JP7256739B2 - 肝臓遺伝子のモジュレーション - Google Patents
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Description
本出願は、2016年9月7日に出願された米国仮出願番号第62/384,428号の利益を主張しており、その開示は、その全体が参考として本明細書によって援用される。
本開示は、遺伝子治療、特に疾患関連内因性遺伝子のノックアウト、および阻害性タンパク質の発現のための肝臓への導入遺伝子コード構築物の標的化送達の分野にある。
遺伝子治療は、1つもしくは複数の不活性化された遺伝子を有するように、および/またはその細胞において以前には産生されなかった産物を細胞に発現させるように細胞を遺伝子操作するため使用され得る(例えば、導入遺伝子挿入を介しておよび/または内因性配列の修正を介して)。導入遺伝子挿入の使用の例には、1つもしくは複数の新規治療的タンパク質をコードする1つもしくは複数の遺伝子の挿入、細胞もしくは個体において欠如しているもしくは機能障害性であるタンパク質をコードするコード配列の挿入、変異型遺伝子配列を含有する細胞における野生型遺伝子もしくはその断片の挿入、および/またはmicroRNAもしくはsiRNAなどの構造的核酸をコードする配列の挿入が含まれる。内因性遺伝子配列の「修正」の有用な適用の例には、疾患関連遺伝子変異の変更、スプライス部位をコードする配列における変更、調節配列における変更、および/またはタンパク質の構造的特徴をコードする配列の標的化変更が含まれる。
本発明は、肝臓におけるPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/もしくはHAO1遺伝子の発現をモジュレートするための組成物および方法、ならびに/または肝臓細胞からの遺伝子産物の特異的阻害剤の発現後に血清におけるそれらの遺伝子産物の量および/もしくは活性をモジュレートするための組成物および方法を記載する。これらの遺伝子についての遺伝子発現のモジュレーションは、1つもしくは複数の操作されたヌクレアーゼを使用したPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/もしくはHAO1遺伝子の遺伝子改変(例えば、遺伝子ノックアウトを生じる、遺伝子に対する配列改変を生じる切断)を介して、ならびに/またはPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/もしくはHAO1遺伝子発現のモジュレーター(活性化因子または阻害剤)、例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/もしくはHAO1遺伝子の発現を調節する(オフにするもしくは下方調節する、またはオンにするもしくは上方調節する)転写因子の導入を介して達成され得る。遺伝子発現のモジュレーターは、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1およびHAO1遺伝子に対する直接的作用によって、ならびに/または間接的作用(例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/もしくはHAO1阻害剤の活性化)によって作用し得る。
特に肝臓細胞における、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子の発現をモジュレートする方法および組成物、ならびにPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1阻害性導入遺伝子の産生のためのカセットが、本明細書に開示される。PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1発現のモジュレーションは、遺伝子をノックアウトするための標的化ヌクレアーゼ(ZFN、TALEN、Ttago、CRISPR/Cas)、および/または内因性PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1もしくはHAO1発現を阻害するための転写因子(ZFP-TF、TALE-TF、RNAガイドされるCas-TF)の使用によって達成され得る。遺伝子モジュレーター(ポリヌクレオチドおよび/またはタンパク質)を含むおよび/または遺伝子モジュレーターによってなされた遺伝子改変を含む(が、遺伝子モジュレーター自体は含まない)細胞、ならびにこれらの細胞の子孫である細胞もまた提供される。本発明の方法および組成物は、肝臓特異的発現構築物を介して、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1阻害性導入遺伝子を発現させるために使用され得る。本明細書に記載される組成物(遺伝子モジュレーターを含む構築物、タンパク質、および/または細胞)は、in vivoまたはin vitroで肝臓細胞に任意の導入遺伝子を送達し得、in vivoおよび/またはex vivo治療を介した1つまたは複数の導入遺伝子の提供によって寛解され得る任意の疾患または障害の処置および/または予防のために使用され得る。
本明細書に開示される方法の実施、ならびに組成物の調製および使用は、特に示さない限り、当業者の技術範囲内の、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えDNAならびに関連分野における従来技術を用いる。これらの技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Sambrookら MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年および第3版、2001年;Ausubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、John Wiley & Sons、New York、1987年および定期的更新;シリーズMETHODS IN ENZYMOLOGY、Academic Press、San Diego;Wolffe、CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION、第3版、Academic Press、San Diego、1998年;METHODS IN ENZYMOLOGY、第304巻、「Chromatin」(P.M. WassarmanおよびA. P. Wolffe編)、Academic Press、San Diego、1999年;ならびにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY、第119巻、「Chromatin Protocols」(P.B. Becker編)Humana Press、Totowa、1999年を参照のこと。
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、相互交換可能に使用され、直鎖または環状コンフォメーションの、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関しての限定として解釈すべきではない。用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および/またはリン酸部分(例えば、ホスホロチオエート骨格)において改変されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対合特異性を有する;即ち、AのアナログはTと塩基対合する。
対象への発現カセットの投与(例えば、末梢または肝静脈送達)後にin vivoを含む肝臓細胞において導入遺伝子(例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子の1つまたは複数のモジュレーター)の発現を指示することにおける使用のための発現カセット(構築物)が、本明細書に記載される。細胞における使用のためのPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子の野生型cDNAコピーを含む発現カセット(構築物)であって、内因性変異体バージョンのPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子が、上記1つまたは複数のモジュレーターによってノックアウトされている、発現カセット(構築物)もまた本明細書に記載される。発現構築物は、エピソームで維持され、染色体外で導入遺伝子の発現を駆動し得(米国特許出願公開第20170119906号を参照のこと)、あるいは、発現構築物は、例えば、ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みによって、肝臓細胞のゲノム中に組み込まれ得る。
本明細書に記載される構築物は、任意の導入遺伝子の肝送達のために使用され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子モジュレーターは、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子を不活性化する1つまたは複数のヌクレアーゼを含む。さらに、ヌクレアーゼは、標的遺伝子中に、例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1もしくはHAO1遺伝子および/またはセーフハーバー遺伝子(例えば、アルブミン)中に、1つまたは複数の導入遺伝子を組み込むためにも使用され得る。好ましくは、導入遺伝子構築物の組み込みは、1つまたは複数のヌクレアーゼ(例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(「ZFN」)、TALEN、TtAgo、CRISPR/Casヌクレアーゼ系およびホーミングエンドヌクレアーゼ)による標的遺伝子の切断後に標的化され、構築物は、相同組換え修復(HDR)によって、または非相同末端結合(NHEJ)駆動性プロセスの間の末端捕捉によって組み込まれる。例えば、全ての目的のためにその開示の全体が本明細書で参照により組み込まれる、米国特許第9,255,250号;同第9,200,266号;同第9,045,763号;同第9,005,973号;同第9,150,847号;同第8,956,828号;同第8,945,868号;同第8,703,489号;同第8,586,526号;同第6,534,261号;同第6,599,692号;同第6,503,717号;同第6,689,558号;同第7,067,317号;同第7,262,054号;同第7,888,121号;同第7,972,854号;同第7,914,796号;同第7,951,925号;同第8,110,379号;同第8,409,861号;米国特許出願公開第20030232410号;同第20050208489号;同第20050026157号;同第20050064474号;同第20060063231号;同第20080159996号;同第201000218264号;同第20120017290号;同第20110265198号;同第20130137104号;同第20130122591号;同第20130177983号;同第20130196373号および同第20150056705号を参照のこと。
ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、TALE DNA結合ドメイン、またはメガヌクレアーゼ由来のDNA結合ドメイン、またはCRIPSR/Cas DNA結合複合体(例えば、シングルガイドRNA)が含まれるがこれらに限定されない任意のDNA結合ドメインが、本明細書に記載されるヌクレアーゼおよび転写因子において使用され得る。ある特定の実施形態では、人工転写因子または人工ヌクレアーゼのDNA結合ドメインは、本明細書に開示される標的部位のいずれかに示される、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24またはそれよりも多くのヌクレオチドの標的部位に結合する。
DNA結合ドメインは、本明細書に記載される遺伝子モジュレーション(例えば、抑圧)において有用な任意の機能的ドメインに作動可能に連結し得る。従って、異種調節(機能的)ドメイン(またはその機能的断片)と関連した本明細書に記載されるDNA結合ドメイン(例えば、ZFPまたはTALE、CRISPR/Cas構成成分、例えばシングルガイドRNA)を含む人工ヌクレアーゼおよび転写因子もまた提供される。一般的なドメインには、例えば、転写因子ドメイン(活性化因子、リプレッサー、共活性化因子、共リプレッサー)、サイレンサー、癌遺伝子(例えば、myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mosファミリーのメンバーなど);DNA修復酵素ならびにそれらの関連の因子およびモディファイアー;DNA再編成酵素ならびにそれらの関連の因子およびモディファイアー;クロマチン関連タンパク質およびそれらのモディファイアー(例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ);ならびにDNA改変酵素(例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ)ならびにそれらの関連の因子およびモディファイアーが含まれる。従って、本発明は、本明細書に記載されるDNA結合ドメインおよび転写調節ドメインを含む人工転写因子、ならびにDNA結合ドメインおよび1つまたは複数のヌクレアーゼドメインを含む人工ヌクレアーゼを提供する。
種 PAM
S.pyogenes NGG
S.pyogenes NAG
S.mutans NGG
S.thermophilius NGGNG
S.thermophilius NNAAAW
S.thermophilius NNAGAA
S.thermophilius NNNGATT
C.jejuni NNNNACA
N.meningitides NNNNGATT
P.multocida GNNNCNNA
F.novicida NG
上に詳細に記載したように、本明細書に記載される人工ヌクレアーゼおよび/または転写因子のDNA結合ドメインは、選択された任意の配列に結合するように操作され得る。操作されたDNA結合ドメインは、天然に存在するDNA結合ドメインと比較して、新規の結合特異性を有し得る。ある特定の実施形態では、DNA結合ドメインは、本明細書(例えば、表1、3、5、7、11、13、14および16)に示される標的部位の配列または12もしくはそれよりも多くの塩基対(連続または非連続)に結合するDNA結合ドメインを含め、本明細書に記載される肝臓特異的遺伝子内の配列、例えば、標的部位(典型的には、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21またはさらにはそれよりも多くの塩基対)に結合する。操作方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的設計には、例えば、三つ組(または四つ組)ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列を結合するジンクフィンガーの1つまたは複数のアミノ酸配列と会合する。例えば、それらの全体が本明細書に参照により組み込まれる、共有の米国特許第6,453,242号および同第6,534,261号を参照のこと。TALエフェクタードメインおよびシングルガイドRNAの合理的設計もまた公知である。例えば、米国特許第8,771,985号および米国特許出願公開第20150056705号を参照のこと。
ヌクレアーゼ、転写因子および/または導入遺伝子(例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1阻害剤)は、任意の適切な手段によって任意の細胞型中に、好ましくは肝臓に(全身的にまたは肝送達を介して)、in vivoまたはex vivoで送達され得る。同様に、標的化組み込みのためにヌクレアーゼと組み合わせて使用される場合、ヌクレアーゼは、例えば、非ウイルスベクター、ウイルスベクターを使用してポリヌクレオチドおよび/もしくはタンパク質形態で、ならびに/またはRNA形態で、例えばmRNAとして、送達され得る。
本明細書に開示される方法および組成物は、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1阻害性導入遺伝子の提供を介するもの(転写因子、ヌクレアーゼなど)を含め、内因性PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子の発現をモジュレートすることによって、任意のPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1関連障害に対する治療を提供する際に有用である。さらに、方法および組成物は、かかる障害の処置または予防のための、変異体PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子のノックアウト、および野生型PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1 cDNAの提供のための方法を提供する。細胞は、in vivoで改変され得るまたはex vivoで改変され、引き続いて、対象に投与され得る。従って、方法および組成物は、かかるPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1関連障害の処置および/または予防を提供する。従って、本明細書に記載される組成物および方法は、例えば、TTR媒介性アミロイドーシス、A1AT欠損症、遺伝性血管性浮腫、家族性高コレステロール血症/スタチン耐性高コレステロール血症および高シュウ酸尿症を含む障害を処置または予防するために使用され得る。
PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子をモジュレートする組成物の設計、構築および一般的特徴付け
(実施例2)
PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子発現をモジュレートする組成物の設計、構築および一般的特徴付け
I.PCSK9のヌクレアーゼ標的化
II.SERPINAのヌクレアーゼ標的化
III.TTRのヌクレアーゼ標的化
IV.HAO1のヌクレアーゼ標的化
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
内因性PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子の発現が野生型と比較して変更された、肝臓細胞。
(項目2)
前記内因性遺伝子の配列が、DNA結合ドメインおよび切断ドメインを含む少なくとも1つのヌクレアーゼを使用して前記遺伝子を切断することによって変更される、項目1に記載の肝臓細胞。
(項目3)
前記DNA結合ドメインが、前記内因性遺伝子中の標的部位に結合する、項目2に記載の肝臓細胞。
(項目4)
前記標的部位が、表1、3、5、7、11、13、14および16に示される標的部位の少なくとも12ヌクレオチドを含む、項目3に記載の肝臓細胞。
(項目5)
外因性配列を、切断された前記内因性遺伝子中に組み込むことをさらに含む、項目2に記載の肝臓細胞。
(項目6)
前記外因性配列が、導入遺伝子を含む、前記遺伝子中に変異を導入する、または前記内因性遺伝子中の変異を修正する、項目5に記載の肝臓細胞。
(項目7)
DNA結合ドメインおよび転写調節ドメインを含む人工転写因子をさらに含み、前記人工転写因子が、前記内因性遺伝子の発現を変更する、項目1に記載の肝臓細胞。
(項目8)
内因性PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子中の標的部位に結合するDNA結合ドメイン、ならびに機能的ドメインを含む、融合分子。
(項目9)
前記DNA結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質、TALエフェクタードメインタンパク質またはシングルガイドRNA(sgRNA)を含む、項目8に記載の融合分子。
(項目10)
前記機能的ドメインが、転写調節ドメインまたは切断ドメインを含む、項目8または9に記載の融合分子。
(項目11)
項目8から10のいずれかに記載の融合分子をコードするポリヌクレオチドであって、mRNAの形態であるか、またはウイルスもしくは非ウイルスベクター上にある、ポリヌクレオチド。
(項目12)
項目1から7のいずれか一項に記載の肝臓細胞、または項目8から10のいずれかに記載の融合分子、または項目11に記載のポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
(項目13)
TTR媒介性アミロイドーシス、A1AT欠損症、遺伝性血管性浮腫、家族性高コレステロール血症/スタチン耐性高コレステロール血症および高シュウ酸尿症の処置のための、項目12に記載の医薬組成物の使用。
(項目14)
項目1から7のいずれか一項に記載の肝臓細胞、または項目8から10のいずれかに記載の融合分子、または項目11に記載のポリヌクレオチドを含む、キット。
Claims (17)
- 前記内因性PCSK9遺伝子の配列が、一対のジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を使用して前記遺伝子を切断することによって変更され、前記対の前記ジンクフィンガーヌクレアーゼの少なくとも一方が、請求項1に記載のジンクフィンガータンパク質および切断ドメインを含む、請求項1に記載の肝臓細胞。
- 前記ZFN対が、配列番号1と配列番号2;配列番号3と配列番号4;配列番号5と配列番号6;配列番号7と配列番号8;配列番号9と配列番号10;または配列番号11と配列番号12中の対になった標的部位に結合する、請求項2に記載の肝臓細胞。
- 切断された前記内因性PCSK9遺伝子中に組み込まれた外因性配列をさらに含む、請求項2に記載の肝臓細胞。
- 前記外因性配列が、導入遺伝子を含む、前記遺伝子中に変異を導入する、または前記内因性PCSK9遺伝子中の変異を修正する、請求項4に記載の肝臓細胞。
- 請求項1に記載のジンクフィンガータンパク質および転写調節ドメインを含む人工転写因子をさらに含み、前記人工転写因子が、前記内因性PCSK9遺伝子の発現を減少させる、請求項1に記載の肝臓細胞。
- 前記機能的ドメインが、転写調節ドメインまたは切断ドメインを含む、請求項7に記載の融合分子。
- 前記機能的ドメインが切断ドメインを含む、請求項8に記載の融合分子。
- 前記切断ドメインがFokI切断ドメインを含む、請求項9に記載の融合分子。
- 前記転写調節ドメインが、抑圧ドメインまたは活性化ドメインを含む、請求項8に記載の融合分子。
- 前記抑圧ドメインが、KRAB A/B、KOX、TGF-ベータ誘導性初期遺伝子(TIEG)、v-erbA、SID、MBD2、MBD3、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B、RbまたはMeCP2を含む、請求項11に記載の融合分子。
- 前記活性化ドメインが、HSV VP16活性化ドメイン、核ホルモン受容体;または核因子カッパBlのp65サブユニットを含む、請求項11に記載の融合分子。
- 請求項7から13のいずれかに記載の融合分子をコードするポリヌクレオチドであって、mRNAの形態であるか、またはウイルスもしくは非ウイルスベクター上にある、ポリヌクレオチド。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の肝臓細胞、または請求項7から13のいずれかに記載の融合分子、または請求項14に記載のポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
- TTR媒介性アミロイドーシス、A1AT欠損症、遺伝性血管性浮腫、家族性高コレステロール血症/スタチン耐性高コレステロール血症および高シュウ酸尿症を処置するための、請求項15に記載の医薬組成物。
- 請求項1から6のいずれか一項に記載の肝臓細胞、または請求項7から13のいずれかに記載の融合分子、または請求項14に記載のポリヌクレオチドを含む、キット。
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