | 2013-04-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted deletion of cellular DNA sequences |
CA2534296C (en) | 2003-08-08 | 2013-03-26 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
US20120196370A1 (en) | 2010-12-03 | 2012-08-02 | Fyodor Urnov | Methods and compositions for targeted genomic deletion |
US7888121B2 (en) | 2003-08-08 | 2011-02-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
US7972854B2 (en) | 2004-02-05 | 2011-07-05 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted cleavage and recombination |
AU2005287278B2 (en) | 2004-09-16 | 2011-08-04 | Sangamo Biosciences, Inc. | Compositions and methods for protein production |
EP2163632A1 (en) | 2004-10-05 | 2010-03-17 | SunGene GmbH | Constitutive expression cassettes for regulation of plant expression |
EP1655364A3 (en) | 2004-11-05 | 2006-08-02 | BASF Plant Science GmbH | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
EP2163631B1 (en) | 2004-11-25 | 2013-05-22 | SunGene GmbH | Expression cassettes for guard cell-preferential expression in plants |
EP1666599A3 (en) | 2004-12-04 | 2006-07-12 | SunGene GmbH | Expression cassettes for mesophyll- and/or epidermis-preferential expression in plants |
EP2072620B1 (en) | 2004-12-08 | 2013-05-08 | SunGene GmbH | Expression casstettes for vascular tissue-preferential expression in plants |
EP1669456A3 (en) | 2004-12-11 | 2006-07-12 | SunGene GmbH | Expression cassettes for meristem-preferential expression in plants |
WO2006084868A2 (en) | 2005-02-09 | 2006-08-17 | Basf Plant Science Gmbh | Expression cassettes for regulation of expression in monocotyledonous plants |
AU2006217847B2 (en) | 2005-02-26 | 2011-04-07 | Basf Plant Science Gmbh | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
WO2006094106A2 (en) * | 2005-02-28 | 2006-09-08 | Sangamo Biosciences, Inc. | Anti-angiogenic methods and compositions |
CA2607263A1 (en) | 2005-05-10 | 2006-11-16 | Basf Plant Science Gmbh | Expression cassettes for seed-preferential expression in plants |
KR101419729B1 (ko) * | 2005-07-26 | 2014-07-17 | 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 | 외래 핵산 서열의 표적화된 통합 및 발현 |
US7919583B2 (en) * | 2005-08-08 | 2011-04-05 | Discovery Genomics, Inc. | Integration-site directed vector systems |
WO2007081647A2 (en) * | 2006-01-03 | 2007-07-19 | The Scripps Research Institute | Zinc finger domains specifically binding agc |
WO2007102618A1 (en) | 2006-03-08 | 2007-09-13 | Kyoto University | Nucleic acid cleaving agent |
CN105296527B (zh) | 2006-08-11 | 2020-11-27 | 陶氏益农公司 | 锌指核酸酶介导的同源重组 |
KR100812110B1 (ko) * | 2006-10-24 | 2008-03-12 | 한국과학기술원 | 징크 핑거 단백질과 원핵 생물의 전사 인자를 포함하는인공 전사 인자의 제조 및 이의 이용 |
WO2008076290A2 (en) * | 2006-12-14 | 2008-06-26 | Dow Agrosciences Llc | Optimized non-canonical zinc finger proteins |
WO2008099013A1 (en) | 2007-02-16 | 2008-08-21 | Basf Plant Science Gmbh | Nucleic acid sequences for regulation of embryo-specific expression in monocotyledonous plants |
EP2155868A2 (en) * | 2007-04-19 | 2010-02-24 | Codon Devices, Inc | Engineered nucleases and their uses for nucleic acid assembly |
WO2008133938A2 (en) | 2007-04-26 | 2008-11-06 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted integration into the ppp1r12c locus |
AU2008275649B2 (en) | 2007-07-12 | 2013-09-05 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for inactivating alpha 1,6 fucosyltransferase (FUT 8) gene expression |
WO2009018576A1 (en) * | 2007-08-02 | 2009-02-05 | Biodesic | Compositions and methods for analyte detection and quantitation |
US11235026B2 (en) | 2007-09-27 | 2022-02-01 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for modulating PD1 |
US8563314B2 (en) | 2007-09-27 | 2013-10-22 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for modulating PD1 |
CA2937438C (en) * | 2007-09-27 | 2020-07-07 | Dow Agrosciences Llc | Engineered zinc finger proteins targeting 5-enolpyruvyl shikimate-3-phosphate synthase genes |
CA2700231C (en) * | 2007-09-27 | 2018-09-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Rapid in vivo identification of biologically active nucleases |
EP2219469B1 (en) | 2007-12-03 | 2017-08-30 | Syngenta Participations AG | Engineering enzymatically susceptible proteins |
AU2009238629C1 (en) | 2008-04-14 | 2015-04-30 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Linear donor constructs for targeted integration |
EP2268129B1 (en) | 2008-04-21 | 2015-06-17 | Danziger Innovations Ltd. | Plant viral expression vectors and use of same for generating genotypic variations in plant genomes |
ES2869955T3 (es) * | 2008-04-30 | 2021-10-26 | Sanbio Inc | Células de regeneración neural con alteraciones en la metilación del ADN |
CA2725773C (en) * | 2008-05-28 | 2017-12-05 | Sangamo Biosciences, Inc. | Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains |
KR101794638B1 (ko) | 2008-06-10 | 2017-12-04 | 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | Bax- 및 bak-결함 세포주들의 제조 방법 및 조성물 |
WO2010019526A1 (en) * | 2008-08-14 | 2010-02-18 | Brent Lee | Dynamic filtration device using centrifugal force |
US8703489B2 (en) | 2008-08-22 | 2014-04-22 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for targeted single-stranded cleavage and targeted integration |
WO2010053518A2 (en) * | 2008-10-29 | 2010-05-14 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for inactivating glutamine synthetase gene expression |
US20110023144A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved in amyotrophyic lateral sclerosis disease |
EP3156494B8 (en) | 2008-12-04 | 2018-09-19 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Genome editing in rats using zinc-finger nucleases |
US20110023148A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genome editing of addiction-related genes in animals |
US20110023159A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Ovine genome editing with zinc finger nucleases |
US20110016542A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-20 | Sigma-Aldrich Co. | Canine genome editing with zinc finger nucleases |
US20110023146A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved in secretase-associated disorders |
US20110016539A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-20 | Sigma-Aldrich Co. | Genome editing of neurotransmission-related genes in animals |
US20110023149A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved in tumor suppression in animals |
US20110023147A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of prion disorder-related genes in animals |
US20110023157A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Equine genome editing with zinc finger nucleases |
US20110023154A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Silkworm genome editing with zinc finger nucleases |
US20110023139A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved in cardiovascular disease |
US20110023151A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genome editing of abc transporters |
US20110016540A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-20 | Sigma-Aldrich Co. | Genome editing of genes associated with trinucleotide repeat expansion disorders in animals |
US20110023158A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Bovine genome editing with zinc finger nucleases |
US20110030072A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-02-03 | Sigma-Aldrich Co. | Genome editing of immunodeficiency genes in animals |
US20110023152A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genome editing of cognition related genes in animals |
US20110023140A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Rabbit genome editing with zinc finger nucleases |
US20110023141A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved with parkinson's disease |
US20110023156A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Feline genome editing with zinc finger nucleases |
US20110016546A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-20 | Sigma-Aldrich Co. | Porcine genome editing with zinc finger nucleases |
US20110023145A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved in autism spectrum disorders |
US20110016543A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-20 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved in inflammation |
US20110023153A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of genes involved in alzheimer's disease |
US20110023143A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genomic editing of neurodevelopmental genes in animals |
US20110016541A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-20 | Sigma-Aldrich Co. | Genome editing of sensory-related genes in animals |
US20110023150A1 (en) * | 2008-12-04 | 2011-01-27 | Sigma-Aldrich Co. | Genome editing of genes associated with schizophrenia in animals |
JP2012511926A (ja) | 2008-12-17 | 2012-05-31 | ダウ・アグロサイエンス・エル・エル・シー | Zp15遺伝子座内への標的組込み |
US8551945B2 (en) | 2009-02-04 | 2013-10-08 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for treating neuropathies |
CA2756833C (en) | 2009-04-09 | 2019-11-19 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted integration into stem cells |
US8772008B2 (en) | 2009-05-18 | 2014-07-08 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for increasing nuclease activity |
CA2765488C (en) | 2009-06-30 | 2018-01-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Rapid screening of biologically active nucleases and isolation of nuclease-modified cells |
WO2011016840A2 (en) | 2009-07-28 | 2011-02-10 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for treating trinucleotide repeat disorders |
EP2462230B1 (en) * | 2009-08-03 | 2015-07-15 | Recombinetics, Inc. | Methods and compositions for targeted gene modification |
KR102262704B1 (ko) * | 2009-08-11 | 2021-06-09 | 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | 표적화 변형에 대한 동형접합성 유기체 |
WO2011048600A1 (en) | 2009-10-21 | 2011-04-28 | Danziger Innovations Ltd. | Generating genotypic variations in plant genomes by gamete infection |
MY174390A (en) | 2009-10-22 | 2020-04-15 | Sangamo Biosciences Inc | Engineered zinc finger proteins targeting plant genes involved in fatty acid biosynthesis |
AU2010325549B2 (en) | 2009-11-27 | 2017-04-20 | Basf Plant Science Company Gmbh | Optimized endonucleases and uses thereof |
US9420770B2 (en) | 2009-12-01 | 2016-08-23 | Indiana University Research & Technology Corporation | Methods of modulating thrombocytopenia and modified transgenic pigs |
GEP20176628B (en) * | 2010-01-22 | 2017-02-27 | Sangamo Biosciences Inc | Targeted genomic alteration |
CA2788850C (en) | 2010-02-09 | 2019-06-25 | Sangamo Biosciences, Inc. | Targeted genomic modification with partially single-stranded donor molecules |
WO2011102796A1 (en) * | 2010-02-18 | 2011-08-25 | Elmar Nurmemmedov | Novel synthetic zinc finger proteins and their spatial design |
US8771985B2 (en) | 2010-04-26 | 2014-07-08 | Sangamo Biosciences, Inc. | Genome editing of a Rosa locus using zinc-finger nucleases |
KR101974036B1 (ko) * | 2010-05-03 | 2019-04-30 | 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | 아연 핑거 모듈을 연결하기 위한 조성물 |
CA2798988C (en) | 2010-05-17 | 2020-03-10 | Sangamo Biosciences, Inc. | Tal-effector (tale) dna-binding polypeptides and uses thereof |
CA2805442C (en) | 2010-07-21 | 2020-05-12 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for modification of an hla locus |
US9512444B2 (en) | 2010-07-23 | 2016-12-06 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Genome editing using targeting endonucleases and single-stranded nucleic acids |
EP2622090B1 (en) | 2010-09-27 | 2019-06-19 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Compositions for inhibiting viral entry into cells |
US9175280B2 (en) | 2010-10-12 | 2015-11-03 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for treating hemophilia B |
EP2659404B1 (en) | 2010-12-29 | 2018-08-08 | Sigma-Aldrich Co., LLC | Cells having disrupted expression of proteins involved in adme and toxicology processes |
WO2012094132A1 (en) | 2011-01-05 | 2012-07-12 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for gene correction |
EP3434781A3 (en) | 2011-03-18 | 2019-03-06 | Basf Plant Science Company GmbH | Promoters for regulating expression in plants |
US20140186340A1 (en) | 2011-04-08 | 2014-07-03 | Gilead Biologics, Inc. | Methods and Compositions for Normalization of Tumor Vasculature by Inhibition of LOXL2 |
BR112013030652A2 (pt) | 2011-06-10 | 2016-12-13 | Basf Plant Science Co Gmbh | polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo, molécula de ácido nucleico, vetor, organismo não humano, polipeptídeo e método para introduzir um ácido nucleico de interesse em um genoma de um organismo não humano |
KR20140045398A (ko) | 2011-06-30 | 2014-04-16 | 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 | Cmp-n-아세틸뉴라민산 하이드록실라제 및/또는 당단백질 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제가 결핍된 세포 |
EP2737063B1 (en) | 2011-07-25 | 2016-06-01 | Sangamo BioSciences, Inc. | Methods and compositions for alteration of a cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (cftr) gene |
WO2013044008A2 (en) | 2011-09-21 | 2013-03-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for regulation of transgene expression |
WO2013059507A1 (en) | 2011-10-20 | 2013-04-25 | University Of Iowa Research Foundation | N-demethyase genes and uses thereof |
AU2012328682B2 (en) | 2011-10-27 | 2017-09-21 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for modification of the HPRT locus |
CA2854819C (en) | 2011-11-16 | 2022-07-19 | Sangamo Biosciences, Inc. | Modified dna-binding proteins and uses thereof |
US8450107B1 (en) | 2011-11-30 | 2013-05-28 | The Broad Institute Inc. | Nucleotide-specific recognition sequences for designer TAL effectors |
ES2733248T3 (es) | 2012-01-11 | 2019-11-28 | Sigma Aldrich Co Llc | Producción de proteínas recombinantes con glicoformas simples |
EP2806881A1 (en) | 2012-01-27 | 2014-12-03 | SanBio, Inc. | Methods and compositions for modulating angiogenesis and vasculogenesis |
EP2820127B1 (en) | 2012-02-28 | 2018-09-26 | Sigma Aldrich Co. LLC | Targeted histone acetylation |
CA2865011C (en) | 2012-02-29 | 2021-06-15 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for treating huntington's disease |
CN104428414B (zh) | 2012-05-02 | 2022-01-21 | 陶氏益农公司 | 苹果酸脱氢酶的靶向修饰 |
RU2650819C2 (ru) | 2012-05-07 | 2018-04-17 | Сангамо Терапьютикс, Инк. | Способы и композиции для опосредованной нуклеазой направленной интеграции трансгенов |
EP2861740A1 (en) | 2012-06-15 | 2015-04-22 | University of Iowa Research Foundation | Caffeine responsive promoters and regulatory genes |
HUE051612T2 (hu) | 2012-07-11 | 2021-03-01 | Sangamo Therapeutics Inc | Eljárások és készítmények lizoszomális tárolási betegségek kezelésére |
US10883119B2 (en) | 2012-07-11 | 2021-01-05 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for delivery of biologics |
US10648001B2 (en) | 2012-07-11 | 2020-05-12 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II |
CN104704110B (zh) | 2012-08-29 | 2018-06-01 | 桑格摩生物科学股份有限公司 | 用于治疗遗传性病状的方法和组合物 |
UA118090C2 (uk) | 2012-09-07 | 2018-11-26 | ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі | Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив |
CN105264067B (zh) | 2012-09-07 | 2020-11-10 | 美国陶氏益农公司 | Fad3性能基因座及相应的能够诱导靶向断裂的靶位点特异性结合蛋白 |
UA119135C2 (uk) | 2012-09-07 | 2019-05-10 | ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі | Спосіб отримання трансгенної рослини |
ES2824024T3 (es) | 2012-10-10 | 2021-05-11 | Sangamo Therapeutics Inc | Compuestos modificadores de células T y usos de los mismos |
AU2013355327A1 (en) | 2012-12-05 | 2015-06-11 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for regulation of metabolic disorders |
AR093980A1 (es) | 2012-12-13 | 2015-07-01 | Dow Agrosciences Llc | Genes de precision que tienen como objetivo un locus particular en el maiz |
RU2766685C2 (ru) | 2012-12-17 | 2022-03-15 | Президент Энд Фэллоуз Оф Харвард Коллидж | Рнк-направляемая инженерия генома человека |
AU2014218621B2 (en) | 2013-02-25 | 2019-11-07 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption |
EP2981166B1 (en) | 2013-04-05 | 2020-09-09 | Dow AgroSciences LLC | Methods and compositions for integration of an exogenous sequence within the genome of plants |
WO2014182700A1 (en) | 2013-05-10 | 2014-11-13 | Sangamo Biosciences, Inc. | Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering |
DE102013106462B3 (de) * | 2013-06-20 | 2014-10-09 | Airbus Defence and Space GmbH | Detektionsverfahren zur Detektion von Bakterien, Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen und Fusionsprotein |
EP3988654A1 (en) | 2013-08-28 | 2022-04-27 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains |
CA2926078C (en) | 2013-10-17 | 2021-11-16 | Sangamo Biosciences, Inc. | Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells |
CA2926094C (en) | 2013-10-17 | 2024-04-02 | Sangamo Biosciences, Inc. | Delivery methods and compositions for nuclease-mediated genome engineering |
AU2014341925B2 (en) | 2013-11-04 | 2017-06-29 | Corteva Agriscience Llc | Optimal soybean loci |
US10093940B2 (en) | 2013-11-04 | 2018-10-09 | Dow Agrosciences Llc | Optimal maize loci |
MX358066B (es) | 2013-11-04 | 2018-08-03 | Dow Agrosciences Llc | Óptimos loci de soya. |
CN107223156A (zh) | 2013-11-04 | 2017-09-29 | 美国陶氏益农公司 | 最优玉米座位 |
BR112016010175A2 (pt) | 2013-11-11 | 2017-10-03 | Sangamo Biosciences Inc | Repressor genético, seus usos, e composição farmacêutica |
SI3068881T1 (sl) | 2013-11-13 | 2019-05-31 | Children's Medical Center Corporation | Z nukleazo posredovano uravnavanje izražanja genov |
ES2813367T3 (es) | 2013-12-09 | 2021-03-23 | Sangamo Therapeutics Inc | Métodos y composiciones para ingeniería genómica |
HUE051232T2 (hu) | 2014-02-03 | 2021-03-01 | Sangamo Therapeutics Inc | Béta-talasszémia kezelésére szolgáló eljárások és készítmények |
US10370680B2 (en) | 2014-02-24 | 2019-08-06 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Method of treating factor IX deficiency using nuclease-mediated targeted integration |
ES2797050T3 (es) | 2014-03-04 | 2020-12-01 | Sigma Aldrich Co Llc | Células virales resistentes y sus usos |
WO2015143046A2 (en) | 2014-03-18 | 2015-09-24 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for regulation of zinc finger protein expression |
WO2015164383A1 (en) | 2014-04-22 | 2015-10-29 | Q-State Biosciences, Inc. | Models for parkinson's disease studies |
US9574211B2 (en) | 2014-05-13 | 2017-02-21 | Sangamo Biosciences, Inc. | Methods and compositions for prevention or treatment of a disease |
CN107072183B (zh) | 2014-07-14 | 2022-01-04 | 华盛顿州立大学 | 消除种系细胞的nanos敲除 |
WO2016014837A1 (en) | 2014-07-25 | 2016-01-28 | Sangamo Biosciences, Inc. | Gene editing for hiv gene therapy |
US9816074B2 (en) | 2014-07-25 | 2017-11-14 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for modulating nuclease-mediated genome engineering in hematopoietic stem cells |
US9616090B2 (en) | 2014-07-30 | 2017-04-11 | Sangamo Biosciences, Inc. | Gene correction of SCID-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells |
US10280402B2 (en) | 2014-08-06 | 2019-05-07 | College Of Medicine Pochon Cha University Industry-Academic Cooperation Foundation | Immune-compatible cells created by nuclease-mediated editing of genes encoding HLA |
RS62334B1 (sr) | 2014-09-16 | 2021-10-29 | Sangamo Therapeutics Inc | Postupci i sastavi za inženjering genoma posredovan nukleazom i korekciju kod matičnih ćelija hematopoeze |
US11352666B2 (en) | 2014-11-14 | 2022-06-07 | Institute For Basic Science | Method for detecting off-target sites of programmable nucleases in a genome |
US10889834B2 (en) | 2014-12-15 | 2021-01-12 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for enhancing targeted transgene integration |
US20180002379A1 (en) | 2015-01-21 | 2018-01-04 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for identification of highly specific nucleases |
US10048275B2 (en) | 2015-03-13 | 2018-08-14 | Q-State Biosciences, Inc. | Cardiotoxicity screening methods |
CN108124453B (zh) | 2015-03-31 | 2022-04-05 | 爱克莱根科技公司 | 用于将DNA序列靶向并入细胞或生物体的基因组中的Cas9逆转录病毒整合酶和Cas9重组酶系统 |
WO2016161446A1 (en) | 2015-04-03 | 2016-10-06 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Composition and methods of genome editing of b-cells |
US11845928B2 (en) | 2015-05-04 | 2023-12-19 | Tsinghua University | Methods and kits for fragmenting DNA |
US10179918B2 (en) | 2015-05-07 | 2019-01-15 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for increasing transgene activity |
US10808020B2 (en) | 2015-05-12 | 2020-10-20 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Nuclease-mediated regulation of gene expression |
US10288863B2 (en) | 2015-05-21 | 2019-05-14 | Q-State Biosciences, Inc. | Optogenetics microscope |
US9957501B2 (en) | 2015-06-18 | 2018-05-01 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Nuclease-mediated regulation of gene expression |
CN108024544B (zh) | 2015-07-13 | 2022-04-29 | 桑格摩生物治疗股份有限公司 | 用于核酸酶介导的基因组工程化的递送方法及组合物 |
JP2018525000A (ja) | 2015-08-06 | 2018-09-06 | ザ・キュレーターズ・オブ・ザ・ユニバーシティ・オブ・ミズーリThe Curators Of The University Of Missouri | 改変cd163遺伝子を有する病原体抵抗性動物 |
WO2017031370A1 (en) | 2015-08-18 | 2017-02-23 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for altering function and structure of chromatin loops and/or domains |
CA3005878A1 (en) | 2015-11-19 | 2017-05-26 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Lymphocyte antigen cd5-like (cd5l)-interleukin 12b (p40) heterodimers in immunity |
AU2016361350B2 (en) | 2015-11-23 | 2023-04-06 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for engineering immunity |
CN108699132B (zh) | 2015-12-18 | 2023-08-11 | 桑格摩生物治疗股份有限公司 | Mhc细胞受体的靶向破坏 |
JP7128741B2 (ja) | 2015-12-18 | 2022-08-31 | サンガモ セラピューティクス, インコーポレイテッド | T細胞受容体の標的化破壊 |
EA201891619A1 (ru) | 2016-01-11 | 2019-02-28 | Те Борд Оф Трастиз Оф Те Лилэнд Стэнфорд Джуниор Юниверсити | Химерные белки и способы регулирования экспрессии генов |
JP7012645B2 (ja) | 2016-01-11 | 2022-01-28 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | キメラタンパク質および免疫治療の方法 |
WO2017123757A1 (en) | 2016-01-15 | 2017-07-20 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for the treatment of neurologic disease |
CA3011049A1 (en) | 2016-02-02 | 2017-08-10 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Compositions for linking dna-binding domains and cleavage domains |
US11471462B2 (en) | 2016-06-27 | 2022-10-18 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for detecting and treating diabetes |
US11124805B2 (en) | 2016-07-13 | 2021-09-21 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Methods, compositions and kits for increasing genome editing efficiency |
WO2018013932A1 (en) | 2016-07-15 | 2018-01-18 | Salk Institute For Biological Studies | Methods and compositions for genome editing in non-dividing cells |
KR20190031306A (ko) | 2016-07-21 | 2019-03-25 | 맥스시티 인코포레이티드 | 게놈 dna를 변경하기 위한 방법 및 조성물 |
SG11201901364VA (en) | 2016-08-24 | 2019-03-28 | Sangamo Therapeutics Inc | Engineered target specific nucleases |
MX2019002207A (es) | 2016-08-24 | 2019-07-15 | Sangamo Therapeutics Inc | Regulacion de la expresion genica usando nucleasas modificadas. |
AU2017324462B2 (en) | 2016-09-07 | 2024-03-21 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Modulation of liver genes |
CN110023339A (zh) | 2016-09-23 | 2019-07-16 | Csl有限公司 | 凝血因子结合蛋白及其应用 |
GB201617559D0 (en) | 2016-10-17 | 2016-11-30 | University Court Of The University Of Edinburgh The | Swine comprising modified cd163 and associated methods |
BR112019007210A2 (pt) | 2016-10-20 | 2019-08-13 | Sangamo Therapeutics Inc | métodos e composições para o tratamento da doença de fabry |
CA3041668A1 (en) | 2016-10-31 | 2018-05-03 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Gene correction of scid-related genes in hematopoietic stem and progenitor cells |
CA3042259A1 (en) | 2016-11-04 | 2018-05-11 | Flagship Pioneering Innovations V. Inc. | Novel plant cells, plants, and seeds |
IL266862B2 (en) | 2016-12-01 | 2024-01-01 | Sangamo Therapeutics Inc | Tau modulators and methods and preparations for their administration |
EP4276187A3 (en) | 2016-12-08 | 2024-01-17 | Case Western Reserve University | Methods and compositions for enhancing functional myelin production |
WO2018140478A1 (en) | 2017-01-24 | 2018-08-02 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Viral resistant cells and culture systems |
WO2018183908A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Dana-Farber Cancer Institute, Inc. | Compositions and methods for treating ovarian tumors |
TWI808079B (zh) | 2017-04-03 | 2023-07-11 | 美商編碼製藥公司 | 組織選擇性轉基因表現 |
EP3610266A4 (en) | 2017-04-12 | 2021-04-21 | Massachusetts Eye and Ear Infirmary | TUMOR SIGNATURE OF METASTASIS, COMPOSITIONS OF SUBSTANCES AND USES THEREOF |
WO2018191520A1 (en) | 2017-04-12 | 2018-10-18 | The Broad Institute, Inc. | Respiratory and sweat gland ionocytes |
EP3612232A1 (en) | 2017-04-21 | 2020-02-26 | The Broad Institute, Inc. | Targeted delivery to beta cells |
CN110799492B (zh) | 2017-04-28 | 2023-06-27 | 爱康泰生治疗公司 | 用于递送核酸的新型羰基脂质和脂质纳米颗粒制剂 |
WO2018204469A2 (en) | 2017-05-03 | 2018-11-08 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for modification of a cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (cftr) gene |
WO2018204777A2 (en) | 2017-05-05 | 2018-11-08 | The Broad Institute, Inc. | Methods for identification and modification of lncrna associated with target genotypes and phenotypes |
WO2018209378A1 (en) * | 2017-05-18 | 2018-11-22 | Portagrid Systems Pty Ltd | Portable power station and array module attachment therefor |
EP3638218A4 (en) | 2017-06-14 | 2021-06-09 | The Broad Institute, Inc. | COMPOSITIONS AND METHOD OF TARGETING COMPLEMENTING COMPONENT 3 FOR INHIBITION OF TUMOR GROWTH |
US11512287B2 (en) | 2017-06-16 | 2022-11-29 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Targeted disruption of T cell and/or HLA receptors |
CN111328290A (zh) | 2017-06-26 | 2020-06-23 | 博德研究所 | 用于靶向核酸编辑的基于crispr/cas-腺嘌呤脱氨酶的组合物、系统和方法 |
US20200255828A1 (en) | 2017-10-04 | 2020-08-13 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for altering function and structure of chromatin loops and/or domains |
AU2018364660B2 (en) | 2017-11-09 | 2022-05-19 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Genetic modification of cytokine inducible SH2-containing protein (CISH) gene |
EP3710039A4 (en) | 2017-11-13 | 2021-08-04 | The Broad Institute, Inc. | METHODS AND COMPOSITIONS FOR CANCER TREATMENT BY TARGETING THE CLEC2D-KLRB1 PATH |
EP3710576A1 (en) | 2017-11-17 | 2020-09-23 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Til expansion from fine needle aspirates and small biopsies |
CA3083118A1 (en) | 2017-11-22 | 2019-05-31 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of peripheral blood lymphocytes (pbls) from peripheral blood |
WO2019143678A1 (en) | 2018-01-17 | 2019-07-25 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Dna-pk inhibitors |
IL276081B2 (en) | 2018-01-17 | 2023-10-01 | Vertex Pharma | Quinoxalinone compounds, preparations, methods and kits for increasing the efficiency of genome editing |
KR20200109358A (ko) | 2018-01-17 | 2020-09-22 | 버텍스 파마슈티칼스 인코포레이티드 | Dna-pk 억제제 |
US11926835B1 (en) | 2018-01-29 | 2024-03-12 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Methods for efficient tomato genome editing |
KR20200118468A (ko) | 2018-02-08 | 2020-10-15 | 상가모 테라퓨틱스, 인코포레이티드 | 조작된 표적 특이적 뉴클레아제 |
US20210155959A1 (en) | 2018-04-06 | 2021-05-27 | Children's Medical Center Corporation | Compositions and methods for somatic cell reprogramming and modulating imprinting |
EP3781587A4 (en) | 2018-04-18 | 2022-03-30 | Sangamo Therapeutics, Inc. | ZINC FINGER PROTEIN COMPOSITIONS FOR MODULATION OF HUNTINGTIN (HTT) |
SI3560330T1 (sl) | 2018-04-24 | 2022-08-31 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Rastline z izboljšano prebavljivostjo in markerskimi haplotipi |
US11957695B2 (en) | 2018-04-26 | 2024-04-16 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions targeting glucocorticoid signaling for modulating immune responses |
KR20210005138A (ko) | 2018-04-27 | 2021-01-13 | 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. | 종양 침윤 림프구의 확장 및 유전자 편집을 위한 폐쇄 방법 및 면역요법에서의 그의 용도 |
US20210147831A1 (en) | 2018-04-27 | 2021-05-20 | The Broad Institute, Inc. | Sequencing-based proteomics |
WO2019213660A2 (en) | 2018-05-04 | 2019-11-07 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for modulating cgrp signaling to regulate innate lymphoid cell inflammatory responses |
KR20210013091A (ko) | 2018-05-16 | 2021-02-03 | 시에스엘 리미티드 | 가용성 보체 수용체 1형 변이체 및 이의 용도 |
US11690921B2 (en) | 2018-05-18 | 2023-07-04 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Delivery of target specific nucleases |
US20210371932A1 (en) | 2018-06-01 | 2021-12-02 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for detecting and modulating microenvironment gene signatures from the csf of metastasis patients |
WO2019234754A1 (en) | 2018-06-07 | 2019-12-12 | The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization (Aro) (Volcani Center) | Nucleic acid constructs and methods of using same |
US20210337753A1 (en) | 2018-06-07 | 2021-11-04 | The State Of Israel, Ministry Of Agriculture & Rural Development, Agricultural Research Organization | Methods of regenerating and transforming cannabis |
CN108802357B (zh) * | 2018-06-27 | 2021-03-30 | 中南民族大学 | 一种用于免疫印迹分析的生物发光探针及其应用 |
WO2020006409A1 (en) | 2018-06-28 | 2020-01-02 | Trustees Of Boston University | Systems and methods for control of gene expression |
US20210317429A1 (en) | 2018-08-20 | 2021-10-14 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for optochemical control of crispr-cas9 |
AU2019326408A1 (en) | 2018-08-23 | 2021-03-11 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Engineered target specific base editors |
EP4268831A2 (en) | 2018-09-12 | 2023-11-01 | Fred Hutchinson Cancer Center | Reducing cd33 expression to selectively protect therapeutic cells |
JP7344300B2 (ja) | 2018-09-18 | 2023-09-13 | ブイエヌブイ ニューコ インク. | Arcベースのカプシドおよびその使用 |
US20210317430A1 (en) | 2018-09-18 | 2021-10-14 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Programmed cell death 1 (pd1) specific nucleases |
WO2020072677A1 (en) * | 2018-10-02 | 2020-04-09 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for modulation of tau proteins |
WO2020077236A1 (en) | 2018-10-12 | 2020-04-16 | The Broad Institute, Inc. | Method for extracting nuclei or whole cells from formalin-fixed paraffin-embedded tissues |
WO2020079033A1 (en) | 2018-10-15 | 2020-04-23 | Fondazione Telethon | Genome editing methods and constructs |
US20210379057A1 (en) | 2018-10-16 | 2021-12-09 | Massachusetts Institute Of Technology | Nutlin-3a for use in treating a mycobacterium tuberculosis infection |
JP2022506586A (ja) | 2018-11-05 | 2022-01-17 | アイオバンス バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | 腫瘍浸潤リンパ球の産生のためのプロセスおよび免疫療法におけるその使用 |
CA3118493A1 (en) | 2018-11-05 | 2020-05-14 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Expansion of tils utilizing akt pathway inhibitors |
KR20210091212A (ko) | 2018-11-05 | 2021-07-21 | 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. | 항-pd-1 항체에 불응성인 nsclc 환자의 치료 |
KR20210099573A (ko) | 2018-11-05 | 2021-08-12 | 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. | 개선된 종양 반응성 t-세포의 선택 |
AU2019406778A1 (en) | 2018-12-17 | 2021-07-22 | Massachusetts Institute Of Technology | Crispr-associated transposase systems and methods of use thereof |
CA3123392A1 (en) | 2018-12-19 | 2020-06-25 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Methods of expanding tumor infiltrating lymphocytes using engineered cytokine receptor pairs and uses thereof |
US11739156B2 (en) | 2019-01-06 | 2023-08-29 | The Broad Institute, Inc. Massachusetts Institute of Technology | Methods and compositions for overcoming immunosuppression |
EP3908568A1 (en) | 2019-01-11 | 2021-11-17 | Acuitas Therapeutics, Inc. | Lipids for lipid nanoparticle delivery of active agents |
AU2019428629A1 (en) | 2019-02-06 | 2021-01-28 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Method for the treatment of mucopolysaccharidosis type I |
US20230053540A1 (en) | 2019-02-19 | 2023-02-23 | Massachusetts Institute Of Technology | Treatment of liver injury |
KR20210136050A (ko) | 2019-03-01 | 2021-11-16 | 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. | 액상 종양으로부터의 종양 침윤 림프구의 확장 및 그의 치료 용도 |
US20220154282A1 (en) | 2019-03-12 | 2022-05-19 | The Broad Institute, Inc. | Detection means, compositions and methods for modulating synovial sarcoma cells |
US20220152115A1 (en) | 2019-03-13 | 2022-05-19 | The Broad Institute, Inc. | Microglial progenitors for regeneration of functional microglia in the central nervous system and therapeutics uses thereof |
US20220143148A1 (en) | 2019-03-14 | 2022-05-12 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for modulating cgrp signaling to regulate intestinal innate lymphoid cells |
US20220152148A1 (en) | 2019-03-18 | 2022-05-19 | The Broad Institute, Inc. | Modulation of type 2 immunity by targeting clec-2 signaling |
US20220142948A1 (en) | 2019-03-18 | 2022-05-12 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for modulating metabolic regulators of t cell pathogenicity |
JP7379528B2 (ja) | 2019-03-26 | 2023-11-14 | ツールジェン・インコーポレイテッド | 血友病b疾患モデルラット |
EP3946384A1 (en) | 2019-04-02 | 2022-02-09 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Methods for the treatment of beta-thalassemia |
PE20212332A1 (es) | 2019-04-23 | 2021-12-14 | Sangamo Therapeutics Inc | Moduladores de la expresioon del gen de marco de lectura abierto 72 del cromosoma 9 y usos de los mismos |
WO2020232029A1 (en) | 2019-05-13 | 2020-11-19 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Methods and compositions for selecting tumor infiltrating lymphocytes and uses of the same in immunotherapy |
EP3969607A1 (en) | 2019-05-13 | 2022-03-23 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Drought tolerance in corn |
WO2020232271A1 (en) | 2019-05-14 | 2020-11-19 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for targeting multinucleated cells |
AR118995A1 (es) | 2019-05-25 | 2021-11-17 | Kws Saat Se & Co Kgaa | Mejorador de la inducción de haploides |
US20220226464A1 (en) | 2019-05-28 | 2022-07-21 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for modulating immune responses |
US20220243178A1 (en) | 2019-05-31 | 2022-08-04 | The Broad Institute, Inc. | Methods for treating metabolic disorders by targeting adcy5 |
CA3138663A1 (en) | 2019-06-25 | 2020-12-30 | Inari Agriculture Technology, Inc. | Improved homology dependent repair genome editing |
EP3772542A1 (en) | 2019-08-07 | 2021-02-10 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Modifying genetic variation in crops by modulating the pachytene checkpoint protein 2 |
WO2021030627A1 (en) | 2019-08-13 | 2021-02-18 | The General Hospital Corporation | Methods for predicting outcomes of checkpoint inhibition and treatment thereof |
WO2021041922A1 (en) | 2019-08-30 | 2021-03-04 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-associated mu transposase systems |
WO2021067864A1 (en) | 2019-10-02 | 2021-04-08 | Sangamo Therapeutics, Inc. | Zinc finger protein transcription factors for treatment of prion disease |
JP2022551286A (ja) | 2019-10-02 | 2022-12-08 | サンガモ セラピューティクス, インコーポレイテッド | α-シヌクレイン発現を抑制するためのジンクフィンガータンパク質転写因子 |
US11793787B2 (en) | 2019-10-07 | 2023-10-24 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for enhancing anti-tumor immunity by targeting steroidogenesis |
AU2020366566A1 (en) | 2019-10-17 | 2022-04-21 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Enhanced disease resistance of crops by downregulation of repressor genes |
ES2938896T3 (es) | 2019-10-21 | 2023-04-17 | Univ Freiburg Albert Ludwigs | Un ensayo in vitro verdaderamente imparcial para perfilar la actividad fuera de objetivo de una o más nucleasas programables específicas de objetivo en células (ABNOBA-SEQ) |
EP4048295A1 (en) | 2019-10-25 | 2022-08-31 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Gene editing of tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy |
US11844800B2 (en) | 2019-10-30 | 2023-12-19 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods and compositions for predicting and preventing relapse of acute lymphoblastic leukemia |
TW202130812A (zh) | 2019-11-01 | 2021-08-16 | 美商聖加莫治療股份有限公司 | 用於基因體工程之組合物及方法 |
EP4065171A1 (en) | 2019-11-27 | 2022-10-05 | The Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Pentapeptide and methods of use thereof |
JP2023506734A (ja) | 2019-12-11 | 2023-02-20 | アイオバンス バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | 腫瘍浸潤リンパ球(til)の産生のためのプロセス及びそれを使用する方法 |
EP4074821A4 (en) | 2019-12-13 | 2024-01-17 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | SYSTEM FOR DETECTING EXTRACELLULAR PURINERGIC RECEPTOR LIGANDS AND NON-HUMAN ANIMAL INTO WHICH SUCH LIGAND WAS TRANSFERRED |
UY39036A (es) | 2020-01-22 | 2021-08-31 | Sangamo Therapeutics Inc | Factores de transcripción de proteína de dedos de zinc para represión de la expresión tau |
EP4127158A2 (en) | 2020-04-02 | 2023-02-08 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Adamts13 variant, compositions, and uses thereof |
JP2023523855A (ja) | 2020-05-04 | 2023-06-07 | アイオバンス バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | 腫瘍浸潤リンパ球の製造方法及び免疫療法におけるその使用 |
EP4146797A1 (en) | 2020-05-06 | 2023-03-15 | Orchard Therapeutics (Europe) Limited | Treatment for neurodegenerative diseases |
EP4146812A1 (en) | 2020-05-06 | 2023-03-15 | Cellectis S.A. | Methods for targeted insertion of exogenous sequences in cellular genomes |
CN115715203A (zh) | 2020-05-06 | 2023-02-24 | 塞勒克提斯公司 | 对细胞进行基因修饰以递送治疗性蛋白质的方法 |
IL298323B2 (en) | 2020-05-20 | 2023-10-01 | Univ Illinois | A method for treating lysosomal storage disease using histatin peptides |
CN116782762A (zh) | 2020-05-29 | 2023-09-19 | 科沃施种子欧洲股份两合公司 | 植物单倍体诱导 |
JP2023530234A (ja) | 2020-06-05 | 2023-07-14 | ザ・ブロード・インスティテュート・インコーポレイテッド | 新生物を治療するための組成物および方法 |
EP4204545A2 (en) | 2020-08-25 | 2023-07-05 | Kite Pharma, Inc. | T cells with improved functionality |
EP4225330A1 (en) | 2020-10-06 | 2023-08-16 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies |
WO2022076606A1 (en) | 2020-10-06 | 2022-04-14 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies |
EP4243609A1 (en) | 2020-11-16 | 2023-09-20 | Pig Improvement Company UK Limited | Influenza a-resistant animals having edited anp32 genes |
JP2023554395A (ja) | 2020-12-17 | 2023-12-27 | アイオバンス バイオセラピューティクス,インコーポレイテッド | Ctla-4及びpd-1阻害剤と併用した腫瘍浸潤リンパ球療法による治療 |
WO2022133149A1 (en) | 2020-12-17 | 2022-06-23 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of cancers with tumor infiltrating lymphocytes |
WO2022165260A1 (en) | 2021-01-29 | 2022-08-04 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Methods of making modified tumor infiltrating lymphocytes and their use in adoptive cell therapy |
CA3212439A1 (en) | 2021-03-19 | 2022-09-22 | Michelle SIMPSON-ABELSON | Methods for tumor infiltrating lymphocyte (til) expansion related to cd39/cd69 selection and gene knockout in tils |
KR20240037185A (ko) | 2021-04-19 | 2024-03-21 | 이오반스 바이오테라퓨틱스, 인크. | 키메라 공동자극 수용체, 케모카인 수용체, 및 세포 면역치료에서의 이의 용도 |
EP4340850A1 (en) | 2021-05-17 | 2024-03-27 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Pd-1 gene-edited tumor infiltrating lymphocytes and uses of same in immunotherapy |
CA3225330A1 (en) | 2021-07-09 | 2023-01-12 | Toolgen Incorporated | Mesenchymal stem cell having oxidative stress resistance, preparation method therefor, and use thereof |
WO2023009716A1 (en) | 2021-07-28 | 2023-02-02 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with kras inhibitors |
CN117730144A (zh) | 2021-07-29 | 2024-03-19 | 株式会社图尔金 | 具有血液相容性的间充质干细胞、其制备方法及用途 |
AR126622A1 (es) | 2021-07-30 | 2023-10-25 | Kws Saat Se & Co Kgaa | Plantas con digestibilidad mejorada y haplotipos marcadores |
WO2023042104A1 (en) | 2021-09-16 | 2023-03-23 | Novartis Ag | Novel transcription factors |
WO2023069881A1 (en) | 2021-10-20 | 2023-04-27 | University Of Rochester | Treatment with genetically modified cells, and genetically modified cells per se, with increased competitive advantage and/or decreased competitive disadvantage |
AU2022370552A1 (en) | 2021-10-20 | 2024-03-28 | University Of Rochester | Compositions and methods for treating myelin deficiency by rejuvenating glial progenitor cells |
AR127482A1 (es) | 2021-10-27 | 2024-01-31 | Iovance Biotherapeutics Inc | Sistemas y métodos para coordinar la fabricación de células para inmunoterapia específica de paciente |
AR127610A1 (es) | 2021-11-09 | 2024-02-14 | Amgen Inc | Método de producción de un conjugado de anticuerpo-péptido |
WO2023093862A1 (en) | 2021-11-26 | 2023-06-01 | Epigenic Therapeutics Inc. | Method of modulating pcsk9 and uses thereof |
WO2023102550A2 (en) | 2021-12-03 | 2023-06-08 | The Broad Institute, Inc. | Compositions and methods for efficient in vivo delivery |
WO2023102156A1 (en) | 2021-12-03 | 2023-06-08 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Mutant ace2 proteins and methods of using same |
WO2023105244A1 (en) | 2021-12-10 | 2023-06-15 | Pig Improvement Company Uk Limited | Editing tmprss2/4 for disease resistance in livestock |
GB202118058D0 (en) | 2021-12-14 | 2022-01-26 | Univ Warwick | Methods to increase yields in crops |
WO2023150553A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | University Of Rochester | Gpr17 promoter-based targeting and transduction of glial progenitor cells |
WO2023150557A1 (en) | 2022-02-01 | 2023-08-10 | University Of Rochester | Methods of generating a population of neurons from human glial progenitor cells and genetic constructs for carrying out such methods |
WO2023168397A1 (en) | 2022-03-04 | 2023-09-07 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Metabolic selection via the asparagine biosynthesis pathway |
WO2023196818A1 (en) | 2022-04-04 | 2023-10-12 | The Regents Of The University Of California | Genetic complementation compositions and methods |
WO2023196877A1 (en) | 2022-04-06 | 2023-10-12 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of nsclc patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies |
WO2023201369A1 (en) | 2022-04-15 | 2023-10-19 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Til expansion processes using specific cytokine combinations and/or akti treatment |
WO2023213831A1 (en) | 2022-05-02 | 2023-11-09 | Fondazione Telethon Ets | Homology independent targeted integration for gene editing |
WO2023220608A1 (en) | 2022-05-10 | 2023-11-16 | Iovance Biotherapeutics, Inc. | Treatment of cancer patients with tumor infiltrating lymphocyte therapies in combination with an il-15r agonist |
EP4278891A1 (en) | 2022-05-20 | 2023-11-22 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Clubroot resistance and markers in brassica |
GB2621813A (en) | 2022-06-30 | 2024-02-28 | Univ Newcastle | Preventing disease recurrence in Mitochondrial replacement therapy |
WO2024013514A2 (en) | 2022-07-15 | 2024-01-18 | Pig Improvement Company Uk Limited | Gene edited livestock animals having coronavirus resistance |
WO2024042199A1 (en) | 2022-08-26 | 2024-02-29 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Use of paired genes in hybrid breeding |
WO2024073692A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Metabolic selection via the glycine-formate biosynthesis pathway |
WO2024073686A1 (en) | 2022-09-30 | 2024-04-04 | Sigma-Aldrich Co. Llc | Metabolic selection via the serine biosynthesis pathway |
WO2024079157A1 (en) | 2022-10-11 | 2024-04-18 | KWS SAAT SE & Co. KGaA | Virus and insect resistance and markers in barley |
Family Cites Families (62)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3410650A1 (de) | 1984-03-23 | 1985-10-03 | Kernforschungsanlage Jülich GmbH, 5170 Jülich | Mit mikroorganismen bewachsene poroese anorganische traeger, verfahren zur immobilisierung von mikroorganismen und dafuer geeignete traegerkoerper |
GB8607679D0 (en) | 1986-03-27 | 1986-04-30 | Winter G P | Recombinant dna product |
US5455170A (en) | 1986-08-22 | 1995-10-03 | Hoffmann-La Roche Inc. | Mutated thermostable nucleic acid polymerase enzyme from Thermus species Z05 |
US5260203A (en) | 1986-09-02 | 1993-11-09 | Enzon, Inc. | Single polypeptide chain binding molecules |
US5317090A (en) | 1987-12-16 | 1994-05-31 | Institut Pasteur | Steroid/thyroid hormone receptor-related gene, which is inappropriately expressed in human hepatocellular carcinoma, and which is a retinoic acid receptor |
US5324819A (en) | 1988-04-08 | 1994-06-28 | Stryker Corporation | Osteogenic proteins |
US5340739A (en) | 1988-07-13 | 1994-08-23 | Brigham & Women's Hospital | Hematopoietic cell specific transcriptional regulatory elements of serglycin and uses thereof |
US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
AU633045B2 (en) | 1988-12-23 | 1993-01-21 | Salk Institute For Biological Studies, The | Receptor transcription-repression activity compositions and methods |
US5198346A (en) | 1989-01-06 | 1993-03-30 | Protein Engineering Corp. | Generation and selection of novel DNA-binding proteins and polypeptides |
US5096815A (en) | 1989-01-06 | 1992-03-17 | Protein Engineering Corporation | Generation and selection of novel dna-binding proteins and polypeptides |
US4990607A (en) | 1989-03-14 | 1991-02-05 | The Rockefeller University | Alteration of gene expression in plants |
WO1990011273A1 (en) | 1989-03-17 | 1990-10-04 | The Salk Institute For Biological Studies | Hormone response element compositions and assay |
US5096614A (en) * | 1989-03-20 | 1992-03-17 | Gte Products Corporation | Process for producing a terbium-activated gadolinium oxysulfide X-ray phosphor wherein the green/blue emission ratio is controlled |
DE69033127T2 (de) | 1989-11-13 | 1999-10-14 | Massachusetts Inst Technology | Lokalisation und charakterisierung des wilms-tumor-gens |
US5578482A (en) | 1990-05-25 | 1996-11-26 | Georgetown University | Ligand growth factors that bind to the erbB-2 receptor protein and induce cellular responses |
ES2082231T3 (es) | 1990-09-21 | 1996-03-16 | Salk Inst For Biological Studi | Metodos mediados por el complejo proteinico proto-oncogenico ap-1. |
US5348864A (en) | 1991-01-25 | 1994-09-20 | E. R. Squibb & Sons, Inc. | Mouse vav proto-oncogene DNA and protein sequences |
DE69230142T2 (de) | 1991-05-15 | 2000-03-09 | Cambridge Antibody Tech | Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern |
US5324818A (en) | 1991-08-21 | 1994-06-28 | The Regents Of The University Of Michigan | Proteins useful in the regulation of κB-containing genes |
US5243041A (en) | 1991-08-22 | 1993-09-07 | Fernandez Pol Jose A | DNA vector with isolated CDNA gene encoding metallopanstimulin |
US5302519A (en) | 1991-09-09 | 1994-04-12 | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Method of producing a Mad polypeptide |
US5270170A (en) | 1991-10-16 | 1993-12-14 | Affymax Technologies N.V. | Peptide library and screening method |
US5436150A (en) | 1992-04-03 | 1995-07-25 | The Johns Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease |
US5916794A (en) | 1992-04-03 | 1999-06-29 | Johns Hopkins University | Methods for inactivating target DNA and for detecting conformational change in a nucleic acid |
US5487994A (en) | 1992-04-03 | 1996-01-30 | The Johns Hopkins University | Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease |
US5792640A (en) | 1992-04-03 | 1998-08-11 | The Johns Hopkins University | General method to clone hybrid restriction endonucleases using lig gene |
US5356802A (en) | 1992-04-03 | 1994-10-18 | The Johns Hopkins University | Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease |
US5324638A (en) | 1992-05-13 | 1994-06-28 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Brain transcription factor, nucleic acids encoding same and uses thereof |
US5503022A (en) | 1993-01-25 | 1996-04-02 | Barone; Larry A. | Marine impeller tester |
CA2681922C (en) | 1994-01-18 | 2012-05-15 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
US6140466A (en) * | 1994-01-18 | 2000-10-31 | The Scripps Research Institute | Zinc finger protein derivatives and methods therefor |
US5376630A (en) * | 1994-03-17 | 1994-12-27 | International Flavors & Fragrances Inc. | Methyl, substituted propyl-substituted pentamethyl indane derivatives, processes for producing same and perfumery uses thereof |
AU3331595A (en) | 1994-08-18 | 1996-03-14 | Ariad Pharmaceuticals, Inc. | Composite dna-binding proteins and materials and methods relating thereto |
GB9824544D0 (en) | 1998-11-09 | 1999-01-06 | Medical Res Council | Screening system |
EP2022856B1 (en) | 1994-08-20 | 2011-09-14 | Gendaq Limited | Improvements in or relating to binding proteins for recognition of DNA |
US5814464A (en) | 1994-10-07 | 1998-09-29 | Regeneron Pharma | Nucleic acids encoding TIE-2 ligand-2 |
DE4435919C1 (de) | 1994-10-07 | 1995-12-07 | Deutsches Krebsforsch | Zinkfinger-DNA, -Protein und ihre Verwendung |
US5871902A (en) | 1994-12-09 | 1999-02-16 | The Gene Pool, Inc. | Sequence-specific detection of nucleic acid hybrids using a DNA-binding molecule or assembly capable of discriminating perfect hybrids from non-perfect hybrids |
US5702914A (en) | 1994-12-21 | 1997-12-30 | The Salk Institute For Biological Studies | Use of reporter genes for retinoid receptor screening assays having novel retinoid-associated response elements |
EP0805819B1 (en) | 1994-12-29 | 2012-02-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Chimeric dna-binding proteins |
US5534261A (en) * | 1995-01-17 | 1996-07-09 | University Of Southern California | Retinoid-based compositions and method for preventing adhesion formation using the same |
US5789538A (en) | 1995-02-03 | 1998-08-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities |
AU5445296A (en) | 1995-04-12 | 1996-10-30 | Cheng Cheng | Methods for preparing dna-binding proteins |
ATE215727T1 (de) | 1996-01-11 | 2002-04-15 | Honeywell Int Inc | Elektrischer drossel mit verteilte spalt |
DK0877752T3 (da) | 1996-01-23 | 2003-09-15 | Univ Leland Stanford Junior | Fremgangsmåder til screening af transdominante effektorpeptider og RNA molekyler |
FR2752734B1 (fr) | 1996-09-02 | 1998-11-06 | Cird Galderma | Utilisation de retinoides pour la preparation d'un medicament destine a traiter les affections liees a une surexpression de vegf |
US5939538A (en) | 1996-10-25 | 1999-08-17 | Immusol Incorporated | Methods and compositions for inhibiting HIV infection of cells by cleaving HIV co-receptor RNA |
DE19718249A1 (de) | 1997-04-30 | 1998-11-05 | Basf Ag | Myc-bindende Zinkfinger-Proteine, ihre Herstellung und ihre Verwendung |
GB9710809D0 (en) | 1997-05-23 | 1997-07-23 | Medical Res Council | Nucleic acid binding proteins |
GB9710807D0 (en) | 1997-05-23 | 1997-07-23 | Medical Res Council | Nucleic acid binding proteins |
US6248864B1 (en) * | 1997-12-31 | 2001-06-19 | Adherex Technologies, Inc. | Compounds and methods and modulating tissue permeability |
CA2318402A1 (en) | 1998-01-15 | 1999-07-22 | Ariad Gene Therapeutics, Inc. | Regulation of biological events using multimeric chimeric proteins |
US5972615A (en) | 1998-01-21 | 1999-10-26 | Urocor, Inc. | Biomarkers and targets for diagnosis, prognosis and management of prostate disease |
US6410248B1 (en) | 1998-01-30 | 2002-06-25 | Massachusetts Institute Of Technology | General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites |
DE69933856D1 (de) | 1998-02-13 | 2006-12-14 | Koester Hubert | Verwendung von ribozymen zur bestimmung der funktion von genen |
JP2003502007A (ja) | 1998-02-20 | 2003-01-21 | ゲノム ダイナミクス, インコーポレイテッド | ジンクフィンガークラスのdna結合タンパク質の設計方法 |
EP1060261B1 (en) * | 1998-03-02 | 2010-05-05 | Massachusetts Institute of Technology | Poly zinc finger proteins with improved linkers |
US6977154B1 (en) | 1998-03-17 | 2005-12-20 | Gendaq Limited | Nucleic acid binding proteins |
US6140081A (en) | 1998-10-16 | 2000-10-31 | The Scripps Research Institute | Zinc finger binding domains for GNN |
US6534261B1 (en) * | 1999-01-12 | 2003-03-18 | Sangamo Biosciences, Inc. | Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins |
WO2001053480A1 (en) | 2000-01-24 | 2001-07-26 | Sangamo Biosciences, Inc. | Nucleic acid binding polypeptides characterized by flexible linkers connected nucleic acid binding modules |
-
1999
- 1999-03-01 EP EP99909701A patent/EP1060261B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-01 ES ES99909701T patent/ES2341926T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-01 DE DE69942334T patent/DE69942334D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-01 JP JP2000534663A patent/JP4309051B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-03-01 CA CA002321938A patent/CA2321938C/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-01 AT AT99909701T patent/ATE466952T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-03-01 WO PCT/US1999/004441 patent/WO1999045132A1/en active IP Right Grant
- 1999-03-01 US US09/260,629 patent/US6479626B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-03-01 AU AU28849/99A patent/AU746454B2/en not_active Expired
-
2002
- 2002-05-13 US US10/146,221 patent/US6903185B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-04-20 US US11/110,594 patent/US7153949B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-12-14 US US11/639,363 patent/US7595376B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-02-05 JP JP2009025146A patent/JP2009136298A/ja not_active Withdrawn
- 2009-08-13 US US12/583,019 patent/US7928195B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU746454B2 (en) | 2002-05-02 |
AU2884999A (en) | 1999-09-20 |
CA2321938C (en) | 2009-11-24 |
US7153949B2 (en) | 2006-12-26 |
US20050202498A1 (en) | 2005-09-15 |
US7928195B2 (en) | 2011-04-19 |
EP1060261A1 (en) | 2000-12-20 |
US20110014675A1 (en) | 2011-01-20 |
US6479626B1 (en) | 2002-11-12 |
EP1060261B1 (en) | 2010-05-05 |
US20070149770A1 (en) | 2007-06-28 |
JP2002505111A (ja) | 2002-02-19 |
US20020173006A1 (en) | 2002-11-21 |
US7595376B2 (en) | 2009-09-29 |
US6903185B2 (en) | 2005-06-07 |
ATE466952T1 (de) | 2010-05-15 |
DE69942334D1 (de) | 2010-06-17 |
JP2009136298A (ja) | 2009-06-25 |
ES2341926T3 (es) | 2010-06-29 |
WO1999045132A1 (en) | 1999-09-10 |
CA2321938A1 (en) | 1999-09-10 |
EP1060261A4 (en) | 2002-11-13 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP4309051B2 (ja) | 改善したリンカーを有するポリジンクフィンガータンパク質 | |
US6410248B1 (en) | General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites | |
US6933113B2 (en) | Modulation of endogenous gene expression in cells | |
US7070934B2 (en) | Ligand-controlled regulation of endogenous gene expression | |
US6794136B1 (en) | Iterative optimization in the design of binding proteins | |
US6785613B2 (en) | Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites | |
CA2435394A1 (en) | Modified zinc finger binding proteins | |
Moore et al. | Recent developments in the engineering of zinc finger proteins | |
US7407776B2 (en) | Engineered zinc finger proteins for regulation of gene expression |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20050225 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050520 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20051108 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060206 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060308 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20060407 |
|
A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20060512 |
|
A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20060609 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080418 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080501 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080521 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080526 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080620 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080701 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090205 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090507 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120515 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120515 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130515 Year of fee payment: 4 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140515 Year of fee payment: 5 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |