JP2024533312A - Ｓｅｒｐｉｎａ調節組成物及び方法 - Google Patents

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ナサニエル ロケ，
カルロス サンチェス，
バレット イーサン スタインバーグ，
ウィリアム エドワード サロモン，
ロバート ジェイムズ シトリク，
ウィリアム クルベス，
ルチアーノ エンリケ アポーニ，
ジャン ワン，
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Abstract

本開示は、例えば、細胞、組織又は対象内のＤＮＡ配列における１つ以上の位置で宿主細胞のゲノムを標的化、編集、改変又は操作するための組成物、システム及び方法を提供する。アルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）を処置するための遺伝子改変システムが記載される。

Description

配列表
本出願は、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２６に準拠したＸＭＬで電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年１０月３１日に作成された前記ＸＭＬコピーは、Ｖ２０６５－７０２４ＷＯ＿ＳＬ．ＸＭＬという名称であり、サイズが３１，１１５，６７５ｋｂである。
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年９月８日に出願された米国仮特許出願第６３／２４１，９７０号、２０２１年１０月６日に出願された米国仮特許出願第６３／２５３，０８７号及び２０２２年１月２７日に出願された米国仮特許出願第６３／３０３，９０５号の利益を主張する。前述の出願の内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ゲノムへの目的の核酸の組込みは、挿入事象を促進するための特殊なタンパク質の非存在下において低頻度で起こり、且つ部位特異性がほとんどない。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のようないくつかの存在する手法は、宿主修復経路に依存する小さい編集により適しており、長い配列の組込みには有効性が低い。Ｃｒｅ／ｌｏｘＰといった他の既存の手法は、ｌｏｘＰ部位をゲノムに挿入する第１ステップ、次いで目的の配列をｌｏｘＰ部位に挿入する第２ステップを必要とする。当技術分野では、改善された組成物（例えばタンパク質及び核酸）及びゲノム内に目的の配列を挿入、変更又は削除する方法が必要とされている。
ＡＡＴＤは、低いＡＡＴの循環レベルを特徴とする。ＡＡＴは主に肝細胞で生成され、血液中に分泌されるが、肺上皮細胞及び特定の白血球を含む他の細胞型でも生成される。ＡＡＴは炎症細胞から分泌されるいくつかのセリンプロテアーゼ（最も著しくは、好中球エラスターゼ［ＮＥ］、プロテイナーゼ３、カテプシンＧ）を阻害し、従って特に炎症の期間中、肺などの器官をプロテアーゼ誘発性の損傷から保護する。
ＡＡＴの最も一般的な２つの臨床的バリアントは、Ｅ２６４Ｖ（ＰｉＳ）とＥ３４２Ｋ（ＰｉＺ）の対立遺伝子である。臨床的一塩基バリアントＥ３４２Ｋ（ＰｉＺ）は、構造的に不安定な且つ／又は不活性なＡＡＴタンパク質を生じ、その結果、肝臓に毒性を、肺に不活性を引き起こす。遺伝は、常染色体共優性である。ＡＡＴＤ患者の過半数が、変異Ｅ３４２Ｋのコピーを少なくとも１つ保有している。
ＡＡＴＤに最も一般的に関連する変異は、ＡＡＴタンパク質をコードするＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内のグルタミン酸のリジンへの置換（Ｅ３４２Ｋ）である。Ｅ３４２Ｋ変異は、ＡＡＴタンパク質のベータシートと反応中心ループ（ＲＣＬ）の間のヒンジに位置し、ループシート二量体を生じ、これは後に伸長して、生合成中に肝細胞の粗面小胞体（ｒＥＲ）内でＡＡＴ－Ｚタンパク質を凝集させる、ループシートポリマーの長鎖を形成することができる。この変異はＺ変異又はＺ対立遺伝子として知られ、翻訳されたタンパク質の誤ったミスフォールドを引き起こし、その結果、血流中に分泌されなくなる。その結果、Ｚ対立遺伝子（ＰｉＺＺ）のホモ接合体の個体の循環ＡＡＴレベルは著しく低下し、変異Ｚ－ＡＡＴタンパク質のおよそ１５％のみが正しくフォールディングされ、細胞から分泌される。Ｚ変異の更なる結果は、分泌されたＺ－ＡＡＴが野生型タンパク質と比較して低下した活性を有し、通常の抗プロテアーゼ活性の４０％～８０％であることである（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｈｏｒａｃｉｃ ｓｏｃｉｅｔｙ／Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｏｃｉｅｔｙ，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２００３；１６８（７）：８１８－９００；及びＯｇｕｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９８７；８０（５）：１３６６－７４）。
ＰｉＺＺ遺伝子型に関連する２つの疾患表現型が存在する。肝細胞内の重合Ｚ－ＡＡＴタンパク質の蓄積により、細胞ストレス、炎症、線維症、肝硬変、及び肝細胞癌（ＨＣＣ）を引き起こし得る機能獲得型細胞毒性並びに新生児肝疾患が患者の１２％に生じる。この蓄積は自然に軽減し得るが、少数の小児では致命的となることもある。機能喪失表現型は、ＡＡＴの全身レベルの低下から生じ、下気道の結合組織のプロテアーゼ消化の増加につながる。結合組織及び肺胞内層の過剰なプロテアーゼ消化により肺の弾力性及び肺機能が低下し、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の特徴である肺気腫を引き起こす。この影響はＰｉＺＺ個体において深刻であり、典型的には中年期に現れ、生活の質の低下及び寿命の短縮（平均６８歳）につながる（Ｔａｎａｓｈ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃｈｒｏｎ Ｏｂｓｔｒｕｃｔ Ｐｕｌｍ Ｄｉｓ．２０１６；１１：１６６３－９）。この影響は喫煙するＰｉＺＺ個体ではより顕著であり、寿命が更に短くなる（５８年）。Ｐｉｉｔｕｌａｉｎｅｎ ａｎｄ Ｔａｎａｓｈ，ＣＯＰＤ ２０１５；１２（１）：３６－４１。ＰｉＺＺ個体は、臨床的に関連するＡＡＴＤ肺疾患を有する個体の大部分を占める。
ＡＡＴＤのより軽度の形態は、Ｚ対立遺伝子がＳ対立遺伝子と組み合わされたＳＺ遺伝子型に関連している。Ｓ対立遺伝子は、循環ＡＡＴレベルの若干の低下と関連しているが、肝細胞に細胞毒性を引き起こさない。結果は、臨床的に重大な肺疾患であるが、肝疾患ではない。Ｆｒｅｇｏｎｅｓｅ ａｎｄ Ｓｔｏｌｋ，Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．２００８；３３：１６。ＺＺ遺伝子型と同様に、ＳＺ遺伝子型を有する対象における循環ＡＡＴの欠乏により、経時的に肺組織を劣化させ、特に喫煙者において肺気腫を引き起こし得る、制御されないプロテアーゼ活性が生じる。
Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｈｏｒａｃｉｃ ｓｏｃｉｅｔｙ／Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｏｃｉｅｔｙ，Ａｍ Ｊ Ｒｅｓｐｉｒ Ｃｒｉｔ Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．２００３；１６８（７）：８１８－９００ Ｏｇｕｓｈｉ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１９８７；８０（５）：１３６６－７４ Ｔａｎａｓｈ ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃｈｒｏｎ Ｏｂｓｔｒｕｃｔ Ｐｕｌｍ Ｄｉｓ．２０１６；１１：１６６３－９ Ｐｉｉｔｕｌａｉｎｅｎ ａｎｄ Ｔａｎａｓｈ，ＣＯＰＤ ２０１５；１２（１）：３６－４１ Ｆｒｅｇｏｎｅｓｅ ａｎｄ Ｓｔｏｌｋ，Ｏｒｐｈａｎｅｔ Ｊ Ｒａｒｅ Ｄｉｓ．２００８；３３：１６
ＡＡＴＤに対する処置の選択肢は限られており、現在のところ治癒法は存在しない。新生児患者及び肝疾患が進行した患者のうち少数が肝移植を受ける。重大な肺疾患を有するか、又はその発症の兆候を示すＡＡＴ欠乏個体に対する現在の標準治療は、増強療法又はタンパク質補充療法である。増強療法は、欠けているＡＡＴを増強するために、プールされたドナー血漿から精製されたヒトＡＡＴタンパク質濃縮物の投与を含む。この処置は、健康な血液ドナーから精製されたＡＡＴタンパク質の毎週の注入を含む。血漿タンパク質の注入は、生存率を改善したり、肺気腫の進行速度を遅らせたりすることが示されているが、困難な状況（例えば、活動性肺感染症）では、多くの場合、増強療法のみでは十分でない。増強療法では、患者のＡＡＴの正常な生理学的調節を回復させることもできず、その有効性を実証することは困難であった。更に、増強療法では、Ｚ対立遺伝子の毒性機能獲得によって引き起こされる肝疾患に対処することはできない。従って、ＡＡＴＤに対する新しいより効果的な処置が必要とされている。
本開示は、宿主細胞、組織若しくは対象における１つ若しくは複数の位置のゲノムをインビボ又はインビトロで改変するための新規の組成物、システム及び方法に関する。本開示は、アルファ１アンチトリプシン（ＡＡＴ）活性を調節すること（例えば、目的の配列を挿入、変更、又は欠失すること）ができる遺伝子改変システム、及び１つ以上のこのようなシステムを投与してゲノム配列を１つのヌクレオチドで変更して、アルファ１アンチトリプシン欠乏症を引き起こすＳＥＲＰＩＮＡ１ ＰｉＺ変異を修正することによる、アルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）を処置する方法を提供する。
一態様では、本開示は、ＡＡＴＤを引き起こすヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子変異を修正するためにＤＮＡを改変するためのシステムに関し、このシステムは、（ａ）標的プライミング逆転写が可能な遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸であって、ポリペプチドが、（ｉ）逆転写酵素ドメイン、及び（ｉｉ）ＤＮＡに結合し、エンドヌクレアーゼ活性を有するＣａｓ９ニッカーゼを含む、核酸、並びに（ｂ）（ｉ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第１の部分に相補的なｇＲＮＡスペーサー、（ｉｉ）ポリペプチドに結合するｇＲＮＡスキャフォールド、（ｉｉｉ）変異を修正するための変異領域を含む異種目的配列、及び（ｉｖ）鋳型ＲＮＡの３’末端の標的ＤＮＡ鎖と１００％の相同性を有する少なくとも３、４、５、６、７又は８塩基を含むプライマー結合部位（ＰＢＳ）配列を含む、鋳型ＲＮＡを含む。ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子は、Ｅ３４２Ｋ変異（ＰｉＺ変異とも呼ばれる）を含み得る。鋳型ＲＮＡ配列は、本明細書に記載の配列、例えば表１、３、４、５、６ａ、６Ｂ、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ３ａ、Ｘ５又はＸＸを含み得る。
ｇＲＮＡスペーサーは、鋳型ＲＮＡの５’末端において標的ＤＮＡに対して１００％の相同性の少なくとも１５の塩基を含み得る。鋳型ＲＮＡは、標的ＤＮＡ鎖に対して少なくとも８０％の相同性の少なくとも５つの塩基を含むＰＢＳ配列を更に含み得る。鋳型ＲＮＡは、１つ又は複数の化学修飾を含み得る。
遺伝子改変ポリペプチドのドメインは、ペプチドリンカーによって結合され得る。ポリペプチドは、１つ又は複数のペプチドリンカーを含み得る。遺伝子改変ポリペプチドは、核局在化シグナルを更に含み得る。ポリペプチドは、２つ以上の核局在化シグナル、例えば、複数の隣接する核局在化シグナル又はポリペプチドの異なる領域における１つ又は複数の核局在化シグナル、例えば、ポリペプチドのＮ末端における１つ又は複数の核局在化シグナル及びポリペプチドのＣ末端における１つ又は複数の核局在化シグナルを含み得る。遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸は、１つ又は複数のインテインドメインをコードし得る。
標的細胞へのシステムの導入は、外因性ＤＮＡの少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、５００、又は１０００塩基対の挿入をもたらし得る。標的細胞へのシステムの導入は、欠失をもたらし得、ここで、欠失は、挿入の上流又は下流のゲノムＤＮＡの２、３、４、５、１０、５０又は１００塩基対未満である。標的細胞へのシステムの導入は、置換、例えば１、２又は３つのヌクレオチド、例えば連続したヌクレオチドの置換をもたらし得る。
異種目的配列は、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００又は７００塩基対であり得る。
一態様では、本開示は、上記のシステム及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む医薬組成物に関し、ここで、薬学的に許容される賦形剤又は担体は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、小胞及び脂質ナノ粒子からなる群から選択される。一態様では、本開示は、上記のシステム及び複数の薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む医薬組成物に関し、ここで、薬学的に許容される賦形剤又は担体は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、小胞及び脂質ナノ粒子からなる群から選択され、例えば、ここで、上記のシステムは、２つの異なる賦形剤又は担体、例えば、２つの脂質ナノ粒子、２つのウイルスベクター、又は１つの脂質ナノ粒子及び１つのウイルスベクターによって送達される。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）であり得る。
一態様では、本開示は、上記のシステムを含む宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）に関する。
一態様では、本開示は、細胞、組織又は対象におけるヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の変異を修正する方法に関し、この方法は、上記のシステムを細胞、組織又は対象に投与することを含み、任意選択で、変異ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の修正は、Ｋ３４２Ｅのアミノ酸置換（Ｅ３４２Ｋである病原性置換の逆転）を含む。システムは、インビボ、インビトロ、エクスビボ、又はインサイチュで導入され得る。（ａ）の核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。一部の実施形態では、（ａ）の核酸は、宿主細胞のゲノムに組み込まれない。一部の実施形態では、異種目的配列は、宿主細胞ゲノム内の１つのみの標的部位において挿入される。異種目的配列は、宿主細胞ゲノム内の２つ以上の標的部位において、例えば、２つの相同染色体における同じ対応する部位又は同じ又は異なる染色体上の２つの異なる部位において挿入され得る。異種目的配列は、哺乳動物ポリペプチド又はそのフラグメント若しくは変異体をコードし得る。システムの成分は、１、２、３、４、又はそれ以上の異なる核酸分子上で送達され得る。システムは、エレクトロポレーションによって又はプラスミドベクター、ウイルスベクター、小胞及び脂質ナノ粒子から選択される少なくとも１つのビヒクルを使用することによって宿主細胞内に導入され得る。
組成物又は方法の特徴は、以下に列挙する実施形態の１つ以上を含み得る。
実施形態の列挙
１．（ｉ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第１の部分に相補的なｇＲＮＡスペーサーであって、表１のｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチドを含む配列又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を有し、且つ任意選択で、ｇＲＮＡスペーサーのフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む（例えば、コアヌクレオチドに隣接する１つ以上のフランキングヌクレオチドを含む）か、又はｇＲＮＡスペーサーが、表６Ａ、６Ｂ、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ３ａ、Ｘ５若しくはＸＸのｇＲＮＡスペーサーの配列又はそれに１つ、２つ又は３つの置換を有する配列を有する、ｇＲＮＡスペーサー；
（ｉｉ）遺伝子改変ポリペプチドに結合する（例えば、遺伝子改変ポリペプチドのＣａｓドメインに結合する）ｇＲＮＡスキャフォールド、
（ｉｉｉ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分に変異を導入するため（例えば、そこにある変異を修正するため）の変異領域を含む異種目的配列（ここで、任意選択で、異種目的配列は、５’から３’に、編集後相同性領域、変異領域及び編集前相同性領域を含む）、及び
（ｉｖ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第３の部分と１００％の同一性を有する、少なくとも３、４、５、６、７又は８塩基を含むプライマー結合部位（ＰＢＳ）配列
を含む（例えば、５’から３’に）、鋳型ＲＮＡ。
２．異種目的配列が、表３からのＲＴ鋳型配列のコアヌクレオチド若しくはそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、且つ任意選択で、ＲＴ鋳型配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又は異種目的配列が、表６Ａ若しくは６ＢからのＲＴ鋳型配列の配列を含む、実施形態１に記載の鋳型ＲＮＡ。
３．異種目的配列が、ｇＲＮＡスペーサー配列に対応する表３のＲＴ鋳型配列のコアヌクレオチド若しくはそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、且つ任意選択で、ＲＴ鋳型配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む（例えば、コアヌクレオチドに隣接する１つ以上のフランキングヌクレオチドを含む）か、又は異種目的配列が、表６Ａ若しくは６ＢからのＲＴ鋳型配列の配列を含む、実施形態１に記載の鋳型ＲＮＡ。
４．異種目的配列が、表Ｘ３若しくはＸ３ａに記載の鋳型ＲＮＡからの異種目的配列の配列、又はそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列、又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を有する、先の実施形態のいずれかに記載の鋳型ＲＮＡ。
５．異種目的配列が、６～１６ヌクレオチド（例えば、６、８、１０、１２、１４、１５又は１６ヌクレオチド）の長さを有する、先の実施形態のいずれかに記載の鋳型ＲＮＡ。
６．ＰＢＳ配列が、表３の、ＲＴ鋳型配列と同じ行からのＰＢＳ配列のコアヌクレオチドを含む配列又はそれに１つ、２つ又は３つの置換を有する配列を有し、且つ任意選択で、ＰＢＳ配列のフランキングヌクレオチドの５’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む（例えば、コアヌクレオチドに隣接する１つ以上のフランキングヌクレオチドを含む）、先の実施形態のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ。
７．ＰＢＳ配列が、ＲＴ鋳型配列、ｇＲＮＡスペーサー配列若しくは両方に対応する表３のＰＢＳ配列のコアヌクレオチドを含む配列若しくはそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を有し、且つ任意選択で、ＰＢＳ配列のフランキングヌクレオチドの５’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又はＰＢＳ配列が、ＲＴ鋳型配列、ｇＲＮＡスペーサー配列若しくは両方に対応する表６Ａ若しくは６ＢのＰＢＳ配列若しくはそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含む配列を有する、実施形態１～５のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ。
８．ＰＢＳ配列が、表Ｘ３若しくはＸ３ａに記載の鋳型ＲＮＡからのＰＢＳの配列、又はそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列、又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を有する、先の実施形態のいずれかに記載の鋳型ＲＮＡ。
９．ＰＢＳ配列が、８～１２ヌクレオチド（例えば、８、９、１０、１１又は１２ヌクレオチド）の長さを有する、先の実施形態のいずれかに記載の鋳型ＲＮＡ。
１０．ｇＲＮＡスキャフォールドが、表１２のｇＲＮＡスキャフォールドの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態１～９のいずれかに記載の鋳型ＲＮＡ。
１１．ｇＲＮＡスキャフォールドが、ＲＴ鋳型配列、ｇＲＮＡスペーサー配列若しくは両方に対応する表１２のｇＲＮＡスキャフォールドの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態１～９のいずれかに記載の鋳型ＲＮＡ。
１２．ｇＲＮＡスキャフォールドが、表Ｘ２、Ｘ３若しくはＸ３ａに記載の鋳型ＲＮＡからのｇＲＮＡスキャフォールドの配列又はそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を有する、先の実施形態のいずれかに記載の鋳型ＲＮＡ。
１３．表Ｘ２、Ｘ３若しくはＸ３ａに記載の鋳型ＲＮＡの配列又はそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含む、先の実施形態のいずれかに記載の鋳型ＲＮＡ。
１４．（ｉ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第１の部分に相補的なｇＲＮＡスペーサー、
（ｉｉ）遺伝子改変ポリペプチドに結合する（例えば、遺伝子改変ポリペプチドのＣａｓドメインに結合する）ｇＲＮＡスキャフォールド、
（ｉｉｉ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分に変異を導入するため（例えば、そこにある変異を修正するため）の変異領域を含む異種目的配列であって、表３からのＲＴ鋳型配列のコアヌクレオチド若しくはそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、且つ任意選択で、ＲＴ鋳型配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又は表６Ａ若しくは６ＢからのＲＴ鋳型配列を含む異種目的配列；及び
（ｉｖ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第３の部分と１００％の同一性を有する、少なくとも３、４、５、６、７又は８塩基を含むＰＢＳ配列
を含む（例えば、５’から３’に）、鋳型ＲＮＡ。
１５．ｇＲＮＡスペーサーが、表１のｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチド又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、且つ任意選択で、ｇＲＮＡスペーサー配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又はｇＲＮＡスペーサーが、表６Ａ若しくは６ＢのｇＲＮＡスペーサー配列を含む、実施形態１４に記載の鋳型ＲＮＡ。
１６．異種目的配列が、ＲＴ鋳型配列に対応する表１のｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチド若しくはそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、且つ任意選択で、ｇＲＮＡスペーサー配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又は異種目的配列が、表６Ａ若しくは６ＢのｇＲＮＡスペーサー配列のヌクレオチドを含む、実施形態１４に記載の鋳型ＲＮＡ。
１７．ＰＢＳ配列が、表３の、ＲＴ鋳型配列と同じ行からのＰＢＳ配列のコアヌクレオチドを含む配列又はそれに１つ、２つ又は３つの置換を有する配列を有し、且つ任意選択で、ＰＢＳ配列のフランキングヌクレオチドの５’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、実施形態１４～１６のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ。
１８．ＰＢＳ配列が、ＲＴ鋳型配列、ｇＲＮＡスペーサー配列若しくは両方に対応する表３のＰＢＳ配列のコアヌクレオチドを含む配列若しくはそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を有し、且つ任意選択で、ＰＢＳ配列のフランキングヌクレオチドの５’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又はＰＢＳ配列が、ＲＴ鋳型配列、ｇＲＮＡスペーサー配列若しくは両方に対応する表６Ａ若しくは６ＢのＰＢＳ配列を含む配列を有する、実施形態１４～１７のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ。
１９．ｇＲＮＡスキャフォールドが、表６Ａ若しくは１２のｇＲＮＡスキャフォールドの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態１４～１８のいずれかに記載の鋳型ＲＮＡ。
２０．ｇＲＮＡスキャフォールドが、ＲＴ鋳型配列、ｇＲＮＡスペーサー配列若しくは両方に対応する表６Ａ若しくは１２のｇＲＮＡスキャフォールドの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態１４～１８のいずれかに記載の鋳型ＲＮＡ。
２１．ＤＮＡを改変するための遺伝子改変システムであって、
（ａ）５’から３’に、（ｉ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第１の部分に相補的なガイドＲＮＡ配列であって、ガイドＲＮＡ配列が、表１のスペーサー配列のコアヌクレオチドを含む配列又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を有し、且つ任意選択で、ガイドＲＮＡ配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、配列；及び（ｉｉ）遺伝子改変ポリペプチドに結合する（例えば、遺伝子改変ポリペプチドのＣａｓドメインに結合する）配列（例えば、スキャフォールド領域）を含む、第１のＲＮＡ、並びに
（ｂ）（ｉｉｉ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分に変異を導入するためのヌクレオチド置換を含む異種目的配列（ここで、任意選択で、異種目的配列は、５’から３’に、編集後相同性領域、変異領域及び編集前相同性領域を含む）、（ｉｖ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第３の部分と１００％の同一性を有する少なくとも５、６、７又は８塩基を含むプライマー領域、及び（ｖ）遺伝子改変タンパク質に結合するＲＲＳ（ＲＮＡ結合タンパク質認識配列）を含む第２のＲＮＡ
を含むシステム。
２２．異種目的配列が、表３からのＲＴ鋳型配列のコアヌクレオチド若しくはそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、且つ任意選択で、ＲＴ鋳型配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、実施形態２１に記載の遺伝子改変システム。
２３．異種目的配列が、ｇＲＮＡスペーサー配列に対応する表３のＲＴ鋳型配列のコアヌクレオチド若しくはそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、且つ任意選択で、ＲＴ鋳型配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、実施形態２１に記載の遺伝子改変システム。
２４．ＰＢＳ配列が、表３の、ＲＴ鋳型配列と同じ行からのＰＢＳ配列のコアヌクレオチドを含む配列又はそれに１つ、２つ又は３つの置換を有する配列を有し、且つ任意選択で、ＰＢＳ配列のフランキングヌクレオチドの５’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、実施形態２１～２３のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
２５．ＰＢＳ配列が、ＲＴ鋳型配列、ｇＲＮＡスペーサー配列若しくは両方に対応する表３のＰＢＳ配列のコアヌクレオチドを含む配列若しくはそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を有し、且つ任意選択で、ＰＢＳ配列のフランキングヌクレオチドの５’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、実施形態２１～２３のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
２６．ｇＲＮＡスキャフォールドが、表１２のｇＲＮＡスキャフォールドの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態２１～２５のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
２７．ｇＲＮＡスキャフォールドが、ＲＴ鋳型配列、ｇＲＮＡスペーサー配列若しくは両方に対応する表１２のｇＲＮＡスキャフォールドの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態２１～２５のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
２８．ＤＮＡを改変するための遺伝子改変システムであって、
（ａ）５’から３’に、（ｉ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第１の部分に相補的なガイドＲＮＡ配列、及び（ｉｉ）遺伝子改変ポリペプチドに結合する（例えば、遺伝子改変ポリペプチドのＣａｓドメインに結合する）配列（例えば、スキャフォールド領域）を含む、第１のＲＮＡ、並びに
（ｂ）（ｉｉｉ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分に変異を導入するためのヌクレオチド置換を含む異種目的配列であって、異種目的配列が、表３からのＲＴ鋳型配列のコアヌクレオチド若しくはそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、且つ任意選択で、ＲＴ鋳型配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、配列、及び（ｉｖ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第３の部分と１００％の相同性を有する少なくとも５、６、７又は８塩基を含むプライマー領域、及び（ｖ）遺伝子改変タンパク質に結合するＲＲＳ（ＲＮＡ結合タンパク質認識配列）を含む第２のＲＮＡ
を含むシステム。
２９．ｇＲＮＡスペーサーが、表１のｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチド又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、且つ任意選択で、ｇＲＮＡスペーサー配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、実施形態２８に記載の遺伝子改変システム。
３０．異種目的配列が、ＲＴ鋳型配列に対応する表１のｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチド若しくはそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、且つ任意選択で、ｇＲＮＡスペーサー配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、実施形態２８に記載の遺伝子改変システム。
３１．ＰＢＳ配列が、表３の、ＲＴ鋳型配列と同じ行からのＰＢＳ配列のコアヌクレオチドを含む配列又はそれに１つ、２つ又は３つの置換を有する配列を有し、且つ任意選択で、ＰＢＳ配列のフランキングヌクレオチドの５’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、実施形態２８～３０のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
３２．ＰＢＳ配列が、ＲＴ鋳型配列、ｇＲＮＡスペーサー配列若しくは両方に対応する表３のＰＢＳ配列のコアヌクレオチドを含む配列又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を有し、且つ任意選択で、ＰＢＳ配列のフランキングヌクレオチドの５’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、実施形態２８～３０のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
３３．ｇＲＮＡスキャフォールドが、表１２のｇＲＮＡスキャフォールドの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
３４．ｇＲＮＡスキャフォールドが、ＲＴ鋳型配列、ｇＲＮＡスペーサー配列若しくは両方に対応する表１２のｇＲＮＡスキャフォールドの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態２８～３２のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
３５．（ｉ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第１の部分に相補的なｇＲＮＡスペーサー配列であって、表１、表２若しくは表４のｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチド又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、且つ任意選択で、ｇＲＮＡスペーサー配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むｇＲＮＡスペーサー配列；及び（ｉｉ）ｇＲＮＡスキャフォールドを含む、ｇＲＮＡ。
３６．ｇＲＮＡスキャフォールドが、表１２のｇＲＮＡスキャフォールドの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態３５に記載のｇＲＮＡ。
３７．ｇＲＮＡスキャフォールドが、ｇＲＮＡスペーサー配列に対応する表１２のｇＲＮＡスキャフォールドの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態３５に記載のｇＲＮＡ。
３８．（ｉｉｉ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分に変異を導入するための変異領域を含む異種目的配列であって、異種目的配列が、表３からのＲＴ鋳型配列のコアヌクレオチド若しくはそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、且つ任意選択で、ＲＴ鋳型配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、配列、及び（ｉｖ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第３の部分と１００％の相同性を有する少なくとも５、６、７又は８塩基を含むＰＢＳ配列を含む鋳型ＲＮＡ。
３９．ＰＢＳ配列が、表３の、ＲＴ鋳型配列と同じ行からのＰＢＳ配列のコアヌクレオチドを含む配列又はそれに１つ、２つ又は３つの置換を有する配列を有し、且つ任意選択で、ＰＢＳ配列のフランキングヌクレオチドの５’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、実施形態３８に記載の鋳型ＲＮＡ。
４０．ＰＢＳ配列が、ＲＴ鋳型配列に対応する表３のＰＢＳ配列のコアヌクレオチドを含む配列又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を有し、且つ任意選択で、ＰＢＳ配列のフランキングヌクレオチドの５’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、実施形態３８に記載の鋳型ＲＮＡ。
４１． システムによって導入される変異が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のＫ３４２Ｅ変異（例えば、病原性Ｅ３４２Ｋ変異を修正するための）である、実施形態１～２０若しくは３８～４０のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ、実施形態２１～３４のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム、又は実施形態３５～３７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡ。
４２．編集前配列が、約１ヌクレオチド～約３５ヌクレオチド（例えば、約１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０又は３０～３５ヌクレオチド）長を含む、実施形態１～２０若しくは３８～４１のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ又は実施形態２１～３４若しくは４１のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
４３．変異領域が、単一ヌクレオチドを含む、実施形態１～２０若しくは３８～４２のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ又は実施形態２１～３４、４１若しくは４２のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
４４．変異領域が、少なくとも２ヌクレオチド長である、実施形態１～２０若しくは３８～４２のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ又は実施形態２１～３４、４１若しくは４２のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
４５．変異領域が、最大３２（例えば、最大５、１０、１５、２０、２５、３０又は３２）ヌクレオチド長であり、且つヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分に対して１つ、２つ又は３つの配列差を含む、実施形態１～２０、３８～４２若しくは４４のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ又は実施形態２１～３４、４１、４２若しくは４４のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
４６．変異領域が、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分に対して２つの配列差を含む、実施形態１～２０、３８～４２、４４若しくは４５のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ又は実施形態２１～３４、４１、４２、４４若しくは４５のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
４７．変異領域が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の病原性変異を修正するように設計された第１の領域（例えば、第１のヌクレオチド）及びＰＡＭ配列を不活性化するように設計された第２の領域（例えば、第２のヌクレオチド）（例えば、表５に記載されるような「ＰＡＭ－ｋｉｌｌ」変異）を含む、実施形態１～２０、３８～４２若しくは４４～４６のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ又は実施形態２１～３４、４１、４２若しくは４４～４６のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
４８．変異領域が、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の対応する部分と８０％、７０％、６０％、５０％、４０％又は３０％未満の同一性を含む、実施形態１～２０、３８～４６のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ又は実施形態２１～３４若しくは４１～４６のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
４９．鋳型ＲＮＡが、例えば表７Ｂに例示されるような、１つ以上のサイレント変異（例えば、サイレント置換）を含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ。
５０．変異領域が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の病原性変異を修正するように設計された第１の領域及びサイレント置換を導入するように設計された第２の領域を含む、先の実施形態のいずれかに記載の鋳型ＲＮＡ。
５１．１つ以上の化学的に改変されたヌクレオチドを含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ。
５２．遺伝子改変システムであって、
実施形態１～２０、３８～４２のいずれかの鋳型ＲＮＡ又は実施形態２１～３４若しくは４１～４６のいずれかのシステム、及び
遺伝子改変ポリペプチド又は遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ）
を含む遺伝子改変システム。
５３．遺伝子改変ポリペプチドが、
逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン（例えば、レトロウイルスからのＲＴドメイン又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドドメイン）；及び
標的ＤＮＡ分子に結合し、且つＲＴドメインに対して異種であるＣａｓドメイン（例えば、Ｃａｓ９ドメイン）；及び
任意選択で、ＲＴドメインとＣａｓドメインとの間に配置されたリンカー
を含む、実施形態５２に記載の遺伝子改変システム。
５４．ＲＴドメインが、
（ａ）表６のＲＴドメイン；又は
（ｂ）マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）；トリ細網内皮症ウイルス（ＡＶＩＲＥ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、サル泡沫状ウイルス（ＳＦＶ）（例えば、ＳＦＶ３Ｌ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、メイソン・ファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ）、ヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）又はウシ泡沫状／合胞体ウイルス（ＢＦＶ／ＢＳＶ）からのＲＴドメイン
を含む、実施形態５３に記載の遺伝子改変システム。
５５．Ｃａｓドメインが、表Ｘ１、ＸＸ若しくはＸ５のＣａｓドメイン又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、実施形態５３又は５４に記載の遺伝子改変システム。
５６．スペーサーが、表ＸＸのスペーサー又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、Ｃａｓドメインが、表ＸＸの同じ行のＣａｓドメイン又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、実施形態５３～５５のいずれかに記載の遺伝子改変システム。
５７．スペーサーが表ＸＸのスペーサーを含み、Ｃａｓドメインが表ＸＸの同じ行のＣａｓドメインを含む、実施形態５３～５６のいずれかに記載の遺伝子改変システム。
５８．スペーサーが、表Ｘ５のスペーサー又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、Ｃａｓドメインが、表Ｘ５の同じ行のＣａｓドメイン又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、実施形態５３～５７のいずれかに記載の遺伝子改変システム。
５９．スペーサーが表Ｘ５のスペーサーを含み、Ｃａｓドメインが表Ｘ５の同じ行のＣａｓドメインを含む、実施形態５３～５８のいずれかに記載の遺伝子改変システム。
６０．スペーサーが、表６Ａのスペーサー又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、Ｃａｓドメインが、表６Ａの同じ行のＣａｓドメイン又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、実施形態５３～５９のいずれかに記載の遺伝子改変システム。
６１．スペーサーが表６Ａのスペーサーを含み、Ｃａｓドメインが表６Ａの同じ行のＣａｓドメインを含む、実施形態５３～６０のいずれかに記載の遺伝子改変システム。
６２．スペーサーが、表６Ｂのスペーサー又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、Ｃａｓドメインが、表６Ｂの同じ行のＣａｓドメイン又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、実施形態５３～５１のいずれかに記載の遺伝子改変システム。
６３．スペーサーが表６Ｂのスペーサーを含み、Ｃａｓドメインが表６Ｂの同じ行のＣａｓドメインを含む、実施形態５３～６２のいずれかに記載の遺伝子改変システム。
６４．Ｃａｓドメインが、表７又は表８のＣａｓドメインを含む、実施形態５３～６３のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
６５．Ｃａｓドメインが、
（ａ）Ｃａｓ９ドメインであり；
（ｂ）ＳｐＣａｓ９ドメイン、ＢｌａｔＣａｓ９ドメイン、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ドメイン、ＰｎｐＣａｓ９ドメイン、ＳａｕＣａｓ９ドメイン、ＳａｕＣａｓ９－ＫＫＨドメイン、ＳａｕｒｉＣａｓ９ドメイン、ＳａｕｒｉＣａｓ９－ＫＫＨドメイン、ＳｃａＣａｓ９－Ｓｃ＋＋ドメイン、ＳｐｙＣａｓ９ドメイン、ＳｐｙＣａｓ９－ＮＧドメイン、ＳｐｙＣａｓ９－ＳｐＲＹドメイン又はＳｔ１Ｃａｓ９ドメインであり；及び／又は
（ｃ）Ｎ６７０Ａ変異、Ｎ６１１Ａ変異、Ｎ６０５Ａ変異、Ｎ５８０Ａ変異、Ｎ５８８Ａ変異、Ｎ８７２Ａ変異、Ｎ８６３変異、Ｎ６２２Ａ変異又はＨ８４０Ａ変異を含むＣａｓ９ドメインである、実施形態５３～６４のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
６６．Ｃａｓ９ドメインが、表７又は表１２に列挙されるＰＡＭ配列に結合する、実施形態６５に記載の遺伝子改変システム。
６７．ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分が、Ｃａｓドメインによって認識されるＰＡＭと重複し、例えば、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分がＰＡＭ内にあるか、又はＰＡＭがヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分内にある）、実施形態６６に記載の遺伝子改変システム。
６８．ｇＲＮＡスペーサーが表１に記載のｇＲＮＡスペーサーであり、Ｃａｓドメインが、表１の同じ行に列挙されるＣａｓドメイン又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態５３～６７のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
６９．鋳型ＲＮＡが、表６Ａ若しくは６Ｂの鋳型ＲＮＡ配列の配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
７０．（ａ）鋳型ＲＮＡが、表３の鋳型ＲＮＡ配列の配列を含み；
（ｂ）Ｃａｓドメインが、表７又は表８のＣａｓドメインを含み；
（ｃ）リンカーが、表１０の（例えば、配列番号５２１７、５１０６、５１９０及び５２１８のいずれかの）リンカー配列を含み；及び
（ｄ）遺伝子改変ポリペプチドが、表１１からの（例えば、配列番号５２４５、５２９０、５３２３、５３３０、５３４９、５３５０、５３５１及び４００１のいずれかの）１つ又は２つのＮＬＳ配列を含む、実施形態５３～６９のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
７１．ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第１の鎖に第１のニックを生成する、実施形態５３～７０のいずれかに記載の遺伝子改変システム。
７２．ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の鎖に第２のニックを導く、第２の鎖を標的とするｇＲＮＡスペーサーを更に含む、実施形態７１に記載の遺伝子改変システム。
７３．第２の鎖を標的とするｇＲＮＡが、表２からの左ｇＲＮＡスペーサー配列又は右ｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチドを含む配列を含み、且つ任意選択で、左ｇＲＮＡスペーサー配列又は右ｇＲＮＡスペーサー配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、実施形態７２に記載の遺伝子改変システム。
７４．第２の鎖を標的とするｇＲＮＡが、（ｉ）のｇＲＮＡスペーサー配列に対応する表２からの左ｇＲＮＡスペーサー配列又は右ｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチドを含む配列を含み、且つ任意選択で、左ｇＲＮＡスペーサー配列又は右ｇＲＮＡスペーサー配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、実施形態７２に記載の遺伝子改変システム。
７５．第２の鎖を標的とするｇＲＮＡが、表４からの第２のニックｇＲＮＡ配列のコアヌクレオチドを含む配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含み、且つ任意選択で、第２のニックｇＲＮＡ配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、実施形態７２に記載の遺伝子改変システム。
７６．第２の鎖を標的とするｇＲＮＡが、（ｉ）のｇＲＮＡスペーサー配列に対応する表４からの第２のニックｇＲＮＡ配列のコアヌクレオチドを含む配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含み、且つ任意選択で、第２のニックｇＲＮＡ配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、実施形態７２に記載の遺伝子改変システム。
７７．第２の鎖を標的とするｇＲＮＡが、例えば、表４に例示されるように、遺伝子改変システムの鋳型ＲＮＡとの「ＰＡＭ－ｉｎ配向」を有する、先の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
７８．第２の鎖を標的とするｇＲＮＡが、鋳型ＲＮＡの標的変異と重複する配列を標的とする、先の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
７９．第２の鎖を標的とするｇＲＮＡが、
（ｉ）ＳＥＲＰＩＮＡ１変異に相補的な配列（例えば、スペーサー配列）
（ｉｉ）標的遺伝子座における野生型配列に相補的な配列（例えば、スペーサー配列）
（ｉｉｉ）標的遺伝子座の近位のＳＮＰ、例えば対象（例えば、患者）のゲノムＤＮＡに含まれるＳＮＰに相補的な配列（例えば、スペーサー配列）；
（ｉｖ）標的遺伝子座の近位の１つ以上のサイレント置換と相補的であるか又はそれを含む配列（例えば、スペーサー配列）
を含む、実施形態７８に記載の遺伝子改変システム。
８０．ｇＲＮＡスペーサーが、ｇＲＮＡスペーサーの約１つ、２つ、３つ又はそれを超えるフランキングヌクレオチドを含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ、遺伝子改変システム、又はｇＲＮＡ。
８１．異種目的配列が、ＲＴ鋳型配列の約２つ、３つ、４つ、５つ、１０個、２０個、３０個、４０個又はそれを超えるフランキングヌクレオチドを含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
８２．異種目的配列が、約８～３０、９～２５、１０～２０、１１～１６又は１２～１５（例えば、約１１～１６）ヌクレオチドを含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
８３．変異領域が、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の対応する部分に対して１つ、２つ又は３つのヌクレオチド位置の配列差を含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
８４．変異領域が、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の対応する部分に対して少なくとも２つのヌクレオチド位置の配列差を含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
８５．編集後相同性領域及び／又は編集前相同性領域が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子と１００％の同一性を含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
８６．ＰＢＳ配列が、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又はそれを超えるフランキングヌクレオチドを更に含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
８７．ＰＢＳ配列が、約５～２０、８～１６、８～１４、８～１３、９～１３、９～１２又は１０～１２（例えば、約９～１２）ヌクレオチドを含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
８８．ＰＢＳ配列が、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のニック部位から１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド以内に結合する、先の実施形態のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
８９．遺伝子改変ポリペプチドのドメインが、ペプチドリンカーによって結合されている、先の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
９０．リンカーが、表１０の（例えば、配列番号５２１７、５１０６、５１９０及び５２１８のいずれかの）リンカーの配列を含む、実施形態８９に記載の遺伝子改変システム。
９１．遺伝子改変ポリペプチドが、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を更に含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム。
９２．遺伝子改変ポリペプチドが、第１のＮＬＳ及び第２のＮＬＳを含む、実施形態９１に記載の遺伝子改変システム。
９３． ＮＬＳが、表１１の（例えば、配列番号５２４５、５２９０、５３２３、５３３０、５３４９、５３５０、５３５１及び４００１のいずれかの）ＮＬＳの配列を含む、実施形態９１又は９２に記載の遺伝子改変システム。
９４．表４の鋳型ＲＮＡの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む鋳型ＲＮＡ。
９５．表４の鋳型ＲＮＡの配列を含む、鋳型ＲＮＡ。
９６．遺伝子改変システムであって、
（ｉ）表４の鋳型ＲＮＡの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む鋳型ＲＮＡ；及び
（ｉｉ）表４の、（ｉ）と同じ行からの第２のニックｇＲＮＡ配列、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列
を含む遺伝子改変システム。
９７．遺伝子改変システムであって、
（ｉ）表４の鋳型ＲＮＡの配列を含む鋳型ＲＮＡ；及び
（ｉｉ）表４の、（ｉ）と同じ行からの第２のニックｇＲＮＡ配列
を含む遺伝子改変システム。
９８．実施形態１～２０、３８～４８、８０～８８、９４若しくは９５のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ又は実施形態３５～３７のいずれか１つに記載のｇＲＮＡをコードするＤＮＡ。
９９．実施形態５２～９３、９６若しくは９７のいずれか１つのシステム又はそれをコードする１つ以上の核酸及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む医薬組成物。
１００．薬学的に許容される賦形剤又は担体が、プラスミドベクター、ウイルスベクター、小胞及び脂質ナノ粒子からなる群から選択される、実施形態９９に記載の医薬組成物。
１０１．ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルスである、実施形態１００に記載の医薬組成物。
１０２．先の実施形態のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システムを含む宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）。
１０３．実施形態１～２０、３８～４８、８０～８８、９４、又は９５３のいずれか１つに記載の鋳型ＲＮＡを作製する方法であって、鋳型ＲＮＡを、インビトロ転写（例えば、固相合成）によって又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡを、鋳型ＲＮＡの生成を可能にする条件下で宿主細胞に導入することによって合成することを含む方法。
１０４．細胞内のヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の標的部位を改変する方法であって、細胞を、実施形態５２～９３、９６若しくは９７のいずれか１つの遺伝子改変システム又はそれをコードするＤＮＡと接触させ、それにより細胞内のヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の標的部位を改変することを含む方法。
１０５．細胞内のヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の標的部位を改変する方法であって、細胞を、（ｉ）実施形態５２～９３、９６若しくは９７のいずれか１つの鋳型ＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡ；及び（ｉｉ）遺伝子改変ポリペプチド又は遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸と接触させ、それにより細胞内のヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の標的部位を改変することを含む方法。
１０６．ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の変異に関連する疾患又は症状を有する対象を処置する方法であって、実施形態５２～９３、９６若しくは９７のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム又はそれをコードするＤＮＡを対象に投与し、それによりヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の変異に関連する疾患又は症状を有する対象を処置することを含む方法。
１０７．ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の変異に関連する疾患又は症状を有する対象を処置する方法であって、実施形態５２～９３、９６若しくは９７のいずれか１つの鋳型ＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡ；及び（ｉｉ）遺伝子改変ポリペプチド又は遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸を対象に投与し、それによりヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の変異に関連する疾患又は症状を有する対象を処置することを含む方法。
１０８．疾患又は症状が、アルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）である、実施形態１０６又は１０７に記載の方法。
１０９．対象が、Ｅ３４２Ｋ変異（すなわち、ＰｉＺ変異）を有する、実施形態１０６～１０８のいずれか１つに記載の方法。
１１０．ＡＡＴＤを有する対象を処置する方法であって、実施形態５２～９３、９６若しくは９７のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム又はそれをコードするＤＮＡを対象に投与し、それによりＡＡＴＤを有する対象を処置することを含む方法。
１１１．ＡＡＴＤを有する対象を処置する方法であって、（ｉ）実施形態５２～９３、９６若しくは９７のいずれか１つの鋳型ＲＮＡ又はそれをコードするＤＮＡ；及び（ｉｉ）遺伝子改変ポリペプチド又は遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸を対象に投与し、それによりＡＡＴＤを有する対象を処置することを含む方法。
１１２．システムの標的細胞への導入は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の病原性変異の修正をもたらす、先の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム又は方法。
１１３．病原性変異がＥ３４２Ｋ変異であり、修正がＫ３４２Ｅのアミノ酸置換を含む、先の実施形態のいずれか１つに記載の遺伝子改変システム又は方法。
１１４．変異の修正が、標的核酸の少なくとも３０％（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又はそれを超えるもの）で起こる、先の実施形態のいずれかに記載の遺伝子改変システム又は方法。
１１５．変異の修正が、標的細胞の少なくとも３０％（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又はそれを超えるもの）で起こる、先の実施形態のいずれかに記載の遺伝子改変システム又は方法。
１１６．遺伝子改変システムが、第２の鎖を標的とするｇＲＮＡを含み、標的細胞の集団における変異の修正が、第２の鎖を標的とするｇＲＮＡを有しない鋳型ＲＮＡを含む遺伝子改変システムで処置された標的細胞の集団に対して増加する、先の実施形態のいずれかに記載の遺伝子改変システム又は方法。
１１７．鋳型ＲＮＡが１つ以上のサイレント置換（例えば、表７Ｂに例示されるようなもの）を含み、標的細胞の集団における変異の修正が、１つ以上のサイレント置換を含まない鋳型ＲＮＡを含む遺伝子改変システムで処置された標的細胞の集団に対して増加する、先の実施形態のいずれかに記載の遺伝子改変システム又は方法。
１１８．細胞が、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である、先の実施形態のいずれかに記載の方法。
１１９．対象がヒトである、先の実施形態のいずれか１つに記載の方法。
１２０．接触がエクスビボで行われ、例えば、細胞又は対象のＤＮＡがエクスビボで改変される、先の実施形態のいずれかに記載の方法。
１２１．接触がインビボで行われ、例えば、細胞又は対象のＤＮＡがインビボで改変される、先の実施形態のいずれかに記載の方法。
１２２．細胞又は対象をシステムと接触させることが、遺伝子改変ポリペプチドの生成を可能にする条件下において、細胞又は対象内の細胞を、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）と接触させることを含む、先の実施形態のいずれかに記載の方法。
特許又は出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれる。カラー図面を含むこの特許又は特許出願公開のコピーは、申請及び必要な手数料の支払いに応じて、特許庁によって提供される。
本明細書に記載の遺伝子改変システムを示す。左側の図は、リンカーによって連結されたＣａｓニッカーゼドメイン（例えば、ｓｐＣａｓ９ Ｎ８６３Ａ）と逆転写酵素ドメイン（ＲＴドメイン）を含む、遺伝子改変ポリペプチドを示す。右側の図は、５’から３’に、ｇＲＮＡスペーサー、ｇＲＮＡスキャフォールド、異種目的配列、プライマー結合部位配列（ＰＢＳ配列）を含む、鋳型ＲＮＡを示す。異種目的配列は、標的部位に対する１つ以上の配列相違を含む変異領域を含み得る。異種目的配列は、変異領域に隣接する編集前相同性領域及び編集後相同性領域も含み得る。理論に縛られることを望むものではないが、鋳型ＲＮＡのｇＲＮＡスペーサーがゲノム内の標的部位の第２の鎖に結合し、鋳型ＲＮＡのｇＲＮＡスキャフォールドが遺伝子改変ポリペプチドに結合し、例えば、遺伝子改変ポリペプチドをゲノム内の標的部位に局在化させると考えられる。遺伝子改変ポリペプチドのＣａｓドメインは、標的部位（例えば、標的部位の第１の鎖）にニックを入れ、例えば、ＰＢＳ配列が標的部位の第１の鎖上の変更される部位に隣接する配列に結合できるようにすると考えられる。遺伝子改変ポリペプチドのＲＴドメインは、例えば異種目的配列に相補的な配列を重合するために、鋳型ＲＮＡのＰＢＳ配列を含む相補配列に結合した標的部位の第１の鎖をプライマーとして、鋳型ＲＮＡの異種目的配列を鋳型として使用すると考えられる。理論に縛られることを望むものではないが、逆転写はその後、編集前相同性領域、次いで変異領域、そして編集後相同性領域を経て進行し、それにより、異種目的配列によって指定された変異を含むＤＮＡ鎖が生成されると考えられる。 示された鋳型ＲＮＡで、ＲＮＡＶ２０９－０１３又はＲＮＡＶ２１４－０４０遺伝子改変ポリペプチドを使用して達成された書き換えの割合を示すグラフである。 鋳型ＲＮＡをＲＮＡＶ２０９－０１３又はＲＮＡＶ２１４－０４０遺伝子改変ポリペプチドと共に使用した場合の、野生型に対するＦａｈ ｍＲＮＡの量を示すグラフである。 様々な遺伝子改変ポリペプチド及び鋳型ＲＮＡを含有するＬＮＰを投与してから６時間後のＣａｓ９陽性肝細胞の割合を示すグラフである。 様々な遺伝子改変ポリペプチド及び鋳型ＲＮＡを含有するＬＮＰを投与してから６日後の肝臓サンプルにおける書き換えレベルを示すグラフである。 様々な遺伝子改変ポリペプチド及び鋳型ＲＮＡを含有するＬＮＰを投与した後の肝臓サンプルにおける、同腹ヘテロ接合マウスと比較した、野生型Ｆａｈ ｍＲＮＡの回復を示すグラフである。 様々な遺伝子改変ポリペプチド及び鋳型ＲＮＡを含有するＬＮＰを投与した後の肝臓サンプル中のＦａｈタンパク質の分布を示すグラフである。 Ｃａｓ９－ＲＴ ｍＲＮＡ＋ＴＴＲガイドＬＮＰの注入から６時間後のＣａｓ９－ＲＴ発現を示す一連のウエスタンブロットである。各レーンは個々の動物を表し、レーンごとに２０μｇの組織ホモジネートを添加した。陽性対照は、Ｃａｓ９－ＲＴが発現されたインビトロ細胞実験からのものである（前述）。ＧＡＰＤＨは、各サンプルのローディングコントロールとして使用した。溶媒群又は処置群あたりｎ＝４。 Ｃａｓ９－ＲＴ ｍＲＮＡ＋ＴＴＲガイドＬＮＰによる処置後のＴＴＲ遺伝子座の遺伝子編集を示すグラフである。プロトスペーサーが標的とするＴＴＲ遺伝子座のサンガーシーケンシングのＴＩＤＥ分析によって測定された、ＴＴＲ遺伝子座で検出されたインデルのレベル。 Ｃａｓ９－ＲＴ ｍＲＮＡ＋ＴＴＲガイドＬＮＰによる処置後にＴＴＲ血清レベルが減少することを示すグラフである。Ｃａｓ９－ＲＴ＋ＴＴＲガイドＲＮＡをカプセル化したＬＮＰでマウスを処置した５日後の循環ＴＴＲレベルの測定。 Ｃａｓ９－ＲＴ ｍＲＮＡ＋ＴＴＲガイドＬＮＰの注入後のＣａｓ９－ＲＴ発現を示すグラフである。相対的発現は、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ Ｊｅｓｓキャピラリー電気泳動ウエスタンブロットによって定量化された。記号内の数字は、群内の動物番号である。溶媒 ｎ＝２、Ｃａｓ９－ＲＴ＋ＴＴＲガイド ｎ＝３。 Ｃａｓ９－ＲＴ ｍＲＮＡ＋ＴＴＲガイドＬＮＰの注入後のＴＴＲ遺伝子座の遺伝子編集を示すグラフである。ＴＴＲ遺伝子座で検出されたインデルのレベルは、プロトスペーサーが標的とするＴＴＲ遺伝子座のアンプリコンシーケンシングによって測定された。各動物の肝臓全体にわたって８つの異なる生検が採取され、アンプリコンシーケンシングによってインデルを示す読み取りの割合が測定された。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で評価した野生型ＳｐＣａｓ９ポリペプチドと組み合わせた、５つのＳｐＣａｓ９スペーサーを含む鋳型ＲＮＡを含む様々な遺伝子改変システムのインデル活性の割合を示すグラフである。 遺伝子改変システムによる処置後のＨＥＫ２９３Ｔランディングパッド細胞におけるＰｉＺ変異部位のインデルの割合を示すグラフである。 ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるスクリーニング評価後のインデル活性及びＰｉＺ変異からの距離による活性スペーサーの順位付けを示すグラフである。 鋳型ＲＮＡを含む様々な遺伝子改変システムの完全な書き換え活性の割合を示すグラフである。 様々なＳｐＲＹ＿ＥＤ０鋳型ＲＮＡ（異なるＰＢＳ及びＲＴの長さ）及び例示的なＳｐＲＹ＿Ｃａｓ９含有遺伝子改変ポリペプチドを含む遺伝子改変システム（図１７Ａ）並びに様々なＳｔ１＿ＥＤ４鋳型ＲＮＡ（異なるＰＢＳ及びＲＴの長さ）及び例示的なＳｔ１Ｃａｓ９含有遺伝子改変ポリペプチドを含む遺伝子改変システム（図１７Ｂ）の書き換え率をグラフ化したヒートマップである。 鋳型ＲＮＡとＣａｓ９バリアントを含む遺伝子改変ポリペプチドとの、パフォーマンスが最も優れた１７の組み合わせ（書き換え活性による順位付け）を示すグラフである。
定義
「発現カセット」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明の核酸分子の発現のために十分な核酸エレメントを含む核酸構築物を指す。
「ｇＲＮＡスペーサー」は、本明細書で使用される場合、標的核酸に対する相補性を有し、ｇＲＮＡスキャフォールドと一緒に、Ｃａｓタンパク質を標的核酸に標的化し得る、核酸の部分を指す。
「ｇＲＮＡスキャフォールド」は、本明細書で使用される場合、Ｃａｓタンパク質に結合し得、ｇＲＮＡスペーサーと一緒に、Ｃａｓタンパク質を標的核酸に標的化し得る、核酸の部分を指す。一部の実施形態では、ｇＲＮＡスキャフォールドは、ｃｒＲＮＡ配列、テトラループ、及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。
「遺伝子改変ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、レトロウイルス逆転写酵素を含むポリペプチド又は核酸配列（例えば、鋳型核酸上で提供される配列）を標的ＤＮＡ分子（例えば、宿主細胞内のゲノムＤＮＡ分子などの、哺乳動物宿主細胞内）に組み込むことが可能なレトロウイルス逆転写酵素に対する少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、宿主機構に実質的に依存せずに配列を組み込むことが可能である。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列を、ゲノム内のランダム位置に組み込み、一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列を特定の標的部位に組み込む。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、集合的に、１）鋳型核酸への結合、２）標的ＤＮＡ分子への結合を促進し、３）鋳型核酸の少なくとも一部の、標的ＤＮＡへの組み込みを促進する１つ又は複数のドメインを含む。遺伝子改変ポリペプチドは、天然ポリペプチド及び例えば天然配列に対する１つ又は複数のアミノ酸置換を有するその操作された変異体の両方を含む。遺伝子改変ポリペプチドは、異種構築物も含み、例えば、ここで、上記に列挙されるドメインの１つ又は複数は、それ以外には野生型ドメインの異種融合（又は他のコンジュゲート）並びに修飾ドメインの融合によるかどうか、例えば、異種サブドメイン又は他の置換ドメインの置換又は融合によるかどうかにかかわらず、互いに異種である。本明細書に提供される方法において使用され得る、例示的な遺伝子改変ポリペプチド、及びそれらを含むシステム及びそれらを使用する方法が、例えば、レトロウイルス逆転写酵素ドメインを含む遺伝子改変ポリペプチドに関して参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２０９４８号明細書に記載される。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列を遺伝子に組み込む。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列を、遺伝子の外部の配列に組み込む。「遺伝子改変システム」は、本明細書で使用される場合、遺伝子改変ポリペプチド及び鋳型核酸を含むシステムを指す。
本明細書で使用される用語「ドメイン」は、生体分子の特定の機能に寄与する生体分子の構造を指す。ドメインは、生体分子の連続領域（例えば、連続配列）又は個別の非連続領域（例えば、非連続配列）を含み得る。タンパク質ドメインの例として、以下に限定されないが、エンドヌクレアーゼドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、逆転写ドメインが挙げられる；核酸のドメインの例として、調節ドメイン、例えば転写因子結合ドメインがある。一部の実施形態では、ドメイン（例えば、Ｃａｓドメイン）は、２つ以上のより小さいドメイン（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメイン）を含み得る。
本明細書で使用されるように、用語「外性」とは、生体分子（例えば、核酸配列又はポリペプチドなど）に関して用いられる場合、生体分子が、人為的に、宿主ゲノム、細胞若しくは生物に導入されたことを意味する。例えば、組換えＤＮＡ技術又はその他の方法を用いて、既存のゲノム、細胞、組織若しくは対象に付加される核酸は、既存の核酸配列、細胞、組織若しくは対象に対して外性である。
本明細書中で用いられる、標的ＤＮＡの個々のＤＮＡ鎖を説明するのに用いられる「第１の鎖」及び「第２の鎖」は、２つのＤＮＡ鎖を識別し、これらの鎖に基づいて、逆転写酵素ドメインは、例えば標的プライムド合成が開始する場所に基づいて、重合を開始する。第１の鎖は、標的ＤＮＡの鎖を指し、この上で、逆転写酵素ドメインが重合を開始する、例えば、標的プライムド合成が開始される。第２の鎖は、標的ＤＮＡの他方の鎖を指す。名称第１の鎖及び第２の鎖は、その他の点では標的部位ＤＮＡ鎖を説明しない；例えば、一部の実施形態において、第１の鎖及び第２の鎖は、本明細書中に記載されるポリペプチドによってニックが入れられるが、名称「第１の」及び「第２の」鎖は、そのようなニックが出現する順序とは無関係である。
用語「異種」は、第２の要素に関して第１の要素を表すために使用されるとき、第１の要素と第２の要素が、記載されるような配置で天然に存在しないことを意味する。例えば、異種ポリペプチド、核酸分子、構築物若しくは配列は、（ａ）それが発現される細胞に対してネイティブではないポリペプチド、核酸分子、又はポリペプチド若しくは核酸分子配列の部分、（ｂ）その天然の状態に対して改変若しくは変異したポリペプチド若しくは核酸分子又はポリペプチド若しくは核酸分子の部分、又は（ｃ）類似の条件下でのネイティブ発現レベルと比較して改変された発現を有するポリペプチド又は核酸分子を指す。例えば、異種調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサー）を用いて、遺伝子又は核酸分子が天然に通常発現されるものと異なる様式で遺伝子又は核酸分子の発現を調節することができる。別の例において、ポリペプチドの異種ドメイン、又は核酸配列（例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメイン、又はポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸）は、他のドメインと比較して配置され得るか、或いはポリペプチドの他のドメイン若しくは一部又はそのコード核酸と比較して異なる配列又は異なる供給源由来であり得る。特定の実施形態では、異種核酸分子は、天然の宿主細胞ゲノム内に存在し得るが、改変された発現レベル若しくは異なる配列を有するか、又はその両方であり得る。他の実施形態では、異種核酸分子は、宿主細胞又は宿主ゲノムに内在性でなくてもよいが、代わりに形質転換（例えば、トランスフェクション、エレクトロポレーション）により宿主細胞に導入され得、ここで、付加される分子は、宿主ゲノムに組み込まれ得るか、又は一過性（例えば、ｍＲＮＡ）若しくは２世代以上にわたって半安定的（例えば、エピソームウイルスベクター、プラスミド若しくは他の自己複製ベクター）のいずれかで染色体外遺伝材料として存在することができる。
本明細書で使用される場合、標的部位への配列の「挿入」は、標的部位におけるＤＮＡ配列の正味の付加を指し、例えば、ここで、非編集標的部位におけるコグネイト位置を有さない異種目的配列における新たなヌクレオチドがある。一部の実施形態では、標的核酸配列に対するＰＢＳ配列及び異種目的配列のヌクレオチドアラインメントが、標的核酸配列におけるアラインメントギャップをもたらすであろう。
本明細書で使用される場合、標的部位における異種目的配列によって生成される「欠失」は、標的部位におけるＤＮＡ配列の正味の欠失を指し、例えば、ここで、異種目的配列におけるコグネイト位置を有さない非編集標的部位におけるヌクレオチドがある。一部の実施形態では、標的核酸配列に対するＰＢＳ配列及び異種目的配列のヌクレオチドアラインメントが、ＰＢＳ配列及び異種目的配列を含む分子におけるアラインメントギャップをもたらすであろう。
本明細書中で用いられる用語「逆位末端反復」又は「ＩＴＲ」は、その対称性のためそう命名されたＡＡＶウイルスシスエレメントを指す。そのエレメントは、ＡＡＶゲノムの有効な増加を促進する。ＩＴＲ機能のための最小エレメントは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；ＡＡＶ２のための５’－ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ－３’；配列番号４６０１）及び末端分離部位（ＴＲＳ；ＡＡＶ２のための５’－ＡＧＴＴＧＧ－３’）並びにヘアピン形成を可能にする可変的な回文配列であると仮定される。本発明に従えば、ＩＴＲは、少なくともこれらの３つのエレメント（ＲＢＳ、ＴＲＳ、及びヘアピンの形成を可能にする配列）を含む。加えて、本発明において、用語「ＩＴＲ」は、知られている天然のＡＡＶ血清型のＩＴＲ（例えば血清型１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１ ＡＡＶのＩＴＲ）を、異なる血清型に由来するＩＴＲエレメントの融合によって形成されるキメラＩＴＲを、そしてその機能的バリアントを指す。「機能的バリアント」は、知られているＩＴＲと、少なくとも８０％、８５％、９０％の、好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を示し、且つＲｅｐタンパク質の存在下で前記ＩＴＲを含む配列の増加を可能にする配列を指す。
「変異領域」という用語は、本明細書で使用される場合、標的核酸中の対応する配列と比べて、１つ又は複数の配列差を有する鋳型ＲＮＡ中の領域を指す。配列差は、例えば、置換、挿入、フレームシフト、又は欠失を含み得る。
用語「（突然）変異型」は、核酸配列に適用されるとき、核酸配列内のヌクレオチドが、参照（例えば、天然）核酸配列に比して、挿入、欠失若しくは変更されていることを意味する。単一の改変が１遺伝子座で為される（点変異）、又は単一遺伝子座で複数のヌクレオチドが挿入、欠失若しくは変更される場合もある。加えて、１核酸配列内の任意の数の遺伝子座で、１つ若しくは複数の改変が為される場合もある。核酸配列は、当技術分野で公知の任意の方法によって変異させることができる。
「核酸分子」は、ＲＮＡ及びＤＮＡ分子の両方を指し、限定しないが、相補的ＤＮＡ（「ｃＤＮＡ」）、ゲノムＤＮＡ（「ｇＤＮＡ」）及びメッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）が挙げられ、本明細書に記載される通り、ＲＮＡ鋳型のように、化学的に合成されるか又は組換えにより生成されるものなどの合成核酸分子も含む。核酸分子は、二本鎖又は一本鎖、環状若しくは線状であり得る。一本鎖の場合、核酸分子は、センス鎖又はアンチセンス鎖であり得る。別に記載のない限り、また一般フォーマット「配列番号」又は「配列番号１を含む核酸」として本明細書に記載される全ての配列の例として、少なくともその一部が、（ｉ）配列番号１の配列、又は（ｉｉ）配列番号１と相補的な配列のどちらかを有する核酸を指す。２つのどちらを選択するかは、配列番号１が使用される状況によって決定される。例えば、核酸がプローブとして使用される場合、２つの間の選択は、プローブが、所望の標的と相補的であるという要件によって決定される。本開示の核酸配列は、当業者に容易に理解されるように、化学的若しくは生化学的に修飾され得るか、又は非天然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有し得る。こうした修飾として、例えば、標識、メチル化、類似体による１つ若しくは複数の自然発生的なヌクレオチドの置換、無電荷結合（例えば、メチルホスホン酸、リン酸トリエステル、ホスホロアミダート、カルバミン酸塩など）、電荷結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）などのヌクレオチド間修飾、ペンダント部分、（例えば、ポリペプチド）、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）、キレート剤、アルキル化剤、及び修飾結合（例えば、α－アノマー核酸など）が挙げられる。化学修飾塩基（例えば、表１３を参照）、バックボーン（例えば、表１４を参照）、及び修飾キャップ（例えば、表１５を参照）も含まれる。水素結合及びその他の化学的相互作用により指定配列と結合する能力についてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。こうした分子は、当技術分野において公知であり、例えば、分子の骨格中のリン酸結合の代わりにペプチド結合を使用するもの、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）がある。他の修飾として、例えば、リボース環が、架橋部分又は「ロックド」核酸（ＬＮＡ）に見いだされる修飾などの他の構造を含む類似体を挙げることができる。種々の実施形態において、核酸は、追加の遺伝的エレメント、例えば、組織特異的発現－制御配列（例えば、組織特異的プロモータ及び組織特異的マイクロＲＮＡ認識配列）並びに追加のエレメント、例えば逆位反復（例えば逆位末端反復、例えば、ウイルスに由来するエレメント（例えばＡＡＶ ＩＴＲ））及びタンデム反復、逆位反復／直接反復、相同性領域（標的ＤＮＡに対する相同性の程度が異なるセグメント）、非翻訳領域（ＵＴＲ）（５’、３’、又は５’と３’両方のＵＴＲ）並びに前述のものの種々の組合せと作用関連している。本発明によって提供されるシステムの核酸エレメントは、一本鎖、二本鎖の、環状、直鎖状、オープンエンドの直鎖状、クローズドエンドの直鎖状、及びこれらの特定のバージョン、例えばｄｏｇｇｙｂｏｎｅ ＤＮＡ（ｄｂＤＮＡ）、クローズドエンドのＤＮＡ（ｃｅＤＮＡ）が挙げられる種々のトポロジーで提供され得る。
本明細書で使用される場合、「遺伝子発現単位」は、少なくとも１つのエフェクター配列に作動可能に連結された少なくとも１つの調節核酸配列を含む核酸配列である。第１の核酸配列は、第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的に関連して配置されるとき、第２の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモータ又はエンハンサーは、プロモータ又はエンハンサーが、コード配列の転写若しくは発現に影響を及ぼす場合、コード配列と作動可能に連結している。作動可能に連結したＤＮＡ配列は、連続的又は非連続であり得る。２つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、作動可能に連結した配列が同じリーディングフレーム内に存在し得る。
「宿主ゲノム」又は「宿主細胞」という用語は、本明細書で使用される場合、タンパク質及び／又は遺伝材料が導入された細胞及び／又はそのゲノムを指す。こうした用語は、特定の対象細胞及び／又はゲノムだけではなく、そのような細胞の子孫及び／又はそのような細胞の子孫のゲノムも指す。特定の修飾は、変異又は環境の影響により後の世代に起こり得ることから、こうした子孫は、実際、親細胞と同一ではない場合もあるが、やはり本明細書で使用される用語「宿主細胞」の範囲に含まれることを理解されたい。宿主ゲノム又は宿主細胞は、単離された細胞若しくは培養で増殖した細胞株又はそうした細胞若しくは細胞株から単離されたゲノム物質であり得るか、或いは生体組織若しくは生物を構成する宿主細胞又は宿主ゲノムであり得る。いくつかの事例では、宿主細胞は、例えば、本明細書で記載されるように、動物細胞又は植物細胞であり得る。特定の例では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、ヒト細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、ブタ細胞、ヤギ細胞、ヒツジ細胞、ニワトリ細胞、又はシチメンチョウ細胞であり得る。特定の例では、宿主細胞は、トウモロコシ細胞、ダイズ細胞、コムギ細胞、又はコメ細胞であり得る。
本明細書中で用いられる「作用関連」は、２つの核酸配列、例えば１）プロモータと、２）異種目的配列との機能的関係を説明し、そしてそのような例では、プロモータ及び異種目的配列（例えば、注目する遺伝子）は、適切な条件の下で、プロモータが異種目的配列の発現を駆動するように、向きを定められていることを意味する。例えば、プロモータと異種目的配列とを有する鋳型核酸は、例えば、（＋）又は（－）の向きの一本鎖であり得る。この鋳型中のプロモータと異種目的配列との間の「作用関連」は、鋳型核酸が特定の状態で転写されることとなるか否かに拘らず、適切な状態にある（例えば、必要とされる触媒因子及びＮＴＰその他の存在下で、（＋）の向きである）場合、正確に転写されることを意味する。作用関連は、他の組織特異的発現制御配列（例えば、エンハンサー、リプレッサ、及びマイクロＲＮＡ認識配列）、ＩＲ／ＤＲ、ＩＴＲ、ＵＴＲ、又は相同性領域、及び異種目的配列、又はレトロウイルスＲＴドメインをコードする配列が挙げられる、核酸の他の対に類似して当て嵌まる。
「プライマー結合部位配列」又は「ＰＢＳ配列」という用語は、本明細書で使用される場合、標的核酸配列に含まれる領域に結合することが可能な、鋳型ＲＮＡの部分を指す。いくつかの事例では、ＰＢＳ配列は、標的核酸配列に含まれる領域に対して１００％の同一性を有する少なくとも３、４、５、６、７又は８つの塩基を含む核酸配列である。一部の実施形態では、プライマー領域は、標的核酸配列に含まれる領域に対して１００％の同一性を有する少なくとも５、６、７、８つの塩基を含む。特定の理論に束縛されることを意図しないが、一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡが、ＰＢＳ配列及び異種目的配列を含む場合、ＰＢＳ配列は、標的核酸配列に含まれる領域に結合して、逆転写酵素ドメインが、逆転写のためのプライマーとしてその領域を使用し、逆転写のための鋳型として異種目的配列を使用することを可能にする。
本明細書中で用いられる「ステム－ループ配列」は、自己相補性がステム－ループを形成するのに十分な、例えば、少なくとも２（例えば、３、４、５、６、７、８、９又は１０）塩基対を含むステム、及び少なくとも３（例えば４）塩基対を有するループを有する、核酸配列（例えばＲＮＡ配列）を指す。ステムは、ミスマッチ又はバルジを含み得る。
本明細書中で用いられる「組織特異的発現－制御配列」は、異種目的配列を、標的組織内に組織特異的に、例えばオフターゲット組織と比較してオンターゲット組織内に優先的に含む転写産物のレベルを増減する核酸エレメントを意味する。一部の実施形態において、組織特異的発現－制御配列は、異種目的配列を、標的組織内に組織特異的に、例えばオフターゲット組織と比較してオンターゲット組織内に優先的に含む転写産物の転写、活性、又は半減期を優先的に駆動又は抑制する。例示的な組織特異的発現－制御配列は、組織特異的プロモータ、リプレッサ、エンハンサー又はそれらの組合せ、及び組織特異的マイクロＲＮＡ認識配列を含む。組織特異性は、オンターゲット（鋳型核酸の発現又は活性が所望されるか、又は容認できる組織）、及びオフターゲット（鋳型核酸の発現又は活性が所望されないか、又は容認できない組織）を指す。例えば、組織特異的プロモータは、オフターゲット組織と比較して、オンターゲット組織内で優先的に発現を駆動する。これに対し、組織特異的マイクロＲＮＡ認識配列に結合するマイクロＲＮＡは、オンターゲット組織と比較して、オフターゲット組織内で優先的に発現されることにより、オフターゲット組織内での鋳型核酸の発現を引き下げる。従って、同じ組織、例えば標的組織に特有のプロモータ及びマイクロＲＮＡ認識配列は、組織内での関連配列の転写、活性、又は半減期に関して、対照的な機能を有する（発現レベルを一致させて、すなわち、オフターゲット組織内でのマイクロＲＮＡの高いレベル、及びオンターゲット組織内での低いレベルをそれぞれ促進且つ抑制する一方、プロモータは、オンターゲット組織内での高い発現、及びオフターゲット組織内での低い発現を駆動する）。
見出し一覧
１）導入
２）遺伝子改変システム
ａ）遺伝子改変システムのポリペプチド成分
ｉ）ライティングドメイン
ｉｉ）エンドヌクレアーゼドメイン及びＤＮＡ結合ドメイン
（１）Ｃａｓドメインを含む遺伝子改変ポリペプチド
（２）ＴＡＬエフェクター及びジンクフィンガーヌクレアーゼ
ｉｉｉ）リンカー
ｉｖ）遺伝子改変システムのための局在化配列
ｖ）遺伝子改変ポリペプチド及びシステムの進化型変異体
ｖｉ）インテイン
ｖｉｉ）更なるドメイン
ｂ）鋳型核酸
ｉ）ｇＲＮＡスペーサー及びｇＲＮＡスキャフォールド
ｉｉ）異種目的配列
ｉｉｉ）ＰＢＳ配列
ｉｖ）例示的な鋳型配列
ｃ）誘導性活性を有するｇＲＮＡ
ｄ）遺伝子改変システムにおける環状ＲＮＡ及びリボザイム
ｅ）標的核酸部位
ｆ）第２の鎖ニッキング
３）組成物及びシステムの作製
４）治療用途
５）投与及び送達
ａ）組織特異的活性／投与
ｉ）プロモータ
ｉｉ）ｍｉｃｒｏＲＮＡ
ｂ）ウイルスベクター及びその成分
ｃ）ＡＡＶ投与
ｄ）脂質ナノ粒子
６）キット、製品、及び医薬組成物
７）化学、製造、及び制御（ＣＭＣ）
導入
本開示は、アルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）を処置するための方法及び例えばインビボ又はインビトロで細胞、組織又は対象におけるＤＮＡ配列内の１つ以上の位置においてＤＮＡ配列をターゲティング、編集、改変又は操作する（例えば、哺乳動物ゲノムの標的部位に異種目的配列を挿入する）ための組成物に関する。異種目的ＤＮＡ配列は、例えば、置換を含み得る。
より具体的には、本開示は、例えば、目的の配列に１つ以上のヌクレオチドを挿入、欠失、又は置換することにより、対象のゲノムＤＮＡ配列を変更するための逆転写酵素ベースのシステムを使用してＡＡＴＤを処置する方法を提供する。
本開示は、部分的に、遺伝子改変ポリペプチド成分及び鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）成分を含む遺伝子改変システムを用いて、ＡＡＴＤを処置する方法を提供する。一部の実施形態において、遺伝子改変システムを用いて、ゲノム内の標的部位中に改変を導入することができる。一部の実施形態において、遺伝子改変ポリペプチド成分は、ライティングドメイン（例えば逆転写酵素ドメイン）、ＤＮＡ結合ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメイン（例えばニッカーゼドメイン）を含む。一部の実施形態において、鋳型核酸（例えば鋳型ＲＮＡ）は、ゲノム内の標的部位に結合する（例えば、標的部位の第２の鎖に結合する）配列（例えばｇＲＮＡスペーサー）、遺伝子改変ポリペプチド成分に結合する配列（例えばｇＲＮＡスキャフォールド）、異種目的配列及びＰＢＳ配列を含む。理論によって拘束されることを望むものではないが、鋳型核酸（例えば鋳型ＲＮＡ）は、ゲノム内の標的部位の第２の鎖に結合して、遺伝子改変ポリペプチド成分に結合する（例えば、ゲノム内の標的部位にポリペプチド成分を局在化させる）と考えられる。遺伝子改変ポリペプチド成分のエンドヌクレアーゼ（例えばニッカーゼ）は、標的部位（例えば、標的部位の第１の鎖）を切断して、例えば、ＰＢＳ配列が、標的部位の第１の鎖上で改変されることとなる部位に隣接する配列に結合し得ると考えられる。ポリペプチド成分のライティングドメイン（例えば、逆転写酵素ドメイン）は、プライマーとしての鋳型核酸のＰＢＳ配列及び鋳型としての鋳型核酸の異種目的配列を含む相補的配列に結合された標的部位の第１の鎖を用いて、例えば、異種目的配列に相補的な配列を重合すると考えられる。理論によって拘束されることを望むものではないが、適切な異種目的配列の選択は、標的部位での１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失及び／又は挿入をもたらし得ると考えられる。
遺伝子改変システム
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変システムは、（Ａ）遺伝子改変ポリペプチド又は遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸を含み、ここで、遺伝子改変ポリペプチドは、（ｉ）逆転写酵素ドメイン、及び（ｘ）ＤＮＡ結合機能性を含むエンドヌクレアーゼドメイン又は（ｙ）エンドヌクレアーゼドメイン及び別個のＤＮＡ結合ドメインのいずれか；並びに（Ｂ）鋳型ＲＮＡを含む。遺伝子改変ポリペプチドは、一部の実施形態では、宿主機構に実質的に依存せずに、鋳型核酸配列を、標的ＤＮＡ分子（例えば、宿主細胞内のゲノムＤＮＡ分子などの、哺乳動物宿主細胞内）に組み込むことが可能な実質的に自律的なタンパク質機構として働く。例えば、遺伝子改変タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメイン、逆転写酵素ドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインを含み得る。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合機能は、タンパク質をＤＮＡ配列に導くＲＮＡ成分、例えば、ｇＲＮＡスペーサーを含み得る。他の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、逆転写酵素ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインを含み得る。遺伝子改変システムのＲＮＡ鋳型エレメントは、典型的に、遺伝子改変ポリペプチドエレメントに対して異種であり、宿主ゲノム内に挿入（逆転写）される目的配列を提供する。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、標的プライミング逆転写が可能である。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、第２の鎖合成が可能である。
一部の実施形態では、遺伝子改変システムは、第２のポリペプチドと組み合わされる。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、エンドヌクレアーゼドメインを含み得る。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ポリメラーゼドメイン、例えば、逆転写酵素ドメインを含み得る。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼドメインを含み得る。一部の実施形態では、第２のポリペプチドは、例えば、第２の鎖合成又はＤＮＡ修復回復に寄与することにより、ゲノム編集の完了を補助する。
機能的遺伝子改変ポリペプチドは、無関係なＤＮＡ結合、逆転写、及びエンドヌクレアーゼドメインから構成され得る。このモジュラー構造は、機能ドメイン、例えば、ｄＣａｓ９（ＤＮＡ結合）、ＭＭＬＶ逆転写酵素（逆転写）、ＦｏｋＩ（エンドヌクレアーゼ）の組合せを可能にする。一部の実施形態では、複数の機能ドメインは、単一のタンパク質、例えば、Ｃａｓ９又はＣａｓ９ニッカーゼ（ＤＮＡ結合、エンドヌクレアーゼ）から起こることがある。
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、集合的に、１）鋳型核酸への結合、２）標的ＤＮＡ分子への結合を促進し、３）鋳型核酸の少なくとも一部の、標的ＤＮＡへの組み込みを促進する１つ又は複数のドメインを含む。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、対応する天然配列に対する１つ又は複数のアミノ酸置換を含む改変されたポリペプチドである。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、例えば、それ以外には野生型ドメインの異種融合（又は他のコンジュゲート）並びに修飾ドメインの融合による、例えば、異種サブドメイン又は他の置換ドメインの置換又は融合による、互いに対して異種である２つ以上のドメインを含む。例えば、一部の実施形態では、ＲＴドメインが、ＤＢＤに対して異種であるか；ＤＢＤが、エンドヌクレアーゼドメインに対して異種であるか；又はＲＴドメインが、エンドヌクレアーゼドメインに対して異種であるかの１つ又は複数である。
一部の実施形態では、システムにおける使用のための鋳型ＲＮＡ分子は、５’から３’に、（１）ｇＲＮＡスペーサー；（２）ｇＲＮＡスキャフォールド；（３）異種目的配列（４）プライマー結合部位（ＰＢＳ）配列を含む。一部の実施形態では：
（１）約１８～２２ｎｔのｇＲＮＡスペーサーであり、例えば、２０ｎｔであり、
（２）１つ又は複数のヘアピンループ、例えば、鋳型を、Ｃａｓドメイン、例えば、ニッカーゼＣａｓ９ドメインと会合するための１、２、又は３つのループを含むｇＲＮＡスキャフォールドである。一部の実施形態では、ｇＲＮＡスキャフォールドは、５’から３’にかけて、ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＧＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＣＣ（配列番号５００８）の配列を含む。
（３）一部の実施形態では、異種目的配列は、長さが、例えば、７～７４、例えば、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０又は７０～８０ｎｔ若しくは８０～９０ｎｔである。一部の実施形態では、配列の第１の（大抵５’）塩基は、Ｃでない。
（４）一部の実施形態では、ニッキングが起きた後、標的プライミング配列に結合するＰＢＳ配列は、例えば、３～２０ｎｔ、例えば、７～１５ｎｔ、例えば、１２～１４ｎｔである。一部の実施形態では、ＰＢＳ配列は、４０～６０％のＧＣ含量を有する。
一部の実施形態では、システムと会合される第２のｇＲＮＡは、完全な組み込みの駆動を補助し得る。一部の実施形態では、第２のｇＲＮＡは、第１の鎖ニックから０～２００ｎｔ離れた、例えば、第１の鎖ニックから０～５０、５０～１００、１００～２００ｎｔ離れた位置を標的にし得る。一部の実施形態では、第２のｇＲＮＡは、編集がなされた後、その標的配列にのみ結合することができ、例えば、ｇＲＮＡは、異種目的配列内に存在するが、初期標的配列内に存在しない配列に結合する。
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変システムを使用して、ＨＥＫ２９３、Ｋ５６２、Ｕ２ＯＳ、又はＨｅＬａ細胞に編集を実施する。一部の実施形態では、遺伝子改変システムを使用して、初代細胞、例えば、Ｅ１８．５マウスからの初代皮質ニューロンに編集を実施する。
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変ポリペプチドは、ＭｏＭＬＶ ＲＴ配列又はその変異体を含む逆転写酵素又はＲＴドメイン（例えば、本明細書に記載される）を含む。複数の実施形態では、ＭｏＭＬＶ ＲＴ配列は、Ｄ２００Ｎ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３３０Ｐ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｄ５２４Ｇ、Ｅ５６２Ｑ、Ｄ５８３Ｎ、Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｅ６７Ｋ、Ｔ１９７Ａ、Ｈ２０４Ｒ、Ｅ３０２Ｋ、Ｆ３０９Ｎ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ、Ｈ５９４Ｑ、Ｄ６５３Ｎ、Ｒ１１０Ｓ、及びＫ１０３Ｌから選択される１つ又は複数の変異を含む。複数の実施形態では、ＭｏＭＬＶ ＲＴ配列は、任意選択で、Ｔ３０６Ｋ及び／又はＷ３１３Ｆを更に含む、Ｄ２００Ｎ、Ｌ６０３Ｗ、及びＴ３３０Ｐなどの変異の組合せを含む。
いくつかの実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン（例えば、本明細書に記載されるもの）ｎＣａｓ９、例えば、Ｎ８６３Ａ変異（例えば、ｓｐＣａｓ９内）又はＨ８４０Ａ変異を含む。
一部の実施形態では、（例えば、本明細書に記載されるシステムの）異種目的配列は、約１～５０、５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、９００～１０００、又はそれ以上のヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、ＲＴ及びエンドヌクレアーゼドメインは、例えば、アミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳ（配列番号５００６）を含む、フレキシブルリンカーによって連結される。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＲＴドメインに対するＮ末端である。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＲＴドメインに対するＣ末端である。
一部の実施形態では、システムは、例えば、本明細書に記載のように、ＴＰＲＴによって異種目的配列を標的部位に組み込む。
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインを含む。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、ＲＮＡ結合ドメインを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、Ｂ－ボックスタンパク質のＲＮＡ結合ドメイン、ＭＳ２コートタンパク質、ｄＣａｓ、又は本明細書中の表の配列のエレメントを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、標準ＲＮＡ結合ドメインより高い親和性で鋳型ＲＮＡに結合することができる。
一部の実施形態では、遺伝子改変システムは、少なくとも４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５若しくは１００ヌクレオチド（及び任意選択で５００以下、４００、３００、２００、又は１００ヌクレオチド）の標的部位に挿入を生成することができる。一部の実施形態では、遺伝子改変システムは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５若しくは１００ヌクレオチド（及び任意選択で５００、４００、３００、２００若しくは１００ヌクレオチド以下）の標的部位に挿入を生成することができる。一部の実施形態では、遺伝子改変システムは、少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５又は１０キロベース（及び任意選択で１、５、１０又は２０キロベース以下）の標的部位に挿入を生成することができる。一部の実施形態では、遺伝子改変システムは、少なくとも８１、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０若しくは２００ヌクレオチド（及び任意選択で５００、４００、３００若しくは２００ヌクレオチド以下）の欠失を生成することができる。一部の実施形態では、遺伝子改変システムは、少なくとも８１、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０若しくは２００ヌクレオチド（及び任意選択で５００、４００、３００若しくは２００ヌクレオチド以下）の欠失を生成することができる。一部の実施形態では、遺伝子改変システムは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０若しくは２００ヌクレオチド（及び任意選択で５００、４００、３００若しくは２００ヌクレオチド以下）の欠失を生成することができる。一部の実施形態では、遺伝子改変システムは、少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５若しくは１０キロベース（及び任意選択で１、５、１０若しくは２０キロベース以下）の欠失を生成することができる。一部の実施形態では、遺伝子改変システムは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００又はそれ以上のヌクレオチドの標的部位に置換を生成することができる。一部の実施形態では、遺伝子改変システムは、１～２、２～３、３～４、４～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０若しくは９０～１００ヌクレオチドの標的部位に置換を生成することができる。
一部の実施形態では、置換は、塩基転位型変異である。一部の実施形態では、置換は、トランスバージョン変異である。一部の実施形態では、置換は、アデニンをチミンに、アデニンをグアニンに、アデニンをシトシンに、グアニンをチミンに、グアニンをシトシンに、グアニンをアデニンに、チミンをシトシンに、チミンをアデニンに、チミンをグアニンに、シトシンをアデニンに、シトシンをグアニンに、又はシトシンをチミンに変換する。
一部の実施形態では、挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、遺伝子の発現（例えば、転写又は翻訳）を増加又は減少させる。一部の実施形態では、挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、プロモータ又はエンハンサー内の配列、例えば転写因子に結合する配列を改変し、付加し、又は欠失させることにより、遺伝子の発現（例えば、転写又は翻訳）を増加又は減少させる。一部の実施形態では、挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、遺伝子の翻訳を改変し（例えば、アミノ酸配列を改変し）、開始若しくは停止コドンを挿入するか若しくは欠失させ、遺伝子の翻訳フレームを改変若しくは修復する。一部の実施形態では、挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、例えば、スプライスアクセプター又はドナー部位を挿入し、欠失させ、又は改変することにより、遺伝子のスプライシングを改変する。一部の実施形態では、挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、転写物又はタンパク質の半減期を改変する。一部の実施形態では、挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、細胞におけるタンパク質局在化を改変する（例えば、細胞質からミトコンドリアにかけて、細胞質から細胞外空間内へ（例えば、分泌タグを付加する））。一部の実施形態では、挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、タンパク質フォールディングを改変する（例えば、改善する）（例えば、ミスフォールドタンパク質の蓄積を阻止するため）。一部の実施形態では、挿入、欠失、置換、又はそれらの組合せは、遺伝子、例えば、遺伝子によってコードされるタンパク質の活性を改変し、増加させ、減少させる。
例示的な遺伝子改変ポリペプチド、及びそれらを含むシステム及びそれらを使用する方法が、例えば、アミノ酸及びその中の核酸配列を含め、レトロウイルスＲＴドメインに関して参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０２０９４８号明細書に記載される。
例示的な遺伝子改変ポリペプチド及びレトロウイルスＲＴドメイン配列は、例えば、２０２１年３月４日に出願された国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２１／２０９４８号明細書、例えばその中の表３０、表３１及び表４４にも記載され；この出願全体が例えば前記配列及び表中のレトロウイルスＲＴに関して参照により本明細書に組み込まれる。従って、本明細書に記載される遺伝子改変ポリペプチドは、この段落に記載された表のいずれかに従うアミノ酸配列又はそのドメイン（例えば、レトロウイルスＲＴドメイン）、又は上記のいずれかのその機能的フラグメント若しくはバリアント、又はそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるシステムのいずれかにおける使用のためのポリペプチドは、複数の相同タンパク質の整列されたポリペプチド配列に基づく、分子再構築体又は祖先再構築体であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載されるシステムのいずれかにおける使用のための逆転写酵素ドメインは、分子再構築体若しくは祖先再構築体であり得、又は同じ又は異なる源からの逆転写酵素ドメインのアラインメントに基づいて、特定の残基において修飾され得る。当業者は、本明細書に提供される受入番号に基づき、例えば、保存ドメイン分析のためのＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）又はＣＤ－Ｓｅａｒｃｈのような常用の配列分析ツールを使用することにより、ポリペプチド又は核酸配列を整列させることができる。分子再構築体は、配列コンセンサスに基づき、例えば、Ｉｖｉｃｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １９９７，５０１－５１０；Ｗａｇｓｔａｆｆ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ２０１３，８８－９９に記載の手法を用いて作製され得る。
遺伝子改変システムのポリペプチド成分
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、ＤＮＡ標的部位結合、鋳型核酸（例えば、ＲＮＡ）結合、ＤＮＡ標的部位切断、及び鋳型核酸（例えば、ＲＮＡ）ライティング、例えば、逆転写の機能を有する。一部の実施形態では、各機能は、異なるドメイン内に含まれる。一部の実施形態では、機能は、２つ以上のドメインに起因し得る（例えば、２つ以上のドメインは、一緒に機能性を示す）。一部の実施形態では、２つ以上のドメインは、同一又は類似機能を有し得る（例えば、２つ以上のドメインは、それぞれ独立して、例えば、２つの異なるＤＮＡ配列において、ＤＮＡ結合機能性を有する）。他の実施形態では、１つ又は複数のドメインは、１つ又は複数の機能を実行可能であり、例えば、Ｃａｓ９ドメインは、ＤＮＡ結合及び標的部位切断の両方を実行可能であり得る。一部の実施形態では、ドメインは全て、単一のポリペプチド内部に位置する。一部の実施形態では、第１ドメインは、第１ポリペプチド中に存在し、第２ドメインは、第２ポリペプチド中に存在する。例えば、一部の実施形態では、配列は、第１ポリペプチドと第２ポリペプチドとの間で分割され得、例えば、第１ポリペプチドは、逆転写酵素（ＲＴ）ドメインを含み、且つ第２ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメイン、例えばニッカーゼドメインを含む。更なる例として、一部の実施形態では、第１ポリペプチド及び第２ポリペプチドのそれぞれは、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、第１ＤＮＡ結合ドメイン及び第２ＤＮＡ結合ドメイン）を含む。一部の実施形態では、第１及び第２のポリペプチドは、翻訳後、スプリットインテインを介して結合されて、単一の遺伝子改変ポリペプチドを形成し得る。
いくつかの態様では、本明細書に記載される遺伝子改変ポリペプチドは、（例えば、本明細書に記載されるシステムは、以下を含む遺伝子改変ポリペプチドを含む）：１）Ｃａｓドメイン（例えば、Ｃａｓニッカーゼドメイン、例えばＣａｓ９ニッカーゼドメイン）；２）表Ｄの逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列であって、ＲＴドメインが、ＣａｓドメインのＣ末端である、逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン；及びＲＴドメインとＣａｓドメインとの間に配置されるリンカーであって、表ＤのＲＴドメインと同じ行からの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を有する、リンカーを含む。
一部の実施形態では、ＲＴドメインは、表ＤのＲＴドメインとの１００％の同一性を有する配列を有し、リンカーは、表ＤのＲＴドメインと同じ行からのリンカー配列との１００％の同一性を有する配列を有する。一部の実施形態では、Ｃａｓドメインは、表８の配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列表中の配列番号１～３３３２のいずれかに従うアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、Ｃａｓドメインとリンカーとの間のＧＧアミノ酸配列、ＲＴドメインと第２のＮＬＳとの間のＡＧアミノ酸配列、及び／又はリンカーとＲＴドメインとの間のＧＧアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、第１のＮＬＳ及びＣａｓドメインを含む配列番号４０００の配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、第２のＮＬＳを含む配列番号４００１の配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。
例示的なＮ末端ＮＬＳ－Ｃａｓ９ドメイン
Figure 2024533312000001
ＮＬＳを含む例示的なＣ末端配列
ＡＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＡＫＶＥ（配列番号４００１）
ライティングドメイン（ＲＴドメイン）
本発明の特定の態様では、遺伝子改変システムのライティングドメインは、逆転写酵素活性を有し、逆転写酵素ドメイン（ＲＴドメイン）とも称される。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、ＲＴ触媒部分、ＲＮＡ結合領域（例えば、鋳型ＲＮＡに結合する領域）を含む。
一部の実施形態では、逆転写酵素をコードする核酸は、例えばヒト細胞について改善された、改変されたコドン使用を有するように、その天然配列から改変される。一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、レトロウイルスからの異種の逆転写酵素である。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドを含むＲＴドメインは、その元のアミノ酸配列から変異されている、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００の置換を有する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、レトロウイルスのＲＴ、例えば、ＨＩＶ－１ ＲＴ、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）（ＭＭＬＶ）ＲＴ、トリ骨髄芽球症ウイルス（ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＶ）ＲＴ、又はラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ Ｓａｒｃｏｍａ Ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）ＲＴに由来する。
一部の実施形態では、レトロウイルス逆転写酵素（ＲＴ）ドメインは、ターゲットプライム逆転写（ＴＰＲＴ）開始の、例えば内因性ＲＴドメインと比較して増加したストリンジェンシーを示す。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、第１の鎖ニックの直ぐ上流の標的部位内の３ｎｔ、例えばＲＮＡ鋳型をプライムするゲノムＤＮＡが、ＲＮＡ鋳型中の相同性の３ｎｔに対して少なくとも６６％若しくは１００％の相補性を有するとき、ＴＰＲＴを開始する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、鋳型ＲＮＡの相同性と標的ＤＮＡプライミング逆転写との間で５ｎｔ未満が一致しない（例えば、１、２、３、４又は５ｎｔ未満が一致しない）とき、ＴＰＲＴを開始する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、ＴＰＲＴ反応のプライミングでのミスマッチにおけるストリンジェンシーが増加するように修飾され、例えば、ＲＴドメインは、野生型（例えば、非修飾）ＲＴドメインと比較して、プライミング領域内でのミスマッチを全く許容しないか、又はミスマッチをより少なければ許容する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、ＨＩＶ－１ ＲＴドメインを含む。複数の実施形態では、ＨＩＶ－１ ＲＴドメインは、代替的なＲＴドメイン（例えば、Ｊａｍｂｕｒｕｔｈｕｇｏｄａ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ４０７（５）：６６１－６７２（２０１１）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって記載のとおり）と比較して、３つのヌクレオチドミスマッチであっても、より低いレベルで合成を開始する。
一部の実施形態では、ＲＴドメインは、二量体（例えば、ヘテロ二量体又はホモ二量体）を形成する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、単量体である。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、天然には単量体又は二量体（例えば、ヘテロ二量体又はホモ二量体）として機能する。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、天然には単量体として機能する、例えば、単量体として機能するウイルスに由来する。実施形態では、ＲＴドメインは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ；ＭｏＭＬＶとも呼ばれる）（例えば、Ｐ０３３５５）、ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ４ＶＦＺ２）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０３３６５）、トリ細網内皮症ウイルス（ＡＶＩＲＥ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ｐ０３３６０）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ又はＦｅＬＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号：Ｐ１０２７３）；メイソン・ファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０７５７２）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０３３６１）、ヒトＴ細胞白血病ウイルス－１（ＨＴＬＶ－１）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０３３６２）、ヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１４３５０）、サル泡沫状ウイルス（ＳＦＶ）（例えば、ＳＦＶ３Ｌ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ２３０７４又はＰ２７４０１）若しくはウシ泡沫状／合胞体ウイルス（ＢＦＶ／ＢＳＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｏ４１８９４）、又はそれらの機能的断片若しくはバリアント（例えば、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列）からのＲＴドメインから選択される。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、その天然機能性において二量体である。一部の実施形態では、ＲＴドメインは、二量体として機能するウイルスに由来する。複数の実施形態では、ＲＴドメインは、トリ肉腫／白血病ウイルス（ａｖｉａｎ ｓａｒｃｏｍａ／ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＡＳＬＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ａ０Ａ１４２ＢＫＨ１）、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０３３５４）、トリ骨髄芽球症ウイルス（ａｖｉａｎ ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ８３１３３）、ヒト免疫不全ウイルスＩ型（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ Ｉ）（ＨＩＶ－１）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０３３６９）、ヒト免疫不全ウイルスＩＩ型（ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ＩＩ）（ＨＩＶ－２）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１５８３３）、サル免疫不全ウイルス（ｓｉｍｉａｎ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）（ＳＩＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０５８９６）、ウシ免疫不全ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）（ＢＩＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１９５６０）、ウマ感染性貧血ウイルス（ｅｑｕｉｎｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ａｎｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＥＩＡＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０３３７１）、又はネコ免疫不全ウイルス（ｆｅｌｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ ｖｉｒｕｓ）（ＦＩＶ）（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ１６０８８）（Ｈｅｒｓｃｈｈｏｒｎ ａｎｄ Ｈｉｚｉ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ ６７（１６）：２７１７－２７４７（２０１０））、又はその機能性断片若しくは変異体（例えば、それと少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列）からのＲＴドメインから選択される。天然には、ヘテロ二量体ＲＴドメインは、一部の実施形態では、ホモ二量体として機能的でもあり得る。一部の実施形態では、二量体ＲＴドメインは、融合タンパク質として、例えば、ホモ二量体融合タンパク質又はヘテロ二量体融合タンパク質として発現される。一部の実施形態では、システムのＲＴ機能は、（例えば、本明細書に記載のような）複数のＲＴドメインによって満たされる。更なる実施形態では、複数のＲＴドメインは、融合されるか又は分かれており、例えば、同じポリペプチド上又は異なるポリペプチド上に存在し得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変システムは、インテグラーゼドメインを含み、例えば、インテグラーゼドメインは、ＲＴドメインの一部であり得る。一部の実施形態では、ＲＴドメイン（例えば、本明細書に記載される）は、インテグラーゼドメインを含む。一部の実施形態では、ＲＴドメイン（例えば、本明細書に記載される）は、インテグラーゼドメインを欠いており、又は変異若しくは欠失によって不活性化されているインテグラーゼドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変システムは、リボヌクレアーゼＨドメインを含み、例えば、リボヌクレアーゼＨドメインは、ＲＴドメインの一部であり得る。一部の実施形態では、ＲＮａｓｅ Ｈドメインは、ＲＴドメインの一部ではなく、フレキシブルリンカーを介して共有結合的に連結される。一部の実施形態では、ＲＴドメイン（例えば、本明細書に記載される）は、リボヌクレアーゼＨドメイン、例えば、内因性リボヌクレアーゼＨドメイン又は異種リボヌクレアーゼＨドメインを含む。一部の実施形態では、ＲＴドメイン（例えば、本明細書に記載される）は、リボヌクレアーゼＨドメインを欠いている。一部の実施形態では、ＲＴドメイン（例えば、本明細書に記載される）は、異種リボヌクレアーゼＨドメインに対して、付加、欠失、変異、又は交換されているリボヌクレアーゼＨドメインを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、不活性化内因性ＲＮａｓｅ Ｈドメインを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドの他のドメインの１つからの内因性ＲＮａｓｅ Ｈドメインは、それがポリペプチドに含まれないように遺伝子的に除去され、例えば、内因性ＲＮａｓｅ Ｈドメインは、ドメインを含むポリペプチドから部分的に又は完全に切断される。一部の実施形態では、リボヌクレアーゼＨドメインの変異は、例えば、Ｋｏｔｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ １６（１）：２６５－２７７（１９８８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）における方法による測定として、例えば、変異を有しない他の類似ドメインと比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％若しくは９０％だけより低い、より低いリボヌクレアーゼ活性を示すポリペプチドを生成する。一部の実施形態では、リボヌクレアーゼＨ活性は、消失する。
一部の実施形態では、ＲＴドメインは、変異を受け、変異を有しない他の類似ドメインと比較して忠実度が増加する。例えば、一部の実施形態では、ＲＴドメイン内（例えば、逆転写酵素中）のＹＡＤＤ（配列番号２５６９０）又はＹＭＤＤ（配列番号２５６９１）モチーフは、ＹＶＤＤ（配列番号２５６９２）と置換される。複数の実施形態では、ＹＡＤＤ（配列番号２５６９０）、又はＹＭＤＤ（配列番号２５６９１）、又はＹＶＤＤ（配列番号２５６９２）の置換は、レトロウイルス逆転写酵素活性において、より高い忠実度をもたらす（例えば、Ｊａｍｂｕｒｕｔｈｕｇｏｄａ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０１１に記載される；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変ポリペプチドは、表６に従うアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を有するＲＴドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸は、表６に従うアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を有するＲＴドメインをコードする。
Figure 2024533312000002
Figure 2024533312000003
Figure 2024533312000004
Figure 2024533312000005
Figure 2024533312000006
Figure 2024533312000007
Figure 2024533312000008
Figure 2024533312000009
Figure 2024533312000010
Figure 2024533312000011
Figure 2024533312000012
Figure 2024533312000013
Figure 2024533312000014
Figure 2024533312000015
Figure 2024533312000016
一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、例えば、部位特異的変異によって修飾される。一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、改善された特性を有するように改変され、例えば、ＭＭＬＶ ＲＴ由来のＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ（ＳＳＩＶ）逆転写酵素が挙げられる。一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２００１０６８８９５号パンフレットに記載のように、より低いエラー率を有するように改変され得る。一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、熱安定性が高まるように改変され得る。一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、加工性が高まるように改変され得る。一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、阻害剤に対する耐性を有するように改変され得る。一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、より高速であるように改変され得る。一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、ＲＮＡ鋳型における修飾ヌクレオチドに対する耐性が高まるように改変され得る。一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、修飾ＤＮＡヌクレオチドを挿入するように改変され得る。一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、鋳型ＲＮＡに結合するように改変される。一部の実施形態では、１つ又は複数の変異は、マウス白血病ウイルス逆転写酵素のＲＴドメイン内のＤ２００Ｎ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３３０Ｐ、Ｄ５２４Ｇ、Ｅ５６２Ｑ、Ｄ５８３Ｎ、Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｅ６７Ｋ、Ｔ１９７Ａ、Ｈ２０４Ｒ、Ｅ３０２Ｋ、Ｆ３０９Ｎ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ、Ｈ５９４Ｑ、Ｌ６７１Ｐ、Ｅ６９Ｋ、Ｈ８Ｙ、Ｔ３０６Ｋ若しくはＤ６５３Ｎ、又は別のＲＴドメインの対応する位置での対応する変異から選択される。
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、レトロウイルス逆転写酵素からのＲＴドメイン、例として、例えば、以下の配列を含む野生型Ｍ－ＭＬＶ ＲＴを含む。
Ｍ－ＭＬＶ（ＷＴ）：
Figure 2024533312000017
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、レトロウイルス逆転写酵素からのＲＴドメイン、例として、例えば、以下の配列を含むＭ－ＭＬＶ ＲＴを含む。
Figure 2024533312000018
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、ＮＰ＿０５７９３３のアミノ酸６５９～１３２９の配列を含むレトロウイルス逆転写酵素からのＲＴドメインを含む。複数の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、例えば、以下に示される、ＮＰ＿０５７９３３のアミノ酸６５９～１３２９の配列のＮ末端に、１つの更なるアミノ酸を更に含む。
Figure 2024533312000019
Figure 2024533312000020
実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、ＮＰ＿０５７９３３のアミノ酸６５９～１３２９の配列のＣ末端に、１つの更なるアミノ酸を更に含む。複数の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、ＲＮａｓｅＨ１ドメイン（例えば、ＮＰ＿０５７９３３のアミノ酸１１７８～１３１８）を含む。
一部の実施形態では、レトロウイルス逆転写酵素ドメイン、例えば、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、ＲＴの特徴、例えば、熱安定性、処理能力、及び／又は鋳型結合を改善し得る、野生型配列からの１つ又は複数の変異を含み得る。一部の実施形態では、Ｍ－ＭＬＶ ＲＴドメインは、上のＭ－ＭＬＶ（ＷＴ）配列に対して、例えば、Ｄ２００Ｎ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３３０Ｐ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、Ｄ５２４Ｇ、Ｅ５６２Ｑ、Ｄ５８３Ｎ、Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｅ６７Ｋ、Ｔ１９７Ａ、Ｈ２０４Ｒ、Ｅ３０２Ｋ、Ｆ３０９Ｎ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ、Ｈ５９４Ｑ、Ｄ６５３Ｎ、Ｒ１１０Ｓ、Ｋ１０３Ｌから選択される１つ又は複数の変異、例えば、任意選択でＴ３０６Ｋ及びＷ３１３Ｆを更に含む、Ｄ２００Ｎ、Ｌ６０３Ｗ、及びＴ３３０Ｐなどの変異の組合せを含む。一部の実施形態では、本明細書で用いられるＭ－ＭＬＶ ＲＴは、変異Ｄ２００Ｎ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３３０Ｐ、Ｔ３０６Ｋ及びＷ３１３Ｆを含む。複数の実施形態では、変異体Ｍ－ＭＬＶ ＲＴは、以下のアミノ酸配列を含む。
Ｍ－ＭＬＶ（ＰＥ２）：
Figure 2024533312000021
一部の実施形態では、ライティングドメイン（例えば、ＲＴドメイン）は、例えば、ＲＮＡ配列に特異的に結合するＲＮＡ結合ドメインを含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、ライティングドメインのＲＮＡ結合ドメインによって特異的に結合されるＲＮＡ配列を含む。
一部の実施形態では、逆転写ドメインは、単に、システムの特定の鋳型、例えば、鋳型ＲＮＡを認識し、逆転写する。一部の実施形態では、鋳型は、逆転写ドメインによって認識及び逆転写を可能にする配列又は構造を含む。一部の実施形態では、鋳型は、本明細書に記載されるゲノム改変システムのポリペプチド成分のＲＮＡ結合ドメインとの会合を可能にする配列又は構造を含む。一部の実施形態では、ゲノム改変システムは、会合配列を欠く鋳型より、会合配列を含む鋳型を好ましくは逆転写する。
ライティングドメインは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性も含み得、例えば、ＤＮＡを鋳型ＤＮＡ配列からのゲノムにライティングする能力がある酵素活性を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ重合が、標的部位編集の第２の鎖合成を完了するのに用いられる。一部の実施形態では、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性は、ポリペプチド中のＤＮＡポリメラーゼドメインによって提供される。一部の実施形態では、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ重合、例えば、第２の鎖合成も可能である逆転写酵素ドメインによって提供される。一部の実施形態では、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性は、システムの第２のポリペプチドによって提供される。一部の実施形態では、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性は、任意選択で、ゲノム改変システムの成分により、標的部位に動員される内因性宿主細胞ポリメラーゼによって提供される。
一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、インビトロで、参照逆転写酵素ドメインと比較してより低い確率で不十分な終結率（Ｐｏｆｆ）を有する。一部の実施形態では、参照逆転写酵素ドメインは、ウイルス逆転写酵素ドメイン、例えば、Ｍ－ＭＬＶからのＲＴドメインである。
一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、例えば、１０９４ｎｔのＲＮＡでの測定によると、インビトロで、約５×１０－３／ｎｔ、５×１０－４／ｎｔ、又は５×１０－６／ｎｔ未満の、より低い確率での不十分な終結率（Ｐｏｆｆ）を有する。複数の実施形態では、インビトロでの不十分な終結率は、Ｂｉｂｉｌｌｏ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７（３８）：３４８３６－３４８４５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように決定される。
一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、細胞における組み込みの少なくとも約３０％又は５０％を完了することができる。完全な組み込みのパーセントは、実質的に完全長の組み込み事象（例えば、予想された組み込み配列の少なくとも９８％を含むゲノム部位）の数をｂｙ細胞集団内の（実質的に完全長及び部分を含む）全体の組み込み事象の数で除することによって測定され得る。複数の実施形態では、細胞における組み込みは、例えば、Ｋａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６４５９０３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、ロングリードアンプリコン配列決定を用いて（例えば、組み込み部位を通じて）決定される。
複数の実施形態では、細胞における組み込みの定量化は、鋳型ＲＮＡ（例えば、少なくとも０．０５、０．１、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、３、４若しくは５ｋｂの長さ、例えば、０．５～０．６、０．６～０．７、０．７～０．８、０．８～０．９、１．０～１．２、１．２～１．４、１．４～１．６、１．６～１．８、１．８～２．０、２～３、３～４若しくは４～５ｋｂの長さを有する鋳型ＲＮＡ）に対応するＤＮＡ配列の少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％を含む組み込みの割合を計数することを含む。
一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、インビトロでｄＮＴＰを重合可能である。複数の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、０．１～５０ｎｔ／秒（例えば、０．１～１、１～１０若しくは１０～５０ｎｔ／秒）の速度で、インビトロでｄＮＴＰを重合可能である。複数の実施形態では、逆転写酵素ドメインによるｄＮＴＰの重合は、例えば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｑｕａｋｅ（２００９）ＰＮＡＳ １０６（４８）：２０２９４－２０２９９（その全体が参照により組み込まれる）に記載のように、単一分子アッセイによって測定される。
一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、例えば、Ｙａｓｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ４９２（２）：１４７－１５３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、１×１０－３～１×１０－４又は１×１０－４～１×１０－５個の置換／ｎｔのインビトロエラー率（例えば、ヌクレオチドの誤取り込み）を有する。一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、例えば、Ｋａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６４５９０３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、例えば、ロングリードアンプリコン配列決定により、細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）内で１×１０－３～１×１０－４又は１×１０－４～１×１０－５個の置換／ｎｔのエラー率（例えば、ヌクレオチドの誤取り込み）を有する。
一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、インビトロで標的ＲＮＡの逆転写を実施することが可能である。一部の実施形態では、逆転写酵素は、鋳型の逆転写を開始するため、少なくとも３ヌクレオチドのプライマーを必要とする。一部の実施形態では、標的ＲＮＡの逆転写は、例えば、Ｂｉｂｉｌｌｏ ａｎｄ Ｅｉｃｋｂｕｓｈ（２００２）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７７（３８）：３４８３６－３４８４５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、（例として、例えば、３’末端に少なくとも３、４、５、６、７、８、９若しくは１０ｎｔを有する標的にアニールする、ｓｓＤＮＡプライマーが提供されるとき）標的ＲＮＡからのｃＤＮＡの検出によって判定される。
一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、例えば、そのＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに変換する場合、逆転写を、例えば、タンパク質結合モチーフ（例えば、３’ＵＴＲ）が欠如したＲＮＡ鋳型と比較して、（例えば、ｃＤＮＡ生成により）少なくとも５倍又は１０倍より効率的に実施する。複数の実施形態では、逆転写の効率は、Ｙａｓｕｋａｗａ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ４９２（２）：１４７－１５３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように測定される。
一部の実施形態では、逆転写酵素ドメインは、例えば、細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）内で発現されるとき、任意の内因性細胞ＲＮＡより高い頻度（例えば、約５倍又は１０倍高い頻度）で、特定のＲＮＡ鋳型に特異的に結合する。複数の実施形態では、逆転写酵素ドメインと鋳型ＲＮＡとの間の特異的結合の頻度は、例えば、Ｌｉｎ ａｎｄ Ｍｉｌｅｓ（２０１９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４７（１１）：５４９０－５５０１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、ＣＬＩＰ－ｓｅｑによって測定される。
鋳型核酸結合ドメイン
遺伝子改変ポリペプチドは、典型的に、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）と会合することが可能な領域を有する。一部の実施形態では、鋳型核酸結合ドメインは、ＲＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、特定のシグネチャー、例えば構造モチーフを含むＲＮＡ分子と会合し得るモジュラードメインである。他の実施形態では、鋳型核酸結合ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合ドメイン）は、逆転写ドメイン内に含まれ、例えば、逆転写酵素由来の成分は、ＲＮＡの優先性についての既知のシグネチャーを有する。
他の実施形態では、鋳型核酸結合ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合ドメイン）は、標的ＤＮＡ結合ドメイン内に含まれる。例えば、一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ｇＲＮＡを含む鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）の構造を認識するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質である。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインが標的ゲノムＤＮＡ配列に結合することを可能にする、ｇＲＮＡスキャフォールドと会合するＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を含むＤＮＡ結合ドメインを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡスキャフォールド及びｇＲＮＡスペーサーは、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）内部に含まれることで、ＤＮＡ結合ドメインは、鋳型核酸結合ドメインでもある。一部の実施形態では、ポリペプチドは、複数のドメイン内にＲＮＡ結合機能を有し、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ＤＮＡ結合ドメイン内のｇＲＮＡ構造及び逆転写酵素ドメイン内の追加の配列又は構造に結合し得る。
一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、標準ＲＮＡ結合ドメインよりも高い親和性で、鋳型ＲＮＡに結合することができる。一部の実施形態では、標準ＲＮＡ結合ドメインは、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９由来のＲＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、１００ｐＭ～１０ｎＭ（例えば、１００ｐＭ～１ｎＭ又は１ｎＭ～１０ｎＭ）の親和性で、鋳型ＲＮＡに結合することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインの、その鋳型ＲＮＡに対する親和性は、例えば、Ａｓｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４６：１０７－１１９（２０１８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、例えば、熱泳動によりインビトロで測定される。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインの、その鋳型ＲＮＡに対する親和性は、細胞中で（例えば、ＦＲＥＴ又はＣＬＩＰ－Ｓｅｑにより）測定される。
一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、鋳型ＲＮＡと、インビトロでスクランブルＲＮＡよりも少なくとも約５倍又は１０倍高い頻度で会合する。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインと鋳型ＲＮＡ又はスクランブルＲＮＡとの間の会合の頻度は、例えば、Ｌｉｎ ａｎｄ Ｍｉｌｅｓ（２０１９）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４７（１１）：５４９０－５５０１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、ＣＬＩＰ－ｓｅｑによって測定される。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインは、細胞内（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内）の鋳型ＲＮＡと、スクランブルＲＮＡよりも少なくとも約５倍又は１０倍高い頻度で会合する。一部の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインと鋳型ＲＮＡ又はスクランブルＲＮＡとの間の会合の頻度は、例えば、Ｌｉｎ ａｎｄ Ｍｉｌｅｓ（２０１９）（前掲）に記載のように、ＣＬＩＰ－ｓｅｑによって測定される。
いくつかの実施形態では、ＲＴドメイン（例えば、表６に列挙されるもの）は、以下の表２Ａに列挙される１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、表６に列挙されるＲＴドメインは、以下の表２Ａの対応する行に列挙される変異のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つを含む。
Figure 2024533312000022
Figure 2024533312000023
Figure 2024533312000024
Figure 2024533312000025
Figure 2024533312000026
エンドヌクレアーゼドメイン及びＤＮＡ結合ドメイン
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、エンドヌクレアーゼドメインを介したＤＮＡ標的部位切断の機能を有する。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、例えば、標的核酸に結合するためのＤＮＡ結合ドメインを含む。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドのドメイン（例えば、Ｃａｓドメイン）は、２つ以上のより小さいドメイン、例えば、ＤＮＡ結合ドメイン及びエンドヌクレアーゼドメインを含む。ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓドメイン）が、標的核酸配列に結合すると記載される場合、一部の実施形態では、結合は、ｇＲＮＡによって媒介されることが理解される。
一部の実施形態では、ドメインは、２つの機能を有する。例えば、一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合ドメインでもある。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）結合ドメインでもある。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドは、ｇＲＮＡを含む鋳型ＲＮＡに結合し、標的ＤＮＡ配列（例えば、ｇＲＮＡの一部に対する相補性を有する）に結合し、且つ標的ＤＮＡ配列を切断する、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼドメインを含む。一部の実施形態では、異種の源に由来するエンドヌクレアーゼドメイン又はエンドヌクレアーゼ／ＤＮＡ結合ドメインは、本明細書に記載される遺伝子改変システムにおいて、使用され得るか又は（例えば、１つ又は複数の残基の挿入、欠失又は置換によって）修飾され得る。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はエンドヌクレアーゼ／ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸は、例えばヒト細胞について改善された、改変されたコドン使用を有するように、その天然配列から改変される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼエレメントは、異種エンドヌクレアーゼエレメント、例えば、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ１）、メガヌクレアーゼ（例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ）、又は他のエンドヌクレアーゼドメインである。
特定の態様では、本明細書に記載される遺伝子改変ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインは、所望の宿主ＤＮＡ標的配列への結合のため、選択、設計、又は構築される。特定の実施形態では、ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインは、異種ＤＮＡ結合因子である。一部の実施形態では、異種ＤＮＡ結合因子は、ジンクフィンガー因子又はＴＡＬエフェクター因子、例えば、ジンクフィンガー又はＴＡＬポリペプチド又はその機能的フラグメントである。一部の実施形態では、異種ＤＮＡ結合因子は、エンドヌクレアーゼ活性を有しないように改変されている、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、又は他のＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質などの配列誘導性のＤＮＡ結合因子である。一部の実施形態では、異種ＤＮＡ結合因子は、エンドヌクレアーゼ活性を保持する。一部の実施形態では、異種ＤＮＡ結合因子は、ｓｓＤＮＡを切断するような部分的なエンドヌクレアーゼ活性を保持し、例えば、ニッカーゼ活性を有する。特定の実施形態では、異種ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９、ＴＡＬドメイン、ＺＦドメイン、Ｍｙｂドメイン、それらの組合せ、又はそれらの複合体のいずれか１つ又は複数であり得る。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、部位特異的変異によって修飾されることで、ＤＮＡ結合因子（例えば、ジンクフィンガーの数及び／又は特異性）などを増加又は減少させ、ＤＮＡ－結合特異性及び親和性を改変する。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインをコードする核酸配列は、例えばヒト細胞について改善された、改変されたコドン使用を有するように、その天然配列から改変される。複数の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、野生型ＤＮＡ結合ドメインに対して１つ又は複数の修飾、例えば、指向性進化、例えば、ファージ支援連続進化（ＰＡＣＥ）による修飾を含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、メガヌクレアーゼドメイン（例えば、エンドヌクレアーゼドメイン部分における、例えば、本明細書に記載されるもの）、又はその機能的フラグメントを含む。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼドメインは、エンドヌクレアーゼ活性、例えば、二本鎖切断及び／又はニッカーゼ活性を有する。他の実施形態では、メガヌクレアーゼドメインは、低下した活性を有し、例えば、エンドヌクレアーゼ活性が欠失しており、例えば、メガヌクレアーゼは、触媒的に不活性である。一部の実施形態では、触媒的に不活性なメガヌクレアーゼは、例えば、Ｆｏｎｆａｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４０（２）：８４７－８６０（２０１２）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、ＤＮＡ結合ドメインとして使用される。
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、例えば、野生型ポリペプチドと比べて、ＤＮＡ結合ドメインに対する修飾を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、元のＤＮＡ結合ドメインのアミノ酸配列に対する付加、欠失、置換、又は修飾を含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、目的の標的核酸（例えば、ＤＮＡ）配列に特異的に結合する異種機能ドメインを含むように修飾される。一部の実施形態では、機能ドメインは、ポリペプチドの先のＤＮＡ結合ドメインの少なくとも一部（例えば、その全体）で置換する。一部の実施形態では、機能ドメインは、ジンクフィンガー（例えば、目的の標的核酸（例えば、ＤＮＡ）配列に特異的に結合するジンクフィンガーを含む。一部の実施形態では、機能ドメインは、Ｃａｓドメイン（例えば、目的の標的核酸（例えば、ＤＮＡ）配列に特異的に結合するＣａｓドメインを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓドメインは、Ｃａｓ９又はその突然変異体若しくは変異体（例えば、本明細書に記載される）を含む。複数の実施形態では、Ｃａｓドメインは、例えば、本明細書に記載されるように、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と会合する。複数の実施形態では、Ｃａｓドメインは、ｇＲＮＡにより、目的の標的核酸（例えば、ＤＮＡ）配列に導かれる。複数の実施形態では、Ｃａｓドメインは、ｇＲＮＡと同じ核酸（例えば、ＲＮＡ）分子においてコードされる。複数の実施形態では、Ｃａｓドメインは、ｇＲＮＡと異なる核酸（例えば、ＲＮＡ）分子においてコードされる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、標準ＤＮＡ結合ドメインよりも高い親和性で、標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）に結合することができる。一部の実施形態では、標準ＤＮＡ結合ドメインは、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９由来のＤＮＡ結合ドメインである。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、１００ｐＭ～１０ｎＭ（例えば、１００ｐＭ～１ｎＭ又は１ｎＭ～１０ｎＭ）の親和性で、標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）に結合することができる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインの、その標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）に対する親和性は、例えば、Ａｓｍａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １４６：１０７－１１９（２０１８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、例えば、熱泳動によりインビトロで測定される。
実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、モル過剰の、例えば、約１００倍モル過剰のスクランブル配列競合ｄｓＤＮＡの存在下で、例えば、１００ｐＭ～１０ｎＭ（例えば、１００ｐＭ～１ｎＭ又は１ｎＭ～１０ｎＭ）の親和性で、その標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）に結合することができる。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、Ｈｅ ａｎｄ Ｐｕ（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ ２１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、例えば、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で）により測定して、標的細胞、例えばヒト標的細胞のゲノム中のいずれか他の配列よりも高い頻度で、その標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）と結合していることが認められる。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、例えば、Ｈｅ ａｎｄ Ｐｕ（２０１０）（前掲）に記載のように、例えば、ＣｈＩＰ－ｓｅｑ（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ中で）により測定して、標的細胞のゲノム中のいずれか他の配列よりも少なくとも約５倍又は１０倍高い頻度で、その標的配列（例えば、ｄｓＤＮＡ標的配列）と結合していることが認められる。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ニッカーゼ活性を有し、標的ＤＮＡの１つの鎖を切断する。一部の実施形態では、ニッカーゼ活性は、標的部位における二本鎖切断の形成を減少させる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、標的ＤＮＡの第１の鎖及び第２の鎖におけるねじれ型のニック構造を生成する。一部の実施形態では、ねじれ型のニック構造は、標的部位における遊離３’オーバーハングを生成する。一部の実施形態では、標的部位における遊離３’オーバーハングは、例えば、鋳型核酸の３’相同性領域のアクセス及びアニーリングを強化することによって編集効率を改善する。一部の実施形態では、ねじれ型のニック構造は、標的部位における二本鎖切断の形成を減少させる。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、標的ＤＮＡの両方の鎖を切断し、例えば、切断部位のいずれの側にもｓｓＤＮＡオーバーハングを有さない標的の平滑末端切断をもたらす。本明細書に記載される遺伝子改変システムのエンドヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列は、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼドメイン、例えば、表８からのエンドヌクレアーゼドメインのアミノ酸配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％同一であり得る。
特定の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼは、Ｆｏｋ１又はその機能性断片である。特定の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼは、ホリデイジャンクションリゾルバーゼ又はその相同体、例えば、スルホロブス・ソルファタリカス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）からのホリデイジャンクション切断酵素（Ｓｓｏｌ Ｈｊｅ）である（Ｇｏｖｉｎｄａｒａｊｕ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ４４：７，２０１６）。特定の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼは、Ｐｒｐ８などのスプライセオソームタンパク質の大きい断片のエンドヌクレアーゼである（Ｍａｈｂｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｂｉｌｅ ＤＮＡ ８：１６，２０１７）。特定の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質、例えば、Ｃａｓ９に由来する。特定の実施形態では、異種エンドヌクレアーゼは、ｓｓＤＮＡ切断活性のみ、例えば、ニッカーゼ活性のみを有するように、例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼ、例えば、Ｄ１０Ａ、Ｈ８４０Ａ又はＮ８６３Ａ変異を有するＳｐＣａｓ９であるように改変される。表８は、例示的なＣａｓタンパク質及びニッカーゼ活性に関連する変異を示す。更に他の実施形態では、相同エンドヌクレアーゼドメインは、例えば、部位特異的変異によって修飾されることで、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ活性を改変する。更に他の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、例えば、ＤＮＡ配列特異性を付与する領域を不活性化するために、ＤＮＡ配列特異性又は変異を付与するドメインを除去するための切断により、ＤＮＡ配列特異性を低下させるように修飾される。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ニッカーゼ活性を有し、二本鎖切断を形成しない。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、二本鎖切断より高い頻度で一本鎖切断を形成し、例えば、切断の少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％は、一本鎖切断であり、又は切断の１０％、５％、４％、３％、２％若しくは１％未満は、二本鎖切断である。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、二本鎖切断を実質的に形成しない。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、検出可能なレベルの二本鎖切断を形成しない。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、第１の鎖の標的部位ＤＮＡに切れ目を入れるニッカーゼ活性を有し；例えば、一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ライティングドメインによって伸長されることになる鎖上の改変部位近傍の標的部位のゲノムＤＮＡを切断する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、第１の鎖の標的部位ＤＮＡに切れ目を入れ、第２の鎖の標的部位ＤＮＡに切れ目を入れないニッカーゼ活性を有する。例えば、ポリペプチドが、ニッカーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼドメインを含むとき、一部の実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼドメインは、ＰＡＭ部位を含む標的部位ＤＮＡ鎖に切れ目を入れる（例えば、そしてＰＡＭ部位を含まない標的部位ＤＮＡ鎖に切れ目を入れない）。更なる例として、ポリペプチドが、ニッカーゼ活性を有するＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼドメインを含むとき、一部の実施形態では、前記ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼドメインは、ＰＡＭ部位を含まない標的部位ＤＮＡ鎖に切れ目を入れる（例えば、そしてＰＡＭ部位を含む標的部位ＤＮＡ鎖に切れ目を入れない）。
いくつかの他の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、第１の鎖及び第２の鎖の標的部位ＤＮＡに切れ目を入れるニッカーゼ活性を有する。特定の理論に束縛されることを意図しないが、本明細書に記載のポリペプチドのライティングドメイン（例えば、ＲＴドメイン）が鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）の異種目的配列から重合（例えば、逆転写）後、細胞ＤＮＡ修復機構は、第１のＤＮＡ鎖上のニックを修復しなければならない。標的部位ＤＮＡはここで、第１のＤＮＡ鎖に対して２つの異なる配列を含み：１番目は元のゲノムＤＮＡ（例えば、自由５’末端を有する）に対応し、２番目は異種目的配列（例えば、自由３’末端を有する）から重合されたものに対応する。２つの異なる配列が互いに平衡化し、まず一方、次いで他方が第２の鎖とハイブリダイズすると考えられ、ここで細胞ＤＮＡ修復装置のその修復標的部位への組み込みの順序は確率過程であると考えられる。特定の理論に束縛されることを意図しないが、更なるニックの第２の鎖への導入が、異種目的配列に基づく配列を元のゲノム配列よりも頻繁に用いるように、細胞ＤＮＡ修復機構をバイアスし得ると考えられる（Ａｎｚａｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ５７６：１４９－１５７（２０１９））。一部の実施形態では、更なるニックは、標的部位修飾（例えば、挿入、欠失又は置換）の５’若しくは３’又は第１の鎖上のニックに対して、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５若しくは１５０ヌクレオチドに位置づけられる。
代替的に又は追加的に、特定の理論に束縛されることを意図しないが、第２の鎖に対する更なるニックが第２の鎖合成を促進し得ると考えられる。一部の実施形態では、遺伝子改変システムが第１の鎖の一部を挿入又は置換している場合、第２の鎖における挿入／置換に対応する新しい配列の合成が必要である。
一部の実施形態では、ポリペプチドは、エンドヌクレアーゼ活性を有する単一ドメイン（例えば、単一エンドヌクレアーゼドメイン）を含み、前記ドメインは、第１の鎖及び第２の鎖の両方に切れ目を入れる。例えば、こうした実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼドメインであり得、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、第１の鎖のニッキングを導くｇＲＮＡスペーサー及び第２の鎖のニッキングを導く更なるｇＲＮＡスペーサーを含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、エンドヌクレアーゼ活性を有する複数のドメインを含み、第１のエンドヌクレアーゼドメインは、第１の鎖に切れ目を入れ、且つ第２のエンドヌクレアーゼドメインは、第２の鎖に切れ目を入れる（任意選択で、第１のエンドヌクレアーゼドメインは、第２の鎖に切れ目を入れず（例えば、それができず）、且つ第２のエンドヌクレアーゼドメインは、第１の鎖に切れ目を入れない（例えば、それができない））。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、第１の鎖及び第２の鎖に切れ目を入れることができる。一部の実施形態では、第１の鎖及び第２の鎖ニックは、標的部位における同じ位置で起こるが、逆鎖上では起きない。一部の実施形態では、第２の鎖ニックは、例えば、第１のニックから上流又は下流の、ねじれた位置で起こる。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、第２の鎖ニックが第１の鎖ニックの上流にある場合、標的部位の欠失を生成する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、第２の鎖ニックが第１の鎖ニックの下流にある場合、標的部位の重複を生成する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、第１及び第２の鎖ニックが標的部位の同じ位置で起こる場合、重複及び／又は欠失を生成しない。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、例えば、（例えば、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２００６に記載のとおり；その全体は参照により本明細書に組み込まれる）第１の鎖又は第２の鎖のニッキングを促進する、タンパク質立体構造又はＲＮＡ結合状態に応じた、改変された活性を有する。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、メガヌクレアーゼ、又はその機能性断片を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ホーミングエンドヌクレアーゼ、又はその機能性断片を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、例えばファミリー名に示されるとおり、例えば、保存されたアミノ酸モチーフを有する、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２５６９３）、ＧＩＹ－ＹＩＧ、ＨＮＨ、Ｈｉｓ－Ｃｙｓ Ｂｏｘ、又はＰＤ－（Ｄ／Ｅ）ＸＫファミリーからのメガヌクレアーゼ、又はその機能性断片若しくは変異体を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、例えば、Ｉ－ＳｍａＭＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｆ７ＷＤ４２）、Ｉ－ＳｃｅＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３８８２）、Ｉ－ＡｎｉＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０３８８０）、Ｉ－ＤｍｏＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ２１５０５）、Ｉ－ＣｒｅＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０５７２５）、Ｉ－ＴｅｖＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ１３２９９）、Ｉ－ＯｎｕＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ４ＶＷＷ５）、又はＩ－ＢｍｏＩ（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｑ９ＡＮＲ６）から選択されるメガヌクレアーゼ、又はその断片を含む。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼは、天然には、その機能的形態において、単量体、例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＴｅｖＩ、又は二量体、例えば、Ｉ－ＣｒｅＩである。例えば、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧモチーフ（配列番号２５６９３）の単一コピーを有するＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２５６９３）メガヌクレアーゼは、一般にホモ二量体を形成する一方、ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号２５６９３）モチーフの２つのコピーを有するメンバーは、一般に単量体として見出される。一部の実施形態では、通常は二量体として形成するメガヌクレアーゼは、融合体として発現され、例えば、２つのサブユニットは、単一のＯＲＦとして、任意選択で、リンカーによって連結された、例えばＩ－ＣｒｅＩ二量体融合体として発現される（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｆｏｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２０２０；その全体は参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、メガヌクレアーゼ、又はその機能性断片は、二本鎖ＤＮＡ分子、例えば、Ｉ－ＳｃｅＩ（Ｋ１２２Ｉ及び／又はＫ２２３Ｉ）（Ｎｉｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００８）、Ｉ－ＡｎｉＩ（Ｋ２２７Ｍ）（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２００９）、Ｉ－ＤｍｏＩ（Ｑ４２Ａ及び／又はＫ１２０Ｍ）（Ｍｏｌｉｎａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１５）の一方の鎖においてニッカーゼ活性を優先するように改変される。一部の実施形態では、一本鎖切断についてのこの優先性を有するメガヌクレアーゼ又はその機能性断片は、例えばニッカーゼ活性を有するエンドヌクレアーゼドメインとして使用される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、安全な港湾部位、例えば、Ｉ－ＣｒｅＩを標的にするＳＨ６部位を天然に標的にする、又は標的にするように改変された、メガヌクレアーゼ、又はその機能性断片を含む（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ－Ｆｏｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、上記）。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、配列耐性触媒ドメインを有する、メガヌクレアーゼ、又はその機能性断片、例えば、最小モチーフＣＮＮＮＧを認識するＩ－ＴｅｖＩを含む（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１２）。一部の実施形態では、標的配列耐性触媒ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインに融合され、例として、例えば、Ｉ－ＴｅｖＩを、（ｉ）Ｔｅｖ－ＺＦＥを作出するためのＺｎフィンガー（Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１２）、（ｉｉ）ＭｅｇａＴｅｖを作出するための他のメガヌクレアーゼ（Ｗｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２０１４）、及び／又は（ｉｉｉ）ＴｅｖＣａｓ９を作出するためのＣａｓ９（Ｗｏｌｆｓ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ ２０１６）に融合させることによって活性を誘導する。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、制限酵素、例えば、タイプＩＩＳ又はタイプＩＩＰ制限酵素を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、タイプＩＩＳ制限酵素、例えば、ＦｏｋＩ又はその断片若しくは変異体を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、タイプＩＩＰ制限酵素、例えば、ＰｖｕＩＩ又はその断片若しくは変異体を含む。一部の実施形態では、二量体制限酵素は、それが一本鎖として機能するように、融合体、例えば、ＦｏｋＩ二量体融合体として発現される（Ｍｉｎｃｚｕｋ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３６（１２）：３９２６－３９３８（２００８））。
更なるエンドヌクレアーゼドメインの使用は、例えば、Ｇｕｈａ ａｎｄ Ｅｄｇｅｌｌ Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ １８（２２）：２５６５（２０１７）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、例えば、野生型Ｃａｓタンパク質と比べて、エンドヌクレアーゼドメインに対する修飾を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、野生型Ｃａｓタンパク質のアミノ酸配列に対する付加、欠失、置換、又は修飾を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、目的の標的核酸（例えば、ＤＮＡ）配列に特異的に結合し、且つ／又はそのエンドヌクレアーゼ切断を誘導する異種機能ドメインを含むように修飾される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ジンクフィンガーを含む。複数の実施形態では、Ｃａｓドメインを含むエンドヌクレアーゼドメインは、例えば、本明細書に記載される、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と会合する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、特定の標的核酸（例えば、ＤＮＡ）配列を標的にしない機能ドメインを含むように修飾される。複数の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、Ｆｏｋ１ドメインを含む。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、標的ｄｓＤＮＡと、インビトロでスクランブルｄｓＤＮＡよりも少なくとも約５倍又は１０倍高い頻度で会合する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、例えば、細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）内で、標的ｄｓＤＮＡと、インビトロでスクランブルｄｓＤＮＡよりも少なくとも約５倍又は１０倍高い頻度で会合する。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインと標的ＤＮＡ又はスクランブルＤＮＡとの間の会合の頻度は、例えば、Ｈｅ ａｎｄ Ｐｕ（２０１０）Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｈａｐｔｅｒ ２１（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、ＣｈＩＰ－ｓｅｑによって測定される。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、標的配列でのニックの形成を、例えば、非標的配列と比較して（例えば、標的細胞のゲノム中の任意の他のゲノム配列と比較して）、少なくとも約５倍又は１０倍の増加まで触媒し得る。一部の実施形態では、ニック形成のレベルは、例えば、Ｅｌａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．（２０１９）ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／８６７９３７（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、ニックＳｅｑを用いて測定される。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、インビトロでのＤＮＡのニッキングが可能である。複数の実施形態では、ニックは、露出された塩基をもたらす。複数の実施形態では、露出された塩基は、例えば、Ｃｈａｕｄｈｒｙ ａｎｄ Ｗｅｉｎｆｅｌｄ（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２３（１９）：３８０５－３８０９（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、ヌクレアーゼ感受性アッセイを用いて検出され得る。複数の実施形態では、（例えば、ヌクレアーゼ感受性アッセイによって検出された）露出された塩基のレベルは、参照エンドヌクレアーゼドメインと比較して、少なくとも１０％、５０％若しくはそれ以上増加する。一部の実施形態では、参照エンドヌクレアーゼドメインは、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９由来のエンドヌクレアーゼドメインである。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、細胞内のＤＮＡのニッキングが可能である。複数の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内のＤＮＡのニッキングが可能である。複数の実施形態では、Ｒａｄ５１の非存在下で複製を受ける未修復のニックは、例えば、Ｂｏｔｈｍｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ８：１３９０５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の、例えば、Ｒａｄ５１阻害アッセイを用いることによって検出可能である、ニックの部位でのＮＨＥＪ率の増加をもたらす。複数の実施形態では、ＮＨＥＪ率は、０～５％超増加する。複数の実施形態では、ＮＨＥＪ率は、例えば、Ｒａｄ５１阻害時、２０～７０％（例えば、３０％～６０％又は４０～５０％）まで増加する。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、切断後、標的を放出する。一部の実施形態では、標的の放出は、例えば、Ｙｏｕｒｉｋ ａｔ ａｌ．ＲＮＡ ２５（１）：３５－４４（２０１９）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、また図２に示すように、酵素による複数のターンオーバーについて評価することによって間接的に示される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインのｋｅｘｐは、こうした方法により測定して、１×１０－３～１×１０－５分－１である。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、インビトロで約１×１０８ｓ－１Ｍ－１を超える触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を有する。複数の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、インビトロで約１×１０５、１×１０６、１×１０７、又は１×１０８ｓ－１Ｍ－１を超える触媒効率を有する。複数の実施形態では、触媒効率は、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３６０（６３８７）：４３６－４３９（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように決定される。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、細胞内で約１×１０８ｓ－１Ｍ－１を超える触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）を有する。複数の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメインは、細胞内で約１×１０５、１×１０６、１×１０７、又は１×１０８ｓ－１Ｍ－１を超える触媒効率を有する。
Ｃａｓドメインを含む遺伝子改変ポリペプチド
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変ポリペプチドは、Ｃａｓドメインを含む。一部の実施形態では、Ｃａｓドメインは、遺伝子改変ポリペプチドを、ｇＲＮＡスペーサーによって特定される標的部位に導き、それにより、「ｃｉｓ」における標的核酸配列を修飾し得る。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、Ｃａｓドメインに融合される。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓドメイン（本明細書においてＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質とも呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓドメインは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）システムに関与するタンパク質、例えば、Ｃａｓタンパク質を含み、任意選択で、ガイドＲＮＡ、例えば単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に結合する。
ＣＲＩＳＰＲシステムは、最初に細菌及び古細菌において発見された適応防御システムである。ＣＲＩＳＰＲシステムは、外来ＤＮＡを切断するため、ＣＲＩＳＰＲ関連又は「Ｃａｓ」エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１）と称されるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを使用する。例えば、典型的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムにおいて、エンドヌクレアーゼは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ配列を標的にする、配列特異的な非コード「ガイドＲＮＡ」により、標的ヌクレオチド配列（例えば、配列編集対象のゲノム中の部位）に導かれる。ＣＲＩＳＰＲシステムの３つのクラス（Ｉ～ＩＩＩ）は、同定されている。クラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、（複数のＣａｓタンパク質ではなく）単一のＣａｓエンドヌクレアーゼを使用する。１つのクラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（「ｃｒＲＮＡ」）、及びトランス活性化ｃｒＲＮＡ（「ｔｒａｃｒＲＮＡ」）などのＩＩ型Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。ｃｒＲＮＡは、典型的に、標的ＤＮＡ配列に対応する約２０ヌクレオチドのＲＮＡ配列である「スペーサー」配列（プロトスペーサー）を含む。野生型システムにおいて、またいくつかの改変システムにおいて、ｃｒＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡに結合し、リボヌクレアーゼＩＩＩによって切断される、部分的に二本鎖の構造を形成し、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド分子をもたらす領域も含む。次に、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドは、Ｃａｓエンドヌクレアーゼを、標的ＤＮＡ配列を認識し、切断するように導く。標的ＤＮＡ配列は、一般に、所与のＣａｓエンドヌクレアーゼに特異的であり、ｃｒＲＮＡのスペーサーに一致する標的部位における切断活性に必要とされる「プロトスペーサー隣接モチーフ」（「ＰＡＭ」）に隣接する。様々な原核生物種から同定されたＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼは、例えば、表７中の例示的なＣａｓ酵素について列挙される、固有のＰＡＭ配列の要件を有し；ＰＡＭ配列の例として、５’－ＮＧＧ（化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ））、５’－ＮＮＡＧＡＡ（ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１）、５’－ＮＧＧＮＧ（ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ３）、及び５’－ＮＮＮＧＡＴＴ（髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｄｉｔｉｓ））が挙げられる。いくつかのエンドヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＧリッチＰＡＭ部位、例えば５’－ＮＧＧと会合し、ＰＡＭ部位から上流（から５’側）の３つのヌクレオチドの位置で標的ＤＮＡの平滑末端切断を実施する。別のクラスＩＩ ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｃａｓ９より小さいＶ型エンドヌクレアーゼＣｐｆ１を含み；例として、ＡｓＣｐｆ１（アシダミノコッカス種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）由来）及びＬｂＣｐｆ１（ラクノスピラセアエ種（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｓｐ．）由来）が挙げられる。Ｃｐｆ１関連ＣＲＩＳＰＲアレイは、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせず、成熟ｃｒＲＮＡに処理され；換言すれば、Ｃｐｆ１システムは、一部の実施形態において、標的ＤＮＡ配列を切断するため、専らＣｐｆ１ヌクレアーゼ及びｃｒＲＮＡを含む。Ｃｐｆ１エンドヌクレアーゼは、典型的に、ＴリッチＰＡＭ部位、例えば５’－ＴＴＮと会合する。Ｃｐｆ１は、５’－ＣＴＡ ＰＡＭモチーフも認識し得る。Ｃｐｆ１は、典型的に、オフセット又はねじれ型の二本鎖切断を４－又は５－ヌクレオチドの５’オーバーハングに導入し、例えば、コード鎖上のＰＡＭ部位から１８ヌクレオチド下流（３’側）及び相補鎖上のＰＡＭ部位から２３ヌクレオチド下流に位置する、５－ヌクレオチドのオフセット又はねじれ型切断によって標的ＤＮＡを切断することによって標的ＤＮＡを切断し；こうしたオフセット切断から得られる５－ヌクレオチドのオーバーハングは、平滑末端切断ＤＮＡでの挿入ではなく、相同組換えによるＤＮＡ挿入により、より正確なゲノム編集を可能にする。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ，１６３：７５９－７７１を参照されたい。
種々のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子又はタンパク質は、本開示によって提供される技術において使用することができ、Ｃａｓタンパク質の選択は、その方法の特定条件に依存することになる。Ｃａｓタンパク質の具体例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃｐｆ１、Ｃ２Ｃ１、又はＣ２Ｃ３を含むクラスＩＩシステムが挙げられる。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質は、種々の原核生物種のいずれに由来し得る。一部の実施形態では、特定のＣａｓタンパク質、例えば、特定のＣａｓ９タンパク質は、特定のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識するように選択される。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン又はエンドヌクレアーゼドメインは、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９などの配列標的化ポリペプチドを含む。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質、例えばＣａｓ９タンパク質は、細菌若しくは古細菌から得ることができるか、又は公知の方法を用いて合成され得る。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、グラム陽性細菌又はグラム陰性細菌に由来し得る。特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、又はＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））、フランシセラ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）（例えば、Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ））、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ））、アシダミノコッカス（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、アシダミノコッカス種ＢＶ３Ｌ６（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＢＶ３Ｌ６））、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）（例えば、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ））、クリプトコッカス（ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘモフィルス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、真正細菌（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、パスツレラ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プレボテーラ（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、ベイロネラ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ）、又はマリノバクター（Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ）に由来し得る。
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、以下の配列番号４０００のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含み得る。複数の実施形態では、以下の配列番号４０００のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列は、遺伝子改変ポリペプチドのＮ末端に位置している。複数の実施形態では、以下の配列番号４０００のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列は、遺伝子改変ポリペプチドのＮ末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、又は３０アミノ酸以内に位置している。
例示的なＮ末端ＮＬＳ－Ｃａｓ９ドメイン
Figure 2024533312000027
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、以下の配列番号４００１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含み得る。複数の実施形態では、以下の配列番号４００１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列は、遺伝子改変ポリペプチドのＣ末端に位置している。複数の実施形態では、以下の配列番号４００１のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列は、遺伝子改変ポリペプチドのＣ末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、又は３０アミノ酸以内に位置している。
ＮＬＳを含む例示的なＣ末端配列
ＡＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＡＫＶＥ（配列番号４００１）
例示的なベンチマーク配列
Figure 2024533312000028
Figure 2024533312000029
Figure 2024533312000030
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、表７若しくは８に列挙されるＣａｓドメイン又はその機能的フラグメント、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を含み得る。
Figure 2024533312000031
Figure 2024533312000032
Figure 2024533312000033
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一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）が、Ｃａｓタンパク質が結合及び／又は機能する対象の標的ＤＮＡ配列内に存在するか又はそれに隣接することが求められる。一部の実施形態では、ＰＡＭは、５’から３’にかけて、ＮＧＧ、ＹＧ、ＮＮＧＲＲＴ、ＮＮＮＲＲＴ、ＮＧＡ、ＴＹＣＶ、ＴＡＴＶ、ＮＴＴＮ、又はＮＮＮＧＡＴＴであるか又はそれらを含み、ここでＮは任意のヌクレオチドを表し、ＹはＣ又はＴを表し、ＲはＡ又はＧを表し、ＶはＡ又はＣ又はＧを表す。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、表７又は８に列記されるタンパク質である。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、そのＰＡＭを改変する、１つ又は複数の変異を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｅ１３６９Ｒ、Ｅ１４４９Ｈ、及びＲ１５５６Ａの変異又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｅ７８２Ｋ、Ｎ９６８Ｋ、及びＲ１０１５Ｈの変異又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１１３５Ｖ、Ｒ１３３５Ｑ、及びＴ１３３７Ｒの変異又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ５４２Ｒ及びＫ６０７Ｒの変異又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｓ５４２Ｒ、Ｋ５４８Ｖ、及びＮ５５２Ｒの変異又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。改変されたＰＡＭ配列を認識するためのＣａｓ酵素の改変の例示的な進歩が、全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｏｌｌｉａｓ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ １２：５５５（２０２１）において概説される。
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、触媒的に活性であり、標的ＤＮＡ部位の一方又は両方の鎖を切断する。一部の実施形態では、標的ＤＮＡ部位の切断に続いて、改変、例えば、挿入又は欠失が、例えば、細胞修復機構によって形成される。
一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、例えば、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９のように、ヌクレアーゼを非活性化又は部分的に非活性化するように修飾される。野生型Ｃａｓ９が、ｇＲＮＡによって標的にされる特定のＤＮＡ配列で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成する一方、修飾された機能性を有するいくつかのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼが利用可能であり、例えば部分的に非活性化されているＣａｓ９の「ニッカーゼ」バージョンは、一本鎖切断のみを生成し；触媒的に不活性であるＣａｓ９（「ｄＣａｓ９」）は、標的ＤＮＡを切断しない。一部の実施形態では、ｄＣａｓ９のＤＮＡ配列への結合は、立体障害によってその部位で転写に干渉し得る。一部の実施形態では、ｄＣａｓ９のアンカー配列への結合は、ゲノム複合体（例えば、ＡＳＭＣ）の形成及び／又は維持に干渉（例えば、それを低減又は阻止）し得る。一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、触媒的に不活性なＣａｓ９、例えば、ｄＣａｓ９を含む。多数の触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質は、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、ｄＣａｓ９は、Ｃａｓタンパク質の各エンドヌクレアーゼドメイン内に、変異、例えば、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａ又はＮ８６３Ａ変異を含む。一部の実施形態では、触媒的に不活性な又は部分的に不活性なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓドメインは、１つ又は複数の変異、例えば、表７に列記される変異の１つ又は複数を含むＣａｓタンパク質を含む。一部の実施形態では、表７の所与の行に記載されるＣａｓタンパク質は、表７の同じ行に列記される変異の１つ、２つ、３つ、又は全部を含む。一部の実施形態では、例えば、表７に記載されていないＣａｓタンパク質は、表７のある行に列記される変異の１つ、２つ、３つ若しくは全部又はそのＣａｓタンパク質中の対応する部位での対応する変異を含む。
一部の実施形態では、触媒的に不活性な、例えばｄＣａｓ９、又は部分的に非活性化されたＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１１変異（例えば、Ｄ１１Ａ変異）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９、又は部分的に非活性化されたＣａｓ９タンパク質は、Ｈ９６９変異（例えば、Ｈ９６９Ａ変異）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９、又は部分的に非活性化されたＣａｓ９タンパク質は、Ｎ９９５変異（例えば、Ｎ９９５Ａ変異）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９は、Ｄ１１、Ｈ９６９、及びＮ９９５の位置の１つ、２つ若しくは３つでの変異（例えば、Ｄ１１Ａ、Ｈ９６９Ａ、及びＮ９９５Ａ変異）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。
一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９、又は部分的に非活性化されたＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１０変異（例えば、Ｄ１０Ａ変異）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９、又は部分的に非活性化されたＣａｓ９タンパク質は、Ｈ５５７変異（例えば、Ｈ５５７Ａ変異）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９は、Ｄ１０変異（例えば、Ｄ１０Ａ変異）及びＨ５５７変異（例えば、Ｈ５５７Ａ変異）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。
一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９、又は部分的に非活性化されたＣａｓ９タンパク質は、Ｄ８３９変異（例えば、Ｄ８３９Ａ変異）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９、又は部分的に非活性化されたＣａｓ９タンパク質は、Ｈ８４０変異（例えば、Ｈ８４０Ａ変異）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９、又は部分的に非活性化されたＣａｓ９タンパク質は、Ｎ８６３変異（例えば、Ｎ８６３Ａ変異）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９は、Ｄ１０変異（例えば、Ｄ１０Ａ）、Ｄ８３９変異（例えば、Ｄ８３９Ａ）、Ｈ８４０変異（例えば、Ｈ８４０Ａ）、及びＮ８６３変異（例えば、Ｎ８６３Ａ）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。
一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９、又は部分的に非活性化されたＣａｓ９タンパク質は、Ｅ９９３変異（例えば、Ｅ９９３Ａ変異）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。
一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９、又は部分的に非活性化されたＣａｓ９タンパク質は、Ｄ９１７変異（例えば、Ｄ９１７Ａ変異）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９、又は部分的に非活性化されたＣａｓ９タンパク質は、Ｅ１００６変異（例えば、Ｅ１００６Ａ変異）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９、又は部分的に非活性化されたＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１２５５変異（例えば、Ｄ１２５５Ａ変異）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９は、Ｄ９１７変異（例えば、Ｄ９１７Ａ）、Ｅ１００６変異（例えば、Ｅ１００６Ａ）、及びＤ１２５５変異（例えば、Ｄ１２５５Ａ）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。
一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９、又は部分的に非活性化されたＣａｓ９タンパク質は、Ｄ１６変異（例えば、Ｄ１６Ａ変異）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９、又は部分的に非活性化されたＣａｓ９タンパク質は、Ｄ５８７変異（例えば、Ｄ５８７Ａ変異）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、部分的に非活性化されたＣａｓドメインは、ニッカーゼ活性を有する。一部の実施形態では、部分的に非活性化されたＣａｓ９ドメインは、Ｃａｓ９ニッカーゼドメインである。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓドメイン又は不活性Ｃａｓドメインは、検出可能な二本鎖切断を形成しない。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９、又は部分的に非活性化されたＣａｓ９タンパク質は、Ｈ５８８変異（例えば、Ｈ５８８Ａ変異）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９、又は部分的に非活性化されたＣａｓ９タンパク質は、Ｎ６１１変異（例えば、Ｎ６１１Ａ変異）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。一部の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質、例えばｄＣａｓ９は、Ｄ１６変異（例えば、Ｄ１６Ａ）、Ｄ５８７変異（例えば、Ｄ５８７Ａ）、Ｈ５８８変異（例えば、Ｈ５８８Ａ）、及びＮ６１１変異（例えば、Ｎ６１１Ａ）又は前記位置に対応するアミノ酸に対する類似置換を含む。
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン又はエンドヌクレアーゼドメインは、ｇＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡを含む鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡ）を含むか又はそれに（例えば共有結合的に）連結されたＣａｓ分子を含み得る。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）又はその機能性断片若しくは変異体を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、修飾ＳｐＣａｓ９を含む。複数の実施形態では、修飾ＳｐＣａｓ９は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）特異性を改変する修飾を含む。複数の実施形態では、ＰＡＭは、核酸配列５’－ＮＧＴ－３’に対する特異性を有する。複数の実施形態では、修飾ＳｐＣａｓ９は、例えば、以下：Ｌ１１１１、Ｄ１１３５、Ｇ１２１８、Ｅ１２１９、Ａ１３２２、又はＲ１３３５の１つ若しくは複数の位置に、１つ若しくは複数のアミノ酸置換を含み、それは、例えば、以下：Ｌ１１１１Ｒ、Ｄ１１３５Ｖ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｆ、Ａ１３２２Ｒ、Ｒ１３３５Ｖから選択される。複数の実施形態では、修飾ＳｐＣａｓ９は、アミノ酸置換Ｔ１３３７Ｒと、以下：Ｌ１１１１、Ｄ１１３５Ｌ、Ｓ１１３６Ｒ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｖ、Ｄ１３３２Ａ、Ｄ１３３２Ｓ、Ｄ１３３２Ｔ、Ｄ１３３２Ｖ、Ｄ１３３２Ｌ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｄ１３３２Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、Ｔ１３３７、Ｔ１３３７Ｌ、Ｔ１３３７Ｑ、Ｔ１３３７Ｉ、Ｔ１３３７Ｖ、Ｔ１３３７Ｆ、Ｔ１３３７Ｓ、Ｔ１３３７Ｎ、Ｔ１３３７Ｋ、Ｔ１３３７Ｈ、Ｔ１３３７Ｑ、及びＴ１３３７Ｍ、又はそれらに対応するアミノ酸置換から選択される１つ若しくは複数の別のアミノ酸置換を含む。複数の実施形態では、修飾ＳｐＣａｓ９は、以下：（ｉ）以下：Ｄ１１３５Ｌ、Ｓ１１３６Ｒ、Ｇ１２１８Ｓ、Ｅ１２１９Ｖ、Ａ１３２２Ｒ、Ｒ１３３５Ｑ、及びＴ１３３７から選択される１つ若しくは複数のアミノ酸置換；並びに（ｉｉ）以下：Ｌ１１１１Ｒ、Ｇ１２１８Ｒ、Ｅ１２１９Ｆ、Ｄ１３３２Ａ、Ｄ１３３２Ｓ、Ｄ１３３２Ｔ、Ｄ１３３２Ｖ、Ｄ１３３２Ｌ、Ｄ１３３２Ｋ、Ｄ１３３２Ｒ、Ｔ１３３７Ｌ、Ｔ１３３７Ｉ、Ｔ１３３７Ｖ、Ｔ１３３７Ｆ、Ｔ１３３７Ｓ、Ｔ１３３７Ｎ、Ｔ１３３７Ｋ、Ｔ１３３７Ｒ、Ｔ１３３７Ｈ、Ｔ１３３７Ｑ、及びＴ１３３７Ｍ、又はそれらに対応するアミノ酸置換から選択される１つ若しくは複数の別のアミノ酸置換を含む。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓドメイン、例えばＣａｓ９ドメインを含む。複数の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓドメイン、Ｃａｓニッカーゼ（ｎＣａｓ）ドメイン、又はヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ（ｄＣａｓ）を含む。複数の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９ドメイン、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ドメイン、又はヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ）を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９のＣａｓ９ドメイン（例えば、ｄＣａｓ９及びｎＣａｓ９）、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、又はＣａｓ１２ｉを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９及びｎＣａｓ９）、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、又はＣａｓ１２ｉを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）若しくはＳ．サーモフィラス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９、又はその機能性断片を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、例えば、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ，Ｒｈｕｎ，ａｎｄ Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ（２０１３）ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０：５，７２６－７３７（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、Ｃａｓ９配列を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ、例えば、本明細書に記載されるように、Ｃａｓ９、又はその変異体のＨＮＨヌクレアーゼサブドメイン及び／又はＲｕｖＣ１サブドメインを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、又はＣａｓ１２ｉを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓポリペプチド（例えば、酵素）、又はその機能性断片を含む。複数の実施形態では、Ｃａｓポリペプチド（例えば酵素）は、以下：Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｄ、Ｃａｓ５ｔ、Ｃａｓ５ｈ、Ｃａｓ５ａ、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９（例えば、Ｃｓｎ１若しくはＣｓｘ１２）、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃａｓ１２ａ／Ｃｐｆｌ、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃｌ、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｄ／ＣａｓＹ、Ｃａｓ１２ｅ／ＣａｓＸ、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｙ４、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｅ３、Ｃｓｅ４、Ｃｓｅ５ｅ、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ１、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ１、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１Ｓ、Ｃｓｘ１１、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、ＣｓＯ、Ｃｓｆ４、Ｃｓｄ１、Ｃｓｄ２、Ｃｓｔ１、Ｃｓｔ２、Ｃｓｈ１、Ｃｓｈ２、Ｃｓａ１、Ｃｓａ２、Ｃｓａ３、Ｃｓａ４、Ｃｓａ５、ＩＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、Ｖ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、ＶＩ型Ｃａｓエフェクタータンパク質、ＣＡＲＦ、ＤｉｎＧ、Ｃｐｆ１、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、Ｃａｓ１２ｂ／Ｃ２ｃ１、Ｃａｓ１２ｃ／Ｃ２ｃ３、ＳｐＣａｓ９（Ｋ８５５Ａ）、ｅＳｐＣａｓ９（１．１）、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、超精密（ｈｙｐｅｒ ａｃｃｕｒａｔｅ）Ｃａｓ９変異体（ＨｙｐａＣａｓ９）、それらの相同体、それらの修飾若しくは操作バージョン、及び／又はそれらの機能性断片から選択される。複数の実施形態では、Ｃａｓ９は、例えば、以下：Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、Ｐ４７５Ａ、Ｗ４７６Ａ、Ｎ４７７Ａ、Ｄ１１２５Ａ、Ｗ１１２６Ａ、及びＤ１１２７Ａから選択される１つ又は複数の置換を含む。複数の実施形態では、Ｃａｓ９は、以下：Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／又はＡ９８７から選択される位置に１つ若しくは複数の変異、例えば、以下：Ｄ１０Ａ、Ｇ１２Ａ、Ｇ１７Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８２Ａ、Ｈ９８３Ａ、Ａ９８４Ａ、及び／又はＤ９８６Ａから選択される１つ若しくは複数の置換を含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、以下：コリネバクテリウム・ウルセランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｕｌｃｅｒａｎｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）、スピロプラズマ・シルフィディコーラ（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｓｙｒｐｈｉｄｉｃｏｌａ）、プレボテーラ・インターメディア（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ）、スピロプラズマ・タイワネンス（Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ ｔａｉｗａｎｅｎｓｅ）、ストレプトコッカス・イニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｉｎｉａｅ）、ベルリエラ・バルティカ（Ｂｅｌｌｉｅｌｌａ ｂａｌｔｉｃａ）、サイクロフレクサス・トークイス（Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓ）、スタフィロコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、化膿性レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）若しくは黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）、又はその機能性断片若しくは変異体に由来するＣａｓ（例えば、Ｃａｓ９）配列を含む。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、例えば、位置：Ｄ９１７、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５又はそれらの任意の組合せに、例えば、以下：Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ、及びＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａから選択される、１つ若しくは複数の置換を含む、Ｃｐｆ１ドメインを含む。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、ｓｐＣａｓ９、ｓｐＣａｓ９－ＶＲＱＲ、ｓｐＣａｓ９－ＶＲＥＲ、ｘＣａｓ９（ｓｐ）、ｓａＣａｓ９、ｓａＣａｓ９－ＫＫＨ、ｓｐＣａｓ９－ＭＱＫＳＥＲ、ｓｐＣａｓ９－ＬＲＫＩＱＫ、又はｓｐＣａｓ９－ＬＲＶＳＱＬを含む。
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、Ｃａｓ９ニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ Ｈ８４０Ａを含むエンドヌクレアーゼドメインを有する。複数の実施形態では、Ｃａｓ９ Ｈ８４０Ａは、以下のアミノ酸配列を有する。
Ｃａｓ９ニッカーゼ（Ｈ８４０Ａ）：
Figure 2024533312000049
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、Ｄ１０Ａ及び／又はＨ８４０Ａ変異を含むｄＣａｓ９配列、例えば、以下の配列を含む。
Figure 2024533312000050
ＴＡＬエフェクター及びジンクフィンガーヌクレアーゼ
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬエフェクター分子を含む。ＴＡＬエフェクター分子、例えば、ＤＮＡ配列に特異的に結合するＴＡＬエフェクター分子は、典型的に、複数のＴＡＬエフェクタードメイン又はそれらの断片及び任意選択で天然に存在するＴＡＬエフェクターの１つ又は複数の更なる部分（例えば、複数のＴＡＬエフェクタードメインのＮ末端及び／又はＣ末端）を含む。多くのＴＡＬエフェクターは、当業者に公知であり、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている。
天然に存在するＴＡＬＥは、宿主植物における遺伝子発現を調節し、細菌の定着及び生存を促進する、植物病原体ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）を含む、極めて多数の細菌性病原体の種によって分泌される天然エフェクタータンパク質である。ＴＡＬエフェクターの特異的結合は、典型的に、３３又は３４アミノ酸のタンデムに配列されたほぼ同一のリピートの中央のリピートドメイン（反復可変二残基、ＲＶＤドメイン）に基づく。
ＴＡＬエフェクターファミリーのメンバーは、主に、それらのリピートの数及び順序が異なる。リピートの数は、典型的に、１．５～３３．５リピートの範囲であり、Ｃ末端リピートは通常、長さがより短く（例えば、約２０アミノ酸）、一般に「ハーフリピート」と称される。ＴＡＬエフェクターの各リピートは、一般に、異なる塩基対特異性を示す異なるリピート型との１リピート対１塩基対相関を特徴とする（１リピートが標的遺伝子配列上の１塩基対を認識する）。一般に、リピートの数が減少すると、タンパク質－ＤＮＡ相互作用が減弱する。いくつかの６．５リピートが、リポータ遺伝子の転写を活性化するのに十分であることが明らかにされている（Ｓｃｈｏｌｚｅ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。
リピート間の変動は、主にアミノ酸位置１２及び１３で起こり、それ故、例示的な反復可変二残基（ＲＶＤ）及び核酸塩基標的に対するそれらの対応を列記する表９に示すように、「超可変」と称されており、標的ＤＮＡプロモータ配列との相互作用の特異性に関与する。
Figure 2024533312000051
従って、ＴＡＬエフェクターのリピートを修飾し、特定のＤＮＡ配列を標的にすることは可能である。更に、試験では、ＲＶＤ ＮＫがＧを標的にし得ることが明らかにされている。更に、ＴＡＬエフェクターの標的部位は、第１のリピートによって標的にされる５’塩基に隣接するＴを含む傾向があるが、この認識の正確な機構は未知である。１１３を超えるＴＡＬエフェクター配列が、現在まで公知である。ザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）からのＴＡＬエフェクターの非限定的な例として、Ｈａｘ２、Ｈａｘ３、Ｈａｘ４、ＡｖｒＸａ７、ＡｖｒＸａ１０及びＡｖｒＢｓ３が挙げられる。
従って、本明細書に記載のＴＡＬエフェクター分子のＴＡＬエフェクタードメインは、任意の細菌種（例えば、ザントモナス・オリゼ・パソバー・オリゼ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．Ｏｒｙｚａｅ）のアフリカ株（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．２０１１）、ザントモナス・キャンペストリス・パソバー・ラファニ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ ｐｖ．ｒａｐｈａｎｉ）株７５６Ｃ及びイネ白葉枯病菌（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ ｐｖ．Ｏｒｙｚｉｃｏｌａ）株ＢＬＳ２５６（Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ ｅｔ ａｌ．２０１１）などのザントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）種）からのＴＡＬエフェクターに由来し得る。一部の実施形態では、ＴＡＬエフェクタードメインは、やはり天然に存在するＴＡＬエフェクターからのＲＶＤドメイン及び隣接配列（ＲＶＤドメインのＮ末端側及び／又はＣ末端側の配列）を含む。それは、天然に存在するＴＡＬエフェクターのＲＶＤよりも多い又は少ないリピートを含み得る。ＴＡＬエフェクター分子は、当技術分野で公知の上記コードやその他に基づく所与のＤＮＡ配列を標的にするように設計され得る。ＴＡＬエフェクタードメイン（例えば、リピート（単量体又はモジュール））の数及びそれらの特定の配列は、所望のＤＮＡ標的配列に基づいて選択され得る。例えば、ＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピートは、特定の標的配列に適するように除去又は付加され得る。ある実施形態では、本発明のＴＡＬエフェクター分子は、６．５～３３．５のＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピートを含む。ある実施形態では、本発明のＴＡＬエフェクター分子は、８～３３．５のＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピート、例えば、１０～２５のＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピート、例えば、１０～１４のＴＡＬエフェクタードメイン、例えば、リピートを含む。
一部の実施形態では、ＴＡＬエフェクター分子は、ＤＮＡ標的配列との完全一致に対応するＴＡＬエフェクタードメインを含む。一部の実施形態では、ＤＮＡ標的配列上のリピートと標的塩基対との間のミスマッチは、ＴＡＬエフェクター分子を含むポリペプチドの機能を可能にする限り、許容される。一般に、ＴＡＬＥ結合は、ミスマッチの数と逆相関する。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドのＴＡＬエフェクター分子は、標的ＤＮＡ配列との、多くて７つのミスマッチ、６つのミスマッチ、５つのミスマッチ、４つのミスマッチ、３つのミスマッチ、２つのミスマッチ、又は１つのミスマッチを含み、及び任意選択でミスマッチを含まない。特定の理論に束縛されることを意図しないが、一般に、ＴＡＬエフェクター分子のＴＡＬエフェクタードメインの数の減少に応じて、ミスマッチの数が減少することは、許容されるばかりか、ＴＡＬエフェクター分子を含むポリペプチドの機能を可能にすることになる。結合親和性は、一致するリピート－ＤＮＡの組合せの和に依存すると考えられる。例えば、２５又はそれ以上のＴＡＬエフェクタードメインを有するＴＡＬエフェクター分子は、最大で７つのミスマッチを許容可能であり得る。
ＴＡＬエフェクタードメインに加えて、本発明のＴＡＬエフェクター分子は、天然に存在するＴＡＬエフェクターに由来する更なる配列を含み得る。ＴＡＬエフェクター分子のＴＡＬエフェクタードメイン部分の両側に含まれるＣ末端及び／又はＮ末端配列の長さは、変動し、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１１）の試験に基づき、当業者によって選択され得る。Ｚｈａｎｇらは、Ｈａｘ３由来のＴＡＬエフェクターに基づくタンパク質中のいくつかのＣ末端及びＮ末端の切断変異体を特徴づけており、標的配列との最適な結合、ひいては転写の活性化に寄与する主要な要素を同定している。一般に、転写活性がＮ末端の長さと逆相関することが見出された。Ｃ末端に関しては、Ｈａｘ３配列の最初の６８アミノ酸中のＤＮＡ結合残基における重要な要素が同定された。従って、一部の実施形態では、天然に存在するＴＡＬエフェクターのＴＡＬエフェクタードメインのＣ末端側の最初の６８アミノ酸は、ＴＡＬエフェクター分子中に含まれる。従って、ある実施形態では、ＴＡＬエフェクター分子は、１）天然に存在するＴＡＬエフェクターに由来する１つ又は複数のＴＡＬエフェクタードメイン；２）ＴＡＬエフェクタードメインのＮ末端側の天然に存在するＴＡＬエフェクターからの少なくとも７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０若しくはそれ以上のアミノ酸；及び／又は３）ＴＡＬエフェクタードメインのＣ末端側の天然に存在するＴＡＬエフェクターからの少なくとも６８、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０若しくはそれ以上のアミノ酸を含む。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン又はＤＮＡ結合ドメインは、Ｚｎフィンガー分子であるか又はそれを含む。Ｚｎフィンガー分子は、Ｚｎフィンガータンパク質、例えば、天然に存在するＺｎフィンガータンパク質若しくは改変されたＺｎフィンガータンパク質、又はその断片を含む。多くのＺｎフィンガータンパク質は、当業者に公知であり、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。
一部の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、選択される標的ＤＮＡ配列に結合するように改変される、非天然に存在するＺｎフィンガータンパク質を含む。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１；Ｐａｂｏ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０；Ｉｓａｌａｎ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０；Ｓｅｇａｌ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７；Ｃｈｏｏ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６；米国特許第６，４５３，２４２号明細書；米国特許第６，５３４，２６１号明細書；米国特許第６，５９９，６９２号明細書；米国特許第６，５０３，７１７号明細書；米国特許第６，６８９，５５８号明細書；米国特許第７，０３０，２１５号明細書；米国特許第６，７９４，１３６号明細書；米国特許第７，０６７，３１７号明細書；米国特許第７，２６２，０５４号明細書；米国特許第７，０７０，９３４号明細書；米国特許第７，３６１，６３５号明細書；米国特許第７，２５３，２７３号明細書；及び米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号明細書；米国特許出願公開第２００７／０２１８５２８号明細書；米国特許出願公開第２００５／０２６７０６１号明細書（全てはそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
改変されたＺｎフィンガータンパク質は、天然に存在するＺｎフィンガータンパク質と比較して、新規な結合特異性を有し得る。改変方法として、限定はしないが、合理的な設計及び様々なタイプの選択が挙げられる。合理的な設計は、例えば、三つ組（又は四つ組）ヌクレオチド配列及び個別のＺｎフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、それぞれの三つ組又は四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組又は四つ組配列に結合するＺｎフィンガーの１つ又は複数のアミノ酸配列と会合する。例えば、米国特許第６，４５３，２４２号明細書及び米国特許第６，５３４，２６１号明細書（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
ファージディスプレイ及びツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号明細書；米国特許第５，９２５，５２３号明細書；米国特許第６，００７，９８８号明細書；米国特許第６，０１３，４５３号明細書；米国特許第６，４１０，２４８号明細書；米国特許第６，１４０，４６６号明細書；米国特許第６，２００，７５９号明細書；及び米国特許第６，２４２，５６８号明細書；並びに国際特許公開の国際公開第９８／３７１８６号パンフレット；国際公開第９８／５３０５７号パンフレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；並びに国際公開第０１／８８１９７号パンフレット及び英国特許第２，３３８，２３７号明細書に開示されている。更に、Ｚｎフィンガータンパク質における結合特異性の増加については、例えば、国際特許公開の国際公開第０２／０７７２２７号パンフレットに記載されている。
更に、これらや他の参考文献に開示のとおり、Ｚｎフィンガードメイン及び／又は多指型（ｍｕｌｔｉ－ｆｉｎｇｅｒｅｄ）Ｚｎフィンガータンパク質は、例えば、５又はそれ以上のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を用いて、一緒に連結され得る。６又はそれ以上のアミノ酸長の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号明細書；米国特許第６，９０３，１８５号明細書；及び米国特許第７，１５３，９４９号明細書も参照されたい。本明細書に記載のタンパク質は、タンパク質の個別のＺｎフィンガー間の好適なリンカーの任意の組合せを含み得る。更に、Ｚｎフィンガー結合ドメインにおける結合特異性の増加については、例えば、共同所有された国際特許公開の国際公開第０２／０７７２２７号パンフレットに記載されている。
融合タンパク質（及びそれをコードするポリヌクレオチド）の設計及び構築のためのＺｎフィンガーのタンパク質及び方法は、当業者に公知であり、米国特許第６，１４０，０８１５号明細書；米国特許第７８９，５３８号明細書；米国特許第６，４５３，２４２号明細書；米国特許第６，５３４，２６１号明細書；米国特許第５，９２５，５２３号明細書；米国特許第６，００７，９８８号明細書；米国特許第６，０１３，４５３号明細書；及び米国特許第６，２００，７５９号明細書；国際特許公開の国際公開第９５／１９４３１号パンフレット；国際公開第９６／０６１６６号パンフレット；国際公開第９８／５３０５７号パンフレット；国際公開第９８／５４３１１号パンフレット；国際公開第００／２７８７８号パンフレット；国際公開第０１／６０９７０号パンフレット；国際公開第０１／８８１９７号パンフレット；国際公開第０２／０９９０８４号パンフレット；国際公開第９８／５３０５８号パンフレット；国際公開第９８／５３０５９号パンフレット；国際公開第９８／５３０６０号パンフレット；国際公開第０２／０１６５３６号パンフレット；及び国際公開第０３／０１６４９６号パンフレットに詳述されている。
更に、これらや他の参考文献に開示のとおり、Ｚｎフィンガータンパク質及び／又は多指型Ｚｎフィンガータンパク質は、例えば、５又はそれ以上のアミノ酸長のリンカーを含む、任意の好適なリンカー配列を用いて、例えば、融合タンパク質として、一緒に連結され得る。６又はそれ以上のアミノ酸長の例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号明細書；米国特許第６，９０３，１８５号明細書；及び米国特許第７，１５３，９４９号明細書も参照されたい。本明細書に記載のＺｎフィンガー分子は、Ｚｎフィンガー分子の個別のＺｎフィンガータンパク質及び／又は多指型Ｚｎフィンガータンパク質間の好適なリンカーの任意の組合せを含み得る。
特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメイン又はエンドヌクレアーゼドメインは、標的ＤＮＡ配列に（配列特異的様式で）結合する改変されたＺｎフィンガータンパク質を含むＺｎフィンガー分子を含む。一部の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、１つのＺｎフィンガータンパク質又はその断片を含む。他の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、複数のＺｎフィンガータンパク質（又はその断片）、例えば、２、３、４、５、６又はそれ以上のＺｎフィンガータンパク質（及び任意選択で多くて１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２つのＺｎフィンガータンパク質）を含む。一部の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、少なくとも３つのＺｎフィンガータンパク質を含む。一部の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、４、５又は６つのフィンガーを含む。一部の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、８、９、１０、１１又は１２のフィンガーを含む。一部の実施形態では、３つのＺｎフィンガータンパク質を含むＺｎフィンガー分子は、９又は１０ヌクレオチドを含む標的ＤＮＡ配列を認識する。一部の実施形態では、４つのＺｎフィンガータンパク質を含むＺｎフィンガー分子は、１２～１４ヌクレオチドを含む標的ＤＮＡ配列を認識する。一部の実施形態では、６つのＺｎフィンガータンパク質を含むＺｎフィンガー分子は、１８～２１ヌクレオチドを含む標的ＤＮＡ配列を認識する。
一部の実施形態では、Ｚｎフィンガー分子は、両手式のＺｎフィンガータンパク質を含む。両手式のＺｎフィンガータンパク質は、２つのＺｎフィンガードメインが２つの不連続な標的ＤＮＡ配列に結合するように、Ｚｎフィンガータンパク質の２つのクラスターが介在性アミノ酸によって分離されたタンパク質である。両手型のＺｎフィンガー結合タンパク質の例として、４つのＺｎフィンガータンパク質のクラスターがそのタンパク質のアミノ末端に位置し、３つのＺｎフィンガータンパク質のクラスターがカルボキシル末端に位置する場合のＳＩＰ１が挙げられる（Ｒｅｍａｄｅ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １８（１８）：５０７３－５０８４を参照されたい）。これらのタンパク質におけるＺｎフィンガーの各クラスターは、固有の標的配列に結合可能であり、２つの標的配列間の間隔は、多数のヌクレオチドを含み得る。
リンカー
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、リンカー、例えば、ペプチドリンカー、例えば、表１０に記載されるリンカーを含み得る。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の方向に、Ｃａｓドメイン（例えば、表８のＣａｓドメイン）、表１０のリンカー（又はそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有する配列）、及びＲＴドメイン（例えば、表６のＲＴドメイン）を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、エンドヌクレアーゼとＲＴドメインとの間のフレキシブルリンカー、例えばアミノ酸配列ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳ（配列番号１１，００２）を含むリンカーを含む。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドのＲＴドメインは、エンドヌクレアーゼドメインに対してＣ末端に位置し得る。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドのＲＴドメインは、エンドヌクレアーゼドメインに対してＮ末端に位置し得る。
Figure 2024533312000052
Figure 2024533312000053
Figure 2024533312000054
Figure 2024533312000055
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドのリンカーは、（ＳＧＧＳ）ｎ（配列番号５０２５）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５０２６）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５０２７）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号５０２８）、（ＧＧＳ）ｎ、又は（ＸＰ）ｎから選択されるモチーフを含む。
プールスクリーニングによる遺伝子改変ポリペプチド選択
候補遺伝子改変ポリペプチドは、候補の遺伝子編集能力を評価するためにスクリーニングされ得る。例えば、ヒトゲノムにおけるコード配列の標的化された編集のために設計されたＲＮＡ遺伝子改変システムが使用され得る。特定の実施形態では、このような遺伝子改変システムが、プールスクリーニング手法と共に使用され得る。
例えば、遺伝子改変ポリペプチド候補及び鋳型ガイドＲＮＡ（ｔｇＲＮＡ）のライブラリーが、プールスクリーニング手法によって候補の遺伝子編集能力を試験するために、哺乳動物細胞内に導入され得る。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチド候補のライブラリーが、哺乳動物細胞内に導入された後、ｔｇＲＮＡが細胞内に導入される。
スクリーニングにおいて使用され得る哺乳動物細胞代表的な非限定的な例としては、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｈ７細胞、Ｋ５６２細胞、又はｉＰＳ細胞が挙げられる。
遺伝子改変ポリペプチド候補は、１）Ｃａｓ－ヌクレアーゼ、例えば野生型Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、変異体Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓニッカーゼ、例えば、Ｃａｓ９ Ｎ８６３ＡニッカーゼなどのＣａｓ９ニッカーゼ、又は表７若しくは表８から選択されるＣａｓヌクレアーゼ、２）ペプチドリンカー、例えば、様々な程度の長さ、柔軟性、疎水性、及び／又は二次構造を示し得る表Ｄ若しくは表１０からの配列；及び３）逆転写酵素（ＲＴ）、例えば、表Ｄ若しくは表６からのＲＴドメインを含み得る。遺伝子改変ポリペプチド候補ライブラリーは、Ｃａｓヌクレアーゼ、ペプチドリンカー若しくはＲＴドメイン成分の１つ、２つ若しくは３つ全てに関して互いに異なる複数の異なる遺伝子改変ポリペプチド候補、又はこのような遺伝子改変ポリペプチド候補をコードする複数の核酸発現ベクターを含む。
遺伝子改変ポリペプチド候補のスクリーニングについて、遺伝子改変ポリペプチド成分及びｔｇＲＮＡ成分を含む２成分システムが使用され得る。遺伝子改変成分は、例えば、発現ベクター、例えば遺伝子改変ポリペプチド候補をコードする発現プラスミド又はレンチウイルスベクターを含み得、例えば遺伝子改変ポリペプチド候補をコードするヒトコドン最適化核酸、例えば上記のＣａｓ－リンカー－ＲＴ融合を含む。特定の実施形態では、（ｉ）哺乳動物細胞内の発現のためのプロモータ、例えばＣＭＶプロモータ；（ｉｉ）遺伝子改変ライブラリー候補、例えば表７又は表８のＣａｓヌクレアーゼ、表１０のペプチドリンカー及び表６のＲＴを含むＣａｓ－リンカー－ＲＴ融合、例えば表ＤにあるようなＣａｓ－リンカー－ＲＴ融合；（ｉｉｉ）自己切断ポリペプチド、例えばＴ２Ａペプチド；（ｉｖ）哺乳動物細胞内の選択を可能にするマーカ、例えばピューロマイシン耐性遺伝子；及び（ｖ）終結シグナル、例えばポリＡテールを含むレンチウイルスカセットが用いられる。
ｔｇＲＮＡ成分は、ｔｇＲＮＡ又は発現ベクター、例えば、ｔｇＲＮＡを生成し、例えば、Ｕ６プロモータを用いて、ｔｇＲＮＡの発現を駆動する発現プラスミドを含み得、ここで、ｔｇＲＮＡは、Ｃａｓによって認識され、それを目的のゲノム遺伝子座に局在化し、またＲＴドメインによって所望の編集の逆転写をゲノムに鋳型化するノンコーディングＲＮＡ配列である。
遺伝子改変ポリペプチドライブラリー候補を発現する細胞のプールを調製するために、哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ又はＵ２ＯＳ細胞に、プールされた遺伝子改変ポリペプチド候補発現ベクター調製物、例えば、遺伝子改変候補ポリペプチドライブラリーのレンチウイルス調製物が形質導入され得る。特定の実施形態では、レンチウイルスプラスミドが用いられ、ＨＥＫ２９３ Ｌｅｎｔｉ－Ｘ細胞が、レンチウイルスプラスミドトランスフェクションの前に、１５ｃｍプレートに播種される（約１２×１０６個の細胞）。こうした実施形態では、レンチウイルスプラスミドトランスフェクションが、Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（Ｂｉｏｓｅｔｔｉａ）を用いて行われ得、遺伝子改変候補ライブラリーのためのプラスミドＤＮＡのトランスフェクションが、製造業者のプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を用いて行われる。こうした実施形態では、細胞外ＤＮＡが、翌日、完全な培地交換によって除去され得、ウイルス含有培地が、４８時間後に収集され得る。レンチウイルス培地は、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて濃縮され得、５ｍＬのレンチウイルスアリコートが作製され、－８０℃で貯蔵され得る。レンチウイルス力価測定が、選択後、例えば、ピューロマイシン選択後にコロニー形成単位を計数することによって行われる。
標的ＤＮＡの遺伝子編集をモニターするために、哺乳動物細胞、例えば、標的ＤＮＡを担持するＨＥＫ２９３Ｔ又はＵ２ＯＳ細胞が用いられ得る。標的ＤＮＡの遺伝子編集のモニターについての他の実施形態では、哺乳動物細胞、例えば、標的ＤＮＡゲノムランディングパッドを担持するＨＥＫ２９３Ｔ又はＵ２ＯＳ細胞が用いられ得る。特定の実施形態では、標的ＤＮＡゲノムランディングパッドは、対象とする疾患又は障害の処置のために編集される遺伝子を含み得る。他の特定の実施形態では、標的ＤＮＡは、遺伝子編集が起こったかどうかを決定するためにモニターされ得る検出可能な特性を示すタンパク質を発現する遺伝子配列である。例えば、特定の実施形態では、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）発現又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現ゲノムランディングパッドが用いられる。特定の実施形態では、哺乳動物細胞、例えば、標的ＤＮＡ、例えば、標的ＤＮＡゲノムランディングパッドを含むＨＥＫ２９３Ｔ又はＵ２ＯＳ細胞が、遺伝子改変ライブラリー候補当たり５００×～３０００×細胞で培養プレートに播種され、細胞当たりの多重感染を最小限に抑えるために０．２～０．３感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入される。ピューロマイシン（２．５ｕｇ／ｍＬ）が、感染細胞の選択を可能にするために、感染の４８時間後に加えられ得る。こうした実施形態では、細胞は、少なくとも７日間にわたってピューロマイシン選択下に置かれ、次に、ｔｇＲＮＡ導入、例えば、ｔｇＲＮＡエレクトロポレーションのためにスケールアップされ得る。
遺伝子編集が起こるかどうかを確認するために、編集される標的ＤＮＡを含有する哺乳動物細胞に、遺伝子改変ポリペプチドライブラリー候補を感染させ、次に、標的ＤＮＡの編集への使用のために設計されたｔｇＲＮＡでトランスフェクトさせ得る。その後、細胞は、例えば、細胞ソーティング及び配列分析を使用することにより、標的遺伝子座の編集が、設計された結果に準じて起こったかどうか、又は編集が起こらなかった若しくは不完全な編集が起こったかどうかを決定するために分析され得る。
特定の実施形態では、ゲノム編集が起こるかどうかを確認するために、ＢＦＰ－又はＧＦＰ発現哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ又はＵ２ＯＳ細胞に、遺伝子改変ライブラリー候補を感染させ、次に、ｔｇＲＮＡプラスミド又はＲＮＡ、例えば、ライブラリー候補につき＞２５０×～１０００×のカバレージを確実にする細胞数で、ＢＦＰからＧＦＰ又はＧＦＰからＢＦＰに変換するように設計された２００ｎｇのｔｇＲＮＡプラスミドによる２５０，０００個の細胞／ウェルのエレクトロポレーションによってトランスフェクト又はエレクトロポレートさせ得る。こうした実施形態では、このアッセイにおける様々な構築物のゲノム編集能力が、エレクトロポレーションの４～１０日後に、色変換型蛍光タンパク質（ＦＰ）の発現のために蛍光活性化細胞ソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）によって細胞をソートすることによって評価され得る。細胞がソートされ、非編集細胞（元の蛍光タンパク質シグナルを示す）、編集細胞（変換された蛍光タンパク質シグナルを示す）、及び不完全な編集（蛍光タンパク質シグナルを示さない）細胞の異なる集団として収集される。非ソート細胞のサンプルも、分析中の候補富化を決定するために入力集団として収集され得る。
遺伝子改変ライブラリー候補が、アッセイにおいてゲノム編集能力を示すかどうかを決定するために、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）が、ソートされた細胞集団から収集され、各集団における遺伝子改変ライブラリー候補をシーケンシングすることによって分析される。簡潔に述べると、遺伝子改変候補が、遺伝子改変ポリペプチド発現ベクター、例えば、レンチウイルスカセットに特異的なプライマーを用いてゲノムから増幅され、ゲノムＤＮＡを希釈するために第２回のＰＣＲにおいて増幅され、次に、シーケンシングされ、例えば、次世代シーケンシングプラットフォームによってシーケンシングされ得る。シーケンシングリードの品質管理の後、少なくとも約１５００ヌクレオチド及び一般に約３２００ヌクレオチド以下のリードが、遺伝子改変ポリペプチドライブラリー配列にマップされ、ライブラリー配列との最小で約８０％の一致を含むものが、このプールされたスクリーンのための所与の候補と問題なく整列されたと見なされる。アッセイにおいて遺伝子編集、例えば、ＢＦＰからＧＦＰ又はＧＦＰからＢＦＰの編集を行うことが可能な候補を同定するために、編集された集団における各ライブラリー候補のリードカウントが、最初の非ソート集団におけるそのリードカウントと比較される。
プールスクリーニングのために、ゲノム編集能力を有する遺伝子改変候補が、非ソート（入力）細胞と比べた編集された（変換されたＦＰ）集団の富化に基づいて同定される。一部の実施形態では、入力の少なくとも１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は少なくとも１００倍の富化は、潜在的に有用な遺伝子編集活性、例えば、少なくとも２倍の富化を示す。一部の実施形態では、富化は、富化比のｌｏｇ底２を取ることによってｌｏｇ値に換算される。一部の実施形態では、少なくとも０、１、２、３、４、５、５．５、６．０、６．２、６．３、６．４、６．５、又は少なくとも６．６のｌｏｇ２富化スコアは、潜在的に有用な遺伝子編集活性、例えば、少なくとも１．０のｌｏｇ２富化スコアを示す。特定の実施形態では、遺伝子改変候補について観察される富化値は、参照、例えば、エレメントＩＤ番号：１７３８０を用いて同様の条件下で観察される富化値と比較され得る。
一部の実施形態では、複数のｔｇＲＮＡが、遺伝子改変候補ライブラリーをスクリーニングするのに使用され得る。特定の実施形態では、複数のｔｇＲＮＡが、例えば、特定の標的遺伝子、例えば、疾患の処置のための遺伝子標的の遺伝子編集のために、鋳型／Ｃａｓ－リンカー－ＲＴ融合対を最適化するのに用いられ得る。特定の実施形態では、遺伝子改変候補をスクリーニングするためのプール手法が、配列された形式で多くの異なるｔｇＲＮＡを用いて行われ得る。
一部の実施形態では、複数のタイプの編集、例えば、異なる長さの挿入、置換、及び／又は欠失が、遺伝子改変候補ライブラリーをスクリーニングするのに使用され得る。
一部の実施形態では、複数の標的配列、例えば、異なる蛍光タンパク質が、遺伝子改変候補ライブラリーをスクリーニングするのに使用され得る。一部の実施形態では、複数の標的配列、例えば、異なる蛍光タンパク質が、遺伝子改変候補ライブラリーをスクリーニングするのに使用され得る。一部の実施形態では、複数の細胞型、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ又はＵ２ＯＳが、遺伝子改変候補ライブラリーをスクリーニングするのに使用され得る。当業者は、所与の候補が、ｔｇＲＮＡ配列（例えば、ヌクレオチド修飾、ＰＢＳ長さ、ＲＴ鋳型長さ）、標的配列、標的位置、編集のタイプ、遺伝子改変ポリペプチドの第１の鎖ニックに対する変異の位置又は細胞型を含む異なる条件にわたり、改変された編集能力又は観察可能な若しくは有用な活性の増加又は低下を示し得ることを理解するであろう。従って、一部の実施形態では、遺伝子改変ライブラリー候補が、例えば、少なくとも２つの細胞型における少なくとも２つの異なるｔｇＲＮＡを用いて、複数のパラメーターにわたってスクリーニングされ、遺伝子編集活性が、いずれかの単一の条件における富化によって同定される。他の実施形態では、異なるｔｇＲＮＡ及び細胞型にわたってよりロバストな活性を有する候補が、少なくとも２つの条件、例えば、スクリーニングされる全ての条件における富化によって同定される。明確にするために、任意の所与の条件下でほとんどないし全く富化を示さないことが分かった候補は、全ての条件にわたって不活性であると推定されず、異なるパラメーターを用いてスクリーニングされるか、又は例えばドメイン（例えば、ＲＴドメイン）、リンカー若しくは他のシグナル（例えば、ＮＬＳ）を交換するか、入れ替えるか又は変化させることにより、ポリペプチドレベルで再構成され得る。
例示的なＣａｓ９－リンカー－ＲＴ融合の配列
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、リンカー配列及びＲＴ配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、表Ｄに列挙されるリンカー配列又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、表Ｄに列挙されるＲＴドメインのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、表Ｄに列挙されるリンカー配列又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列；及び表Ｄに列挙されるＲＴドメインのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、（ｉ）表Ｄの行に列挙されるリンカー配列又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列；及び（ｉｉ）表Ｄの同じ行に列挙されるＲＴドメインのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
例示的な遺伝子改変ポリペプチド
いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチド（例えば、本明細書に記載のシステムの一部である遺伝子改変ポリペプチド）は、配列番号１～７７４３のいずれか１つのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号１～７７４３のいずれか１つのアミノ酸配列又はそれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号１～７７４３のいずれか１つのアミノ酸配列又はそれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号１～７７４３のいずれか１つのアミノ酸配列又はそれと少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号１～７７４３のいずれか１つのアミノ酸配列又はそれと少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号１～７７４３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号６００１～７７４３のいずれか１つのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号４５０１～４５４１のいずれか１つのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、表Ａ１に列挙されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、表Ｔ１に列挙されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、表Ｔ１に列挙されるリンカー配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、リンカーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、表Ｔ１に列挙されるＲＴドメイン配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＲＴドメインを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、（ｉ）表Ｔ１の行に列挙されるリンカー配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、リンカー；及び（ｉｉ）表Ｔ１の同じ行に列挙されるＲＴドメイン配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＲＴドメインを含む。
Figure 2024533312000056
いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、表Ｔ２に列挙されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、表Ｔ２に列挙されるリンカー配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、リンカーを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、表Ｔ２に列挙されるＲＴドメイン配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＲＴドメインを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、（ｉ）表Ｔ２の行に列挙されるリンカー配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、リンカー；及び（ｉｉ）表Ｔ２の同じ行に列挙されるＲＴドメイン配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＲＴドメインを含む。
Figure 2024533312000057
Figure 2024533312000058
Figure 2024533312000059
例示的な遺伝子改変ポリペプチドの部分配列
いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の順に、Ｎ末端メチオニン残基、第１の核局在シグナル（ＮＬＳ）、ＤＮＡ結合ドメイン、リンカー、ＲＴドメイン、及び／又は第２のＮＬＳの１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ全て）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の順に、ＮＬＳ（例えば、第１のＮＬＳ）、ＤＮＡ結合ドメイン、リンカー、及びＲＴドメインを含み、ここで、リンカー及びＲＴドメインは、配列番号１～７７４３のいずれか１つの遺伝子改変ポリペプチドのリンカー及びＲＴドメイン、又は前記リンカー及びＲＴドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の順に、ＤＮＡ結合ドメイン、リンカー、ＲＴドメイン、及びＮＬＳ（例えば、第２のＮＬＳ）を含み、ここで、リンカー及びＲＴドメインは、配列番号１～７７４３のいずれか１つの遺伝子改変ポリペプチドのリンカー及びＲＴドメイン、又は前記リンカー及びＲＴドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の順に、第１のＮＬＳ、ＤＮＡ結合ドメイン、リンカー、ＲＴドメイン、及び第２のＮＬＳを含み、ここで、リンカー及びＲＴドメインは、配列番号１～７７４３のいずれか１つの遺伝子改変ポリペプチドのリンカー及びＲＴドメイン、又は前記リンカー及びＲＴドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基を更に含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の順に、Ｎ末端メチオニン残基、第１の核局在シグナル（ＮＬＳ）（例えば、配列番号１～７７４３のいずれか１つ及び／又は表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙される遺伝子改変ポリペプチド又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列のもの）ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、Ｃａｓドメイン、例えば、ＳｐｙＣａｓ９ドメイン、例えば、表８に列挙されるもの、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列；又は配列番号１～７７４３のいずれか１つ及び／又は表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙される遺伝子改変ポリペプチド又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＤＮＡ結合ドメイン）、リンカー（例えば、配列番号１～７７４３のいずれか１つ及び／又は表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙される遺伝子改変ポリペプチド又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列のもの）ＲＴドメイン（例えば、配列番号１～７７４３のいずれか１つ及び／又は表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙される遺伝子改変ポリペプチド又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列のもの）、及び第２のＮＬＳ（例えば、配列番号１～７７４３のいずれか１つ及び／又は表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙される遺伝子改変ポリペプチド又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列のもの）の１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ全て）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、（例えば、第２のＮＬＳのＣ末端に）Ｔ２Ａ配列及び／又はピューロマイシン配列（例えば、配列番号１～７７４３のいずれか１つ及び／又は表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙される遺伝子改変ポリペプチド又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列のもの）を更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸（例えば、本明細書に記載のもの）は、Ｔ２Ａ配列をコードし、例えば、Ｔ２Ａ配列は、遺伝子改変ポリペプチドをコードする領域と、第２の領域との間に位置し、第２の領域は、選択マーカ、例えば、ピューロマイシンを任意選択でコードする。
特定の実施形態では、第１のＮＬＳは、配列番号１～７７４３のいずれかのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有する遺伝子改変ポリペプチドの第１のＮＬＳ配列を含む。特定の実施形態では、第１のＮＬＳは、表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙される遺伝子改変ポリペプチドの第１のＮＬＳ配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、第１のＮＬＳ配列は、Ｃ－ｍｙｃ ＮＬＳを含む。特定の実施形態では、第１のＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号１１，０９５）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、第１のＮＬＳとＤＮＡ結合ドメインとの間にスペーサー配列を更に含む。特定の実施形態では、第１のＮＬＳとＤＮＡ結合ドメインとの間のスペーサー配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、第１のＮＬＳとＤＮＡ結合ドメインとの間のスペーサー配列は、アミノ酸配列ＧＧを含む。
特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、配列番号１～７７４３のいずれか１つの遺伝子改変ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメイン又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、表Ａ１、Ｔ１又はＴ２のいずれかに列挙される遺伝子改変ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメイン又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、Ｃａｓドメイン（例えば、表８に列挙されるもの）を含む。特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＳｐｙＣａｓ９ポリペプチド（例えば、表８に記載されているもの、例えば、Ｃａｓ９ Ｎ８６３Ａポリペプチド）のアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、アミノ酸配列：
Figure 2024533312000060
 又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、ＤＮＡ結合ドメインとリンカーとの間にスペーサー配列を更に含む。特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインとリンカーとの間のスペーサー配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインとリンカーとの間のスペーサー配列は、アミノ酸配列ＧＧを含む。
特定の実施形態では、リンカーは、配列番号１～７７４３のいずれか１つの遺伝子改変ポリペプチドのリンカー配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、リンカーは、表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙される遺伝子改変ポリペプチドのリンカー配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、リンカーは、表Ｄ又は１０に列挙されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、リンカーとＲＴドメインとの間にスペーサー配列を更に含む。特定の実施形態では、リンカーとＲＴドメインとの間のスペーサー配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、リンカーとＲＴドメインとの間のスペーサー配列は、アミノ酸配列ＧＧを含む。
特定の実施形態では、ＲＴドメインは、配列番号１～７７４３のいずれか１つの遺伝子改変ポリペプチドのＲＴドメイン配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＲＴドメインは、表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙される遺伝子改変ポリペプチドのＲＴドメイン配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＲＴドメインは、表Ｄ又は６に列挙されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、約４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００、又は９００～１０００アミノ酸の長さを有する。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、ＲＴドメインと第２のＮＬＳとの間にスペーサー配列を更に含む。特定の実施形態では、ＲＴドメインと第２のＮＬＳとの間のスペーサー配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、ＲＴドメインと第２のＮＬＳとの間のスペーサー配列は、アミノ酸配列ＡＧを含む。
特定の実施形態では、第２のＮＬＳは、配列番号１～７７４３のいずれか１つの遺伝子改変ポリペプチドの第２のＮＬＳ配列を含む。特定の実施形態では、第２のＮＬＳは、表Ａ１、Ｔ１、又はＴ２のいずれかに列挙される遺伝子改変ポリペプチドの第２のＮＬＳ配列を含む。特定の実施形態では、第２のＮＬＳ配列は、複数の部分ＮＬＳ配列を含む。実施形態では、ＮＬＳ配列、例えば第２のＮＬＳ配列は、第１の部分ＮＬＳ配列（例えば、アミノ酸配列ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥ（配列番号１１，０９７）を含む）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態では、ＮＬＳ配列、例えば、第２のＮＬＳ配列は、第２の部分ＮＬＳ配列を含む。実施形態では、ＮＬＳ配列、例えば第２のＮＬＳ配列は、ＳＶ４０Ａ５ ＮＬＳ、例えば二分ＳＶ４０Ａ５ ＮＬＳ（例えばアミノ酸配列ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＡＫＶＥ（配列番号１１，０９８）を含む）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳ配列、例えば第２のＮＬＳ配列は、アミノ酸配列ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＡＫＶＥ（配列番号１１，０９９）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、第２のＮＬＳとＴ２Ａ配列及び／又はピューロマイシン配列との間にスペーサー配列を更に含む。特定の実施形態では、第２のＮＬＳとＴ２Ａ配列及び／又はピューロマイシン配列との間のスペーサー配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、第２のＮＬＳとＴ２Ａ配列及び／又はピューロマイシン配列との間のスペーサー配列は、アミノ酸配列ＧＳＧを含む。
リンカー及びＲＴドメイン
いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、リンカー（例えば、本明細書に記載されるもの）及びＲＴドメイン（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の順に、リンカー（例えば、本明細書に記載されるもの）及びＲＴドメイン（例えば、本明細書に記載されるもの）を含む。
特定の実施形態では、リンカーは、表１０に列挙されるリンカー配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、リンカーは、配列番号１～７７４３のいずれか１つのリンカー配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、リンカーは、配列番号６００１～７７４３のいずれか１つのリンカー配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、リンカーは、配列番号４５０１～４５４１のいずれか１つのリンカー配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、リンカーは、表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙される例示的な遺伝子改変ポリペプチドのリンカー配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＲＴドメインは、表６に列挙されるＲＴドメイン配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ＲＴドメインは、表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙される例示的な遺伝子改変ポリペプチドのＲＴドメイン配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号１～７７４３のいずれか１つの遺伝子改変ポリペプチドの一部を含み、この一部は、リンカー及びＲＴドメイン、又は前記一部と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号１～７７４３のいずれか１つの遺伝子改変ポリペプチドのリンカー、又は前記リンカーと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号６００１～７７４３のいずれか１つの遺伝子改変ポリペプチドのリンカー、又は前記リンカーと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号４５０１～４５４１のいずれか１つの遺伝子改変ポリペプチドのリンカー、又は前記リンカーと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙される遺伝子改変ポリペプチドのリンカー又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むリンカーを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号１～７７４３のいずれか１つの遺伝子改変ポリペプチドのＲＴドメイン、又は前記ＲＴドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号６００１～７７４３のいずれか１つの遺伝子改変ポリペプチドのＲＴドメイン、又は前記ＲＴドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号４５０１～４５４１のいずれか１つの遺伝子改変ポリペプチドのＲＴドメイン、又は前記ＲＴドメインと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙される遺伝子改変ポリペプチドのＲＴドメイン又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＲＴドメインを含む。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドのリンカー及びＲＴドメインは、配列番号１～７７４３のいずれか１つのアミノ酸配列を有する遺伝子改変ポリペプチドのリンカー及びＲＴドメインのアミノ酸配列（又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドのリンカー及びＲＴドメインは、配列番号１～７７４３のいずれか１つのリンカー及びＲＴドメインと少なくとも８０％の同一性を有するリンカー及びＲＴドメインのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドのリンカー及びＲＴドメインは、配列番号１～７７４３のいずれか１つのリンカー及びＲＴドメインと少なくとも９０％の同一性を有するリンカー及びＲＴドメインのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドのリンカー及びＲＴドメインは、配列番号１～７７４３のいずれか１つのリンカー及びＲＴドメインと少なくとも９５％の同一性を有するリンカー及びＲＴドメインのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドのリンカー及びＲＴドメインは、配列番号１～７７４３のいずれか１つのリンカー及びＲＴドメインと少なくとも９９％の同一性を有するリンカー及びＲＴドメインのアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドのリンカー及びＲＴドメインは、配列番号６００１～７７４３のいずれか１つのアミノ酸配列を有する遺伝子改変ポリペプチドのリンカー及びＲＴドメインのアミノ酸配列（又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドのリンカー及びＲＴドメインは、配列番号４５０１～４５４１のいずれか１つのアミノ酸配列を有する遺伝子改変ポリペプチドのリンカー及びＲＴドメインのアミノ酸配列（又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドのリンカー及びＲＴドメインは、表Ａ１、Ｔ１、又はＴ２のいずれかの単一の行（例えば、表Ａ１、Ｔ１、又はＴ２のいずれかに列挙される単一の例示的な遺伝子改変ポリペプチド）からのリンカー及びＲＴドメインのアミノ酸配列（又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドのリンカー及びＲＴドメインは、配列番号１～７７４３から選択される２つの異なるアミノ酸配列からのリンカー及びＲＴドメインのアミノ酸配列（又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドのリンカー及びＲＴドメインは、表Ａ１、Ｔ１、又はＴ２のいずれかの異なる行からのリンカー及びＲＴドメインのアミノ酸配列（又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列）を含む。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、例えば本明細書に記載されるように、第１のＮＬＳ（例えば、５’ＮＬＳ）を更に含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、例えば本明細書に記載されるように、第２のＮＬＳ（例えば、３’ＮＬＳ）を更に含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニン残基を更に含む。
ＲＴファミリー及び変異体
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、ＡＶＩＲＥ、ＢＡＥＶＭ、ＦＦＶ、ＦＬＶ、ＦＯＡＭＶ、ＧＡＬＶ、ＫＯＲＶ、ＭＬＶＡＶ、ＭＬＶＢＭ、ＭＬＶＣＢ、ＭＬＶＦＦ、ＭＬＶＭＳ、ＰＥＲＶ、ＳＦＶ１、ＳＦＶ３Ｌ、ＷＭＳＶ、ＸＭＲＶ６、ＢＬＶＡＵ、ＢＬＶＪ、ＨＴＬ１Ａ、ＨＴＬ１Ｃ、ＨＴＬ１Ｌ、ＨＴＬ３２、ＨＴＬ３Ｐ、ＨＴＬＶ２、ＪＳＲＶ、ＭＬＶＦ５、ＭＬＶＲＤ、ＭＭＴＶＢ、ＭＰＭＶ、ＳＦＶＣＰ、ＳＭＲＶＨ、ＳＲＶ１、ＳＲＶ２、及びＷＤＳＶから選択されるファミリーからのＲＴドメイン配列のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、ＡＶＩＲＥ、ＢＡＥＶＭ、ＦＦＶ、ＦＬＶ、ＦＯＡＭＶ、ＧＡＬＶ、ＫＯＲＶ、ＭＬＶＡＶ、ＭＬＶＢＭ、ＭＬＶＣＢ、ＭＬＶＦＦ、ＭＬＶＭＳ、ＰＥＲＶ、ＳＦＶ１、ＳＦＶ３Ｌ、ＷＭＳＶ、及びＸＭＲＶ６から選択されるファミリーからのＲＴドメイン配列のアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、ＭＬＶＭＳ ＲＴドメインからのＲＴドメイン配列のアミノ酸配列を含む。実施形態では、ＲＴドメイン配列のアミノ酸配列は、表Ｍ１の列１に列挙されるような１つ以上の点変異、又はそれに対応する点変異を含む。実施形態では、ＲＴドメイン配列のアミノ酸配列は、表Ｍ１の列３（Ｇｅｎ１ ＭＬＶＭＳ）に列挙されるような１つ以上の点変異、又はそれに対応する点変異を含む。実施形態では、ＲＴドメイン配列のアミノ酸配列は、表Ｍ２の列１及び２に列挙されるようなＲＴドメインのアミノ酸位置、又はそれに対応するアミノ酸位置に、１つ以上の点変異を含む。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、ＡＶＩＲＥ ＲＴドメインからのＲＴドメイン配列のアミノ酸配列を含む。実施形態では、ＲＴドメイン配列のアミノ酸配列は、表Ｍ１の列２に列挙されるような１つ以上の点変異、又はそれに対応する点変異を含む。実施形態では、ＲＴドメイン配列のアミノ酸配列は、表Ｍ１の列４（Ｇｅｎ２ ＡＶＩＲＥ）に列挙されるような１つ以上の点変異、又はそれに対応する点変異を含む。実施形態では、ＲＴドメイン配列のアミノ酸配列は、表Ｍ２の列３及び４に列挙されるようなＲＴドメインのアミノ酸位置、又はそれに対応するアミノ酸位置に、１つ以上の点変異を含む。特定の実施形態では、ＲＴドメインは、ＩＥＮＳＳＰを（例えば、Ｃ末端に）含む。
Figure 2024533312000061
Figure 2024533312000062
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、ガンマレトロウイルスからのＲＴドメインを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドの、ガンマレトロウイルスからのＲＴドメインは、ＡＶＩＲＥ、ＢＡＥＶＭ、ＦＦＶ、ＦＬＶ、ＦＯＡＭＶ、ＧＡＬＶ、ＫＯＲＶ、ＭＬＶＡＶ、ＭＬＶＢＭ、ＭＬＶＣＢ、ＭＬＶＦＦ、ＭＬＶＭＳ、ＰＥＲＶ、ＳＦＶ１、ＳＦＶ３Ｌ、ＷＭＳＶ、及びＸＭＲＶ６から選択されるファミリーからのＲＴドメイン配列のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドの、ガンマレトロウイルスからのＲＴドメインは、ＰＥＲＶに由来しない。いくつかの実施形態では、前記ＲＴは、表２Ａに示され、マウス白血病ウイルス逆転写酵素のＲＴドメインにおける変異Ｄ２００Ｎ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３３０Ｐ、Ｄ５２４Ｇ、Ｅ５６２Ｑ、Ｄ５８３Ｎ、Ｐ５１Ｌ、Ｓ６７Ｒ、Ｅ６７Ｋ、Ｔ１９７Ａ、Ｈ２０４Ｒ、Ｅ３０２Ｋ、Ｆ３０９Ｎ、Ｗ３１３Ｆ、Ｌ４３５Ｇ、Ｎ４５４Ｋ、Ｈ５９４Ｑ、Ｌ６７１Ｐ、Ｅ６９Ｋ、又はＤ６５３Ｎに対応する１、２、３、４、５、６個以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号１～７７４３のいずれか１つのリンカードメインと少なくとも９９％の同一性を有するリンカーを更に含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号５２１７又は配列番号１１，０４１と少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するリンカーを更に含む。
実施形態では、ＲＴドメインは、ＡＶＩＲＥ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列（例えば、ＡＶＩＲＥ＿Ｐ０３３６０配列、例えば、配列番号８００１）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２００Ｎ、Ｇ３３０Ｐ、Ｌ６０５Ｗ、Ｔ３０６Ｋ、及びＷ３１３Ｆからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの変異を更に含むＡＶＩＲＥ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２００Ｎ、Ｇ３３０Ｐ、及びＬ６０５Ｗからなる群から選択される１つ、２つ若しくは３つの変異を更に含むＡＶＩＲＥ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。
実施形態では、ＲＴドメインは、ＢＡＥＶＭ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列（例えば、ＢＡＥＶＭ＿Ｐ１０２７２配列、例えば、配列番号８００４）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ１９８Ｎ、Ｅ３２８Ｐ、Ｌ６０２Ｗ、Ｔ３０４Ｋ、及びＷ３１１Ｆからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの変異を更に含むＢＡＥＶＭ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ１９８Ｎ、Ｅ３２８Ｐ、及びＬ６０２Ｗからなる群から選択される１つ、２つ若しくは３つの変異を更に含むＢＡＥＶＭ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。
実施形態では、ＲＴドメインは、ＦＦＶ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列（例えば、ＦＦＶ＿Ｏ９３２０９配列、例えば、配列番号８０１２）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２１Ｎ、Ｔ２９３Ｎ、Ｔ４１９Ｐ、及びＬ３９３Ｋからなる群から選択される１つ、２つ、３つ若しくは４つの変異を更に含むＦＦＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２１Ｎ、Ｔ２９３Ｎ、及びＴ４１９Ｐからなる群から選択される１つ、２つ若しくは３つの変異を更に含むＦＦＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、変異Ｄ２１Ｎを更に含むＦＦＶ ＲＴのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｔ２０７Ｎ、Ｔ３３３Ｐ、及びＬ３０７Ｋからなる群から選択される１つ、２つ若しくは３つの変異を更に含むＦＦＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｔ２０７Ｎ及びＴ３３３Ｐからなる群から選択される１つ若しくは２つの変異を更に含むＦＦＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。
実施形態では、ＲＴドメインは、ＦＬＶ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列（例えば、ＦＬＶ＿Ｐ１０２７３配列、例えば、配列番号８０１９）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ１９９Ｎ、Ｌ６０２Ｗ、Ｔ３０５Ｋ、及びＷ３１２Ｆからなる群から選択される１つ、２つ、３つ若しくは４つの変異を更に含むＦＬＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ１９９Ｎ及びＬ６０２Ｗからなる群から選択される１つ若しくは２つの変異を更に含むＦＬＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。
実施形態では、ＲＴドメインは、ＦＯＡＭＶ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列（例えば、ＦＯＡＭＶ＿Ｐ１４３５０配列、例えば、配列番号８０２１）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２４Ｎ、Ｔ２９６Ｎ、Ｓ４２０Ｐ、及びＬ３９６Ｋからなる群から選択される１つ、２つ、３つ若しくは４つの変異を更に含むＦＯＡＭＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２４Ｎ、Ｔ２９６Ｎ、及びＳ４２０Ｐからなる群から選択される１つ、２つ若しくは３つの変異を更に含むＦＯＡＭＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、変異Ｄ２４Ｎを更に含むＦＯＡＭＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｔ２０７Ｎ、Ｓ３３１Ｐ、及びＬ３０７Ｋからなる群から選択される１つ、２つ若しくは３つの変異を更に含むＦＯＡＭＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｔ２０７Ｎ及びＳ３３１Ｐからなる群から選択される１つ若しくは２つの変異を更に含むＦＯＡＭＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。
実施形態では、ＲＴドメインは、ＧＡＬＶ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列（例えば、ＧＡＬＶ＿Ｐ２１４１４配列、例えば、配列番号８０２７）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ１９８Ｎ、Ｅ３２８Ｐ、Ｌ６００Ｗ、Ｔ３０４Ｋ、及びＷ３１１Ｆからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの変異を更に含むＧＡＬＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ１９８Ｎ、Ｅ３２８Ｐ、及びＬ６００Ｗからなる群から選択される１つ、２つ若しくは３つの変異を更に含むＧＡＬＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。
実施形態では、ＲＴドメインは、ＫＯＲＶ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列（例えば、ＫＯＲＶ＿Ｑ９ＴＴＣ１配列、例えば、配列番号８０４７）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ３２Ｎ、Ｄ３２２Ｎ、Ｅ４５２Ｐ、Ｌ２７４Ｗ、Ｔ４２８Ｋ、及びＷ４３５Ｆからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ若しくは６つの変異を更に含むＧＡＬＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ３２Ｎ、Ｄ３２２Ｎ、Ｅ４５２Ｐ、及びＬ２７４Ｗからなる群から選択される１つ、２つ、３つ若しくは４つの変異を更に含むＧＡＬＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、変異Ｄ３２Ｎを更に含むＧＡＬＶ ＲＴのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２３１Ｎ、Ｅ３６１Ｐ、Ｌ６３３Ｗ、Ｔ３３７Ｋ、及びＷ３４４Ｆからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの変異を更に含むＫＯＲＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２３１Ｎ、Ｅ３６１Ｐ、及びＬ６３３Ｗからなる群から選択される１つ、２つ若しくは３つの変異を更に含むＫＯＲＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。
実施形態では、ＲＴドメインは、ＭＬＶＡＶ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列（例えば、ＭＬＶＡＶ＿Ｐ０３３５６配列、例えば、配列番号８０５３）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２００Ｎ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３０６Ｋ、及びＷ３１３Ｆからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの変異を更に含むＭＬＶＡＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２００Ｎ、Ｔ３３０Ｐ、及びＬ６０３Ｗからなる群から選択される１つ、２つ若しくは３つの変異を更に含むＭＬＶＡＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。
実施形態では、ＲＴドメインは、ＭＬＶＢＭ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列（例えば、ＭＬＶＢＭ＿Ｑ７ＳＶＫ７配列、例えば、配列番号８０５６）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ１９９Ｎ、Ｔ３２９Ｐ、Ｌ６０２Ｗ、Ｔ３０５Ｋ、及びＷ３１２Ｆからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの変異を更に含むＭＬＶＢＭ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２００Ｎ、Ｔ３３０Ｐ、及びＬ６０３Ｗからなる群から選択される１つ、２つ、及び３つの変異を更に含むＭＬＶＢＭ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。
実施形態では、ＲＴドメインは、ＭＬＶＣＢ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列（例えば、ＭＬＶＣＢ＿Ｐ０８３６１配列、例えば、配列番号８０６２）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２００Ｎ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３０６Ｋ、及びＷ３１３Ｆからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの変異を更に含むＭＬＶＣＢ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２００Ｎ、Ｔ３３０Ｐ、及びＬ６０３Ｗからなる群から選択される１つ、２つ、及び３つの変異を更に含むＭＬＶＣＢ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。
実施形態では、ＲＴドメインは、ＭＬＶＦＦ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２００Ｎ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３０６Ｋ、及びＷ３１３Ｆからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの変異を更に含むＭＬＶＦＦ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２００Ｎ、Ｔ３３０Ｐ、及びＬ６０３Ｗからなる群から選択される１つ、２つ、及び３つの変異を更に含むＭＬＶＦＦ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。
実施形態では、ＲＴドメインは、ＭＬＶＭＳ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列（例えば、ＭＬＶＭＳ＿参照配列、例えば、配列番号８１３７；又はＭＬＶＭＳ＿Ｐ０３３５５配列、例えば、配列番号８０７０）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２００Ｎ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３０６Ｋ、Ｗ３１３Ｆ、及びＨ８Ｙからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの変異を更に含むＭＬＶＭＳ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２００Ｎ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３０６Ｋ、及びＷ３１３Ｆからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの変異を更に含むＭＬＶＭＳ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２００Ｎ、Ｔ３３０Ｐ、及びＬ６０３Ｗからなる群から選択される１つ、２つ若しくは３つの変異を更に含むＭＬＶＭＳ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。
実施形態では、ＲＴドメインは、ＰＥＲＶ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列（例えば、ＰＥＲＶ＿Ｑ４ＶＦＺ２配列、例えば、配列番号８０９９）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ１９６Ｎ、Ｅ３２６Ｐ、Ｌ５９９Ｗ、Ｔ３０２Ｋ、及びＷ３０９Ｆからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの変異を更に含むＰＥＲＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ１９６Ｎ、Ｅ３２６Ｐ、及びＬ５９９Ｗからなる群から選択される１つ、２つ若しくは３つの変異を更に含むＰＥＲＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。
実施形態では、ＲＴドメインは、ＳＦＶ１ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列（例えば、ＳＦＶ１＿Ｐ２３０７４配列、例えば、配列番号８１０５）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２４Ｎ、Ｔ２９６Ｎ、Ｎ４２０Ｐ、及びＬ３９６Ｋからなる群から選択される１つ、２つ、３つ若しくは４つの変異を更に含むＳＦＶ１ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２４Ｎ、Ｔ２９６Ｎ、及びＮ４２０Ｐからなる群から選択される１つ、２つ若しくは３つの変異を更に含むＳＦＶ１ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２４Ｎを更に含むＳＦＶ１ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。
実施形態では、ＲＴドメインは、ＳＦＶ３Ｌ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列（例えば、ＳＦＶ３Ｌ＿Ｐ２７４０１配列、例えば、配列番号８１１１）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２４Ｎ、Ｔ２９６Ｎ、Ｎ４２２Ｐ、及びＬ３９６Ｋからなる群から選択される１つ、２つ、３つ若しくは４つの変異を更に含むＳＦＶ３Ｌ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２４Ｎ、Ｔ２９６Ｎ、及びＮ４２２Ｐからなる群から選択される１つ、２つ若しくは３つの変異を更に含むＳＦＶ３Ｌ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、変異Ｄ２４Ｎを更に含むＳＦＶ３Ｌ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｔ３０７Ｎ、Ｎ３３３Ｐ、及びＬ３０７Ｋからなる群から選択される１つ、２つ若しくは３つの変異を更に含むＳＦＶ３Ｌ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｔ３０７Ｎ及びＮ３３３Ｐからなる群から選択される１つ若しくは２つの変異を更に含むＳＦＶ３Ｌ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。
実施形態では、ＲＴドメインは、ＷＭＳＶ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列（例えば、ＷＭＳＶ＿Ｐ０３３５９配列、例えば、配列番号８１３１）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ１９８Ｎ、Ｅ３２８Ｐ、Ｌ６００Ｗ、Ｔ３０４Ｋ、及びＷ３１１Ｆからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの変異を更に含むＷＭＳＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ１９８Ｎ、Ｅ３２８Ｐ、及びＬ６００Ｗからなる群から選択される１つ、２つ若しくは３つの変異を更に含むＷＭＳＶ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。
実施形態では、ＲＴドメインは、ＸＭＲＶ６ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列（例えば、ＸＭＲＶ６＿Ａ１Ｚ６５１配列、例えば、配列番号８１３４）、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２００Ｎ、Ｔ３３０Ｐ、Ｌ６０３Ｗ、Ｔ３０６Ｋ、及びＷ３１３Ｆからなる群から選択される１つ、２つ、３つ、４つ若しくは５つの変異を更に含むＸＭＲＶ６ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＴドメインは、Ｄ２００Ｎ、Ｔ３３０Ｐ、及びＬ６０３Ｗからなる群から選択される１つ、２つ若しくは３つの変異を更に含むＸＭＲＶ６ ＲＴ、又は相同ＲＴドメイン内の対応する位置の、アミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドのＲＴドメインは、ＡＶＩＲＥ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態では、ＲＴドメインは、表Ａ５の列１に列挙される配列に含まれるＲＴドメインのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号５２１７又は配列番号１１，０４１と少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するリンカーを更に含む。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドのＲＴドメインは、ＭＬＶＭＳ ＲＴのＲＴドメインのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。実施形態では、ＲＴドメインは、表Ａ５の列２～６のいずれかに列挙される配列に含まれるＲＴドメインのアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号５２１７又は配列番号１１，０４１と少なくとも９９％又は１００％の同一性を有するリンカーを更に含む。
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システム
一態様では、本開示は、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、本明細書に記載されるもの）及び鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ、例えば、本明細書に記載されるもの）を含むシステムに関する。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸分子は、本明細書に記載される核酸分子に対して、コード領域（例えば、ＲＴドメインをコードする配列）に１つ以上のサイレント変異を含む。特定の実施形態では、システムは、ｇＲＮＡ（例えば、遺伝子改変ポリペプチドが結合した標的ＤＮＡの反対鎖に、例えば、ニックを誘導するポリペプチドに結合するｇＲＮＡ）を更に含む。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号１～７７４３から選択されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号６００１～７７４３から選択されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号４５０１～４５４１から選択されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸分子は、表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙されるポリペプチド又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号１～７７４３から選択されるアミノ酸配列の一部をコードする配列を含み、この一部は、リンカー及びＲＴドメイン、又は前記一部と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号６００１～７７４３から選択されるアミノ酸配列の一部をコードする配列を含み、この一部は、リンカー及びＲＴドメイン、又は前記一部と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号４５０１～４５４１から選択されるアミノ酸配列の一部をコードする配列を含み、この一部は、リンカー及びＲＴドメイン、又は前記一部と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸分子は、表Ａ１、Ｔ１、又はＴ２のいずれかに列挙されるポリペプチドの一部をコードする配列を含み、この一部は、リンカー及びＲＴドメイン、又は前記一部と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号１～７７４３から選択されるアミノ酸配列のリンカーをコードする配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号６００１～７７４３から選択されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのリンカーをコードする配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号４５０１～４５４１から選択されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのリンカーをコードする配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸分子は、表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙されるポリペプチドのリンカーをコードする配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号１～７７４３から選択されるアミノ酸配列のＲＴドメインをコードする配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号６００１～７７４３から選択されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのＲＴドメインをコードする配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号４５０１～４５４１から選択されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのＲＴドメインをコードする配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸分子は、表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙されるポリペプチドのＲＴドメインをコードする配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
一態様では、本開示は、遺伝子改変ポリペプチド（例えば、本明細書に記載されるもの）及び鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ、例えば、本明細書に記載されるもの）を含むシステムに関する。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号１～７７４３から選択されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号６００１～７７４３から選択されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号４５０１～４５４１から選択されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙されるポリペプチド又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号１～７７４３から選択されるアミノ酸配列の一部を含み、この一部は、リンカー及びＲＴドメイン、又は前記一部と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号６００１～７７４３から選択されるアミノ酸配列の一部を含み、この一部は、リンカー及びＲＴドメイン、又は前記一部と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号４５０１～４５４１から選択されるアミノ酸配列の一部を含み、この一部は、リンカー及びＲＴドメイン、又は前記一部と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙されるポリペプチドの一部を含み、この一部は、リンカー及びＲＴドメイン、又は前記一部と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号１～７７４３から選択されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列のリンカーを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号６００１～７７４３から選択されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのリンカーをコードする配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号４５０１～４５４１から選択されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのリンカーをコードする配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙されるポリペプチド又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列のリンカーを含む。
特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号１～７７４３から選択されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＲＴドメインを含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号６００１～７７４３から選択されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのＲＴドメインをコードする配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号４５０１～４５４１から選択されるアミノ酸配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドのＲＴドメインをコードする配列を含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、表Ａ１、Ｔ１若しくはＴ２のいずれかに列挙されるポリペプチド又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列のＲＴドメインを含む。
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遺伝子改変システムのための局在化配列
特定の実施形態では、遺伝子エディターシステムＲＮＡは、細胞内局在化配列、例えば、核局在化配列（ＮＬＳ）を更に含む。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、配列番号４０００及び／若しくは配列番号４００１に含まれるＮＬＳ、又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有するアミノ酸配列を有するＮＬＳを含む。
核局在化配列は、ＲＮＡの核への入力を促進するＲＮＡ配列であり得る。特定の実施形態では、核局在化シグナルは、鋳型ＲＮＡ上に位置する。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、第１のＲＮＡ上にコードされ、鋳型ＲＮＡは、第２の別のＲＮＡであり、核局在化シグナルは、鋳型ＲＮＡ上に位置し、遺伝子改変ポリペプチドをコードするＲＮＡ上に位置しない。特定の理論に束縛されることを意図しないが、一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードするＲＮＡは、その翻訳を促進するため、主に細胞質に標的化される一方、鋳型ＲＮＡは、ゲノム中に挿入を促進するため、主に核に標的化される。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、鋳型ＲＮＡの３’末端、５’末端、又は内部領域内に存在する。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、異種配列の３’である（例えば、直接的に異種配列の３’である）、又は異種配列の５’である（例えば、直接的に異種配列の５’である）。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、鋳型ＲＮＡの５’ＵＴＲの外側又は３’ＵＴＲの外側に配置される。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、５’ＵＴＲと３’ＵＴＲとの間に配置され、任意選択で、核局在化シグナルは、導入遺伝子によって転写されない（例えば、核局在化シグナルは、アンチセンス方向性であるか、又は転写終結シグナル若しくはポリアデニル化シグナルの下流である）。一部の実施形態では、核局在化配列は、イントロンの内部に位置する。一部の実施形態では、複数の同じ又は異なる核局在化シグナルは、ＲＮＡ中、例えば、鋳型ＲＮＡ中に存在する。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、５ｂｐ、１０ｂｐ、２５ｂｐ、５０ｂｐ、７５ｂｐ、１００ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ又は１０００ｂｐ未満の長さである。様々なＲＮＡ核局在化配列が使用可能である。例えば、Ｌｕｂｅｌｓｋｙ ａｎｄ Ｕｌｉｔｓｋｙ，Ｎａｔｕｒｅ ５５５（１０７－１１１），２０１８は、ＲＮＡの核内への局在化を駆動するＲＮＡ配列について記載している。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、ＳＩＮＥ由来の核ＲＮＡ局在化（ＳＩＲＬＯＩＮ）シグナルである。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、核濃縮タンパク質に結合する。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、ＨＮＲＮＰＫタンパク質に結合する。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、ピリミジン中に豊富に存在し、例えば、Ｃ／Ｔリッチ、Ｃ／Ｕリッチ、Ｃリッチ、Ｔリッチ、又はＵリッチ領域である。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、長鎖非翻訳ＲＮＡに由来する。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、ＭＡＬＡＴ１長鎖非翻訳ＲＮＡに由来する、又はＭＡＬＡＴ１の６００ヌクレオチドのＭ領域である（Ｍｉｙａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ １８，（７３８－７５１），２０１２に記載されている）。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、ＢＯＲＧ長鎖非翻訳ＲＮＡに由来する、又はＡＧＣＣＣモチーフである（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３４，２３１８－２３２９（２０１４）に記載されている。一部の実施形態では、核局在化配列は、Ｓｈｕｋｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ｅ９８４５２（２０１８）に記載されている。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、レトロウイルスに由来する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、１つ又は複数の（例えば、２、３、４、５）の核ターゲティング配列、例えば、核局在化配列（ＮＬＳ）を含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、双節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳである。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＮＬＳを含むタンパク質の細胞核への入力を促進する。一部の実施形態では、ＮＬＳは、本明細書に記載の遺伝子改変ポリペプチドのＮ末端と融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、遺伝子改変ポリペプチドのＣ末端と融合される。一部の実施形態では、ＮＬＳは、ＣａｓドメインのＮ末端又はＣ末端と融合される。一部の実施形態では、リンカー配列は、ＮＬＳと、遺伝子改変ポリペプチドの隣接ドメインとの間に配置される。
いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、アミノ酸配列ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ（配列番号５００９）、ＰＫＫＲＫＶＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５０１０）、ＲＫＳＧＫＩＡＡＩＷＫＲＰＲＫＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５０１１）ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５０１２）、ＫＫＴＥＬＱＴＴＮＡＥＮＫＴＫＫＬ（配列番号５０１３）、又はＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲ（配列番号５０１４）、ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号５０１５）、ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号４６４４）、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＡＫＶＥ（配列番号４６４９）、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥ（配列番号４６５０）、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＡＫＶＥ（配列番号４６５１）、ＡＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＡＫＶＥ（配列番号４００１）、又はその機能的断片若しくはバリアントを含む。例示的なＮＬＳ配列は、ＰＣＴ／ＥＰ２０００／０１１６９０号明細書にも記載されており、その内容は、その例示的な核局在化配列の開示について、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＮＬＳは、表１１に開示のようなアミノ酸配列を含む。この表のＮＬＳは、核への細胞内局在化を改善するため、ポリペプチド中の１つ又は複数の位置におけるポリペプチド中の１つ又は複数のコピー、例えば、Ｎ末端ドメイン内、ペプチドドメイン間、Ｃ末端ドメイン内、又は位置の組合せにおける、ＮＬＳの１、２、３若しくはそれ以上コピーで利用され得る。複数の固有配列は、単一のポリペプチド中で使用され得る。配列は、例えば、塩基性アミノ酸の１つ若しくは２つのストレッチを有する、天然に単節型（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）又は双節型であり得るか、又はキメラ双節型配列として使用され得る。配列の参照は、細胞内局在化予測アルゴリズムを用いて取り出された配列について、ＳｅｑＮＬＳとして示される場合を除いて、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号に対応する（Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ ＢＭＣ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔ １３：１５７（２０１２）、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
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一部の実施形態では、ＮＬＳは、双節型ＮＬＳである。双節型ＮＬＳは、典型的に、スペーサー配列によって隔てられる２つの塩基性アミノ酸クラスター（例えば、約１０アミノ酸長であり得る）を含む。単節型ＮＬＳは、典型的に、スペーサーを欠いている。双節型ＮＬＳの例は、配列ＫＲ［ＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡ］ＫＫＫＫ（配列番号５０１５）（括弧内はスペーサー）を有するヌクレオプラスミンＮＬＳである。別の例示的な双節型ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶＥＧＡＤＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号５０１６）を有する。例示的なＮＬＳは、国際公開第２０２００５１５６１号パンフレット（核局在化配列に関する開示を含め、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
特定の実施形態では、遺伝子エディターシステムポリペプチド（例えば、本明細書に記載の遺伝子改変ポリペプチド）は、細胞内局在化配列、例えば、核局在化配列及び／又は核小体局在化配列を更に含む。核局在化配列及び／又は核小体局在化配列は、そのタンパク質の核及び／又は核小体への入力を促進するアミノ酸配列であり得、ここで、それは、異種配列のゲノムへの組み込みを促進し得る。特定の実施形態では、遺伝子エディターシステムポリペプチド（例えば、例として本明細書に記載の遺伝子改変ポリペプチド）は、核小体局在化配列を更に含む。特定の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、第１のＲＮＡ上にコードされ、鋳型ＲＮＡは、第２の分かれたＲＮＡであり、核小体局在化シグナルは、遺伝子改変ポリペプチドをコードするＲＮＡ上にコードされ、鋳型ＲＮＡ上にコードされない。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、ポリペプチドのＮ末端、Ｃ末端、又は内部領域内に位置する。一部の実施形態では、複数の同じ又は異なる核小体局在化シグナルが使用される。一部の実施形態では、核局在化シグナルは、５、１０、２５、５０、７５又は１００アミノ酸長未満である。様々なポリペプチドの核小体局在化シグナルが使用可能である。例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２，３３（２０１５）は、核小体局在化シグナルとしても機能する核局在化シグナルについての記載がある。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、核局在化シグナルでもあり得る。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、核局在化シグナルと重複し得る。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、塩基性残基のストレッチを含み得る。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、アルギニン及びリジン残基中に豊富であり得る。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、核小体中に豊富に存在するタンパク質に由来し得る。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、リボソームＲＮＡ遺伝子座に豊富に存在するタンパク質に由来し得る。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、ｒＲＮＡに結合するタンパク質に由来し得る。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、ＭＳＰ５８に由来し得る。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、単節型モチーフであり得る。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、双節型モチーフであり得る。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、複数の単節型又は双節型モチーフからなり得る。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、単節型及び双節型モチーフの混合物からなり得る。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、二重の双節型モチーフであり得る。一部の実施形態では、核小体局在化モチーフは、ＫＲＡＳＳＱＡＬＧＴＩＰＫＲＲＳＳＳＲＦＩＫＲＫＫ（配列番号５０１７）であり得る。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、核内因子κＢ誘導キナーゼに由来し得る。一部の実施形態では、核小体局在化シグナルは、ＲＫＫＲＫＫＫモチーフ（配列番号５０１８）であり得る（Ｂｉｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１７（３６１５－３６２４），２００４に記載されている）。
遺伝子改変ポリペプチド及びシステムの進化型変異体
一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される遺伝子改変ポリペプチドの進化型変異体を提供する。進化型変異体は、一部の実施形態では、参照遺伝子改変ポリペプチド又はそこに含まれる断片若しくはドメインの１つを変異誘発させることにより生産することができる。一部の実施形態では、ドメイン（例えば、逆転写酵素ドメイン）の１つ又は複数が進化する。こうした進化型変異体ドメインの１つ又は複数は、一部の実施形態では、単独で、又は他のドメインと一緒に進化し得る。１つ又は複数の進化型変異体ドメインは、一部の実施形態では、非進化型コグネイト成分又はコグネイト成分の進化型変異体（例えば、平行若しくは連続様式で進化した可能性のあるもの）と組み合わされ得る。
一部の実施形態では、参照遺伝子改変ポリペプチド又はその断片若しくはドメインを変異誘発させるプロセスは、参照遺伝子改変ポリペプチド又はその断片若しくはドメインを変異誘発させることを含む。複数の実施形態では、変異誘発は、例えば、本明細書に記載されるように、漸進的進化方法（例えば、ＰＡＣＥ）又は非漸進的進化方法（例えば、ＰＡＮＣＥ）を含む。一部の実施形態では、進化型遺伝子改変ポリペプチド又はその断片若しくはドメインは、参照遺伝子改変ポリペプチドのアミノ酸配列又はその断片若しくはドメインと比較して、そのアミノ酸配列に導入された１つ若しくは複数のアミノ酸変異を含む。複数の実施形態では、アミノ酸配列変異は、例として、例えば、コード配列内のいずれか特定の位置のコドンの変化を招く遺伝子改変ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の変化、１つ若しくは複数のアミノ酸の欠失（例えば、短縮タンパク質）、１つ若しくは複数のアミノ酸の挿入、又はそれらの任意の組合せの結果として、参照遺伝子改変ポリペプチドのアミノ酸配列内に１つ若しくは複数の変異残基（例えば、保存的置換、非保存的置換、又はそれらの組合せ）を含み得る。進化型変異体遺伝子改変ポリペプチドは、遺伝子改変ポリペプチドの１つ又は複数の成分又はドメインにおける変異体（例えば、逆転写酵素ドメインに導入された変異体）を含み得る。
いくつかの態様では、本開示は、遺伝子改変ポリペプチドの進化型変異体を用いる、又はそれを含む遺伝子改変ポリペプチド、システム、キット、及び方法を提供し、例えば、遺伝子改変ポリペプチドの進化型変異体、又はＰＡＣＥ若しくはＰＡＮＣＥにより生産若しくは生産可能な遺伝子改変ポリペプチドを使用する。複数の実施形態では、非進化型参照遺伝子改変ポリペプチドは、本明細書に開示される遺伝子改変ポリペプチドである。
「ファージ支援連続進化（ＰＡＣＥ）」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、ウイルスベクターとしてファージを使用する漸進的進化を指す。ＰＡＣＥ技術の例は、例えば、２００９年９月８日に出願され、２０１０年３月１１日に国際公開第２０１０／０２８３４７号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５６１９４号明細書；２０１１年１２月２２日に出願され、２０１２年６月２８日に国際公開第２０１２／０８８３８１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６６７４７号明細書；２０１５年５月５日に発行された米国特許第９，０２３，５９４号明細書；２０１７年９月２６日に発行された米国特許第９，７７１，５７４号明細書；２０１６年７月１９日に発行された米国特許第９，３９４，５３７号明細書；２０１５年１月２０日に出願され、２０１５年９月１１日に国際公開第２０１５／１３４１２１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１２０２２号明細書；２０１９年１月１５日に発行された米国特許第１０，１７９，９１１号明細書；及び２０１６年４月１５日に出願され、２０１６年１０月２０日に国際公開第２０１６／１６８６３１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２７７９５号明細書に記載されており、これらは各々、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
「ファージ支援型非漸進的進化（ＰＡＮＣＥ）」という用語は、本明細書で使用される場合、一般に、ウイルスベクターとしてファージを使用する非漸進的進化を指す。ＰＡＮＣＥ技術の例は、例えば、Ｓｕｚｕｋｉ Ｔ．ｅｔ ａｌ，Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｒｅｖｅａｌ ａｎ ｅｌｕｓｉｖｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｐｙｒｒｏｌｙｓｙｌ－ｔＲＮＡ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ，Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．１３（１２）：１２６１－１２６６（２０１７）に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。簡潔に述べると、ＰＡＮＣＥは、新鮮な宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞）全体に、進化させようとする目的の遺伝子を含有する、進化選択ファージ（ＳＰ）の連続フラスコ移入を用いる迅速なインビボ指向性進化のための技術である。ＳＰに含まれる遺伝子が漸進的に進化する間、宿主細胞内部の遺伝子を一定に保持することができる。ファージ増殖の後、感染した細胞のアリコートを用いて、宿主大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を含有する次のフラスコをトランスフェクトすることができる。このプロセスは、所望の表現型が、例えば、所望されるだけの数の移入について進化するまで、反復及び／又は継続することができる。
ＰＡＣＥ及びＰＡＮＣＥを遺伝子改変ポリペプチドに適用する方法は、とりわけ、前述の参照文献を参照することにより、当業者により容易に理解されるであろう。例えば、ファージ粒子を用いて、例えば、宿主細胞の集団中に、ゲノム修飾タンパク質若しくはシステムの漸進的進化を指令するための更なる例示的な方法を適用して、遺伝子改変ポリペプチド又はその断片又は若しくはサブドメインの進化型変異体を作製することができる。こうした方法の非限定的な例は、２００９年９月８日に出願され、２０１０年３月１１日に国際公開第２０１０／０２８３４７号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０５６１９４号明細書；２０１１年１２月２２日に出願され、２０１２年６月２８日に国際公開第２０１２／０８８３８１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０６６７４７号明細書；２０１５年５月５日に発行された米国特許第９，０２３，５９４号明細書；２０１７年９月２６日に発行された米国特許第９，７７１，５７４号明細書；２０１６年７月１９日に発行された米国特許第９，３９４，５３７号明細書；２０１５年１月２０日に出願され、２０１５年９月１１日に国際公開第２０１５／１３４１２１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０１２０２２号明細書；２０１９年１月１５日に発行された米国特許第１０，１７９，９１１号明細書；２０１９年６月１４日に出願され、２０１９年１月３１日に国際公開第２０１９／０２３６８０号パンフレットとして公開された、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／３７２１６号明細書、２０１６年４月１５日に出願され、２０１６年１０月２０日に国際公開第２０１６／１６８６３１号パンフレットとして公開された、国際ＰＣＴ出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２７７９５号明細書並びに２０１９年８月２３日に出願された国際出願、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／４７９９６号明細書に記載されており、これらは各々、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの非限定的な例示的実施形態では、進化型変異体遺伝子改変ポリペプチド、その断片若しくはドメインの進化方法は、（ａ）宿主細胞の集団を、目的の遺伝子を含むウイルスベクターの集団（出発遺伝子改変ポリペプチド又はその断片若しくはドメイン）と接触させるステップを含み、ここで、（１）宿主細胞は、ウイルスベクターによる感染に適しており；（２）宿主細胞は、ウイルス粒子の産生に必要なウイルス遺伝子を発現し；（３）感染性ウイルス粒子の産生に必要な少なくとも１つのウイルス遺伝子の発現が、目的の遺伝子の機能に依存しており；及び／又は（４）ウイルスベクターは、宿主細胞でのタンパク質の発現を可能にし、且つ宿主細胞により複製されて、ウイルス粒子中にパッケージングされ得る。一部の実施形態では、本方法は、（ｂ）変異速度を高める（例えば、変異プラスミド又は何らかのゲノム修飾－例えば、損傷ＤＮＡプルーフリーディングポリメラーゼ、ＳＯＳ遺伝子、例えば、ＵｍｕＣ、ＵｍｕＤ’及び／若しくはＲｅｃＡ（それらの変異は、プラスミドと結合すると、誘導性プロモータの制御下となり得る）を輸送することにより又はそれらの組合せで）変異を含む宿主細胞を用いて、変異原と宿主細胞を接触させることを含む。一部の実施形態では、本方法は、（ｃ）ウイルス複製及びウイルス粒子の産生を可能にする条件下で宿主細胞の集団をインキュベートすることを含み、ここで、宿主細胞を、宿主細胞集団から除去し、新鮮で、非感染の宿主細胞を、宿主細胞の集団に導入し、このようにして、宿主細胞の集団を補給すると共に、宿主細胞の流れを形成する。一部の実施形態では、目的の遺伝子が変異を取得するのを可能にする条件下で細胞をインキュベートする。一部の実施形態では、本方法は、（ｄ）宿主細胞の集団から、進化した遺伝子産物（例えば、進化型変異体遺伝子改変ポリペプチド又はその断片若しくはドメイン）をコードするウイルスベクターの変異バージョンを単離することを更に含む。
当業者は、前述した枠組み内で使用可能な種々の特徴を理解するであろう。例えば、一部の実施形態では、ウイルスベクター又はファージは、繊維状ファージ、例えば、Ｍ１３ファージ、例えば、Ｍ１３選択ファージである。特定の実施形態では、感染性ウイルス粒子の産生に必要な遺伝子は、Ｍ１３遺伝子ＩＩＩ（ｇＩＩＩ）である。複数の実施形態では、ファージは、機能性ｇＩＩＩを欠失している場合があるが、代わりにｇＩ、ｇＩＩ、ｇＩＶ、ｇＶ、ｇＶＩ、ｇＶＩＩ、ｇＶＩＩＩ、ｇＩＸ、及びｇＸを含む。一部の実施形態では、感染性ＶＳＶ粒子の世代は、エンベロープタンパク質ＶＳＶ－Ｇを含む。様々な実施形態で、異なるレトロウイルスベクター、例えば、マウス白血病ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ）ベクター、又はレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ベクターが使用され得る。複数の実施形態では、レトロウイルスベクターは、例えば、ウイルスのネイティブエンベロープタンパク質の代替物としてＶＳＶ－Ｇエンベロープタンパク質を用いて、効率的にパッケージングすることができる。
一部の実施形態では、宿主細胞は、好適な数のウイルス生活環、例えば、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも４００、少なくとも、５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１２５０、少なくとも１５００、少なくとも１７５０、少なくとも２０００、少なくとも２５００、少なくとも３０００、少なくとも４０００、少なくとも５０００、少なくとも７５００、少なくとも１００００、又はそれ以上の連続したウイルス生活環に応じてインキュベートされ、ここで、Ｍ１３ファージの例示的且つ非限定的な例は、ウイルス生活環毎に１０～２０分である。同様に、宿主細胞が、宿主細胞の集団中に滞留する時間（例えば、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１２０、約１５０、又は約１８０分）を調整するために、条件を調節することができる。宿主細胞集団は、宿主細胞の密度、又は一部の実施形態では、流入中の宿主細胞密度、例えば、１０３個の細胞／ｍｌ、約１０４個の細胞／ｍｌ、約１０５個の細胞／ｍｌ、約５～１０５個の細胞／ｍｌ、約１０６個の細胞／ｍｌ、約５～１０６個の細胞／ｍｌ、約１０７個の細胞／ｍｌ、約５～１０７個の細胞／ｍｌ、約１０８個の細胞／ｍｌ、約５～１０８個の細胞／ｍｌ、約１０９個の細胞／ｍｌ、約５～１０９個の細胞／ｍｌ、約１０１０個の細胞／ｍｌ、又は約５～１０１０個の細胞／ｍｌにより、一部を制御することができる。
インテイン
一部の実施形態では、以下により詳細に記載されるように、インテイン－Ｎ（ｉｎｔＮ）ドメインは、本明細書に記載される遺伝子改変ポリペプチドの第１ドメインのＮ末端部分に融合され得、インテイン－Ｃ（ｉｎｔＣ）ドメインは、本明細書に記載される遺伝子改変ポリペプチドの第２のドメインのＣ末端部分に融合されて、Ｎ末端部分をＣ末端部分に連結し、それにより、第１ドメインと第２のドメインを連結し得る。一部の実施形態では、第１及び第２のドメインは、各々独立して、ＤＮＡ結合ドメイン、ＲＮＡ結合ドメイン、ＲＴドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインから選択される。
インテインは、例えば、フランキングするＮ末端及びＣ末端エクステイン（例えば、連結しようとする断片）を連結する、自己スプライシングタンパク質イントロン（例えば、ペプチド）として存在し得る。インテインは、いくつかの事例では、自動的に切除されて、タンパク質スプライシングとして知られるプロセスで、残りの断片（エクステイン）をペプチド結合と連結させることができるタンパク質の断片を含み得る。インテインは、「タンパク質イントロン」とも呼ばれる。自動的に切除されて、タンパク質の残り部分を連結させるインテインのプロセスは、本明細書において、「タンパク質スプライシング」又は「インテイン媒介性タンパク質スプライシング」と呼ばれる。
一部の実施形態では、前駆体タンパク質（インテイン媒介性タンパク質スプライシング前のインテイン含有タンパク質）のインテインは、２つの遺伝子に由来する。こうしたインテインは、本明細書において、スプリットインテイン（例えば、スプリットインテイン－Ｎ及びスプリットインテイン－Ｃ）と呼ばれる。従って、インテインベースの手法が、第１のポリペプチド配列及び第２のポリペプチド配列を一緒に連結するのに使用され得る。例えば、シアノバクテリア（ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ）では、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩの触媒サブユニットであるＤｎａＥは、２つの個別の遺伝子、ｄｎａＥ－ｎ及びｄｎａＥ－ｃによってコードされる。ｄｎａＥ－ｎ遺伝子によってコードされるものなどのインテイン－Ｎドメインは、第１のポリペプチド配列の一部として位置する場合、第１のポリペプチド配列を第２のポリペプチド配列と連結し得、ここで、第２のポリペプチド配列は、ｄｎａＥ－ｃ遺伝子によってコードされるものなどのインテイン－Ｃドメインを含む。従って、一部の実施形態では、タンパク質は、第１及び第２のポリペプチド配列をコードする核酸（例えば、第１の核酸分子は、第１のポリペプチド配列をコードし、第２の核酸分子は、第２のポリペプチド配列をコードする）を提供することによって作製され得、核酸は、第１及び第２のポリペプチド配列の生成、及びインテインベースの機構を介した、第１のポリペプチド配列の、第２のポリペプチド配列への連結を可能にする条件下で細胞内に導入される。
異種タンパク質断片を連結するためのインテインの使用は、例えば、Ｗｏｏｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８９（２１）；１４５１２－９（２０１４）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。例えば、個別のタンパク質断片に融合されると、インテインＩｎｔＮ及びＩｎｔＣは、互いを認識し、それ自体からスプライシングして、且つ／又は同時に、それらが融合されているタンパク質断片のフランキングするＮ－及びＣ末端エクステインを連結し、それにより、２つのタンパク質断片から完全長タンパク質を再構成することができる。
一部の実施形態では、ｄｎａＥインテイン、Ｃｆａ－Ｎ（例えば、スプリットインテイン－Ｎ）及びＣｆａ－Ｃ（例えば、スプリットインテイン－Ｃ）インテイン対に基づく合成インテインを使用する。こうしたインテインの例は、例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．２０１６ Ｆｅｂ．２４；１３８（７）：２１６２－５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本開示に従って使用することができるインテイン対の非限定的な例として、Ｃｆａ ＤｎａＥインテイン、Ｓｓｐ ＧｙｒＢインテイン、Ｓｓｐ ＤｎａＸインテイン、Ｔｅｒ ＤｎａＥ３インテイン、Ｔｅｒ ＴｈｙＸインテイン、Ｒｍａ ＤｎａＢインテイン及びＣｎｅ Ｐｒｐ８インテイン（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３９４，６０４号明細書に記載されるような）が挙げられる。
スプリットＣａｓ９に関わる一部の実施形態では、インテイン－Ｎドメイン及びインテイン－Ｃドメインは、スプリットＣａｓ９のＮ末端部分とスプリットＣａｓ９のＣ末端部分との連結のために、スプリットＣａｓ９のＮ末端部分及びスプリットＣａｓ９のＣ末端部分にそれぞれ融合し得る。例えば、一部の実施形態では、インテイン－Ｎを、スプリットＣａｓ９のＮ末端部分のＣ末端に融合させ、すなわち、Ｎ－［スプリットＣａｓ９のＮ末端部分］－［インテイン－Ｎ］－Ｃの構造を形成する。一部の実施形態では、インテイン－ＣをスプリットＣａｓ９のＣ末端部分のＮ末端に融合させ、すなわち、Ｎ－［インテイン－Ｃ］－［スプリットＣａｓ９のＣ末端部分］－Ｃの構造を形成する。インテインが連結したタンパク質（例えば、スプリットＣａｓ９）を連結させるためのインテイン媒介性タンパク質スプライシングの機構は、Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍ Ｓｃｉ．２０１４；５（ｌ）：４４６－４６ｌ（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。インテインを設計及び使用する方法は、当技術分野において公知であり、例えば、国際公開第２０２００５１５６１号パンフレット、国際公開第２０１４００４３３６号パンフレット、国際公開第２０１７１３２５８０号パンフレット、米国特許出願公開第２０１５０３４４５４９号明細書、及び米国特許出願公開第２０１８０１２７７８０号明細書（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
一部の実施形態では、スプリットは、２つ以上の断片への分割を指す。一部の実施形態では、スプリットＣａｓ９タンパク質又はスプリットＣａｓ９は、２つの個別のヌクレオチド配列によりコードされるＮ末端断片及びＣ末端断片として提供されるＣａｓ９タンパク質を含む。Ｃａｓ９タンパク質のＮ末端部分及びＣ末端部分に対応するポリペプチドはスプライシングされて、再構成Ｃａｓ９タンパク質を形成し得る。実施形態では、Ｃａｓ９タンパク質は、例えば、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌｕｍｅ １５６，Ｉｓｓｕｅ ５，ｐｐ．９３５－９４９，２０１４に記載されているか、又はＪｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５１：８６７－８７１及びＰＤＢ ｆｉｌｅ：５Ｆ９Ｒに記載されている（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）ように、タンパク質の変性領域内で２つの断片に分割される。変性領域は、当技術分野で公知の１つ又は複数のタンパク質構造決定技術により決定することができ、そうしたものとして、限定はしないが、Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲ分光法、電子顕微鏡法（例えば、ｃｒｙｏＥＭ）、及び／又はインシリコタンパク質モデル化が挙げられる。一部の実施形態では、タンパク質は、例えば、アミノ酸Ａ２９２－Ｇ３６４、Ｆ４４５－Ｋ４８３若しくはＥ５６５－Ｔ６３７間のＳｐＣａｓ９の領域内の任意のＣ、Ｔ、Ａ若しくはＳ又はいずれか他のＣａｓ９、Ｃａｓ９変異体（例えば、ｎＣａｓ９、ｄＣａｓ９）或いは他のｎａｐＤＮＡｂｐ内の対応する位置で２つの断片に分割される。一部の実施形態では、タンパク質は、ＳｐＣａｓ９ Ｔ３１０、Ｔ３１３、Ａ４５６、Ｓ４６９、又はＣ５７４で２つの断片に分割される。一部の実施形態では、タンパク質を２つの断片に分割するプロセスは、タンパク質の分断と呼ばれる。
一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが約２～１０００アミノ酸（例えば、２～１０、１０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００、４００～５００、５００～６００、６００～７００、７００～８００、８００～９００又は９００～１０００アミノ酸）の範囲である。一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが約５～５００アミノ酸（例えば、５～１０、１０～５０、５０～１００、１００～２００、２００～３００、３００～４００又は４００～５００アミノ酸）の範囲である。一部の実施形態では、タンパク質断片は、長さが約２０～２００アミノ酸（例えば、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～１００又は１００～２００アミノ酸）の範囲である。
一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドの部分又は断片をインテインと融合させる。ヌクレアーゼをインテインのＮ末端又はＣ末端と融合させることができる。一部の実施形態では、融合タンパク質の部分又は断片をインテインと融合させると共に、ＡＡＶカプシドタンパク質と融合させる。インテイン、ヌクレアーゼ及びカプシドタンパク質を、任意の配置（例えば、ヌクレアーゼ－インテイン－カプシド、インテイン－ヌクレアーゼ－カプシド、カプシド－インテイン－ヌクレアーゼなど）で一緒に融合させることができる。一部の実施形態では、インテインのＮ末端を融合タンパク質のＣ末端と融合させ、インテインのＣ末端をＡＡＶカプシドタンパク質のＮ末端と融合させる。
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ニッカーゼＣａｓ９ドメイン）がインテイン－Ｎに融合され、ＲＴドメインを含むポリペプチドがインテイン－Ｃに融合される。
インテイン－Ｎドメイン及び同等のインテイン－Ｃドメインの例示的なヌクレオチド及びアミノ酸配列を以下に記載する。
ＤｎａＥインテイン－Ｎ ＤＮＡ：
Figure 2024533312000520
 ＤｎａＥインテイン－Ｎタンパク質：
ＣＬＳＹＥＴＥＩＬＴＶＥＹＧＬＬＰＩＧＫＩＶＥＫＲＩＥＣＴＶＹＳＶＤＮＮＧＮＩＹＴＱＰＶＡＱＷＨＤＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＬＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＶＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＥＬＤＬＭＲＶＤＮＬＰＮ（配列番号５０３０）
ＤｎａＥインテイン－Ｃ ＤＮＡ：
ＡＴＧＡＴＣＡＡＧＡＴＡＧＣＴＡＣＡＡＧＧＡＡＧＴＡＴＣＴＴＧＧＣＡＡＡＣＡＡＡＡＣＧＴＴＴＡＴＧＡＴＡＴＴＧＧＡＧＴＣＧＡＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＡＣＴＴＴＧＣＴＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＧＡＴＴＣＡＴＡＧＣＴＴＣＴＡＡＴ（配列番号５０３１）
ＤｎａＥインテイン－Ｃタンパク質：
ＭＩＫＩＡＴＲＫＹＬＧＫＱＮＶＹＤＩＧＶＥＲＤＨＮＦＡＬＫＮＧＦＩＡＳＮ（配列番号５０３２）
Ｃｆａ－Ｎ ＤＮＡ：
Figure 2024533312000521
 Ｃｆａ－Ｎタンパク質：
ＣＬＳＹＤＴＥＩＬＴＶＥＹＧＦＬＰＩＧＫＩＶＥＥＲＩＥＣＴＶＹＴＶＤＫＮＧＦＶＹＴＱＰＩＡＱＷＨＮＲＧＥＱＥＶＦＥＹＣＬＥＤＧＳＩＩＲＡＴＫＤＨＫＦＭＴＴＤＧＱＭＬＰＩＤＥＩＦＥＲＧＬＤＬＫＱＶＤＧＬＰ（配列番号５０３４）
Figure 2024533312000522
 Ｃｆａ－Ｃタンパク質：
ＭＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶＫＩＩＳＲＫＳＬＧＴＱＮＶＹＤＩＧＶＥＫＤＨＮＦＬＬＫＮＧＬＶＡＳＮ（配列番号５０３６）
更なるドメイン：
遺伝子改変ポリペプチドは、標的ＤＮＡ配列及び鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）に結合し、標的部位に切れ目を入れ、鋳型をＤＮＡに書き込み（例えば、逆転写し）、標的部位の修飾をもたらし得る。一部の実施形態では、プロセスの効率を増強するため、更なるドメインがポリペプチドに付加され得る。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、逆転写されたＤＮＡを標的部位のＤＮＡに連結するため、更なるＤＮＡライゲーションドメインを含み得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、異種ＲＮＡ結合ドメインを含み得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、５’から３’にかけてのエキソヌクレアーゼ活性を有するドメインを含み得る（例えば、ここで５’から３’にかけてのエキソヌクレアーゼ活性は、例えば、元のゲノム配列にわたる改変を意図して、標的部位の改変の修復を増強する）。一部の実施形態では、ポリペプチドは、３’から５’にかけてのエキソヌクレアーゼ活性、例えば、プルーフリーディング活性を有するドメインを含み得る。一部の実施形態では、ライティングドメイン、例えばＲＴドメインは、３’から５’にかけてのエキソヌクレアーゼ活性、例えば、プルーフリーディング活性を有する。
鋳型核酸
本明細書に記載の遺伝子改変システムは、鋳型核酸配列を使用し、宿主標的ＤＮＡ部位を修飾することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変システムは、ターゲットプライム逆転写（ＴＰＲＴ）により、ＲＮＡ配列鋳型を宿主標的ＤＮＡ部位に転写する。遺伝子改変システムは、ＲＮＡ配列鋳型の逆転写を介してＤＮＡ配列を宿主ゲノムに直接的に組み換えることにより、（例えば、ＣＲＩＳＰＲシステムと異なり）外因性ＤＮＡ配列を宿主細胞に導入する必要なく、目的配列を標的ゲノムに挿入できるとともに、外因性ＤＮＡ挿入ステップを除くことができる。遺伝子改変システムは、標的ゲノムから配列を欠失させるか、又は目的配列を用いて置換を導入することもできる。従って、遺伝子改変システムは、目的配列、例えば、異種遺伝子コーディング及び／又は機能情報を含む配列を含む、カスタマイズされたＲＮＡ配列鋳型の使用のためのプラットフォームを提供する。
一部の実施形態では、鋳型核酸は、遺伝子改変ポリペプチドに結合する１つ又は複数の配列（例えば、２つの配列）を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるシステム又は方法は、単一の鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるシステム又は方法は、複数の鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）を含む。例えば、本明細書に記載されるシステムは、（例えば、５’から３’にかけて）遺伝子改変ポリペプチド（例えば、ＤＮＡ結合ドメイン及び／又はエンドヌクレアーゼドメイン、例えば、ｇＲＮＡ）に結合する配列及び標的部位（例えば、標的ゲノム中のある部位の第２の鎖）に結合する配列を含む第１のＲＮＡ並びに（例えば、５’から３’にかけて）任意選択で、遺伝子改変ポリペプチドに結合する（例えば、ＲＴドメインに特異的に結合する）配列、異種目的配列及びＰＢＳ配列を含む第２のＲＮＡ（例えば、鋳型ＲＮＡ）を含む。一部の実施形態では、システムが複数の核酸を含む場合、各核酸は、コンジュゲートドメインを含む。一部の実施形態では、コンジュゲートドメインは、例えば、相補的配列のハイブリダイゼーションにより、核酸分子の会合を可能にする。例えば、一部の実施形態では、第１のＲＮＡは、第１のコンジュゲートドメインを含み、第２のＲＮＡは、第２のコンジュゲートドメインを含み、且つ第１及び第２のコンジュゲートドメインは、例えば、ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることが可能である。一部の実施形態では、ハイブリダイゼーションにおけるストリンジェントな条件は、約６５℃、４倍塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーションと、それに続く、約６５℃、１×ＳＳＣでの洗浄とを含む。
一部の実施形態では、鋳型核酸は、ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、鋳型核酸は、ＤＮＡ（例えば、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ）を含む。
一部の実施形態では、鋳型核酸は、標的配列に対して相同性を有する１つ又は複数（例えば、２つ）の相同性ドメインを含む。一部の実施形態では、相同性ドメインは、約１０～２０、２０～５０、又は５０～１００ヌクレオチド長である。
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、例えば、遺伝子改変ポリペプチドを目的の標的部位に導くためのｇＲＮＡ配列を含み得る。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、（例えば、５’から３’にかけて）（ｉ）任意選択で、標的部位（例えば、標的ゲノム中のある部位の第２の鎖）に結合するｇＲＮＡスペーサー、（ｉｉ）任意選択で、本明細書に記載されるポリペプチド（例えば、遺伝子改変ポリペプチド又はＣａｓポリペプチド）に結合するｇＲＮＡスキャフォールド、（ｉｉｉ）変異領域を含む異種目的配列（ここで、任意選択で、異種目的配列は、５’から３’にかけて、第１の相同性領域、変異領域、及び第２の相同性領域を含む）、並びに（ｉｖ）３’標的相同性ドメインを含むプライマー結合部位（ＰＢＳ）配列を含む。
本明細書に記載されるゲノム編集システムの鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）成分は、典型的に、システムの遺伝子改変ポリペプチドに結合可能である。一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、遺伝子改変ポリペプチドに結合可能である３’領域を有する。結合領域、例えば、３’領域は、システムの遺伝子改変ポリペプチドに結合可能である、例えば、少なくとも１、２又は３つのヘアピンループを有する構造化ＲＮＡ領域であり得る。結合領域は、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）をポリペプチドモジュールのいずれかと会合させ得る。一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）の結合領域は、ポリペプチド中のＲＮＡ結合ドメインと会合し得る。一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）の結合領域は、遺伝子改変ポリペプチドの逆転写ドメインと会合し（例えば、ＲＴドメインに特異的に結合し）得る。一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、ポリペプチドのＤＮＡ結合ドメインと会合し得、例えば、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９由来のＤＮＡ結合ドメインと会合する。一部の実施形態では、結合領域は、ＤＮＡ標的認識も提供し得、例えば、ｇＲＮＡは、標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズし、且つポリペプチド、例えばＣａｓ９ドメインに結合する。一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、ポリペプチドの複数の成分、例えばＤＮＡ結合ドメイン及び逆転写ドメインと会合し得る。
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、３’末端にポリＡテールを有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、３’末端にポリＡテールを有しない。
一部の実施形態では、鋳型核酸は、鋳型ＲＮＡである。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含む。例えば、一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、１つ又は複数のデオキシリボヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡの領域は、例えば、分子の安定性を増強するため、ＤＮＡヌクレオチドで置換される。例えば、鋳型の３’末端は、ＤＮＡヌクレオチドを含み得る一方、鋳型の残り部分は、逆転写され得るＲＮＡヌクレオチドを含む。例えば、一部の実施形態では、異種目的配列は、主に又は全体的に、ＲＮＡヌクレオチド（例えば、少なくとも９０％、９５％、９８％若しくは９９％のＲＮＡヌクレオチド）から構成される。一部の実施形態では、ＰＢＳ配列は、主に又は全体的に、ＤＮＡヌクレオチド（例えば、少なくとも９０％、９５％、９８％若しくは９９％のＤＮＡヌクレオチド）から構成される。他の実施形態では、ゲノムへのライティングのための異種目的配列は、ＤＮＡヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、鋳型中のＤＮＡヌクレオチドは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の能力があるドメインによってゲノム中に複製される。一部の実施形態では、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性は、ポリペプチド中のＤＮＡポリメラーゼドメインによって提供される。一部の実施形態では、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡ重合、例えば、第２の鎖合成の能力もある逆転写酵素ドメインによって提供される。一部の実施形態では、鋳型分子は、ＤＮＡヌクレオチドのみで構成される。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるシステムは、本明細書に記載される鋳型ＲＮＡの配列を共に含む２つの核酸を含む。一部の実施形態では、２つの核酸は、非共有結合的に互いに会合し、例えば、直接互いに会合し（例えば、塩基対合によって）、又は１つ又は複数の更なる分子を含む複合体の一部として間接的に会合する。
本明細書に記載される鋳型ＲＮＡは、５’から３’にかけて：（１）ｇＲＮＡスペーサー；（２）ｇＲＮＡスキャフォールド；（３）異種目的配列（４）プライマー結合部位（ＰＢＳ）配列を含み得る。これらの成分のそれぞれが、ここでより詳細に記載される。
ｇＲＮＡスペーサー及びｇＲＮＡスキャフォールド
本明細書に記載される鋳型ＲＮＡは、遺伝子改変システムを標的核酸に導くｇＲＮＡスペーサー、及び鋳型ＲＮＡと遺伝子改変ポリペプチドのＣａｓドメインとの会合を促進するｇＲＮＡスキャフォールドを含み得る。本明細書に記載されるシステムは、鋳型核酸の一部でないｇＲＮＡも含み得る。例えば、ｇＲＮＡスペーサー及びｇＲＮＡスキャフォールドを含むが、異種目的配列又はＰＢＳ配列を含まないｇＲＮＡが使用されて、例えば、例えば本明細書において「第２の鎖ニッキング（Ｓｅｃｏｎｄ Ｓｔｒａｎｄ Ｎｉｃｋｉｎｇ）」という表題の節に記載されるように、第２の鎖ニッキングを誘導し得る。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質の結合に関与するスキャフォールド配列と、ゲノム標的に対するユーザ定義の約２０ヌクレオチドの標的配列から構成される短い合成ＲＮＡである。完全ｇＲＮＡの構造は、Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５６，Ｐ９３５－９４９（２０１４）に記載された。ｇＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡに対するｓｇＲＮＡとも称される）は、人工的テトラループで接続されたｃｒＲＮＡ由来及びｔｒａｃｒＲＮＡ由来の配列からなる。ｃｒＲＮＡ配列は、ガイド（２０ｎｔ）及びリピート（１２ｎｔ）領域に分割され得る一方、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、アンチリピート（１４ｎｔ）及び３つのｔｒａｃｒＲＮＡステムループに分割され得る（Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １５６，Ｐ９３５－９４９（２０１４））。実際、ガイドＲＮＡ配列は、一般に、１７～２４のヌクレオチド（例えば、１９、２０若しくは２１ヌクレオチド）の長さを有し、且つ標的核酸配列に対して相補的であるように設計される。カスタムｇＲＮＡのジェネレーター及びアルゴリズムは、有効なガイドＲＮＡの設計における使用のため、商業的に利用可能である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、天然ＣＲＩＳＰＲシステムからの２つのＲＮＡ成分、例えばｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。当技術分野で周知のように、ｇＲＮＡは、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼに結合するため）及び少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼを編集／結合について標的化された配列に導くため）の両方からの配列を含むキメラの単一ＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）も含み得る。化学修飾ｓｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質での使用に有効であることも証明されており；例えば、Ｈｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９８５－９９１を参照されたい。一部の実施形態では、ｇＲＮＡスペーサーは、標的遺伝子と会合されるＤＮＡ配列に対して相補的である核酸配列を含む。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡを含む鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡの領域は、（例えば、Ｍｕｌｅｐａｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９ Ｓｅｐ ２０１４：Ｖｏｌ．３４５，Ｉｓｓｕｅ ６２０３，ｐｐ．１４７９－１４８４に記載のように）標的ＤＮＡに結合したｇＲＮＡのアンダーワウンドリボン様構造をとる。特定の理論に束縛されることを意図しないが、この非標準構造は、ＲＮＡ－ＤＮＡハイブリッドからの６ヌクレオチドごとの回転によって促進されると考えられる。従って、一部の実施形態では、ｇＲＮＡを含む鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡの領域は、いくらかの間隔で、例えば、６塩基ごとの、標的部位とのミスマッチの増加を許容し得る。一部の実施形態では、標的部位に対する相同性を含むｇＲＮＡを含む鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡの領域は、規則的間隔で、例えば、６塩基ごとに、標的部位と塩基対合する必要がないようなゆらぎ位置を有し得る。
いくつかの実施形態では、活性が強化されたＣａｓ９誘導体が遺伝子改変ポリペプチドに使用され得る。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９誘導体は、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインの活性を改善する変異、例えば、ＳｐｙＣａｓ９ Ｒ２２１Ｋ、Ｎ３９４Ｋ、又はＲループ形成を改善する変異、例えば、ＳｐｙＣａｓ９ Ｌ１２４５Ｖ、又はそのような変異の組み合わせ、例えば、ＳｐｙＣａｓ９ Ｒ２２１Ｋ／Ｎ３９４Ｋ、ＳｐｙＣａｓ９ Ｎ３９４Ｋ／Ｌ１２４５Ｖ、ＳｐｙＣａｓ９ Ｒ２２１Ｋ／Ｌ１２４５Ｖ、又はＳｐｙＣａｓ９ Ｒ２２１Ｋ／Ｎ３９４Ｋ／Ｌ１２４５Ｖを含み得る（例えば、Ｓｐｅｎｃｅｒ ａｎｄ Ｚｈａｎｇ Ｓｃｉ Ｒｅｐ ７：１６８３６（２０１７）を参照。このＣａｓ９誘導体及びその変異体は、参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９誘導体は、本明細書に記載の１つ以上の種類の変異、例えば、ＰＡＭ改変変異、タンパク質安定化変異、活性増強変異、及び／又は親酵素に対して１つ又は２つのエンドヌクレアーゼドメインを部分的又は完全に不活性化する変異（例えば、標的ＤＮＡの一方又は両方の鎖に対するエンドヌクレアーゼ活性を消失させる１つ以上の変異、例えば、ニッカーゼ又は触媒的に不活性な酵素）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシステムにおいて使用されるＣａｓ９酵素は、触媒効率を改善する変異（例えば、ＳｐｙＣａｓ９ Ｒ２２１Ｋ、Ｎ３９４Ｋ、及び／又はＬ１２４５Ｖ）に加えて、酵素に対するニッカーゼ活性を付与する変異（例えば、ＳｐｙＣａｓ９ Ｎ８６３Ａ又はＨ８４０Ａ）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のシステムで使用されるＣａｓ９酵素は、触媒効率を改善するためのＲ２２１Ｋ及びＮ３９４Ｋ変異に加えて、ニッカーゼ活性を付与するためのＮ８６３Ａ変異を更に含むＳｐｙＣａｓ９酵素又はその誘導体である。
一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、例えば、遺伝子改変ポリペプチド（表８）のＣａｓ９ドメインに適切な長さのｇＲＮＡスペーサー配列を含む、例えば、５’末端において、標的部位に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９９％若しくは１００％の相同性の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３若しくは２４の塩基を有する。
表１２は、ｇＲＮＡ及び／又は鋳型ＲＮＡを設計するための成分を定義し、遺伝子改変についての表８に列記されるＣａｓ変異体を適用するためのパラメーターを提供する。切断部位は、検証又は予測されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の要件、（ＰＡＭ部位の最も上流の塩基に対する）検証又は予測された切断部位の位置を示す。所与の酵素に対するｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ、テトラループ、及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を連結し、標的部位でプロトスペーサーに一致するスペーサー（最小）及びスペーサー（最大）以内の長さの５’スペーサーを更に付加することによって構築され得る。更に、標的でのｓｓＤＮＡニックの予測された位置は、標的プライミング逆転写を開始させるため、ニックのすぐ５’側の配列にアニールし得る鋳型ＲＮＡのＰＢＳ配列を設計するために重要である。一部の実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡスキャフォールドは、５’から３’方向に、表１２のｃｒＲＮＡ、表１２の同じ行からのテトラループ、及び表１２の同じ行からのｔｒａｃｒＲＮＡ又はそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む核酸配列を含む。一部の実施形態では、スキャフォールドを含むｇＲＮＡ又は鋳型ＲＮＡは、表１２の同じ行に示されるスペーサー（最小）及びスペーサー（最大）以内の長さを有するｇＲＮＡスペーサーを更に含む。一部の実施形態では、表１２に従う配列を有するｇＲＮＡ又は鋳型ＲＮＡは、遺伝子改変ポリペプチドを更に含むシステムに含まれ、ここで、遺伝子改変ポリペプチドは、表１２の同じ行に記載されるＣａｓドメインを含む。
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本明細書において、ＲＮＡ配列（例えば、鋳型ＲＮＡ配列）が、チミン（Ｔ）を含む特定の配列（例えば、表１２の配列又はその部分）を含むと記載される場合、当然ながら、ＲＮＡ配列は、Ｔの代わりにウラシル（Ｕ）を含み得る（含むことが多い）ことが理解される。例えば、ＲＮＡ配列は、表１２中の配列においてＴとして示される全ての位置においてＵを含み得る。より具体的には、本開示は、表１２の全てのｇＲＮＡスキャフォールド配列に従うＲＮＡ配列を提供し、ここで、ＲＮＡ配列は、表１２中の配列において各Ｔの代わりにＵを有する。更に、末端Ｕｓ及びＴｓが、任意選択で付加されるか又はｔｒａｃｒＲＮＡ配列から除去され得、ＲＮＡとして提供される場合、修飾されるか又は非修飾であり得ることが理解される。特定の例に束縛されることを意図しないが、表１２において例示されるものの代替となるｇＲＮＡスキャフォールド配列の形態、例えば、ヌクレオチド付加、置換若しくは欠失を有する代替的なｇＲＮＡスキャフォールド配列、例えば、ステム－ループ構造が付加若しくは除去された配列は、表８において例示される異なるＣａｓ９酵素又はその誘導体と一緒にも機能し得る。ｇＲＮＡスキャフォールド配列が、所与のシステム、Ｃａｓ－ＲＴ融合ポリペプチド、指示、標的変異、鋳型ＲＮＡ又は送達ビヒクルについて同様に最適化され得る遺伝子改変システムの成分を表すことが、本明細書において考えられる。
異種目的配列
本明細書に記載される鋳型ＲＮＡは、所望の配列を標的核酸に書き込むために、遺伝子改変ポリペプチドが逆転写のための鋳型として使用し得る異種目的配列を含み得る。一部の実施形態では、異種目的配列は、５’から３’に、後編集相同性領域、変異領域及び前編集相同性領域を含む。特定の理論に束縛されることを意図しないが、鋳型ＲＮＡにおける逆転写を行うＲＴは、最初に、前編集相同性領域、次に変異領域及び次に後編集相同性領域を逆転写し、それによりいずれの側にも相同性領域を有する所望の変異を含むＤＮＡ鎖を生成する。
一部の実施形態では、異種目的配列は、長さが、少なくとも３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、５００若しくは１、０００ヌクレオチド（ｎｔ）、又は長さが、少なくとも１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５若しくは１０キロベースである。一部の実施形態では、異種目的配列は、長さが、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、５００、１、０００若しくは２０００ヌクレオチド（ｎｔ）以下、又は長さが、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４若しくは３キロベース以下である。一部の実施形態では、異種目的配列は、長さが、３０～１０００、４０～１０００、５０～１０００、６０～１０００、７０～１０００、７４～１０００、７５～１０００、７６～１０００、７７～１０００、７８～１０００、７９～１０００、８０～１０００、８５～１０００、９０～１０００、１００～１０００、１２０～１０００、１４０～１０００、１６０～１０００、１８０～１０００、２００～１０００、５００～１０００、３０～５００、４０～５００、５０～５００、６０～５００、７０～５００、７４～５００、７５～５００、７６～５００、７７～５００、７８～５００、７９～５００、８０～５００、８５～５００、９０～５００、１００～５００、１２０～５００、１４０～５００、１６０～５００、１８０～５００、２００～５００、３０～２００、４０～２００、５０～２００、６０～２００、７０～２００、７４～２００、７５～２００、７６～２００、７７～２００、７８～２００、７９～２００、８０～２００、８５～２００、９０～２００、１００～２００、１２０～２００、１４０～２００、１６０～２００、１８０～２００、３０～１００、４０～１００、５０～１００、６０～１００、７０～１００、７４～１００、７５～１００、７６～１００、７７～１００、７８～１００、７９～１００、８０～１００、８５～１００若しくは９０～１００ヌクレオチド（ｎｔ）、又は長さが、１～２０、１～１５、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、２～２０、２～１５、２～１０、２～９、２～８、２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～２０、３～１５、３～１０、３～９、３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～２０、４～１５、４～１０、４～９、４～８、４～７、４～６、４～５、５～２０、５～１５、５～１０、５～９、５～８、５～７、５～６、６～２０、６～１５、６～１０、６～９、６～８、６～７、７～２０、７～１５、７～１０、７～９、７～８、８～２０、８～１５、８～１０、８～９、９～２０、９～１５、９～１０、１０～１５、１０～２０若しくは１５～２０キロベースである。一部の実施形態では、異種目的配列は、長さが、１０～１００、１０～９０、１０～８０、１０～７０、１０～６０、１０～５０、１０～４０、１０～３０、又は１０～２０ｎｔ、例えば、長さが１０～８０、１０～５０、又は１０～２０ｎｔ、例えば、長さが約１０～２０ｎｔである。一部の実施形態では、異種目的配列は、長さが８～３０、９～２５、１０～２０、１１～１６又は１２～１５ヌクレオチド、例えば長さが１１～１６ｎｔである。特定の理論に束縛されることを意図しないが、一部の実施形態では、編集のより大きい挿入サイズ、より大きい領域（例えば、標的領域中の第１の編集／置換及び第２の編集／置換間の距離）及び／又はより多い数の所望の編集（例えば、標的ゲノムに対する異種目的配列のミスマッチ）、より長い最適な異種目的配列をもたらし得る。
特定の実施形態では、鋳型核酸は、例えば、異種コード領域をゲノムに導入し；エクソンの構造／選択的スプライシングに影響するか若しくはそれを引き起こし、例えば、１つ又は複数のエクソンのエクソンスキッピングをもたらし；内因性遺伝子の破壊を引き起こし、例えば、遺伝子ノックアウトを生成し；内因性遺伝子の転写活性化を引き起こし；内因性ＤＮＡのエピジェネティック調節を引き起こし；１つ又は複数の作動可能に連結された遺伝子の上方制御を引き起こし、例えば、遺伝子活性化若しくは過剰発現をもたらし；１つ又は複数の作動可能に連結された遺伝子の下方制御を引き起こし、例えば、遺伝子ノックダウンを生成することなどにより、宿主ゲノム機能を改変又は特定化する配列を含むように同定、設計、改変及び構築可能である、カスタマイズされたＲＮＡ配列鋳型を含む。特定の実施形態では、カスタマイズされたＲＮＡ配列鋳型は、エクソン及び／又は導入遺伝子をコードする配列を含むように、転写因子アクチベーター、リプレッサ、エンハンサーなどに対する結合部位、及びそれらの組合せを意図して、改変され得る。一部の実施形態では、カスタマイズされた鋳型は、標的部位に作動可能に連結された内因性ＲＮＡ転写物又は内因性タンパク質において発現される核酸又はペプチドタグをコードするように改変され得る。他の実施形態では、コード配列は、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、又はポリＡテールで更にカスタマイズされ得る。
システムの鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、典型的に、所望の配列を標的ＤＮＡに書き込むための目的配列（例えば、異種目的配列）を含む。目的配列は、コーディング又はノンコーディング配列であり得る。鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、標的ＤＮＡ遺伝子座において挿入、変異、又は欠失をもたらすように設計され得る。一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、標的ＤＮＡにおける挿入を引き起こすように設計され得る。例えば、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、異種配列を含み得、逆転写は、異種配列の標的ＤＮＡへの挿入をもたらすことになる。他の実施形態では、ＲＮＡ鋳型は、欠失を標的ＤＮＡに導入するように設計され得る。例えば、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、所望の欠失の上流及び下流で標的ＤＮＡに一致することがあり、逆転写は、介在配列を有しない鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）からの上流及び下流配列の複製をもたらし、例えば、介在配列の欠失を引き起こすことになる。他の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、編集を標的ＤＮＡに導入するように設計され得る。例えば、鋳型ＲＮＡは、１つ又は複数のヌクレオチドを例外として、標的ＤＮＡ配列に一致することがあり、逆転写は、標的ＤＮＡへのこれらの編集の複製をもたらし、例えば、変異、例えば、トランジション又はトランスバージョン変異をもたらすことになる。
一部の実施形態では、標的部位への目的配列の書き込みは、ヌクレオチドの置換をもたらし、例えば、ここで、目的配列の完全長は、１つ又は複数のミスマッチ塩基を有する標的部位の一致している長さに対応する。一部の実施形態では、異種目的配列は、配列変異の組合せ、例えば、同時の付加及び欠失、付加及び置換、又は欠失及び置換が存在し得るように設計され得る。
一部の実施形態では、異種目的配列は、オープンリーディングフレーム又はオープンリーディングフレームの断片を含有し得る。一部の実施形態では、異種目的配列は、コザック配列を有する。一部の実施形態では、異種目的配列は、内部リボソーム進入部位を有する。一部の実施形態では、異種目的配列は、Ｔ２Ａ又はＰ２Ａ部位などの自己切断型ペプチドを有する。一部の実施形態では異種目的配列は、開始コドンを有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、スプライスアクセプター部位を有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、スプライスドナー部位を有する。例示的なスプライスアクセプター及びスプライスドナー部位は、国際公開第２０１６０４４４１６号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。例示的なスプライスアクセプター部位配列は、当業者に公知である。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、停止コドンの下流にｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、オープンリーディングフレームの停止コドンの下流にポリＡテールを有する。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、１つ又は複数のエクソンを含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、１つ又は複数のイントロンを含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、真核生物転写ターミネーターを含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、増強された翻訳エレメント又は翻訳増強エレメントを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、ヒトＴ細胞白血病ウイルス（ｈｕｍａｎ Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ ｖｉｒｕｓ）（ＨＴＬＶ－１）Ｒ領域を含む。一部の実施形態では、ＲＮＡは、核外輸送を増強する転写後調節配列、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ）（ＨＰＲＥ）又はウッドチャック肝炎ウイルス（Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）（ＷＰＲＥ）のものを含む。
一部の実施形態では、異種目的配列は、ノンコーディング配列を含有し得る。例えば、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、調節エレメント、例えば、プロモータ又はエンハンサー配列又はｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。一部の実施形態では、標的部位での目的配列の組み込みは、内因性遺伝子の上方制御をもたらすことになる。一部の実施形態では、標的部位での目的配列の組み込みは、内因性遺伝子の下方制御をもたらすことになる。一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、組織特異的プロモータ又はエンハンサーを含み、その各々は、一方向又は二方向であり得る。一部の実施形態では、プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモータ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータ、又はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータである。一部の実施形態では、プロモータは、ＴＡＴＡエレメントを含む。一部の実施形態では、プロモータは、Ｂ認識エレメントを含む。一部の実施形態では、プロモータは、転写因子のための１つ又は複数の結合部位を有する。
一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、エピジェネティック修飾を連携させる部位を含む。一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、クロマチン絶縁体を含む。例えば、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、ＣＴＣＦ部位又はＤＮＡメチル化に対して標的化された部位を含む。
一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、エフェクター配列に作動可能に連結された少なくとも１つの調節領域から構成される遺伝子発現ユニットを含む。エフェクター配列は、ＲＮＡに転写される配列（例えば、コーディング配列又はノンコーディング配列、例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡをコードする配列）であり得る。
一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）の異種目的配列は、内因性イントロン中に標的ゲノムに挿入される。一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）の異種目的配列は、標的ゲノムに挿入され、それにより新しいエクソンとして作用する。一部の実施形態では、異種目的配列の標的ゲノムへの挿入は、天然のエクソンの置換又は天然のエクソンのスキッピングをもたらす。
鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、標的ＤＮＡ遺伝子座で挿入、変異、又は欠失をもたらすように設計され得る。一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、標的ＤＮＡ中に挿入を引き起こすように設計され得る。例えば、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、異種目的配列を含み得、逆転写は、異種目的配列の標的ＤＮＡへの挿入をもたらすことになる。他の実施形態では、ＲＮＡ鋳型は、欠失を標的ＤＮＡに書き込むように設計され得る。例えば、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、所望の欠失の上流及び下流で標的ＤＮＡに一致することがあり、逆転写は、介在配列を有しない鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）からの上流及び下流配列の複製をもたらし、例えば、介在配列の欠失を引き起こすことになる。他の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、編集を標的ＤＮＡに書き込むように設計され得る。例えば、鋳型ＲＮＡは、１つ又は複数のヌクレオチドを例外として、標的ＤＮＡ配列に一致することがあり、逆転写は、標的ＤＮＡへのこれらの編集の複製をもたらし、例えば、変異、例えば、トランジション又はトランスバージョン変異をもたらすことになる。
一部の実施形態では、前編集相同性ドメインは、標的核酸分子に含まれる核酸配列との１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
一部の実施形態では、後編集相同性ドメインは、標的核酸分子に含まれる核酸配列との１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。
ＰＢＳ配列
一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、ＰＢＳ配列を含む。一部の実施形態では、ＰＢＳ配列は、異種目的配列の３’側に配置され、本明細書に記載されるシステムによって修飾されるべき部位に隣接した配列に対して相補的であるか、又はシステム／遺伝子改変ポリペプチドによって修飾されるべき部位に隣接した配列に相補的な配列に対して、１、２、３、４若しくは５つ以下のミスマッチを含む。一部の実施形態では、ＰＢＳ配列は、標的核酸分子中のニック部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９若しくは１０ヌクレオチド以内に結合する。一部の実施形態では、ＰＢＳ配列の標的核酸分子への結合は、例えば、ＴＰＲＴについてのプライマーとして作用する３’相同性ドメインによる、ターゲットプライム逆転写（ＴＰＲＴ）の開始を可能にする。一部の実施形態では、ＰＢＳ配列は、長さが、３～５、５～１０、１０～３０、１０～２５、１０～２０、１０～１９、１０～１８、１０～１７、１０～１６、１０～１５、１０～１４、１０～１３、１０～１２、１０～１１、１１～３０、１１～２５、１１～２０、１１～１９、１１～１８、１１～１７、１１～１６、１１～１５、１１～１４、１１～１３、１１～１２、１２～３０、１２～２５、１２～２０、１２～１９、１２～１８、１２～１７、１２～１６、１２～１５、１２～１４、１２～１３、１３～３０、１３～２５、１３～２０、１３～１９、１３～１８、１３～１７、１３～１６、１３～１５、１３～１４、１４～３０、１４～２５、１４～２０、１４～１９、１４～１８、１４～１７、１４～１６、１４～１５、１５～３０、１５～２５、１５～２０、１５～１９、１５～１８、１５～１７、１５～１６、１６～３０、１６～２５、１６～２０、１６～１９、１６～１８、１６～１７、１７～３０、１７～２５、１７～２０、１７～１９、１７～１８、１８～３０、１８～２５、１８～２０、１８～１９、１９～３０、１９～２５、１９～２０、２０～３０、２０～２５若しくは２５～３０ヌクレオチド、例えば長さが１０～１７、１２～１６若しくは１２～１４ヌクレオチドである。一部の実施形態では、ＰＢＳ配列は、長さが、５～２０、８～１６、８～１４、８～１３、９～１３、９～１２若しくは１０～１２ヌクレオチド、例えば長さが９～１２ヌクレオチドである。
鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、標的ＤＮＡに対していくらかの相同性を有し得る。一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、ＰＢＳ配列ドメインは、標的ＤＮＡに対するアニーリング領域として機能し得ることで、標的ＤＮＡは、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）の逆転写をプライムするように位置づけられる。一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、ＲＮＡの３’末端で、標的ＤＮＡと少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、２００又はそれ以上の塩基の正確な相同性を有する。一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、例えば、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）の５’末端で、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、２００又はそれ以上の塩基の、標的ＤＮＡに対する少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％又は１００％の相同性を有する。
例示的な鋳型配列
本明細書のシステム及び方法のいくつかの実施形態では、鋳型ＲＮＡは、表１のｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチドを含むｇＲＮＡスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡスペーサーは、ｇＲＮＡスペーサーのフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上（例えば、２つ、３つ、又は全て）の連続ヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、表１の配列を含む鋳型ＲＮＡは、表１の同じ行に列挙されるＲＴドメインを有する遺伝子改変ポリペプチドを更に含むシステムを含む。ＲＴドメインのアミノ酸配列は、例えば本明細書の表６に見出される。
表１：例示的なｇＲＮＡスペーサーとＣａｓの対
表１は、ＳＥＲＰＩＮＡ１の病原性Ｅ３４２Ｋ変異を修正するためのｇＲＮＡデータベースを提供する。遺伝子改変システムによる所望のゲノム編集の導入を可能にするために適切な位置にニックを生成するためのスペーサー、ＰＡＭ、及びＣａｓバリアントのリスト。この表のスペーサーは、表に示されているＣａｓ種のニッカーゼバリアントを含む遺伝子改変ポリペプチドとともに使用するように設計されている。表２、３、及び４には、システムの他の成分の詳細が示されており、ここで列１に示されるＩＤ番号（「ＩＤ」）が、後続の表の同じＩＤ番号に対応するように構成されている。
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本明細書で提供される例示的な鋳型配列では、大文字は「コアヌクレオチド」を示し、小文字は「フランキングヌクレオチド」を示す。ここで、ＲＮＡ配列（例えば、鋳型ＲＮＡ配列）がチミン（Ｔ）を含む特定の配列（例えば、表１の配列又はその一部）を含むと言われる場合、ＲＮＡ配列がＴの代わりにウラシル（Ｕ）を含み得る（多くの場合そうである）ことは当然理解される。例えば、ＲＮＡ配列は、表１の配列でＴとして示されている全ての位置にＵを含み得る。より具体的には、本開示は、表１に示される全てのｇＲＮＡスペーサー配列に従ったＲＮＡ配列を提供し、ここで、このＲＮＡ配列は、表１の配列中の各Ｔの代わりにＵを有する。
本明細書のシステム及び方法のいくつかの実施形態では、異種目的配列は、表３からのＲＴ鋳型配列のコアヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、異種目的配列は、ＲＴ鋳型配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、１０個、２０個、３０個、４０個、又は全て）の連続ヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、異種目的配列が、ｇＲＮＡスペーサー配列に対応する表３のＲＴ鋳型配列のコアヌクレオチドを含む。配列表では、参照先の表で両方の成分が同じＩＤ番号を有する場合、第１の成分は、第２の成分に「対応」する。例えば、ＩＤ＃１のｇＲＮＡスペーサーの場合、対応するＲＴ鋳型は、同じくＩＤ＃１を有するＲＴ鋳型であろう。いくつかの実施形態では、異種目的配列は、ＲＴ鋳型配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを更に含む。
いくつかの実施形態では、プライマー結合部位（ＰＢＳ）配列は、表３の、ＲＴ鋳型配列と同じ行からのＰＢＳ配列のコアヌクレオチドを含む配列を有する。いくつかの実施形態では、ＰＢＳ配列は、プライマー領域のフランキングヌクレオチドの５’末端から始まる１つ以上（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は全て）の連続ヌクレオチドを更に含む。
表３：例示的なＲＴ配列（異種目的配列）とＰＢＳ配列の対
表３は、ＳＥＲＰＩＮＡ１の病原性Ｅ３４２Ｋ変異を修正するための鋳型ＲＮＡの例示的なＰＢＳ配列及び異種目的配列（逆転写鋳型領域）を提供する。表１のｇＲＮＡスペーサーがフィルタリングされ、例えば、所望の編集位置から１５ｎｔ以内の出現及びＴｉｅｒ１ Ｃａｓ酵素の使用によってフィルタリングされた。ＰＢＳ配列及び異種目的配列（逆転写鋳型領域）は、本出願で説明されているように、表１の同族ｇＲＮＡによって導かれるニック部位に対して設計された。例として、これらの領域は、８～１７ｎｔ（プライミング）であるように設計され、編集の位置を超えて１～５０ｎｔ拡張される（ＲＴ）。例に限定されることを望むものではないが、長さの可変性を考慮して、最大長パラメーターを使用し、所与のパラメーター内でより短い長さの全ての鋳型を含む配列が提供される。配列は、コア配列を示す大文字、及び記載の長さパラメーター内で切断され得る隣接配列を示す小文字で示される。
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大文字は「コアヌクレオチド」を示し、小文字は「フランキングヌクレオチド」を示す。ここで、ＲＮＡ配列（例えば、鋳型ＲＮＡ配列）がチミン（Ｔ）を含む特定の配列（例えば、表３の配列又はその一部）を含むと言われる場合、ＲＮＡ配列がＴの代わりにウラシル（Ｕ）を含み得る（多くの場合そうである）ことは当然理解される。例えば、ＲＮＡ配列は、表３の配列でＴとして示されている全ての位置にＵを含み得る。より具体的には、本発明は、表３に示すあらゆる異種目的配列及びＰＢＳ配列に従ったＲＮＡ配列を提供し、ここで、このＲＮＡ配列は、表３の配列中の各Ｔの代わりにＵを有する。
本明細書のシステム及び方法のいくつかの実施形態では、鋳型ＲＮＡは、表１２のｇＲＮＡスキャフォールドの配列を含む（例えば、遺伝子改変ポリペプチド、例えばＣａｓポリペプチドに結合する）ｇＲＮＡスキャフォールドを含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡスキャフォールドは、表１２のｇＲＮＡスキャフォールドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡスキャフォールドは、ＲＴ鋳型配列、スペーサー配列若しくは両方に対応する表１２のスキャフォールド領域の配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。
本明細書のシステム及び方法のいくつかの実施形態では、システムは、ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の鎖にニックを導く、第２の鎖を標的とするｇＲＮＡを更に含む。いくつかの実施形態では、第２の鎖を標的とするｇＲＮＡは、表２からの左ｇＲＮＡスペーサー配列又は右ｇＲＮＡスペーサー配列を含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡスペーサーは、左ｇＲＮＡスペーサー配列又は右ｇＲＮＡスペーサー配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上（例えば、２つ、３つ、又は全て）の連続ヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、第２の鎖を標的とするｇＲＮＡは、表４からの第２のニックｇＲＮＡ配列のコアヌクレオチドを含む配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のニックｇＲＮＡ配列は、第２のニックｇＲＮＡ配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態では、第２のニックｇＲＮＡは、遺伝子改変ポリペプチドのＣａｓドメインと直交するｇＲＮＡスキャフォールド配列を含む。いくつかの実施形態では、第２のニックｇＲＮＡは、表１２のｇＲＮＡスキャフォールド配列を含む。
表２：例示的な左ｇＲＮＡスペーサーと右ｇＲＮＡスペーサーの対
表２は、ＳＥＲＰＩＮＡ１の病原性Ｅ３４２Ｋ変異を修正するための任意選択による使用のための、第２の鎖を標的とするｇＲＮＡ種の例を提供する。表１のｇＲＮＡスペーサーがフィルタリングされ、例えば、所望の編集位置から１５ｎｔ以内の出現及びＴｉｅｒ１ Ｃａｓ酵素の使用によってフィルタリングされた。第２の鎖を標的とするｇＲＮＡは、第１のｇＲＮＡによって定義された第１のニック部位に対し、対応するＣａｓバリアントによって利用されるＰＡＭについて、－４０～－１４０（「左」）及び＋４０～＋１４０（「右」）の領域でＤＮＡの逆鎖を検索することによって生成された。標的ニック部位の各側に１つの例示的なスペーサーが示される。
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大文字は「コアヌクレオチド」を示し、小文字は「フランキングヌクレオチド」を示す。ここで、ＲＮＡ配列（例えば、第２のニックを生成するｇＲＮＡ）がチミン（Ｔ）を含む特定の配列（例えば、表２の配列又はその一部）を含むと言われる場合、ＲＮＡ配列がＴの代わりにウラシル（Ｕ）を含み得る（多くの場合そうである）ことは当然理解される。例えば、ＲＮＡ配列は、表２の配列でＴとして示されている全ての位置にＵを含み得る。より具体的には、本開示は、表２に示される全てのｇＲＮＡスペーサー配列に従ったＲＮＡ配列を提供し、ここで、このＲＮＡ配列は、表２の配列中の各Ｔの代わりにＵを有する。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるシステム及び方法は、表４に列挙される鋳型配列を含み得る。表４は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の変異を修正するために遺伝子改変ポリペプチドと対になるように設計された、例示的な鋳型ＲＮＡ配列（列４）及び任意選択による第２の鎖を標的とするｇＲＮＡ配列（列５）を提供する。表４の鋳型は、（１）ｇＲＮＡスペーサー（例えば、第１の鎖ニックを標的とするため）、（２）ｇＲＮＡスキャフォールド、（３）異種目的配列、及び（４）ＰＢＳ配列（例えば、第１の鎖ニックでＴＰＲＴを開始するため）の全配列を例示することを意図している。
表４．例示的な鋳型ＲＮＡ配列及び第２のニックｇＲＮＡ配列
表４は、ＳＥＲＰＩＮＡ１の病原性Ｅ３４２Ｋ変異を修正するための遺伝子改変システムのＲＮＡ成分の設計を提供する。表１のｇＲＮＡスペーサーがフィルタリングされ、例えば、所望の編集位置から１５ｎｔ以内の出現及びＴｉｅｒ１ Ｃａｓ酵素の使用によってフィルタリングされた。この表には、各ｇＲＮＡ ＩＤについて、完全な鋳型ＲＮＡ、任意選択による第２の鎖を標的とするｇＲＮＡ、及びＣａｓ－ＲＴ融合遺伝子改変ポリペプチドにおける使用のためのＣａｓバリアントの配列が詳細に示されている。例として、ＰＢＳ配列と編集後の相同性領域（編集の位置の後）は、それぞれ１２ｎｔと３０ｎｔに設定されている。更に、本出願の他の箇所で説明されているように、第１のニックから１００ｎｔ近くの距離を優先し、ＰＡＭ－ｉｎシステムを生じる設計を第一優先として、第２の鎖を標的とするｇＲＮＡが選択される。
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大文字は「コアヌクレオチド」を示し、小文字は「フランキングヌクレオチド」を示す。ここで、ＲＮＡ配列（例えば、鋳型ＲＮＡ配列）がチミン（Ｔ）を含む特定の配列（例えば、表４の配列又はその一部）を含むと言われる場合、ＲＮＡ配列がＴの代わりにウラシル（Ｕ）を含み得る（多くの場合そうである）ことは当然理解される。例えば、ＲＮＡ配列は、表４の配列でＴとして示されている全ての位置にＵを含み得る。より具体的には、本開示は、表４に示される全ての鋳型配列に従ったＲＮＡ配列を提供し、ここで、このＲＮＡ配列は、表４の配列中の各Ｔの代わりにＵを有する。
表５：ＰＡＭ不活性化部位を含む例示的な鋳型ＲＮＡ配列
表５は、表４から選択した配列と、ＰＡＭ部位の不活性化を示す注釈を提供する。「ＩＤ」の列には、表１～４で使用されるＩＤに対応する鋳型ＲＮＡのユニークな識別子が含まれており、例えば、表１の対応するｇＲＮＡスペーサー配列を識別するために使用できる。「Ｃａｓ種」の列は、鋳型ＲＮＡでの使用のために遺伝子改変ポリペプチドに含めるのに適したＣａｓドメインのタイプを示す。「コンセンサス」の列は、Ｃａｓによって認識されるコンセンサスＰＡＭモチーフを示す。「ＰＡＭ配列」の列は、例えばＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子中の、Ｃａｓによって認識される特定のＰＡＭ配列を示す。「ＰＡＭ変異」の列は、表の同じ行に記載されている鋳型ＲＮＡによってＰＡＭに生成され得る変異を示す。変異したヌクレオチドは太字且つ下線で示される。「鎖」の列は、標的核酸の＋又は１鎖を示す。「距離」の列は、編集前の相同性領域内のヌクレオチドの数を示す。「ＰＢＳ配列」の列は、鋳型ＲＮＡに部分的又は完全に含まれるＰＢＳ配列を示し、ここで、コアヌクレオチドは大文字であり、フランキングヌクレオチドは小文字である。「ＲＴ鋳型配列」の列は、鋳型ＲＮＡに部分的又は完全に含まれる異種目的配列を示し、ここで、コアヌクレオチドは大文字、フランキングヌクレオチドは小文字、標的核酸とのヌクレオチドの相違は太字且つ下線で表される。
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ここで、ＲＮＡ配列（例えば、鋳型ＲＮＡ配列）がチミン（Ｔ）を含む特定の配列（例えば、表５の配列又はその一部）を含むと言われる場合、ＲＮＡ配列がＴの代わりにウラシル（Ｕ）を含み得る（多くの場合そうである）ことは当然理解される。例えば、ＲＮＡ配列は、表５の配列でＴとして示されている全ての位置にＵを含み得る。より具体的には、本開示は、表５に示される全ての鋳型配列に従ったＲＮＡ配列を提供し、ここで、このＲＮＡ配列は、表５の配列中の各Ｔの代わりにＵを有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｇＲＮＡスキャフォールドは、５’から３’の方向に、表６ＡのｃｒＲＮＡ、表６Ａの同じ行のテトラループ、及び表６Ａの同じ行のｔｒａｃｒＲＮＡを含む核酸配列又はそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、表６Ａに従った配列を有するｇＲＮＡ又は鋳型ＲＮＡは、遺伝子改変ポリペプチド及びスペーサーを更に含むシステムによって構成され、ここで、スペーサーは、表６Ａの同じ行に記載されているｇＲＮＡスペーサーを含む。
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いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるシステム及び方法は、表６Ｂに列挙される鋳型配列若しくはその構成要素、又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含み得る。表６Ｂは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の変異を修正するために遺伝子改変ポリペプチドと対になるように設計された例示的な鋳型ＲＮＡ配列を提供する。
表６Ｂ．例示的な鋳型ＲＮＡ配列
表６Ｂは、ＳＥＲＰＩＮＡ１の病原性Ｅ３４２Ｋ変異を野生型に修正するための遺伝子改変システムの例示的なＤＮＡ成分の設計を提供する。この表は、遺伝子改変ポリペプチドを含む例示的な遺伝子改変システムにおける使用のための完全な鋳型ＲＮＡの配列を詳細に示す。
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Figure 2024533312000776
表１～４、５、６Ａ、及び６Ｂに示す鋳型ＲＮＡ配列は、対象となる細胞に応じてカスタマイズされ得る。例えば、いくつかの実施形態では、編集時にＰＡＭ配列を不活性化して（例えば、「ＰＡＭ－ｋｉｌｌ」改変を使用して）、最初の編集後の更なる遺伝子編集（例えば、Ｃａｓ再標的化による）の可能性を低減することが望ましい。従って、本明細書に記載の特定の鋳型ＲＮＡは、編集時にＰＡＭ部位が遺伝子改変ポリペプチドによって認識されなくなる配列に変異するように、標的部位のＰＡＭに変異（例えば、置換）を書き込むように設計される。従って、鋳型ＲＮＡの異種目的配列内の変異領域は、ＰＡＭ－ｋｉｌｌ配列を含み得る。理論に縛られることを望むものではないが、いくつかの実施形態では、ＰＡＭ－ｋｉｌｌ配列は、遺伝子改変の完了時に遺伝子改変ポリペプチドの再結合を防ぐか、又はＰＡＭ－ｋｉｌｌ配列を欠く鋳型ＲＮＡと比較して再結合を減少させる。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ－ｋｉｌｌ配列は遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を変更せず、例えば、ＰＡＭ－ｋｉｌｌ配列はサイレント変異を生じる。他の実施形態では、ＰＡＭ配列をそのまま残す（ＰＡＭ－ｋｉｌｌなし）ことが望ましい。
同様に、いくつかの実施形態では、最初の編集後の更なる遺伝子編集（例えば、Ｃａｓ再標的化による）の可能性を低減するために、「シード－ｋｉｌｌ」モチーフを介してＲＴ鋳型配列の最初の３つのヌクレオチドを変更することが望ましい場合がある。従って、本明細書に記載の特定の鋳型ＲＮＡは、編集時に標的部位がＲＴ鋳型配列との相同性がより低い配列変異するように、ＲＴ鋳型配列の最初の３つのヌクレオチドに対応する標的部位の部分に変異（例えば、置換）を書き込むように設計される。従って、鋳型ＲＮＡの異種目的配列内の変異領域は、シード－ｋｉｌｌ配列を含み得る。理論に縛られることを望むものではないが、いくつかの実施形態では、シード－ｋｉｌｌ配列は、遺伝子改変の完了時に遺伝子改変ポリペプチドの再結合を防ぐか、又はシード－ｋｉｌｌ配列を欠く以外は同様の鋳型ＲＮＡと比較して再結合を減少させる。いくつかの実施形態では、シード－ｋｉｌｌ配列は遺伝子によってコードされるアミノ酸配列を変更せず、例えば、シード－ｋｉｌｌ配列はサイレント変異を生じる。他の実施形態では、シード領域をインタクトなまま残すことが望ましく、シード－ｋｉｌｌ配列は使用されない。
更なる実施形態では、遺伝子編集効率を最適化又は改善するために、標的細胞のミスマッチ修復又はヌクレオチド修復経路を回避するか、又は標的細胞の修復経路を編集された鎖の保存に偏向させることが望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、標的細胞のミスマッチ修復又はヌクレオチド修復経路を回避するか、又は標的細胞の修復経路を編集された鎖の保存に偏向させるために、複数のサイレント変異（例えば、サイレント置換）がＲＴ鋳型配列内に導入され得る。
表７Ｂは、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子内の様々な位置の例示的なサイレント変異を提供する。
Figure 2024533312000777
Figure 2024533312000778
いくつかの実施形態では、鋳型ＲＮＡは、１つ以上のサイレント変異を含む。
表７Ｂに示されているサイレント変異は、本明細書に記載の鋳型ＲＮＡ配列において個別に、又は任意の方法で組み合わせて使用され得ることが理解されるべきである。
誘導性活性を有するｇＲＮＡ
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｇＲＮＡ（例えば、鋳型ＲＮＡの一部であるｇＲＮＡ又は第２の鎖ニッキングのために使用されるｇＲＮＡ）は、誘導性活性を有する。誘導性活性は、（ｇＲＮＡに加えて）ブロッキングドメインを更に含む鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡによって達成され得、ブロッキングドメインの一部又は全部の配列は、ｇＲＮＡの一部又は全部に対して、少なくとも部分的に相補的である。従って、ブロッキングドメインは、ｇＲＮＡの一部又は全部に対してハイブリダイズ又は実質的にハイブリダイズ可能である。一部の実施形態では、ブロッキングドメイン及び誘導性活性ｇＲＮＡは、鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡ上に配置されることで、ｇＲＮＡは、ブロッキングドメインがｇＲＮＡに対してハイブリダイズ又は実質的にハイブリダイズされる場合の第１の立体構造と、ブロッキングドメインがｇＲＮＡに対してハイブリダイズされない又は実質的にハイブリダイズされない場合の第２の立体構造とをとり得る。一部の実施形態では、第１の立体構造において、ｇＲＮＡは、遺伝子改変ポリペプチド（例えば、鋳型核酸結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、又はエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質））に結合できない、又はブロッキングドメインを欠く以外には同様の鋳型ＲＮＡと比較して、実質的に減少した親和性で結合する。一部の実施形態では、第２の立体構造において、ｇＲＮＡは、遺伝子改変ポリペプチド（例えば、鋳型核酸結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメイン、又はエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質））に結合可能である。一部の実施形態では、ｇＲＮＡが第１又は第２の立体構造のいずれであるかは、遺伝子改変ポリペプチドの（例えば、遺伝子改変ポリペプチドが含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の）ＤＮＡ結合又はエンドヌクレアーゼ活性のいずれが活性であるかに影響し得る。
一部の実施形態では、第２のニックを連携させるｇＲＮＡは、誘導性活性を有する。一部の実施形態では、第２のニックを連携させるｇＲＮＡは、鋳型が逆転写された後に誘導される。一部の実施形態では、ｇＲＮＡのブロッキングドメインへのハイブリダイゼーションは、開口分子を用いて破壊され得る。一部の実施形態では、開口分子は、ｇＲＮＡ又はブロッキングドメインの一部又は全てに結合し、ｇＲＮＡのブロッキングドメインへのハイブリダイゼーションを阻害する薬剤を含む。一部の実施形態では、開口分子は、例えば、ｇＲＮＡ、ブロッキングドメイン、又は両方に対して部分的に又は全体的に相補的である配列を含む核酸を含む。適切な開口分子を選択又は設計することにより、開口分子の提供は、それがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質と会合し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質の関連機能（例えば、ＤＮＡ結合及び／又はエンドヌクレアーゼ活性）を提供し得るように、ｇＲＮＡの立体構造の変化を促進し得る。特定の理論に束縛されることを意図しないが、選択された時間及び／又は位置での開口分子の提供は、ｇＲＮＡ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、又はそれらを含む遺伝子改変システムの活性の空間的及び時間的制御を可能にし得る。一部の実施形態では、開口分子は、遺伝子改変ポリペプチド及び／又は鋳型核酸を含む細胞に対して外因性である。一部の実施形態では、開口分子は、（例えば、遺伝子改変ポリペプチド並びに／又はｇＲＮＡ及びブロッキングドメインを含む鋳型核酸を含む細胞に対して内因性である）内因性薬剤を含む。例えば、誘導性ｇＲＮＡ、ブロッキングドメイン、及び開口分子は、開口分子が標的細胞又は組織内で発現される内因性薬剤であるように選択され得、例えば、それにより、標的細胞又は組織内での遺伝子改変システムの活性が確認される。更なる例として、誘導性ｇＲＮＡ、ブロッキングドメイン、及び開口分子は、開口分子が１つ又は複数の非標的細胞又は組織内で存在しないか又は実質的に発現されないように選択され得、例えば、それにより、遺伝子改変システムの活性は、１つ又は複数の非標的細胞又は組織内で存在しないか若しくは実質的に存在しない、又は標的細胞又は組織と比較して低下したレベルで存在することが確認される。例示的なブロッキングドメイン、開口分子、及びその使用については、ＰＣＴ出願公開の国際公開第２０２００４４０３９Ａ１号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。一部の実施形態では、鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡは、遺伝子改変ポリペプチドの１つ又は複数の成分による、例えば、逆転写酵素又はＲＮＡ結合ドメインによる結合のための１つ又は複数の配列又は構造、及びｇＲＮＡを含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、遺伝子改変ポリペプチドの鋳型核酸結合ドメイン（例えば、ＲＮＡ結合ドメイン）との相互作用を促進する。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、遺伝子改変ポリペプチドを、例えば、標的細胞ゲノム中の一致する標的配列に導く。
遺伝子改変システムにおける環状ＲＮＡ及びリボザイム
標的細胞内での製剤化、送達又は遺伝子改変反応中、環状及び／又は線状ＲＮＡ状態を使用することが有用であり得ると考えられる。従って、本明細書に記載の態様のいずれかの一部の実施形態では、遺伝子改変システムは、１つ又は複数の環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）を含む。本明細書に記載の態様のいずれかの一部の実施形態では、遺伝子改変システムは、１つ又は複数の線状ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸（例えば、鋳型核酸、遺伝子改変ポリペプチド又は両方をコードする核酸分子）は、ｃｉｒｃＲＮＡである。一部の実施形態では、環状ＲＮＡ分子は、遺伝子改変ポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡ分子は、宿主細胞に送達される。一部の実施形態では、環状ＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載されるようなリコンビナーゼをコードする。一部の実施形態では、リコンビナーゼをコードするｃｉｒｃＲＮＡ分子は、宿主細胞に送達される。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡ分子は、翻訳前に（例えば、宿主細胞内で、例えば、宿主細胞の核内で）線状化される。
環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）は、細胞内で天然に生じることが見出されており、ヒト細胞内での非コード及びタンパク質をコードする役割の両方を含む、多様な機能を有することが見出されている。ｃｉｒｃＲＮＡが、ＲＮＡの環状化をもたらすように、自己スプライシングイントロンをＲＮＡ分子（又はＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ）に組み込むことによって改変され得、改変されたｃｉｒｃＲＮＡが、増強されたタンパク質の生成及び安定性を有し得ることが示されている（Ｗｅｓｓｅｌｈｏｅｆｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２０１８）。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、ｃｉｒｃＲＮＡとしてコードされる。特定の実施形態では、鋳型核酸は、ｄｓＤＮＡ又はｓｓＤＮＡなどのＤＮＡである。特定の実施形態では、ｃｉｒｃＤＮＡは、鋳型ＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、１つ又は複数のリボザイム配列を含む。一部の実施形態では、リボザイム配列は、例えば宿主細胞内で、自己切断のため、活性化され、例えば、それにより、ｃｉｒｃＲＮＡの線状化をもたらす。一部の実施形態では、リボザイムは、マグネシウムの濃度が、例えば宿主細胞内で、切断にとって十分なレベルに達するとき、活性化される。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、宿主細胞への送達の前、低いマグネシウム環境下で維持される。一部の実施形態では、リボザイムは、タンパク質応答性リボザイムである。一部の実施形態では、リボザイムは、核酸応答性リボザイムである。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、切断部位を含む。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、第２の切断部位を含む。
一部の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡは、標的細胞の核内で線状化される。一部の実施形態では、細胞の核内でのｃｉｒｃＲＮＡの線状化は、例えば、切断事象を活性化するため、細胞の核内に存在する成分に関連する。一部の実施形態では、核エレメント、例えば、核タンパク質、例えば、ゲノムと相互作用するタンパク質、例えば、エピジェネティック修飾因子、例えば、ＥＺＨ２に対して応答性がある、リボザイム、例えば、Ｂ２又はＡＬＵエレメント由来のリボザイムは、例えば、遺伝子改変システムの、ｃｉｒｃＲＮＡに組み込まれる。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの核局在化は、リボザイムの自己触媒活性の増加及びｃｉｒｃＲＮＡの線状化をもたらす。
一部の実施形態では、リボザイムは、遺伝子改変システムの他の成分の１つ又は複数に対して異種である。一部の実施形態では、誘導性リボザイム（例えば、本明細書に記載されるｃｉｒｃＲＮＡ中）は、例えば、タンパク質リガンド応答性のアプタマー設計を用いることによって合成的に作製される。ＭＳ２コートタンパク質アプタマーを有するタバコ輪斑ウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ ｒｉｎｇｓｐｏｔ ｖｉｒｕｓ）ハンマーヘッド型リボザイムのサテライトＲＮＡを使用するためのシステムは、ＭＳ２コートタンパク質の存在下で、リボザイム活性の活性化をもたらすことが記載されている（Ｋｅｎｎｅｄｙ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２（１９）：１２３０６－１２３２１（２０１４）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。複数の実施形態では、こうしたシステムは、細胞質又は核に局在されたタンパク質リガンドに応答する。一部の実施形態では、タンパク質リガンドは、ＭＳ２でない。標的リガンドに対するＲＮＡアプタマーを作製する方法は、例えば、指数関数的濃縮（ＳＥＬＥＸ）によるリガンドの系統的進化に基づき、記載されており（Ｔｕｅｒｋ ａｎｄ Ｇｏｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９（４９６８）：５０５－５１０（１９９０）；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ ３４６（６２８７）：８１８－８２２（１９９０）；それらの各々の方法は参照により本明細書に組み込まれる）、いくつかの事例では、インシリコ設計によって支援されている（Ｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ １１７（１５）：８４８６－８４９３、それらの方法は参照により本明細書に組み込まれる）。従って、一部の実施形態では、標的リガンドに対するアプタマーは、合成リボザイムシステム中に作製され、組み込まれ、例えば、例えば、タンパク質リガンドの存在下で、リボザイム媒介性切断及びｃｉｒｃＲＮＡの線状化を誘起する。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの線状化は、例えば、細胞質内でリガンドと会合するアプタマーを用いて、細胞質内で誘起される。一部の実施形態では、ｃｉｒｃＲＮＡの線状化は、例えば、核内でリガンドと会合するアプタマーを用いて、核内で誘起される。複数の実施形態では、核内のリガンドは、エピジェネティック修飾因子又は転写因子を含む。一部の実施形態では、線状化を誘起するリガンドは、オンターゲット細胞内に、オフターゲット細胞より高いレベルで存在する。
更に、ｃｉｒｃＲＮＡの線状化のため、核酸応答性リボザイムシステムが使用され得ると考えられる。例えば、リボザイム活性化を誘起するための、規定された標的核酸分子を感知するバイオセンサーは、例えば、Ｐｅｎｃｈｏｖｓｋｙ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｄｖａｎｃｅｓ ３２（５）：１０１５－１０２７（２０１４）、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。これらの方法により、リボザイムは、天然に不活性状態にフォールドし、規定された標的核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子）の存在下のみで活性化される。一部の実施形態では、遺伝子改変システムのｃｉｒｃＲＮＡは、規定された標的核酸、例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ又はｍｔＲＮＡの存在下で活性化される、核酸応答性リボザイムを含む。一部の実施形態では、線状化を誘起する核酸は、オンターゲット細胞内に、オフターゲット細胞より高いレベルで存在する。
本明細書中の態様のいずれかの一部の実施形態では、遺伝子改変システムは、目的の標的組織又は標的細胞に対する誘導特異性を有する１つ又は複数のリボザイム、例えば、目的の標的組織又は標的細胞においてより高いレベルで存在するリガンド又は核酸によって活性化されるリボザイムを組み込む。一部の実施形態では、遺伝子改変システムは、細胞内区画、例えば、核、核小体、細胞質、又はミトコンドリアに対する誘導特異性を有するリボザイムを組み込む。一部の実施形態では、リボザイムは、標的細胞内区画中により高いレベルで存在するリガンド又は核酸によって活性化される。一部の実施形態では、遺伝子改変システムのＲＮＡ成分は、例えば、線状化によって活性化される、ｃｉｒｃＲＮＡとして提供される。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡの線状化は、翻訳のための分子を活性化する。一部の実施形態では、遺伝子改変システムのｃｉｒｃＲＮＡ成分を活性化するシグナルが、オンターゲット細胞又は組織内により高いレベルで存在することで、例えば、システムは、これらの細胞内で特異的に活性化される。
一部の実施形態では、遺伝子改変システムのＲＮＡ成分は、線状化によって不活性化されるｃｉｒｃＲＮＡとして提供される。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡは、切断及び分解によって不活性化される。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードするｃｉｒｃＲＮＡは、翻訳シグナルをポリペプチドのコーディング配列から分離する切断によって不活性化される。一部の実施形態では、遺伝子改変システムのｃｉｒｃＲＮＡ成分を不活性化するシグナルが、オフターゲット細胞又は組織内により高いレベルで存在することで、システムは、これらの細胞内で特異的に不活性化される。
標的核酸部位
一部の実施形態では、遺伝子改変後、編集された配列周囲の標的部位は、例えば、Ｋａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６４５９０３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、例として、例えば、標的部位のロングリードアンプリコン配列決定により判定して、編集事象の約５０％又は１０％未満において、限られた数の挿入又は欠失を含む。一部の実施形態では、標的部位は、例えば、Ｋａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６４５９０３（２０２０）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、例えば、標的部位のロングリードアンプリコン配列決定により判定して、複数の連続した編集事象、例えば、ヘッドトゥーテール又はヘッドトゥヘッド重複を示さない。一部の実施形態では、標的部位は、鋳型ＲＮＡに対応する組み込まれた配列を含む。一部の実施形態では、標的部位は、例えば、Ｋａｒｓｔ ｅｔ ａｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／６４５９０３（２０２０）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、例えば、標的部位のロングリードアンプリコン配列決定により判定して、事象の約１％又は１０％超において、内因性ＲＮＡから得られる挿入を含まない。一部の実施形態では、標的部位は、鋳型ＲＮＡに対応する組み込まれた配列を含む。
本発明の特定の態様では、遺伝子改変システムによって組み込まれる宿主ＤＮＡ結合部位は、遺伝子内、イントロン内、エクソン内、ＯＲＦ内、任意の遺伝子のコード領域外、遺伝子の調節領域内、又は遺伝子の調節領域外に存在し得る。他の態様では、ポリペプチドは、１つ又は２つ以上の宿主ＤＮＡ配列に結合し得る。
一部の実施形態では、遺伝子改変システムを用いて、複数の対立遺伝子中の標的遺伝子座を編集する。一部の実施形態では、遺伝子改変システムは、特定の対立遺伝子を編集するように設計される。例えば、遺伝子改変ポリペプチドは、一方の対立遺伝子上のみに存在する特定の配列に導かれ得、例えば、標的対立遺伝子、例えば、第２のコグネイト対立遺伝子に対してではなく、ｇＲＮＡ又はアニーリングドメインに対して相同性を有する鋳型ＲＮＡを含む。一部の実施形態では、遺伝子改変システムは、ハプロタイプに特異的な対立遺伝子を改変し得る。一部の実施形態では、特定の対立遺伝子を標的にする遺伝子改変システムは、その対立遺伝子を優先的に標的にし、例えば、標的対立遺伝子に対する少なくとも２、４、６、８、又は１０倍の優先性を有する。
第２の鎖ニッキング
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変システムは、第１の鎖に切れ目を入れるニッカーゼ活性（例えば、遺伝子改変ポリペプチド中）、及び標的ＤＮＡの第２の鎖に切れ目を入れるニッカーゼ活性（例えば、遺伝子改変ポリペプチドと別個のポリペプチド中）を含む。本明細書に記載されるように、特定の理論に束縛されることを意図しないが、標的部位ＤＮＡの第１の鎖のニッキングは、鋳型ＲＮＡの配列、例えば、異種目的配列を逆転写するために、ＲＴドメインによって使用され得る３’ＯＨを提供すると考えられる。特定の理論に束縛されることを意図しないが、更なるニックの第２の鎖への導入が、元のゲノム配列より高頻度で異種目的配列ベースの配列をとるように細胞ＤＮＡ修復機構をバイアスし得ると考えられる。一部の実施形態では、第２の鎖に対する更なるニックが、第１の鎖に対するニックとして同じエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ニッカーゼドメイン）によって作製される。一部の実施形態では、同じ遺伝子改変ポリペプチドは、第１の鎖に対するニック及び第２の鎖に対するニックの両方の機能を果たす。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓドメインを含み、第２の鎖に対する更なるニックは、例えば、第２の鎖に切れ目を入れるようにＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓドメインを導く第２のｇＲＮＡを含む更なる核酸によって導かれる。他の実施形態では、更なる第２の鎖ニックは、第１の鎖に対するニックと異なるエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ニッカーゼドメイン）によって作製される。一部の実施形態では、その異なるエンドヌクレアーゼドメインは、遺伝子改変ポリペプチドと別個に、更なるポリペプチド中に位置する（例えば、本発明のシステムは、更なるポリペプチドを更に含む）。一部の実施形態では、更なるポリペプチドは、本明細書に記載されるエンドヌクレアーゼドメイン（例えば、ニッカーゼドメイン）を含む。一部の実施形態では、更なるポリペプチドは、例えば、本明細書に記載されるＤＮＡ結合ドメインを含む。
第１の鎖ニックと比較して、第２の鎖ニックが生じる位置は、所望の遺伝子改変ＤＮＡ修飾が得られる範囲、望まれない二本鎖切断（ＤＳＢ）が生じる範囲、望まれない挿入が生じる範囲、又は望まれない欠失が生じる範囲の１つ又は複数に影響し得ることは、本明細書で企図される。特定の理論に束縛されることを意図しないが、第２の鎖ニッキングは、２つの一般的な方向性：内向きニック（ｉｎｗａｒｄ ｎｉｃｋ）及び外向きニック（ｏｕｔｗａｒｄ ｎｉｃｋ）において生じ得る。
一部の実施形態では、内向きニック方向性において、ＲＴドメインは、第２の鎖ニックから離れて（例えば、鋳型ＲＮＡ（例えば、異種目的配列）を用いて）重合する。一部の実施形態では、内向きニック方向性において、第１の鎖に対するニックの位置及び第２の鎖に対するニックの位置は、第１のＰＡＭ部位と第２のＰＡＭ部位との間に位置づけられる（例えば、両方のニックが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓドメインを含むポリペプチド（例えば、遺伝子改変ポリペプチド）によって作製される状況で）。外側に２つのＰＡＭが存在し、内側に２つのニックが存在する場合、この内向きニック方向性は、「ＰＡＭ－アウト」とも呼ばれ得る。一部の実施形態では、内向きニック方向性において、第１の鎖に対するニックの位置及び第２の鎖に対するニックの位置は、ポリペプチドが標的ＤＮＡに結合する部位と更なるポリペプチドが標的ＤＮＡに結合する部位との間に存在する。一部の実施形態では、内向きニック方向性において、第２の鎖に対するニックの位置は、ポリペプチド及び更なるポリペプチドの結合部位間に位置づけられ、第１の鎖に対するニックも、ポリペプチド及び更なるポリペプチドの結合部位間に位置する。一部の実施形態では、内向きニック方向性において、第１の鎖に対するニックの位置及び第２の鎖に対するニックの位置は、ＰＡＭ部位と、標的部位から距離を置いた第２のポリペプチドの結合部位との間に位置づけられる。
内向きニック方向性を提供する遺伝子改変システムの例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓドメインを含む遺伝子改変ポリペプチド、第１の鎖上の標的部位ＤＮＡのニッキングを導くｇＲＮＡを含む鋳型ＲＮＡ、及び第１のニックの位置から距離を置いた部位でニッキングを導く更なるｇＲＮＡを含む更なる核酸を含み、第１のニックの位置及び第２のニックの位置は、２つのｇＲＮＡが遺伝子改変ポリペプチドを導く部位のＰＡＭ部位間に存在する。更なる例として、内向きニック方向性を提供する別の遺伝子改変システムは、ジンクフィンガー分子及び第１のニッカーゼドメインを含む遺伝子改変ポリペプチド、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓドメインを含む更なるポリペプチド、及び第２の鎖上の標的部位ＤＮＡから距離を置いた部位に切れ目を入れるように更なるポリペプチドを導くｇＲＮＡを含む更なる核酸を含み、ここで、ジンクフィンガー分子は、標的部位の第１の鎖に切れ目を入れるように第１のニッカーゼドメインを導く様式で標的ＤＮＡに結合し；第１のニックの位置及び第２のニックの位置が、ＰＡＭ部位とジンクフィンガー分子が結合する部位との間に存在する。更なる例として、内向きニック方向性を提供する別の遺伝子改変システムは、ジンクフィンガー分子及び第１のニッカーゼドメインを含む遺伝子改変ポリペプチド、ＴＡＬエフェクター分子及び第２のニッカーゼドメインを含む更なるポリペプチドを含み、ここで、ジンクフィンガー分子は、標的部位の第１の鎖に切れ目を入れるように第１のニッカーゼドメインを導く様式で標的ＤＮＡに結合し；ここで、ＴＡＬエフェクター分子は、第２の鎖に切れ目を入れるように更なるポリペプチドを導く様式で標的部位から距離を置いた部位に結合し、第１のニックの位置及び第２のニックの位置は、ＴＡＬエフェクター分子が結合する部位とジンクフィンガー分子が結合する部位との間に存在する。
一部の実施形態では、外向きニック方向性において、ＲＴドメインは、（例えば、鋳型ＲＮＡ（例えば、異種目的配列）を用いて）第２の鎖ニックに向けて重合する。一部の実施形態では、外向きニック方向性において、第１及び第２のニックの両方がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓドメインを含むポリペプチド（例えば、遺伝子改変ポリペプチド）によって作製される場合、第１のＰＡＭ部位及び第２のＰＡＭ部位は、第１の鎖に対するニックの位置と第２の鎖に対するニックの位置との間に位置づけられる。内側に２つのＰＡＭが存在し、外側に２つのニックが存在する場合、この外向きニック方向性は、「ＰＡＭ－イン」とも呼ばれる。一部の実施形態では、外向きニック方向性において、ポリペプチド（例えば、遺伝子改変ポリペプチド）及び更なるポリペプチドは、第１の鎖に対するニックの位置と第２の鎖に対するニックの位置との間の標的ＤＮＡ上の部位に結合する。一部の実施形態では、外向きニック方向性において、第２の鎖に対するニックの位置は、第１の鎖に対するニックの位置に対する、ポリペプチド及び更なるポリペプチドの結合部位の反対側に位置づけられる。一部の実施形態では、外向き方向性において、ＰＡＭ部位及び標的部位から距離を置いた第２のポリペプチドの結合部位は、第１の鎖に対するニックの位置と第２の鎖に対するニックの位置との間に位置づけられる。
外向きニック方向性を提供する遺伝子改変システムの例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓドメインを含む遺伝子改変ポリペプチド、第１の鎖上の標的部位ＤＮＡのニッキングを導くｇＲＮＡを含む鋳型ＲＮＡ、及び第１のニックの位置から距離を置いた部位でニッキングを導く更なるｇＲＮＡを含む更なる核酸を含み、第１のニックの位置及び第２のニックの位置は、２つのｇＲＮＡが遺伝子改変ポリペプチドを導く部位のＰＡＭ部位外側に存在する（すなわち、ＰＡＭ部位は、第１のニックの位置と第２のニックの位置との間に存在する）。更なる例として、外向きニック方向性を提供する別の遺伝子改変システムは、ジンクフィンガー分子及び第１のニッカーゼドメインを含む遺伝子改変ポリペプチド、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓドメインを含む更なるポリペプチド並びに第２の鎖上の標的部位ＤＮＡから距離を置いた部位に切れ目を入れるように更なるポリペプチドを導くｇＲＮＡを含む更なる核酸を含み、ここで、ジンクフィンガー分子は、標的部位の第１の鎖に切れ目を入れるように第１のニッカーゼドメインを導く様式で標的ＤＮＡに結合し；第１のニックの位置及び第２のニックの位置は、ＰＡＭ部位及びジンクフィンガー分子が結合する部位の外側に存在する（すなわち、ＰＡＭ部位及びジンクフィンガー分子が結合する部位は、第１のニックの位置と第２のニックの位置との間に存在する）。更なる例として、外向きニック方向性を提供する別の遺伝子改変システムは、ジンクフィンガー分子及び第１のニッカーゼドメインを含む遺伝子改変ポリペプチド、ＴＡＬエフェクター分子及び第２のニッカーゼドメインを含む更なるポリペプチドを含み、ここで、ジンクフィンガー分子は、標的部位の第１の鎖に切れ目を入れるように第１のニッカーゼドメインを導く様式で標的ＤＮＡに結合し；ここで、ＴＡＬエフェクター分子は、第２の鎖に切れ目を入れるように更なるポリペプチドを導く様式で標的部位から距離を置いた部位に結合し、第１のニックの位置及び第２のニックの位置は、ＴＡＬエフェクター分子が結合する部位及びジンクフィンガー分子が結合する部位の外側に存在する（すなわち、ＴＡＬエフェクター分子が結合する部位及びジンクフィンガー分子が結合する部位は、第１のニックの位置と第２のニックの位置との間に存在する）。
特定の理論に束縛されることを意図しないが、第２の鎖ニックが提供される遺伝子改変システムの場合、外向きニック方向性が一部の実施形態において好ましいと考えられる。本明細書に記載のように、内向きニックは、外向きニック方向性より多い数の二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成し得る。ＤＳＢは、細胞の核内のＤＳＢ修復経路によって認識され得、望まれない挿入及び欠失を生じ得る。外向きニック方向性は、ＤＳＢ形成のリスク低減、及び対応するより少量の望まれない挿入及び欠失を提供し得る。一部の実施形態では、望まれない挿入及び欠失は、異種目的配列によってコードされない挿入及び欠失、例えば、異種目的配列によってコードされる修飾と無関係の二本鎖切断修復経路によって生成される挿入又は欠失である。一部の実施形態では、所望の遺伝子改変は、異種目的配列によってコードされる（例えば、異種目的配列を標的部位に書き込む遺伝子改変によって達成される）標的ＤＮＡに対する改変（例えば、置換、挿入、又は欠失）を含む。一部の実施形態では、第１の鎖ニック及び第２の鎖ニックは、外向きの方向性である。
更に、第１の鎖ニックと第２の鎖ニックとの間の距離は、所望の遺伝子改変システムＤＮＡ修飾が得られる範囲、望まれない二本鎖切断（ＤＳＢ）が生じる範囲、望まれない挿入が生じる範囲、又は望まれない欠失が生じる範囲の１つ又は複数に影響し得る。特定の理論に束縛されることを意図しないが、第２の鎖ニックは、異種目的配列の標的ＤＮＡへの組み込みに向けてＤＮＡ修復をバイアスすることが、第１の鎖ニックと第２の鎖ニックとの間の距離の減少に応じて増加することから有利であると考えられる。しかしながら、第１の鎖ニックと第２の鎖ニックとの間の距離の減少に応じてＤＳＢ形成のリスクも増加すると考えられる。それに応じて、望まれない挿入及び／又は欠失の数が、第１の鎖ニックと第２の鎖ニックとの間の距離の減少に応じて増加し得ると考えられる。一部の実施形態では、第１の鎖ニックと第２の鎖ニックとの間の距離は、異種目的配列の標的ＤＮＡへの組み込みに向けてＤＮＡ修復をバイアスする利点と、ＤＳＢ形成及び望まれない欠失及び／又は挿入のリスクとを均衡させるように選択される。一部の実施形態では、第１の鎖ニック及び第２の鎖ニックが少なくとも閾値距離離れている場合のシステムは、第１のニック及び第２のニックが閾値距離未満離れている場合のそれ以外には同様の内向きニック方向性システムと比較して、所望の遺伝子改変システム修飾結果のレベル増加、望まれない欠失のレベル低下、及び／又は望まれない挿入のレベル低下を有する。一部の実施形態では、閾値距離は、以下に与えられる。
一部の実施形態では、第１のニック及び第２のニックは、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０若しくは２００ヌクレオチド離れている。一部の実施形態では、第１のニック及び第２のニックは、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００若しくは２５０ヌクレオチド以下離れている。一部の実施形態では、第１のニック及び第２のニックは、２０～２００、３０～２００、４０～２００、５０～２００、６０～２００、７０～２００、８０～２００、９０～２００、１００～２００、１１０～２００、１２０～２００、１３０～２００、１４０～２００、１５０～２００、１６０～２００、１７０～２００、１８０～２００、１９０～２００、２０～１９０、３０～１９０、４０～１９０、５０～１９０、６０～１９０、７０～１９０、８０～１９０、９０～１９０、１００～１９０、１１０～１９０、１２０～１９０、１３０～１９０、１４０～１９０、１５０～１９０、１６０～１９０、１７０～１９０、１８０～１９０、２０～１８０、３０～１８０、４０～１８０、５０～１８０、６０～１８０、７０～１８０、８０～１８０、９０～１８０、１００～１８０、１１０～１８０、１２０～１８０、１３０～１８０、１４０～１８０、１５０～１８０、１６０～１８０、１７０～１８０、２０～１７０、３０～１７０、４０～１７０、５０～１７０、６０～１７０、７０～１７０、８０～１７０、９０～１７０、１００～１７０、１１０～１７０、１２０～１７０、１３０～１７０、１４０～１７０、１５０～１７０、１６０～１７０、２０～１６０、３０～１６０、４０～１６０、５０～１６０、６０～１６０、７０～１６０、８０～１６０、９０～１６０、１００～１６０、１１０～１６０、１２０～１６０、１３０～１６０、１４０～１６０、１５０～１６０、２０～１５０、３０～１５０、４０～１５０、５０～１５０、６０～１５０、７０～１５０、８０～１５０、９０～１５０、１００～１５０、１１０～１５０、１２０～１５０、１３０～１５０、１４０～１５０、２０～１４０、３０～１４０、４０～１４０、５０～１４０、６０～１４０、７０～１４０、８０～１４０、９０～１４０、１００～１４０、１１０～１４０、１２０～１４０、１３０～１４０、２０～１３０、３０～１３０、４０～１３０、５０～１３０、６０～１３０、７０～１３０、８０～１３０、９０～１３０、１００～１３０、１１０～１３０、１２０～１３０、２０～１２０、３０～１２０、４０～１２０、５０～１２０、６０～１２０、７０～１２０、８０～１２０、９０～１２０、１００～１２０、１１０～１２０、２０～１１０、３０～１１０、４０～１１０、５０～１１０、６０～１１０、７０～１１０、８０～１１０、９０～１１０、１００～１１０、２０～１００、３０～１００、４０～１００、５０～１００、６０～１００、７０～１００、８０～１００、９０～１００、２０～９０、３０～９０、４０～９０、５０～９０、６０～９０、７０～９０、８０～９０、２０～８０、３０～８０、４０～８０、５０～８０、６０～８０、７０～８０、２０～７０、３０～７０、４０～７０、５０～７０、６０～７０、２０～６０、３０～６０、４０～６０、５０～６０、２０～５０、３０～５０、４０～５０、２０～４０、３０～４０若しくは２０～３０ヌクレオチド離れている。一部の実施形態では、第１のニック及び第２のニックは、４０～１００ヌクレオチド離れている。
特定の理論に束縛されることを意図しないが、第２の鎖ニックが提供され、且つ内向きニック方向性が選択される遺伝子改変システムの場合、第１の鎖ニックと第２の鎖ニックとの間の距離の増加が好ましいことがあると考えられる。本明細書に記載のように、内向きニック方向性は、外向きニック方向性よりも多い数のＤＳＢを生成し得、外向きニック方向性よりも多い量の望まれない挿入及び欠失をもたらし得るが、ニック間の距離の増加が、ＤＳＢ、望まれない欠失、及び／又は望まれない挿入のそうした増加を緩和し得る。一部の実施形態では、第１のニック及び第２のニックが少なくとも閾値距離離れている場合の内向きニック方向性は、第１のニック及び第２のニックが閾値距離未満離れている場合のそれ以外には同様の内向きニック方向性システムと比較して、所望の遺伝子改変システム修飾結果のレベル増加、望まれない欠失のレベル低下、及び／又は望まれない挿入のレベル低下を有する。一部の実施形態では、閾値距離は、以下に与えられる。
一部の実施形態では、第１の鎖ニック及び第２の鎖ニックは、内向き方向性である。一部の実施形態では、第１の鎖ニック及び第２の鎖ニックは、内向き方向性であり、第１の鎖ニック及び第２の鎖ニックは、少なくとも１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３５０、４００、４５０若しくは５００ヌクレオチド離れており、例えば、少なくとも１００ヌクレオチド離れている（及び任意選択で５００、４００、３００、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０若しくは１２０ヌクレオチド以下離れている）。一部の実施形態では、第１の鎖ニック及び第２の鎖ニックは、内向き方向性であり、第１の鎖ニック及び第２の鎖ニックは、１００～２００、１１０～２００、１２０～２００、１３０～２００、１４０～２００、１５０～２００、１６０～２００、１７０～２００、１８０～２００、１９０～２００、１００～１９０、１１０～１９０、１２０～１９０、１３０～１９０、１４０～１９０、１５０～１９０、１６０～１９０、１７０～１９０、１８０～１９０、１００～１８０、１１０～１８０、１２０～１８０、１３０～１８０、１４０～１８０、１５０～１８０、１６０～１８０、１７０～１８０、１００～１７０、１１０～１７０、１２０～１７０、１３０～１７０、１４０～１７０、１５０～１７０、１６０～１７０、１００～１６０、１１０～１６０、１２０～１６０、１３０～１６０、１４０～１６０、１５０～１６０、１００～１５０、１１０～１５０、１２０～１５０、１３０～１５０、１４０～１５０、１００～１４０、１１０～１４０、１２０～１４０、１３０～１４０、１００～１３０、１１０～１３０、１２０～１３０、１００～１２０、１１０～１２０若しくは１００～１１０ヌクレオチド離れている。
化学修飾核酸及び核酸末端の特徴
本明細書に記載される核酸（例えば、鋳型核酸、例えば、鋳型ＲＮＡ；又は遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）；又はｇＲＮＡ）は、非修飾又は修飾核酸塩基を含み得る。天然に存在するＲＮＡは、４つの塩基性リボヌクレオチド：ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＵＴＰ及びＧＴＰから合成されるが、転写後修飾ヌクレオチドを含み得る。更に、ＲＮＡにおいて、約１００の異なるヌクレオシド修飾が同定されている（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．（１９９９）．Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９ ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１９６－１９７）。ＲＮＡは、天然に存在しない、全体的に合成のヌクレオチドも含み得る。
一部の実施形態では、化学修飾は、国際公開第２０１６／１８３４８２号パンフレット、米国特許出願公開第２００９０２８６８５２号明細書、国際特許の国際公開第２０１２／０１９１６８号パンフレット、国際公開第２０１２／０４５０７５号パンフレット、国際公開第２０１２／１３５８０５号パンフレット、国際公開第２０１２／１５８７３６号パンフレット、国際公開第２０１３／０３９８５７号パンフレット、国際公開第２０１３／０３９８６１号パンフレット、国際公開第２０１３／０５２５２３号パンフレット、国際公開第２０１３／０９０６４８号パンフレット、国際公開第２０１３／０９６７０９号パンフレット、国際公開第２０１３／１０１６９０号パンフレット、国際公開第２０１３／１０６４９６号パンフレット、国際公開第２０１３／１３０１６１号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６９号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１７３６号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６７２号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６４号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６５号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６８号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６７１号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６７号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６７０号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６６号パンフレット、国際公開第２０１３／１５１６６３号パンフレット、国際公開第２０１４／０２８４２９号パンフレット、国際公開第２０１４／０８１５０７号パンフレット、国際公開第２０１４／０９３９２４号パンフレット、国際公開第２０１４／０９３５７４号パンフレット、国際公開第２０１４／１１３０８９号パンフレット、国際公開第２０１４／１４４７１１号パンフレット、国際公開第２０１４／１４４７６７号パンフレット、国際公開第２０１４／１４４０３９号パンフレット、国際公開第２０１４／１５２５４０号パンフレット、国際公開第２０１４／１５２０３０号パンフレット、国際公開第２０１４／１５２０３１号パンフレット、国際公開第２０１４／１５２０２７号パンフレット、国際公開第２０１４／１５２２１１号パンフレット、国際公開第２０１４／１５８７９５号パンフレット、国際公開第２０１４／１５９８１３号パンフレット、国際公開第２０１４／１６４２５３号パンフレット、国際公開第２０１５／００６７４７号パンフレット、国際公開第２０１５／０３４９２８号パンフレット、国際公開第２０１５／０３４９２５号パンフレット、国際公開第２０１５／０３８８９２号パンフレット、国際公開第２０１５／０４８７４４号パンフレット、国際公開第２０１５／０５１２１４号パンフレット、国際公開第２０１５／０５１１７３号パンフレット、国際公開第２０１５／０５１１６９号パンフレット、国際公開第２０１５／０５８０６９号パンフレット、国際公開第２０１５／０８５３１８号パンフレット、国際公開第２０１５／０８９５１１号パンフレット、国際公開第２０１５／１０５９２６号パンフレット、国際公開第２０１５／１６４６７４号パンフレット、国際公開第２０１５／１９６１３０号パンフレット、国際公開第２０１５／１９６１２８号パンフレット、国際公開第２０１５／１９６１１８号パンフレット、国際公開第２０１６／０１１２２６号パンフレット、国際公開第２０１６／０１１２２２号パンフレット、国際公開第２０１６／０１１３０６号パンフレット、国際公開第２０１６／０１４８４６号パンフレット、国際公開第２０１６／０２２９１４号パンフレット、国際公開第２０１６／０３６９０２号パンフレット、国際公開第２０１６／０７７１２５号パンフレット、又は国際公開第２０１６／０７７１２３号パンフレット（それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるものである。化学修飾ヌクレオチドのポリヌクレオチドへの組み込みが、ヌクレオチド中の修飾の位置に応じて、核酸塩基、バックボーン、又は両方に組み込まれている修飾を生じ得ることが理解される。一部の実施形態では、バックボーン修飾は、欧州特許第２８１３５７０号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるものである。一部の実施形態では、修飾キャップは、米国特許出願公開第２００５０２８７５３９号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供されるものである。
一部の実施形態では、化学修飾核酸（例えば、ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ）は、ＡＲＣＡ：アンチリバースキャップ類似体（ｍ２７．３’－ＯＧＰ３Ｇ）、ＧＰ３Ｇ（非メチル化キャップ類似体）、ｍ７ＧＰ３Ｇ（モノメチル化キャップ類似体）、ｍ３２．２．７ＧＰ３Ｇ（トリメチル化キャップ類似体）、ｍ５ＣＴＰ（５’－メチル－シチジン三リン酸）、ｍ６ＡＴＰ（Ｎ６－メチル－アデノシン－５’－三リン酸）、ｓ２ＵＴＰ（２－チオ－ウリジン三リン酸）、及びΨ（プソイドウリジン三リン酸）の１つ又は複数を含む。
一部の実施形態では、化学修飾核酸は、５’キャップ、例えば：７－メチルグアノシンキャップ（例えば、Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇキャップ）；過剰メチル化キャップ類似体；ＮＡＤ＋由来のキャップ類似体（例えば、Ｋｉｌｅｄｊｉａｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２８，４５４－４６４（２０１８）に記載のもの）；又は修飾、例えば、ビオチン化されたキャップ類似体（例えば、Ｂｅｄｎａｒｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈｉｌ Ｔｒａｎｓ Ｒ Ｓｏｃ Ｂ ３７３，２０１８０１６７（２０１８）に記載のもの）を含む。
一部の実施形態では、化学修飾核酸は、ポリＡテール；不対の５ヌクレオチドによって隣接された１６ヌクレオチド長のステム－ループ構造（例えば、Ｍａｎｎｉｒｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １７，９１１３－９１２６（１９８９）に記載のもの）；三重らせん構造（例えば、Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ １０９，１９２０２－１９２０７（２０１２）に記載のもの）；ｔＲＮＡ、Ｙ ＲＮＡ若しくはヴォールトＲＮＡ構造（例えば、Ｌａｂｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １８６３，３１２５－３１４７（２０１６）に記載のもの）；１つ又は複数のデオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰｓ）、２’Ｏ－メチル化ＮＴＰ若しくはホスホロチオエート－ＮＴＰの組み込み；単一のヌクレオチド化学修飾（例えば、３’末端リボースの反応性アルデヒドへの酸化とその後のアルデヒド反応性修飾ヌクレオチドのコンジュゲーション）；又は別の核酸分子への化学ライゲーションの１つ又は複数から選択される３’の特徴を含む。
一部の実施形態では、核酸（例えば、鋳型核酸）は、例えば、ジヒドロウリジン、イノシン、７－メチルグアノシン、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、５’リン酸リボチミジン、２’－Ｏ－メチルリボチミジン、２’－Ｏ－エチルリボチミジン、２’－フルオロリボチミジン、Ｃ－５プロピニル－デオキシシチジン（ｐｄＣ）、Ｃ－５プロピニル－デオキシウリジン（ｐｄＵ）、Ｃ－５プロピニル－シチジン（ｐＣ）、Ｃ－５プロピニル－ウリジン（ｐＵ）、５－メチルシチジン、５－メチルウリジン、５－メチルデオキシシチジン、５－メチルデオキシウリジンメトキシ、２，６－ジアミノプリン、５’－ジメトキシトリチル－Ｎ４－エチル－２’－デオキシシチジン、Ｃ－５プロピニル－ｆ－シチジン（ｐｆＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆ－ウリジン（ｐｆＵ）、５－メチルｆ－シチジン、５－メチルｆ－ウリジン、Ｃ－５プロピニル－ｍ－シチジン（ｐｍＣ）、Ｃ－５プロピニル－ｆ－ウリジン（ｐｍＵ）、５－メチルｍ－シチジン、５－メチルｍ－ウリジン、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＭＧＢ（副溝結合剤）プソイドウリジン（Ψ）、１－Ｎ－メチルプソイドウリジン（１－Ｍｅ－Ψ）、又は５－メトキシウリジン（５－ＭＯ－Ｕ）から選択される１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、核酸は、バックボーン修飾、例えば、バックボーン中の糖又はリン酸基に対する修飾を含む。一部の実施形態では、核酸は、核酸塩基修飾を含む。
一部の実施形態では、核酸は、表１３の１つ又は複数の化学修飾ヌクレオチド、表１４の１つ又は複数の化学バックボーン修飾、表１５の１つ又は複数の化学修飾キャップを含む。例えば、一部の実施形態では、核酸は、２つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９又は１０又はそれ以上）の異なるタイプの化学修飾を含む。例として、核酸は、例えば、本明細書に記載の、例えば、表１３中の２つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９又は１０又はそれ以上）の異なるタイプの修飾核酸塩基を含み得る。代替的に又は組み合わせて、核酸は、例えば、本明細書に記載の、例えば、表１４中の２つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９又は１０又はそれ以上）の異なるタイプのバックボーン修飾を含み得る。代替的に又は組み合わせて、核酸は、例えば、本明細書に記載の、例えば、表１５中の１つ又は複数の修飾キャップを含み得る。例えば、一部の実施形態では、核酸は、１つ若しくは複数のタイプの修飾核酸塩基及び１つ若しくは複数のタイプのバックボーン修飾；１つ若しくは複数のタイプの修飾核酸塩基及び１つ若しくは複数の修飾キャップ；１つ若しくは複数のタイプの修飾キャップ及び１つ若しくは複数のタイプのバックボーン修飾；又は１つ若しくは複数のタイプの修飾核酸塩基、１つ若しくは複数のタイプのバックボーン修飾、及び１つ若しくは複数のタイプの修飾キャップを含む。
一部の実施形態では、核酸は、１つ又は複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれ以上）の修飾核酸塩基を含む。一部の実施形態では、核酸の全ての核酸塩基が修飾される。一部の実施形態では、核酸は、バックボーン中の１つ又は複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、又はそれ以上）の位置で修飾される。一部の実施形態では、核酸の全てのバックボーン位置が修飾される。
Figure 2024533312000779
Figure 2024533312000780
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Figure 2024533312000782
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遺伝子改変システムの鋳型を含むヌクレオチドは、天然又は修飾塩基、又はそれらの組合せであり得る。例えば、鋳型は、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、イノシン、７－メチルグアノシン、又は他の修飾塩基を含み得る。一部の実施形態では、鋳型は、ロックド核酸ヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、鋳型中で使用される修飾塩基は、鋳型の逆転写を阻害しない。一部の実施形態では、鋳型中で使用される修飾塩基は、逆転写、例えば、特異性又は忠実度を改善し得る。
一部の実施形態では、システムのＲＮＡ成分（例えば、鋳型ＲＮＡ又はｇＲＮＡ）は、１つ又は複数のヌクレオチド修飾を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡの修飾パターンは、（例えば、Ｆｉｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ ２２（９）：２２２７－２２３５（２０１８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）からの図１Ｄに示される）非修飾又は末端修飾ガイドと比較して、インビボ活性に有意に影響し得る。特定の理論に束縛されることを意図しないが、このプロセスは、少なくとも部分的には、修飾によって付与されるＲＮＡの安定化に起因し得る。こうした修飾の非限定的な例は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－０－（２－メトキシエチル）（２’－０－ＭＯＥ）、２’－フルオロ（２’－Ｆ）、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合、Ｇ－Ｃ置換並びにヌクレオチド間の逆位脱塩基結合及びそれらの均等物を含み得る。
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡ（例えば、標的部位に結合するその１部分）又はガイドＲＮＡは、５’末端領域を含む。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡ又はガイドＲＮＡは、５’末端領域を含まない。一部の実施形態では、５’末端領域は、例えば、Ｂｒｉｎｅｒ ＡＥ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５６：３３３－３３９（２０１４）（全体が参照により本明細書に組み込まれる；例えば、全てのガイドＲＮＡに、本明細書で適用可能）中のｓｇＲＮＡに関する記載のように、ｇＲＮＡスペーサー領域を含む。一部の実施形態では、５’末端領域は、５’末端修飾を含む。一部の実施形態では、５’末端領域は、スペーサー領域と共に又はスペーサー領域なしで、ｃｒＲＮＡ、ｔｒＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ及び／又はｄｇＲＮＡと会合され得る。ｇＲＮＡスペーサー領域は、いくつかの事例では、ガイド領域、ガイドドメイン、又は標的ドメインを含み得る。
一部の実施形態では、本明細書に記載される鋳型ＲＮＡ（例えば、標的部位に結合するその１部分）又はガイドＲＮＡは、国際公開第２０１８１０７０２８Ａ１号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の表４に示される配列のいずれかを含む。一部の実施形態では、配列が、ガイド及び／又はスペーサー領域を示す場合、組成物は、この領域を含んでも又は含まなくてもよい。一部の実施形態では、ガイドＲＮＡは、国際公開第２０１８１０７０２８Ａ１号パンフレットの表４に示される、例えば、その中で配列番号によって同定されたような配列のいずれかの修飾の１つ又は複数を含む。複数の実施形態では、ヌクレオチドは、同じであるか又は異なり得、且つ／又は示される修飾パターンは、国際公開第２０１８１０７０２８Ａ１号パンフレットの表４に示されるようなガイド配列の修飾パターンに対して同一又は類似であり得る。一部の実施形態では、修飾パターンは、ｇＲＮＡの修飾の相対的位置及び同一性又はｇＲＮＡの領域（例えば５’末端領域、より下流のステム領域、バルジ領域、より上流のステム領域、ネクサス領域、ヘアピン１領域、ヘアピン２領域、３’末端領域）を含む。一部の実施形態では、修飾パターンは、国際公開第２０１８１０７０２８Ａ１号パンフレットの表４の配列カラムに示される配列のいずれか１つの、及び／又はその配列の１つ若しくは複数の領域にわたる修飾の少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％を含む。一部の実施形態では、修飾パターンは、国際公開第２０１８１０７０２８Ａ１号パンフレットの表４の配列カラムに示される配列のいずれか１つの修飾パターンと、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である。一部の実施形態では、修飾パターンは、国際公開第２０１８１０７０２８Ａ１号パンフレットの表４に示される配列の１つ又は複数の領域にわたり、例えば、５’末端領域、より下流のステム領域、バルジ領域、より上流のステム領域、ネクサス領域、ヘアピン１領域、ヘアピン２領域、及び／又は３’末端領域において、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である。一部の実施形態では、修飾パターンは、５’末端領域にわたる配列の修飾パターンに対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である。一部の実施形態では、修飾パターンは、より下流のステムにわたり、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である。一部の実施形態では、修飾パターンは、バルジにわたり、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である。一部の実施形態では、修飾パターンは、より上流のステムにわたり、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である。一部の実施形態では、修飾パターンは、ネクサスにわたり、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である。一部の実施形態では、修飾パターンは、ヘアピン１にわたり、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である。一部の実施形態では、修飾パターンは、ヘアピン２にわたり、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である。一部の実施形態では、修飾パターンは、３’末端にわたり、少なくとも５０％、５５％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％同一である。一部の実施形態では、修飾パターンは、国際公開第２０１８１０７０２８Ａ１号パンフレットの表４の配列、又はこうした配列の領域（例えば５’末端、より下流のステム、バルジ、より上流のステム、ネクサス、ヘアピン１、ヘアピン２、３’末端）の修飾パターンと、例えば、０、１、２、３、４、５、６、又はそれ以上のヌクレオチドで異なる。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、国際公開第２０１８１０７０２８Ａ１号パンフレットの表４の配列の修飾と、例えば、０、１、２、３、４、５、６、又はそれ以上のヌクレオチドで異なる修飾を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、国際公開第２０１８１０７０２８Ａ１号パンフレットの表４の配列の領域（例えば５’末端、より下流のステム、バルジ、より上流のステム、ネクサス、ヘアピン１、ヘアピン２、３’末端）の修飾と、例えば、０、１、２、３、４、５、６、又はそれ以上のヌクレオチドで異なる修飾を含む。
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡ（例えば、標的部位に結合するその１部分）又はｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ｍｏｅ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、５’末端修飾、３’末端修飾、又は５’及び３’末端修飾を含む。一部の実施形態では、５’末端修飾は、ヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合を含む。一部の実施形態では、５’末端修飾は、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、及び／又は２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、５’末端修飾は、少なくとも１つのホスホロチオエート（ＰＳ）結合及び２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、及び／又は２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾ヌクレオチドの１つ又は複数を含む。末端修飾は、ホスホロチオエート（ＰＳ）、２’－Ｏ－メチル（２’－Ｏ－Ｍｅ）、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、及び／又は２’－フルオロ（２’－Ｆ）修飾を含み得る。等価な末端修飾も、本明細書に記載される実施形態によって包含される。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡ又はｇＲＮＡは、鋳型ＲＮＡ又はｇＲＮＡの１つ又は複数の領域の修飾と組み合わせた末端修飾を含む。ＲＮＡ、例えば、ｇＲＮＡ、及びその組成式を保護するための更なる例示的な修飾及び方法は、国際公開第２０１８１２６１７６Ａ１号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の鋳型ＲＮＡは、５’末端に３つのホスホロチオエート結合を含み、３’末端に３つのホスホロチオエート結合を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の鋳型ＲＮＡは、５’末端に３つの２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドを含み、３’末端に３つの２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＲＮＡの５’末端の３つのヌクレオチドは２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドであり、鋳型ＲＮＡの５’末端の３つのヌクレオチド間結合はホスホロチオエート結合であり、鋳型ＲＮＡの３’末端の３つのヌクレオチドは２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドであり、鋳型ＲＮＡの３’末端の３つのヌクレオチド間結合はホスホロチオエート結合である。いくつかの実施形態では、鋳型ＲＮＡは、リボヌクレオチドと２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチドの交互のブロック、例えば、１２～２８ヌクレオチド長のブロックを含む。いくつかの実施形態では、鋳型ＲＮＡの中央部分は交互のブロックを含み、５’末端及び３’末端はそれぞれ３つの２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド及び３つのホスホロチオエート結合を含む。
一部の実施形態では、構造－ガイド及び系統学的手法を用いて、例えば、Ｍｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９：２６４１（２０１８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、鋳型ＲＮＡ又はガイドＲＮＡに修飾（例えば、２’－ＯＭｅ－ＲＮＡ、２’－Ｆ－ＲＮＡ、及びＰＳ修飾）を導入する。一部の実施形態では、２’－Ｆ－ＲＮＡの組み込みは、例えば、Ｃ３’－エンド糖パッカリングに最小限に干渉しながら、ＲＮＡ：ＲＮＡ又はＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖の熱安定性及びヌクレアーゼ安定性を増加させる。一部の実施形態では、２’－Ｆは、２’－ＯＨがＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖安定性に重要である場合の位置で２’－ＯＭｅより優れた耐容性を示し得る。一部の実施形態では、ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９活性を低下させない１つ又は複数の修飾、例えば、Ｍｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９：２６４１（２０１８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の補足表１に記載の、例えば、Ｃ１０、Ｃ２０、又はＣ２１（完全に修飾）を含む。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９活性を低下させない１つ又は複数の修飾、例えば、Ｍｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９：２６４１（２０１８）の補足表１のＴ２、Ｔ６、Ｔ７、又はＴ８（完全に修飾）を含む。一部の実施形態では、（例えば、本明細書に記載されるような）１つ又は複数の修飾を含むｃｒＲＮＡは、１つ又は複数の修飾、例えば、Ｃ２０及びＴ２を含むｔｒａｃｒＲＮＡと対合され得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡのキメラを含む（例えば、Ｊｉｎｅｋ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７（６０９６）：８１６－８２１（２０１２））。複数の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの修飾は、例えば、安定性が増強された修飾ｇＲＮＡを作製するため、単一ガイドキメラ上にマッピングされる。
一部の実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、天然に存在する構成成分、例えば、ヘアピンの付加又はサブトラクションによって修飾され得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、例えば、国際公開第２０１８１０６７２７号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のように、１つ又は複数の３’ヘアピン要素が欠失されたｇＲＮＡを含み得る。一部の実施形態では、ｇＲＮＡは、付加されたヘアピン構造、例えば、Ｋｏｃａｋ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３７（６）：６５７－６６６（２０１９）の教示内容中でＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムの特異性を増加させることが示された、スペーサー領域内に付加されたヘアピン構造を含有し得る。短縮されたｇＲＮＡ及びインビボ活性を改善する特定の修飾の例を含む更なる修飾は、米国特許出願公開第２０１９０３１６１２１号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見出すことができる。
一部の実施形態では、構造－ガイド及び系統学的手法（例えば、Ｍｉｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ９：２６４１（２０１８）に記載のとおり；全体が参照により本明細書に組み込まれる）を用いて、鋳型ＲＮＡに対する修飾を見出す。複数の実施形態では、その修飾は、鋳型ＲＮＡのガイド領域の包含又は除外によって同定される。一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡに結合されたポリペプチドの構造を用いて、ＲＮＡの非タンパク質と接触したヌクレオチドを判定し、次に、例えば、ＲＮＡとポリペプチドとの会合を破壊するリスクがより低い修飾について選択することができる。更に、鋳型ＲＮＡ中の二次構造は、ソフトウェアツール、例えば、ｒｎａ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅＷｅｂで利用可能なＲＮＡ構造ツールによってインシリコで予測し（Ｂｅｌｌａｏｕｓｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４１：Ｗ４７１－Ｗ４７４（２０１３）；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、例えば、修飾、例えば、ヘアピン、ステム、及び／又はバルジを選択するための二次構造を決定することが可能である。
組成物及びシステムの作製
当業者に理解されるように、核酸構築物及びタンパク質又はポリペプチド（本明細書に記載されるシステム、構築物及びポリペプチドなど）を設計及び構築する方法は、当技術分野において常用的である。一般に、組換え法が使用され得る。概略については、Ｓｍａｌｅｓ ＆ Ｊａｍｅｓ（Ｅｄｓ．）、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２００５）；及びＣｒｏｍｍｅｌｉｎ，Ｓｉｎｄｅｌａｒ ＆ Ｍｅｉｂｏｈｍ（Ｅｄｓ．），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１３）を参照されたい。核酸組成物を設計、調製、評価、精製及び操作する方法は、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ（Ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に記載されている。
本開示は、部分的に、本明細書に記載される遺伝子改変ポリペプチド、本明細書に記載される鋳型核酸、又は両方をコードする核酸、例えば、ベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、選択マーカ、例えば、抗生物質耐性マーカを含む。一部の実施形態では、抗生物質耐性マーカは、カナマイシン耐性マーカである。一部の実施形態では、抗生物質耐性マーカは、βラクタム抗生物質に耐性を付与しない。一部の実施形態では、ベクターは、アンピシリン耐性マーカを含まない。一部の実施形態では、ベクターは、カナマイシン耐性マーカを含み、アンピシリン耐性マーカを含まない。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードするベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれる（例えば、標的細胞、組織、器官、又は対象への投与時に）。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドをコードするベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれない（例えば、標的細胞、組織、器官、又は対象への投与時に）。一部の実施形態では、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）をコードするベクターは、標的細胞ゲノムに組み込まれない（例えば、標的細胞、組織、器官、又は対象への投与時に）。一部の実施形態では、ベクターが、標的細胞ゲノム中の標的部位に組み込まれる場合、選択マーカは、ゲノムに組み込まれない。一部の実施形態では、ベクターが、標的細胞ゲノム中の標的部位に組み込まれる場合、ベクターの維持に関与する遺伝子又は配列（例えば、プラスミド維持遺伝子）は、ゲノムに組み込まれない。一部の実施形態では、ベクターが、標的細胞ゲノム中の標的部位に組み込まれる場合、移入調節配列（例えば、ＡＡＶ由来の、例えば、逆位末端配列）は、ゲノムに組み込まれない。一部の実施形態では、ベクター（例えば、本明細書に記載される遺伝子改変ポリペプチド、本明細書に記載される鋳型核酸、又はその両方をコードする）を標的細胞、組織、器官、又は対象へ投与することにより、前記標的細胞、組織、器官、又は対象のゲノム中の１つ若しくは複数の標的部位へのベクターの１部分の組み込みが起こる。一部の実施形態では、組み込まれた物質を含む標的部位の９９、９５、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２若しくは１％未満（例えば、標的部位なし）は、ベクター由来の、選択マーカ（例えば、抗生物質耐性遺伝子）、移入調節配列（例えば、ＡＡＶ由来の、例えば、逆位末端配列）、又は両方を含む。
本明細書に記載される医薬用タンパク質又はポリペプチドを生産する例示的な方法は、哺乳動物細胞での発現を含むが、適切なプロモータの制御下の昆虫細胞、酵母、細菌、又は他の細胞を用いて、組換えタンパク質を生産することもできる。哺乳動物発現ベクターは、非転写因子、例えば、複製起点、好適なプロモータ、並びに他の５’若しくは３’フランキング非転写配列、並びに５’若しくは３’非翻訳配列、例えば必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライスドナー及びアクセプター部位並びに終結配列を含み得る。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮＡ配列、例えばＳＶ４０オリジン、アーリープロモータ、スプライス、及びポリアデニル化部位を使用して、異種ＤＮＡ配列の発現に必要な他の遺伝因子を提供することができる。細菌、真菌、酵母、及び哺乳動物細胞宿主での使用に適切なクローニング及び発現ベクターは、Ｇｒｅｅｎ ＆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２０１２）に記載されている。
様々な哺乳動物細胞培養システムを使用して、組換えタンパク質を発現させ、製造することができる。哺乳動物発現システムの例として、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬＡ、及びＢＨＫ細胞株が挙げられる。タンパク質治療薬生産のための宿主細胞培養方法は、Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ（Ｅｄｓ．），Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２０１４）に記載されている。本明細書に記載される組成物は、組換えタンパク質をコードするベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクターを含み得る。一部の実施形態では、ベクター、例えば、ウイルスベクターは、組換えタンパク質をコードする核酸を含み得る。
タンパク質治療薬の精製は、Ｆｒａｎｋｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＣｕｔｌｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されている。
本開示は、遺伝子改変ポリペプチド及び／又はゲノム標的部位に対する特異性を有する鋳型核酸分子（例えば、鋳型ＲＮＡ）の作製のための組成物及び方法も提供する。一態様では、本方法は、上流の相同性セグメント、異種目的配列セグメント、遺伝子改変ポリペプチド結合モチーフ、及びｇＲＮＡセグメントを含むＲＮＡセグメントの作製を含む。
治療用途
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変システムを用いて、細胞（例えば、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞）を修飾することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変システムを用いて、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）を修飾することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変システムを用いて、家畜動物（例えば、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ラマ、アルパカ、ラクダ、ヤク、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、又はダチョウ）由来の細胞を修飾することができる。一部の実施形態では、例えば、動物細胞、例えば、哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）、植物細胞、又は真菌細胞を修飾するために、本明細書に記載される遺伝子改変システムを、実験ツール若しくは研究ツールとして使用するか、又は実験方法若しくは研究方法に使用することができる。
コーディング遺伝子をＲＮＡ配列鋳型に組み込むことにより、例えば、機能喪失型変異を有する個体において治療導入遺伝子の発現を提供することにより、機能獲得型変異を正常な導入遺伝子で置換することにより、機能獲得型変異発現を排除するために調節配列を提供することにより、及び／又は作動可能に連結された遺伝子、導入遺伝子及びそのシステムの発現を制御することにより、遺伝子改変システムは、治療ニーズに対処することができる。特定の実施形態では、ＲＮＡ配列鋳型は、宿主細胞の治療ニーズに特異的なプロモータ領域、例えば組織特異的プロモータ又はエンハンサーをコードする。更に他の実施形態では、プロモータは、コーディング配列と作動可能に連結させることができる。
従って、本明細書では、それを必要とする対象におけるアルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）を処置するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、処置により、ＡＡＴＤに関連する１つ以上の症状が緩和される。
いくつかの実施形態では、本明細書のシステムは、Ｅ３４２に変異（例えば、Ｅ３４２Ｋ）を有する対象を処置するために使用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるシステムによる処置により、細胞の約３０～１００％（例えば、約３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、９０～１００％、又は約５０％）でＥ３４２Ｋ変異が修正される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるシステムによる処置により、処置された細胞から単離されたＤＮＡの約３０～６０％（例えば、約３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、又は約５０％）でＥ３４２Ｋ変異が修正される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変システムによる処置は、本明細書に記載の遺伝子改変システムで処置されていないＡＡＴＤを有する対象と比較した、
（ａ）α－１アンチトリプシン（ＡＡＴ）活性及び／又は機能の増加；
（ｂ）循環ＡＡＴのレベルの増加；
（ｃ）プロテアーゼ誘発性肺損傷及び／又は炎症の減少（例えば、下気道の結合組織（例えば肺胞内層）のプロテアーゼ消化の減少）；
（ｄ）肝細胞内の、蓄積した重合Ｚ－ＡＡＴタンパク質の減少；
（ｅ）ＡＡＴ誘発性肝細胞毒性の減少；
（ｆ）細胞ストレス、炎症、線維症、肝硬変、肝細胞癌（ＨＣＣ）、及び／又は新生児肝疾患の減少；
（ｇ）肺機能の増加（例えば、肺の弾力性の増加）；及び／又は
（ｈ）肺気腫に伴う症状の減少
の１つ以上を生じる。
投与及び送達
本明細書に記載される組成物及びシステムは、インビトロ又はインビボで使用され得る。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、例えば、インビトロ又はインビボで細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）に送達される。一部の実施形態では、細胞は、真核細胞、例えば、多細胞生物、例えば、動物、例えば、哺乳動物（例えば、ヒト、ブタ、ウシ）、鳥類（例えば、家禽類、例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、又はアヒル）、又は魚類の細胞である。一部の実施形態では、細胞は、非ヒト動物細胞（例えば、実験動物、家畜動物、又はコンパニオンアニマル）である。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞（例えば、造血幹細胞）、線維芽細胞、又はＴ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、Ｔｒｅｇ、ＣＤ４、ＣＤ８、γδ、又はメモリーＴ細胞）、Ｂ細胞（例えば、メモリーＢ細胞又は形質細胞）、又はＮＫ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、非分裂細胞、例えば、非分裂線維芽細胞又は非分裂Ｔ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＨＳＣであり、ｐ５３は上方制御されないか、又は例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４８６０７号明細書の実施例３０に記載の方法に従って決定されるように、１０％、５％、２％、又は１％未満上方制御される。当業者は、遺伝子改変システムの成分が、ポリペプチド、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、及びそれらの組合せの形態で送達され得ることが理解されるであろう。
一実施形態では、システム及び／又はシステムの成分は、核酸として送達される。例えば、遺伝子改変ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はＲＮＡの形態で送達され得、鋳型ＲＮＡは、ＲＮＡ又はＲＮＡに転写されるその相補的ＤＮＡの形態で送達され得る。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、１、２、３、４、又はそれ以上の個別の核酸分子上で送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ＤＮＡ及びＲＮＡの組合せとして送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ＤＮＡ及びタンパク質の組合せとして送達される。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ＲＮＡ及びタンパク質の組合せとして送達される。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、タンパク質として送達される。
一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ベクターを用いて、細胞、例えば哺乳動物細胞又はヒト細胞に送達される。ベクターは、例えば、プラスミド又はウイルスであり得る。一部の実施形態では、送達は、インビボ、インビトロ、エクスビボ、又はインサイチュである。一部の実施形態では、ウイルスは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、又はアデノウイルスである。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、ウイルス様粒子又はビロソームを用いて細胞に送達される。一部の実施形態では、送達は、２つ以上のウイルス、ウイルス様粒子又はビロソームを使用する。
一実施形態では、本明細書に記載される組成物及びシステムは、リポソーム又は他の類似の小胞中に製剤化することができる。リポソームは、内部水性コンパートメントを取り囲む単層又は多重層脂質二重膜と、及び比較的不透過性の外側親油性リン脂質二重膜から構成される球状の小胞構造である。リポソームは、アニオン性、中性又はカチオン性であり得る。リポソームは、生体適合性、非毒性であり、親水性及び親油性薬物分子の両方を送達し、それらのカーゴをプラズマ酵素による分解から保護すると共に、それらのロードを生体膜及び血液脳関門（ＢＢＢ）を介して輸送することができる（例えば、論評については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。
小胞は、いくつかの異なるタイプの脂質から製造することができるが；薬物担体としてリポソームを作製するためにはリン脂質が最も一般的に使用される。多重層小胞脂質の調製方法は、当技術分野で公知である（例えば、米国特許第６，６９３，０８６号明細書を参照、多重層小胞脂質の調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。脂質膜を水溶液と混合すれば、小胞形成は自然に起こり得るが、ホモジナイザー、超音波発生装置、又は押出機を用いて振盪の形態で力を加えることにより、それを促進することもできる（例えば、論評については、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９を参照）。押出脂質は、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ，１５：６４７－６５２，１９９７（押出脂質調製に関するその教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、サイズ漸減フィルターを介した押出により調製することができる。
リポソーム、脂質ナノ粒子、カチオン性脂質ナノ粒子、イオン化可能な脂質ナノ粒子、ポリマーナノ粒子、金ナノ粒子、デンドリマー、シクロデキストリンナノ粒子、ミセル、又は前述の組み合わせなどの、様々なナノ粒子を送達に使用できる。
脂質ナノ粒子は、本明細書に記載される医薬組成物のための生体適合性及び生分解性送達系を提供する担体の一例である。ナノ構造脂質担体（ＮＬＣ）は、ＳＬＮの特徴を保持し、薬物安定性及び負荷容量を向上させると共に、薬物漏出を防ぐ、修飾固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）である。ポリマーナノ粒子（ＰＮＰ）は、薬物送達の重要な成分である。これらのナノ粒子は、特定の標的に対して薬物送達を効果的に指向し、薬物安定性及び薬物放出制御を改善することができる。脂質－ポリマーナノ粒子（ＰＬＮ）、すなわちリポソーム及びポリマーを組み合わせたタイプの担体も使用し得る。これらのナノ粒子は、ＰＮＰ及びリポソームの相補的利点を有する。ＰＬＮは、コア－シェル構造から構成され；ポリマーコアは、安定した構造を提供し、リン脂質シェルは良好な生体適合性を賦与する。このように、２つの成分は、薬物封入効率を高め、表面修飾を促進すると共に、水溶性薬物の漏出を防ぐ。例えば、論評については、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．２０１７，Ｎａｎｏｍａｔｅｒｉａｌｓ ７，１２２；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｎａｎｏ７０６０１２２を参照されたい。
本明細書に記載される組成物及びシステム用の薬物送達ビヒクルとしてエクソソームを使用することもできる。論評については、Ｈａ ｅｔ ａｌ．Ｊｕｌｙ ２０１６．Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ Ｂ．Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｉｓｓｕｅ ４，Ｐａｇｅｓ ２８７－２９６；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ａｐｓｂ．２０１６．０２．００１を参照されたい。
フソソームは、標的細胞と相互作用して、それと融合することから、様々な分子の送達ビヒクルとして用いることができる。フソソームは、一般に、管腔又は空洞を封入する両親媒性脂質の二重層及び両親媒性脂質二重層と相互作用するフソゲンからなる。フソゲン成分は、融合及びペイロード送達のための標的細胞特異性を付与し、プログラム可能な細胞特異性を備える送達ビヒクルの作製を可能にするために操作可能であることが示されている（例えば国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットを参照されたい。フソソーム設計、調製、及び使用に関するその教示は、参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、遺伝子改変システムのタンパク質成分は、鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）と事前に結合され得る。例えば、一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドを初めに鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）と組み合わせて、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成し得る。一部の実施形態では、ＲＮＰは、例えば、トランスフェクション、ヌクレオフェクション、ウイルス、小胞、ＬＮＰ、エクソソーム、フソソームを介して、細胞に送達され得る。
遺伝子改変システムは、細胞、組織及び多細胞生物に導入され得る。一部の実施形態では、システム又はシステムの成分は、機械的手段又は物理的手段を用いて、細胞に送達される。
タンパク質治療薬の製剤化は、Ｍｅｙｅｒ（Ｅｄ．），Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ：Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ ｔｏ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ ｔｈｅ Ｃｌｉｎｉｃ，Ｗｏｏｄｈｅａｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｓｅｒｉｅｓ（２０１２）に記載されている。
組織特異的活性／投与
一部の実施形態では、本明細書に記載されるシステムは、オフターゲット細胞又は組織において活性を制限するために、１つ又は複数の特徴（例えば、プロモータ又はｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位）を利用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、プロモータ配列、例えば、組織特異的プロモータ配列を含む。一部の実施形態では、組織特異的プロモータを用いて、遺伝子改変システムの標的細胞特異性を増加させる。例えば、プロモータは、標的細胞型において活性があるが、非標的細胞型において活性がない（又はより低いレベルで活性がある）ことに基づいて選択され得る。従って、プロモータが非標的細胞のゲノムに組み込まれても、それは、組み込まれた遺伝子の発現を駆動することはない（又は低レベルの発現を駆動するに過ぎない）。更に、鋳型ＲＮＡ中に組織特異的プロモータ配列を有するシステムは、例えば、本明細書に記載のように、例えば、鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変タンパク質をコードする核酸において、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位と組み合わせて使用され得る。鋳型ＲＮＡ中に組織特異的プロモータ配列を有するシステムは、例えば、標的細胞内で、非標的細胞内よりも高いレベルの遺伝子改変タンパク質を得るため、組織特異的プロモータによって駆動される、遺伝子改変ポリペプチドをコードするＤＮＡと組み合わせても使用され得る。一部の実施形態では、例えば、肝臓の適応症の場合、組織特異的プロモータは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０２００１４２０９号パンフレットの表３から選択される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を含む。一部の実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を用いて、遺伝子改変システムの標的細胞特異性を増加させる。例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位は、非標的細胞型内に存在するが、標的細胞型内に存在しない（又は非標的細胞と比較して低下したレベルで存在する）ｍｉＲＮＡによって認識されることに基づいて選択され得る。従って、鋳型ＲＮＡが非標的細胞内に存在する場合、それはｍｉＲＮＡによって結合されることになり、鋳型ＲＮＡが標的細胞内に存在する場合、それはｍｉＲＮＡによって結合されない（又は専ら非標的細胞と比較して低下したレベルで結合される）ことになる。特定の理論に束縛されることを意図しないが、ｍｉＲＮＡの鋳型ＲＮＡへの結合は、その活性に干渉することがあり、例えば、異種目的配列のゲノムへの挿入に干渉することがある。従って、このシステムであれば、標的細胞のゲノムを、それが非標的細胞のゲノムを編集する場合よりも効率的に編集することになり、例えば、異種目的配列であれば、標的細胞のゲノムに、非標的細胞のゲノムに挿入されるよりも効率的に挿入されることになり、又は挿入若しくは欠失は、標的細胞において、非標的細胞におけるよりも効率的に生成される。更に、鋳型ＲＮＡ（又はそれをコードするＤＮＡ）中にｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位を有するシステムは、遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸と組み合わせて使用され得、ここで、遺伝子改変ポリペプチドの発現は、例えば、本明細書に記載されるように、第２のｍｉｃｒｏＲＮＡ結合部位によって調節される。一部の実施形態では、例えば、肝臓の適応症の場合、ｍｉＲＮＡは、国際公開第２０２００１４２０９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の表４から選択される。
一部の実施形態では、鋳型ＲＮＡは、ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列、ｓｉＲＮＡ配列、ガイドＲＮＡ配列、又はｐｉｗｉ ＲＮＡ配列を含む。
プロモータ
一部の実施形態では、１つ若しくは複数のプロモータ又はエンハンサーを、遺伝子改変タンパク質をコードする核酸、又は例えば、異種目的配列の発現を制御する鋳型核酸と作動可能に連結する。特定の実施形態では、１つ若しくは複数のプロモータ又はエンハンサーは、細胞型若しくは組織特異的エレメントを含む。一部の実施形態では、プロモータ又はエンハンサーは、同じであるか、又は異種目的配列の発現を天然で制御するプロモータ若しくはエンハンサーに由来する。例えば、オルニチントランスカルボミラーゼプロモータ及びエンハンサーを用いて、オルニチントランスカルボミラーゼ欠失を補正するために本発明により提供されるシステム若しくは方法におけるオルニチントランスカルボミラーゼ遺伝子の発現を制御することができる。一部の実施形態では、プロモータは、表１６又は１７のプロモータ又はその機能性断片若しくは変異体である。
市販されている例示的な組織特異的プロモータは、例えば、ＵＲＬ（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｔｉｓｓｕｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ－ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ）に見出すことができる。一部の実施形態では、プロモータは、ネイティブプロモータ又は最小プロモータ（例えば、所与の遺伝子の５’領域からの単一断片から構成されるもの）である。一部の実施形態では、ネイティブプロモータは、コアプロモータとその天然の５’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、５’ＵＴＲは、イントロンを含む。他の実施形態では、これらは、起源の異なるプロモータを組み合わせるか、又は同じ起源の最小プロモータと共に遠位エンハンサーをアセンブリングすることにより作製された複合プロモータを含む。
例示的な細胞又は組織特異的プロモータを以下の表に記載し、それらをコードする例示的な核酸は、当技術分野で公知であり、様々なリソース、例えば、ＲｅｆＳｅｑ．を含むＮＣＢＩデータベース並びにＥｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ（／／ｅｐｄ．ｅｐｆｌ．ｃｈ／／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ）を用いて、容易に入手することができる。
Figure 2024533312000784
Figure 2024533312000785
Figure 2024533312000786
Figure 2024533312000787
使用される宿主／ベクターシステムに応じて、構成性及び誘導性プロモータ、転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含め、いくつかの好適な転写及び翻訳制御エレメントのいずれも発現ベクターに使用し得る（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１５３：５１６－５４４を参照されたい；尚、その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）。
一部の実施形態では、遺伝子改変タンパク質をコードする核酸又は鋳型核酸は、制御エレメント、例えば、プロモータなどの転写制御エレメントと作動可能に連結される。転写制御エレメントは、一部の実施形態では、真核生物細胞、例えば、哺乳動物細胞；又は原核生物細胞（例えば、細菌若しくは古細菌細胞）のいずれかで機能性であり得る。一部の実施形態では、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、例えば、原核生物細胞及び真核生物細胞の両方でポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を可能にする、複数の制御エレメントと作動可能に連結される。
例示の目的のために、空間限定プロモータの例として、限定されないが、ニューロン特異的プロモータ、脂肪細胞特異的プロモータ、心筋細胞特異的プロモータ、平滑筋特異的プロモータ、光受容体特異的プロモータなどが挙げられる。ニューロン特異的空間限定プロモータとして、限定されないが、以下のものが挙げられる：ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータ（例えば、ＥＭＢＬ ＨＳＥＮＯ２，Ｘ５１９５６を参照）；芳香族アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモータ、ニューロフィラメントプロモータ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＮＦＬ，Ｌ０４１４７を参照）；シナプシンプロモータ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ ＨＵＭＳＹＮＩＢ，Ｍ５５３０１を参照）；ｔｈｙ－１プロモータ（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ ５１：７－１９；及びＬｌｅｗｅｌｌｙｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１６（１０）：１１６１－１１６６を参照）；セロトニン受容体プロモータ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ Ｓ６２２８３を参照）；チロシンヒドロキシラーゼプロモータ（ＴＨ）（例えば、Ｏｈ ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １６：４３７；Ｓａｓａｏｋａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１６：２７４；Ｂｏｕｎｄｙ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１８：９９８９；及びＫａｎｅｄａ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｎｅｕｒｏｎ ６：５８３－５９４を参照）；ＧｎＲＨプロモータ（例えば、Ｒａｄｏｖｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：３４０２－３４０６を参照）；Ｌ７プロモータ（例えば、Ｏｂｅｒｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４８：２２３－２２６を参照）；ＤＮＭＴプロモータ（例えば、Ｂａｒｔｇｅ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：３６４８－３６５２を参照）；エンケファリンプロモータ（例えば、Ｃｏｍｂ ｅｔ ａｌ．（１９８８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３７９３－３８０５を参照）；ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモータ；Ｃａ２＋カルモジュリン依存性タンパク質キナーゼＩＩ－α（ＣａｍＫＩＩα）プロモータ（例えば、Ｍａｙｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９３：１３２５０；及びＣａｓａｎｏｖａ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｇｅｎｅｓｉｓ ３１：３７を参照）；ＣＭＶエンハンサー／血小板由来成長因子－βプロモータ（例えば、Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １１：５２－６０を参照）；など。
脂肪細胞特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる：ａＰ２遺伝子プロモータ／エンハンサー、例えば、ヒトａＰ２遺伝子の－５．４ｋｂから＋２１ｂｐまでの領域（例えば、Ｔｏｚｚｏ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３８：１６０４；Ｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：９５９０；及びＰａｖｊａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：７９７を参照）；グルコーストランスポーター－４（ＧＬＵＴ４）プロモータ（例えば、Ｋｎｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １００：１４７２５を参照）；脂肪酸トランスロカーゼ（ＦＡＴ／ＣＤ３６）プロモータ（例えば、Ｋｕｒｉｋｉ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２５：１４７６；及びＳａｔｏ ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：１５７０３を参照）；ステアロイル－ＣｏＡデサチュラーゼ－１（ＳＣＤ１）プロモータ（Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２０６０３）；レプチンプロモータ（例えば、Ｍａｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１３９：１０１３；及びＣｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．２６２：１８７を参照）；アジドネクチンプロモータ（例えば、Ｋｉｔａ ｅｔ ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３３１：４８４；及びＣｈａｋｒａｂａｒｔｉ （２０１０）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１５１：２４０８を参照）；アジプシンプロモータ（例えば、Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：７４９０を参照）；レジスチンプロモータ（例えば、Ｓｅｏ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌｅｃ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１７：１５２２を参照）；など。
心筋細胞特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下の遺伝子；ミオシン軽鎖－２、α－ミオシン重鎖、ＡＥ３、心臓トロポニンＣ、心臓アクチンなどに由来する制御配列が挙げられる。Ｆｒａｎｚ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３５：５６０－５６６；Ｒｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７５２：４９２－５０５；Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６：５８４－５９１；Ｐａｒｍａｃｅｋ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：１８７０－１８８５；Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２２：６０８－６１７；及びＳａｒｔｏｒｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４０４７－４０５１。
平滑筋細胞特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる：ＳＭ２２αプロモータ（例えば、Ａｋｙｕｅｒｅｋ ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．６：９８３；及び米国特許第７，１６９，８７４号明細書を参照）；スムーセリンプロモータ（例えば、国際公開第２００１／０１８０４８号パンフレットを参照）；α－平滑筋アクチンプロモータ；など。例えば、ＳＭ２２αプロモータの０．４ｋｂ領域（その内部に２つのＣＡｒＧエレメントが位置する）は、血管の平滑筋細胞特異的発現を媒介することが明らかにされている（例えば、Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１７，２２６６－２２７８；Ｌｉ，ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３２ ８４９－８５９；及びＭｏｅｓｓｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２２，２４１５－２４２５を参照）。
光受容体特異的空間限定プロモータとしては、限定されないが、以下のものが挙げられる：ロドプシンキナーゼプロモータ（Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：４０７６）；βホスホジエステラーゼ遺伝子プロモータ（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ．９：１０１５）；網膜色素変性遺伝子プロモータ（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）前掲）；光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Ｎｉｃｏｕｄ ｅｔ ａｌ．（２００７）前掲）；ＩＲＢＰ遺伝子プロモータ（Ｙｏｋｏｙａｍａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｅｘｐ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．５５：２２５）；など。
一部の実施形態では、遺伝子改変システム、例えば、遺伝子改変ポリペプチドをコードするＤＮＡ、鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ又は異種目的配列をコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡは、１つ又は複数のエレメントが、組織特異的プロモータ、例えば、Ｔ細胞内で活性があるプロモータに作動可能に連結されるように設計される。更なる実施形態では、Ｔ細胞活性プロモータは、他の細胞型、例えば、Ｂ細胞、ＮＫ細胞において不活性である。一部の実施形態では、Ｔ細胞活性プロモータは、Ｔ細胞受容体の成分、例えば、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＴＲＧＣ、ＴＲＤＣをコードする遺伝子についてのプロモータに由来する。一部の実施形態では、Ｔ細胞活性プロモータは、分化タンパク質のＴ細胞特異的クラスターの成分、例えば、ＣＤ３、例えば、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚをコードする遺伝子についてのプロモータに由来する。一部の実施形態では、遺伝子改変システムにおけるＴ細胞特異的プロモータは、公的に利用可能な遺伝子発現データを細胞型にわたって比較し、Ｔ細胞内での発現が増強された遺伝子からプロモータを選択することによって発見される。一部の実施形態では、プロモータは、所望の発現幅に応じて選択され得、例えば、Ｔ細胞のみにおいて活性があるプロモータ、ＮＫ細胞のみにおいて活性があるプロモータ、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の両方において活性があるプロモータである。
当技術分野で公知の細胞特異的プロモータを用いて、例えば、本明細書に記載される遺伝子改変タンパク質の発現を指令することができる。非限定的な例示的哺乳動物細胞特異的プロモータは、特性決定されており、細胞特異的にＣｒｅリコンビナーゼを発現するマウスに使用されている。いくつかの非限定的な例示的哺乳動物細胞特異的プロモータは、米国特許第９８４５４８１号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）の表１に列挙されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるベクターは、発現カセットを含む。典型的に、発現カセットは、プロモータ配列と作動可能に連結した本発明の核酸分子を含む。例えば、プロモータは、それが、コーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる場合、コーディング配列と作動可能に連結している（例えば、コーディング配列は、プロモータの転写制御下にある）。コーディング配列は、センス又はアンチセンス配向で調節配列と作動可能に連結することができる。特定の実施形態では、プロモータは、異種プロモータである。特定の実施形態では、発現カセットは、別のエレメント、例えば、イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化部位、ウッドチャック（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ）応答エレメント（ＷＲＥ）、及び／又はコーディング配列の発現レベルに影響を及ぼすことがわかっている他のエレメントを含み得る。プロモータは、典型的に、コーディング配列又は機能性ＲＮＡの発現を制御する。特定の実施形態では、プロモータ配列は、近位及びより遠位の上流エレメントを含み、更にエンハンサーエレメントも含み得る。エンハンサーは、典型的に、プロモータ活性を刺激することができ、プロモータの天然のエレメントであり得るか、又はプロモータのレベル若しくは組織特異性を増強するために挿入された異種エレメントであり得る。特定の実施形態では、プロモータは、その全体がネイティブ遺伝子に由来する。特定の実施形態では、プロモータは、天然に存在する異なるプロモータ由来の様々なエレメントから構成される。特定の実施形態では、プロモータは、合成ヌクレオチド配列を含む。当業者であれば、種々のプロモータが、様々な組織若しくは細胞型において、又は様々な発生段階において、又は様々な環境条件又は薬剤若しくは転写補因子の存在若しくは非存在に応答して、遺伝子の発現を指令し得ることが理解されるであろう。ユビキタス、細胞型特異的、組織特異的、発生段階特異的、及び条件的プロモータ、例えば、薬剤応答性プロモータ（例えばテトラサイクリン応答性プロモータ）は、当業者に周知である。例示的なプロモータとして、限定されないが、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＫＧ）プロモータ、ＣＡＧ（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβアクチンプロモータ（ＣＢＡ）及びウサギβグロビンイントロンの複合物）、ＮＳＥ（ニューロン特異的エノラーゼ）、シナプシン若しくはＮｅｕＮプロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルスＬＴＲプロモータ；アデノウイルス主要後期プロモータ（Ａｄ ＭＬＰ）、単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ ｓｉｍｐｌｅｘ ｖｉｒｕｓ）（ＨＳＶ）プロモータ、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）プロモータ、例えば、ＣＭＶ最初期プロモータ領域（ＣＭＶＩＥ）、ＳＦＦＶプロモータ、ラウス肉腫ウイルス（ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）プロモータ、合成プロモータ、ハイブリダイゼーションプロモータなどが挙げられる。他のプロモータは、ヒト由来又はマウスをはじめとする他の種由来のものであり得る。一般的なプロモータとしては、例えば、ヒトサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモータ、ＳＶ４０初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルス（Ｒｏｕｓ ｓａｒｃｏｍａ ｖｉｒｕｓ）の長い末端反復、［β］－アクチン、ラットインスリンプロモータ、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモータ、ヒトα－１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモータ、トランスサイレチンプロモータ、ＴＢＧプロモータ及び他の肝臓特異的プロモータ、デスミンプロモータ及び類似の筋肉特異的プロモータ、ＥＦ１－α－プロモータ、多組織特異性を備えるハイブリッドプロモータ、シナプシン及びグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼプロモータのようなニューロン特異的プロモータが挙げられ、これらは、全て当業者に周知であり、容易に入手可能であり、目的のコーディング配列の高レベルの発現を達成するために使用することができる。加えて、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子由来の配列も本発明において有用であろう。こうしたプロモータ配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されている。更に別の例示的なプロモータ配列は、例えば、国際公開第２０１８２１３７８６Ａ１号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
一部の実施形態では、例えば、肝臓での発現を駆動するために、アポリポタンパク質Ｅエンハンサー（ＡｐｏＥ）又はその機能性断片を使用する。一部の実施形態では、ＡｐｏＥエンハンサー又はその機能性断片の２コピーを使用する。一部の実施形態では、ＡｐｏＥエンハンサー又はその機能性断片をプロモータ、例えば、ヒトα－１アンチトリプシン（ｈＡＡＴ）プロモータと組み合わせて使用する。
一部の実施形態では、調節配列は、組織特異的遺伝子発現能力を付与する。いくつかのケースでは、組織特異的調節配列は、組織特異的に転写を誘導する組織特異的転写因子に結合する。様々な組織特異的調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサーなど）が当技術分野で公知である。例示的な組織特異的調節配列として、限定されないが、以下の組織特異的プロモータが挙げられる：肝臓特異的チロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモータ、インスリンプロモータ、グルカゴンプロモータ、ソマトスタチンプロモータ、膵ポリペプチド（ＰＰＹ）プロモータ、シナプシン－１（Ｓｙｎ）プロモータ、クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ、哺乳動物デスミン（ＤＥＳ）プロモータ、α－ミオシン重鎖（ａ－ＭＨＣ）プロモータ、又は心臓トロポニンＴ（ｃＴｎＴ）プロモータ。他の例示的なプロモータとしては、β－アクチンプロモータ、Ｂ型肝炎ウイルスコアプロモータ、Ｓａｎｄｉｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，３：１００２－９（１９９６）；α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）プロモータ、Ａｒｂｕｔｈｎｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，７：１５０３－１４（１９９６））、骨オステオカルシンプロモータ（Ｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐ．，２４：１８５－９６（１９９７））；骨シアロタンパク質プロモータ（Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｏｎｅ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．，１１：６５４－６４（１９９６））、ＣＤ２プロモータ（Ｈａｎｓａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１：１０６３－８（１９９８）；免疫グロブリン重鎖プロモータ；Ｔ細胞受容体α－鎖プロモータ、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモータなどのニューロンプロモータ（Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１３：５０３－１５（１９９３））、ニューロフィラメント軽鎖遺伝子プロモータ（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：５６１１－５（１９９１））並びにニューロン特異的ｖｇｆ遺伝子プロモータ（Ｐｉｃｃｉｏｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，１５：３７３－８４（１９９５））などが挙げられる。別の例示的なプロモータ配列は、例えば、米国特許第１０３００１４６号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。一部の実施形態では、組織特異的調節エレメント、例えば、組織特異的プロモータは、例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑ若しくはタンパク質発現データ、又はそれらの組合せにより測定して、所与の組織中で高度に発現される遺伝子と作動可能に連結していることがわかっているものから選択される。発現による組織特異性を分析する方法は、Ｆａｇｅｒｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １３（２）：３９７－４０６ （２０１４）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。
一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターは、マルチシストロン性発現構築物である。マルチシストロン性発現構築物として、例えば、第１発現カセット（例えば、第１プロモータ及び第１コーディング核酸配列を含む）と、第２発現カセット（例えば、第２プロモータ及び第２コーディング核酸配列を含む）を有する構築物が挙げられる。こうしたマルチシストロン性発現構築物は、いくつかの事例では、ポリペプチド、例えば遺伝子改変ポリペプチド及び遺伝子改変鋳型と一緒に、ヘアピンＲＮＡなどの非翻訳遺伝子産物の送達に特に有用となり得る。一部の実施形態では、マルチシストロン性発現構築物は、例えば、プロモータ干渉、又は不適合性核酸エレメントの近接した存在のために、含まれる導入遺伝子の１つ若しくは複数の発現レベル低下を呈示し得る。マルチシストロン性発現構築物がウイルスベクターの一部である場合、自己相補性核酸配列の存在は、いくつかの事例において、ウイルスの増殖又はパッケージングに必要な構造の形成を妨害し得る。
一部の実施形態では、配列は、ヘアピンを有するＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、ヘアピンＲＮＡは、ガイドＲＮＡ、鋳型ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はｍｉｃｒｏＲＮＡである。一部の実施形態では、第１プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩプロモータである。一部の実施形態では、第１プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモータである。一部の実施形態では、第２プロモータは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータである。一部の実施形態では、第２プロモータは、Ｕ６又はＨ１プロモータである。
特定の理論に束縛されることを意図しないが、マルチシストロン性発現構築物は、ただ１つのシストロンを含む発現システムと比較して、最適な発現レベルを達成しないと考えられる。２つ以上のプロモータエレメントを含むマルチシストロン性発現構築物を用いて達成される発現レベル低下について示される原因の１つは、プロモータ干渉の現象である（例えば、Ｃｕｒｔｉｎ Ｊ Ａ，Ｄａｎｅ Ａ Ｐ，Ｓｗａｎｓｏｎ Ａ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ Ｉ Ｅ，Ｇｉｎｎ Ｓ Ｌ．Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｎ ａ ｌａｔｅ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８ Ｍａｒｃｈ；１５（５）：３８４－９０；及びＭａｒｔｉｎ－Ｄｕｑｕｅ Ｐ，Ｊｅｚｚａｒｄ Ｓ，Ｋａｆｔａｎｓｉｓ Ｌ，Ｖａｓｓａｕｘ Ｇ．Ｄｉｒｅｃｔ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｓｕｌａｔｉｎｇ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｔｗｏ ｇｅｎｅｔｉｃ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎ ａｎ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｗｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００４ Ｏｃｔｏｂｅｒ；１５（１０）：９９５－１００２を参照されたい；尚、いずれの参照文献も、プロモータ干渉現象の開示について、参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、プロモータ干渉の問題は、例えば、内部リボソーム進入部位により隔てられる複数のコーディング核酸配列の転写を駆動するただ１つのプロモータを含むマルチシストロン性発現構築物を生成することにより、又は転写インスレータエレメントを備えるそれ自身のプロモータを含むシストロンを分離することによって解消することができる。一部の実施形態では、単一プロモータにより駆動される多シストロンの発現は、シストロンの不均一な発現レベルを招き得る。一部の実施形態では、プロモータを効率的に分離することはできず、分離エレメントは、一部の遺伝子導入ベクター、例えば、一部のレトロウイルスベクターと適合性ではない場合がある。
ｍｉｃｒｏＲＮＡ
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）及び他の低分子干渉核酸は、一般に、標的ＲＮＡ転写物切断／分解又は標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳抑制によって遺伝子発現を調節する。ｍｉＲＮＡは、いくつかの事例において、典型的に、最終的な１９～２５の非翻訳ＲＮＡ産物として天然に発現され得る。ｍｉＲＮＡは、一般に、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）との配列特異的相互作用を介してその活性を呈示する。これらの内在性発現ｍｉＲＮＡは、ヘアピン前駆体を形成し得るが、これらは、後に、ｍｉＲＮＡデュープレックス、更には成熟一本鎖ｍｉＲＮＡ分子にプロセシングされる。この成熟ｍｉＲＮＡは、一般に、多タンパク質複合体、ｍｉＲＩＳＣを誘導し、これは、成熟ｍｉＲＮＡに対するその相補性に基づいて標的ｍＲＮＡの標的３’ＵＴＲ領域を識別する。有用な導入遺伝子産物として、例えば、連結ポリペプチドの発現を調節するｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ結合部位を挙げることができる。ｍｉＲＮＡ遺伝子；これら遺伝子の産物及びその相同体の非限定的なリストは、導入遺伝子として、又は低分子干渉核酸（例えば、ｍｉＲＮＡスポンジ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）の標的として、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０３００１４６号明細書、２２：２５－２５：４８に列挙されるものなどの方法において有用である。一部の実施形態では、前述したｍｉＲＮＡの１つ又は複数に対する１つ若しくは複数の結合部位は、導入遺伝子、例えば、ｒＡＡＶベクターにより送達される導入遺伝子に組み込まれて、例えば、その導入遺伝子を保有する動物の１つ若しくは複数の組織中の導入遺伝子の発現を阻害する。一部の実施形態では、組織特異的に導入遺伝子の発現を制御するように、結合部位を選択し得る。例えば、肝臓特異適ｍｉＲ－１２２に対する結合部位を導入遺伝子に組み込んで、肝臓中のその導入遺伝子の発現を阻害することができる。別の例示的なｍｉＲＮＡ配列は、例えば、米国特許第１０，３００，１４６号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ｍｉＲ阻害剤又はｍｉＲＮＡ阻害剤は、概して、ｍｉＲＮＡ発現及び／又はプロセシングを阻止する薬剤である。こうした薬剤の例として、限定されないが、ｍｉｃｒｏＲＮＡアンタゴニスト、ｍｉｃｒｏＲＮＡ特異的アンチセンス、ｍｉｃｒｏＲＮＡスポンジ、及びｍｉｃｒｏＲＮＡオリゴヌクレオチド（二本鎖、ヘアピン、短いオリゴヌクレオチド）が挙げられ、これらは、Ｄｒｏｓｈａ複合体とのｍｉＲＮＡ相互作用を阻害する。ｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤、例えば、ｍｉＲＮＡスポンジは、導入遺伝子から細胞に発現させることができる（例えば、Ｅｂｅｒｔ，Ｍ．Ｓ．Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｅｐｕｂ Ａｕｇ．１２，２００７に記載の通り；尚、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。一部の実施形態では、ｍｉｃｒｏＲＮＡスポンジ、又は他のｍｉＲ阻害剤は、ＡＡＶと一緒に使用される。ｍｉｃｒｏＲＮＡスポンジは、一般に、相補的ヘプタマーシード配列を介して、ｍｉＲＮＡを特異的に阻害する。一部の実施形態では、単一のスポンジ配列を用いて、ｍｉＲＮＡのファミリー全体をサイレンシングすることができる。細胞中でｍｉＲＮＡ機能をサイレンシングする（ｍｉＲＮＡ標的の抑制解除）他の方法は、当業者に明らかであろう。
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変システム、鋳型ＲＮＡ又はポリペプチドは、標的組織、例えば、第１の組織に投与されるか、又はそこで活性である（例えば、より活性である）。一部の実施形態では、遺伝子改変システム、鋳型ＲＮＡ又はポリペプチドは、非標的組織に投与されないか、又は非標的組織において活性が低い（例えば、活性でない）。一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変システム、鋳型ＲＮＡ又はポリペプチドは、標的組織、例えば、第１組織において、ＤＮＡを修飾する（そして例えば、非標的組織においてＤＮＡを修飾しない）のに有用である。
一部の実施形態では、遺伝子改変システムは、（ａ）本明細書に記載のポリペプチド又はそれをコードする核酸、（ｂ）本明細書に記載の鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）、及び（ｃ）標的組織に特異的な１つ又は複数の第１組織特異的発現制御配列を含み、ここで、標的組織に特異的な１つ又は複数の第１組織特異的発現制御配列は、（ａ）、（ｂ）、又は（ａ）及び（ｂ）と機能的に関連しており、（ａ）と関連する場合、（ａ）はポリペプチドをコードする核酸を含む。
一部の実施形態では、（ｂ）の核酸はＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、（ｂ）の核酸はＤＮＡを含む。
一部の実施形態では、（ｂ）の核酸は：（ｉ）一本鎖であるか、又は一本鎖セグメントを含む、例えば、一本鎖ＤＮＡであるか、又は一本鎖セグメント及び１つ若しくは複数の二本鎖セグメントを含む；（ｉｉ）逆末端反復を有する；又は（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方である。
一部の実施形態では、（ｂ）の核酸は二本鎖であるか、又は二本鎖セグメントを含む。
一部の実施形態では、（ａ）は、ポリペプチドをコードする核酸を含む。
一部の実施形態では、（ａ）の核酸はＲＮＡを含む。
一部の実施形態では、（ａ）の核酸はＤＮＡを含む。
一部の実施形態では、（ａ）の核酸は：（ｉ）一本鎖であるか、又は一本鎖セグメントを含む、例えば、一本鎖ＤＮＡであるか、又は一本鎖セグメント及び１つ若しくは複数の二本鎖セグメントを含む；（ｉｉ）逆末端反復を有する；又は（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方である。
一部の実施形態では、（ａ）の核酸は二本鎖であるか、又は二本鎖セグメントを含む。
一部の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、又は（ａ）及び（ｂ）における核酸は線状である。
一部の実施形態では、（ａ）、（ｂ）、又は（ａ）及び（ｂ）における核酸は、環状、例えば、プラスミド又はミニサークルである。
一部の実施形態では、異種目的配列は、第１プロモータと機能的に関連している。
一部の実施形態では、１つ又は複数の第１組織特異的発現制御配列は、組織特異的プロモータを含む。
一部の実施形態では、組織特異的プロモータは、以下と機能的に関連する第１プロモータを含む：（ｉ）異種目的配列、（ｉｉ）レトロウイルスＲＴをコードする核酸、又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）。
一部の実施形態では、１つ又は複数の第１組織特異的発現制御配列は、以下と機能的に関連する組織特異的マイクロＲＮＡ認識配列を含む：（ｉ）異種目的配列、（ｉｉ）レトロウイルスＲＴドメインをコードする核酸、又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）。
一部の実施形態では、システムは組織特異的プロモータを含み、システムは１つ又は複数の組織特異的マイクロＲＮＡ認識配列を更に含み、ここで、（ｉ）組織特異的プロモータは、（Ｉ）異種目的配列、（ＩＩ）レトロウイルスＲＴドメインをコードする核酸、又は（ＩＩＩ）（ｉ）及び（ｉｉ）と機能的に関連している；且つ／又は（ｉｉ）１つ又は複数の組織特異的マイクロＲＮＡ認識配列は、（Ｉ）異種目的配列、（ＩＩ）レトロウイルスＲＴをコードする核酸、又は（ＩＩＩ）（ｉ）及び（ｉｉ）と機能的に関連している。
一部の実施形態では、（ａ）は、ポリペプチドをコードする核酸を含み、核酸は、ポリペプチドをコードする核酸と機能的に関連するプロモータを含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸は、ポリペプチドコード配列と機能的に関連する標的組織に特異的な１つ又は複数の第２組織特異的発現制御配列を含む。
一部の実施形態では、１つ又は複数の第２組織特異的発現制御配列は、組織特異的プロモータを含む。
一部の実施形態では、組織特異的プロモータは、ポリペプチドをコードする核酸と機能的に関連するプロモータである。
一部の実施形態では、１つ又は複数の第２組織特異的発現制御配列は、組織特異的マイクロＲＮＡ認識配列を含む。
一部の実施形態では、ポリペプチドをコードする核酸と機能的に関連するプロモータは、組織特異的プロモータであり、システムは、１つ又は複数の組織特異的マイクロＲＮＡ認識配列を更に含む。
一部の実施形態では、本発明によって提供されるシステムの核酸成分は、タンパク質発現レベルを改変する非翻訳領域（ＵＴＲ）に隣接する配列（例えば、ポリペプチドをコードするか、又は異種目的配列を含む）である。様々な５’及び３’ＵＴＲがタンパク質発現に影響を与え得る。例えば、一部の実施形態では、コード配列は、ＲＮＡの安定性又はタンパク質翻訳を修飾する５’ＵＴＲが先行し得る。一部の実施形態では、配列の後に、ＲＮＡの安定性又は翻訳を修飾する３’ＵＴＲが続き得る。一部の実施形態では、配列は、ＲＮＡの安定性又は翻訳を修飾するように、５’ＵＴＲが先行し、３’ＵＴＲが後続し得る。一部の実施形態では、５’及び／又は３’ＵＴＲは、補体因子３（Ｃ３）（ＣＡＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＴＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＣＴＧＴＣＣＣＴＣＴＧＡＣＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴＣＣＣＡＧＣＡＣＣ；配列番号１１，００４）又はオロソムコイド１（ＯＲＭ１）
Figure 2024533312000788
 の５’及び３’ＵＴＲから選択され得る（Ａｓｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０１８）。特定の実施形態では、５’ＵＴＲはＣ３からの５’ＵＴＲであり、３’ＵＴＲはＯＲＭ１からの３’ＵＴＲである。特定の実施形態では、タンパク質発現のための５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲ、例えば、遺伝子改変ポリペプチド若しくは異種目的配列のためのｍＲＮＡ（又はＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、最適化された発現配列を含む。一部の実施形態では、例えば、Ｒｉｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６８（６）：Ｐ１１１４－１１２５（２０１７）（その配列は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、５’ＵＴＲは、ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ（配列番号１１，００６）を含み、及び／又は３’ＵＴＲは、ＵＧＡＵＡＡＵＡＧＧＣＵＧＧＡＧＣＣＵＣＧＧＵＧＧＣＣＡＵＧＣＵＵＣＵＵＧＣＣＣＣＵＵＧＧＧＣＣＵＣＣＣＣＣＣＡＧＣＣＣＣＵＣＣＵＣＣＣＣＵＵＣＣＵＧＣＡＣＣＣＧＵＡＣＣＣＣＣＧＵＧＧＵＣＵＵＵＧＡＡＵＡＡＡＧＵＣＵＧＡ（配列番号１１，００７）を含む。
一部の実施形態では、５’及び／又は３’ＵＴＲを選択して、タンパク質発現が増強され得る。一部の実施形態では、過剰産生阻害が最小限に抑えられるようにタンパク質発現を修飾するように、５’及び／又は３’ＵＴＲを選択し得る。一部の実施形態では、ＵＴＲはコード配列の周囲にあり、例えば、コード配列の外側にあり、他の実施形態では、コード配列に近接している。一部の実施形態では、更なる調節エレメント（例えば、ｍｉＲＮＡ結合部位、シス調節部位）がＵＴＲに含まれる。
一部の実施形態では、遺伝子改変システムのオープンリーディングフレーム、例えば、遺伝子改変ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ（若しくはｍＲＮＡをコードするＤＮＡ）のＯＲＦ又は異種目的配列のｍＲＮＡ（若しくはｍＲＮＡをコードするＤＮＡ）の１つ若しくは複数のＯＲＦは、その発現を増強する、５’及び／又は３’非翻訳領域（ＵＴＲ）によりフランキングされている。一部の実施形態では、システムのｍＲＮＡ成分（又はＤＮＡ成分から産生された転写物）の５’ＵＴＲは、配列５’－ＧＧＧＡＡＡＵＡＡＧＡＧＡＧＡＡＡＡＧＡＡＧＡＧＵＡＡＧＡＡＧＡＡＡＵＡＵＡＡＧＡＧＣＣＡＣＣ－３’；配列番号１１，００８）を含む。一部の実施形態では、システムのｍＲＮＡ成分（又はＤＮＡ成分から産生された転写物）の３’ＵＴＲは、配列
Figure 2024533312000789
 を含む。５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲのこの組合せは、Ｒｉｃｈｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ １６８（６）：Ｐ１１１４－１１２５（２０１７）（その教示内容及び配列は、参照により本明細書に組み込まれる）により、作動可能に連結したＯＲＦの所望の発現をもたらすことが明らかにされている。一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムは、転写物をコードするＤＮＡを含み、この場合、上記ＤＮＡは、上に挙げた配列中のＵをＴで置換した、対応する５’ＵＴＲ及び３’ＵＴＲを含む。一部の実施形態では、システムのＲＮＡ成分を生産するために用いられるＤＮＡベクターは、インビトロ転写を開始するために、５’ＵＴＲの上流にプロモータ、例えば、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６プロモータを含む。上記の５’ＵＴＲは、ＧＧＧで開始するが、これは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼを用いた転写を最適化するのに好適な開始である。代替５’ＵＴＲに適合するように、転写レベルを調整し、且つ転写開始部位ヌクレオチドを改変するために、Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐａｃ Ｓｙｍｐ Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ ４３３－４４３（２０１０）の教示には、これらの特性の両方を満たすＴ７プロモータ変異体、及びそれを見出す方法が記載されている。
ウイルスベクター及びその成分
ウイルスは、例えば、本明細書で使用されるポリメラーゼ及びポリメラーゼ機能、例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素の供給源として、本明細書に記載の関連酵素又はドメインの供給源に加え、本明細書に記載のシステムのための送達ビヒクルの有用な供給源である。一部の酵素、例えば、逆転写酵素は、複数の活性を有する可能性があり、例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡ重合及びＤＮＡ依存性ＤＮＡ重合の両方（例えば、第１及び第２の鎖合成）が可能であり得る。一部の実施形態では、遺伝子改変送達システム又はその成分の供給源として使用されるウイルスは、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ Ｒｅｖ ３５（３）：２３５－２４１（１９７１）により記載される一群から選択され得る。
一部の実施形態では、ウイルスは、Ｉ群ウイルスから選択され、例えば、ＤＮＡウイルスであり、ｄｓＤＮＡをビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、Ｉ群ウイルスは、例えば、アデノウイルス（Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、ヘルペスウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ポックスウイルス（Ｐｏｘｖｉｒｕｓ）から選択される。
一部の実施形態では、ウイルスは、ＩＩ群ウイルスから選択され、例えば、ＤＮＡウイルスであり、ｓｓＤＮＡをビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、ＩＩ群ウイルスは、例えば、パルボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）から選択される。一部の実施形態では、パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）は、ディペンドパルボウイルス属（ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、例えば、アデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ）（ＡＡＶ）である。
一部の実施形態では、ウイルスは、ＩＩＩ群ウイルスから選択され、例えば、ＲＮＡウイルスであり、ｄｓＲＮＡをビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、ＩＩＩ群ウイルスは、例えば、レオウイルス（Ｒｅｏｖｉｒｕｓ）から選択される。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるｄｓＲＮＡの一方又は両方の鎖は、宿主細胞への形質導入時にｍＲＮＡとして直接役立ち得るコーディング分子であり、例えば、介在核酸複製又は重合ステップを一切必要とせずに、宿主細胞への形質導入時に、タンパク質に直接翻訳され得る。
一部の実施形態では、ウイルスは、ＩＶ群ウイルスから選択され、例えば、ＲＮＡウイルスであり、ｓｓＲＮＡ（＋）をビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、ＩＶ群ウイルスは、例えば、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ）、トガウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｕｓ）から選択される。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるｓｓＲＮＡ（＋）は、宿主細胞への形質導入時にｍＲＮＡとして直接役立ち得るコーディング分子であり、例えば、介在核酸複製又は重合ステップを一切必要とせずに、宿主細胞への形質導入時に、タンパク質に直接翻訳され得る。
一部の実施形態では、ウイルスは、Ｖ群ウイルスから選択され、例えば、ＲＮＡウイルスであり、ｓｓＲＮＡ（－）をビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、ＩＶ群ウイルスは、例えば、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｕｓｅｓ）、ラブドウイルス（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｕｓ）から選択される。一部の実施形態では、ｓｓＲＮＡ（－）ゲノムを有するＲＮＡウイルスは、ビリオン内部に、ウイルスゲノムと一緒に宿主細胞に形質導入される酵素（例えば、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ）も担持しており、これは、ｓｓＲＮＡ（－）を、宿主によって直接翻訳され得るｓｓＲＮＡ（＋）にコピーすることができる。
一部の実施形態では、ウイルスは、ＶＩ群ウイルスから選択され、例えば、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）であり、ｓｓＲＮＡ（＋）をビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、ＶＩ群ウイルスは、例えば、レトロウイルスから選択される。一部の実施形態では、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）は、レンチウイルス（ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）、例えば、ＨＩＶ－１、ＨＩＶ－２、ＳＩＶ、ＢＩＶである。一部の実施形態では、レトロウイルスは、スプマウイルス（ｓｐｕｍａｖｉｒｕｓ）、例えば、フォーミーウイルス（ｆｏａｍｙ ｖｉｒｕｓ）、例えば、ＨＦＶ、ＳＦＶ、ＢＦＶである。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるｓｓＲＮＡ（＋）は、宿主細胞への形質導入時にｍＲＮＡとして直接役立ち得るコーディング分子であり、例えば、介在核酸複製又は重合ステップを一切必要とせずに、宿主細胞への形質導入時に、タンパク質に直接翻訳され得る。一部の実施形態では、ｓｓＲＮＡ（＋）は、まず逆転写され、コピーされて、ｄｓＤＮＡゲノム中間体を生成し、そこからｍＲＮＡが宿主に転写され得る。一部の実施形態では、ｓｓＲＮＡ（＋）ゲノムを有するＲＮＡウイルスは、ビリオン内部に、ウイルスゲノムと一緒に宿主細胞に形質導入される酵素（例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）も担持しており、これは、ｓｓＲＮＡ（＋）をｄｓＤＮＡにコピーすることができ、このｄｓＤＮＡは、宿主によりｍＲＮＡに転写されて、翻訳され得る。一部の実施形態では、ＶＩ群レトロウイルス由来の逆転写酵素は、遺伝子改変ポリペプチドの逆転写酵素ドメインとして組み込まれる。
一部の実施形態では、ウイルスは、ＶＩＩ群ウイルスから選択され、例えば、レトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）であり、ｄｓＲＮＡをビリオンにパッケージングする。一部の実施形態では、ＶＩＩ群ウイルスは、例えば、ヘパドナウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）から選択される。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるｄｓＲＮＡの一方又は両方の鎖は、宿主細胞への形質導入時にｍＲＮＡとして直接役立ち得るコーディング分子であり、例えば、介在核酸複製又は重合ステップを一切必要とせずに、宿主細胞への形質導入時に、タンパク質に直接翻訳され得る。一部の実施形態では、こうしたビリオンに含有されるｄｓＲＮＡの一方又は両方の鎖は、まず逆転写され、コピーされて、ｄｓＤＮＡゲノム中間体を生成し、そこからｍＲＮＡが宿主に転写され得る。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡゲノムを有するＲＮＡウイルスは、ビリオン内部に、ウイルスゲノムと一緒に宿主細胞に形質導入される酵素（例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）も担持しており、これは、ｄｓＲＮＡをｄｓＤＮＡにコピーすることができ、このｄｓＤＮＡは、宿主によりｍＲＮＡに転写されて、翻訳され得る。一部の実施形態では、ＶＩＩ群レトロウイルス由来の逆転写酵素は、遺伝子改変ポリペプチドの逆転写酵素ドメインとして組み込まれる。
一部の実施形態では、本発明で核酸を送達するために用いられるビリオンは、遺伝子改変のプロセスに関与する酵素も担持し得る。例えば、レトロウイルスビリオンは、核酸と一緒に宿主細胞に送達される逆転写酵素ドメインを含有し得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ鋳型は、ビリオン内の遺伝子改変ポリペプチドを随伴し得、それにより、両方が、ウイルス粒子からの核酸の形質導入時に標的細胞に同時送達される。一部の実施形態では、ビリオン内の核酸は、ＤＮＡ、例えば、線状ｓｓＤＮＡ、線状ｄｓＤＮＡ、環状ｓｓＤＮＡ、環状ｄｓＤＮＡ、ミニサークルＤＮＡ、ｄｂＤＮＡ、ｃｅＤＮＡを含み得る。一部の実施形態では、ビリオン内の核酸は、ＲＮＡ、例えば、線状ｓｓＲＮＡ、線状ｄｓＲＮＡ、環状ｓｓＲＮＡ、環状ｄｓＲＮＡを含み得る。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、宿主細胞への形質導入時に環状化され得、例えば、線状ｓｓＲＮＡ分子は、共有結合を経て、環状ｓｓＲＮＡを形成することができ、線状ｄｓＲＮＡ分子は、共有結合を経て、環状ｄｓＲＮＡ又は１つ若しくは複数の環状ｓｓＲＮＡを形成し得る。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、宿主細胞内でのローリングサークル複製により複製し得る。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、単一核酸分子を含み得、例えば非セグメント化ゲノムを含み得る。一部の実施形態では、ウイルスゲノムは、２つ以上の核酸分子を含み得、例えばセグメント化ゲノムを含み得る。一部の実施形態では、ビリオン内の核酸は１つ若しくは複数のタンパク質を随伴し得る。一部の実施形態では、ビリオン内の１つ又は複数のタンパク質を、形質導入時に宿主細胞に送達することができる。一部の実施形態では、標的核酸に対するビリオンパッケージングシグナルの付加により、天然ウイルスを核酸の送達のために改変し得、その場合、宿主細胞を用いて、パッケージングシグナルを含有する標的核酸をパッケージングする。
一部の実施形態では、送達ビヒクルとして用いられるビリオンは、片利ヒトウイルスを含み得る。一部の実施形態では、送達ビヒクルとして用いられるビリオンは、アネロウイルス（ａｎｅｌｌｏｖｉｒｕｓ）を含み得、その使用は、国際公開第２０１８２３２０１７Ａ１号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
ＡＡＶ投与
一部の実施形態では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が、本明細書に記載されるシステム、鋳型核酸、及び／又はポリペプチドと一緒に使用される。一部の実施形態では、ＡＡＶは、本明細書に記載のシステム、鋳型核酸、及び／又はポリペプチドを送達、投与、又はパッケージングするために使用される。一部の実施形態では、ＡＡＶは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。
一部の実施形態では、システムは、（ａ）本明細書に記載のポリペプチド又はそれをコードする核酸、（ｂ）本明細書に記載の鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）、及び（ｃ）標的組織に特異的な１つ又は複数の第１組織特異的発現制御配列を含み、ここで、標的組織に特異的な１つ又は複数の第１組織特異的発現制御配列は、（ａ）、（ｂ）、又は（ａ）及び（ｂ）と機能的に関連しており、（ａ）と関連する場合、（ａ）はポリペプチドをコードする核酸を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載のシステムは、第１組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）カプシドタンパク質を更に含み、ここで、（ａ）又は（ｂ）の少なくとも１つは、第１ｒＡＡＶカプシドタンパク質と会合し、（ａ）又は（ｂ）の少なくとも１つは、ＡＡＶ逆位末端リピート（ＩＴＲ）が隣接している。
一部の実施形態では、（ａ）及び（ｂ）は、第１ｒＡＡＶカプシドタンパク質と会合している。
一部の実施形態では、（ａ）及び（ｂ）は単一核酸上にある。
一部の実施形態では、システムは、第２ｒＡＡＶカプシドタンパク質を更に含み、ここで、（ａ）又は（ｂ）の少なくとも１つは、第２ｒＡＡＶカプシドタンパク質と会合し、第２ｒＡＡＶカプシドタンパク質と会合する（ａ）又は（ｂ）の少なくとも１つは、第１ｒＡＡＶカプシドタンパク質と会合する（ａ）又は（ｂ）の少なくとも１つと異なる。
一部の実施形態では、（ａ）又は（ｂ）の少なくとも１つは、第１又は第２ｒＡＡＶカプシドタンパク質と会合し、第１又は第２ｒＡＡＶカプシドタンパク質の内部に分散しており、ここで、第１又は第２ｒＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシド粒子の形態である。
一部の実施形態では、システムはナノ粒子を更に含み、ナノ粒子は（ａ）又は（ｂ）の少なくとも１つと会合している。
一部の実施形態では、（ａ）及び（ｂ）は、それぞれａ）第１ｒＡＡＶカプシドタンパク質及び第２ｒＡＡＶカプシドタンパク質；ｂ）ナノ粒子及び第１ｒＡＡＶカプシドタンパク質；ｃ）第１ｒＡＡＶカプシドタンパク質；ｄ）第１アデノウイルスカプシドタンパク質；ｅ）第１ナノ粒子及び第２ナノ粒子；又はｆ）第１ナノ粒子と会合している。
ウイルスベクターは、本発明によって提供されるシステムの全部又は一部を送達するために、例えば、本発明によって提供される方法における使用のために有用である。ポリペプチド又は核酸の送達には、異なるウイルスに由来するシステムが採用されており、例えば、インテグラーゼ欠損レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、単純ヘルペスウイルス、バキュロウイルス（Ｈｏｄｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１７；Ｎａｒａｙａｎａｖａｒｉ ｅｔ ａｌ．Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０１７；Ｂｏｅｈｍｅ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１５で論評される）である。
アデノウイルスは、明確に定義された生物学、遺伝的安定性、高い形質導入効率、及び大規模生産の容易さを考慮して、遺伝子送達ビヒクルとして使用されてきた一般的なウイルスである（例えば、Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｉｓｅａｓｅｓ ２０１７による論評を参照）。それらは線状ｄｓＤＮＡゲノムを有し、組織と細胞の向性が異なる様々な血清型がある。レシピエント細胞での感染性ウイルスの複製を防ぐために、パッケージングに使用されるアデノウイルスゲノムは、ウイルス産生細胞にトランスで提供される内因性ウイルスタンパク質の一部又は全てが欠失している。これにより、ゲノムはヘルパー依存性となる。つまり、ゲノムは、いわゆるヘルパー機能によって提供される欠損成分の存在下でのみ複製され、ウイルス粒子にパッケージングされる。全てのウイルスＯＲＦが除去されたヘルパー依存性アデノウイルスシステムは、最大３７ｋｂの外来ＤＮＡのパッケージングと適合性であり得る（Ｐａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ １９９７）。一部の実施形態では、アデノウイルスベクターは、遺伝子改変システムのポリペプチド又は鋳型成分に対応するＤＮＡを送達するために使用されるか、又は両方が別々の若しくは同じアデノウイルスベクターに含まれる。一部の実施形態では、アデノウイルスは、自己パッケージングができないヘルパー依存性アデノウイルス（ＨＤ－ＡｄＶ）である。一部の実施形態では、アデノウイルスは、アデノウイルス粒子へのパッケージングに必要な配列成分を保持しながら、内因性ウイルスＯＲＦの全て又は実質的な部分が欠失した高容量アデノウイルス（ＨＣ－ＡｄＶ）である。このベクター型の場合、ゲノムパッケージングに必要な唯一のアデノウイルス配列は、非コード配列：両端の逆位末端リピート（ＩＴＲ）及び５’末端のパッケージングシグナルである（Ｊａｇｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２００９）。一部の実施形態では、アデノウイルスゲノムは、最適な産生及び安定性のための最小ゲノムサイズを満たすスタッファーＤＮＡも含む（例えば、Ｈａｕｓｌ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２０１０を参照）。一部の実施形態では、アデノウイルスを使用して、遺伝子改変システムを肝臓に送達する。
一部の実施形態では、アデノウイルスを使用して、遺伝子改変システムをＨＳＣ、例えば、ＨＤＡｄ５／３５＋＋に送達する。ＨＤＡｄ５／３５＋＋は、肝臓からベクターの標的を外す、血清型３５線維が改変されたアデノウイルスである（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｂｌｏｏｄ Ａｄｖ ２０１９）。一部の実施形態では、遺伝子改変システムをＨＳＣに送達するアデノウイルスは、原始ＨＳＣ上で特異的に発現される受容体、例えばＣＤ４６を利用する。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はパルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属し、より具体的にはディペンドパルボウイルス（ｄｅｐｅｎｄｏｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）属を構成する。ＡＡＶゲノムは、約４．７キロベース（ｋｂ）を含む線状一本鎖ＤＮＡ分子で構成され、非構造Ｒｅｐ（複製）及び構造Ｃａｐ（カプシド）タンパク質をコードする２つの主要なオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）で構成される。アセンブリー活性化タンパク質（ＡＡＰ）をコードするキャップ遺伝子内の第２ＯＲＦが同定された。ＡＡＶコード領域に隣接するＤＮＡは、長さが約１４５ヌクレオチドの２つのシス作用性逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列であり、ＤＮＡ複製のプライマーとして機能するエネルギー的に安定したヘアピン構造に折りたたむことができる中断されたパリンドローム配列を有する。ＤＮＡ複製におけるその役割に加え、ＩＴＲ配列は、ウイルスＤＮＡの細胞ゲノムへの組込み、宿主ゲノム又はプラスミドからのレスキュー、及びウイルス核酸の成熟ビリオンへのカプシド形成に関与することが示されている（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，（１９９２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：９７－１２９）。一部の実施形態では、１つ又は複数の遺伝子改変核酸成分は、ウイルスパッケージングのためにＡＡＶに由来するＩＴＲが隣接する。例えば、国際公開第２０１９１１３３１０号パンフレットを参照されたい。
一部の実施形態では、遺伝子改変システムの１つ又は複数の成分が、少なくとも１つのＡＡＶベクターを介して輸送される。一部の実施形態では、少なくとも１つのＡＡＶベクターは、特定の細胞、組織、生物に対する向性について選択される。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターはシュードタイプ化され（例えば、ＡＡＶ２／８）、ここで、ＡＡＶ２は構築物の設計を表すが、カプシドタンパク質はＡＡＶ８由来のものに置換される。記載されるベクターはいずれも、ＡＡＶゲノムをパッケージングするために使用されるカプシドタンパク質が異なるＡＡＶ血清型のものに由来するシュードタイプ誘導体であり得ることが理解される。ベクターの選択において制限されることを意図しないが、例示的なＡＡＶ血清型のリストは、表１８に見出すことができる。一部の実施形態では、遺伝子改変に使用されるＡＡＶは、文献（例えば、Ｄａｖｉｄｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ２０１９）で示されているように、新規細胞又は組織の向性について進化し得る。
一部の実施形態では、ＡＡＶ送達ベクターは、２つのＡＡＶ逆位末端リピート（ＩＴＲ）及び目的のヌクレオチド配列（例えば、遺伝子改変ポリペプチド若しくはＤＮＡ鋳型又はその両方をコードする配列）を有するベクターであり、前記ＩＴＲはそれぞれ中断された（又は不連続な）パリンドローム配列、すなわち、３つのセグメント：５’→３’で読むと同一であるが、互いに反対に配置するとハイブリダイズする、最初のセグメント及び最後のセグメント並びに同一のセグメントを分離する異なるセグメントから構成される配列を有する。例えば、国際公開第２０１２１２３４３０号パンフレットを参照されたい。
従来、カプシドを有するＡＡＶビリオンは、ｒＡＡＶ又はｓｃＡＡＶゲノム、Ｒｅｐタンパク質、及びＣａｐタンパク質をコードする１つ又は複数のプラスミドを導入することによって産生される（Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ，１９９８）。これらのヘルパープラスミドがトランスで導入されると、ＡＡＶゲノムは宿主ゲノムから「レスキュー」され（すなわち、放出され、その後回復される）、更にカプシド化されて感染性ＡＡＶが産生される。一部の実施形態では、１つ又は複数の遺伝子改変核酸は、ＩＴＲ隣接核酸をヘルパー機能と一緒にパッケージング細胞に導入することにより、ＡＡＶ粒子にパッケージングされる。
一部の実施形態では、ＡＡＶゲノムは、ＩＴＲ間に位置する配列が、所望の核酸配列の逆相補体に加えて、所望の核酸配列（例えば、遺伝子改変ポリペプチド又は鋳型をコードするＤＮＡ又はその両方）の両方を含み、これら２つの成分が折り畳まれて自己ハイブリダイズできるようにするように、いわゆる自己相補性ゲノム（ｓｃＡＡＶと呼ばれる）である。一部の実施形態では、自己相補性モジュールは、ＤＮＡがそれ自体に折り畳まれる（例えば、ステムループを形成する）ことを可能にする介在配列によって分離される。ｓｃＡＡＶには、最初にＩＴＲプライミングと第２の鎖合成に依存してｄｓＤＮＡを形成するのではなく、核に入ると転写の準備ができているという利点がある。一部の実施形態では、１つ又は複数の遺伝子改変成分がｓｃＡＡＶとして設計され、ここで、ＡＡＶ ＩＴＲ間の配列は、自己ハイブリダイズしてｄｓＤＮＡを生成することができる２つの逆相補モジュールを含む。
一部の実施形態では、細胞に送達される核酸（例えば、ポリペプチド又は鋳型、又はその両方をコードする）は、閉鎖型線状デュープレックスＤＮＡ（ＣＥＬｉＤ ＤＮＡ又はｃｅＤＮＡ）である。一部の実施形態では、ｃｅＤＮＡは、ＡＡＶゲノムの複製形態に由来する（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１３）。一部の実施形態では、核酸（例えば、ポリペプチド若しくは鋳型ＤＮＡ又はその両方をコードする）は、ＩＴＲ、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲによって隣接され、ここで、ＩＴＲの少なくとも１つは、末端分解部位及び複製タンパク質結合部位（複製タンパク質結合部位と呼ばれることもある）を含む。一部の実施形態では、ＩＴＲは、アデノ随伴ウイルス、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はそれらの組み合わせに由来する。一部の実施形態では、ＩＴＲは対称的である。一部の実施形態では、ＩＴＲは非対称的である。一部の実施形態では、構築物の複製を可能にするために、少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が提供される。一部の実施形態では、少なくとも１つのＲｅｐタンパク質は、アデノ随伴ウイルス、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、又はそれらの組み合わせに由来する。一部の実施形態では、ｃｅＤＮＡは、産生細胞に、（ｉ）ＩＴＲ、例えば、ＡＡＶ ＩＴＲが隣接するＤＮＡ、及び（ｉｉ）ＩＴＲ依存性複製に必要な成分、例えばＡＡＶタンパク質Ｒｅｐ７８及びＲｅｐ５２（又はタンパク質をコードする核酸）を提供することによって生成される。一部の実施形態では、ｃｅＤＮＡは、カプシドタンパク質を含まず、例えば、感染性ＡＡＶ粒子にパッケージングされていない。一部の実施形態では、ｃｅＤＮＡはＬＮＰに製剤化される（例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ１号パンフレットを参照）。
一部の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、２つの自己相補的配列、例えば、本明細書で定義される非対称又は対称又は実質的に対称なＩＴＲからなり、前記発現カセットに隣接し、ここで、ｃｅＤＮＡベクターはカプシドタンパク質と会合していない。一部の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶゲノムに見出される２つの自己相補性配列を含み、ここで、少なくとも１つのＩＴＲは、作動可能なＲｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）（本明細書では「ＲＢＳ」とも呼ばれることもある）及びＡＡＶ又はＲＢＥの機能的バリアントの末端分解部位（ｔｒｓ）を含む。例えば、国際公開第２０１９１１３３１０号パンフレットを参照されたい。
一部の実施形態では、ＡＡＶゲノムは、４つの複製タンパク質及び３つのカプシドタンパク質をそれぞれコードする２つの遺伝子を含む。一部の実施形態では、これらの遺伝子は、１４５ｂｐ逆位末端配列（ＩＴＲ）により両側がフランキングされている。一部の実施形態では、ビリオンは、例えば、１：１：１０の比で産生される、最大３つのカプシドタンパク質（Ｖｐ１、Ｖｐ２、及び／又はＶｐ３）を含む。一部の実施形態では、カプシドタンパク質は、同じオープンリーディングフレーム及び／又は異なるスプライシング（Ｖｐ１）並びに別の翻訳開始部位（それぞれＶｐ２及びＶｐ３）から産生される。一般に、Ｖｐ３は、ビリオン中で最も豊富なサブユニットであり、細胞表面での受容体認識に参加して、ウイルスの屈性を定める。一部の実施形態では、Ｖｐ１は、例えばＶｐ１のＮ末端において、ウイルスの感染力において機能するホスホリパーゼドメインを含む。
一部の実施形態では、ウイルスベクターのパッケージング能力は、ベクターにパッケージングされ得る遺伝子改変システムのサイズを制限する。例えば、ＡＡＶのパッケージング能力は、例えば、１つ又は２つの逆位末端配列（ＩＴＲ）、例えば、１４５塩基ＩＴＲを含め、約４．５ｋｂ（例えば、約３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５若しくは６．０ｋｂ）であり得る。
一部の実施形態では、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、ベクター導入遺伝子カセットをフランキングするシス作用性１４５ｂｐ ＩＴＲを含み、例えば、外来ＤＮＡのパッケージングのために最大４．５ｋｂを提供する。感染の後、ｒＡＡＶは、いくつかの事例において、本発明の融合タンパク質を発現し、円形の頭－尾コンカテマー内にエピソームとして存在することにより、宿主ゲノムに組み込まれることなく存続する。ｒＡＡＶは、例えば、インビトロ及びインビボで使用することができる。一部の実施形態では、ＡＡＶ媒介遺伝子送達のためには、遺伝子のコーディング配列の長さが野生型ＡＡＶゲノムと等しいか、又はそれ以上である必要がある。
上記サイズを超える遺伝子のＡＡＶ送達及び／又は大きい生理学的調節エレメントの使用は、例えば、送達しようとするタンパク質を２つ以上の断片に分割することにより、達成することができる。一部の実施形態では、Ｎ－末端断片をインテイン－Ｎ配列と融合させる。一部の実施形態では、Ｃ－末端断片をインテイン－Ｃ配列と融合させる。複数の実施形態では、上記断片を２つ以上のＡＡＶベクターにパッケージングする。
一部の実施形態では、大きい導入遺伝子発現カセットを２つの個別の半分（５’及び３’末端、又は頭及び尾）に分割することにより、デュアルＡＡＶベクターを作製し、例えば、カセットの各半分を単一のＡＡＶベクター（＜５ｋｂ）にパッケージングする。次に、一部の実施形態では、両方のデュアルＡＡＶベクターによる同じ細胞の同時感染時に、完全長導入遺伝子発現カセットの再アセンブリーを達成することができる。一部の実施形態では、同時感染の後に、以下：（１）５’及び３’ゲノム同士の相同組換え（ＨＲ）（デュアルＡＡＶ重複ベクター）；（２）ＩＴＲ媒介による５’及び３’ゲノムの尾－頭コンカテマー化（デュアルＡＡＶトランス－スプライシングベクター）；及び／又は（３）これら２つの機構の組合せ（デュアルＡＡＶハイブリッドベクター）の１つ若しくは複数が続く。一部の実施形態では、インビボでのデュアルＡＡＶベクターの使用により、完全長タンパク質の発現が達成される。一部の実施形態では、デュアルＡＡＶベクタープラットフォームの使用は、サイズが約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、又は５．０ｋｂ超の導入遺伝子のための効率的且つ実行可能な遺伝子移入戦略を表している。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、例えば、核酸及びペプチドのインビトロ生産において、標的核酸で細胞を形質導入するために使用することもできる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、インビボ及びエクスビボ遺伝子療法手順に使用することができる（例えば、Ｗｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７（１９８７）；米国特許第４，７９７，３６８号明細書；国際公開第９３／２４６４１号パンフレット；Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１（１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１３５１（１９９４）を参照されたい；尚、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。組換えＡＡＶベクターの構築については、いくつかの刊行物に記載されており、そうしたものとして、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１－３２６０（１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２－２０８１（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０（１９８４）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：０３８２２－３８２８（１９８９）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。
一部の実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変ポリペプチド（例えば、１つ若しくは複数のガイド核酸を含む、又は含まない）は、ＡＡＶ、レンチウイルス、アデノウイルス、又は他のプラスミド若しくはウイルスベクタータイプを用いて送達することができ、とりわけ、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号明細書（アデノウイルス用の製剤、用量）、米国特許第８，４０４，６５８号明細書（ＡＡＶ用の製剤、用量）、及び米国特許第５，８４６，９４６号明細書（ＤＮＡプラスミド用の製剤、用量）並びにレンチウイルス、ＡＡＶ及びアデノウイルスに関係する臨床試験及びそうした臨床試験に関する刊行物から得られる製剤及び用量を用いて、送達することができる。例えば、ＡＡＶの場合、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号明細書に記載される通り、及びＡＡＶに関係する臨床試験に記載の通りであり得る。アデノウイルスの場合、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号明細書に記載される通り、及びアデノウイルスに関係する臨床試験に記載の通りであり得る。プラスミド送達の場合、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号明細書に記載される通り、及びプラスミドに関係する臨床試験に記載の通りであり得る。用量は、平均７０ｋｇの個体（例えば、成人男性）を基準とするか又はそれに外挿され得、異なる体重及び種の患者、対象、哺乳動物について調節することができる。投与頻度は、患者又は対象の年齢、性別、健康全般、他の状態を含む通常の要因並びに対処しようとする具体的な病状又は症状に応じて、医学又は獣医療専門家（例えば、医師、獣医師）の範囲内である。一部の実施形態では、ウイルスベクターを目的の組織に注射することができる。細胞型特異的遺伝子改変の場合、遺伝子改変ポリペプチド及び任意選択のガイド核酸の発現は、一部の実施形態では、細胞型特異的プロモータによって駆動することができる。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、免疫応答を活性化し得る細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製方法のために、低毒性を可能にする。一部の実施形態では、ＡＡＶは、例えば、それが実質的に宿主ゲノムに組み込まれないことから、挿入変異誘発を引き起こす低い可能性を可能にする。
一部の実施形態では、ＡＡＶは、約４．４、４．５、４．６、４．７、又は４．７５ｋｂのパッケージング限度を有する。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドコード化配列、プロモータ、及び転写終結因子は、単一のウイルスベクターに適合し得る。ＳｐＣａｓ９（４．１ｋｂ）は、いくつかの事例では、ＡＡＶにパッケージングするのが困難であり得る。従って、一部の実施形態では、他の遺伝子改変ポリペプチドコード配列又は塩基編集因子より長さが短い遺伝子改変ポリペプチドコード配列が使用される。一部の実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドコード化配列は、約４．５ｋｂ、４．４ｋｂ、４．３ｋｂ、４．２ｋｂ、４．１ｋｂ、４ｋｂ、３．９ｋｂ、３．８ｋｂ、３．７ｋｂ、３．６ｋｂ、３．５ｋｂ、３．４ｋｂ、３．３ｋｂ、３．２ｋｂ、３．１ｋｂ、３ｋｂ、２．９ｋｂ、２．８ｋｂ、２．７ｋｂ、２．６ｋｂ、２．５ｋｂ、２ｋｂ、又は１．５ｋｂ未満である。
ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はそれらの任意の組合せであり得る。一部の実施形態では、ＡＡＶの種類は、ターゲティングしようとする細胞に関して選択され；例えば、脳又はニューロン細胞をターゲティングするためには、ＡＡＶ血清型１、２、５若しくはハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５又はそれらの任意の組合せを選択することができるか；又は心臓組織をターゲティングするためにＡＡＶ４を選択することができる。一部の実施形態では、肝臓への送達のために、ＡＡＶ８を選択する。これらの細胞に関する例示的なＡＡＶ血清型は、例えば、Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７－５９１１（２００８）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。一部の実施形態では、ＡＡＶは、あらゆる血清型、サブタイプ、及び天然に存在するＡＡＶ並びに組換えＡＡＶを指す。ＡＡＶが用いられるとき、ウイルス自体又はその誘導体を指す場合もある。一部の実施形態では、ＡＡＶとして、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒｌ、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．３２．３３、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶｒｈｌＯ、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ １２、ｒｈｌＯ、及びそれらのハイブリッド、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶが挙げられる。ＡＡＶの様々な血清型のゲノム配列並びにネイティブ末端反復（ＴＲ）、Ｒｅｐタンパク質及びカプシドサブユニットの配列は、当技術分野で公知である。こうした配列は、文献又はＧｅｎＢａｎｋなどの公式データベースで見出すことができる。別の例示的なＡＡＶ血清型を表１８に挙げる。
Figure 2024533312000790
一部の実施形態では、医薬組成物（例えば、本明細書に記載のＡＡＶを含む）は、１０％未満の空のカプシド、８％未満の空のカプシド、７％未満の空のカプシド、５％未満の空のカプシド、３％未満の空のカプシド、又は１％未満の空のカプシドを有する。一部の実施形態では、医薬組成物は、約５％未満の空のカプシドを有する。一部の実施形態では、空のカプシドの数は、検出限界未満である。一部の実施形態では、例えば、空のカプシドは、有害な反応（例えば、免疫応答、炎症性応答、肝臓の反応、及び／又は心臓の反応）を起こす恐れがあり、例えば、実質的な治療利益がほとんど若しくは全くないことから、医薬組成物は少量の空のカプシドを有するのが有利である。
一部の実施形態では、医薬組成物中の残留宿主細胞タンパク質（ｒＨＣＰ）は、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１００ｎｇ／ｍｌ以下のｒＨＣＰ、例えば、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり４０ｎｇ／ｍｌ以下のｒＨＣＰ又は１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１～５０ｎｇ／ｍｌのｒＨＣＰである。一部の実施形態では、医薬組成物は、１．０×１０１３ｖｇ当たり１０ｎｇ未満のｒＨＣＰ若しくは１．０×１０１３ｖｇ当たり５ｎｇ未満のｒＨＣＰ、１．０×１０１３ｖｇ当たり４ｎｇ未満のｒＨＣＰ若しくは１．０×１０１３ｖｇ当たり３ｎｇ未満のｒＨＣＰ、又はこれらの間の任意の濃度を含む。一部の実施形態では、医薬組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡ（ｈｃＤＮＡ）は、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり５×１０６ｐｇ／ｍｌ以下のｈｃＤＮＡ、１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．２×１０６ｐｇ／ｍｌ以下のｈｃＤＮＡ又は１×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１×１０５ｐｇ／ｍｌのｈｃＤＮＡである。一部の実施形態では、前記医薬組成物中の残留宿主細胞ＤＮＡは、１×１０１３ｖｇ当たり５．０×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり２．０×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり１．１×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり１．０×１０５ｐｇ未満のｈｃＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．９×１０５ｐｇ未満のｈｃＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．８×１０５ｐｇ未満のｈｃＤＮＡ又はこれらの間の任意の濃度である。
一部の実施形態では、医薬組成物中の残留プラスミドＤＮＡは、１．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．７×１０５ｐｇ／ｍｌ以下、１×１．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１×１０５ｐｇ／ｍｌ、又は１．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ当たり１．７×１０６ｐｇ／ｍｌである。一部の実施形態では、医薬組成物中の残留ＤＮＡプラスミドは、１．０×１０１３ｖｇ当たり１０．０×１０５ｐｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり８．０×１０５ｐｇ未満、又は１．０×１０１３ｖｇ当たり６．８×１０５ｐｇ未満である。一部の実施形態では、医薬組成物は、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．５ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．３ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２２ｎｇ未満若しくは１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２ｎｇ未満、又は任意の中間濃度のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む。複数の実施形態では、医薬組成物中のベンゾナーゼは、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．２ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．１ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．０９ｎｇ未満、１．０×１０１３ｖｇ当たり０．０８ｎｇ未満、又は任意の中間濃度である。複数の実施形態では、医薬組成物中のポロキサマー１８８は、約１０～１５０ｐｐｍ、約１５～１００ｐｐｍ又は約２０～８０ｐｐｍである。複数の実施形態では、医薬組成物中のセシウムは、５０ｐｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満、３０ｐｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満若しくは２０ｐｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満、又は任意の中間濃度である。
複数の実施形態では、医薬組成物は、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定して、１０％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満又はそれらの間の任意のパーセンテージの総不純物を含む。複数の実施形態では、総不純物は、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定して、９０％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、９７％超、９８％超又はそれらの間の任意のパーセンテージである。複数の実施形態では、単一の不特定関連不純物はいずれも、例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより測定して、５％超、４％超、３％超若しくは２％超又はそれらの間の任意のパーセンテージである。複数の実施形態では、医薬組成物は、総カプシド（分析用超遠心により測定して、ピーク１＋ピーク２）に対して、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、９０％超、９１％超、９１．９％超、９２％超、９３％超のパーセンテージ又はそれらの間の任意のパーセンテージの充填カプシドを含む。医薬組成物の複数の実施形態では、分析用超遠心によりピーク１で測定した充填カプシドのパーセンテージは、２０～８０％、２５～７５％、３０～７５％、３５～７５％、又は３７．４～７０．３％である。医薬組成物の複数の実施形態では、分析用超遠心によりピーク２で測定した充填カプシドのパーセンテージは、２０～８０％、２０～７０％、２２～６５％、２４～６２％、又は２４．９～６０．１％である。
一実施形態では、医薬組成物は、１．０～５．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ、１．２～３．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ、又は１．７～２．３×１０１３ｖｇ／ｍｌのゲノム力価を含む。一実施形態では、医薬組成物は、５ＣＦＵ／ｍＬ未満、４ＣＦＵ／ｍＬ未満、３ＣＦＵ／ｍＬ未満、２ＣＦＵ／ｍＬ未満若しくは１ＣＦＵ／ｍＬ未満、又は任意の中間濃度の生物学的負荷を示す。複数の実施形態では、ＵＳＰ、例えば、ＵＳＰ＜８５＞（その全体が参照により組み込まれる）に従うエンドトキシンの量は、１．０ＥＵ／ｍＬ未満、０．８ＥＵ／ｍＬ未満、又は０．７５ＥＵ／ｍＬ未満である。複数の実施形態では、ＵＳＰ、例えば、ＵＳＰ＜７８５＞（その全体が参照により組み込まれる）に従う医薬組成物の浸透圧は、３５０～４５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、３７０～４４０ｍＯｓｍ／ｋｇ又は３９０～４３０ｍＯｓｍ／ｋｇである。複数の実施形態では、医薬組成物は、容器当たり１２００個未満の２５μｍ超の粒子、容器当たり１０００個未満の２５μｍ超の粒子、容器当たり５００個未満の２５μｍ超の粒子、又は任意の中間値を含有する。複数の実施形態では、医薬組成物は、容器当たり１０，０００個未満の１０μｍ超の粒子、容器当たり８０００個未満の１０μｍ超の粒子又は容器当たり６００個未満の１０ｐｍ超の粒子を含有する。
一実施形態では、医薬組成物は、０．５～５．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ、１．０～４．０×１０１３ｖｇ／ｍＬ、１．５～３．０×１０１３ｖｇ／ｍｌ又は１．７～２．３×１０１３ｖｇ／ｍｌのゲノム力価を有する。一実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、以下の１つ又は複数を含む：１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．０９ｎｇ未満のベンゾナーゼ、約３０ｐｇ／ｇ（ｐｐｍ）未満のセシウム、約２０～８０ｐｐｍのポロキサマー１８８、１．０×１０１３ｖｇ当たり約０．２２ｎｇ未満のＢＳＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり約６．８×１０５ｐｇ未満の残留ＤＮＡプラスミド、１．０×１０１３ｖｇ当たり約１．１×１０５ｐｇ未満の残留ｈｃＤＮＡ、１．０×１０１３ｖｇ当たり約４ｎｇ未満のｒＨＣＰ、ｐＨ７．７～８．３、約３９０～４３０ｍＯｓｍ／ｋｇ、容器当たり約６００個未満の粒径＞２５μｍの粒子、容器当たり約６０００個未満の粒径＞１０μｍの粒子、約１．７×１０１３～２．３×１０１３ｖｇ／ｍＬのゲノム力価、１．０×１０１３ｖｇ当たり約３．９×１０８～８．４×１０１０ＩＵの感染力価、１．０×１０１３ｖｇ当たり約１００～３００ｐｇの総タンパク質、約７．５×１０１３ｖｇ／ｋｇ用量のウイルスベクターを用いたＡ７ＳＭＡマウスで＞２４日の平均生存期間、インビトロ細胞アッセイに基づき約７０～１３０％の相対効力及び／又は約５％未満の空のカプシド。様々な実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、本明細書で扱うウイルス粒子のいずれかを含み、参照基準の±２０％、±１５％、±１０％又は±５％の効力を保持する。一部の実施形態では、好適なインビトロ細胞アッセイ又はインビボ動物モデルを用いて、効力を測定する。
ＡＡＶ粒子の別の調製、特性決定、及び投与方法は、国際公開第２０１９０９４２５３号パンフレット（その全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。
本発明と一致して使用することができる別のｒＡＡＶ構築物として、表１を含め、以下：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１５７３－０１９－００１２－９で入手可能なＷａｎｇ ｅｔ ａｌ ２０１９（その全体が、参照により組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。
脂質ナノ粒子
本明細書で提供される方法及びシステムは、特定の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む任意の好適な担体又は送達方法を含み得る。脂質ナノ粒子は、一部の実施形態において、１つ若しくは複数のイオン脂質、例えば、非カチオン脂質（例えば、中性若しくはアニオン、又は双性イオン脂質）；１つ若しくは複数の共役脂質（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表５に記載される、ＰＥＧ共役脂質又はポリマーと共役した脂質など）；１つ若しくは複数のステロール（例えば、コレステロール）；並びに任意選択で１つ若しくは複数のターゲティング分子（例えば、共役受容体、受容体リガンド、抗体）；又はこれらの組合せを含む。
ナノ粒子形成（例えば、脂質ナノ粒子）に使用することができる脂質として、例えば、国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の表４に記載されるものが挙げられ、例えば、脂質含有ナノ粒子は、国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレットの表４に示される脂質の１つ又は複数を含み得る。脂質ナノ粒子は、ポリマー、例えば、国際公開第２０１９２１７９４１号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の表５に記載されるポリマーなどの別の要素を含み得る。
一部の実施形態では、共役脂質は、存在する場合、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（例えば、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ））、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、ＰＥＧ－コハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（例えば、４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ））、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－１－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩及び国際公開第２０１９０５１２８９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）並びにこれらの組合せの１つ又は複数を含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子に組み込むことができるステロールは、コレステロール又はこれらのコレステロール誘導体、例えば、国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものなどを含む。別の例示的なステロールとして、フィトステロールが挙げられ、Ｅｙｇｅｒｉｓ ｅｔ ａｌ（２０２０），ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．０ｃ０１３８６（参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものを含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、イオン化性脂質、非カチオン脂質、粒子の凝集を阻害する共役脂質、及びステロールを含む。これらの成分の量は、独立して、且つ所望の特性を達成するように変動し得る。例えば、一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、総脂質の約２０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％の量のイオン化性脂質（他の実施形態では、それは、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の２０～７０％（ｍｏｌ）、３０～６０％（ｍｏｌ）若しくは４０～５０％（ｍｏｌ）；約５０ｍｏｌ％～約９０ｍｏｌ％であり得る）、総脂質の約５ｍｏｌ％～約３０ｍｏｌ％の量の非カチオン脂質、総脂質の約０．５ｍｏｌ％～約２０ｍｏｌ％の量の共役脂質、及び総脂質の約２０ｍｏｌ％～約５０ｍｏｌ％の量のステロールを含む。核酸（例えば、遺伝子改変ポリペプチド又は鋳型核酸をコードする）に対する総脂質の比は、要望に応じて変動し得る。例えば、核酸に対する総脂質（質量又は重量）は、約１０：１～約３０：１であり得る。
一部の実施形態では、イオン化性脂質は、カチオン性脂質、イオン化性カチオン性脂質、例えば、ｐＨに応じて正に帯電した形態又は中性の形態で存在することができるカチオン性脂質、又は容易にプロトン化され得るアミン含有脂質であり得る。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、例えば生理学的条件下で正に荷電することができる脂質である。例示的なカチオン性脂質には、正電荷を保持する１つ又は複数のアミン基が含まれる。一部の実施形態では、脂質粒子は、中性脂質、イオン化性アミン含有脂質、生分解性アルキン脂質、ステロイド、多価不飽和脂質を含むリン脂質、構造脂質（例えば、ステロール）、ＰＥＧ、コレステロール及びポリマー共役脂質の１つ又は複数とともに、製剤中にカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、カチオン性脂質は、イオン化可能なカチオン性脂質であり得る。本明細書に開示される例示的なカチオン性脂質は、６．０を超える有効ｐＫａを有し得る。実施形態では、脂質ナノ粒子は、第１カチオン性脂質と異なる有効ｐＫａ（例えば、第１有効ｐＫａより大きい）を有する第２カチオン性脂質を含み得る。脂質ナノ粒子は、脂質ナノ粒子内に封入されているか、又はそれと会合している、４０～６０モルパーセントのカチオン性脂質、中性脂質、ステロイド、ポリマー共役脂質、及び治療剤、例えば、本明細書に記載の核酸（例えば、ＲＮＡ）（例えば、鋳型核酸又は遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸）を含み得る。一部の実施形態では、核酸はカチオン性脂質と共製剤化される。核酸は、ＬＮＰ、例えば、カチオン性脂質を含むＬＮＰの表面に吸着され得る。一部の実施形態では、核酸は、ＬＮＰ、例えば、カチオン性脂質を含むＬＮＰに封入され得る。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、例えば、ターゲティング剤でコーティングされたターゲティング部分を含み得る。実施形態では、ＬＮＰ製剤は生分解性である。一部の実施形態では、本明細書に記載の１つ又は複数の脂質、例えば、式（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉ）、（ｖｉｉ）及び／又は（ｉｘ）を含む脂質ナノ粒子は、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は１００％のＲＮＡ分子、例えば、鋳型ＲＮＡ及び／又は遺伝子改変ポリペプチドをコードするｍＲＮＡを封入する。
一部の実施形態では、脂質と核酸の比（質量／質量比；ｗ／ｗ比）は、約１：１～約２５：１、約１０：１～約１４：１、約３：１～約１５：１、約４：１～約１０：１、約５：１～約９：１、又は約６：１～約９：１の範囲であり得る。脂質及び核酸の量は、所望のＮ／Ｐ比、例えば、３、４、５、６、７、８、９又は１０以上のＮ／Ｐ比を提供するように、調節することができる。一般に、脂質ナノ粒子製剤の総脂質含量は、約５ｍｇ／ｍｌ～約３０ｍｇ／ｍｌであり得る。
脂質ナノ粒子製剤に使用することができる例示的なイオン化性脂質は、限定されないが、国際公開第２０１９０５１２８９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の表１に列挙されるものを含む。別の例示的な脂質として、限定されないが、以下の式の１つ若しくは複数が挙げられる：米国特許出願公開第２０１６／０３１１７５９号明細書のＸ；米国特許出願公開第２０１５０３７６１１５号又は米国特許第２０１６／０３７６２２４号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１６０１５１２８４号明細書のＩ、ＩＩ又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１７０２１０９６７号明細書のＩ、ＩＡ、ＩＩ、又はＩＩＡ；米国特許出願公開第２０１５０１４００７０号明細書のＩ－ｃ；米国特許出願公開第２０１３／０１７８５４１号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０３０３５８７号又は米国特許第２０１３／０１２３３３８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／０１４１６７８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／０２３９９２６号明細書のＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、又はＶ；米国特許出願公開第２０１７／０１１９９０４号明細書のＩ；国際公開第２０１７／１１７５２８号パンフレットのＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／０１４９８９４号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１５／００５７３７３号明細書のＡ；国際公開第２０１３／１１６１２６号パンフレットのＡ；米国特許出願公開第２０１３／００９０３７２号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０２７４５２３号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／０２７４５０４号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１３／００５３５７２号明細書のＡ；国際公開第２０１３／０１６０５８号パンフレットのＡ；国際公開第２０１２／１６２２１０号パンフレットのＡ；米国特許出願公開第２００８／０４２９７３号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１２／０１２８７６７０号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ又はＩＶ；米国特許出願公開第２０１４／０２００２５７号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１５／０２０３４４６号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１５／０００５３６３号明細書のＩ又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１４／０３０８３０４号明細書のＩ、ＩＡ、ＩＢ、ＩＣ、ＩＤ、ＩＩ、ＩＩＡ、ＩＩＢ、ＩＩＣ、ＩＩＤ、又はＩＩＩ－ＸＸＩＶ；米国特許出願公開第２０１３／０３３８２１０号明細書の；国際公開第２００９／１３２１３１号パンフレットのＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、又はＩＶ；米国特許出願公開第２０１２／０１０１１４７８号明細書のＡ；米国特許出願公開第２０１２／００２７７９６号明細書のＩ又はＸＸＸＶ；米国特許出願公開第２０１２／００５８１４４号明細書のＸＩＶ又はＸＶＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０３２３２６９号明細書の；米国特許出願公開第２０１１／０１１７１２５号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１１／０２５６１７５号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／０２０２８７１号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ；米国特許出願公開第２０１１／００７６３３５号明細書のＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、又はＸＶＩ；米国特許出願公開第２００６／００８３７８号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１２３３３８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１５／００６４２４２号明細書のＩ又はＸ－Ａ－Ｙ－Ｚ；米国特許出願公開第２０１３／００２２６４９号明細書のＸＶＩ、ＸＶＩＩ、又はＸＶＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１１６３０７号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１１６３０７号明細書のＩ、ＩＩ、又はＩＩＩ；米国特許出願公開第２０１０／００６２９６７号明細書のＩ又はＩＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１８９３５１号明細書のＩ～Ｘ；米国特許出願公開第２０１４／００３９０３２号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書のＶ；米国特許出願公開第２０１６／０３１７４５８号明細書のＩ；米国特許出願公開第２０１３／０１９５９２０号明細書のＩ；米国特許第１０，２２１，１２７号明細書の５、６又は１０；国際公開第２０１８／０８１４８０号パンフレットのＩＩＩ－３；国際公開第２０２０／０８１９３８号パンフレットのＩ－５又はＩ－８；米国特許第９，８６７，８８８号明細書の１８又は２５；米国特許出願公開第２０１９／０１３６２３１号明細書のＡ；国際公開第２０２０／２１９８７６号パンフレットのＩＩ；米国特許出願公開第２０１２／００２７８０３号明細書の１；米国特許出願公開第２０１９／０２４０３４９号明細書のＯＦ－０２；米国特許第１０，０８６，０１３号明細書の２３；Ｍｉａｏ ｅｔ ａｌ（２０２０）のｃＫＫ－Ｅ１２／Ａ６；国際公開第２０１０／０５３５７２号パンフレットのＣ１２－２００；Ｄａｈｌｍａｎ ｅｔ ａｌ（２０１７）の７Ｃ１；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌの３０４－Ｏ１３又は５０３－Ｏ１３；米国特許第９，７０８，６２８号明細書のＴＳ－Ｐ４Ｃ２；国際公開第２０２０／１０６９４６号パンフレットのＩ；国際公開第２０２０／１０６９４６号パンフレットのＩ。
一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９に記載されているように、ＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３ ｌＺ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３，ｌ－テトラエン－ｌ９－イル－４－（ジメチルペンチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ又はＭＣ３）である。一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例１０に記載されているように、脂質ＡＴＸ－００２である。一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例１１に記載されているように、（ｌ３Ｚ，ｌ６Ｚ）－Ａ，Ａ－ジメチル－３－ノニルドコサ－ｌ３、ｌ６－ジエン－１－アミン（化合物３２）である。一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例１２に記載されているように、化合物６又は化合物２２である。一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、米国特許第９，８６７，８８８号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の実施例１に記載されている、ヘプタデカン－９－イル８－（（２－ヒドロキシエチル）（６－オキソ－６－（ウンデシルオキシ）ヘキシル）アミノ）オクタノエート（ＳＭ－１０２）である。一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、国際公開第２０１５／０９５３４０号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の実施例１３で合成された、９Ｚ，１２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ－９，１２－ジエノエート（ＬＰ０１）である。一部の実施形態では、イオン化性脂質は、ジ（（Ｚ）－ノン－２－エン－１－イル）９－（（４－ジメチルアミノ）ブタノイル）オキシ）ヘプタデカンジオエート（Ｌ３１９）であり、例えば、米国特許出願公開第２０１２／００２７８０３号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の実施例７、８、又は９で合成される。一部の実施形態では、イオン化性脂質は、例えば、国際公開第２０１０／０５３５７２号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の実施例１４及び１６で合成された、１，１’－（（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチル）アザンジイル）ビス（ドデカン－２－オール）（Ｃ１２－２００）である。一部の実施形態では、イオン化性脂質は、イミダゾールコレステロールエステル（ＩＣＥ）脂質（３Ｓ，１０Ｒ，１３Ｒ，１７Ｒ）－１０，１３－ジメチル－１７－（（Ｒ）－６－メチルヘプタン－２－イル）－２，３，４，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７－テトラデカヒドロ－１Ｈ－シクロペンタ［ａ］フェナントレン－３－イル３－（１Ｈ－イミダゾール－４－イル）プロパノエート、例えば、国際公開第２０２０／１０６９４６号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の構造（Ｉ）である。
本明細書に記載の組成物、例えば、本明細書に記載の核酸（例えば、ＲＮＡ）（例えば、鋳型核酸又は遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸）、の送達のための脂質ナノ粒子を形成するために（例えば、他の脂質成分と組み合わせて）使用され得る脂質化合物のいくつかの非限定的な例は、
Figure 2024533312000791
 を含む。
一部の実施形態では、式（ｉ）を含むＬＮＰを使用して、本明細書に記載の遺伝子改変組成物を肝臓及び／又は肝細胞に送達する。
Figure 2024533312000792
 一部の実施形態では、式（ｉｉ）を含むＬＮＰを使用して、本明細書に記載の遺伝子改変組成物を肝臓及び／又は肝細胞に送達する。
Figure 2024533312000793
 一部の実施形態では、式（ｉｉｉ）を含むＬＮＰを使用して、本明細書に記載の遺伝子改変組成物を肝臓及び／又は肝細胞に送達する。
Figure 2024533312000794
 一部の実施形態では、式（ｖ）を含むＬＮＰを使用して、本明細書に記載の遺伝子改変組成物を肝臓及び／又は肝細胞に送達する。
Figure 2024533312000795
 一部の実施形態では、式（ｖｉ）を含むＬＮＰを使用して、本明細書に記載の遺伝子改変組成物を肝臓及び／又は肝細胞に送達する。
Figure 2024533312000796
 一部の実施形態では、式（ｖｉｉｉ）を含むＬＮＰを使用して、本明細書に記載の遺伝子改変組成物を肝臓及び／又は肝細胞に送達する。
Figure 2024533312000797
 一部の実施形態では、式（ｉｘ）を含むＬＮＰを使用して、本明細書に記載の遺伝子改変組成物を肝臓及び／又は肝細胞に送達する。
Figure 2024533312000798
 式中、
Ｘ１はＯ、ＮＲ１、又は直接結合であり、Ｘ２はＣ２～５アルキレンであり、Ｘ３はＣ（＝０）又は直接結合であり、Ｒ１はＨ又はＭｅであり、Ｒ３はＣｉ～３アルキルであり、Ｒ２はＣｉ～３アルキルであるか、又はＲ２はそれが結合している窒素原子及びＸ２の１～３個の炭素原子と一緒になって、４、５、又は６員環を形成するか、又はＸ１はＮＲ１、Ｒ１及びＲ２であり、それらが結合している窒素原子と一緒になって、５又は６員環を形成するか、又はＲ２はＲ３及びそれらが結合している窒素原子と一緒になって、５、６、又は７員環を形成し、Ｙ１はＣ２～１２アルキレンであり、Ｙ２は
Figure 2024533312000799
 から選択され、ｎは０～３であり、Ｒ４はＣｉ～１５アルキルであり、Ｚ１はＣｉ～６アルキレン又は直接結合であり、Ｚ２は
Figure 2024533312000800
 又は非存在であり、ただし、Ｚ１が直接結合である場合、Ｚ２は非存在であり；
Ｒ５はＣ５～９アルキル又はＣ６～１０アルコキシであり、Ｒ６はＣ５～９アルキル又はＣ６～１０アルコキシであり、Ｗはメチレン又は直接結合であり、Ｒ７はＨ若しくはＭｅ、又はその塩であり、ただし、Ｒ３及びＲ２がＣ２アルキルである場合、Ｘ１はＯであり、Ｘ２は直鎖Ｃ３アルキレンであり、Ｘ３はＣ（＝０）であり、Ｙ１は直鎖Ｃｅアルキレンであり、（Ｙ２）ｎ－Ｒ４は
Figure 2024533312000801
 であり、Ｒ４は直鎖Ｃ５アルキルであり、Ｚ１はＣ２アルキレンであり、Ｚ２は非存在であり、Ｗはメチレンであり、Ｒ７はＨであり、Ｒ５及びＲ６はＣｘアルコキシでない。
一部の実施形態では、式（ｘｉｉ）を含むＬＮＰを使用して、本明細書に記載の遺伝子改変組成物を肝臓及び／又は肝細胞に送達する。
Figure 2024533312000802
 一部の実施形態では、式（ｘｉ）を含むＬＮＰを使用して、本明細書に記載の遺伝子改変組成物を肝臓及び／又は肝細胞に送達する。
Figure 2024533312000803
 一部の実施形態では、ＬＮＰは、式（ｘｉｉｉ）の化合物及び式（ｘｉｖ）の化合物を含む。
Figure 2024533312000804
 一部の実施形態では、式（ｘｖ）を含むＬＮＰを使用して、本明細書に記載の遺伝子改変組成物を肝臓及び／又は肝細胞に送達する。
Figure 2024533312000805
 一部の実施形態では、式（ｘｖｉ）の製剤を含むＬＮＰを使用して、本明細書に記載の遺伝子改変組成物を肺内皮細胞に送達する。
Figure 2024533312000806
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物、例えば、本明細書に記載の核酸（例えば、ＲＮＡ）（例えば、鋳型核酸又は遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸）、の送達のための脂質ナノ粒子を形成するために使用される脂質化合物は、以下の反応の１つによって作製される：
Figure 2024533312000807
例示的な非カチオン脂質として、限定されないが、以下のものが挙げられる：ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－１－カルボン酸ジオレオイル－ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジパルミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル－ホスファチジルエタノールアミン（例えば、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ）、ジメチル－ホスファチジルエタノールアミン（例えば、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ）、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－１－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素添加ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシド、リン酸ジセチル、リソホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン又はそれらの混合物。更に、他のジアセチルホスファチジルコリン及びジアセチルホスファチジルエタノールアミンリン脂質も使用できることが理解される。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０～２４炭素鎖を有する脂肪酸由来のアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、又はオレオイルである。特定の実施形態における別の例示的な脂質として、限定しないが、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（２０２０）ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０２１／ａｃｓ．ｎａｎｏｌｅｔｔ．０ｃ０１３８６（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるものが挙げられる。こうした脂質には、一部の実施形態では、ｍＲＮＡを用いた肝トランスフェクションを改善することが判明している植物脂質（例えば、ＤＧＴＳ）が含まれる。一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、以下の構造を有し得る。
Figure 2024533312000808
脂質ナノ粒子での使用に適した非カチオン脂質の他の例として、限定しないが、無リン脂質、例えば、ステアリルアミン、ドデエイルアミン、ヘキサアデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリルポリマー、ラウリル硫酸トリエタノールアミン、アルキル－アリール硫酸塩ポリエトキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチルアンモニウム臭化物、セラミド、スフィンゴミエリンなどが挙げられる。他の非カチオン脂質は、国際公開第２０１７／０９９８２３号パンフレット又は米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書に記載されており、それらの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、非カチオン脂質は、米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の式Ｉ、ＩＩ若しくはＩＶのオレイン酸又は化合物である。非カチオン脂質は、例えば、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～３０％（ｍｏｌ）を占め得る。一部の実施形態では、非カチオン脂質含有率は、例えば、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の５～２０％（ｍｏｌ）又は１０～１５％（ｍｏｌ）である。複数の実施形態では、イオン化性脂質と中性脂質のモル比は、約２：１～約８：１（例えば、約２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、又は８：１）の範囲である。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質を一切含まない。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、膜完全性を賦与するために、ステロールなどの成分を更に含み得る。脂質ナノ粒子に使用することができるステロールの一例は、コレステロール及びその誘導体である。コレステロール誘導体の非限定的な例として、５ａ－コレスタノール、５３－コプロスタノール、コレステリル－（２－ヒドロキシ）－エチルエーテル、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエーテル、及び６－ケトコレスタノールなどの極性類似体；５ａ－コレスタン、コレステノン、５ａ－コレスタノン、５ｐ－コレスタノン、及びデカン酸コレステリルなどの非極性類似体；並びにそれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、コレステロール誘導体は、極性類似体、例えば、コレステリル－（４’－ヒドロキシ）－ブチルエステルである。例示的なコレステロール誘導体は、国際公開第２００９／１２７０６０号パンフレット及び米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
一部の実施形態では、膜完全性を賦与する成分、例えば、ステロールなどは、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～５０％（ｍｏｌ）（例えば、０～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、又は４０～５０％）を含む。一部の実施形態では、こうした成分は、脂質ナノ粒子の総脂質の２０～５０％（ｍｏｌ）、３０～４０％（ｍｏｌ）である。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は共役脂質分子を含み得る。一般に、これらは、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、且つ／又は立体安定化をもたらす。例示的な共役脂質として、限定されないが、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（例えば、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート）、カチオンポリマー脂質（ＣＰＬ）コンジュゲート、及びそれらの混合物が挙げられる。一部の実施形態では、共役脂質分子は、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）共役脂質である。
例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートとして、限定されないが、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（例えば、１－（モノメトキシ－ポリエチレングリコール）－２，３－ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ－ＤＭＧ））、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ－ＰＥ）、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ、メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ－ＰＥＧ－２Ｋ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ－ＤＡＧ）（例えば、４－０－（２’，３’－ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル－１－０－（ｗ－メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ－Ｓ－ＤＭＧ））、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ－（カルボニル－１－メトキシポリエチレングリコール２０００）－１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミンナトリウム塩又はそれらの混合物が挙げられる。別の例示的なＰＥＧ－脂質コンジュゲートは、例えば、米国特許第５，８８５，６ｌ３号明細書、米国特許第６，２８７，５９ｌ号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書、米国特許出願公開第２００３／００７７８２９号明細書、米国特許出願公開第２００５／０１７５６８２号明細書、米国特許出願公開第２００８／００２００５８号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１１７１２５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０１３０５８８号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書、米国特許出願公開第２０１７／０１１９９０４号明細書、及び米国特許出願公開第／０９９８２３号明細書に記載されており、これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、米国特許出願公開第２０１８／００２８６６４号明細書（その内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる）の式ＩＩＩ、ＩＩＩ－ａ－Ｉ、ＩＩＩ－ａ－２、ＩＩＩ－ｂ－１、ＩＩＩ－ｂ－２の化合物である。一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、米国特許出願公開第２０１５０３７６１１５号明細書又は米国特許出願公開第２０１６／０３７６２２４号明細書（いずれの内容も、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の式ＩＩのものである。一部の実施形態では、ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウロイルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル、又はＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ－脂質は、以下：ＰＥＧ－ＤＭＧ、ＰＥＧ－ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ－ジステリルグリセロール、ＰＥＧ－ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ－ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ－ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ－ジステリルグリカミド、ＰＥＧ－コレステロール（ｌ－［８’－（コレスト－５－エン－３［β］－オキシ）カルボキサミド－３’，６’－ジオキサオクタニル］カルバモイル－［ω］－メチル－ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ－ＤＭＢ（３，４－ジテトラデコキシルベンジル－［ω］－メチル－ポリ（エチレングリコール）エーテル）、及び１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］の１つ若しくは複数であり得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、ＰＥＧ－ＤＭＧ、１，２－ジミリストイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［メトキシ（ポリエチレングリコール）－２０００］を含む。一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質は、以下：
Figure 2024533312000809
 から選択される構造を含む。
一部の実施形態では、ＰＥＧ－脂質の代わりに、ＰＥＧ以外の分子と共役した脂質を使用することもできる。例えば、ＰＥＧ－脂質の代わりに、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ポリアミド－脂質コンジュゲート（例えば、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート）、及びカチオンポリマー脂質（ＧＰＬ）コンジュゲートを使用することができる。
例示的な共役脂質、すなわちＰＥＧ－脂質、（ＰＯＺ）－脂質コンジュゲート、ＡＴＴＡ－脂質コンジュゲート、及びカチオンポリマー脂質は、国際公開第２０１９０５１２８９Ａ９号パンフレットの表２及び国際公開第２０２０１０６９４６Ａ１号パンフレットに列挙されるＰＣＴ及びＬＩＳ特許出願に記載されており、これらの内容は全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、式（ｘｉｘ）の化合物、式（ｘｘｉ）の化合物及び式（ｘｘｖ）の化合物を含む。一部の実施形態では、式（ｘｉｘ）、式（ｘｘｉ）及び式（ｘｘｖ）の製剤を含むＬＮＰを使用して、本明細書に記載の遺伝子改変組成物を肺又は肺細胞に送達する。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、式（ｉ）、式（ｉｉ）、式（ｉｉｉ）、式（ｖｉｉ）、及び式（ｉｘ）から選択される１つ又は複数のカチオン性脂質を含み得る。一部の実施形態では、ＬＮＰは、１つ又は複数の中性脂質、例えばＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、ＳＭ、ステロイド、例えばコレステロール及び／又は１つ又は複数のポリマーと共役した脂質、例えばＰＥＧ化脂質、例えばＰＥＧ－ＤＡＧ、ＰＥＧ－ＰＥ、ＰＥＧ－Ｓ－ＤＡＧ、ＰＥＧ－ｃｅｒ又はＰＥＧジアルコキシプロピルカルバメートを更に含む。
一部の実施形態では、ＰＥＧ又は共役脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０～２０％（ｍｏｌ）を占め得る。一部の実施形態では、ＰＥＧ又は共役脂質の含有率は、脂質ナノ粒子中に存在する総脂質の０．５～１０％又は２～５％（ｍｏｌ）である。イオン化性脂質、非カチオン脂質、ステロール、及びＰＥＧ／共役脂質のモル比は、必要に応じて変動し得る。例えば、脂質粒子は、組成物のモル又は総重量当たり３０～７０％のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり０～６０％のコレステロールと、組成物のモル又は総重量当たり０～３０％の非カチオン脂質と、組成物のモル又は総重量当たり１～１０％の共役脂質とを含み得る。好ましくは、組成物は、組成物のモル又は総重量当たり３０～４０％のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり４０～５０％のコレステロールと、組成物のモル又は総重量当たり１０～２０％の非カチオン脂質とを含む。一部の実施形態では、組成物は、組成物のモル又は総重量当たり５０～７５％のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり２０～４０％のコレステロールと、組成物のモル又は総重量当たり５～１０％の非カチオン脂質と、組成物のモル又は総重量当たり１～１０％の共役脂質である。組成物は、組成物のモル又は総重量当たり６０～７０％のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり２５～３５％のコレステロールと、組成物のモル又は総重量当たり５～１０％の非カチオン脂質とを含み得る。組成物はまた、組成物のモル又は総重量当たり最大９０％のイオン化性脂質と、組成物のモル又は総重量当たり２～１５％の非カチオン脂質とを含み得る。製剤は、例えば、組成物のモル若しくは総重量当たり８～３０％のイオン化性脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり５～３０％の非カチオン脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり０～２０％のコレステロールと；組成物のモル若しくは総重量当たり４～２５％のイオン化性脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり４～２５％の非カチオン脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり２～２５％のコレステロールと、組成物のモル若しくは総重量当たり１０～３５％の共役脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり５％のコレステロール；又は組成物のモル若しくは総重量当たり２～３０％のイオン化性脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり２～３０％の非カチオン脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり１～１５％のコレステロールと、組成物のモル若しくは総重量当たり２～３５％の共役脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり１～２０％のコレステロール；或いはまた組成物のモル若しくは総重量当たり最大９０％のイオン化性脂質と、組成物のモル若しくは総重量当たり２～１０％の非カチオン脂質と、又は組成物のモル若しくは総重量当たり１００％のカチオン脂質でもあり得る。一部の実施形態では、脂質粒子製剤は、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化性脂質、リン脂質、コレステロール及びＰＥＧ化脂質を含む。一部の他の実施形態では、脂質粒子製剤は、６０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化性脂質、コレステロール及びＰＥＧ化脂質を含む。
一部の実施形態では、脂質粒子は、イオン化性脂質、非カチオン脂質（例えば、リン脂質）、ステロール（例えば、コレステロール）及びＰＥＧ化脂質を含み、ここで、脂質のモル比は、イオン化性脂質の場合、２０～７０モル％の範囲で、目標は４０～６０であり、非カチオン脂質のモルパーセントは、０～３０の範囲で、目標は０～１５、ステロールのモルパーセントは、２０～７０の範囲で、目標は３０～５０、ＰＥＧ化脂質のモルパーセントは、１～６の範囲で、目標は２～５である。
一部の実施形態では、脂質粒子は、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で、イオン化性脂質／非カチオン脂質／ステロール／共役脂質を含む。
一態様では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン及びホスファチジルエタノールアミンを含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。
一部の実施形態では、１つ又は複数の別の化合物を含有させることができる。そうした化合物は個別に投与することもできるし、又は追加的化合物を本発明の脂質ナノ粒子に含有させることもできる。言い換えれば、脂質ナノ粒子は、核酸又は最初の核酸と異なる少なくとも１つの第２の核酸に加えて、他の化合物を含有することができる。限定はしないが、他の追加的化合物は、以下：小若しくは大有機又は無機分子、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、多糖、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体及びその誘導体、ペプチド模倣物、核酸、核酸類似体及びその誘導体、生体材料から調製された抽出物、又はそれらの任意の組合せから選択することができる。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子（又は脂質ナノ粒子を含む製剤）は、反応性不純物（例えば、アルデヒド又はケトン）を欠いているか、又は予め選択されたレベル未満の反応性不純物（例えば、アルデヒド又はケトン）を含む。特定の理論に束縛されることを意図しないが、一部の実施形態では、脂質試薬を使用して脂質ナノ粒子製剤を作製し、脂質試薬は、混入反応性不純物（例えば、アルデヒド又はケトン）を含み得る。脂質試薬は、予め選択されたレベル未満の反応性不純物（例えば、アルデヒド又はケトン）を有することに基づいて、製造のために選択され得る。特定の理論に束縛されることを意図しないが、一部の実施形態では、アルデヒドは、ＲＮＡの修飾及び損傷、例えば、塩基間の架橋及び／又は脂質のＲＮＡへの共有結合（例えば、脂質－ＲＮＡ付加物の形成）を引き起こし得る。これは、いくつかの事例では、逆転写酵素反応の失敗及び／又は不適切な塩基の組込み（例えば、損傷部位で）、例えば、新しく合成された標的ＤＮＡの変異につながる可能性がある。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の総反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有量を含む脂質試薬を使用して産生される。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む脂質試薬を使用して産生される。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、（ｉ）５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の総反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有量；及び（ｉｉ）５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む、脂質試薬を使用して産生される。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、複数の脂質試薬を使用して産生され、複数の脂質試薬は各々独立して、この段落に記載された１つ又は複数の基準を満たす。一部の実施形態では、複数の各脂質試薬は、同じ基準、例えば、本段落の基準を満たす。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の総反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有量を含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、（ｉ）５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の総反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有量；及び（ｉｉ）５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子又はその製剤に使用される脂質試薬の１つ以上、又は任意選択で全ては、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の総反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有量を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子又はその製剤に使用される脂質試薬の１つ以上、又は任意選択で全ては、５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載の脂質ナノ粒子又はその製剤に使用される脂質試薬の１つ以上、又は任意選択で全ては、（ｉ）５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の総反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有量；及び（ｉｉ）５％、４％、３％、２％、１％、０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、又は０．１％未満の任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種を含む。
一部の実施形態では、総アルデヒド含有量及び／又は任意の単一反応性不純物（例えば、アルデヒド）種の量は、例えばタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）と組み合わせた、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）により、例えばＰＣＴ／ＵＳ２１／２０９４８号明細書の実施例４０に記載の方法に従って決定される。一部の実施形態では、反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有量及び／又は反応性不純物（例えば、アルデヒド）種の量は、例えば脂質試薬中の、反応性不純物（例えば、アルデヒド）の存在に関連した、核酸分子（例えば、ＲＮＡ分子、例えば、本明細書に記載されるもの）の１つ又は複数の化学修飾を検出することによって決定される。一部の実施形態では、反応性不純物（例えば、アルデヒド）含有量及び／又は反応性不純物（例えば、アルデヒド）種の量は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２１／２０９４８号明細書の実施例４１に記載される方法に従い、例えば脂質試薬中の反応性不純物（例えば、アルデヒド）の存在に関連した、ヌクレオチド又はヌクレオシド（例えば、リボヌクレオチド又はリボヌクレオシド、例えば鋳型核酸に含まれるか、又は鋳型核酸から単離されたもの、例えば本明細書に記載されるもの）の１つ又は複数の化学修飾を検出することによって決定される。複数の実施形態では、核酸分子、ヌクレオチド又はヌクレオシドの化学修飾は、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２１／２０９４８号明細書の実施例４１に記載される方法に従って、例えば、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を用いて、１つ又は複数の修飾ヌクレオチド又はヌクレオシドの存在を決定することによって検出される。
一部の実施形態では、本明細書に記載の核酸（例えば、ＲＮＡ）（例えば、鋳型核酸又は遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸）は、アルデヒド修飾を含まないか、又は予め選択された量未満のアルデヒド修飾を含む。一部の実施形態では、平均して、核酸は、１０００ヌクレオチドあたり５０、２０、１０、５、２又は１未満のアルデヒド修飾を有し、例えば、２つのヌクレオチドの単一の架橋は単一のアルデヒド修飾である。一部の実施形態では、アルデヒド修飾はＲＮＡ付加（例えば、脂質ＲＮＡ付加）である。一部の実施形態では、アルデヒド修飾ヌクレオチドは、塩基間で架橋している。一部の実施形態では、本明細書に記載される核酸（例えば、ＲＮＡ）は、ヌクレオチド間に５０、２０、１０、５、２又は１未満の架橋を含む。
一部の実施形態では、ターゲティングドメインの付加により、ＬＮＰを特定の組織に指向させる。例えば、生物学的リガンドをＬＮＰの表面に展示して、同種受容体を展示する細胞との相互作用を増強し、それにより上記受容体との結合並びに細胞が受容体を発現する組織へのカーゴ送達を駆動することができる。一部の実施形態では、生物学的リガンドは、肝臓への送達を駆動するリガンドであり得、例えば、ＧａｌＮＡｃを展示するＬＮＰは、アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）を展示する肝細胞に対する核酸カーゴの送達を達成する。Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １８（７）：１３５７－１３６４ ２０１０）の論文は、観察可能なＬＮＰカーゴ効果（例えば、その中の図６を参照）についてＡＳＧＰＲに依存的なＬＮＰを取得するためのＰＥＧ－脂質に対する三価ＧａｌＮＡｃリガンド（ＧａｌＮＡｃ－ＰＥＧ－ＤＳＧ）の共役を教示している。例えば、葉酸塩、トランスフェリン、又は抗体を含む他のリガンド展示ＬＮＰ製剤は、国際公開第２０１７２２３１３５号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）、更には、そこで使用される参照文献、すなわちＫｏｌｈａｔｋａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１ ８：１９７－２０６；Ｍｕｓａｃｃｈｉｏ ａｎｄ Ｔｏｒｃｈｉｌｉｎ，Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ．２０１１ １６：１３８８－１４１２；Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｍｅｍｂｒ Ｂｉｏｌ．２０１０ ２７：２８６－２９８；Ｐａｔｉｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．２００８ ２５：１－６１；Ｂｅｎｏｉｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．２０１１ １２：２７０８－２７１４；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．２００８ ５：３０９－３１９；Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：１３５７－１３６４；Ｓｒｉｎｉｖａｓａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ ８２０：１０５－１１６；Ｂｅｎ－Ａｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１２ ７５７：４９７－５０７；Ｐｅｅｒ ２０１０ Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０：６３－６８； Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００７ １０４：４０９５－４１００；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２０１１ ７２１：３３９－３５３；Ｓｕｂｒａｍａｎｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１０ １８：２０２８－２０３７；Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２００５ ２３：７０９－７１７；Ｐｅｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８ ３１９：６２７－６３０；及びＰｅｅｒ ａｎｄ Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２０１１ １８：１１２７－１１３３で論じられている。
一部の実施形態では、イオン化性脂質、両性リン脂質、コレステロール及びポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）脂質などの伝統的成分を含む製剤に対するＳｅｌｅｃｔｉｖｅ ＯＲｇａｎ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＳＯＲＴ）分子の添加により、組織特異的活性についてＬＮＰを選択する。Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ １５（４）：３１３－３２０（２０２０）の教示は、補足的「ＳＯＲＴ」成分の添加により、インビボＲＮＡ送達プロファイルを厳密に改変し、ＳＯＲＴ分子のパーセンテージ及び生物物理学的特性に応じて組織特異的（例えば、肺、肝臓、脾臓）遺伝子送達を媒介することを実証している。
一部の実施形態では、ＬＮＰは、生分解性、イオン化性脂質を含む。一部の実施形態では、ＬＮＰは、オクタデカ－９，１２－ジエン酸（９Ｚ，ｌ２Ｚ）－３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルを含み、これは、（９Ｚ，ｌ２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン酸）３－（（４，４－ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）－２－（（（（３－ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルとも呼ばれる。例えば、国際公開第２０１９／０６７９９２号パンフレット、国際公開第２０１７／１７３０５４号パンフレット、国際公開第２０１５／０９５３４０号パンフレット及び国際公開第２０１４／１３６０８６号パンフレット並びにそこに記載される参照文献に記載の脂質を参照されたい。一部の実施形態では、ＬＮＰ脂質に関して、カチオン（性）及びイオン化性という用語は互換可能であり、例えば、イオン化性脂質は、ｐＨによってはカチオン性である。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるＬＮＰは、表１９に記載される脂質を含む。
Figure 2024533312000810
一部の実施形態では、遺伝子改変システムの複数の構成要素を単一のＬＮＰ製剤として調製し得、例えば、ＬＮＰ製剤は、遺伝子改変ポリペプチドコードするｍＲＮＡ及びＲＮＡ鋳型を含む。核酸成分の比は、治療薬の特性を最大にするために変動させ得る。一部の実施形態では、ＲＮＡ鋳型と、遺伝子改変ポリペプチドコードするｍＲＮＡの比は、モル比で約１：１～１００：１、例えば、約１：１～２０：１、約２０：１～４０：１、約４０：１～６０：１、約６０：１～８０：１、又は約８０：１～１００：１である。他の実施形態では、複数の核酸のシステムは、個別の製剤、例えば、鋳型ＲＮＡを含む１つのＬＮＰ製剤と、遺伝子改変ポリペプチドコードするｍＲＮＡを含む第２のＬＮＰ製剤により調製され得る。一部の実施形態では、システムは、ＬＮＰに製剤化された３つ以上の核酸成分を含み得る。一部の実施形態では、システムは、少なくとも１つのＬＮＰに製剤化された、タンパク質、例えば、遺伝子改変システム、及び鋳型ＲＮＡを含み得る。
一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、例えば、動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定して、数１０ｎｍ～数１００ｎｍであり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約４０ｎｍ～約１５０ｎｍ、例えば、約４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、７５ｎｍ、８０ｎｍ、８５ｎｍ、９０ｎｍ、９５ｎｍ、１００ｎｍ、１０５ｎｍ、１１０ｎｍ、１１５ｎｍ、１２０ｎｍ、１２５ｎｍ、１３０ｎｍ、１３５ｎｍ、１４０ｎｍ、１４５ｎｍ又は１５０ｎｍであり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約５０ｎｍ～約１００ｎｍ、約５０ｎｍ～約９０ｎｍ、約５０ｎｍ～約８０ｎｍ、約５０ｎｍ～約７０ｎｍ、約５０ｎｍ～約６０ｎｍ、約６０ｎｍ～約１００ｎｍ、約６０ｎｍ～約９０ｎｍ、約６０ｎｍ～約８０ｎｍ、約６０ｎｍ～約７０ｎｍ、約７０ｎｍ～約１００ｎｍ、約７０ｎｍ～約９０ｎｍ、約７０ｎｍ～約８０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１００ｎｍ、約８０ｎｍ～約９０ｎｍ又は約９０ｎｍ～約１００ｎｍであり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約７０ｎｍ～約１００ｎｍであり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約８０ｎｍであり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約１００ｎｍであり得る。一部の実施形態では、ＬＮＰ製剤の平均ＬＮＰ径は、約１ｍｍ～約５００ｍｍ、約５ｍｍ～約２００ｍｍ、約１０ｍｍ～約１００ｍｍ、約２０ｍｍ～約８０ｍｍ、約２５ｍｍ～約６０ｍｍ、約３０ｍｍ～約５５ｍｍ、約３５ｍｍ～約５０ｍｍ、又は約３８ｍｍ～約４２ｍｍの範囲である。
ＬＮＰは、いくつかの事例では、比較的均質であり得る。多分散指数を用いて、ＬＮＰの均質性、例えば、脂質ナノ粒子の粒度分布を示すことができる。低い（例えば、０．３未満の）多分散指数は、概して、狭い粒度分布を示す。ＬＮＰは、約０～約０．２５、例えば、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、又は０．２５の多分散指数を有し得る。一部の実施形態では、ＬＮＰの多分散指数は、約０．１０～約０．２０であり得る。
ＬＮＰのゼータ電位を用いて、組成物の界面動電位を示すことができる。一部の実施形態では、ゼータ電位は、ＬＮＰの表面電荷を表し得る。高度に荷電された種は、身体内の細胞、組織、及び他の要素と不必要に相互作用する可能性があるため、正又は負の比較的低い電荷を持つ脂質ナノ粒子が一般的に望ましい。一部の実施形態では、ＬＮＰのゼータ電位は、約－１０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－１０ｍＶ～約０ｍＶ、約－１０ｍＶ～約－５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約－５ｍＶ～約＋５ｍＶ、約－５ｍＶ～約０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋２０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１５ｍＶ、約０ｍＶ～約＋１０ｍＶ、約０ｍＶ～約＋５ｍＶ、約＋５ｍＶ～約２０ｍＶ、約＋５ｍＶ～約１５ｍＶ又は約＋５ｍＶ～約１０ｍＶであり得る。
タンパク質及び／又は核酸、例えば、遺伝子改変ポリペプチド若しくはポリペプチドをコードするｍＲＮＡの封入の効率は、提供される初期量と比較して、封入されるか若しくは調製後にＬＮＰと結合されるタンパク質及び／又は核酸の量を表す。封入効率は、高い（例えば、１００％近く）のが望ましい。封入効率は、例えば、１若しくは複数種の溶媒又はデタージェントで脂質ナノ粒子を分解する前と後で、脂質ナノ粒子を含有する溶液中のタンパク質又は核酸の量を比較することにより、測定することができる。アニオン交換樹脂を用いて、溶液中の遊離タンパク質又は核酸（例えば、ＲＮＡ）の量を測定することができる。蛍光を用いて、溶液中の遊離タンパク質又は核酸（例えば、ＲＮＡ）の量を測定することができる。本明細書に記載の脂質ナノ粒子の場合、タンパク質及び／又は核酸の封入効率は、少なくとも５０％、例えば、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％若しくは１００％であり得る。一部の実施形態では、封入効率は、少なくとも８０％であり得る。一部の実施形態では、封入効率は、少なくとも９０％であり得る。一部の実施形態では、封入効率は、少なくとも９５％であり得る。
ＬＮＰは、任意選択で、１つ又は複数のコーティングを含み得る。一部の実施形態では、ＬＮＰは、コーティングを有するカプセル、フィルム又は錠剤に製剤化され得る。本明細書に記載の組成物を含むカプセル、フィルム又は錠剤は、任意の有用なサイズ、引張強度、硬度若しくは密度を有し得る。
ＬＮＰの更に別の例示的な脂質、製剤、方法、及び特性決定は、国際公開第２０２００６１４５７号パンフレットに教示されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
一部の実施形態では、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）又はＴｒａｎｓＩＴ－ｍＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ）を用いて、インビトロ又はエクスビボ細胞リポフェクションを実施する。特定の実施形態では、ＧｅｎＶｏｙ＿ＩＬＭ ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ ｍｉｘ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ＮａｎｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いて、ＬＮＰを製剤化する。特定の実施形態では、ＬＮＰは、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－ＫＣ２‐ＤＭＡ）又はジリノレイルメチル－４－ジメチルアミノ酪酸塩（ＤＬｉｎ－ＭＣ３－ＤＭＡ若しくはＭＣ３）を用いて、ＬＮＰを製剤化するが、その製剤及びインビボでの使用については、Ｊａｙａｒａｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ Ｉｎｔ Ｅｄ Ｅｎｇｌ ５１（３４）：８５２９－８５３３（２０１２）に教示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステム、例えば、Ｃａｓ９－ｇＲＮＡ ＲＮＰ、ｇＲＮＡ、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡの送達のために最適化されたＬＮＰ製剤は、国際公開第２０１９０６７９９２号パンフレット及び国際公開第２０１９０６７９１０号パンフレットに記載されており、そのいずれも参照により本明細書に組み込まれる。
核酸の送達に有用な別の具体的なＬＮＰ製剤は、米国特許第８１５８６０１号明細書及び米国特許第８１６８７７５号明細書（そのいずれも参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、これは、ＯＮＰＡＴＴＲＯの名称で販売されているパチシランに使用される製剤を含む。
遺伝子改変ＬＮＰの例示的な用量としては、約０．１、０．２５、０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、８、１０、又は１００ ｍｇ／ｋｇ（ＲＮＡ）を挙げることができる。システムの１つ若しくは複数の成分をコードする核酸を含むＡＡＶの例示的な用量としては、約１０１１、１０１２、１０１３、及び１０１４ｖｇ／ｋｇのＭＯＩを挙げることができる。
遺伝子改変ポリペプチドをコードするｍＲＮＡには、キャップ、コザックを含有する５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及び少なくとも６０個のＡを含有するポリＡテール（配列番号２５６９５）を有し得る。遺伝子改変ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、コドンの選択／最適化によって低下したウリジン含有量を有し得る。遺伝子改変ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％が５－メトキシウリジンで置換されたウリジンを有し得る。遺伝子改変ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％がＮ１－メチル－シュードウリジンで置換されたウリジンを有し得る。遺伝子改変ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、ｍＲＮＡ中のシトシンの約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％が５－メチルシトシンに置換されたシトシンを有し得る。遺伝子改変ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、シトシンの５－メチルシトシンによる約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の置換と、ウリジンの５－メトキシウリジンによる約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の置換の組み合わせを有し得る。遺伝子改変ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、シトシンの５－メチルシトシンによる約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の置換と、ウリジンのＮ１－メチル－シュードウリジンによる約１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の置換の組み合わせを有し得る。
ガイドＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって合成され得る。ガイドＲＮＡは化学的に合成され、例えば２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、及び／又はホスホロチオエートなどの改変を含有し得る。ガイドＲＮＡの最も末端の３つのヌクレオチドは、ヌクレオチド間に３つのホスホロチオエート結合を有する２’－Ｏ－メチル改変を含有し得る。シトシン及びウリジンが２’－フルオロ改変を含有する、ガイドＲＮＡの「シード」に見られるヌクレオチドを除き、ガイドＲＮＡは、シトシン及びウリジンがあるところに２’－Ｏ－メチル改変ヌクレオチドを含有し得る。
遺伝子改変ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、本明細書に記載されるようにＬＮＰ中に共製剤化され得る。これらは、別々に製剤化され得る。これらは、注射前に組み合わされ得る。これらは、約１：１０～１：２５０のｍＲＮＡ：ｇＲＮＡのモル比の範囲で組み合わされ得る。これらは、約１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：１１０、１：１２０、１：１３０、１：１４０、１：１５０、１：１６０、１：１７０、１：１８０、１：１９０、１：２００、１：２１０、１：２２０、１：２３０、１：２４０、又は１：２５０のｍＲＮＡ：ｇＲＮＡのモル比で製剤化され得る。ｍＲＮＡとガイドＲＮＡは、最初にｍＲＮＡ ＬＮＰが送達され、その後にガイドＲＮＡ ＬＮＰが送達されるように、３０～１８０分の間隔で注入され得る。これは、約３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、又は１８０分の間隔で送達され得る。ｍＲＮＡ及び／又はｇＲＮＡは、ＲＮＡ－ＬＮＰの総量として別々に又は一緒に０．０１～６ｍｇ／ｋｇで投与され得る。ＲＮＡ－ＬＮＰは、ＩＶボーラスで注入され得る。ＲＮＡ－ＬＮＰは、３０～３６０分かけて注入され得る。ＲＮＡ－ＬＮＰは、約３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０、３００、３３０又は３６０分間にわたって注入され得る。
Ｅ３４２Ｋ変異を修正するための例示的な遺伝子改変システム
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、ＰｉＺモデルにおけるＥ３４２Ｋ変異を修正するために使用される遺伝子改変システムの成分は、編集の効率及び精度を最適化するために以下のように改変される。
遺伝子改変ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、そのＮ末端及びＣ末端に、二分ＳＶ４０ ＮＬＳ配列（ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ６０１７１８２００）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変システム構築物は、そのＮ末端に改変されたｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ及び二分ＳＶ４０ ＮＬＳを含み、Ｃ末端には改変された二分ＳＶ４０ ＮＬＳとそれに続くＳＶ４０ ＮＬＳがＳＧＧＳ（配列番号２５６９４）リンカーを介して逆転写酵素に連結されている。いくつかの実施形態では、各ＮＬＳの間、及びＮＬＳと融合タンパク質の間のリンカーは、ＳＧＧＳ（配列番号２５６９４）リンカーである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされる融合タンパク質の３２アミノ酸リンカーは、ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳ（配列番号１９５２５）である。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼ活性を生成するＣａｓ９ドメインの触媒変異は、Ｈ８４０Ａ又はＮ８６３Ａである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、キャップ、コザック配列を含有する５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及び少なくとも６０個のＡを含有するポリＡテール（配列番号２５６９５）を有する。いくつかの実施形態では、コドンの選択／最適化により、ｍＲＮＡのウリジン含有量が減少する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ内のウリジンは、５－メトキシウリジンで１００％置換される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ内のウリジンは、Ｎ１－メチル－シュードウリジンで１００％置換される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ内のシトシンは、５－メチルシトシンで１００％置換される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、シトシンの５－メチルシトシンによる１００％置換と、ウリジンの５－メトキシウリジンによる１００％置換との組み合わせを含有する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、シトシンの５－メチルシトシンによる１００％置換と、ウリジンのＮ１－メチル－シュードウリジンによる１００％置換との組み合わせを含有する。いくつかの実施形態では、上記の改変の組み合わせは、改変されていないヌクレオチドの０～１００％の置換、例えば、０～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、又は９０～１００％未満の置換を含む。いくつかの実施形態では、システムのｍＲＮＡによってコードされる遺伝子改変ポリペプチドは、配列：
Figure 2024533312000811
Figure 2024533312000812
Figure 2024533312000813
 を含む。
鋳型ＲＮＡ及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡ。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変システムは、遺伝子改変ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに加えて、鋳型ＲＮＡのみを使用する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変システムは、システムのＣａｓ９ニッカーゼを、標的ＤＮＡの編集されていない鎖に標的化する、第２のニックガイドＲＮＡを更に使用する。いくつかの実施形態では、ＳＥＲＰＩＮＡ１を標的とする遺伝子改変鋳型ＲＮＡは、
Figure 2024533312000814
 である。いくつかの実施形態では、第２のニッキングのための任意選択によるガイドＲＮＡは、ＧＧＵＵＵＧＵＵＧＡＡＣＵＵＧＡＣＣＵＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵ（配列番号１９５２８）である。いくつかの実施形態では、鋳型ＲＮＡ及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって合成される。いくつかの実施形態では、鋳型ＲＮＡ及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡは、化学的に合成され、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、及び／又はホスホロチオエートの１つ又は複数の改変の組み合わせを含有する。いくつかの実施形態では、最も末端の３つのヌクレオチドは、ヌクレオチド間に３つのホスホロチオエート結合を有する２’－Ｏ－メチル改変を含有する。いくつかの実施形態では、鋳型ＲＮＡ及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡは、ｇＲＮＡスペーサーのシード配列（例えば、スペーサー領域の３’末端のシード配列）に見られるヌクレオチド（ここでは、シトシン及びウリジンは、２’－フルオロ改変並びに／又は２’－フルオロ及び２’ヒドロキシルの組み合わせを含有する）を除き、シトシン及びウリジンが存在する場合、２’－Ｏ－メチル改変ヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、上記の改変の組み合わせは、改変されていないヌクレオチドの０～１００％の置換、例えば、０～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、又は９０～１００％未満の置換を含む。
製剤。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドｍＲＮＡ及び鋳型ＲＮＡ（及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡ）は、上記のように別々に製剤化され、それぞれｍＲＮＡ：鋳型ＲＮＡ（及び任意選択でｍＲＮＡ：第２のニックガイドＲＮＡ）のＲＮＡモル比１：２０で注入前に組み合わされる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドｍＲＮＡ及び鋳型ＲＮＡ（及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡ）は、上記のように別々に製剤化され、それぞれｍＲＮＡ：ガイドＲＮＡ（及び任意選択でｍＲＮＡ：第２のニックガイドＲＮＡ）のＲＮＡモル比１：５０で注入前に組み合わされる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドｍＲＮＡ及び鋳型ＲＮＡ（及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡ）は別々に製剤化され、それぞれｍＲＮＡ：鋳型ＲＮＡ（及び任意選択でｍＲＮＡ：第２のニックガイドＲＮＡ）が１：１０～１：２５０の範囲の比で注入前に組み合わされる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ及び鋳型ＲＮＡ（及び任意選択による第２のニックガイドＮＲＡ）は、ｍＲＮＡ：鋳型ＲＮＡ（及び任意選択でｍＲＮＡ：第２のニックガイドＲＮＡ）が１：１０～１：２５０で一緒に混合され、次に上記のように製剤化され、ここで製剤化されるＲＮＡ濃度は０．１ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ及び鋳型ＲＮＡ（及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡ）は別々に製剤化され、３０～１８０分間隔で注入され、ここで最初にｍＲＮＡ ＬＮＰが送達され、その後に鋳型ＲＮＡ（及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡ）ＬＮＰが送達される。いくつかの実施形態では、イオン化脂質（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）は、表１９のＬＩＰＩＤＶ００５である。
投与。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドｍＲＮＡ及び／又は鋳型ＲＮＡ（及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡ）は、ＲＮＡ－ＬＮＰの総量として別々に又は一緒に、０．０１～６ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－ＬＮＰは、ＩＶボーラスとして注入される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－ＬＮＰは、３０～３６０分間にわたって注入される。
キット、製品、及び医薬組成物
一態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載される、遺伝子改変ポリペプチド又は遺伝子改変システムを含むキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、遺伝子改変ポリペプチド（又はポリペプチドをコードする核酸）及び鋳型ＲＮＡ（又は鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、キットは、細胞にシステムを導入するための試薬、例えば、トランスフェクション試薬、ＬＮＰなどを更に含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される方法のいずれかに好適である。一部の実施形態では、キットは、例えば、製品内に配置されるような、１つ若しくは複数のエレメント、組成物（例えば、医薬組成物）、遺伝子改変ポリペプチド、及び／又は遺伝子改変システム又はその機能的フラグメント若しくは成分を含む。一部の実施形態では、キットは、その使用説明書を含む。
一態様では、本開示は、製品、例えば、その中に本明細書に記載されるキット、又はその要素が配置される製品を提供する。
一態様では、本開示は、例えば、本明細書に記載される、遺伝子改変ポリペプチド又は遺伝子改変システムを含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤を更に含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡを含む。複数の実施形態では、医薬組成物は、以下の特徴の１つ又は複数（例えば、１、２、３若しくは４つ）を有する：
（ａ）例えば、モル基準で、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％若しくは０．１％未満）のＤＮＡ鋳型；
（ｂ）例えば、モル基準で、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％若しくは０．１％未満）の非キャップＲＮＡ；
（ｃ）例えば、モル基準で、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％若しくは０．１％未満）の部分長ＲＮＡ；
（ｄ）未反応キャップジヌクレオチドを実質的に含まない。
化学、製造、及び制御（ＣＭＣ）
タンパク質治療薬の精製は、例えば、Ｆｒａｎｋｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＣｕｔｌｅｒ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（２０１０）に記載されている。
一部の実施形態では、遺伝子改変システム、ポリペプチド、及び／又は鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、特定の品質基準を満たす。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法により生産された遺伝子改変システム、ポリペプチド、及び／又は鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）は、特定の品質基準を満たす。従って、本開示は、いくつかの態様では、例えば、前記品質基準が検定される、特定の品質基準を満たす遺伝子改変システム、ポリペプチド、及び／又は鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）を製造する方法に関する。本開示は、いくつかの態様では、遺伝子改変システム、ポリペプチド、及び／又は鋳型核酸（例えば、鋳型ＲＮＡ）で前記品質基準を検定する方法にも関する。一部の実施形態では、品質基準として、限定はしないが、以下の１つ又は複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２）が挙げられる：
（ｉ）鋳型ＲＮＡの長さ、例えば、鋳型ＲＮＡが、標準長さを超えるか、又は標準長さ範囲内の長さを有するか否か、例えば、存在する鋳型ＲＮＡの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％が、１００、１２５、１５０、１７５若しくは２００ヌクレオチド長を超えるか否か；
（ｉｉ）鋳型ＲＮＡ上のポリＡテールの存在、非存在、及び／又は長さ、例えば、存在する鋳型ＲＮＡの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％が、ポリＡテール（例えば、少なくとも５、１０、２０、３０、５０、７０、１００ヌクレオチド長のポリＡテール）（配列番号２５６９７）を含むか否か；
（ｉｉｉ）鋳型ＲＮＡ上の５’キャップの存在、非存在、及び／又は種類、例えば、存在する鋳型ＲＮＡの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％が、５’キャップを含むか否か、例えば、上記キャップが、７－メチルグアノシンキャップ、例えば、Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇキャップであるか否か；
（ｉｖ）鋳型ＲＮＡ中の１つ若しくは複数の修飾ヌクレオチド（例えば、プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、イノシン、７－メチルグアノシン、１－Ｎ－メチルプソイドウリジン（１－Ｍｅ－Ψ）、５－メトキシウリジン（５－ＭＯ－Ｕ）、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、又はロックドヌクレオチドから選択される）の存在、非存在、及び／又は種類、例えば、存在する鋳型ＲＮＡの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％が、１つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含むか否か；
（ｖ）鋳型ＲＮＡの安定性（例えば、時間経過による及び／若しくは予め選択した条件下で）、例えば、鋳型ＲＮＡの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％が、安定性試験の後、インタクトなままである（例えば、１００、１２５、１５０、１７５、又は２００ヌクレオチド長を超える）か否か；
（ｖｉ）ＤＮＡを修飾するためのシステム中の鋳型ＲＮＡの効力、例えば、鋳型ＲＮＡを含むシステムを効力について検定した後に、標的部位の少なくとも１％が修飾されているか否か；
（ｖｉｉ）ポリペプチド、第１のポリペプチド又は第２のポリペプチドの長さ、例えば、ポリペプチド、第１のポリペプチド又は第２のポリペプチドが、標準長さを超えるか、又は標準長さ範囲内の長さを有するか否か、例えば、存在するポリペプチド、第１のポリペプチド又は第２のポリペプチドの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％が、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００若しくは２０００アミノ酸長を超える（且つ任意選択で、２５００、２０００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００若しくは６００アミノ酸長以下である）か否か；
（ｖｉｉｉ）ポリペプチド、第１のポリペプチド又は第２のポリペプチドに対する翻訳後修飾の存在、非存在、及び／又は種類、例えば、ポリペプチド、第１のポリペプチド又は第２のポリペプチドの少なくとも８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８若しくは９９％が、リン酸化、メチル化、アセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、グリピヤチヨン若しくはリポイル化又はそれらの任意の組合せを含むか否か；
（ｉｘ）ポリペプチド、第１のポリペプチド又は第２のポリペプチド中の１つ若しくは複数の人工、合成、又は非標準アミノ酸（例えば、オルニチン、β－アラニン、ＧＡＢＡ、δ－アミノレブリン酸、ＰＡＢＡ、Ｄ－アミノ酸（例えば、Ｄ－アラニン若しくはＤ－グルタミン酸）、アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、シスタチオニン、ランチオニン、ジェンコル酸、ジアミノピメリン酸、ホモアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、ホモノルロイシン、ホモセリン、Ｏ－メチル－ホモセリン及びＯ－エチル－ホモセリン、エチオニン、セレノシステイン、セレノホモシステイン、セレノメチオニン、セレノエチオニン、テルロシステイン若しくはテルロメチオニンから選択される）の存在、非存在、及び／又は種類、例えば、存在するポリペプチド、第１のポリペプチド又は第２のポリペプチドの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％が、１つ又は複数の人工、合成、又は非標準アミノ酸を含むか否か；
（ｘ）ポリペプチド、第１のポリペプチド又は第２のポリペプチドの安定性（例えば、時間経過による及び／若しくは予め選択した条件下で）、例えば、ｗｈｅｔｈｅｒポリペプチド、第１のポリペプチド又は第２のポリペプチドの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％が、安定性試験の後に、インタクトなままである（例えば、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、１３００、１３５０、１４００、１４５０、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００若しくは２０００アミノ酸長を超える（且つ任意選択で、２５００、２０００、１５００、１４００、１３００、１２００、１１００、１０００、９００、８００、７００若しくは６００アミノ酸長以下である））か否か；
（ｘｉ）ＤＮＡを修飾するためのシステム中のポリペプチド、第１のポリペプチド又は第２のポリペプチドの効力、例えば、ポリペプチド、第１のポリペプチド又は第２のポリペプチドを含むシステムを効力について検定した後に、標的部位の少なくとも１％が修飾されているか否か；又は
（ｘｉｉ）パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体、又は宿主細胞タンパク質の１つ又は複数の存在、非存在、及び／若しくはレベル、例えば、システムが、パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体、又は宿主細胞タンパク質混入を含まないか若しくは実質的に含まないか否か。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるシステム又は医薬組成物は、エンドトキシンを含まない。
一部の実施形態では、パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体、及び／又は宿主細胞タンパク質の１つ又は複数の存在、非存在、及び／若しくはレベルが決定される。複数の実施形態では、システムが、パイロジェン、ウイルス、真菌、細菌性病原体、及び／又は宿主細胞タンパク質混入を含まないか若しくは実質的に含まないか否かが決定される。
一部の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物又はシステムは、以下の特徴１つ又は複数（例えば、１、２、３若しくは４つ）を有する：
（ａ）例えば、モル基準で、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％若しくは０．１％未満）のＤＮＡ鋳型；
（ｂ）例えば、モル基準で、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％若しくは０．１％未満）の非キャップＲＮＡ；
（ｃ）例えば、モル基準で、鋳型ＲＮＡ及び／又はポリペプチドをコードするＲＮＡに対して、１％未満（例えば、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％若しくは０．１％未満）の部分長ＲＮＡ；
（ｄ）未反応キャップジヌクレオチドを実質的に含まない。
実施例１：ヒト細胞のゲノムランディングパッドにおけるＡＡＴＤ変異を修正する鋳型ＲＮＡの構成のスクリーニング
この例は、ＡＡＴＤ変異を修正するための鋳型ＲＮＡの活性を定量化するための、遺伝子改変ポリペプチドと、異なる長さの異種目的配列及びＰＢＳ配列を含む鋳型ＲＮＡとを含有する遺伝子改変システムの使用を説明する。この例では、鋳型ＲＮＡは、
（１）ｇＲＮＡスペーサー；
（２）ｇＲＮＡスキャフォールド；
（３）異種目的配列；及び
（４）プライマー結合部位（ＰＢＳ）配列
を含有する。
表１～５に記載されている１つ以上の鋳型ＲＮＡを、この例に記載されるように試験できる。異種目的配列及びＰＢＳ配列は、対応するタンパク質のＥ３４２Ｋ変異を元に戻すために、遺伝子編集によって変異部位の「Ａ」ヌクレオチドを「Ｇ」ヌクレオチドに置き換えてランディングパッドのＡＡＴＤ変異を修正するように設計された。
ＳＥＲＰＩＮＡ１変異部位及び隣接配列を含有するＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の領域を模倣する「ランディングパッド」又は安定した組込みを有するように、細胞株が作成される。ランディングパッドのＤＮＡは、化学的に合成され、ｐＬｅｎｔｉ－Ｎ－ｔＧＦＰベクターにクローニングされる。レンチウイルス発現ベクター内のクローン化されたランディングパッド配列が確認され、ランディングパッドのサンガーシーケンシングによって配列が検証される。レンチウイルスパッケージングミックス（９μｇ、Ｂｉｏｓｅｔｔｉａ）と一緒に配列確認済みのプラスミド（９μｇ）を製造者の指示に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（商標）を使用してパッケージング細胞株、ＬｅｎｔｉＸ－２９３Ｔ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）にトランスフェクトする。トランスフェクトされた細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間（２４時間での１回の培地交換を含む）インキュベートし、培地を含むウイルス粒子を細胞培養皿から収集する。収集した培地を０．２μｍフィルターで濾過して細胞破片を除去し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質導入の準備をした。ウイルス含有培地をＤＭＥＭで希釈し、ポリブレンと混合して、ポリブレンの最終濃度が８μｇ／ｍｌであるＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質導入用の希釈系列を調製する。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をウイルス含有培地で４８時間増殖させた後、新鮮な培地で分割する。分割した細胞をコンフルエンスまで増殖させ、異なる希釈のウイルスの形質導入効率を、フローサイトメトリーによるＧＦＰ発現と、ＧＦＰ及びＳＥＲＰＩＮＡ１ランディングパッドを含むゲノム組込みレンチウイルスのｄｄＰＣＲ検出によって測定する。
（ｉ）本明細書に記載の適合性遺伝子改変ポリペプチド、例えば、表１１のＮＬＳ、表８の配列を有する適合性Ｃａｓ９ドメイン、表１０のリンカー、表６のＲＴ配列（例えば、ＭＬＶＭＳ＿Ｐ０３３５５＿ＰＬＶ９１９）、及び表１１の第２のＮＬＳを有するもの、及び（ｉｉ）表１～５のいずれかの鋳型ＲＮＡを含む遺伝子改変システムをＨＥＫ２９３Ｔランディングパッド細胞株にトランスフェクトする。遺伝子改変ポリペプチド及び鋳型ＲＮＡは、ＲＮＡ形式でヌクレオフェクションによって送達される。具体的には、１μｇの遺伝子改変ポリペプチドｍＲＮＡを１０μＭの鋳型ＲＮＡと組み合わせる。ｍＲＮＡ及び鋳型ＲＮＡを、２５０，０００個のＨＥＫ２９３Ｔランディングパッド細胞を含有する２５μＬのＳＦバッファーに加え、プログラムＤＳ－１５０を使用して細胞をヌクレオフェクションする。ヌクレオフェクション後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３日間増殖させ、その後、細胞溶解及びゲノムＤＮＡ抽出を行う。遺伝子編集活性を分析するために、ＳＥＲＰＩＮＡ１部位に隣接するプライマーを使用して、遺伝子座全体を増幅する。アンプリコンは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを使用したショートリードシーケンスによって分析される。いくつかの実施形態では、アッセイは、サンプル中のＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のコピーの少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％が、所望の野生型配列に変換されていることを示す。
実施例２：ＨＥＫ２９３Ｔ及びＵ２ＯＳ細胞におけるプールスクリーニングによる遺伝子改変ポリペプチドの選択
この実施例は、ヒトゲノムにおけるコード配列の標的化編集のためのＲＮＡ遺伝子改変システムの使用を説明する。より具体的には、この実施例は、例えば、プールスクリーニング手法により、ヒト細胞内の活性を編集するための新規な遺伝子改変ポリペプチドを評価する手段としての、遺伝子改変候補のライブラリーによるＨＥＫ２９３Ｔ及びＵ２ＯＳ細胞の感染、続いて、細胞内のインビトロ遺伝子改変のための鋳型ガイドＲＮＡ（ｔｇＲＮＡ）のトランスフェクションを説明する。
本明細書においてアッセイされる遺伝子改変ポリペプチドライブラリー候補は、それぞれ以下を含む：１）１つのエンドヌクレアーゼ活性部位を不活性化するＮ８６３Ａ変異を含有する化膿性レンサ球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ｓｐｙ）Ｃａｓ９ニッカーゼ；２）表１０に示される１２２のペプチドリンカーの１つ；及び３）レトロウイルス由来の表６からの逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン。用いられる特定のレトロウイルスＲＴドメインは、それらがモノマーとして機能することが予想される場合に選択された。各選択されたＲＴドメインについて、野生型配列及び一次野生型配列に導入された点変異を有する形態が試験された。特に、野生型であるか又は様々な変異を含む１４３のＲＴドメインが試験された。合計で、１７，４４６のＣａｓ－リンカー－ＲＴ遺伝子改変ポリペプチドが試験された。
本明細書に記載されるシステムは、１）レンチウイルスカセット内のヒトコドン最適化遺伝子改変ポリペプチドライブラリー候補をコードする発現プラスミド、及び２）Ｃａｓによって認識され、それを目的のゲノム遺伝子座に局在化し、またＵ６プロモータによって駆動されるＲＴドメインによって所望の編集の逆転写をゲノムに鋳型化するノンコーディングｔｇＲＮＡ配列を発現するｔｇＲＮＡ発現プラスミドを含む２成分システムである。レンチウイルスカセットは、（ｉ）哺乳動物細胞内の発現のためのＣＭＶプロモータ；（ｉｉ）示されるような遺伝子改変ポリペプチドライブラリー候補；（ｉｉｉ）自己切断Ｔ２Ａポリペプチド；（ｉｖ）哺乳動物細胞における選択を可能にするピューロマイシン耐性遺伝子；及び（ｖ）ポリＡテール終結シグナルを含む。
遺伝子改変ポリペプチドライブラリー候補を発現する細胞のプールを調製するために、ＨＥＫ２９３Ｔ又はＵ２ＯＳ細胞に、遺伝子改変候補プラスミドライブラリーのプールされたレンチウイルス調製物を形質導入した。ＨＥＫ２９３ Ｌｅｎｔｉ－Ｘ細胞を、レンチウイルスプラスミドトランスフェクションの前に、１５ｃｍプレートに播種した（１２×１０６個の細胞）。Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｍｉｘ（Ｂｉｏｓｅｔｔｉａ、２７ｕｇ）及び遺伝子改変候補ライブラリーのためのプラスミドＤＮＡ（２７ｕｇ）を用いたレンチウイルスプラスミドトランスフェクションを、製造業者のプロトコルに従って、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地を用いて、翌日に行った。細胞外ＤＮＡを、翌日、完全な培地交換によって除去し、ウイルス含有培地を、４８時間後に収集した。レンチウイルス培地を、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて濃縮し、５ｍＬのレンチウイルスアリコートを作製し、－８０℃で貯蔵した。レンチウイルス力価測定を、ピューロマイシン選択後にコロニー形成単位を計数することによって行った。ＢＦＰ発現ゲノムランディングパッドを担持するＨＥＫ２９３Ｔ又はＵ２ＯＳ細胞を、培養プレート中６×１０７個の細胞で播種し、細胞当たりの多重感染を最小限に抑えるために０．３感染多重度（ＭＯＩ）で形質導入した。ピューロマイシン（２．５ｕｇ／ｍＬ）を、感染細胞の選択を可能にするために、感染の４８時間後に加えた。細胞を、少なくとも７日間にわたってピューロマイシン選択下に置き、次に、ｔｇＲＮＡエレクトロポレーションのためにスケールアップした。
アッセイにおける遺伝子改変ライブラリー候補のゲノム編集能力を決定するために、次に、感染されたＢＦＰ発現ＨＥＫ２９３Ｔ又はＵ２ＯＳ細胞を、ライブラリー候補につき＞１０００×カバレージのために十分な細胞数で、ＢＦＰをＧＦＰに変換するように設計された２００ｎｇのｔｇＲＮＡ（ｇ４又はｇ１０のいずれか）プラスミドによる、２５０，０００個の細胞／ウェルのエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。
ｇ４ ｔｇＲＮＡ（５’－３’）は、以下のとおりである：２０ヌクレオチドスペーサー領域（ＧＣＣＧＡＡＧＣＡＣＴＧＣＡＣＧＣＣＧＴ；配列番号１１，０１１）、スキャフォールド領域（ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣ；配列番号１１，０１２）、ＢＦＰをＧＦＰに変化させる単一の塩基対置換（太字）及び機能遺伝子改変反応の完了時に遺伝子改変ポリペプチドの再エンゲージメントを防ぐＳｐｙＣａｓ９ ＰＡＭ（ＮＧＧからＮＣＧ）における同義点変異を導入するＰＡＭ不活性化（下線）をコードする鋳型領域（
Figure 2024533312000815
 ）、及び１３ヌクレオチドＰＢＳ（ＧＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＴＴ；配列番号１１，０１４）。
同様に、ｇ１０ ｔｇＲＮＡ（５’－３’）は、以下のとおりである：２０ヌクレオチドスペーサー領域（ＡＧＡＡＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＴＣＡＴＧ；配列番号１１，０１５）、スキャフォールド領域（ＧＴＴＴＴＡＧＡＧＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＡＡＴＡＡＧＧＣＴＡＧＴＣＣＧＴＴＡＴＣＡＡＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＣＡＣＣＧＡＧＴＣＧＧＴＧＣ；配列番号１１，０１６）、ＢＦＰをＧＦＰに変化させる単一の塩基対置換（太字）及び機能遺伝子改変反応の完了時に遺伝子改変ポリペプチドの再エンゲージメントを防ぐＳｐｙＣａｓ９ ＰＡＭ（ＮＧＧからＮＧＡ）における同義点変異を導入するＰＡＭ不活性化（下線）をコードする鋳型領域（
Figure 2024533312000816
 ）、及び１３ヌクレオチドＰＢＳ（ＧＡＡＧＣＡＧＣＡＣＧＡＣ；配列番号１１，０１８）。
アッセイにおいて様々な構築物のゲノム編集能力を評価するために、細胞を、エレクトロポレーションの６～７日後に、ＧＦＰ発現のために蛍光活性化細胞ソーティング（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｓｏｒｔｉｎｇ）（ＦＡＣＳ）によってソートした。細胞をソートし、非編集（ＢＦＰ＋）細胞、編集（ＧＦＰ＋）細胞及び不完全な編集（ＢＦＰ－、ＧＦＰ－）細胞の異なる集団として収集した。非ソート細胞のサンプルも、分析中の富化を決定するために、入力集団として収集した。
どの遺伝子改変ライブラリー候補が、このアッセイにおいてゲノム編集能力を有するかを決定するために、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、ソート及び非ソート細胞集団から収集し、各集団における遺伝子改変ライブラリー候補をシーケンシングすることによって分析した。簡潔に述べると、遺伝子改変配列を、レンチウイルスカセットに特異的なプライマーを用いてゲノムから増幅し、ゲノムＤＮＡを希釈するために第２回のＰＣＲにおいて増幅し、次に、製造業者のプロトコルに従って、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いてシーケンシングした。
シーケンシングリードの品質管理の後、少なくとも１５００且つ３２００ヌクレオチド以下のリードを、遺伝子改変ポリペプチドライブラリー配列にマップし、ライブラリー配列との最小で８０％の一致を含むものが、所与の候補と問題なく整列されたと見なされた。アッセイにおいて遺伝子編集を行うことが可能な遺伝子改変候補を同定するために、編集された集団における各ライブラリー候補のリードカウントを、最初の非ソート集団におけるそのリードカウントと比較した。このプールされたスクリーンのために、ゲノム編集能力を有する遺伝子改変候補を、非ソート（入力）細胞と比べて変換された（ＧＦＰ＋）集団において富化された候補として選択し、富化は、参照（エレメントＩＤ番号：１７３８０）の富化レベルであるか又はそれを超えると決定された。
多数の遺伝子改変ポリペプチド候補が、ＧＦＰ＋細胞集団において富化されていることが決定された。例えば、試験された１７，４４６の候補のうち、３，３００超が（非ソートと比べて）ＧＦＰ＋ソート集団において富化を示し、これは、表Ｄに示される、同様の実験条件（ｇ４ ｔｇＲＮＡを用いたＨＥＫ２９３Ｔ；ｇ１０ ｔｇＲＮＡを用いたＨＥＫ２９３Ｔ細胞；又はｇ４ ｔｇＲＮＡを用いたＵ２ＯＳ細胞）下の参照のものと少なくとも同等であった。１７，４４６の候補は、ｇ１０ ｔｇＲＮＡを用いたＵ２ＯＳ細胞でも試験されたが、プールされたスクリーンでは、その実験条件下における非ソート（入力）細胞と比べて、変換された（ＧＦＰ＋）集団において富化された候補を得られず；これらの結果を説明するために、更なる調査が必要とされる。
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実施例３：アルファ１アンチトリプシン欠乏症に関連する病原性Ｅ３４２Ｋ変異を修正するための遺伝子改変システムの送達のための脂質ナノ粒子組成物の最適化。
この例では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）成分は、国際公開第２０２１／１７８７２０号パンフレットの実施例４４に記載されているように製剤化される。具体的には、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）成分（イオン化脂質、ヘルパー脂質、ステロール、ＰＥＧ）を、脂質成分モル比がそれぞれ５０：１０：３８．５：１．５となるように１００％エタノールに溶解する。本明細書に記載される遺伝子改変ポリペプチドをコードするｍＲＮＡをインビトロ転写によって生成し、精製したｍＲＮＡを、２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４）に溶解して、ＲＮＡカーゴの最終濃度を０．１ｍｇ／ｍＬとする。同様に、ＳＥＲＰＩＮＡ１のＥ３４２Ｋ変異を修正するように設計され、任意選択で特定の遺伝子改変ポリペプチド（本明細書に記載）との使用のために最適化された鋳型ＲＮＡを、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ４）に溶解する。任意選択で、本明細書に記載の第２のニックｇＲＮＡを２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４）に溶解する。
各ＲＮＡは、脂質アミンとリン酸ＲＮＡ（Ｎ：Ｐ）のモル比が６の別個のＬＮＰに別個に製剤化された。ＬＮＰは、製造者の推奨設定を使用して、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して、脂質及びＲＮＡ溶液のマイクロ流体混合によって形成される。異なる流量を使用して、混合中、水性溶媒と有機溶媒の比率を３：１に維持する。混合後、ＬＮＰを収集し、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％スクロースバッファー中、４℃で一晩透析する。製剤は、Ａｍｉｃｏｎ １０ｋＤａ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた遠心分離によって濃縮される。次に、得られた混合物を、０．２μｍ滅菌フィルターを使用して濾過する。最終ＬＮＰ組成物は、更なる使用まで－８０℃で保存する。
遺伝子改変システムの送達及び機能のための製剤組成及びプロセスを最適化するために、追加のＬＮＰ製剤が生成される。脂質ナノ粒子の成分は、以下のパラメーターに応じて異なる：３０～６０％のイオン化脂質（例えば、表１９のイオン化脂質又は本出願の他の箇所で説明されているもの）、５～１５％のヘルパーリン脂質ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、３０～５０％のコレステロール、及び０．５～５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）。脂質組成物以外にも、遺伝子改変成分の組み合わせを含む追加の製剤が生成される。例えば、遺伝子改変ポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、疾患を引き起こす変異を修正するための鋳型ＲＮＡと共製剤化され、任意選択で、第２のニックｇＲＮＡは、ｍＲＮＡ及び鋳型ＲＮＡと共製剤化されるか、又は別々に製剤化される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ及び鋳型ＲＮＡ及び任意選択で第２のニックｇＲＮＡが脂質ナノ粒子成分と共に共製剤化されて、総ＲＮＡカーゴの濃度がおよそ０．１ｍｇ／ｍＬになる。共製剤化のためのＲＮＡ成分は、それぞれ重量比１～４：１～１０のｍＲＮＡと鋳型ＲＮＡの混合物、又はそれぞれ１～４：１～１０：１～１０の比率のｍＲＮＡ、鋳型ＲＮＡ、及び第２のニックｇＲＮＡの混合物である。
この例で説明する代替的製剤は、システムのＲＮＡ（例えば、遺伝子改変ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、鋳型ＲＮＡ、及び任意選択による第２のニックｇＲＮＡ）を含み、同一又は異なるイオン化脂質、又は本明細書に記載されるように異なる脂質成分比で製剤化された同一のイオン化脂質を使用して別々に製剤化される。例示的な製剤は、イオン化脂質ＬＩＰＩＤＶ００４を使用して製剤化された遺伝子改変ポリペプチドｍＲＮＡを有し、その製剤は、イオン化脂質、ヘルパー脂質、ステロール、及びＰＥＧの比率がそれぞれ５０：１０：３８．５：１．５である。ＲＮＡは、脂質アミンとＲＮＡリン酸（Ｎ：Ｐ）の比が６で脂質と混合される。例示的なｍＲＮＡとともに使用される例示的な鋳型ＲＮＡは、イオン化脂質ＬＩＰＩＤＶ００４を使用して製剤化され、その製剤は、イオン化脂質、ヘルパー脂質、ステロール、及びＰＥＧの比率がそれぞれ５０：１０：３８．５：１．５である。鋳型ＲＮＡは、Ｎ：Ｐ比４で脂質と混合される。このシステムにおける更なる使用のための例示的な任意選択による第２のニックｇＲＮＡは、イオン化脂質ＬＩＰＩＤＶ００４を使用して製剤化され、その製剤は、イオン化脂質、ヘルパー脂質、ステロール、及びＰＥＧの比率がそれぞれ５０：１０：３８．５：１．５であり、任意選択による第２のニックｇＲＮＡはＮ：Ｐ比率４で脂質と混合される。
本明細書に記載されるように、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の一塩基多型は、α－１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）につながる病原性Ｅ３４２Ｋ変異を引き起こす。この特定のアミノ酸の変化は、ヒトではＰｉ＊Ｚ対立遺伝子として知られており、トランスジェニックマウス系統Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（ＳＥＲＰＩＮＡ１＊Ｅ３４２Ｋ）Ｚ１１．０３Ｓｌｃｗ／ＣｈｍｕＪ（ストック番号０３５４１１、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）でモデル化されており、ＡＡＴＤを有するヒト患者と同様のレベルで肝臓及び腎臓においてヒトＳＥＲＰＩＮＡ１のＰｉ＊Ｚ対立遺伝子を発現する。アミノ酸置換を修正し、非機能性ＡＡＴタンパク質によって引き起こされる影響を改善するために、本明細書に記載の最適化された遺伝子改変システム、例えば、表４に記載の遺伝子改変システム組成物、又は表５に示すように標的部位でＰＡＭ破壊を導入するＲＴ鋳型領域を利用するように更に改変された表４の組成物が、国際公開第２０２１／１７８７２０号パンフレットの実施例４６又は以下の実施例４に記載のＬＮＰ製剤によってＡＡＴＤのトランスジェニックマウスモデルに送達される。第２のニックｇＲＮＡの有効性改変効果を決定するために、第２のニックｇＲＮＡを含むか、又はそれを欠く製剤が、遺伝子改変ポリペプチドｍＲＮＡ及び疾患改変鋳型ＲＮＡとともに調製され、更に別個のＬＮＰ又は共製剤として調製される。この例のＬＮＰは、本出願の例に記載されるように調製され、総ＲＮＡ量１ｍｇ／ｋｇで疾患モデルマウスに静脈内で送達される。マウスの肝臓及び腎臓における修正は、野生型ヒトＡＡＴの検出（例えば、ｈＡＡＴ特異的ＥＬＩＳＡ）、肝臓及び／又は腎臓線維症の変化を検出するための組織学、細胞内ｈＡＡＴを染色するための免疫組織化学、及びゲノム編集のためのアンプリコンシーケンシングを含む、様々な免疫学的、生理学的、分子的アッセイを通じてモニタリングされる。本明細書に記載されるように、アンプリコンシーケンシングは、変異を含有する標的部位全体を増幅するための遺伝子座特異的プライマーの使用、精製されたアンプリコンの次世代シーケンシング（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ）、及びアンプリコンシーケンシングデータのコンピューター分析（例えば、ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ２パイプラインを使用した編集結果の分析）を含む（Ｃｌｅｍｅｎｔ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３７（３）：２２４－２２６（２０１９））。
実施例４：アルファ１アンチトリプシン疾患の処置のための、遺伝子改変システムを使用したＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の修正
この例では、実施例３に記載されるように、疾患のマウスモデルでアルファ１アンチトリプシン欠乏症を引き起こすＳＥＲＰＩＮＡ１のＥ３４２Ｋ変異を修正するための遺伝子改変システムの特定の組成物の使用を説明する。デュアルＡＡＶ送達アプローチを採用したこのモデルにおける変異の修正のためのシステムは、以前に説明され、検証されている（Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ．ｂｉｏＲｘｉｖ（２０２０）、ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／２０２０．１２．１５．４２２９７０、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の編集に関連する方法及び組成物、例えば、図１ａ、３ａ～ｄ、及び５ａ～ｅの方法及び組成物は、参照により本明細書に組み込まれる）。ここでは、最適化された全てのＲＮＡ遺伝子改変システムを使用して、変異修正に対する非ウイルス治療アプローチを実証する。より具体的には、（１）Ｍ－ＭＬＶ逆転写酵素と融合した、触媒変異Ｈ８４０Ａを有する化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の融合タンパク物のＮ末端及びＣ末端に核局在シグナルを含有する融合タンパク質をコードするｍＲＮＡであって、タンパク質が３２アミノ酸リンカー（ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳ（配列番号５００６））を使用して互いに結合している、ｍＲＮＡと；（２）２つのガイドＲＮＡ（１つは修正のためにＳＥＲＰＩＮＡ１のゲノム部位を標的とするための遺伝子改変鋳型ＲＮＡとして機能し、
Figure 2024533312000901
 もう一つは、修正を強化するための、近くのゲノムの第２のニッキングのための、任意選択によるガイド（ＧＧＵＵＵＧＵＵＧＡＡＣＵＵＧＡＣＣＵＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵ（配列番号１９５３０））とを含む遺伝子改変システムが採用される。ここで、ＲＮＡ組成物は製剤化され、ＬＮＰを使用してマウスに送達される。
ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、例えば実施例３に記載されているように、十分に確立された混合、精製、及び濃縮手順を使用してＬＮＰに製剤化される。簡単に説明すると、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）成分（イオン化脂質（表１９のＬＩＰＩＤＶ００５）、ヘルパー脂質（ＤＳＰＣ）、ステロール（コレステロール）、ＰＥＧ（ＤＭＧ－ＰＥＧ－２０００（ＧＭ－２０）））を、脂質成分モル比がそれぞれ５０：１０：３８．５：１．５となるように１００％エタノールに溶解する。遺伝子改変ポリペプチド（Ｃａｓ－ＲＴ）をコードするｍＲＮＡ、鋳型ＲＮＡ及び任意選択で第２のニックガイドＲＮＡを２５ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ４）に溶解する。各ＲＮＡは、脂質アミンとリン酸ＲＮＡ（Ｎ：Ｐ）のモル比が６のＬＮＰに別個に製剤化された。ＬＮＰは、製造者の推奨設定を使用して、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標）Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを使用して、脂質及びＲＮＡ溶液のマイクロ流体混合によって形成される。異なる流量を使用して、混合中、水性溶媒と有機溶媒の比率を３：１に維持する。混合後、ＬＮＰを収集し、次に１５ｍＭ Ｔｒｉｓ、５％スクロースバッファー中、４℃で一晩透析する。製剤は、Ａｍｉｃｏｎ １０ｋＤａ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた遠心分離によって濃縮される。得られた混合物を、０．２μｍ滅菌フィルターを使用して濾過する。最終的なＬＮＰは、例えば国際公開第２０２１／１７８７２０号パンフレットの実施例４４に従って、アリコートに分割して－８０℃で保存した後、粒子サイズ、多分散性、及びＲＮＡの完全性について分析される。
ＬＮＰは濃縮ストックから希釈され、各ガイドＲＮＡ（鋳型ＲＮＡ及び任意選択で第２のニックガイドＲＮＡ）のモル比がｍＲＮＡの２０倍である混合物が作製される。マウスモデルでの評価は、実施例３に記載されているように実施される。ｍＲＮＡ－ＬＮＰとガイドＲＮＡ－ＬＮＰの混合物をＰｉＺマウス（例えば、Ｂ６．Ｃｇ－Ｔｇ（ＳＥＲＰＩＮＡ１＊Ｅ３４２Ｋ）Ｚ１１．０３Ｓｌｃｗ／ＣｈｍｕＪ、ストック番号：０３５４１１、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に１ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ量で静脈内注射する。マウスは、アンプリコン次世代シーケンシング、野生型ヒトアルファ抗トリプシンタンパク質の産生、及び肝臓及び腎臓線維症の組織学的減少を通じて、肝臓及び腎臓における修正についてモニタリングされる。
いくつかの実施形態では、上記のように、ＰｉＺモデルにおけるＥ３４２Ｋ変異を修正するために使用される遺伝子改変システムの成分は、編集の効率及び精度を最適化するために以下のように改変される。
遺伝子改変ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドは、そのＮ末端及びＣ末端に、二分ＳＶ４０ ＮＬＳ配列（ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ６０１７１８２００）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変システム構築物は、そのＮ末端に改変されたｃ－ｍｙｃ ＮＬＳ及び二分ＳＶ４０ ＮＬＳを含み、Ｃ末端には改変された二分ＳＶ４０ ＮＬＳとそれに続くＳＶ４０ ＮＬＳがＳＧＧＳ（配列番号２５６９４）リンカーを介して逆転写酵素に連結されている。いくつかの実施形態では、各ＮＬＳの間、及びＮＬＳと融合タンパク質の間のリンカーは、ＳＧＧＳ（配列番号２５６９４）リンカーである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡによってコードされる融合タンパク質の３２アミノ酸リンカーは、ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳ（配列番号１９５３１）である。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼ活性を生成するＣａｓ９ドメインの触媒変異は、Ｈ８４０Ａ又はＮ８６３Ａである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、キャップ、コザック配列を含有する５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、及び少なくとも６０個のＡを含有するポリＡテール（配列番号２５６９５）を有する。いくつかの実施形態では、コドンの選択／最適化により、ｍＲＮＡのウリジン含有量が減少する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ内のウリジンは、５－メトキシウリジンで１００％置換される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ内のウリジンは、Ｎ１－メチル－シュードウリジンで１００％置換される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ内のシトシンは、５－メチルシトシンで１００％置換される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、シトシンの５－メチルシトシンによる１００％置換と、ウリジンの５－メトキシウリジンによる１００％置換との組み合わせを含有する。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、シトシンの５－メチルシトシンによる１００％置換と、ウリジンのＮ１－メチル－シュードウリジンによる１００％置換との組み合わせを含有する。いくつかの実施形態では、上記の改変の組み合わせは、改変されていないヌクレオチドの０～１００％の置換、例えば、０～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、又は９０～１００％未満の置換を含む。いくつかの実施形態では、システムのｍＲＮＡによってコードされる遺伝子改変ポリペプチドは、配列：
Figure 2024533312000902
Figure 2024533312000903
 を含む。
鋳型ＲＮＡ及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡ。いくつかの実施形態では、遺伝子改変システムは、遺伝子改変ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに加えて、鋳型ＲＮＡのみを使用する。いくつかの実施形態では、遺伝子改変システムは、システムのＣａｓ９ニッカーゼを、標的ＤＮＡの編集されていない鎖に標的化する、第２のニックガイドＲＮＡを更に使用する。いくつかの実施形態では、ＳＥＲＰＩＮＡ１を標的とする遺伝子改変鋳型ＲＮＡは、
Figure 2024533312000904
 である。いくつかの実施形態では、第２のニッキングのための任意選択によるガイドＲＮＡは、ＧＧＵＵＵＧＵＵＧＡＡＣＵＵＧＡＣＣＵＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡＧＡＡＡＵＡＧＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡＡＣＵＵＧＡＡＡＡＡＧＵＧＧＣＡＣＣＧＡＧＵＣＧＧＵＧＣＵＵＵＵＵ（配列番号１９５３４）である。いくつかの実施形態では、鋳型ＲＮＡ及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼによって合成される。いくつかの実施形態では、鋳型ＲＮＡ及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡは、化学的に合成され、２’－Ｏ－メチル、２’－フルオロ、及び／又はホスホロチオエートの１つ又は複数の改変の組み合わせを含有する。いくつかの実施形態では、最も末端の３つのヌクレオチドは、ヌクレオチド間に３つのホスホロチオエート結合を有する２’－Ｏ－メチル改変を含有する。いくつかの実施形態では、鋳型ＲＮＡ及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡは、ｇＲＮＡスペーサーのシード配列（例えば、スペーサー領域の３’末端のシード配列）に見られるヌクレオチド（ここでは、シトシン及びウリジンは、２’－フルオロ改変並びに／又は２’－フルオロ及び２’ヒドロキシルの組み合わせを含有する）を除き、シトシン及びウリジンが存在する場合、２’－Ｏ－メチル改変ヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態では、上記の改変の組み合わせは、改変されていないヌクレオチドの０～１００％の置換、例えば、０～１０％、１０～２０％、２０～３０％、３０～４０％、４０～５０％、５０～６０％、６０～７０％、７０～８０％、８０～９０％、又は９０～１００％未満の置換を含む。
製剤。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドｍＲＮＡ及び鋳型ＲＮＡ（及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡ）は、上記のように別々に製剤化され、それぞれｍＲＮＡ：鋳型ＲＮＡ（及び任意選択でｍＲＮＡ：第２のニックガイドＲＮＡ）のＲＮＡモル比１：２０で注入前に組み合わされる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドｍＲＮＡ及び鋳型ＲＮＡ（及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡ）は、上記のように別々に製剤化され、それぞれｍＲＮＡ：ガイドＲＮＡ（及び任意選択でｍＲＮＡ：第２のニックガイドＲＮＡ）のＲＮＡモル比１：５０で注入前に組み合わされる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドｍＲＮＡ及び鋳型ＲＮＡ（及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡ）は別々に製剤化され、それぞれｍＲＮＡ：鋳型ＲＮＡ（及び任意選択でｍＲＮＡ：第２のニックガイドＲＮＡ）が１：１０～１：２５０の範囲の比で注入前に組み合わされる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ及び鋳型ＲＮＡ（及び任意選択による第２のニックガイドＮＲＡ）は、ｍＲＮＡ：鋳型ＲＮＡ（及び任意選択でｍＲＮＡ：第２のニックガイドＲＮＡ）が１：１０～１：２５０で一緒に混合され、次に上記のように製剤化され、ここで製剤化されるＲＮＡ濃度は０．１ｍｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡ及び鋳型ＲＮＡ（及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡ）は別々に製剤化され、３０～１８０分間隔で注入され、ここで最初にｍＲＮＡ ＬＮＰが送達され、その後に鋳型ＲＮＡ（及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡ）ＬＮＰが送達される。いくつかの実施形態では、イオン化脂質（ｉｏｎｉｚａｂｌｅ ｌｉｐｉｄ）は、表１９のＬＩＰＩＤＶ００５である。
投与。いくつかの実施形態では、遺伝子改変ポリペプチドｍＲＮＡ及び／又は鋳型ＲＮＡ（及び任意選択による第２のニックガイドＲＮＡ）は、ＲＮＡ－ＬＮＰの総量として別々に又は一緒に、０．０１～６ｍｇ／ｋｇで投与される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－ＬＮＰは、ＩＶボーラスとして注入される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ－ＬＮＰは、３０～３６０分間にわたって注入される。
実施例５：マウスの初代肝細胞で達成された内因性ＦＡＨ遺伝子座の書き換えのための、遺伝子編集ポリペプチド及び鋳型の活性の定量化
この例は、遺伝子改変ポリペプチド及び鋳型ＲＮＡを含有する遺伝子改変システムを使用して、Ｆａｈ５９８１ＳＢマウス由来のマウス初代肝細胞における内因性Ｆａｈ遺伝子座のＡヌクレオチドをＧヌクレオチドに変換する方法を実証する。Ｆａｈ５９８１ＳＢマウスモデルは、Ｆａｈ遺伝子のエクソン８の最後のヌクレオチドにＧからＡへの点変異を有し、異常なｍＲＮＡスプライシング及びそれに続くｍＲＮＡ分解を引き起こし、Ｆａｈタンパク質は生成されないため、遺伝性チロシン血症Ｉ型のマウスモデルとして機能する。
この例では、鋳型ＲＮＡは、
（１）ｇＲＮＡスペーサー；
（２）ｇＲＮＡスキャフォールド；
（３）異種目的配列；及び
（４）プライマー結合部位（ＰＢＳ）配列
を含有していた。
より具体的には、鋳型ＲＮＡ（化学的改変パターンを含む）は、次の配列を含んでいた：
ＦＡＨ１＿Ｒ１４＿Ｐ１２＿Ｈｅａｖｙ ＲＮＡＣＳ０４８
Figure 2024533312000905
 ＦＡＨ１＿Ｒ１５＿Ｐ１０＿Ｈｅａｖｙ ＲＮＡＣＳ０４９
Figure 2024533312000906
 ＦＡＨ２＿Ｒ１９＿Ｐ１１＿ＭＵＴ＿Ｈｅａｖｙ ＲＮＡＣＳ０５２
Figure 2024533312000907
 ＦＡＨ２＿Ｒ１９＿Ｐ１３＿ＭＵＴ＿Ｈｅａｖｙ ＲＮＡＣＳ０５３
Figure 2024533312000908
この実験で利用できる追加の例示的な鋳型ＲＮＡには、以下が含まれる：
ＦＡＨ１ ＲＮＡＣＳ０５０
Figure 2024533312000909
 ＦＡＨ１ ＲＮＡＣＳ０５１
Figure 2024533312000910
上記の配列において、ｍ＝２’－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ｒ＝リボース、＊＝ホスホロチオエート結合である。
試験した遺伝子改変ポリペプチドは、ＲＮＡＶ２０９（ｎＣａｓ９－ＲＴ）及びＲＮＡＶ２１４（ｗｔＣａｓ９－ＲＴ）の配列を含んでいた。具体的には、ｎＣａｓ９－ＲＴ及びｗｔＣａｓ９－ＲＴは、次のアミノ酸配列を有していた。
ｎＣａｓ９－ＲＴ（ＲＮＡＶ２０９）：
Figure 2024533312000911
Figure 2024533312000912
 ｗｔＣａｓ９－ＲＴ（ＲＮＡＶ２１４）：
Figure 2024533312000913
Figure 2024533312000914
Figure 2024533312000915
下線は、ニッカーゼと野生型配列間で異なる残基を示す。
上に列挙される遺伝子改変ポリペプチド及び上記の鋳型ＲＮＡを含む遺伝子改変システムを、初代マウス肝細胞にトランスフェクトした。遺伝子改変ポリペプチド及び鋳型ＲＮＡは、ＲＮＡ形式でヌクレオフェクションによって送達された。具体的には、４μｇの遺伝子改変ポリペプチドｍＲＮＡを、５μＬの水中で、化学的に合成された１０μｇの鋳型ＲＮＡと合わせた。トランスフェクションミックスは、バッファーＰ３［Ｌｏｎｚａ］中の１００，０００個のマウス初代肝細胞に加えられ、プログラムＤＧ－１３８を使用して細胞が核移入された。ヌクレオフェクション後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３日間増殖させ、その後、細胞溶解及びゲノムＤＮＡ抽出を行った。遺伝子編集活性を分析するために、標的挿入部位の遺伝子座に隣接するプライマーを使用して、遺伝子座全体を増幅した。アンプリコンは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを使用したショートリードシーケンスによって分析された。ｆａｈ遺伝子のエクソン８の末端ＡからＧ配列への変換は、編集が成功したことを示す。
図２に示すように、ＦＡＨ２鋳型の場合、ＲＮＡＶ２０９－０１３では４～８％の完全な書き換えレベル（望ましくない変異が検出されないＡからＧへの変換）が検出されたが、ＲＮＡＶ２１４－０４０では検出されなかった。ＲＮＡＶ２０９－０１３では４．４～６．６％のインデルレベルが観察された。更に、エクソン７及び８に結合するプライマーを使用した定量的ＲＴ－ＰＣＲを使用して、ＷＴ Ｆａｈ ｍＲＮＡの量を測定した。図３に示すように、ＦＡＨ２鋳型をＲＮＡＶ２０９－０１３ ｍＲＮＡで試験すると、ＦＡＨ２鋳型では、ＷＴに対してＦａｈ ｍＲＮＡの存在量が最大１２％増加する。これらの結果は、遺伝子改変システムを使用してＦａｈ遺伝子の変異を元に戻し、野生型Ｆａｈ ｍＲＮＡの発現を部分的に回復させたことを示す。
実施例６：マウス肝臓における内因性ＦＡＨ遺伝子座の書き換えのための、インビボでの遺伝子編集ポリペプチド及び鋳型の活性の定量化
この例では、遺伝子改変ポリペプチド及び鋳型ＲＮＡを含有する遺伝子改変システムを使用して、Ｆａｈ５９８１ＳＢマウスモデルにおいて、マウス肝臓の内因性Ｆａｈ遺伝子座中のＡヌクレオチドをＧヌクレオチドに変換する方法を示す。Ｆａｈ５９８１ＳＢマウスモデルは、Ｆａｈ遺伝子のエクソン８の最後のヌクレオチドにＧからＡへの点変異を有し、異常なｍＲＮＡスプライシング及びそれに続くｍＲＮＡ分解を引き起こし、Ｆａｈタンパク質は生成されず、遺伝性チロシン血症Ｉ型のマウスモデルとして機能する。
この例では、鋳型ＲＮＡは、
（１）ｇＲＮＡスペーサー；
（２）ｇＲＮＡスキャフォールド；
（３）異種目的配列；及び
（４）プライマー結合部位（ＰＢＳ）配列
を含有していた。
具体的には、鋳型ＲＮＡは、次の配列：
ＦＡＨ１＿Ｒ１４＿Ｐ１２＿Ｈｅａｖｙ ＲＮＡＣＳ０４８
Figure 2024533312000916
 ＦＡＨ１＿Ｒ１５＿Ｐ１０＿Ｈｅａｖｙ ＲＮＡＣＳ０４９
Figure 2024533312000917
 ＦＡＨ２＿Ｒ１９＿Ｐ１１＿ＭＵＴ＿Ｈｅａｖｙ ＲＮＡＣＳ０５２
Figure 2024533312000918
 ＦＡＨ２＿Ｒ１９＿Ｐ１３＿ＭＵＴ＿Ｈｅａｖｙ ＲＮＡＣＳ０５３
Figure 2024533312000919
 を含んでいた。
試験した遺伝子改変ポリペプチドは、ＲＮＡＶ２０９及びＲＮＡＶ２１４の配列で構成され、その配列はそれぞれ実施例３に提供される。
上記の遺伝子改変ポリペプチド及び鋳型ＲＮＡを含む遺伝子改変システムをＬＮＰ中に製剤化し、マウスに送達した。具体的には、鋳型ＲＮＡとｍＲＮＡを１：１（ｗ／ｗ）で組み合わせた、ＬＮＰに製剤化された２ｍｇ／ｋｇの総ＲＮＡ相当量を、７～９週齢の雌雄混合Ｆａｈ５９８１ＳＢマウスに静脈内投与した。投与後６時間又は６日後に動物を殺処分し、分析のために肝臓を採取した。肝臓における遺伝子改変ポリペプチドの発現分布を決定するために、６時間の肝臓サンプルを、抗Ｃａｓ９抗体を用いた免疫組織化学検査に供した。染色後、ＱｕＰａｔｈ ＭａｒｋｕｐによってＣａｓ９陽性肝細胞の定量化が行われた。図４に示すように、遺伝子改変ポリペプチドの発現は、肝細胞の８２～９１％で観察された。
遺伝子編集活性を分析するために、標的挿入部位の遺伝子座に隣接するプライマーを使用して、投与後６日目に採取した肝臓サンプルのゲノムＤＮＡの遺伝子座全体を増幅した。アンプリコンは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを使用したショートリードシーケンスによって分析された。ＡヌクレオチドからＧヌクレオチドへの変換は、編集が成功したことを示す。図５に示すように、０．１％～１．９％の完全な書き換えレベル（望ましくない変異が検出されないＡからＧへの変換）が異なる群にわたって検出された。インデルレベルは０．２％～０．４％の範囲であった。
遺伝子編集活性によって引き起こされる表現型修正を決定するために、野生型ＦＡＨ ｍＲＮＡの回復をリアルタイムｑＲＴ－ＰＣＲによって決定し、Ｆａｈタンパク質発現の回復を、抗Ｆａｈ抗体を使用した免疫組織化学によって決定した。図６に示すように、同腹ヘテロ接合マウスに対して０．１％～６％の野生型ｍＲＮＡの回復が、異なる群にわたって検出された。図７に示すように、Ｆａｈタンパク質は、異なる群にわたって肝臓断面積の０．１％～７％で検出された。これらの結果は、遺伝性チロシン血症Ｉ型のインビボマウスモデルにおけるＦａｈ遺伝子の変異を元に戻す遺伝子改変システムの使用を示しており、その結果、野生型Ｆａｈ ｍＲＮＡ及びＦａｈタンパク質の発現が部分的に回復した。
実施例７．インビボマウスモデルでのＴＴＲ遺伝子座における遺伝子編集
この例では、Ｃ５７Ｂｌｋ／６マウスにおいて、遺伝子改変ポリペプチド及びＲＮＡを使用してＴＴＲ遺伝子座を標的とするプロトスペーサー配列ＡＣＡＣＡＡＡＵＡＣＣＡＧＵＣＣＡＧＣＧ（配列番号２５６９６）を使用した、Ｃａｓ９介在遺伝子編集によるｍＲＮＡ及びガイドの正常な送達を示す。
ＲＮＡは以下のように調製した。下記表７Ａに示す配列を有する遺伝子改変ポリペプチドをコードするｍＲＮＡをインビトロ転写により生成し、精製したｍＲＮＡを１ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６）に溶解して、ＲＮＡの最終濃度を１～２ｍｇ／ｍＬとした。同様に、以下の表７Ａに示す配列を有するガイドＲＮＡを化学合成により生成し、水又は水性バッファーに溶解して、ＲＮＡの最終濃度を１～２ｍｇ／ｍＬとした。
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脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）成分（イオン化脂質、ヘルパー脂質、ステロール、ＰＥＧ）を、脂質成分モル比がそれぞれ４７：８：４３．５：１．５となるように１００％エタノールに溶解した。ＲＮＡ（ガイド及びｍＲＮＡ）を１：１の重量比で合わせ、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５）で０．０５～０．２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。ＲＮＡは、脂質アミンと総リン酸ＲＮＡ（Ｎ：Ｐ）のモル比が４．０の別個のＬＮＰに製剤化された。ＬＮＰは、脂質とＲＮＡ溶液のマイクロ流体又は乱流混合によって形成された。異なる流量を使用して、混合中、水性溶媒と有機溶媒の比率を３：１に維持した。混合後、ＬＮＰを希釈し、収集し、タンジェンシャルフロー濾過を使用して、５０ｍＭトリス、９％スクロースにバッファー交換した。製剤は１．０ｍｇ／ｍＬ以上に濃縮し、次に０．２μｍの滅菌フィルターで濾過した。最終ＬＮＰは、更なる使用まで－８０℃で保存した。
ＬＮＰ製剤は、１～０．１ｍｇ／ｋｇの範囲の濃度で、およそ８週齢のＣ５７Ｂｌｋ／６マウスに尾静脈ボーラス注射により静脈内投与で送達された。Ｃａｓ９－ＲＴの発現は、動物を安楽死させ、剖検中に肝臓を採取することにより、注射後６時間で測定された。動物は注射後５日目に安楽死させられ、剖検時に肝臓が採取され、ＴＴＲ遺伝子座の遺伝子編集の活性が評価された。肝臓におけるＣａｓ９－ＲＴ遺伝子編集ポリペプチドの発現をウエスタンブロット法で測定し、ここで、Ｃａｓ９はマウスモノクローナル抗体（７Ａ９－３Ａ３、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で検出され、ＧＡＰＤＨ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）がローディングコントロールとして使用された。（図８）。ＴＴＲ遺伝子座の編集は、サンガーシーケンシングとそれに続くプロトスペーサーの結合部位付近のＴＴＲ遺伝子座のアンプリコンのＴＩＤＥ分析によって定量化された。図９に示すように、ＴＴＲ遺伝子座の編集が観察された。血清中のＴＴＲタンパク質レベルは、標準曲線（Ａｖｉｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したＥＬＩＳＡによって定量化された。図１０に示すように、処置された動物の血清中のＴＴＲタンパク質レベルは低下した。これらの実験は、Ｃａｓ９－ＲＴポリペプチドがインビボで発現し、ＴＴＲ遺伝子座を編集して血清中のＴＴＲタンパク質レベルを低下させることができることを示す。
実施例８．インビボカニクイザルモデルでのＴＴＲ遺伝子座における遺伝子編集
この例では、カニクイザルモデルにおいて、遺伝子改変ポリペプチド及びＲＮＡを使用してＴＴＲ遺伝子座を標的とするプロトスペーサー配列ＡＣＡＣＡＡＡＵＡＣＣＡＧＵＣＣＡＧＣＧ（配列番号２５６９６）を使用した、Ｃａｓ９介在遺伝子編集によるｍＲＮＡ及びガイドの正常な送達を示す。
ＲＮＡは以下のように調製した。下記表８Ａに示す配列を有する遺伝子改変ポリペプチドをコードするｍＲＮＡをインビトロ転写により生成し、精製したｍＲＮＡを１ｍＭのクエン酸ナトリウム（ｐＨ６）に溶解して、ＲＮＡの最終濃度を１～２ｍｇ／ｍＬとした。同様に、以下の表８Ａに示す配列を有するガイドＲＮＡを化学合成により生成し、水又は水性バッファーに溶解して、ＲＮＡの最終濃度を１～２ｍｇ／ｍＬとした。
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脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）成分（イオン化脂質、ヘルパー脂質、ステロール、ＰＥＧ）を、脂質成分モル比がそれぞれ４７：８：４３．５：１．５となるように１００％エタノールに溶解した。ＲＮＡ（ガイド及びｍＲＮＡ）を１：１の重量比で合わせ、酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５）で０．０５～０．２ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈した。ＲＮＡは、脂質アミンと総リン酸ＲＮＡ（Ｎ：Ｐ）のモル比が４．０の別個のＬＮＰに製剤化された。ＬＮＰは、脂質とＲＮＡ溶液のマイクロ流体又は乱流混合によって形成された。異なる流量を使用して、混合中、水性溶媒と有機溶媒の比率を３：１に維持した。混合後、ＬＮＰを希釈し、収集し、タンジェンシャルフロー濾過を使用して、５０ｍＭトリス、９％スクロースにバッファー交換した。製剤は１．０ｍｇ／ｍＬ以上に濃縮し、次に０．２μｍの滅菌フィルターで濾過した。最終ＬＮＰは、更なる使用まで－８０℃で保存した。ＬＮＰ製剤は、２ｍｇ／ｋｇで１時間かけて注入により静脈内に送達され、注入量は５ｍｌ／ｋｇであった。アジア大陸のカニクイザルに、シリンジポンプを用いた静脈内注入の１．５～２時間前に、デキサメタゾン２ｍｇ／ｋｇを筋肉内注射でボーラス投与した。動物は注入後にモニタリングされ、注入後８～１２時間、２４時間、及び４８時間で肝臓から採取した腹腔鏡生検によってＣａｓ９－ＲＴの発現が測定された。動物は注入後１４日で安楽死させられ、肝臓が８つの異なる断片に分けて摘出され、ＴＴＲ遺伝子座の遺伝子編集の活性が評価された。肝臓におけるＣａｓ９－ＲＴ遺伝子編集ポリペプチドの発現は、ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ Ｊｅｓｓシステム（ｂｉｏ－ｔｅｃｈｎｅ）を使用したキャピラリー電気泳動ウエスタンブロットによって定量化され、Ｃａｓ９はマウスモノクローナル抗体（７Ａ９－３Ａ３、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって検出された。Ｃａｓ９－ＲＴ遺伝子編集ポリペプチドの相対的発現は、図１１に示すように、曲線下面積分析によって測定された。ＴＴＲ遺伝子座の編集は、プロトスペーサーの結合部位付近のＴＴＲ遺伝子座のアンプリコンシーケンシングによって定量化された。図１２に示すように、ＴＴＲ遺伝子座の編集が観察された。これらの実験は、Ｃａｓ９－ＲＴポリペプチドが非ヒト霊長類モデルにおいてインビボで発現され、ＴＴＲ遺伝子座を編集できることを実証する。
実施例９．高いインデル活性のＣａｓ９バリアントとスペーサーの組み合わせのスクリーニング
この実施例は、高いインデル活性を生成できるＣａｓ９バリアントとスペーサーの組み合わせを特定するために実行されたスクリーニング実験を特徴付ける。この例では、ｓｇＲＮＡは、
（１）ｇＲＮＡスペーサー
（２）ｇＲＮＡスキャフォールド
を含有する。
修正される変異に近接するように選択された複数のスペーサー配列を含む鋳型ＲＮＡと組み合わせて、野生型ＳｐＣａｓ９ポリペプチドバリアントを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で初期スクリーニングを実施した。この最初のスクリーニングでは、標的のＰｉＺ変異を編集するためのスペーサーの有用性の指標として、インデル活性を評価した。この分析に続いて、バリアントＣａｓ９ドメインを使用して、選択されたＣａｓ９ドメイン、リンカー、及び例示的なＲＴドメインを含む例示的な遺伝子改変ポリペプチドを生成し、例示的な遺伝子改変ポリペプチドを使用して、インデル活性を使用して適合性鋳型ＲＮＡをスクリーニングした。
－ａ）本明細書に記載の適合性遺伝子改変ポリペプチド（例えば、ＮＬＳ、リンカー、ＲＴ配列、及びこの実施例で以下に記載される第２のＮＬＳを有する）、及び表Ｘ１の配列を有する野生型Ｃａｓ９、又は
（ｉ－ｂ）適合性野生型Ｃａｓ９ポリペプチド；
及び（ｉｉ）単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（例えば、Ａ１ＡＴ－Ｓｐ－ｓｇＲＮＡ－１）
のいずれかを含む遺伝子改変システムを、ＨＥＫ２９３Ｔランディングパッド細胞株（実施例１に記載）にトランスフェクトした。遺伝子改変ポリペプチド及びｓｇＲＮＡ又は野生型Ｃａｓ９ポリペプチド及びｓｇＲＮＡは、ＤＮＡ形式でのトランスフェクションによって送達された。具体的には、５０ｎｇの遺伝子改変ポリペプチド／Ｃａｓ９ポリペプチドプラスミドを５０ｎｇのｓｇＲＮＡと組み合わせた。このプラスミドの組み合わせを、１０ｕＬのＯｐｔｉＭｅＭ溶液中の０．５ｕＬのＴｒａｎｓＩＴ２９３と混合し、２０，０００個の細胞に加えた。トランスフェクション後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３日間増殖させ、その後、細胞溶解及びゲノムＤＮＡ抽出を行う。遺伝子編集活性を分析するために、Ａ１ＡＴ ＰｉＺ変異部位に隣接するプライマーを使用して、遺伝子座全体を増幅した。アンプリコンは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを使用したショートリードシーケンスによって分析された。
図１３で使用されているＳｐＣａｓ９スペーサー配列：
Ａ１ＡＴ－Ｓｐ－ｓｇＲＮＡ－１：ｇｇｇｔａｔｇｇｃｃｔｃｔａａａａａｃａ（ＰＬＶ３６７６）（配列番号２３７８６）［切断部位はＰｉＺ変異から３０ｂｐ］
Ａ１ＡＴ－Ｓｐ－ｓｇＲＮＡ－２：ｔｃｃｃｃｔｃｃａｇｇｃｃｇｔｇｃａｔａ（ＰＬＶ３７１２）（配列番号２３７８７）［切断部位はＰｉＺ変異から２３ｂｐ］
Ａ１ＡＴ－Ｓｐ－ｓｇＲＮＡ－３：ｔｃｔｃｔｇｃｔｔｃｔｃｔｃｃｃｃｔｃｃ（ＰＬＶ３７３５）（配列番号２３７８８）［切断部位はＰｉＺ変異から３５ｂｐ］
Ａ１ＡＴ－Ｓｐ－ｓｇＲＮＡ－４：ｇｔｃｃｃｃｔｃｃａｇｇｃｃｇｔｇｃａｔａ（ＰＬＶ３６９０）（配列番号２３７８９）［切断部位はＰｉＺ変異から２３ｂｐ］
Ａ１ＡＴ－Ｓｐ－ｓｇＲＮＡ－５：ｇｔｃｔｃｔｇｃｔｔｃｔｃｔｃｃｃｃｔｃｃ（ＰＬＶ３６６８）（配列番号２３７９０）［切断部位はＰｉＺ変異から３５ｂｐ］
図１３のバー６は、無ｓｇＲＮＡ対照であった。
Ｃａｓ９バリアントを含む例示的な遺伝子改変ポリペプチドは、以下を含んでいた：
ＭＰＡＡＫＲＶＫＬＤＧＧＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２３７９１）のアミノ酸配列を有するＮ末端ＮＬＳ；
ＫＲＴＡＤＳＱＨＳＴＰＰＫＴＫＲＫＶＥＦＥＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号２３７９２）のアミノ酸配列を有するＣ末端ＮＬＳ；
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 のアミノ酸配列を有するＲＴドメイン
及び
ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥ（配列番号：２５６８９）
ＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳ（配列番号：２３７９４）
のアミノ酸配列を有する、ＲＴドメインとＣａｓドメインの間のリンカー
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まず、５つのＳｐＣａｓ９スペーサーを含む鋳型ＲＮＡを野生型ＳｐＣａｓ９ポリペプチドと組み合わせて含む、遺伝子改変システムのインデル活性を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で評価した。
図１３に示すように、試験した５つのスペーサーのうち、スペーサー１、３、及び４は、１５％を超えるインデル活性を示した。鋳型ＲＮＡは、これらの３つのスペーサーを使用して設計され、ＳｐＣａｓ９を含む例示的な遺伝子改変ポリペプチドを使用して書き換え活性について試験された。しかし、これらの組み合わせでは、目標閾値を超える書き換え活性は生じなかった（データは示さず）。理論に縛られることを望むものではないが、ＳｐＣａｓ９スペーサーは、おそらくＰｉＺ変異からの距離のため、目標閾値を超える書き換え活性を生じなかった。この結果に基づき、Ｃａｓ９バリアント及び適合性スペーサーを評価した。
各バリアントに対していくつかの異なるスペーサーを有する１２の異なるＣａｓ９バリアント（表Ｘ１）がスクリーニングされた。異なるＣａｓ９ドメインを含む例示的な遺伝子改変ポリペプチドが生成され（表Ｘ１）、適合性鋳型ＲＮＡを用いて試験された（表Ｘ２）。図１４は、遺伝子改変システムによる処置後のＨＥＫ２９３Ｔランディングパッド細胞におけるＰｉＺ変異部位のインデル％を示す。結果は、Ｃａｓ９バリアントドメイン及び適合性鋳型ＲＮＡの多くの組み合わせが有望なインデル活性を示すことを示した。調べた組み合わせのうち、ＳｐＣａｓ９に対して同等であるか又はそれを超えるインデル活性を示した５つのＣａｓ９バリアントが特定された（図１４）。活性スペーサーは、インデル活性及びＰｉＺ変異からの距離によってランク付けされ、高いインデル活性を示し、ＰｉＺ変異から２０ｂｐ以内に位置する選択されたスペーサー：Ｃａｓ９の組み合わせが、更なるスクリーニングのために選択された（図１５及び表ＸＸ）。
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実施例１０．高い書き換え活性のＣａｓ９バリアントとスペーサーの組み合わせのスクリーニング
この例は、ＰｉＺ変異を修正するための鋳型ＲＮＡの活性を定量化するための、例示的な遺伝子改変ポリペプチドと、異なる長さの異種目的配列及びＰＢＳ配列を含む例示的な鋳型ＲＮＡとを含有する遺伝子改変システムの使用を説明する。この例では、鋳型ＲＮＡは、
（１）ｇＲＮＡスペーサー；
（２）ｇＲＮＡスキャフォールド；
（３）異種目的配列；及び
（４）プライマー結合部位（ＰＢＳ）配列
を含有する。
使用される例示的な遺伝子改変ポリペプチドは、上記の実施例９に記載されている。次いで、実施例９で高いスペーサー活性（インデル）を有すると特定された１１個のＣａｓ９／スペーサーの組み合わせを使用して、一致するＣａｓ９ドメインを含む例示的な遺伝子改変ポリペプチドと組み合わせて書き換え活性を有する鋳型ＲＮＡをスクリーニングした。異種目的配列及びＰＢＳ配列は、対応するタンパク質のＰｉＺ変異を元に戻すために、遺伝子編集によって変異部位の「Ｔ」ヌクレオチドを「Ｃ」ヌクレオチドに置き換えてランディングパッドのＡＡＴＤ ＰｉＺ変異を修正するように設計された。試験した例示的な鋳型ＲＮＡの配列を表Ｘ３に示す。
（ｉ）以下を含む、記載された適合遺伝子改変ポリペプチド：実施例９に記載されるＮＬＳ、表Ｘ１の配列を有する適合性ニッカーゼＣａｓ９（例えば、ＳｐｙＣａｓ９－ＳｐＲＹ）、実施例９に記載されるリンカー、実施例９に記載されるＲＴ配列（例えば、ＰＬＶ４９３１）、及び実施例９に記載される第２のＮＬＳと、（ｉｉ）表Ｘ３の鋳型ＲＮＡとを含む遺伝子改変システムをＨＥＫ２９３Ｔランディングパッド細胞株にトランスフェクトした。遺伝子改変ポリペプチドとｓｇＲＮＡは、ＲＮＡ形式でのトランスフェクションによって送達された。具体的には、７５ｎｇの遺伝子改変ポリペプチドｍＲＮＡを１ｐｍｏｌの鋳型ＲＮＡと組み合わせた。次に、このＲＮＡの組み合わせを１０ｕＬのＯｐｔｉＭＥＭ溶液中の０．５ｕＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘと混合し、２０，０００個の細胞に加えた。トランスフェクション後、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で３日間増殖させ、その後、細胞溶解及びゲノムＤＮＡ抽出を行う。遺伝子編集活性を分析するために、Ａ１ＡＴ ＰｉＺ変異部位に隣接するプライマーを使用して、遺伝子座全体を増幅した。アンプリコンは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑを使用したショートリードシーケンスによって分析された。
遺伝子改変ポリペプチドと鋳型ＲＮＡの組み合わせを含む遺伝子改変システム（ここで、遺伝子改変ポリペプチドは、実施例９の鋳型ＲＮＡスペーサーとマッチするＣａｓ９ドメインを含む）を、書き換え活性について試験した。試験した様々な鋳型ＲＮＡは、異なる長さのＰＢＳ及びＲＴ鋳型を含んでいた（図１６）。結果は、調べた組み合わせのうち、Ｃａｓ９バリアントとスペーサーの５つの組み合わせが、２％の目標閾値を超える書き換え活性を示すことを示した（図１６及び表Ｘ５）。
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図１７Ａ～１７Ｂは、様々なＳｐＲＹ＿ＥＤ０鋳型ＲＮＡ（異なるＰＢＳ及びＲＴの長さ）及び例示的なＳｐＲＹ＿Ｃａｓ９含有遺伝子改変ポリペプチドを含む遺伝子改変システム（図１７Ａ）並びに様々なＳｔ１＿ＥＤ４鋳型ＲＮＡ（異なるＰＢＳ及びＲＴの長さ）及び例示的なＳｔ１Ｃａｓ９含有遺伝子改変ポリペプチドを含む遺伝子改変システム（図１７Ｂ）の書き換え率をグラフ化したヒートマップを示す。結果から、ＳｐＲＹ＿ＥＤ０鋳型ＲＮＡに最適なＲＴ長（例えば、６、８、１０、１２、及び１５ヌクレオチド）及びＰＢＳ長（８、１０、１１、及び１２ヌクレオチド）並びにそれらの組み合わせがいくつか特定された。結果から、Ｓｔ１＿ＥＤ４鋳型ＲＮＡに最適なＲＴ長（例えば、８、１４、及び１６ヌクレオチド）及びＰＢＳ長（８、９、１０、１１、及び１２ヌクレオチド）並びにそれらの組み合わせがいくつか特定された。ＳｐＲＹ Ｃａｓ９及びＳｐＲＹ＿ＥＤ０スペーサーの場合、最もパフォーマンスの高い鋳型ＲＮＡは１０．３％の完全な書き換えを示し、６ヌクレオチドのＲＴ長、８ヌクレオチドのＰＢＳ長を有していた。Ｓｔ１Ｃａｓ９及びＳｔ１＿ＥＤ４スペーサーについて、最もパフォーマンスの良かったＲＴ長は８ヌクレオチドであり、ＰＢＳ長は９ヌクレオチドであった。鋳型ＲＮＡとＣａｓ９バリアントを含む遺伝子改変ポリペプチドとの、パフォーマンスが最も優れた１７の組み合わせの書き換え活性（書き換え活性による順位付け）を図１８にグラフで示した。更に、この結果は、試験された遺伝子改変システムが標的のＰｉＺ変異部位で書き換え活性を示し、書き換えレベルが一般にインデルレベルよりも高いことを示す。ＳｐＲＹ Ｃａｓ９遺伝子改変ポリペプチドとＳｐＲＹ＿ＥＤ０＿ＰＢＳ８＿ＲＴ６鋳型ＲＮＡを含む例示的な遺伝子改変システムは、１０．３％の書き換え及び４％未満のインデルで最高のパフォーマンスを示した。
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表Ｘ３Ａは、改変のないＸ３の配列を示す。いくつかの実施形態では、この表で使用される配列は化学的改変なしで使用できる。
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「約」、「少なくとも」、「未満」、及び「を超える」などの、本出願におけるいくつかのパラメーターを表す全ての数値境界について、記載は、記載される値によって境界付けられるいずれの範囲も必然的に包含することが理解されるべきである。従って、例えば、「少なくとも１、２、３、４又は５」という記載は、とりわけ、１～２、１～３、１～４、１～５、２～３、２～４、２～５、３～４、３～５及び４～５などの範囲も表す。
本明細書に引用される全ての特許、出願又は非特許文献及び参照配列情報などの他の参照文献について、それらが、あらゆる目的のため及び記載される提示のため、全体が参照により組み込まれることが理解されるべきである。参照により組み込まれる文献と及び本出願との間に矛盾が存在する場合、本出願が優先される。本出願に開示される参照遺伝子配列に関連する全ての情報、例えば、例えば、ゲノム遺伝子座、ゲノム配列、機能注釈、対立遺伝子多型及び参照ｍＲＮＡ（例えば、エクソン境界又は応答エレメントを含む）及びタンパク質配列（保存的ドメイン構造など）並びに化学参照（例えば、ＰｕｂＣｈｅｍ化合物、ＰｕｂＣｈｅｍ物質又はＰｕｂＣｈｅｍ Ｂｉｏａｓｓａｙエントリ（構造及びアッセイなどのその中の注釈を含む））を含む、ＧｅｎｅＩＤｓ又は受入番号（典型的に、ＮＣＢＩ受入番号を参照する）は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願において使用される見出しは、便宜上のものであるに過ぎず、本出願の解釈に影響を及ぼすものではない。
本出願において使用される見出しは、便宜上のものであるに過ぎず、本出願の解釈に影響を及ぼすものではない。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
鋳型ＲＮＡであって、５’から３’に、
（ｉ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第１の部分に相補的なｇＲＮＡスペーサーであって、表１のｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチドを含む配列を有し、且つ任意選択で、前記ｇＲＮＡスペーサーのフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又は表６Ａ、６Ｂ、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ３ａ、Ｘ５又はＸＸから選択されるスペーサーの配列を有するｇＲＮＡスペーサー；
（ｉｉ）遺伝子改変ポリペプチドに結合する（例えば、前記遺伝子改変ポリペプチドのＣａｓドメインに結合する）ｇＲＮＡスキャフォールド、
（ｉｉｉ）前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分に変異を導入するため（例えば、そこにある変異を修正するため）の変異領域を含む異種目的配列（ここで、任意選択で、前記異種目的配列は、５’から３’に、編集後相同性領域、変異領域及び編集前相同性領域を含む）、及び
（ｉｖ）前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第３の部分と１００％の同一性を有する少なくとも５、６、７又は８塩基を含むプライマー結合部位（ＰＢＳ）配列
を含む鋳型ＲＮＡ。
（項目２）
前記異種目的配列は、表３からのＲＴ鋳型配列のコアヌクレオチドを含み、且つ任意選択で、前記ＲＴ鋳型配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又は前記異種目的配列は、表６Ａ若しくは６ＢからのＲＴ鋳型配列の配列を含む、項目１に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目３）
前記異種目的配列は、前記ｇＲＮＡスペーサー配列に対応する表３のＲＴ鋳型配列のコアヌクレオチドを含み、且つ任意選択で、前記ＲＴ鋳型配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又は前記異種目的配列は、表６Ａ若しくは６ＢからのＲＴ鋳型配列の配列を含む、項目１に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目４）
前記異種目的配列は、表Ｘ３若しくはＸ３ａに記載の鋳型ＲＮＡからの異種目的配列の配列、又はそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列、又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を有する、項目１～３のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目５）
前記異種目的配列は、６～１６ヌクレオチド（例えば、６、８、１０、１２、１４、１５又は１６ヌクレオチド）の長さを有する、項目１～４のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目６）
鋳型ＲＮＡであって、５’から３’に、
（ｉ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第１の部分に相補的なｇＲＮＡスペーサー、
（ｉｉ）遺伝子改変ポリペプチドに結合する（例えば、前記遺伝子改変ポリペプチドのＣａｓドメインに結合する）ｇＲＮＡスキャフォールド、
（ｉｉｉ）前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分に変異を導入するため（例えば、そこにある変異を修正するため）の変異領域を含む異種目的配列であって、表３のＲＴ鋳型配列のコアヌクレオチドを含み、且つ任意選択で、前記ＲＴ鋳型配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又は表６Ａ、６Ｂ、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ３ａ、Ｘ５若しくはＸＸのＲＴ鋳型配列を含む異種目的配列；及び
（ｉｖ）前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第３の部分と１００％の同一性の少なくとも５、６、７又は８塩基を含むＰＢＳ配列
を含む鋳型ＲＮＡ。
（項目７）
前記ｇＲＮＡスペーサーは、表１のｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチドを含み、且つ任意選択で、前記ｇＲＮＡスペーサー配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又は前記ｇＲＮＡスペーサーは、表６Ａ若しくは６ＢのｇＲＮＡスペーサー配列を含む、項目６に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目８）
前記異種目的配列は、前記ＲＴ鋳型配列に対応する表１のｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチドを含み、且つ任意選択で、前記ｇＲＮＡスペーサー配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又は前記異種目的配列は、表６Ａ若しくは６ＢのｇＲＮＡスペーサー配列のヌクレオチドを含む、項目６に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目９）
前記ＰＢＳ配列は、表３の、前記ＲＴ鋳型配列と同じ行からのＰＢＳ配列のコアヌクレオチドを含む配列を有し、且つ任意選択で、前記ＰＢＳ配列のフランキングヌクレオチドの５’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、項目１～８のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目１０）
前記ＰＢＳ配列は、前記ＲＴ鋳型配列、前記ｇＲＮＡスペーサー配列若しくは両方に対応する表３のＰＢＳ配列のコアヌクレオチドを含む配列を有し、且つ任意選択で、前記ＰＢＳ配列のフランキングヌクレオチドの５’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又は前記ＰＢＳ配列は、前記ＲＴ鋳型配列、前記ｇＲＮＡスペーサー配列若しくは両方に対応する表６Ａ若しくは６ＢのＰＢＳ配列を含む配列を有する、項目１～８のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目１１）
前記ＰＢＳ配列は、表Ｘ３若しくはＸ３ａに記載の鋳型ＲＮＡからのＰＢＳの配列、又はそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列、又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を有する、項目１～１０のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目１２）
前記ＰＢＳ配列は、８～１２ヌクレオチド（例えば、８、９、１０、１１又は１２ヌクレオチド）の長さを有する、項目１～１１のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目１３）
前記ｇＲＮＡスキャフォールドは、表６Ａ若しくは１２のｇＲＮＡスキャフォールドの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、項目１～１２のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目１４）
前記ｇＲＮＡスキャフォールドは、前記ＲＴ鋳型配列、前記ｇＲＮＡスペーサー配列若しくは両方に対応する表６Ａ若しくは１２のｇＲＮＡスキャフォールドの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、項目１～１２のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目１５）
前記ｇＲＮＡスキャフォールドは、表Ｘ２、Ｘ３若しくはＸ３ａに記載の鋳型ＲＮＡからのｇＲＮＡスキャフォールドの配列又はそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を有する、項目１～１４のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目１６）
表Ｘ２、Ｘ３若しくはＸ３ａに記載の鋳型ＲＮＡの配列又はそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含む、項目１～１５のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目１７）
前記変異は、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のＫ３４２Ｅ変異（例えば、病原性Ｅ３４２Ｋ変異を修正するための）である、項目１～１６のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目１８）
前記編集前配列は、約１ヌクレオチド～約３５ヌクレオチドの長さを含む（例えば、約１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０又は３０～３５ヌクレオチドを含む）、項目１～１７のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目１９）
前記変異領域は、単一ヌクレオチドを含む、項目１～１８のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目２０）
前記変異領域は、少なくとも２ヌクレオチド長である、項目１～１８のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目２１）
前記変異領域は、最大３２（例えば、最大５、１０、１５、２０、２５、３０又は３２）ヌクレオチド長であり、且つ前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分に対して１つ、２つ又は３つの配列差を含む、項目１～１８又は２０のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目２２）
前記変異領域は、前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分に対して２つの配列差を含む、項目１～１８、２０又は２１のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目２３）
前記変異領域は、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の病原性変異を修正するように設計された第１の領域（例えば、第１のヌクレオチド）及びＰＡＭ配列を不活性化するように設計された第２の領域（例えば、第２のヌクレオチド）（例えば、表５に記載されるような「ＰＡＭ－ｋｉｌｌ」変異）を含む、項目１～１８又は２１若しくは２２のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目２４）
前記変異領域は、前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の前記対応する部分と８０％、７０％、６０％、５０％、４０％又は３０％未満の同一性を含む、項目１～２３のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目２５）
例えば、表７Ｂに例示されるような１つ以上のサイレント変異（例えば、サイレント置換）を含む、項目１～２８のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目２６）
前記変異領域は、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の病原性変異を修正するように設計された第１の領域及びサイレント置換を導入するように設計された第２の領域を含む、項目１～２５のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目２７）
１つ以上の化学的に改変されたヌクレオチドを含む、項目１～２６のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
（項目２８）
遺伝子改変システムであって、
項目１～２７のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ、及び
遺伝子改変ポリペプチド又は前記遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ）
を含む遺伝子改変システム。
（項目２９）
前記遺伝子改変ポリペプチドは、
逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン（例えば、レトロウイルスからのＲＴドメイン又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドドメイン）；及び
標的ＤＮＡ分子に結合し、且つ前記ＲＴドメインに対して異種であるＣａｓドメイン（例えば、Ｃａｓ９ドメイン）；及び
任意選択で、前記ＲＴドメインと前記Ｃａｓドメインとの間に配置されたリンカー
を含む、項目２８に記載の遺伝子改変システム。
（項目３０）
前記ＲＴドメインは、
（ａ）表６のＲＴドメイン；又は
（ｂ）マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）；トリ細網内皮症ウイルス（ＡＶＩＲＥ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、サル泡沫状ウイルス（ＳＦＶ）（例えば、ＳＦＶ３Ｌ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、メイソン・ファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ）、ヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）又はウシ泡沫状／合胞体ウイルス（ＢＦＶ／ＢＳＶ）からのＲＴドメイン
を含む、項目２９に記載の遺伝子改変システム。
（項目３１）
前記Ｃａｓドメインは、表Ｘ１、ＸＸ若しくはＸ５のＣａｓドメイン又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、項目２８～３０のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目３２）
前記スペーサーは、表ＸＸのスペーサー又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、及び前記Ｃａｓドメインは、表ＸＸの同じ行のＣａｓドメイン又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、項目２８～３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目３３）
前記スペーサーは、表ＸＸのスペーサーを含み、及び前記Ｃａｓドメインは、表ＸＸの同じ行のＣａｓドメインを含む、項目２８～３２のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目３４）
前記スペーサーは、表Ｘ５のスペーサー又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、及び前記Ｃａｓドメインは、表Ｘ５の同じ行のＣａｓドメイン又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、項目２８～３３のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目３５）
前記スペーサーは、表Ｘ５のスペーサーを含み、及び前記Ｃａｓドメインは、表Ｘ５の同じ行のＣａｓドメインを含む、項目２８～３４のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目３６）
前記スペーサーは、表６Ａのスペーサー又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、及び前記Ｃａｓドメインは、表６Ａの同じ行のＣａｓドメイン又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、項目２８～３５のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目３７）
前記スペーサーは、表６Ａのスペーサーを含み、及び前記Ｃａｓドメインは、表６Ａの同じ行のＣａｓドメインを含む、項目２８～３６のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目３８）
前記スペーサーは、表６Ｂのスペーサー又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、及び前記Ｃａｓドメインは、表６Ｂの同じ行のＣａｓドメイン又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、項目２８～３７のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目３９）
前記スペーサーは、表６Ｂのスペーサーを含み、及び前記Ｃａｓドメインは、表６Ｂの同じ行のＣａｓドメインを含む、項目２８～３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目４０）
前記Ｃａｓドメインは、表７又は表８のＣａｓドメインを含む、項目２８～３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目４１）
前記Ｃａｓドメインは、
（ａ）Ｃａｓ９ドメインであり；
（ｂ）ＳｐＣａｓ９ドメイン、ＢｌａｔＣａｓ９ドメイン、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ドメイン、ＰｎｐＣａｓ９ドメイン、ＳａｕＣａｓ９ドメイン、ＳａｕＣａｓ９－ＫＫＨドメイン、ＳａｕｒｉＣａｓ９ドメイン、ＳａｕｒｉＣａｓ９－ＫＫＨドメイン、ＳｃａＣａｓ９－Ｓｃ＋＋ドメイン、ＳｐｙＣａｓ９ドメイン、ＳｐｙＣａｓ９－ＮＧドメイン、ＳｐｙＣａｓ９－ＳｐＲＹドメイン又はＳｔ１Ｃａｓ９ドメインであり；及び／又は
（ｃ）Ｎ６７０Ａ変異、Ｎ６１１Ａ変異、Ｎ６０５Ａ変異、Ｎ５８０Ａ変異、Ｎ５８８Ａ変異、Ｎ８７２Ａ変異、Ｎ８６３変異、Ｎ６２２Ａ変異又はＨ８４０Ａ変異を含むＣａｓ９ドメインである、項目２８～３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目４２）
前記Ｃａｓ９ドメインは、表７又は表１２に列挙されるＰＡＭ配列に結合する、項目４１に記載の遺伝子改変システム。
（項目４３）
前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分は、前記Ｃａｓドメインによって認識されるＰＡＭと重複し、例えば、前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の前記第２の部分は、前記ＰＡＭ内にあるか、又は前記ＰＡＭは、前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の前記第２の部分内にある）、項目４２に記載の遺伝子改変システム。
（項目４４）
前記ｇＲＮＡスペーサーは、表１に記載のｇＲＮＡスペーサーであり、及び前記Ｃａｓドメインは、表１の同じ行に列挙されるＣａｓドメイン又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、項目２８～４３のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目４５）
前記鋳型ＲＮＡは、表６Ａ若しくは６Ｂの鋳型ＲＮＡ配列の配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、項目２８～４４のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目４６）
（ａ）前記鋳型ＲＮＡは、表３、６Ａ又は６Ｂの鋳型ＲＮＡ配列の配列を含み；
（ｂ）前記Ｃａｓドメインは、表７又は表８のＣａｓドメインを含み；
（ｃ）前記リンカーは、表１０の（例えば、配列番号５２１７、５１０６、５１９０及び５２１８のいずれかの）リンカー配列を含み；及び
（ｄ）前記遺伝子改変ポリペプチドは、表１１からの（例えば、配列番号５２４５、５２９０、５３２３、５３３０、５３４９、５３５０、５３５１及び４００１のいずれかの）１つ又は２つのＮＬＳ配列を含む、項目２８～４５のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目４７）
前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第１の鎖に第１のニックを生成する、項目２８～４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目４８）
前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の鎖に第２のニックを導く、第２の鎖を標的とするｇＲＮＡスペーサーを更に含む、項目４７に記載の遺伝子改変システム。
（項目４９）
前記第２の鎖を標的とするｇＲＮＡは、表２からの左ｇＲＮＡスペーサー配列又は右ｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチドを含む配列を含み、且つ任意選択で、前記左ｇＲＮＡスペーサー配列又は右ｇＲＮＡスペーサー配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、項目４８に記載の遺伝子改変システム。
（項目５０）
前記第２の鎖を標的とするｇＲＮＡは、（ｉ）の前記ｇＲＮＡスペーサー配列に対応する表２からの左ｇＲＮＡスペーサー配列又は右ｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチドを含む配列を含み、且つ任意選択で、前記左ｇＲＮＡスペーサー配列又は右ｇＲＮＡスペーサー配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、項目４８に記載の遺伝子改変システム。
（項目５１）
前記第２の鎖を標的とするｇＲＮＡは、表４からの第２のニックｇＲＮＡ配列のコアヌクレオチドを含む配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含み、且つ任意選択で、前記第２のニックｇＲＮＡ配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、項目４８に記載の遺伝子改変システム。
（項目５２）
前記第２の鎖を標的とするｇＲＮＡは、（ｉ）の前記ｇＲＮＡスペーサー配列に対応する表４からの第２のニックｇＲＮＡ配列のコアヌクレオチドを含む配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含み、且つ任意選択で、前記第２のニックｇＲＮＡ配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、項目４８に記載の遺伝子改変システム。
（項目５３）
前記第２の鎖を標的とするｇＲＮＡは、例えば、表４に例示されるように、前記遺伝子改変システムの前記鋳型ＲＮＡとの「ＰＡＭ－ｉｎ配向」を有する、項目２８～５２のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目５４）
前記第２の鎖を標的とするｇＲＮＡは、前記鋳型ＲＮＡの標的変異と重複する配列を標的とする、項目２８～５３のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目５５）
第２の鎖を標的とするｇＲＮＡは、
（ｉ）前記ＳＥＲＰＩＮＡ１変異に相補的な配列（例えば、スペーサー配列）；
（ｉｉ）標的遺伝子座における野生型配列に相補的な配列（例えば、スペーサー配列）；
（ｉｉｉ）前記標的遺伝子座の近位のＳＮＰ、例えば対象（例えば、患者）のゲノムＤＮＡに含まれるＳＮＰに相補的な配列（例えば、スペーサー配列）；
（ｉｖ）前記標的遺伝子座の近位の１つ以上のサイレント置換と相補的であるか又はそれを含む配列（例えば、スペーサー配列）
を含む、項目５４に記載の遺伝子改変システム。
（項目５６）
前記ｇＲＮＡスペーサーは、前記ｇＲＮＡスペーサーの約１つ、２つ、３つ又はそれを超えるフランキングヌクレオチドを含む、項目１～５５のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
（項目５７）
前記異種目的配列は、前記ＲＴ鋳型配列の約２つ、３つ、４つ、５つ、１０個、２０個、３０個、４０個又はそれを超えるフランキングヌクレオチドを含む、項目１～５６のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
（項目５８）
前記異種目的配列は、約８～３０、９～２５、１０～２０、１１～１６又は１２～１５（例えば、約１１～１６）ヌクレオチドを含む、項目１～５７のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
（項目５９）
前記変異領域は、前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の前記対応する部分に対して１つ、２つ又は３つのヌクレオチド位置の配列差を含む、項目１～５８のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
（項目６０）
前記変異領域は、前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の前記対応する部分に対して少なくとも２つのヌクレオチド位置の配列差を含む、項目１～５９のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
（項目６１）
前記編集後相同性領域及び／又は編集前相同性領域は、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子と１００％の同一性を含む、項目１～６０のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
（項目６２）
前記ＰＢＳ配列は、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又はそれを超えるフランキングヌクレオチドを更に含む、項目１～６１のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
（項目６３）
前記ＰＢＳ配列は、約５～２０、８～１６、８～１４、８～１３、９～１３、９～１２又は１０～１２（例えば、約９～１２）ヌクレオチドを含む、項目１～６２のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
（項目６４）
前記ＰＢＳ配列は、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のニック部位から１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド以内に結合する、項目１～６３のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
（項目６５）
前記遺伝子改変ポリペプチドの前記ドメインは、ペプチドリンカーによって結合されている、項目２８～６４のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目６６）
前記リンカーは、表１０の（例えば、配列番号５２１７、５１０６、５１９０及び５２１８のいずれかの）リンカーの配列を含む、項目６５に記載の遺伝子改変システム。
（項目６７）
前記遺伝子改変ポリペプチドは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を更に含む、項目２８～６６のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
（項目６８）
前記遺伝子改変ポリペプチドは、第１のＮＬＳ及び第２のＮＬＳを含む、項目６７に記載の遺伝子改変システム。
（項目６９）
前記ＮＬＳは、表１１の（例えば、配列番号５２４５、５２９０、５３２３、５３３０、５３４９、５３５０、５３５１及び４００１のいずれかの）ＮＬＳの配列を含む、項目６７又は６８に記載の遺伝子改変システム。
（項目７０）
表４、６Ａ若しくは６Ｂの鋳型ＲＮＡの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む鋳型ＲＮＡ。
（項目４９）
表４、６Ａ又は６Ｂの鋳型ＲＮＡの配列を含む鋳型ＲＮＡ。
（項目７１）
遺伝子改変システムであって、
（ｉｉｉ）表４の鋳型ＲＮＡの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む鋳型ＲＮＡ；及び
（ｉｖ）表４の、（ｉ）と同じ行からの第２のニックｇＲＮＡ配列、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列
を含む遺伝子改変システム。
（項目７２）
遺伝子改変システムであって、
（ｉｉｉ）表４の鋳型ＲＮＡの配列を含む鋳型ＲＮＡ；及び
（ｉｖ）表４の、（ｉ）と同じ行からの第２のニックｇＲＮＡ配列
を含む遺伝子改変システム。
（項目７３）
項目１～２４、５６～６４、７０若しくは７１のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は項目２８～６９、７１若しくは７２のいずれか一項に記載の遺伝子改変システムをコードするＤＮＡ。
（項目７４）
項目２８～６９、７１若しくは７２のいずれか一項に記載のシステム又はそれをコードする１つ以上の核酸及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む医薬組成物。
（項目７５）
前記薬学的に許容される賦形剤又は担体は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、小胞及び脂質ナノ粒子からなる群から選択される、項目７４に記載の医薬組成物。
（項目７６）
前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスである、項目７５に記載の医薬組成物。
（項目７７）
項目１～７２のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システムを含む宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）。
（項目７８）
項目１～２４、５６～６４、７０又は７１のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡを作製する方法であって、前記鋳型ＲＮＡを、インビトロ転写（例えば、固相合成）によって又は前記鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡを、前記鋳型ＲＮＡの生成を可能にする条件下で宿主細胞に導入することによって合成することを含む方法。
（項目７９）
細胞内のヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の標的部位を改変する方法であって、前記細胞を、項目２８～６９、７１若しくは７２のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又はそれをコードするＤＮＡと接触させ、それにより細胞内の前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の前記標的部位を改変することを含む方法。
（項目８０）
ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の変異に関連する疾患又は症状を有する対象を処置する方法であって、項目２８～６９、７１若しくは７２のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又はそれをコードするＤＮＡを前記対象に投与し、それにより前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の変異に関連する疾患又は症状を有する前記対象を処置することを含む方法。
（項目８１）
前記疾患又は症状は、アルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）である、項目７９又は８０に記載の方法。
（項目８２）
前記対象は、Ｅ３４２Ｋ変異を有する、項目７９～８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目８３）
ＡＡＴＤを有する対象を処置する方法であって、項目２８～６９、７１若しくは７２のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又はそれをコードするＤＮＡを前記対象に投与し、それによりＡＡＴＤを有する前記対象を処置することを含む方法。
（項目８４）
前記システムの標的細胞への導入は、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の病原性変異の修正をもたらす、項目２８～７２又は７８～８３のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又は方法。
（項目８５）
前記病原性変異は、Ｅ３４２Ｋ変異であり、前記修正は、Ｋ３４２Ｅのアミノ酸置換を含む、項目２８～７２又は７８～８４のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又は方法。
（項目８６）
前記システムの標的細胞への導入は、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の機能の回復を引き起こす変異をもたらす、項目２８～７２又は７８～８５のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又は方法。
（項目８７）
前記変異の修正は、標的核酸の少なくとも３０％（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又はそれを超えるもの）で起こる、項目２８～７２又は７８～８６のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又は方法。
（項目８８）
前記変異の修正は、標的細胞の少なくとも３０％（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又はそれを超えるもの）で起こる、項目２８～７２又は７８～８７のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又は方法。
（項目８９）
前記遺伝子改変システムは、第２の鎖を標的とするｇＲＮＡを含み、標的細胞の集団における前記変異の修正は、第２の鎖を標的とするｇＲＮＡを有しない鋳型ＲＮＡを含む遺伝子改変システムで処置された標的細胞の集団に対して増加する、項目２８～７２又は７８～８８のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又は方法。
（項目９０）
前記鋳型ＲＮＡは、１つ以上のサイレント置換（例えば、表７Ｂに例示されるようなもの）を含み、標的細胞の集団における前記変異の修正は、１つ以上のサイレント置換を含まない鋳型ＲＮＡを含む遺伝子改変システムで処置された標的細胞の集団に対して増加する、項目２８～７２又は７８～８９のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又は方法。
（項目９１）
前記細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である、項目７８～９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目９２）
前記対象は、ヒトである、項目７８～９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目９３）
前記接触は、エクスビボで行われ、例えば、前記細胞又は対象のＤＮＡは、エクスビボで改変される、項目７８～９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目９４）
前記接触は、インビボで行われ、例えば、前記細胞又は対象のＤＮＡは、インビボで改変される、項目７８～９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目９５）
前記細胞又は前記対象を前記システムと接触させることは、前記遺伝子改変ポリペプチドの生成を可能にする条件下において、前記細胞又は前記対象内の細胞を、前記遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）と接触させることを含む、項目７８～９４のいずれか一項に記載の方法。

Claims (96)

  1. 鋳型ＲＮＡであって、５’から３’に、
    （ｉ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第１の部分に相補的なｇＲＮＡスペーサーであって、表１のｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチドを含む配列を有し、且つ任意選択で、前記ｇＲＮＡスペーサーのフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又は表６Ａ、６Ｂ、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ３ａ、Ｘ５又はＸＸから選択されるスペーサーの配列を有するｇＲＮＡスペーサー；
    （ｉｉ）遺伝子改変ポリペプチドに結合する（例えば、前記遺伝子改変ポリペプチドのＣａｓドメインに結合する）ｇＲＮＡスキャフォールド、
    （ｉｉｉ）前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分に変異を導入するため（例えば、そこにある変異を修正するため）の変異領域を含む異種目的配列（ここで、任意選択で、前記異種目的配列は、５’から３’に、編集後相同性領域、変異領域及び編集前相同性領域を含む）、及び
    （ｉｖ）前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第３の部分と１００％の同一性を有する少なくとも５、６、７又は８塩基を含むプライマー結合部位（ＰＢＳ）配列
    を含む鋳型ＲＮＡ。
  2. 前記異種目的配列は、表３からのＲＴ鋳型配列のコアヌクレオチドを含み、且つ任意選択で、前記ＲＴ鋳型配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又は前記異種目的配列は、表６Ａ若しくは６ＢからのＲＴ鋳型配列の配列を含む、請求項１に記載の鋳型ＲＮＡ。
  3. 前記異種目的配列は、前記ｇＲＮＡスペーサー配列に対応する表３のＲＴ鋳型配列のコアヌクレオチドを含み、且つ任意選択で、前記ＲＴ鋳型配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又は前記異種目的配列は、表６Ａ若しくは６ＢからのＲＴ鋳型配列の配列を含む、請求項１に記載の鋳型ＲＮＡ。
  4. 前記異種目的配列は、表Ｘ３若しくはＸ３ａに記載の鋳型ＲＮＡからの異種目的配列の配列、又はそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列、又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  5. 前記異種目的配列は、６～１６ヌクレオチド（例えば、６、８、１０、１２、１４、１５又は１６ヌクレオチド）の長さを有する、請求項１～４のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  6. 鋳型ＲＮＡであって、５’から３’に、
    （ｉ）ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第１の部分に相補的なｇＲＮＡスペーサー、
    （ｉｉ）遺伝子改変ポリペプチドに結合する（例えば、前記遺伝子改変ポリペプチドのＣａｓドメインに結合する）ｇＲＮＡスキャフォールド、
    （ｉｉｉ）前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分に変異を導入するため（例えば、そこにある変異を修正するため）の変異領域を含む異種目的配列であって、表３のＲＴ鋳型配列のコアヌクレオチドを含み、且つ任意選択で、前記ＲＴ鋳型配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又は表６Ａ、６Ｂ、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ３ａ、Ｘ５若しくはＸＸのＲＴ鋳型配列を含む異種目的配列；及び
    （ｉｖ）前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第３の部分と１００％の同一性の少なくとも５、６、７又は８塩基を含むＰＢＳ配列
    を含む鋳型ＲＮＡ。
  7. 前記ｇＲＮＡスペーサーは、表１のｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチドを含み、且つ任意選択で、前記ｇＲＮＡスペーサー配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又は前記ｇＲＮＡスペーサーは、表６Ａ若しくは６ＢのｇＲＮＡスペーサー配列を含む、請求項６に記載の鋳型ＲＮＡ。
  8. 前記異種目的配列は、前記ＲＴ鋳型配列に対応する表１のｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチドを含み、且つ任意選択で、前記ｇＲＮＡスペーサー配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又は前記異種目的配列は、表６Ａ若しくは６ＢのｇＲＮＡスペーサー配列のヌクレオチドを含む、請求項６に記載の鋳型ＲＮＡ。
  9. 前記ＰＢＳ配列は、表３の、前記ＲＴ鋳型配列と同じ行からのＰＢＳ配列のコアヌクレオチドを含む配列を有し、且つ任意選択で、前記ＰＢＳ配列のフランキングヌクレオチドの５’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  10. 前記ＰＢＳ配列は、前記ＲＴ鋳型配列、前記ｇＲＮＡスペーサー配列若しくは両方に対応する表３のＰＢＳ配列のコアヌクレオチドを含む配列を有し、且つ任意選択で、前記ＰＢＳ配列のフランキングヌクレオチドの５’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含むか、又は前記ＰＢＳ配列は、前記ＲＴ鋳型配列、前記ｇＲＮＡスペーサー配列若しくは両方に対応する表６Ａ若しくは６ＢのＰＢＳ配列を含む配列を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  11. 前記ＰＢＳ配列は、表Ｘ３若しくはＸ３ａに記載の鋳型ＲＮＡからのＰＢＳの配列、又はそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列、又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  12. 前記ＰＢＳ配列は、８～１２ヌクレオチド（例えば、８、９、１０、１１又は１２ヌクレオチド）の長さを有する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  13. 前記ｇＲＮＡスキャフォールドは、表６Ａ若しくは１２のｇＲＮＡスキャフォールドの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  14. 前記ｇＲＮＡスキャフォールドは、前記ＲＴ鋳型配列、前記ｇＲＮＡスペーサー配列若しくは両方に対応する表６Ａ若しくは１２のｇＲＮＡスキャフォールドの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  15. 前記ｇＲＮＡスキャフォールドは、表Ｘ２、Ｘ３若しくはＸ３ａに記載の鋳型ＲＮＡからのｇＲＮＡスキャフォールドの配列又はそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を有する、請求項１～１４のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  16. 表Ｘ２、Ｘ３若しくはＸ３ａに記載の鋳型ＲＮＡの配列又はそれと少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  17. 前記変異は、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のＫ３４２Ｅ変異（例えば、病原性Ｅ３４２Ｋ変異を修正するための）である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  18. 前記編集前配列は、約１ヌクレオチド～約３５ヌクレオチドの長さを含む（例えば、約１～５、５～１０、１０～１５、１５～２０、２０～２５、２５～３０又は３０～３５ヌクレオチドを含む）、請求項１～１７のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  19. 前記変異領域は、単一ヌクレオチドを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  20. 前記変異領域は、少なくとも２ヌクレオチド長である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  21. 前記変異領域は、最大３２（例えば、最大５、１０、１５、２０、２５、３０又は３２）ヌクレオチド長であり、且つ前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分に対して１つ、２つ又は３つの配列差を含む、請求項１～１８又は２０のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  22. 前記変異領域は、前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分に対して２つの配列差を含む、請求項１～１８、２０又は２１のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  23. 前記変異領域は、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の病原性変異を修正するように設計された第１の領域（例えば、第１のヌクレオチド）及びＰＡＭ配列を不活性化するように設計された第２の領域（例えば、第２のヌクレオチド）（例えば、表５に記載されるような「ＰＡＭ－ｋｉｌｌ」変異）を含む、請求項１～１８又は２１若しくは２２のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  24. 前記変異領域は、前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の前記対応する部分と８０％、７０％、６０％、５０％、４０％又は３０％未満の同一性を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  25. 例えば、表７Ｂに例示されるような１つ以上のサイレント変異（例えば、サイレント置換）を含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  26. 前記変異領域は、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の病原性変異を修正するように設計された第１の領域及びサイレント置換を導入するように設計された第２の領域を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  27. １つ以上の化学的に改変されたヌクレオチドを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ。
  28. 遺伝子改変システムであって、
    請求項１～２７のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ、及び
    遺伝子改変ポリペプチド又は前記遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ）
    を含む遺伝子改変システム。
  29. 前記遺伝子改変ポリペプチドは、
    逆転写酵素（ＲＴ）ドメイン（例えば、レトロウイルスからのＲＴドメイン又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドドメイン）；及び
    標的ＤＮＡ分子に結合し、且つ前記ＲＴドメインに対して異種であるＣａｓドメイン（例えば、Ｃａｓ９ドメイン）；及び
    任意選択で、前記ＲＴドメインと前記Ｃａｓドメインとの間に配置されたリンカー
    を含む、請求項２８に記載の遺伝子改変システム。
  30. 前記ＲＴドメインは、
    （ａ）表６のＲＴドメイン；又は
    （ｂ）マウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）、ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）；トリ細網内皮症ウイルス（ＡＶＩＲＥ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、サル泡沫状ウイルス（ＳＦＶ）（例えば、ＳＦＶ３Ｌ）、ウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）、メイソン・ファイザーサルウイルス（ＭＰＭＶ）、ヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）又はウシ泡沫状／合胞体ウイルス（ＢＦＶ／ＢＳＶ）からのＲＴドメイン
    を含む、請求項２９に記載の遺伝子改変システム。
  31. 前記Ｃａｓドメインは、表Ｘ１、ＸＸ若しくはＸ５のＣａｓドメイン又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  32. 前記スペーサーは、表ＸＸのスペーサー又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、及び前記Ｃａｓドメインは、表ＸＸの同じ行のＣａｓドメイン又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、請求項２８～３１のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  33. 前記スペーサーは、表ＸＸのスペーサーを含み、及び前記Ｃａｓドメインは、表ＸＸの同じ行のＣａｓドメインを含む、請求項２８～３２のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  34. 前記スペーサーは、表Ｘ５のスペーサー又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、及び前記Ｃａｓドメインは、表Ｘ５の同じ行のＣａｓドメイン又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、請求項２８～３３のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  35. 前記スペーサーは、表Ｘ５のスペーサーを含み、及び前記Ｃａｓドメインは、表Ｘ５の同じ行のＣａｓドメインを含む、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  36. 前記スペーサーは、表６Ａのスペーサー又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、及び前記Ｃａｓドメインは、表６Ａの同じ行のＣａｓドメイン又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、請求項２８～３５のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  37. 前記スペーサーは、表６Ａのスペーサーを含み、及び前記Ｃａｓドメインは、表６Ａの同じ行のＣａｓドメインを含む、請求項２８～３６のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  38. 前記スペーサーは、表６Ｂのスペーサー又はそれに１つ、２つ若しくは３つの置換を有する配列を含み、及び前記Ｃａｓドメインは、表６Ｂの同じ行のＣａｓドメイン又はそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列を含む、請求項２８～３７のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  39. 前記スペーサーは、表６Ｂのスペーサーを含み、及び前記Ｃａｓドメインは、表６Ｂの同じ行のＣａｓドメインを含む、請求項２８～３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  40. 前記Ｃａｓドメインは、表７又は表８のＣａｓドメインを含む、請求項２８～３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  41. 前記Ｃａｓドメインは、
    （ａ）Ｃａｓ９ドメインであり；
    （ｂ）ＳｐＣａｓ９ドメイン、ＢｌａｔＣａｓ９ドメイン、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ドメイン、ＰｎｐＣａｓ９ドメイン、ＳａｕＣａｓ９ドメイン、ＳａｕＣａｓ９－ＫＫＨドメイン、ＳａｕｒｉＣａｓ９ドメイン、ＳａｕｒｉＣａｓ９－ＫＫＨドメイン、ＳｃａＣａｓ９－Ｓｃ＋＋ドメイン、ＳｐｙＣａｓ９ドメイン、ＳｐｙＣａｓ９－ＮＧドメイン、ＳｐｙＣａｓ９－ＳｐＲＹドメイン又はＳｔ１Ｃａｓ９ドメインであり；及び／又は
    （ｃ）Ｎ６７０Ａ変異、Ｎ６１１Ａ変異、Ｎ６０５Ａ変異、Ｎ５８０Ａ変異、Ｎ５８８Ａ変異、Ｎ８７２Ａ変異、Ｎ８６３変異、Ｎ６２２Ａ変異又はＨ８４０Ａ変異を含むＣａｓ９ドメインである、請求項２８～３９のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  42. 前記Ｃａｓ９ドメインは、表７又は表１２に列挙されるＰＡＭ配列に結合する、請求項４１に記載の遺伝子改変システム。
  43. 前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の部分は、前記Ｃａｓドメインによって認識されるＰＡＭと重複し、例えば、前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の前記第２の部分は、前記ＰＡＭ内にあるか、又は前記ＰＡＭは、前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の前記第２の部分内にある）、請求項４２に記載の遺伝子改変システム。
  44. 前記ｇＲＮＡスペーサーは、表１に記載のｇＲＮＡスペーサーであり、及び前記Ｃａｓドメインは、表１の同じ行に列挙されるＣａｓドメイン又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、請求項２８～４３のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  45. 前記鋳型ＲＮＡは、表６Ａ若しくは６Ｂの鋳型ＲＮＡ配列の配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む、請求項２８～４４のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  46. （ａ）前記鋳型ＲＮＡは、表３、６Ａ又は６Ｂの鋳型ＲＮＡ配列の配列を含み；
    （ｂ）前記Ｃａｓドメインは、表７又は表８のＣａｓドメインを含み；
    （ｃ）前記リンカーは、表１０の（例えば、配列番号５２１７、５１０６、５１９０及び５２１８のいずれかの）リンカー配列を含み；及び
    （ｄ）前記遺伝子改変ポリペプチドは、表１１からの（例えば、配列番号５２４５、５２９０、５３２３、５３３０、５３４９、５３５０、５３５１及び４００１のいずれかの）１つ又は２つのＮＬＳ配列を含む、請求項２８～４５のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  47. 前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第１の鎖に第１のニックを生成する、請求項２８～４６のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  48. 前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の第２の鎖に第２のニックを導く、第２の鎖を標的とするｇＲＮＡスペーサーを更に含む、請求項４７に記載の遺伝子改変システム。
  49. 前記第２の鎖を標的とするｇＲＮＡは、表２からの左ｇＲＮＡスペーサー配列又は右ｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチドを含む配列を含み、且つ任意選択で、前記左ｇＲＮＡスペーサー配列又は右ｇＲＮＡスペーサー配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、請求項４８に記載の遺伝子改変システム。
  50. 前記第２の鎖を標的とするｇＲＮＡは、（ｉ）の前記ｇＲＮＡスペーサー配列に対応する表２からの左ｇＲＮＡスペーサー配列又は右ｇＲＮＡスペーサー配列のコアヌクレオチドを含む配列を含み、且つ任意選択で、前記左ｇＲＮＡスペーサー配列又は右ｇＲＮＡスペーサー配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、請求項４８に記載の遺伝子改変システム。
  51. 前記第２の鎖を標的とするｇＲＮＡは、表４からの第２のニックｇＲＮＡ配列のコアヌクレオチドを含む配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含み、且つ任意選択で、前記第２のニックｇＲＮＡ配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、請求項４８に記載の遺伝子改変システム。
  52. 前記第２の鎖を標的とするｇＲＮＡは、（ｉ）の前記ｇＲＮＡスペーサー配列に対応する表４からの第２のニックｇＲＮＡ配列のコアヌクレオチドを含む配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含み、且つ任意選択で、前記第２のニックｇＲＮＡ配列のフランキングヌクレオチドの３’末端から始まる１つ以上の連続ヌクレオチドを含む、請求項４８に記載の遺伝子改変システム。
  53. 前記第２の鎖を標的とするｇＲＮＡは、例えば、表４に例示されるように、前記遺伝子改変システムの前記鋳型ＲＮＡとの「ＰＡＭ－ｉｎ配向」を有する、請求項２８～５２のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  54. 前記第２の鎖を標的とするｇＲＮＡは、前記鋳型ＲＮＡの標的変異と重複する配列を標的とする、請求項２８～５３のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  55. 第２の鎖を標的とするｇＲＮＡは、
    （ｉ）前記ＳＥＲＰＩＮＡ１変異に相補的な配列（例えば、スペーサー配列）；
    （ｉｉ）標的遺伝子座における野生型配列に相補的な配列（例えば、スペーサー配列）；
    （ｉｉｉ）前記標的遺伝子座の近位のＳＮＰ、例えば対象（例えば、患者）のゲノムＤＮＡに含まれるＳＮＰに相補的な配列（例えば、スペーサー配列）；
    （ｉｖ）前記標的遺伝子座の近位の１つ以上のサイレント置換と相補的であるか又はそれを含む配列（例えば、スペーサー配列）
    を含む、請求項５４に記載の遺伝子改変システム。
  56. 前記ｇＲＮＡスペーサーは、前記ｇＲＮＡスペーサーの約１つ、２つ、３つ又はそれを超えるフランキングヌクレオチドを含む、請求項１～５５のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
  57. 前記異種目的配列は、前記ＲＴ鋳型配列の約２つ、３つ、４つ、５つ、１０個、２０個、３０個、４０個又はそれを超えるフランキングヌクレオチドを含む、請求項１～５６のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
  58. 前記異種目的配列は、約８～３０、９～２５、１０～２０、１１～１６又は１２～１５（例えば、約１１～１６）ヌクレオチドを含む、請求項１～５７のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
  59. 前記変異領域は、前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の前記対応する部分に対して１つ、２つ又は３つのヌクレオチド位置の配列差を含む、請求項１～５８のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
  60. 前記変異領域は、前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の前記対応する部分に対して少なくとも２つのヌクレオチド位置の配列差を含む、請求項１～５９のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
  61. 前記編集後相同性領域及び／又は編集前相同性領域は、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子と１００％の同一性を含む、請求項１～６０のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
  62. 前記ＰＢＳ配列は、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又はそれを超えるフランキングヌクレオチドを更に含む、請求項１～６１のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
  63. 前記ＰＢＳ配列は、約５～２０、８～１６、８～１４、８～１３、９～１３、９～１２又は１０～１２（例えば、約９～１２）ヌクレオチドを含む、請求項１～６２のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
  64. 前記ＰＢＳ配列は、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子のニック部位から１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチド以内に結合する、請求項１～６３のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システム。
  65. 前記遺伝子改変ポリペプチドの前記ドメインは、ペプチドリンカーによって結合されている、請求項２８～６４のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  66. 前記リンカーは、表１０の（例えば、配列番号５２１７、５１０６、５１９０及び５２１８のいずれかの）リンカーの配列を含む、請求項６５に記載の遺伝子改変システム。
  67. 前記遺伝子改変ポリペプチドは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）を更に含む、請求項２８～６６のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム。
  68. 前記遺伝子改変ポリペプチドは、第１のＮＬＳ及び第２のＮＬＳを含む、請求項６７に記載の遺伝子改変システム。
  69. 前記ＮＬＳは、表１１の（例えば、配列番号５２４５、５２９０、５３２３、５３３０、５３４９、５３５０、５３５１及び４００１のいずれかの）ＮＬＳの配列を含む、請求項６７又は６８に記載の遺伝子改変システム。
  70. 表４、６Ａ若しくは６Ｂの鋳型ＲＮＡの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む鋳型ＲＮＡ。
  71. 表４、６Ａ又は６Ｂの鋳型ＲＮＡの配列を含む鋳型ＲＮＡ。
  72. 遺伝子改変システムであって、
    （ｉｉｉ）表４の鋳型ＲＮＡの配列又はそれと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の同一性を有する配列を含む鋳型ＲＮＡ；及び
    （ｉｖ）表４の、（ｉ）と同じ行からの第２のニックｇＲＮＡ配列、それと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有する配列
    を含む遺伝子改変システム。
  73. 遺伝子改変システムであって、
    （ｉｉｉ）表４の鋳型ＲＮＡの配列を含む鋳型ＲＮＡ；及び
    （ｉｖ）表４の、（ｉ）と同じ行からの第２のニックｇＲＮＡ配列
    を含む遺伝子改変システム。
  74. 請求項１～２４、５６～６４、７０若しくは７１のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は請求項２８～６９、７１若しくは７２のいずれか一項に記載の遺伝子改変システムをコードするＤＮＡ。
  75. 請求項２８～６９、７１若しくは７２のいずれか一項に記載のシステム又はそれをコードする１つ以上の核酸及び薬学的に許容される賦形剤又は担体を含む医薬組成物。
  76. 前記薬学的に許容される賦形剤又は担体は、プラスミドベクター、ウイルスベクター、小胞及び脂質ナノ粒子からなる群から選択される、請求項７４に記載の医薬組成物。
  77. 前記ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスである、請求項７５に記載の医薬組成物。
  78. 請求項１～７２のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡ又は遺伝子改変システムを含む宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞）。
  79. 請求項１～２４、５６～６４、７０又は７１のいずれか一項に記載の鋳型ＲＮＡを作製する方法であって、前記鋳型ＲＮＡを、インビトロ転写（例えば、固相合成）によって又は前記鋳型ＲＮＡをコードするＤＮＡを、前記鋳型ＲＮＡの生成を可能にする条件下で宿主細胞に導入することによって合成することを含む方法。
  80. 細胞内のヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の標的部位を改変する方法であって、前記細胞を、請求項２８～６９、７１若しくは７２のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又はそれをコードするＤＮＡと接触させ、それにより細胞内の前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の前記標的部位を改変することを含む方法。
  81. ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の変異に関連する疾患又は症状を有する対象を処置する方法であって、請求項２８～６９、７１若しくは７２のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又はそれをコードするＤＮＡを前記対象に投与し、それにより前記ヒトＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の変異に関連する疾患又は症状を有する前記対象を処置することを含む方法。
  82. 前記疾患又は症状は、アルファ１アンチトリプシン欠乏症（ＡＡＴＤ）である、請求項７９又は８０に記載の方法。
  83. 前記対象は、Ｅ３４２Ｋ変異を有する、請求項７９～８１のいずれか一項に記載の方法。
  84. ＡＡＴＤを有する対象を処置する方法であって、請求項２８～６９、７１若しくは７２のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又はそれをコードするＤＮＡを前記対象に投与し、それによりＡＡＴＤを有する前記対象を処置することを含む方法。
  85. 前記システムの標的細胞への導入は、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の病原性変異の修正をもたらす、請求項２８～７２又は７８～８３のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又は方法。
  86. 前記病原性変異は、Ｅ３４２Ｋ変異であり、前記修正は、Ｋ３４２Ｅのアミノ酸置換を含む、請求項２８～７２又は７８～８４のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又は方法。
  87. 前記システムの標的細胞への導入は、前記ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子の機能の回復を引き起こす変異をもたらす、請求項２８～７２又は７８～８５のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又は方法。
  88. 前記変異の修正は、標的核酸の少なくとも３０％（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又はそれを超えるもの）で起こる、請求項２８～７２又は７８～８６のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又は方法。
  89. 前記変異の修正は、標的細胞の少なくとも３０％（例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％又はそれを超えるもの）で起こる、請求項２８～７２又は７８～８７のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又は方法。
  90. 前記遺伝子改変システムは、第２の鎖を標的とするｇＲＮＡを含み、標的細胞の集団における前記変異の修正は、第２の鎖を標的とするｇＲＮＡを有しない鋳型ＲＮＡを含む遺伝子改変システムで処置された標的細胞の集団に対して増加する、請求項２８～７２又は７８～８８のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又は方法。
  91. 前記鋳型ＲＮＡは、１つ以上のサイレント置換（例えば、表７Ｂに例示されるようなもの）を含み、標的細胞の集団における前記変異の修正は、１つ以上のサイレント置換を含まない鋳型ＲＮＡを含む遺伝子改変システムで処置された標的細胞の集団に対して増加する、請求項２８～７２又は７８～８９のいずれか一項に記載の遺伝子改変システム又は方法。
  92. 前記細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞である、請求項７８～９０のいずれか一項に記載の方法。
  93. 前記対象は、ヒトである、請求項７８～９１のいずれか一項に記載の方法。
  94. 前記接触は、エクスビボで行われ、例えば、前記細胞又は対象のＤＮＡは、エクスビボで改変される、請求項７８～９２のいずれか一項に記載の方法。
  95. 前記接触は、インビボで行われ、例えば、前記細胞又は対象のＤＮＡは、インビボで改変される、請求項７８～９３のいずれか一項に記載の方法。
  96. 前記細胞又は前記対象を前記システムと接触させることは、前記遺伝子改変ポリペプチドの生成を可能にする条件下において、前記細胞又は前記対象内の細胞を、前記遺伝子改変ポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）と接触させることを含む、請求項７８～９４のいずれか一項に記載の方法。
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