JP6588438B2 - Dna結合ドメインと切断ドメインとを連結するための組成物 - Google Patents
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Description
本出願は、2013年8月28日に出願された米国仮出願第61/871,219号の利益を請求し、その開示は、その全体が参照として本明細書により援用される。
連邦支援の研究によってなされた発明に対する権利に関する声明
該当なし。
本開示は、ゲノム編集およびタンパク質工学の分野におけるものである。
人工ヌクレアーゼ、例えば、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、操作されたcrRNA/tracrRNA(「一本鎖ガイドRNA」)を用いるCRISPR/Casシステムおよび/またはArgonauteシステムに基づくヌクレアーゼ(例えば、T.thermophilusに由来し、「TtAgo」として知られるもの(Swartsら(2014)Nature 507(7491):258−261)は、切断ドメインに作動可能に連結されたDNA結合ドメイン(ヌクレオチドまたはポリペプチド)を含み、ゲノム配列の標的化変更に使用されている。例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、外因性配列を挿入するため、1つまたはそれを超える内因性遺伝子を不活性化するため、遺伝子発現パターンが変更された生物(例えば、作物)および細胞株を作出するためなどに使用されている。例えば、米国特許第8,586,526号;同第8,329,986号;同第8,399,218号;同第6,534,261号;同第6,599,692号;同第6,503,717号;同第6,689,558号;同第7,067,317号;同第7,262,054号;同第7,888,121号;同第7,972,854号;同第7,914,796号;同第7,951,925号;同第8,110,379号;同第8,409,861号;米国特許公開20030232410;同20050208489;同20050026157;同20050064474;同20060063231;同20080159996;同201000218264;同20120017290;同20110265198;同20130137104;同20130122591;同20130177983および同20130177960ならびに米国出願番号14/278,903を参照のこと(これらの開示は、すべての目的のために全体として参照により援用される)。例えば、ゲノム配列を切断するためにヌクレアーゼ(例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、TALEN)の対が、代表的に使用される。その対の各メンバーは、通常、ヌクレアーゼの1つまたはそれを超える切断ドメイン(またはハーフドメイン)に連結された操作された(天然に存在しない)DNA結合タンパク質を含む。DNA結合タンパク質が、それらの標的部位に結合するとき、それらのDNA結合タンパク質に連結された切断ドメインは、二量体化およびその後のゲノムの切断が生じることができるように、通常、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはTALENの対の間に置かれる。
したがって、人工ヌクレアーゼが、結合部位が5bpまたは6bp以外の長さだけ離れている内因性ゲノム配列を切断し得る、標的化された改変を可能にする方法および組成物がなおも必要とされている。種々の間隔で配列を標的化することができれば、切断できるゲノム標的の数が増加するだろう。また、種々の数の塩基対だけ離れた標的部位間の優先度を変化させられれば、より高い特異性で人工ヌクレアーゼを作用させることができるだろう。
DNA結合ドメインと切断ドメインとを連結することにより、ヌクレアーゼ、例えば、従来のリンカーと比べて標的部位の間隙(ギャップ)の優先度が変更されたヌクレアーゼを形成するための組成物が、本明細書中に開示される。これらのリンカーを含む融合タンパク質も記載される。本開示は、細胞内において、細胞性クロマチンを目的の領域において標的化切断するためおよび/または目的の所定領域における相同組換えのためにこれらの融合タンパク質およびその組成物を使用する方法も提供する。
本発明は、例えば、以下の項目も提供する。
(項目1)
N末端およびC末端を有するDNA結合ドメインであって、該DNA結合ドメインは、ヌクレオチド標的部位に結合する、DNA結合ドメイン;
N末端およびC末端を有するFokI切断ドメイン;ならびに
該DNA結合ドメインのC末端と該切断ドメインのN末端との間のリンカーであって、該リンカーは、PKPAN(配列番号289)、RARPLN(配列番号290);PMPPLA(配列番号291)またはPPPRP(配列番号292)からなる群より選択される配列を含む、リンカー
を含む、融合タンパク質。
(項目2)
前記リンカーが、ZC配列(配列番号2)をさらに含む、項目1に記載の融合タンパク質。
(項目3)
前記ZC配列が、前記リンカーのN末端に存在する、項目2に記載の融合タンパク質。
(項目4)
前記DNA結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質である、項目1〜3のいずれかに記載の融合タンパク質。
(項目5)
項目1〜4のいずれかに記載の2つの融合タンパク質を含む二量体。
(項目6)
前記二量体が、ホモ二量体またはヘテロ二量体である、項目5に記載の二量体。
(項目7)
項目1〜4のいずれかに記載の少なくとも1つの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(項目8)
項目1〜4のいずれかに記載の融合タンパク質、項目5もしくは6に記載の二量体または項目7に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
(項目9)
細胞内において細胞性クロマチンを目的の領域において標的化切断するための方法であって、該方法は、
細胞性クロマチンが該目的の領域において切断されるような条件下で、該細胞内においてヌクレアーゼ対を発現させる工程を含み、ここで、該ヌクレアーゼは、該目的の領域内の標的部位に結合し、さらに、少なくとも1つのヌクレアーゼは、項目1〜4のいずれかに記載の融合タンパク質を構成する、方法。
(項目10)
両方のヌクレアーゼが、項目1〜4のいずれかに記載の融合タンパク質を構成する、項目9に記載の方法。
(項目11)
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼに対する標的部位が、3〜20塩基対離れている、項目9または10に記載の方法。
(項目12)
ドナーポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程をさらに含み、ここで、該ドナーポリヌクレオチドの全部または一部は、切断後に前記目的の領域に組み込まれる、項目9〜11のいずれかに記載の方法。
(項目13)
ヌクレアーゼを作製するためのキットであって、該キットは、1つまたはそれを超える容器に含まれる、項目1〜4のいずれかに記載の融合タンパク質または項目7に記載のポリヌクレオチド、任意選択のハードウェアおよび該キットを使用するための指示書を含む、キット。
(項目14)
ドナーポリヌクレオチドをさらに含む、項目13に記載のキット。
(項目15)
N末端およびC末端を有するDNA結合ドメインであって、該DNA結合ドメインは、ヌクレオチド標的部位に結合する、DNA結合ドメイン;
N末端およびC末端を有するFokI切断ドメインであって、ここで、該N末端は、該N末端への1つまたはそれを超えるアミノ酸残基の付加;該N末端からの1つまたはそれを超えるアミノ酸残基の欠失;および該N末端における1つまたはそれを超えるアミノ酸残基の置換からなる群より選択される1つまたはそれを超えるアミノ酸改変を含む、FokI切断ドメイン;ならびに
該DNA結合ドメインのC末端と該切断ドメインのN末端との間のZCリンカー
を含む、融合タンパク質。
(項目16)
前記DNA結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質である、項目1に記載の融合タンパク質。
(項目17)
項目15または項目16に記載の2つの融合タンパク質を含む二量体。
(項目18)
前記二量体が、ホモ二量体またはヘテロ二量体である、項目17に記載の二量体。
(項目19)
項目15または項目16に記載の少なくとも1つの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
(項目20)
項目15または項目16に記載の融合タンパク質、項目17もしくは18に記載の二量体または項目19に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
(項目21)
細胞内において細胞性クロマチンを目的の領域において標的化切断するための方法であって、該方法は、
細胞性クロマチンが該目的の領域において切断されるような条件下で、該細胞内においてヌクレアーゼ対を発現させる工程を含み、ここで、該ヌクレアーゼは、該目的の領域内の標的部位に結合し、さらに、少なくとも1つのヌクレアーゼは、項目15または項目16に記載の融合タンパク質を構成する、方法。
(項目22)
両方のヌクレアーゼが、項目15または項目16に記載の融合タンパク質を構成する、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼに対する標的部位が、3〜20塩基対離れている、項目21または22に記載の方法。
(項目24)
ドナーポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程をさらに含み、ここで、該ドナーポリヌクレオチドの全部または一部は、切断後に前記目的の領域に組み込まれる、項目21〜23のいずれかに記載の方法。
(項目25)
ヌクレアーゼを作製するためのキットであって、該キットは、1つまたはそれを超える容器に含まれる、項目15もしくは項目16に記載の融合タンパク質または項目19に記載のポリヌクレオチド、任意選択のハードウェアおよび該キットを使用するための指示書を含む、キット。
(項目26)
ドナーポリヌクレオチドをさらに含む、項目25に記載のキット。
DNA結合ドメインと切断ドメインとを連結することにより人工ヌクレアーゼを形成するための組成物、および例えば、標的化切断に続く非相同末端結合によって;標的化切断に続く、外因性ポリヌクレオチド(細胞のヌクレオチド配列と相同な1つまたはそれを超える領域を含む)とゲノム配列との間の相同組換えによって;1つまたはそれを超える内因性遺伝子の標的化された不活性化によって、細胞のヌクレオチド配列を標的化変更するためにこれらのヌクレアーゼを使用する方法が、本明細書中に記載される。
本方法の実施、ならびに本明細書中に開示される組成物の調製および使用は、別段示されない限り、分子生物学、生化学、クロマチンの構造および解析、計算機化学、細胞培養、組換えDNAならびに当該分野の技術範囲内である関連分野における従来の手法を用いる。これらの手法は、文献において十分に説明されている。例えば、Sambrookら、MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989およびThird edition,2001;Ausubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley & Sons,New York,1987および定期的な改訂版;the series METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998;METHODS IN ENZYMOLOGY,Vol.304,“Chromatin” (P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),Academic Press,San Diego,1999;ならびにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,“Chromatin Protocols”(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999を参照のこと。
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、直鎖状または環状の立体配座であり、一本鎖または二本鎖の形態である、デオキシリボヌクレオチドポリマーまたはリボヌクレオチドポリマーのことを指す。本開示の目的では、これらの用語は、ポリマーの長さに関して限定すると解釈されるべきでない。これらの用語は、天然のヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および/またはリン酸の部分(例えば、ホスホロチオエート骨格)において改変されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成の特異性を有し;すなわち、Aのアナログは、Tと塩基対形成する。
DNA結合ドメイン(例えば、ジンクフィンガータンパク質、TALEなど)とヌクレアーゼ(例えば、切断ドメインまたは切断ハーフドメイン)とを融合する(連結する)アミノ酸配列が、本明細書中に記載される。
本明細書中に記載されるリンカー配列を有益に使用することにより、DNA結合ドメイン、例えば、ジンクフィンガータンパク質、TALE、ホーミングエンドヌクレアーゼ、CRISPR/Casおよび/またはTtagoガイドRNAが、ヌクレアーゼ切断ドメインまたはハーフドメインに連結され、それにより、特異的に標的化された天然に存在しないヌクレアーゼが形成される。
任意のDNA結合ドメインが、本明細書中に開示される方法において使用され得る。ある特定の実施形態において、DNA結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、そのジンクフィンガータンパク質は、最適な標的部位に結合するように操作されているという点において、天然に存在しない。例えば、Beerliら(2002)Nature Biotechnol.20:135−141;Paboら(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313−340;Isalanら(2001)Nature Biotechnol.19:656−660;Segalら(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632−637;Chooら(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411−416を参照のこと。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比べて、新しい結合特異性を有し得る。操作する方法としては、合理的なデザインおよび様々なタイプの選択が挙げられるが、これらに限定されない。合理的なデザインとしては、例えば、トリプレット(またはクワドルプレット)ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが挙げられ、ここで、トリプレットヌクレオチド配列またはクワドルプレットヌクレオチド配列の各々は、特定のトリプレット配列またはクワドルプレット配列に結合するジンクフィンガーの1つまたはそれを超えるアミノ酸配列に会合される。例えば、共同所有の米国特許第6,453,242号および同第6,534,261号(全体として参照により本明細書に援用される)を参照のこと。
本明細書中に記載されるヌクレアーゼ(例えば、ZFN、TALEN、CRISPR/Casヌクレアーゼ)は、あるヌクレアーゼ(切断ドメイン、切断ハーフドメイン)も含む。本明細書中に開示される融合タンパク質の切断ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、2002−2003 Catalogue,New England Biolabs,Beverly,MA;およびBelfortら(1997)Nucleic Acids Res.25:3379−3388を参照のこと。DNAを切断するさらなる酵素は、公知である(例えば、S1ヌクレアーゼ;マングビーンヌクレアーゼ;膵臓DNase I;小球菌ヌクレアーゼ;酵母HOエンドヌクレアーゼ;Linnら(eds.)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993も参照のこと)。1つまたはそれを超えるこれらの酵素(またはそれらの機能的フラグメント)は、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの起源として使用され得る。
上で詳細に説明されたように、本明細書中に記載されるようなリンカーを含む融合タンパク質のDNA結合ドメインは、任意の最適な配列に結合するように操作され得る。操作されたDNA結合ドメインは、天然に存在するDNA結合ドメインと比べて、新しい結合特異性を有し得る。
ある特定の実施形態において、本開示は、幹細胞のゲノムのヌクレアーゼ媒介性改変に関する。上で述べたように、外因性配列(「ドナー配列」または「ドナー」または「トランスジーン」とも呼ばれる)の挿入は、例えば、指定の領域の欠失のためおよび/もしくは変異遺伝子の修正のため、または野生型遺伝子の発現の増大のためである。そのドナー配列は、通常、それが配置されるゲノム配列と同一でないことは容易に明らかであるだろう。ドナー配列は、目的の位置における効率的なHDRを可能にするために相同な2つの領域に隣接した非相同配列を含み得るか、または非相同性特異的修復機構(non−homology directed repair mechanisms)によってインテグレートされ得る。さらに、ドナー配列は、細胞性クロマチンにおける目的の領域と相同でない配列を含むベクター分子を構成し得る。ドナー分子は、細胞性クロマチンと相同ないくつかの不連続な領域を含み得る。さらに、目的の領域に通常存在しない配列を標的化挿入するために、前記配列は、ドナー核酸分子に存在し得、目的の領域における配列に相同な領域に隣接し得る。
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびに本明細書中に記載されるタンパク質および/またはポリヌクレオチドを含む組成物は、任意の好適な手段によって送達され得る。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼおよび/またはドナーは、インビボにおいて送達される。他の実施形態において、ヌクレアーゼおよび/またはドナーは、患者へのエキソビボ送達において有用な改変された細胞を提供するために、単離された細胞(例えば、自己または異種の幹細胞)に送達される。
本明細書中に記載される任意のリンカーを含むキットおよび/または上記方法のいずれかを実施するためのキットもまた提供される。それらのキットは、代表的には、本明細書中に記載されるようなリンカー配列(または本明細書中に記載されるようなリンカーをコードするポリヌクレオチド)を含む。そのキットは、リンカーだけを供給してもよいし、最適なDNA結合ドメインおよび/またはヌクレアーゼが容易に挿入され得るベクターを提供してもよい。それらのキットは、細胞、細胞を形質転換するための緩衝液、細胞用の培養液および/またはアッセイを行うための緩衝液も含み得る。代表的には、それらのキットは、そのキットの他の構成要素に付着されたまたはその他の方法で伴う任意の材料(例えば、指示書、包装または広告リーフレット)を含むラベルも含む。
開示されるリンカーは、切断ドメインを有する操作されたDNA結合ドメインと連結して、DNAを切断するためのヌクレアーゼを形成するために都合よく使用される。本明細書中に記載されるようなリンカーは、切断のために使用されるヌクレアーゼ対の標的部位が、様々な間隔であるとき、例えば、標的部位が5または6塩基対ではない塩基対だけ離れている(例えば、7、8、9塩基対またはそれを超える塩基対だけ離れている)とき、DNAの切断を可能にする。切断は、ゲノム配列(例えば、細胞性クロマチンにおける目的の領域)を相同であるが同一でない配列で置き換えるため(すなわち、標的化された組換え);ゲノム内の1つまたはそれを超える部位においてDNAを切断し、次いで、その切断部位を非相同末端結合(NHEJ)によってつなげることによってゲノム配列を欠失させるため;相同組換えを促進する細胞性因子についてスクリーニングするため;および/または野生型配列を変異体配列で置き換えるため、もしくは一方の対立遺伝子を異なる対立遺伝子に変換するための、細胞性クロマチンにおける目的の領域(例えば、ゲノム内の、例えば、変異体または野生型の遺伝子内の、所望のまたは所定の部位)での切断であり得る。そのような方法は、例えば、米国特許第7,888,121号(全体として参照により本明細書に援用される)に詳細に記載されている。
ヒトCCR5遺伝子座を標的とするジンクフィンガーヌクレアーゼ構築物を、米国特許第7,951,925号に開示されているように調製した。「野生型構築物」は、「ZC」リンカーを含んだ。
A.CCR5を標的とするZFN
CCR5を標的とするZFN SBS#8266をコードする構築物を、まず、米国特許第8,563,314号に記載されているような酵母Mel−Iレポーターシステムにおいて試験した。特に、3、4、5、6、7または8bp離れたSBS#8266標的部位の逆方向反復を有する酵母株を使用することにより、構築物を特徴づけた。
6bpギャップを有する標的部位を使用し、Amaxa Shuttleによって、mROSAを標的とするZFNの組み合わせ(例えば、米国特許公開番号2007/0134796を参照のこと)でNeuro2A細胞をトランスフェクトした。それらの対の一方のZFNは、野生型リンカー(「ZC」)を含み、他方は、野生型リンカーまたは本明細書中に記載されるようなL7aリンカーを含んだ。上に記載されたように、サンプルをトランスフェクションの3日後に回収し、CEL−I解析に供した。
6bpギャップを有する標的部位を使用し、Amaxa Shuttleによって、ラットIgMを標的とするZFNの組み合わせ(例えば、米国公開番号20100218264を参照のこと)でラットC6細胞をトランスフェクトした。それらの対の一方のZFNは、野生型リンカー(「ZC」)を含み、他方は、野生型リンカーまたはL7aリンカーを含んだ。上記および米国特許公開番号2007/0134796に記載されているように、サンプルをトランスフェクションの9日後に回収し、CEL−I解析に供した。
さらなるリンカーを、Barbasら(2010)J.Mol.Biol.400:96−107から改変された細菌選択系から作製した。簡潔には、ZFNをコードするプラスミド(ZFNの発現がアラビノース誘導性プロモーターによって駆動される)、およびT7プロモーターから細菌ccdBトキシンを発現し、ZFN標的部位を含むプラスミドで細菌を形質転換した。図2を参照のこと。この系は、約108という複雑度および高ストリンジェンシーオプション(生存に必要な>100切断事象)を有する非常に大きなライブラリーを検索する能力を可能にした。
ヘテロ二量体標的部位(米国特許第7,951,925号に記載されているような8166および8266ZFN)間のギャップを5〜16塩基対(例えば、5、6、7、8、15または16bp)の新しいギャップで置き換えるようにCCR5遺伝子座において操作された6つのバリアントK562細胞株において、選択された候補(リンカーを有するZFN)を内因性標的の改変についてスクリーニングした。リンカーカセット(約80/選択=合計480)を、CCHC構造を有するCCR5 ZFN発現ベクターにおいてL0リンカーの代わりに使用し、構築物を適切なK562細胞にトランスフェクトした。図6を参照のこと。上記および米国特許公開番号2007/0134796に記載されているように、Cel1アッセイを使用して活性を評価した。
群1:L8c[ZFP]HAQRC−NGSYAPMPPLALASPELEEKKSEL[wt FokI](配列番号229)
群2:L8c[ZFP]HAQRC−NGSYAPMPPLALASPELEEKKSEL[eHiFi FokI](配列番号229)
群3:L8n[ZFP]HTKIH−NGSYAPMPPLALASPELEEKKSEL[eHiFi FokI](配列番号230)
群4:L8o[ZFP]HTKIH−GGSYAPMPPLALASPELEEKKSEL[eHiFi FokI](配列番号231)
群5:L8m[ZFP]HTKIH−−GSYAPMPPLALASPELEEKKSEL[eHiFi FokI](配列番号232)
群6:L8p[ZFP]HTKIHLRGSYAPMPPLALASPELEEKKSEL[eHiFi FokI](配列番号233)
「L7a」リンカーは、C2H2とCCHCの両方のZFP構成において7bpギャップ部位を標的にするためにZFP−FokIリンカーとして現在使用されている。図9Aおよび9Bに示されているリンカーが、CCHC ZFP構成の中に同定されたので、7bpギャップ部位を標的にするZFPのC2H2構成においてさらなる研究を行った。
ZFPとFokIヌクレアーゼドメインとの間の従来のジャンクション配列は、「−−−HTKIHLRGSQLVKSELEEK−−−」(配列番号259)である。ZFN活性は、2つのZFP結合部位間のギャップの長さおよびその結合部位に対するZFPの親和性をはじめとした多くの因子によって影響され得るので、本発明者らは、ZFN対の切断効率が、その長さおよび/またはジャンクション部位の組成を変更することによって調節されて、その2つのFokI切断ドメイン間のヘテロ二量体相互作用が最適化され得るかを試験した。図14を参照のこと。C2H2またはC3H構造のZFNを使用することができる。
Claims (17)
- N末端およびC末端を有するDNA結合ドメインであって、該DNA結合ドメインは、ヌクレオチド標的部位に結合する、DNA結合ドメイン;
N末端残基QLVKSが欠失された切断型FokI切断ドメイン;ならびに
該DNA結合ドメインのC末端と該切断ドメインのN末端との間のリンカーであって、該リンカーは、NGICPPPRPRTSPP;TGTAPIEIPPEVYP;NGSYAPMPPLALASP;PGIYTAPTSRPTVPP;NGSQTPKRFQPTHPSA;TGLMPPSHPRQPIHINF;TGTVHTSPICPQTYP;TGSGTPTRPHPPLPP;HLPKPANPFPLD;HRDGPRNLPPTSPP;HRLPDSPTALAPDTL;DPNSPISRARPLNPHP;YGPRPTPRLRCPIDSLIFR;HCPASRPIHP;GLQSLIPQQLL;GLQPTVNHEYNN;およびPANIHSLSSPPPLからなる群より選択される配列である、リンカー
を含む、融合タンパク質。 - 前記リンカーが、ZC配列(LRGS)(配列番号35)をさらに含む、請求項1に記載の融合タンパク質。
- 前記ZC配列が、前記リンカーのN末端に存在する、請求項2に記載の融合タンパク質。
- 前記DNA結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質、TALエフェクタードメインまたはCasドメインである、請求項1〜3のいずれかに記載の融合タンパク質。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の2つの融合タンパク質を含む二量体。
- 前記二量体が、ホモ二量体またはヘテロ二量体である、請求項5に記載の二量体。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の少なくとも1つの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の融合タンパク質、請求項5もしくは6に記載の二量体または請求項7に記載のポリヌクレオチドを含む細胞。
- 細胞内において細胞性クロマチンを目的の領域において標的化切断するためのインビトロ方法であって、該方法は、
細胞性クロマチンが該目的の領域において切断されるような条件下で、該細胞内においてヌクレアーゼ対を発現させる工程を含み、ここで、該ヌクレアーゼは、該目的の領域内の5〜8塩基対だけ離れた標的部位に結合し、さらに、少なくとも1つのヌクレアーゼは、請求項1〜4のいずれかに記載の融合タンパク質を構成する、方法。 - 非ヒト細胞内において細胞性クロマチンを目的の領域において標的化切断するための方法であって、該方法は、
細胞性クロマチンが該目的の領域において切断されるような条件下で、該細胞内においてヌクレアーゼ対を発現させる工程を含み、ここで、該ヌクレアーゼは、該目的の領域内の5〜8塩基対だけ離れた標的部位に結合し、さらに、少なくとも1つのヌクレアーゼは、請求項1〜4のいずれかに記載の融合タンパク質を構成する、方法。 - 両方のヌクレアーゼが、請求項1〜4のいずれかに記載の融合タンパク質を構成する、請求項9または10に記載の方法。
- 前記ヌクレアーゼに対する標的部位が、7または8塩基対離れている、請求項9〜11のいずれかに記載の方法。
- ドナーポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程をさらに含み、ここで、該ドナーポリヌクレオチドの全部または一部は、切断後に前記目的の領域に組み込まれる、請求項9〜12のいずれかに記載の方法。
- 標的遺伝子を切断するヌクレアーゼを作製するためのキットであって、該キットは、1つまたはそれを超える容器に含まれる、請求項1〜4のいずれかに記載の融合タンパク質または請求項7に記載のポリヌクレオチド、任意選択のハードウェアおよび1つまたはそれを超える該融合タンパク質または該ポリヌクレオチドを使用して該ヌクレアーゼを作製するための指示書を含む、キット。
- 前記ヌクレアーゼの切断後に前記標的遺伝子に組み込まれるドナーポリヌクレオチドをさらに含む、請求項14に記載のキット。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の融合タンパク質、請求項5もしくは6に記載の二量体、請求項7に記載の1つもしくはそれを超えるポリヌクレオチド、および/または請求項8に記載の1つもしくはそれを超える細胞を含む医薬組成物。
- 細胞内において細胞性クロマチンを目的の領域において標的化切断するための組成物であって、請求項1〜4のいずれかに記載の融合タンパク質、請求項5または6に記載の二量体、請求項7に記載の1つまたはそれを超えるポリヌクレオチドを含む組成物。
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