JP2023082133A - 肝臓遺伝子のモジュレーション - Google Patents
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Abstract
【課題】肝臓指向性遺伝子治療を通じて対処され得るいくつかの疾患の処置または予防のための組成物および方法を提供する。【解決手段】一態様では、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子の発現がモジュレートされた細胞が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、細胞は、前記遺伝子をノックアウトするために1つまたは複数の操作されたヌクレアーゼを使用して、前記遺伝子が不活性化された細胞など、前記遺伝子のノックアウトを含む。別の態様では、本明細書に記載される細胞、発現構築物、転写因子および/またはヌクレアーゼの1つまたは複数を含む医薬組成物が提供される。【選択図】図1
Description
関連出願への相互参照
本出願は、2016年9月7日に出願された米国仮出願番号第62/384,428号の利益を主張しており、その開示は、その全体が参考として本明細書によって援用される。
本出願は、2016年9月7日に出願された米国仮出願番号第62/384,428号の利益を主張しており、その開示は、その全体が参考として本明細書によって援用される。
技術分野
本開示は、遺伝子治療、特に疾患関連内因性遺伝子のノックアウト、および阻害性タンパク質の発現のための肝臓への導入遺伝子コード構築物の標的化送達の分野にある。
本開示は、遺伝子治療、特に疾患関連内因性遺伝子のノックアウト、および阻害性タンパク質の発現のための肝臓への導入遺伝子コード構築物の標的化送達の分野にある。
背景
遺伝子治療は、1つもしくは複数の不活性化された遺伝子を有するように、および/またはその細胞において以前には産生されなかった産物を細胞に発現させるように細胞を遺伝子操作するため使用され得る(例えば、導入遺伝子挿入を介しておよび/または内因性配列の修正を介して)。導入遺伝子挿入の使用の例には、1つもしくは複数の新規治療的タンパク質をコードする1つもしくは複数の遺伝子の挿入、細胞もしくは個体において欠如しているもしくは機能障害性であるタンパク質をコードするコード配列の挿入、変異型遺伝子配列を含有する細胞における野生型遺伝子もしくはその断片の挿入、および/またはmicroRNAもしくはsiRNAなどの構造的核酸をコードする配列の挿入が含まれる。内因性遺伝子配列の「修正」の有用な適用の例には、疾患関連遺伝子変異の変更、スプライス部位をコードする配列における変更、調節配列における変更、および/またはタンパク質の構造的特徴をコードする配列の標的化変更が含まれる。
遺伝子治療は、1つもしくは複数の不活性化された遺伝子を有するように、および/またはその細胞において以前には産生されなかった産物を細胞に発現させるように細胞を遺伝子操作するため使用され得る(例えば、導入遺伝子挿入を介しておよび/または内因性配列の修正を介して)。導入遺伝子挿入の使用の例には、1つもしくは複数の新規治療的タンパク質をコードする1つもしくは複数の遺伝子の挿入、細胞もしくは個体において欠如しているもしくは機能障害性であるタンパク質をコードするコード配列の挿入、変異型遺伝子配列を含有する細胞における野生型遺伝子もしくはその断片の挿入、および/またはmicroRNAもしくはsiRNAなどの構造的核酸をコードする配列の挿入が含まれる。内因性遺伝子配列の「修正」の有用な適用の例には、疾患関連遺伝子変異の変更、スプライス部位をコードする配列における変更、調節配列における変更、および/またはタンパク質の構造的特徴をコードする配列の標的化変更が含まれる。
肝遺伝子移入は、血友病およびリソソーム蓄積障害を含む種々の障害の処置および/または予防のために対象に導入遺伝子を送達する有効な手段を提供する。例えば、米国特許第9,150,847号ならびに米国特許出願公開第20170119906号、同第20130177983号および同第20140017212号を参照のこと。肝臓指向性遺伝子治療に特異的なベクターも記載されている。例えば、WO2014064277;WO2009130208;PCT公開番号WO2017/074526;EP2451474B1、Chuahら(2014年)Molecular Therapy、22巻、1605~1613頁;およびNairら(2014年)Blood 123巻:3195~3199頁を参照のこと。これらのベクターは、野生型マウス微小ウイルス(MVM)イントロン配列を含み得る。例えば、HautおよびPintel(1998年)J. Virol. 72巻:1834~1843頁;HautおよびPintel(1998年)Virol. 258巻:84~94頁を参照のこと。従って、肝臓指向性遺伝子治療は、いくつかの疾患の処置または予防に有望である。
人工転写因子およびヌクレアーゼ、例えば、操作されたジンクフィンガータンパク質転写因子(ZFP-TF)、転写活性化因子様エフェクター転写因子(TALE-TF)、CRISPR/Cas転写因子(CRISPR-TF)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、RNAガイドされるヌクレアーゼとも呼ばれる、操作されたcrRNA/tracr RNA(「シングルガイドRNA」)を用いるCRISPR/Cas系、および/またはアルゴノート系に基づくヌクレアーゼ(例えば、T.thermophilus由来、「TtAgo」として公知、(Swartsら(2014年)Nature 507巻(7491号):258~261頁)は、転写調節ドメイン(転写因子について)もしくは切断ドメイン(ヌクレアーゼについて)と会合したまたはそれらに作動可能に連結したDNA結合ドメイン(ヌクレオチドまたはポリペプチド)を含み、遺伝子発現のモジュレーションおよびゲノム配列の標的化変更に使用されてきた。例えば、人工ヌクレアーゼは、外因性配列を挿入し、1つまたは複数の内因性遺伝子を不活性化し、変更された遺伝子発現パターンを有する生物(例えば、作物)および細胞系を創出するなどのために使用されてきた。例えば、米国特許第9,255,250号;同第9,200,266号;同第9,045,763号;同第9,005,973号;同第8,956,828号;同第8,945,868号;同第8,703,489号;同第8,586,526号;同第6,534,261号;同第6,599,692号;同第6,503,717号;同第6,689,558号;同第7,067,317号;同第7,262,054号;同第7,888,121号;同第7,972,854号;同第7,914,796号;同第7,951,925号;同第8,110,379号;同第8,409,861号;米国特許出願公開第20030232410号;同第20050208489号;同第20050026157号;同第20050064474号;同第20060063231号;同第20080159996号;同第201000218264号;同第20120017290号;同第20110265198号;同第20130137104号;同第20130122591号;同第20130177983号および同第20130177960号および同第20150056705号を参照のこと。同様に、特定の配列に標的化される人工転写因子が、内因性遺伝子発現を活性化または抑圧するために使用されてきた。例えば、米国特許第9,234,016号;同第8,563,314号および同第8,841,260号;Perez-Pineraら(2013年)Nature Methods 10巻:973~976頁を参照のこと。ジンクフィンガータンパク質を含有するこれらの操作された転写因子を使用する臨床試験は、これらの新規転写因子が、種々の状態を処置することが可能であることを示している(例えば、Yuら(2006年)FASEB J. 20巻:479~481頁を参照のこと)。
Chuahら(2014年)Molecular Therapy、22巻、1605~1613頁
Nairら(2014年)Blood 123巻:3195~3199頁
HautおよびPintel(1998年)J. Virol. 72巻:1834~1843頁
HautおよびPintel(1998年)Virol. 258巻:84~94頁
Perez-Pineraら(2013年)Nature Methods 10巻:973~976頁
Yuら(2006年)FASEB J. 20巻:479~481頁
しかし、肝臓指向性遺伝子治療を通じて対処され得るいくつかの疾患の処置または予防が依然として必要とされている。かかる疾患には、TTR媒介性アミロイドーシス、A1AT欠損症、遺伝性血管性浮腫、家族性高コレステロール血症/スタチン耐性高コレステロール血症(Static resistant hypercholesterolemia)および高シュウ酸尿症(Hyperxoaluria)が含まれる。
要旨
本発明は、肝臓におけるPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/もしくはHAO1遺伝子の発現をモジュレートするための組成物および方法、ならびに/または肝臓細胞からの遺伝子産物の特異的阻害剤の発現後に血清におけるそれらの遺伝子産物の量および/もしくは活性をモジュレートするための組成物および方法を記載する。これらの遺伝子についての遺伝子発現のモジュレーションは、1つもしくは複数の操作されたヌクレアーゼを使用したPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/もしくはHAO1遺伝子の遺伝子改変(例えば、遺伝子ノックアウトを生じる、遺伝子に対する配列改変を生じる切断)を介して、ならびに/またはPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/もしくはHAO1遺伝子発現のモジュレーター(活性化因子または阻害剤)、例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/もしくはHAO1遺伝子の発現を調節する(オフにするもしくは下方調節する、またはオンにするもしくは上方調節する)転写因子の導入を介して達成され得る。遺伝子発現のモジュレーターは、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1およびHAO1遺伝子に対する直接的作用によって、ならびに/または間接的作用(例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/もしくはHAO1阻害剤の活性化)によって作用し得る。
本発明は、肝臓におけるPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/もしくはHAO1遺伝子の発現をモジュレートするための組成物および方法、ならびに/または肝臓細胞からの遺伝子産物の特異的阻害剤の発現後に血清におけるそれらの遺伝子産物の量および/もしくは活性をモジュレートするための組成物および方法を記載する。これらの遺伝子についての遺伝子発現のモジュレーションは、1つもしくは複数の操作されたヌクレアーゼを使用したPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/もしくはHAO1遺伝子の遺伝子改変(例えば、遺伝子ノックアウトを生じる、遺伝子に対する配列改変を生じる切断)を介して、ならびに/またはPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/もしくはHAO1遺伝子発現のモジュレーター(活性化因子または阻害剤)、例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/もしくはHAO1遺伝子の発現を調節する(オフにするもしくは下方調節する、またはオンにするもしくは上方調節する)転写因子の導入を介して達成され得る。遺伝子発現のモジュレーターは、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1およびHAO1遺伝子に対する直接的作用によって、ならびに/または間接的作用(例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/もしくはHAO1阻害剤の活性化)によって作用し得る。
さらに、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1ヌルの細胞、幹細胞、組織または生物全体を産生するために、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子を欠失(不活性化)または抑圧するための方法および組成物が、本明細書で提供される。PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子のモジュレーションは、例えば、染色体外で(エピソームで)発現され得るまたは肝臓細胞のゲノム中に(例えば、例えばアルブミン遺伝子座中へのヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みを介して)組み込まれ得る、阻害剤をコードする導入遺伝子の、肝臓細胞中への導入による、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子産物の阻害によっても達成され得る。一部の実施形態では、導入遺伝子は、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子産物を阻害することが可能な抗体またはポリペプチドをコードする。一部の態様では、阻害剤は、RNAiなどの阻害性核酸である。
従って、一態様では、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子の発現がモジュレートされた細胞が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、細胞は、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子をノックアウトするために1つまたは複数の操作されたヌクレアーゼを使用して、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1が(部分的にまたは完全に)不活性化された細胞など、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子のノックアウトを含む。他の実施形態では、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子の発現がモジュレートされるように操作された転写因子(TF)を含む細胞が記載される。一部の実施形態では、細胞は肝臓細胞である。PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子の発現が、(例えば、ヌクレアーゼ媒介性不活性化を介しておよび/または1つもしくは複数の操作されたTFを使用して)モジュレートされる細胞がさらに記載され、細胞は、少なくとも1つの外因性導入遺伝子、もしくは少なくとも1つの内因性遺伝子のさらなるノックアウト、またはそれらの組合せを含むように、さらに操作される。外因性導入遺伝子は、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1もしくはHAO1遺伝子中に組み込まれ得、および/またはセーフハーバー遺伝子座中に組み込まれ得る。一部の例では、外因性導入遺伝子は、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1阻害剤(例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/もしくはHAO1ポリペプチド阻害剤、例えば抗体、ならびに/またはPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/もしくはHAO1阻害剤RNA分子)をコードする。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される細胞は、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子配列に対する改変(例えば、欠失および/または挿入)を含み、改変は、選択された標的遺伝子内の配列に結合するヌクレアーゼを使用してなされる。ある特定の実施形態では、示された標的遺伝子の改変に使用されるヌクレアーゼのDNA結合ドメイン(例えば、ZFP、TALE、シングルガイドRNAなど)は、本明細書(例えば、表1、3、5、7、11、13、14および16)に示される、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21またはさらにはそれよりも多い塩基対の標的部位に結合する。ヌクレアーゼ標的部位は、連続または非連続配列であり得る。ある特定の実施形態では、対になったヌクレアーゼが使用される。本明細書に記載されるヌクレアーゼ媒介性改変は、切断および/または結合部位の部位の上流の、下流の、および/またはその部位の1つもしくは複数の塩基対を含む1~300塩基対(またはそれらの間の任意の塩基対数)以内の配列に対する改変;結合および/または切断部位を含むおよび/またはそれらのいずれかの側の1~100塩基対(またはそれらの間の任意の塩基対数)以内の改変;結合および/または切断部位を含むおよび/またはそれらのいずれかの側の1~50塩基対(またはそれらの間の任意の塩基対数)以内の改変;ならびに/あるいはヌクレアーゼ結合部位および/または切断部位内の1つまたは複数の塩基対に対する改変が含まれるがこれらに限定されない、ヌクレアーゼ結合および/もしくは切断部位内またはその近傍にある改変(挿入および/または欠失)を生じ得る。ある特定の実施形態では、改変は、本明細書(例えば、表1、3、5、7、11、13、14および16)に示される標的部位内、それらの間(例えば、対になった標的部位について)またはそれらの近傍(例えば、1~50ヌクレオチドまたはそれよりも多く(または任意の数のヌクレオチド))での、細胞のゲノムにおける改変が含まれるがこれらに限定されない、本明細書に示される標的部位内またはその近傍にある。
別の態様では、本明細書に記載される組成物(改変された細胞)および方法は、例えば、障害の処置および/または予防もしくは寛解において使用され得る。方法は、典型的には、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子が不活性化または下方モジュレートされるように、(a)ヌクレアーゼ(例えば、ZFNまたはTALEN)もしくはRNAガイドされるヌクレアーゼ系、例えば、操作されたcrRNA/tracr RNAを用いるCRISPR/Casを使用して、または操作された転写因子(例えば、ZFP-TF、TALE-TFまたはCas9-TF)を使用して、細胞(例えば、肝細胞)において内因性PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子を切断またはその発現を下方調節するステップを含み;それによって障害を処置または予防する。
肝臓特異的遺伝子(例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1)内の標的部位に結合するDNA結合ドメイン(例えば、ZFP、TALE、sgRNAなど)および機能的ドメイン(例えば、ヌクレアーゼの場合にはヌクレアーゼ/切断ドメイン、転写因子の場合には転写活性化または抑圧ドメイン)を含む人工ヌクレアーゼおよび/または転写因子もまた、本明細書に記載される。DNA結合ドメインは、標的配列内の任意の配列に結合して、遺伝子のモジュレーションをもたらし得る。ある特定の実施形態では、DNA結合ドメインは、添付の表に示される標的部位の12またはそれよりも多くの(12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22またはそれよりも多くの)ヌクレオチドの標的部位に結合する。結合したヌクレオチドは、連続または非連続であり得る。次いで、本明細書に記載される人工転写因子のDNA結合ドメインの、その標的部位への結合は、上方調節または下方調節を介して標的遺伝子の発現をモジュレートする。同様に、本明細書に記載される人工ヌクレアーゼのDNA結合ドメイン(例えば、切断/ヌクレアーゼドメインと会合したDNA結合ドメイン)の結合は、標的遺伝子中に破断(一本鎖または二本鎖)を引き起こし、これは、NHEJ媒介性修復(「インデル」として公知の挿入および/または欠失)、ドナーのNHEJ媒介性組み込み(例えば、末端捕捉を介した)および/または相同組換え修復(例えば、破断中への相同性アームを有するドナーの組み込み)を介した改変を生じる。切断および/または改変の部位は、ヌクレアーゼ標的部位の内部もしくはそれに隣接し得(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10またはそれよりも多くを含む、1~50ヌクレオチド)、または対になった標的部位間にあり得る。
ヌクレアーゼ、転写因子および/または導入遺伝子は、mRNAとして、タンパク質形態で、ならびに/またはヌクレアーゼ、TFおよび/もしくは導入遺伝子の1つもしくは複数の構成成分をコードするDNA配列として、導入され得る。一態様では、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALENおよび/またはCRISPR/Cas系が、本明細書で提供される。他の実施形態では、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子の発現をモジュレートするZFP-TF、TALE-TFおよびCas9-TFが、本明細書で提供される。ある特定の実施形態では、ZFP、TALE、またはCRISPR/Cas系のヌクレアーゼもしくは転写因子のシングルガイドRNA(sgRNA)は、ヒトPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子中の標的部位に結合する。ジンクフィンガータンパク質は、1、2、3、4、5、6つまたはそれよりも多くのジンクフィンガーを含み得、各ジンクフィンガーは、標的遺伝子中の標的下位部位と特異的に接触する認識ヘリックスを有する。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質は、4または5または6つのフィンガー(F1、F2、F3、F4、F5およびF6と称され、N末端からC末端へと、F1からF4またはF5またはF6へと順序付けられる)を含む。他の実施形態では、シングルガイドRNAは、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子中の標的部位に結合し得る。
本明細書に記載されるヌクレアーゼのいずれかは、切断ドメインおよび/または切断ハーフドメイン(例えば、野生型または操作されたFokI切断ハーフドメイン)をさらに含み得る。従って、本明細書に記載されるZFNおよび/またはTALENのいずれかでは、ヌクレアーゼドメインは、野生型ヌクレアーゼドメインまたはヌクレアーゼハーフドメイン(例えば、FokI切断ハーフドメイン)を含み得る。他の実施形態では、ZFNおよび/またはTALENは、操作されたヌクレアーゼドメインまたはハーフドメイン、例えば、偏性(obligate)ヘテロダイマーを形成する操作されたFokI切断ハーフドメインを含む。例えば、米国特許出願公開第20080131962号を参照のこと。一部の実施形態では、ZFNは、非特異的DNA相互作用を減少させるために、ZFP骨格に対する改変をさらに含み得る。さらなる実施形態では、操作されたZFN、TALENまたはdCas-FokI融合物中のFokIドメインは、FokIドメインとDNA分子との間の非特異的相互作用を破壊する変異を含む(米国特許出願第15/685,580号を参照のこと)。なおさらなる実施形態では、ZFN、TALENおよび/またはRNAガイドされるCRISPR/Cas系は、ニッカーゼとして作用する。一部の例では、二本鎖切断は、2対のニッカーゼを使用して達成される(例えば、米国特許第9,200,266号)。本明細書に記載される転写因子のいずれかは、転写活性化または抑圧ドメインをさらに含み得る。
別の態様では、1つまたは複数のタンパク質、ポリヌクレオチド、系および/またはベクターを本明細書に記載される細胞中に導入することによって、細胞においてPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子を不活性化する方法が、本明細書に記載される。本明細書に記載される方法のいずれかでは、ヌクレアーゼは、標的化変異誘発、細胞DNA配列の欠失を誘導、および/または所定の染色体遺伝子座における標的化組換えを促進し得る。従って、ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、標的遺伝子の1つまたは複数のヌクレオチドを欠失または挿入する。一部の実施形態では、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子は、ヌクレアーゼ切断とその後の非相同末端接合とによって不活性化される。他の実施形態では、標的遺伝子中のゲノム配列は、例えば、本明細書に記載されるヌクレアーゼ(または前記ヌクレアーゼをコードするベクター)、およびヌクレアーゼによる標的化切断後に遺伝子中に挿入される「ドナー」配列を使用して、置き換えられる。ドナー配列は、ヌクレアーゼベクター中に存在、別々のベクター(例えば、AAV、AdまたはLVベクター)中に存在し得、あるいは、異なる核酸送達機構を使用して細胞中に導入され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1モジュレーション(例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1もしくはHAO1標的化ヌクレアーゼおよび/または転写因子を介した下方調節)を含む細胞は、(切断されたPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1もしくはHAO1、または他の遺伝子、例えば、セーフハーバー遺伝子もしくは遺伝子座中に)1つまたは複数のさらなるゲノム改変、例えば、組み込まれた外因性配列をさらに含む。外因性配列は、ベクター(例えば、Ad、AAV、LV)を介して、またはエレクトロポレーションなどの技術を使用することによって、導入され得る。さらなる実施形態では、さらなる改変は、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1の野生型cDNAコピーを、細胞中の内因性変異体コピーが本明細書に記載される方法のいずれかによってノックアウトされている細胞中に導入することを含む。一部の態様では、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1の野生型cDNAコピーは、cDNAが標的化ヌクレアーゼによる切断に供されないように、サイレントな遺伝子改変を含み得る。一部の実施形態では、cDNAコピーは、ゲノム中に組み込まれるが、他の実施形態では、cDNAコピーは、染色体外で維持される。
一部の態様では、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1がモジュレートされた細胞は、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1活性を阻害する外因性導入遺伝子をコードする遺伝子をさらに含む。他の態様では、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子改変を欠如するが、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1阻害活性をコードする導入遺伝子の発現のための構築物を含む細胞が、本明細書に記載される。一部の実施形態では、阻害性導入遺伝子は、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1によってコードされるタンパク質を阻害する抗体をコードする。他の実施形態では、阻害性導入遺伝子は、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1発現を阻害する阻害性核酸(例えば、RNAi、shRNA)をコードする。一部の実施形態では、阻害性RNAは二本鎖RNAである(米国特許第9,249,415号)。これらの細胞の子孫である細胞(例えば、本明細書に記載されるように改変された細胞の子孫である遺伝子改変された細胞)を含む、本明細書に記載される方法によって産生される細胞もまた記載される。ある特定の実施形態では、遺伝子改変は、本明細書に開示される標的部位内のおよび/または本明細書に記載される対になった標的部位間の挿入および/または欠失が含まれるがこれらに限定されない、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子内の1つまたは複数の挿入および/または欠失を含む。
一態様では、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子発現の1つまたは複数のモジュレーター(例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1に標的化される操作されたヌクレアーゼおよび/または操作された転写因子)をコードする導入遺伝子をコードする配列を含むポリヌクレオチド発現構築物が、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド発現構築物は、エンハンサー配列(例えば、野生型または変異型Serpin1エンハンサー)、プロモーター配列(例えば、トランスサイレチンミニマルプロモーター(TTRm)プロモーター)および導入遺伝子、ならびに任意選択で、ポリアデニル化配列(例えば、合成ポリアデニル化配列(SPA)および/またはシグナルペプチド(SP))をさらに含む(米国特許出願公開第2017-0119906号A1を参照のこと)。ある特定の実施形態では、発現構築物は、イントロン配列(例えば、野生型MVMもしくは変異型MVM配列および/またはキメライントロン)をさらに含む。ある特定の実施形態では、発現構築物は、5’から3’の配向で、エンハンサー配列、プロモーター配列、イントロン配列、導入遺伝子(任意選択でシグナルペプチドを含む)およびポリアデニル化シグナルを含む。
本明細書に記載される遺伝子モジュレーターをコードする発現カセットは、プラスミドベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよびアデノ随伴ベクター(AAV)が含まれるがこれらに限定されない、任意のウイルスまたは非ウイルスベクター中に含まれ得る。好ましい実施形態では、発現構築物は、AAV構築物上にある、本明細書に記載される発現構築物に隣接する5’および3’ITRをさらに含む。任意選択で、スペーサー分子もまた、発現構築物の1つまたは複数の構成成分間、例えば、5’ITRとエンハンサーとの間および/またはポリアデニル化シグナルと3’ITRとの間に含まれる。
一部の実施形態では、1つまたは複数の導入遺伝子には、遺伝子モジュレーター、例えば、操作されたヌクレアーゼ(例えば、ZFN、TALEN、TtAgoおよびCRISPR/Cas系)をコードする配列が含まれる。他の実施形態では、遺伝子をモジュレートする導入遺伝子には、操作された転写因子(例えば、ZFP-TF、TALE-TF、CRISPR/Cas-TF系)をコードする配列が含まれる。ある特定の実施形態では、遺伝子モジュレーター(例えば、ヌクレアーゼおよび/または転写因子)は、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1に標的化される。
ある特定の態様では、本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子をモジュレートする導入遺伝子の発現を駆動しつつ、それらがエピソームで維持されるように、細胞中に導入される。他の態様では、発現構築物は、それらが導入される細胞のゲノム中にランダムに組み込まれる。さらなる態様では、導入遺伝子発現を駆動する発現構築物は、ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みによってゲノム中に組み込まれる。
なおさらなる態様では、本明細書に開示される遺伝子モジュレーター(ポリヌクレオチドおよび/またはタンパク質)のいずれかを含む細胞、ならびに本明細書に記載される遺伝子モジュレーターによってなされた任意の遺伝子改変を含む細胞が、本明細書に記載される。これらの細胞の子孫である細胞、例えば、細胞が遺伝子モジュレーターをもはや含まない、本明細書に記載される遺伝子改変された細胞の子孫である細胞(幹細胞または前駆細胞から分化した細胞が含まれるがそれらに限定されない)もまた提供される。単離された細胞は、対象中に導入され得(ex vivo細胞治療)、または本明細書に記載される細胞(例えば、遺伝子改変された細胞)は、それが対象の一部である場合、改変され得る(in vivo)。
さらなる態様では、肝臓細胞において1つまたは複数の導入遺伝子(PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1のモジュレーター)を発現させるための方法であって、導入遺伝子が細胞において発現されるように、本明細書に記載される1つまたは複数の発現構築物を細胞中に導入するステップを含む、方法が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、この発現構築物は、ウイルスまたは非ウイルスベクター、好ましくはAAVベクター(例えば、AAV2、AAV6、AAV8、AAV2/6またはAAV2/8)上にある。
別の態様では、生きた動物において1つまたは複数の導入遺伝子(PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1のモジュレーター)を発現させる方法であって、生きた動物に、本明細書に記載される1つまたは複数の発現カセットを投与するステップを含む、方法が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、発現カセットは、生きた動物の肝臓に投与される。ある特定の実施形態では、発現構築物は、ウイルスまたは非ウイルスベクター、好ましくはAAVベクター(例えば、AAV2またはAAV2/6)上にある。一部の実施形態では、発現構築物は、末梢静脈を介して全身(例えば、静脈内)投与される。
別の態様では、本明細書に記載される細胞、発現構築物、転写因子および/またはヌクレアーゼの1つまたは複数を含む医薬組成物が提供される。
ある特定の態様では、肝臓特異的発現カセットの標的化組み込みのための組成物、方法および系が、本明細書に記載される。方法および系は、細胞に、本明細書に記載される1つまたは複数の発現カセットを投与するステップ、および標的遺伝子(例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/もしくはHAO1ならびに/またはセーフハーバー遺伝子)に対して特異的な1つまたは複数のヌクレアーゼを投与するステップを含む。標的遺伝子のヌクレアーゼ媒介性切断後に、発現カセットは、相同性依存的または相同性非依存的機構を介して遺伝子中に組み込まれる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子は内因性アルブミン遺伝子である。
本発明の発現構築物のヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みのために、ヌクレアーゼによって切断された領域(遺伝子)中に発現構築物が組み込まれるように、1つまたは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、TALEN、CRISPR/Casヌクレアーゼおよび/またはTtAgoヌクレアーゼが含まれるがこれらに限定されない任意のヌクレアーゼが使用され得る。ある特定の実施形態では、1つまたは複数の対のヌクレアーゼが用いられる。ヌクレアーゼは、mRNAの形態で導入され得る、または非ウイルスもしくはウイルスベクターを使用して細胞に投与され得る。一部の態様では、ヌクレアーゼポリヌクレオチドは、レンチウイルスによって、または非組み込みレンチウイルスによって、送達され得る。他の態様では、発現カセットは、AAVおよび/またはDNAオリゴによって送達され得る。
さらなる態様では、障害を処置するための治療的タンパク質を提供するための方法および組成物であって、治療的タンパク質が単鎖抗体である、方法および組成物が本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、方法は、それを必要とする対象の肝臓に、本明細書に記載される発現カセット(例えば、AAVベクター)を投与するステップを含む。他の実施形態では、方法は、対象に、改変された細胞(対象において異常に発現されるタンパク質の機能的バージョンを、記載される発現カセットから発現させる)を投与するステップを含む。
記載される組成物および方法のいずれかでは、発現カセットおよび/またはヌクレアーゼは、AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9およびAAVrh10、または偽型AAV、例えば、AAV2/8、AAV8.2、AAV2/5およびAAV2/6などが含まれるがこれらに限定されないAAVベクター上にあってもよい。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチド(発現構築物および/またはヌクレアーゼ)は、同じAAVベクター型を使用して送達される。他の実施形態では、ポリヌクレオチドは、異なるAAVベクター型を使用して送達される。ポリヌクレオチドは、1つまたは複数のベクターを使用して送達され得る。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、インタクトな動物の肝臓中に、静脈内(例えば、門静脈内または末梢静脈内)投与を介して送達される。
本明細書に記載される組成物および方法は、例えば、TTR媒介性アミロイドーシス、A1AT欠損症、遺伝性血管性浮腫、家族性高コレステロール血症/スタチン耐性高コレステロール血症および高シュウ酸尿症を含む障害を処置または予防するために使用され得る。
本明細書に記載される方法は、in vitro、ex vivoまたはin vivoで実施され得る。ある特定の実施形態では、組成物は、生きたインタクトな哺乳動物中に導入される。哺乳動物は、送達の時点で、任意の発生段階、例えば胚、胎仔、新生仔、乳仔、若年、または成体であり得る。さらに、標的化される細胞は、健康または病的であり得る。ある特定の実施形態では、組成物の1つまたは複数は、静脈内(例えば、門静脈内を介して肝臓に、例えば、尾静脈注射、または末梢静脈を介して全身的に)、動脈内に、腹腔内に、筋肉内に、肝臓実質中に(例えば、注射を介して)、肝動脈中に(例えば、注射を介して)、および/または胆樹を介して(例えば、注射を介して)送達される。
特定の型の細胞、例えば、血小板、線維芽細胞、肝細胞などに組成物を標的化するために、投与される組成物の1つまたは複数は、細胞の表面受容体に特異的に結合するホーミング剤と会合し得る。例えば、ベクターは、ある特定の肝系細胞が受容体を有するリガンド(例えば、ガラクトース)にコンジュゲートされ得る。コンジュゲーションは、共有結合、例えば、グルタルアルデヒドなどの架橋剤、または非共有結合、例えば、アビジン化リガンドのビオチン化ベクターへの結合であり得る。別の形態の共有結合コンジュゲーションは、ベクターストックを調製するために使用されるAAVヘルパープラスミドを操作することによって提供され、その結果、リガンドがウイルス粒子の表面上に曝露されるように、コードされるコートタンパク質の1つまたは複数は、ネイティブAAVコートタンパク質とペプチドまたはタンパク質リガンドとのハイブリッドである。
本明細書に記載される細胞および/または発現構築物を含むキットもまた提供される。キットは、ヌクレアーゼをコードする核酸(例えば、ZFN、TALENまたはCasおよび改変されたCasタンパク質をコードするRNA分子、ならびにガイドRNA)、転写因子、またはヌクレアーゼのアリコート、転写因子、細胞、本発明の方法を実施するための指示書などをさらに含み得る。
これらおよび他の態様は、全体としての本開示に照らして、当業者に容易に明らかとなる。
詳細な説明
特に肝臓細胞における、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子の発現をモジュレートする方法および組成物、ならびにPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1阻害性導入遺伝子の産生のためのカセットが、本明細書に開示される。PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1発現のモジュレーションは、遺伝子をノックアウトするための標的化ヌクレアーゼ(ZFN、TALEN、Ttago、CRISPR/Cas)、および/または内因性PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1もしくはHAO1発現を阻害するための転写因子(ZFP-TF、TALE-TF、RNAガイドされるCas-TF)の使用によって達成され得る。遺伝子モジュレーター(ポリヌクレオチドおよび/またはタンパク質)を含むおよび/または遺伝子モジュレーターによってなされた遺伝子改変を含む(が、遺伝子モジュレーター自体は含まない)細胞、ならびにこれらの細胞の子孫である細胞もまた提供される。本発明の方法および組成物は、肝臓特異的発現構築物を介して、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1阻害性導入遺伝子を発現させるために使用され得る。本明細書に記載される組成物(遺伝子モジュレーターを含む構築物、タンパク質、および/または細胞)は、in vivoまたはin vitroで肝臓細胞に任意の導入遺伝子を送達し得、in vivoおよび/またはex vivo治療を介した1つまたは複数の導入遺伝子の提供によって寛解され得る任意の疾患または障害の処置および/または予防のために使用され得る。
特に肝臓細胞における、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子の発現をモジュレートする方法および組成物、ならびにPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1阻害性導入遺伝子の産生のためのカセットが、本明細書に開示される。PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1発現のモジュレーションは、遺伝子をノックアウトするための標的化ヌクレアーゼ(ZFN、TALEN、Ttago、CRISPR/Cas)、および/または内因性PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1もしくはHAO1発現を阻害するための転写因子(ZFP-TF、TALE-TF、RNAガイドされるCas-TF)の使用によって達成され得る。遺伝子モジュレーター(ポリヌクレオチドおよび/またはタンパク質)を含むおよび/または遺伝子モジュレーターによってなされた遺伝子改変を含む(が、遺伝子モジュレーター自体は含まない)細胞、ならびにこれらの細胞の子孫である細胞もまた提供される。本発明の方法および組成物は、肝臓特異的発現構築物を介して、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1阻害性導入遺伝子を発現させるために使用され得る。本明細書に記載される組成物(遺伝子モジュレーターを含む構築物、タンパク質、および/または細胞)は、in vivoまたはin vitroで肝臓細胞に任意の導入遺伝子を送達し得、in vivoおよび/またはex vivo治療を介した1つまたは複数の導入遺伝子の提供によって寛解され得る任意の疾患または障害の処置および/または予防のために使用され得る。
例えば、発現が変更されるように、DNA結合ドメイン(内因性遺伝子中の標的部位に結合する)および切断ドメインを含む少なくとも1つの人工ヌクレアーゼを使用して、またはDNA結合ドメイン(内因性遺伝子中の標的部位に結合する)および転写調節ドメイン(活性化因子またはリプレッサー)を含む人工転写因子(リプレッサーまたは活性化因子)を使用して遺伝子を切断することによって、内因性PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子の発現が野生型と比較して変更された肝臓細胞が、本明細書で提供される。標的部位は、添付の表(例えば、表1、3、5、7、11、13、14および16)のいずれかの標的部位に示される少なくとも12の(例えば、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22またはそれよりも多くの)連続または非連続ヌクレオチドを含み得る。外因性配列(例えば、導入遺伝子;遺伝子中に変異を導入する配列または内因性遺伝子中の変異を修正する配列)が、切断後に内因性遺伝子中に組み込まれ得、ならびに/または1つもしくは複数のヌクレオチドが、切断後に挿入および/もしくは欠失され得る。内因性PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子中の標的部位に結合するDNA結合ドメイン(例えば、ジンクフィンガータンパク質、TALエフェクタードメインタンパク質またはシングルガイドRNA(sgRNA))および機能的ドメイン(例えば、切断ドメイン、転写活性化ドメインまたは転写抑圧ドメイン)を含む融合分子、ならびにこれらの融合分子をコードするポリヌクレオチド(例えば、mRNA、ウイルスまたは非ウイルスベクターなど)もまた提供される。また、本明細書に記載される細胞、融合分子および/またはポリヌクレオチドを含む医薬組成物も提供され、内因性遺伝子発現の変更、ならびに/またはTTR媒介性アミロイドーシス、A1AT欠損症、遺伝性血管性浮腫、家族性高コレステロール血症/スタチン耐性高コレステロール血症および高シュウ酸尿症などの障害の処置(必要とする対象へのその投与を介して)のための、細胞、融合分子および/または医薬組成物を作製および使用する方法も同様に提供される。
遺伝性血管性浮腫(HAE)は、50,000人に1人が罹患する常染色体優性疾患であり、C1阻害剤の減少したレベルの結果である。患者は、身体の任意の部分における腫脹の再発性のエピソードを経験し、中咽頭、喉頭または腹部に局在化した腫脹は、罹患率および死亡の最も高いリスクを有する(TseおよびZuraw(2013年)Clev Clin J of Med 80巻(5号):297頁を参照のこと)。疾患は、ブラジキニンの過剰産生の結果としての、組織中への血漿の血管外漏出から生じる。機構には、活性な血漿カリクレイン(これは、より多くの第XII因子を活性化する)を放出する、活性化第XII因子によるプレカリクレイン(PKK、KLK3、PKKD、フレッチャー因子およびキニノゲニン(Kininogenin)としても公知)の切断が関与すると思われる。次いで、血漿カリクレインはキニノーゲンを切断し、ブラジキニンを放出する。次いで、ブラジキニンは、内皮細胞上のB2ブラジキニン受容体に結合し、内皮の透過性を増加させる。通常、C1阻害剤(SERPING1によってコードされる)は、血漿カリクレインの阻害および第XII因子の活性化によってブラジキニン産生を制御する。HAEは3つの型で存在し、I型およびII型は、存在するC1阻害剤の量および型によって識別され、III型は、第XII因子中のThr309Lys変異と関係する(Prietoら(2009年)Allergy 64巻(2号):284頁)。I型HAEは、作製されるC1阻害剤タンパク質の不十分な発現およびその少量の破壊の結果であると思われる、低レベルのC1阻害剤を有する。1型は、HAE患者のおよそ85%を占める。II型患者は、正常レベルのC1阻害剤を有するが、C1阻害剤タンパク質は、変異に起因して無効である(TseおよびZuraw、同書)。小さいおよび大きい挿入および欠失ならびに重複を含む、I型HAEをもたらすSERPING1中の250よりも多い変異が特徴付けられている(Rijavecら(2013年)PLoS One 8巻(2号):e56712頁)。HAEの遺伝的基礎におけるこの高い可変性に起因して、本発明の方法および組成物は、HAEの顕在化における下流のプレイヤーを標的化することによって、HAEを予防または処置するために使用され得る。例えば、プレカリクレイン(PKKと略称する)発現における減少をもたらすためにプレカリクレイン(KLKB1、肝細胞において発現される)をコードする遺伝子を標的化することは、HAEを引き起こしている上流の変異の型に関係なくブラジキニン産生における減少を生じ、従って、血漿血管外漏出における減少を生じ得る。従って、本発明の方法および組成物は、HAEを予防または処置するためにKLKB1の発現における減少を引き起こすために使用され得る。操作されたヌクレアーゼは、肝細胞のサブセットにおいてKLKB1をノックアウトするために使用されて、ブラジキニン産生を低減させ得、および/または操作された転写因子は、KLKB1発現を下方調節するために使用され得る。
PCSK9は、コレステロール恒常性において主要な調節的役割を果たすタンパク質をコードする遺伝子(FH3;HCHOLA3;LDLCQ1;NARC-1;NARC1;PC9としても公知)である。PCSK9タンパク質は、LDLRの上皮増殖因子様リピートA(EGF-A)ドメインに結合し、LDLR分解を誘導する。PCSK9における常染色体優性の毒性機能獲得型変異(例えば、S127R、P216L、D374YおよびN157K)が記載されており、血漿LDLコレステロールにおける対応する増加をもたらすLDLR分解の増加した速度の結果としての高脂血症および家族性高コレステロール血症(FH)と関連する(Abifadelら(2003年)Nat Gen 34巻(2号):154頁)。さらに、冠動脈心疾患の発生率における88%の低減をもたらす、血漿LDLコレステロールの量における関連する実質的な減少を伴う、肝LDLRレベルにおける増加を引き起こす機能喪失型PCSK9変異(例えば、Y142X、C679XおよびR46L)が同定されている(Cohenら(2003年)New Eng J Med 354巻(12号):1264頁)。従って、本発明の方法および組成物は、高脂血症および/またはFHを処置または予防するために使用され得る。操作されたヌクレアーゼは、毒性機能獲得型と関連する変異を含むPCSK9遺伝子をノックアウトするために設計され得る。さらに、野生型PCSK9遺伝子は、LDLRまたはAPOBなどの他の遺伝子における変異によって引き起こされるFHを処置するために、肝臓中のいくつかの細胞においてノックアウトされ得る。あるいは、操作された転写因子が、変異体または野生型PCSK9遺伝子からの発現を抑圧するために使用され得る。
トランスサイレチンアミロイドーシス(TTRA)は、ミスフォールディングおよび凝集されたタンパク質(アミロイド)に関連すると疑われるいくつかの変性疾患の1つである。トランスサイレチン(TTR、CTS;CTS1;HEL111;HsT2651;PALB;TBPAとしても公知)は、肝臓において産生されるテトラマーであり、血流中に分泌され、ホロ-レチナール結合タンパク質を輸送するように機能する。しかし、コンフォメーション変化により、これはアミロイド形成性になる。部分的アンフォールディングは、最終的にクロス-βシートアミロイド構造になる前に、ほとんどが構造不定の球状凝集体へと効率的にミスアセンブルする伸展したコンフォメーションの疎水性残基のストレッチを曝露させる(Johnsonら(2012年)J Mol Biol 421巻(2~3号):183頁を参照のこと)。TTRAは、家族性アミロイド多発ニューロパチー(FAP)および家族性アミロイド心筋症(FAC)を含む孤発性および常染色体優性遺伝性形態の両方で、患者において生じ得る。これらの遺伝性形態は通常、早期発症型であり、TTR遺伝子において記載された100を超える点変異と関連する。一般に、変異があるタンパク質が不安定化するほど、ある程度のアミロイド病理を有する可能性が高くなる。形成されたアミロイドは、FACでは心組織の、またはFAPでは末梢および中枢神経組織の選択的破壊を引き起こす。これらの疾患を処置するための一部の新たな治療戦略、例えば阻害性RNA戦略は、タンパク質の凝集能を減少させるためにTTRの量を減少させる試みに重点を置いている(Johnsonら、同書)。従って、本発明の方法および組成物は、病理学的形態のTTRタンパク質の量を低減させるためおよび/またはTTR濃度を概して減少させるための努力において、特異的TTR変異体を標的化するおよび/または野生型TTRを標的化するために使用され得る。操作されたヌクレアーゼは、肝細胞のサブセットにおいてTTRをノックアウトするために使用され得、および/またはTTRに対して特異的な操作された転写因子もまた、その発現を下方調節するために使用され得る。
アルファ-1-アンチトリプシン(A1AT)欠損症は、ヨーロッパ系の1500~3000人に約1人において生じるが、アジア人家系の個体では稀である。アルファ-1-アンチトリプシンタンパク質は、SERPINA1遺伝子によってコードされるプロテアーゼ阻害剤であり、好中球エラスターゼ、トリプシン、メタロプロテイナーゼ9(MMP-9)、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)およびプロテイナーゼ-3(PR-3)を含む、炎症細胞によって放出されるプロテアーゼの活性から細胞を保護するように機能する。欠損症は、ヘテロ接合性個体において変異体SERPINA1遺伝子によって引き起こされる常染色体共優性または劣性の障害であり、変異体対立遺伝子からの低減された発現、または不十分な阻害活性を有する変異体A1ATタンパク質の発現は、好中球エラスターゼの阻害の慢性的欠如をもたらし、組織損傷を生じる。最も一般的なSERPINA1変異は、患者肝細胞の小胞体において秩序のあるポリマーをタンパク質に形成させる、Glu342Lys置換(Z対立遺伝子とも呼ばれる)を含む。これらを含むことは、肝臓移植によってしか処置できない肝硬変を最終的に引き起こす(Yusaら(2011年)Nature 478巻、391頁)。肝細胞内での重合は、血漿A1ATレベルにおける重度の減少を生じ、この炎症性疾患の増加したリスクをもたらす。さらに、A1AT欠損症は、慢性閉塞性肺疾患(COPD)、肺気腫および慢性気管支炎を含む肺疾患と関連し(Tuderら(2010年)Proc Am Thorac Soc 7巻(6号):381頁)、潜在的に、1型および2型糖尿病、急性心筋梗塞、関節リウマチ、炎症性腸疾患、嚢胞性線維症、移植片拒絶、移植片対宿主病および多発性硬化症を含む他の疾患の進行の阻害への、はるかに広い範囲を有し得る(Lewis(2012年)Mol Med 18巻(1号)957頁)。乳児期および幼児期発症型肝臓疾患では、疾患の病理は、新生児黄疸および胆汁うっ滞として現れ、進行した線維症または硬変への進行が後に続き得る。成人では、肝臓疾患は、患者が50歳代のときに典型的には診断される緩徐に進行性の線維症として顕在化し、これらの患者は、硬変および肝細胞癌の増加したリスクを有する(Guoら(2014年)J Clin Invest 124巻(1号):251頁)。集団研究は、これらの疾患を回避するために、およそ0.5mg/mLの最小A1AT血漿閾値(正常血漿レベルは、非炎症状態でおよそ0.9~1.75mg/MLである)を提唱しており、現行の治療は、気管支拡張薬などの使用によって、症状を低減させるように主に作用するが、A1AT(Zemaira(登録商標)、Prolastin)の毎週の注入の使用もまた、血漿A1ATの実証された重度の欠如を有する肺気腫患者のための選択肢である(Koepkeら(2015年)PLoS One 10巻(1号):e0117497頁)。A1ATと関連する重症肺疾患もまた、最終的に移植によって処置される。A1AT欠損症の処置についての臨床試験には、少しだけ挙げると、濃縮されたA1ATタンパク質の送達、IM注射によるA1AT遺伝子を含むAAV構築物の使用、およびHIVにおけるA1ATの使用を含む、種々のアプローチが含まれる。従って、本発明の組成物および方法は、A1AT欠損症と関連する疾患を処置または予防するために使用され得る。変異体A1AT対立遺伝子(例えば、Z対立遺伝子)に対して特異的な本明細書に記載される転写因子および系は、遺伝子をサイレンシングして発現を防止し、それによって、硬変をもたらし得る肝凝集体を排除するために作製され得る。さらに、野生型SERPINA1遺伝子は、発現のために細胞のゲノム中に導入され得、細胞外発現のために非組み込みベクター系(例えば、野生型遺伝子のcDNAコピーを有する)を介して導入され得、または増加した肝分泌のためにin vivoでアルブミン遺伝子座中に導入され得るが、特異的SERPINA1ヌクレアーゼは、内因性変異体SERPINA1対立遺伝子(例えば、Z点変異を含む遺伝子)をノックアウトするために導入される。一部の実施形態では、Z点変異は、点変異が修正されるように、修正性オリゴヌクレオチドまたは部分的cDNAのヌクレアーゼ駆動性挿入によって修正される。
新生児100,000人あたり0.11~0.26人で生じる遺伝性の稀な常染色体劣性障害である原発性高シュウ酸尿症1型(PH1)は、グリオキシル酸代謝の疾患であり、酵素アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ(AGT、Siegalら(2011年)Int J Organ Transpl Med)における変異から生じる。この酵素において生じた欠損は、腎臓および多くの他の組織におけるシュウ酸カルシウム結晶形成および沈着を生じる異常に高いシュウ酸産生をもたらし、全身性シュウ酸症および末期腎疾患(ESRD)は、一般的な転帰である。通常、細胞では、細胞質中に存在するグリオキシル酸は、酵素グリオキシル酸レダクターゼによってグリコール酸に変換され、グリコール酸は、ペルオキシソーム中に取り込まれ、AGTによってグリシンに変換され得る。ACTが不足している場合、蓄積するグリオキシル酸は、肝臓特異的酵素グリコール酸オキシダーゼまたはヒドロキシ酸オキシダーゼ-1(HAO1;HAO1X1、GOX1、GOおよびGOXとしても公知)によって、シュウ酸に変換される。シュウ酸のこの増加した蓄積は、シュウ酸による尿の過飽和をもたらし、次いで、シュウ酸尿路結石症、腎石灰化症、腎尿細管損傷、腎不全およびさらには死亡をもたらす。高シュウ酸尿症におけるESRDは、皮膚、骨髄、骨(再発性の骨折を引き起こす)、心筋、神経系、骨格筋、血管および網膜におけるシュウ酸カルシウム沈着を伴う。処置は、腎臓損傷の前に小児期に開始するのが最もよく、食餌の配慮(ビタミンCおよび高シュウ酸食を回避する)および毎日の透析を含み得る。残念ながら、透析は、シュウ酸負荷を顕著に低減させることができる場合が多い。肝臓移植が実施され得るが、拒絶を回避するために必要な治療薬は、PH1と関連する腎臓障害を悪化させ得る。1つの研究(Nolkemperら(2000年)Pediatr Transplant 4巻(3号):177~81頁)では、患者が10歳で肝臓移植を受けた場合、82%の生存があったが、20歳で移植を実施した場合には、生存は72%に低下した。対照的に、肝腎移植を実施した場合、5歳で移植を実施した場合には、80%の患者生存率があったが、20歳で実施した場合には、これはわずか66%に低減した(EytanおよびWeismann(2009年)Pediatr Transplant 13巻(7号):805~807頁)。GO特異的siRNAの注射は、GOの発現を減少させ、マウス疾患モデルにおいて尿中シュウ酸排泄を低減させたので、RNAiアプローチは、いくらかの助けになり得る(Liら(2016年)Biochim Biophys Acta 1862巻(2号):233~239頁)。
一般
本明細書に開示される方法の実施、ならびに組成物の調製および使用は、特に示さない限り、当業者の技術範囲内の、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えDNAならびに関連分野における従来技術を用いる。これらの技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Sambrookら MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年および第3版、2001年;Ausubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、John Wiley & Sons、New York、1987年および定期的更新;シリーズMETHODS IN ENZYMOLOGY、Academic Press、San Diego;Wolffe、CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION、第3版、Academic Press、San Diego、1998年;METHODS IN ENZYMOLOGY、第304巻、「Chromatin」(P.M. WassarmanおよびA. P. Wolffe編)、Academic Press、San Diego、1999年;ならびにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY、第119巻、「Chromatin Protocols」(P.B. Becker編)Humana Press、Totowa、1999年を参照のこと。
本明細書に開示される方法の実施、ならびに組成物の調製および使用は、特に示さない限り、当業者の技術範囲内の、分子生物学、生化学、クロマチン構造および分析、計算化学、細胞培養、組換えDNAならびに関連分野における従来技術を用いる。これらの技術は、文献中に完全に説明されている。例えば、Sambrookら MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989年および第3版、2001年;Ausubelら、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、John Wiley & Sons、New York、1987年および定期的更新;シリーズMETHODS IN ENZYMOLOGY、Academic Press、San Diego;Wolffe、CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION、第3版、Academic Press、San Diego、1998年;METHODS IN ENZYMOLOGY、第304巻、「Chromatin」(P.M. WassarmanおよびA. P. Wolffe編)、Academic Press、San Diego、1999年;ならびにMETHODS IN MOLECULAR BIOLOGY、第119巻、「Chromatin Protocols」(P.B. Becker編)Humana Press、Totowa、1999年を参照のこと。
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、相互交換可能に使用され、直鎖または環状コンフォメーションの、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関しての限定として解釈すべきではない。用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および/またはリン酸部分(例えば、ホスホロチオエート骨格)において改変されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対合特異性を有する;即ち、AのアナログはTと塩基対合する。
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、相互交換可能に使用され、直鎖または環状コンフォメーションの、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態の、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、ポリマーの長さに関しての限定として解釈すべきではない。用語は、天然ヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および/またはリン酸部分(例えば、ホスホロチオエート骨格)において改変されたヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対合特異性を有する;即ち、AのアナログはTと塩基対合する。
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、相互交換可能に使用される。用語は、1つまたは複数のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログまたは改変された誘導体である、アミノ酸ポリマーにも当てはまる。
「組換え」とは、非相同末端結合(NHEJ)および相同組換えによる捕捉が含まれるがこれらに限定されない、2つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え(HR)」とは、例えば、相同組換え修復機構を介した細胞における二本鎖破断の修復の間に起こるかかる交換の特殊な形態を指す。
本開示のある特定の方法では、本明細書に記載される1つまたは複数の標的化ヌクレアーゼは、所定の部位(例えば、PCSK9遺伝子)において標的配列(例えば、細胞クロマチン)中に二本鎖破断(DSB)を創出する。DSBは、本明細書に記載される構築物の組み込みを媒介する。任意選択で、構築物は、破断の領域中のヌクレオチド配列に対する相同性を有する。発現構築物は、物理的に組み込まれ得、あるいは、発現カセットは、相同組換えを介した破断の修復のための鋳型として使用されて、細胞クロマチン中への、発現カセット中と同様のヌクレオチド配列の全てまたは一部の導入を生じる。従って、細胞クロマチン中の第1の配列は変更され得、ある特定の実施形態では、発現カセット中に存在する配列へと変換され得る。従って、用語「置き換える」または「置き換え」の使用は、別のヌクレオチド配列による1つのヌクレオチド配列の置き換え(即ち、情報的な意味での配列の置き換え)を示すと理解され得、別のポリヌクレオチドによる1つのポリヌクレオチドの物理的または化学的置き換えを必ずしも要求しない。
本明細書に記載される方法のいずれかでは、外因性ヌクレオチド配列(「発現構築物」または「発現カセット」または「ベクター」)は、目的の領域中のゲノム配列に対して相同であるが同一ではない配列を含有し得、それによって、目的の領域において非同一配列を挿入するように相同組換えを刺激する。従って、ある特定の実施形態では、目的の領域中の配列に対して相同な発現カセット配列の部分は、置き換えられるゲノム配列に対して約80~99%の間(またはそれらの間の任意の整数)の配列同一性を示す。他の実施形態では、発現カセットとゲノム配列との間の相同性は、例えば、100を超える連続塩基対の、発現カセットの相同性領域とゲノム配列の相同性領域との間で1ヌクレオチドのみが異なる場合、99%よりも高い。ある特定の場合では、発現カセットの非相同部分は、新たな配列が目的の領域中に導入されるように、目的の領域中に存在しない配列を含有し得る。これらの例では、非相同配列には一般に、目的の領域中の配列に対して相同または同一である、50~1,000塩基対(またはそれらの間の任意の整数値)の、または1,000よりも多い任意の数の塩基対の配列が隣接する。
用語「配列」とは、DNAまたはRNAであり得、直鎖、環状または分岐鎖であり得、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得る、任意の長さのヌクレオチド配列を指す。用語「導入遺伝子」とは、ゲノム中に挿入されるヌクレオチド配列を指す。導入遺伝子は、任意の長さ、例えば、2~100,000,000ヌクレオチド長の間(またはそれらの間もしくはそれを上回る任意の整数値)、好ましくは約100~100,000ヌクレオチド長の間(またはそれらの間の任意の整数)、より好ましくは約2000~20,000ヌクレオチド長の間(またはそれらの間の任意の値)、さらにより好ましくは約5~15kbの間(またはそれらの間の任意の値)のものであり得る。
「染色体」は、細胞のゲノムの全てまたは一部分を構成するクロマチン複合体である。細胞のゲノムは、細胞のゲノムを構成する全ての染色体の収集であるその核型によって特徴付けられる場合が多い。細胞のゲノムは、1つまたは複数の染色体を含み得る。
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主にDNA、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核生物の細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンH2A、H2B、H3およびH4を2つずつ含むオクタマーと会合したおよそ150塩基対のDNAを含む;リンカーDNA(生物に依存して可変長のもの)がヌクレオソームコア間に伸びる。ヒストンH1の分子は一般に、リンカーDNAと会合する。本開示の目的のために、用語「クロマチン」とは、原核生物および真核生物の両方の、全ての型の細胞核タンパク質を包含することを意味する。細胞クロマチンには、染色体クロマチンおよびエピソームクロマチンの両方が含まれる。
「アクセス可能な領域」は、核酸中に存在する標的部位が、標的部位を認識する外因性分子によって結合され得る、細胞クロマチン中の部位である。いずれの特定の理論に束縛されることも望まないが、アクセス可能な領域は、ヌクレオソーム構造へとまとめられていない領域であると考えられる。アクセス可能な領域の特徴的な構造は、化学的および酵素的プローブ、例えばヌクレアーゼに対するその感受性によってしばしば検出できる。
「標的部位」または「標的配列」は、結合が存在するのに十分な条件であるならば結合分子が結合する核酸の一部分を規定する核酸配列である。例えば、配列5’GAATTC3’は、Eco RI制限エンドヌクレアーゼの標的部位である。
「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部ではない核酸を含む、複製性の核酸、核タンパク質複合体または他の構造である。エピソームの例には、プラスミド、ミニサークルおよびある特定のウイルスゲノムが含まれる。本明細書に記載される肝臓特異的構築物は、エピソームで維持され得、あるいは、細胞中に安定に組み込まれ得る。
「外因性」分子は、細胞中に通常は存在しないが、1つまたは複数の遺伝学的、生化学的または他の方法によって細胞中に導入され得る分子である。「細胞中の通常の存在」は、特定の発生段階および細胞の環境条件に関して決定される。従って、例えば、筋肉の胚発生の間にのみ存在する分子は、成体筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、ヒートショックによって誘導される分子は、ヒートショックされていない細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全性内因性分子の機能性バージョン、または正常に機能する内因性分子の機能不全性バージョンを含み得る。
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるような小分子、あるいは高分子、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の任意の改変された誘導体、または上記分子の1つもしくは複数を含む任意の複合体であり得る。核酸は、DNAおよびRNAを含み、一本鎖または二本鎖であり得、直鎖、分岐鎖または環状であり得、任意の長さのものであり得る。核酸には、二重鎖を形成することが可能なもの、ならびに三重鎖形成性核酸が含まれる。例えば、米国特許第5,176,996号および同第5,422,251号を参照のこと。タンパク質には、DNA結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化DNA結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、リガーゼ、デユビキチナーゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレースおよびヘリカーゼが含まれるがこれらに限定されない。
外因性分子は、内因性分子と同じ型の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸であり得る。例えば、外因性核酸は、細胞中に導入される感染性ウイルスゲノム、プラスミドもしくはエピソーム、または細胞中に通常は存在しない染色体を含み得る。細胞中への外因性分子の導入のための方法は、当業者に公知であり、これには、脂質媒介性移入(即ち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム)、エレクトロポレーション、直接的注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈、DEAE-デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が含まれるがこれらに限定されない。外因性分子はまた、細胞が由来する種とは異なる種に由来するが、内因性分子と同じ型の分子であり得る。例えば、ヒト核酸配列は、マウスまたはハムスターに元々由来する細胞系中に導入され得る。
それに反して、「内因性」分子は、特定の環境条件下で特定の発生段階において、特定の細胞中に通常存在する分子である。例えば、内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他のオルガネラのゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子には、タンパク質、例えば、転写因子および酵素が含まれ得る。
本明細書で使用する場合、用語「外因性核酸の産物」には、ポリヌクレオチド産物およびポリペプチド産物の両方、例えば、転写産物(RNAなどのポリヌクレオチド)および翻訳産物(ポリペプチド)が含まれる。
「融合」分子は、2つまたはそれよりも多くのサブユニット分子が、好ましくは共有結合によって連結された分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得る、または異なる化学型の分子であり得る。融合分子の例には、融合タンパク質(例えば、タンパク質DNA結合ドメインと切断ドメインとの間の融合物)、切断ドメインと動作可能に会合したポリヌクレオチドDNA結合ドメイン(例えば、sgRNA)間の融合物、および融合核酸(例えば、融合タンパク質をコードする核酸)が含まれるがこれらに限定されない。
細胞における融合分子の発現は、細胞への融合分子の送達から、または細胞への融合分子の1つもしくは複数の構成成分をコードするポリヌクレオチドの送達によって生じ得、このとき、ポリヌクレオチドは転写され、転写物は翻訳されて、融合分子を生成する。CRISPR/Cas転写因子および/またはヌクレアーゼの場合、sgRNA DNA結合ドメインは、細胞中へのsgRNAおよび機能的ドメインコード配列の導入の際に、機能的ドメイン(例えば、ヌクレアーゼドメインまたは転写調節ドメイン)と会合する。トランス-スプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションもまた、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、本開示中の別の場所に提示される。
本開示の目的のために、「遺伝子」には、遺伝子産物をコードするDNA領域(以下を参照のこと)、ならびにそのような調節配列がコード配列および/または転写された配列に隣接していてもいなくても、遺伝子産物の産生を調節する全てのDNA領域が含まれる。従って、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位および内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位ならびに遺伝子座制御領域が含まれるが、これらに必ずしも限定されない。
「遺伝子発現」とは、遺伝子中に含有される情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的転写産物(例えば、mRNA、tRNA、rRNA、アンチセンスRNA、リボザイム、構造的RNAまたは任意の他の型のRNA)またはmRNAの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化および編集などのプロセスによって改変されたRNA、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ADP-リボシル化、ミリスチル化およびグリコシル化によって改変されたタンパク質も含まれる。
遺伝子発現の「モジュレーション」とは、遺伝子の活性における変化を指す。発現のモジュレーションには、遺伝子活性化および遺伝子抑圧が含まれ得るがこれらに限定されない。ゲノム編集(例えば、切断、変更、不活性化、ランダム変異)は、発現をモジュレートするために使用され得る。遺伝子不活性化とは、本明細書に記載されるZFP、TALEまたはCRISPR/Cas系を含まない細胞と比較した、遺伝子発現における任意の低減を指す。従って、遺伝子不活性化は、部分的または完全であり得る。従って、「遺伝子モジュレーター」は、遺伝子配列の改変および/または遺伝子発現の改変が含まれるがこれらに限定されない、標的遺伝子の発現をモジュレートする任意の分子である。
「目的の領域」は、細胞クロマチンの任意の領域、例えば、遺伝子、または遺伝子内のもしくは遺伝子に隣接する非コード配列などであり、外因性分子を結合することが望ましい。結合は、標的化DNA切断および/または標的化組換えの目的のためであり得る。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム(例えば、ミトコンドリア、葉緑体)または感染性ウイルスゲノム中に存在し得る。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、転写された非コード領域、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロンなどの内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内にあり得る。目的の領域は、単一ヌクレオチド対くらいの小ささ、もしくは最大で2,000ヌクレオチド対長、または任意の整数値のヌクレオチド対であり得る。
「セーフハーバー」遺伝子座は、遺伝子が宿主細胞に対するいずれの有害効果もなしに挿入され得る、ゲノム内の遺伝子座である。挿入された遺伝子配列の発現が近隣遺伝子からのいずれのリードスルー発現によっても乱されないセーフハーバー遺伝子座が、最も有益である。ヌクレアーゼによって標的化されるセーフハーバー遺伝子座の非限定的な例には、CCR5、HPRT、AAVS1、Rosa、ATPA1、CLYBLおよびアルブミンが含まれる。例えば、米国特許第7,951,925号;同第8,771,985号;同第8,110,379号;同第7,951,925号;米国特許出願公開第20100218264号;同第20110265198号;同第20130137104号;同第20130122591号;同第20130177983号;同第20130177960号;同第20150056705号および同第20150159172号を参照のこと。
「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、好ましくは、必ずしも慣用的なアッセイにおいてではないが、容易に測定されるタンパク質産物を産生する任意の配列を指す。適切なレポーター遺伝子には、抗生物質耐性(例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、G418耐性、ピューロマイシン耐性)を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ)ならびに増強された細胞成長および/または遺伝子増幅を媒介するタンパク質(例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ)をコードする配列が含まれるがこれらに限定されない。エピトープタグには、例えば、FLAG、His、myc、Tap、HAまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の1つまたは複数のコピーが含まれる。「発現タグ」には、目的の遺伝子の発現をモニタリングするために、所望の遺伝子配列に作動可能に連結し得る、レポーターをコードする配列が含まれる。
「真核生物」細胞には、幹細胞(多能性および多分化能性)を含む、真菌細胞(例えば、酵母)、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞(例えば、T細胞)が含まれるがこれらに限定されない。
「結合」とは、高分子間の(例えば、タンパク質と核酸との間の)配列特異的な非共有結合相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合相互作用の全ての構成成分が配列特異的である必要はない(例えば、DNA骨格中のリン酸残基との接触)。かかる相互作用は一般に、10-6M-1またはそれよりも低い解離定数(Kd)によって特徴付けられる。「親和性」とは、結合の強さを指す:増加した結合親和性は、より低いKdと相関する。「非特異的結合」とは、1つの分子中の任意の一般化された位置で生じ得る、目的の任意の分子(例えば、操作されたヌクレアーゼ)と高分子(例えば、DNA)との間で生じる一般化された非共有結合相互作用を指し、かかる相互作用は、標的配列に限定されない。
「結合タンパク質」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えば、DNA分子(DNA結合タンパク質)、RNA分子(RNA結合タンパク質)および/またはタンパク質分子(タンパク質結合タンパク質)に結合し得る。タンパク質結合タンパク質の場合、これはそれ自体に結合でき(ホモダイマー、ホモトリマーなどを形成する)、および/または異なるタンパク質(単数または複数)の1つもしくは複数の分子に結合できる。結合タンパク質は、1つよりも多い型の結合活性を有し得る。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、DNA結合、RNA結合およびタンパク質結合活性を有する。RNAガイドされるヌクレアーゼ系の場合、RNAガイドは、ヌクレアーゼ構成成分(Cas9またはCfp1)に対して異種であり、両方が操作され得る。
「DNA結合分子」は、DNAに結合できる分子である。かかるDNA結合分子は、ポリペプチド、タンパク質のドメイン、より大きいタンパク質またはポリヌクレオチド内のドメインであり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはDNAであるが、他の実施形態では、ポリヌクレオチドはRNAである。一部の実施形態では、DNA結合分子は、ヌクレアーゼのタンパク質ドメイン(例えば、FokIドメイン)であるが、他の実施形態では、DNA結合分子は、RNAガイドされるヌクレアーゼ(例えば、Cas9またはCfp1)のガイドRNA構成成分である。
「DNA結合タンパク質」(または結合ドメイン)は、1つもしくは複数のジンクフィンガーを介して、またはそれぞれジンクフィンガータンパク質もしくはTALE中の1つもしくは複数のRVDとの相互作用によって、配列特異的様式でDNAを結合する、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインである。用語ジンクフィンガーDNA結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質またはZFPと略称する場合が多い。
「ジンクフィンガーDNA結合タンパク質」(または結合ドメイン)は、その構造が亜鉛イオンの配位によって安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である1つまたは複数のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でDNAを結合する、タンパク質、またはより大きいタンパク質内のドメインである。用語ジンクフィンガーDNA結合タンパク質は、ジンクフィンガータンパク質またはZFPと略称する場合が多い。
「TALE DNA結合ドメイン」または「TALE」は、1つまたは複数のTALEリピートドメイン/単位を含むポリペプチドである。リピートドメインは、その同族標的DNA配列へのTALEの結合に関与する。単一の「リピート単位」(「リピート」とも呼ばれる)は、典型的には33~35アミノ酸長であり、天然に存在するTALEタンパク質内の他のTALEリピート配列と、少なくともいくらかの配列相同性を示す。例えば、その全体が本明細書に参照により組み込まれる米国特許第8,586,526号を参照のこと。
ジンクフィンガーおよびTALE結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガータンパク質の認識ヘリックス領域の操作(1つまたは複数のアミノ酸を変更すること)を介して、またはDNA結合に関与するアミノ酸(「リピート可変二残基」またはRVD領域)の操作によって、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作され」得る。従って、操作されたDNA結合タンパク質(ジンクフィンガーまたはTALE)は、天然に存在しないタンパク質である。DNA結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたDNA結合タンパク質は、その設計/組成が合理的基準から主に生じる、天然には存在しないタンパク質である。設計のための合理的基準には、既存のZFPおよび/またはTALE設計ならびに結合データの情報を保存するデータベース中の情報を処理するための置換ルールおよびコンピューター化アルゴリズムの適用が含まれる。例えば、米国特許第8,586,526号;同第6,140,081号;同第6,453,242号;同第6,746,838号;同第7,241,573号;同第6,866,997号;同第7,241,574号および同第6,534,261号を参照のこと;WO98/53058;WO98/53059;WO98/53060;WO02/016536およびWO03/016496もまた参照のこと。
「選択された」ジンクフィンガータンパク質、TALEまたはCRISPR/Cas系は、その産生が実験に基づいたプロセス、例えば、ファージディスプレイ、相互作用トラップ、合理的設計またはハイブリッド選択から主に生じる、天然には見出されないものである。例えば、米国特許第8,586,526号;同第5,789,538号;同第5,925,523号;同第6,007,988号;同第6,013,453号;同第6,200,759号;同第6,242,568号;同第6,733,970号;同第7,297,491号;WO98/53057;WO02/099084を参照のこと。
「CRISPR/Cas」系とは、シングルガイドRNA(sgRNA)DNA結合ドメインおよび1つまたは複数の切断ドメイン(ヌクレアーゼについて)または転写調節因子ドメイン(転写因子について)を含むヌクレアーゼまたは転写因子系を指す。sgRNAは、任意のDNA配列に結合するように設計され得る。sgRNAは、切断または転写調節ドメインと会合すると、遺伝子発現のモジュレーションを媒介する。例えば、米国特許第9,267,135号および同第8,841,260号ならびに米国特許出願公開第20150056705号および同第20150031134号を参照のこと。
「TtAgo」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物アルゴノートタンパク質である。TtAgoは、細菌Thermus thermophilusに由来する。例えば、Swartsら(2014年)Nature 507巻(7491号):258~61頁;G. Shengら(2013年)Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111巻、652頁を参照のこと。「TtAgo系」は、例えば、TtAgo酵素による切断のためのガイドDNAを含む、必要とされる全ての構成成分である。「組換え」とは、非相同末端結合(NHEJ)および相同組換えによるドナー捕捉が含まれるがこれらに限定されない、2つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え(HR)」とは、例えば、相同組換え修復機構を介した細胞における二本鎖破断の修復の間に起こるかかる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子(即ち、二本鎖破断を経験したもの)の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、「非乗換え遺伝子変換」または「ショートトラクト(short tract)遺伝子変換」として種々に公知であるが、それは、このプロセスが、ドナーから標的への遺伝情報の移行をもたらすからである。いずれの特定の理論に束縛されることも望まないが、かかる移行には、壊れた標的とドナーとの間で形成するヘテロ二重鎖DNAのミスマッチ修正、および/または標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング」、および/または関連のプロセスが含まれ得る。ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチド中に取り込まれるように、かかる特殊なHRは、標的分子の配列の変更を生じる場合が多い。
「組換え」とは、非相同末端結合(NHEJ)および相同組換えによる捕捉が含まれるがこれらに限定されない、2つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換のプロセスを指す。本開示の目的のために、「相同組換え(HR)」とは、例えば、相同組換え修復機構を介した細胞における二本鎖破断の修復の間に起こるかかる交換の特殊な形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子(即ち、二本鎖破断を経験したもの)の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、「非乗換え遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として種々に公知であるが、それは、このプロセスが、ドナーから標的への遺伝情報の移行をもたらすからである。いずれの特定の理論に束縛されることも望まないが、かかる移行には、壊れた標的とドナーとの間で形成するヘテロ二重鎖DNAのミスマッチ修正、および/または標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング」、および/または関連のプロセスが含まれ得る。ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全てが標的ポリヌクレオチド中に取り込まれるように、かかる特殊なHRは、標的分子の配列の変更を生じる場合が多い。
本開示のある特定の方法では、本明細書に記載される1つまたは複数の標的化ヌクレアーゼは、所定の部位(例えば、目的の遺伝子または遺伝子座)において標的配列(例えば、細胞クロマチン)中に二本鎖破断(DSB)を創出する。DSBは、本明細書に記載される構築物(例えば、ドナー)の組み込みを媒介する。任意選択で、構築物は、破断の領域中のヌクレオチド配列に対して相同性を有する。発現構築物は、物理的に組み込まれ得、あるいは、発現カセットは、相同組換えを介した破断の修復のための鋳型として使用されて、細胞クロマチン中への、発現カセット中と同様のヌクレオチド配列の全てまたは一部の導入を生じる。従って、細胞クロマチン中の第1の配列は変更され得、ある特定の実施形態では、発現カセット中に存在する配列へと変換され得る。従って、用語「置き換える」または「置き換え」の使用は、別のヌクレオチド配列による1つのヌクレオチド配列の置き換え(即ち、情報的な意味での配列の置き換え)を示すと理解され得、別のポリヌクレオチドによる1つのポリヌクレオチドの物理的または化学的置き換えを必ずしも要求しない。
本明細書に記載される方法のいずれかでは、さらなる操作されたヌクレアーゼが、細胞内のさらなる標的部位のさらなる二本鎖切断のために使用され得る。
細胞クロマチン中の目的の領域における配列の標的化組換えおよび/または置き換えおよび/または変更のための方法のある特定の実施形態では、染色体配列は、外因性「ドナー」ヌクレオチド配列による相同組換えによって変更される。かかる相同組換えは、破断の領域に対して相同な配列が存在する場合、細胞クロマチン中の二本鎖破断の存在によって刺激される。
本明細書に記載される方法のいずれかでは、第1のヌクレオチド配列(「ドナー配列」)は、目的の領域中のゲノム配列に対して相同であるが同一ではない配列を含有し得、それによって、目的の領域において非同一配列を挿入するように相同組換えを刺激する。従って、ある特定の実施形態では、目的の領域中の配列に対して相同なドナー配列の部分は、置き換えられるゲノム配列に対して約80~99%の間(またはそれらの間の任意の整数)の配列同一性を示す。他の実施形態では、ドナーとゲノム配列との間の相同性は、例えば、100を超える連続塩基対の、ドナーとゲノム配列との間で1ヌクレオチドのみが異なる場合、99%よりも高い。ある特定の場合では、ドナー配列の非相同部分は、新たな配列が目的の領域中に導入されるように、目的の領域中に存在しない配列を含有し得る。これらの例では、非相同配列には一般に、目的の領域中の配列に対して相同または同一である、50~1,000塩基対(またはそれらの間の任意の整数値)の、または1,000よりも多い任意の数の塩基対の配列が隣接する。他の実施形態では、ドナー配列は、第1の配列に対して非相同であり、非相同組換え機構によってゲノム中に挿入される。
本明細書に記載される方法のいずれかは、ドナー配列の標的化組み込みによる、または標的配列の切断と、その後の目的の遺伝子の発現を破壊するエラープローンなNHEJ媒介性修復とを介した、細胞における1つまたは複数の標的配列の部分的または完全な不活性化のために使用され得る。部分的または完全に不活性化された遺伝子を有する細胞系もまた提供される。
さらに、本明細書に記載される標的化組み込みの方法は、1つまたは複数の外因性配列を組み込むためにも使用され得る。外因性核酸配列は、例えば、1つもしくは複数の遺伝子もしくはcDNA分子、または任意の型のコード配列もしくは非コード配列、ならびに1つもしくは複数の制御エレメント(例えば、プロモーター)を含み得る。さらに、外因性核酸配列は、1つまたは複数のRNA分子(例えば、低分子ヘアピンRNA(shRNA)、阻害性RNA(RNAi)、microRNA(miRNA)など)を産生し得る。
「切断」とは、DNA分子の共有結合骨格の破断を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が含まれるがこれらに限定されない種々の方法によって開始され得る。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、2つの別個の一本鎖切断事象の結果として生じ得る。DNA切断は、平滑末端または粘着末端のいずれかの産生を生じ得る。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドが、標的化二本鎖DNA切断のために使用される。
「切断ハーフドメイン」は、第2のポリペプチド(同一または異なるのいずれか)と一緒になって切断活性(好ましくは二本鎖切断活性)を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。用語「第1および第2の切断ハーフドメイン」;「+および-の切断ハーフドメイン」および「右および左の切断ハーフドメイン」は、ダイマー化する切断ハーフドメインの対を指すために、相互交換可能に使用される。
「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン(例えば、別の操作された切断ハーフドメイン)と共に偏性ヘテロダイマーを形成するように改変された切断ハーフドメインである。
用語「動作可能な連結」および「動作可能に連結した」(または「作動可能に連結した」)は、2つまたはそれよりも多くの構成成分(例えば、配列エレメント)の並置に関して相互交換可能に使用され、構成成分は、両方の構成成分が正常に機能し、構成成分の少なくとも1つが他の構成成分の少なくとも1つに対して発揮される機能を媒介できる可能性を与えるように配置される。例示として、転写調節配列、例えばプロモーターは、転写調節配列が、1つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に動作可能に連結している。転写調節配列は一般に、コード配列とシスで動作可能に連結するが、それと直接隣接する必要はない。例えば、エンハンサーは、それらが連続していない場合であっても、コード配列に動作可能に連結した転写調節配列である。
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、全長のタンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能をなおも保持する、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応するネイティブ分子よりも多い、少ない、もしくは同じ数の残基を保有し得、および/または1つもしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有し得る。核酸の機能(例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力)を決定するための方法は、当該分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法は、周知である。
ポリヌクレオチド「ベクター」または「構築物」は、遺伝子配列を標的細胞に移入させることが可能である。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」、「発現構築物」、「発現カセット」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を指示することが可能であり、遺伝子配列を標的細胞に移入させることができる、任意の核酸構築物を意味する。従って、用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびに組み込みベクターを含む。
用語「対象」および「患者」は、相互交換可能に使用され、哺乳動物、例えば、ヒト患者および非ヒト霊長類、ならびに実験動物、例えば、ウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウスおよび他の動物を指す。従って、用語「対象」または「患者」は、本明細書で使用する場合、本発明の発現カセットが投与され得る任意の哺乳動物患者または対象を意味する。本発明の対象には、障害を有する対象が含まれる。
用語「処置する」および「処置」とは、本明細書で使用する場合、症状の重症度および/または頻度における低減、症状および/または根底にある原因の排除、症状および/またはそれらの根底にある原因の発生の予防、ならびに損傷の改善または矯正を指す。がん、一遺伝子性疾患および移植片対宿主病は、本明細書に記載される組成物および方法を使用して処置され得る状態の非限定的な例である。
肝臓特異的発現構築物
対象への発現カセットの投与(例えば、末梢または肝静脈送達)後にin vivoを含む肝臓細胞において導入遺伝子(例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子の1つまたは複数のモジュレーター)の発現を指示することにおける使用のための発現カセット(構築物)が、本明細書に記載される。細胞における使用のためのPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子の野生型cDNAコピーを含む発現カセット(構築物)であって、内因性変異体バージョンのPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子が、上記1つまたは複数のモジュレーターによってノックアウトされている、発現カセット(構築物)もまた本明細書に記載される。発現構築物は、エピソームで維持され、染色体外で導入遺伝子の発現を駆動し得(米国特許出願公開第20170119906号を参照のこと)、あるいは、発現構築物は、例えば、ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みによって、肝臓細胞のゲノム中に組み込まれ得る。
対象への発現カセットの投与(例えば、末梢または肝静脈送達)後にin vivoを含む肝臓細胞において導入遺伝子(例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子の1つまたは複数のモジュレーター)の発現を指示することにおける使用のための発現カセット(構築物)が、本明細書に記載される。細胞における使用のためのPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子の野生型cDNAコピーを含む発現カセット(構築物)であって、内因性変異体バージョンのPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子が、上記1つまたは複数のモジュレーターによってノックアウトされている、発現カセット(構築物)もまた本明細書に記載される。発現構築物は、エピソームで維持され、染色体外で導入遺伝子の発現を駆動し得(米国特許出願公開第20170119906号を参照のこと)、あるいは、発現構築物は、例えば、ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みによって、肝臓細胞のゲノム中に組み込まれ得る。
ポリヌクレオチド発現構築物は、エンハンサー配列、プロモーター配列、および1つまたは複数の導入遺伝子を含む。任意選択で、以下:イントロン配列、ポリアデニル化配列および/またはシグナルペプチドの1つまたは複数が含まれる。任意のエンハンサー配列が、本明細書に記載される発現構築物において使用され得る。ある特定の実施形態では、エンハンサーは、野生型または改変されたSerpin1エンハンサーである(Chuahら(2014年)Molecular Therapy、22巻、1605~1613頁;Nairら(2014年)Blood 123巻、3195~3199頁)。
好ましい実施形態では、Serpin1エンハンサーは、野生型と比較して1つまたは複数の変異(例えば、点変異)を含み、例えば、Serpin1エンハンサーは、示されるような1つまたは複数のヌクレオチド改変、即ち、エンハンサー内の1つまたは複数の位置におけるヌクレオチドの改変を含有する。例えば、米国特許出願公開第2017-0119906号A1を参照のこと。
同様に、任意のプロモーター配列が、本発明の発現カセットにおいて使用され得る。ある特定の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、誘導性または組織特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、肝臓特異的プロモーターである。ある特定の実施形態では、プロモーターは、トランスサイレチンミニマルプロモーター(TTRm)プロモーターである。他の実施形態では、プロモーターは、アルファ-1アンチトリプシン(hAAT)プロモーターである。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドのいずれかは、イントロン配列を任意選択でさらに含み得る。ある特定の実施形態では、発現構築物は、短縮されたキメライントロン(T-キメライントロン)配列を含む。T-キメライントロンは、pCI-neo(GenBank U47120)中の短縮されたバージョンのキメライントロンである。pCI-neo中のキメライントロンは、ヒトβ-グロビン遺伝子由来の5’スプライスドナー部位、ならびに免疫グロブリン遺伝子重鎖可変領域の分岐点および3’アクセプター部位である。T-キメライントロンは、5’スプライスドナーと分岐点との間に45bpの欠失を含有する。さらに他の実施形態では、発現構築物は、変異型MVMイントロン配列を含む(例えば、米国特許出願公開第2017-0119906号A1に示される)。
あるいは、本明細書に記載される発現構築物は、例えば、米国特許出願公開第2017-0119906号A1に示されるように、イントロン配列を欠如し得る。
本明細書に記載される構築物は、任意のウイルスまたは非ウイルスベクター内に含有され得る。構築物は、エピソームで維持され得るまたは細胞のゲノム中に(例えば、ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みを介して)組み込まれ得る。
非ウイルスベクターには、DNAまたはRNAプラスミド、DNA MC、ネイキッド核酸、およびリポソーム、ナノ粒子またはポロクサマーなどの送達ビヒクルと複合体化した核酸が含まれる。本明細書に記載される発現カセットを運搬するために使用され得るウイルスベクターには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアおよび単純ヘルペスウイルスベクターが含まれるがこれらに限定されない。宿主ゲノムにおける組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入法を用いて可能であり、本明細書に記載されるように、ヌクレアーゼ媒介性組み込みによって促進され得る。
ある特定の好ましい実施形態では、構築物は、エピソームで維持または肝臓細胞のゲノム中に(例えば、ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みを介して)組み込まれ得るアデノ随伴ウイルス(「AAV」)ベクターまたはベクター系中に含まれる。組換えAAVベクターの構築は、米国特許第5,173,414号;Tratschinら、Mol. Cell. Biol. 5巻:3251~3260頁(1985年);Tratschinら、Mol. Cell. Biol. 4巻:2072~2081頁(1984年);HermonatおよびMuzyczka、PNAS 81巻:6466~6470頁(1984年);ならびにSamulskiら、J. Virol. 63巻:03822~3828頁(1989年)を含むいくつかの刊行物中にある。
従って、ある特定の実施形態では、発現構築物は、AAV構築物上にあり、本明細書に記載される発現構築物のエレメント(例えば、エンハンサー、プロモーター、任意選択のイントロン、導入遺伝子など)に隣接する5’および3’ITRをさらに含む。任意選択で、スペーサー分子もまた、発現構築物の構成成分の1つまたは複数の間、例えば、5’ITRとエンハンサーとの間および/またはポリアデニル化シグナルと3’ITRとの間に含まれる。スペーサーは、セーフハーバー遺伝子座(例えば、アルブミン)中への組換えを促進するための相同性アームとして機能し得る。ある特定の実施形態では、構築物は、米国特許出願公開第2017-0119906号A1に示される構築物である。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるAAVベクターは、任意のAAVに由来し得る。ある特定の実施形態では、AAVベクターは、欠損性および非病原性パルボウイルスであるアデノ随伴2型ウイルスに由来する。全てのかかるベクターは、導入遺伝子発現カセットに隣接するAAVの145bpの逆位末端リピートのみを保持するプラスミドに由来する。形質導入された細胞のゲノム中への組み込みに起因する効率的な遺伝子移入および安定な導入遺伝子送達は、このベクター系の重要な特色である(Wagnerら、Lancet 351巻:9117号、1702~3頁(1998年)、Kearnsら、Gene Ther. 9巻:748~55頁(1996年))。AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9およびAAVrh.10ならびに任意の新規AAV血清型を含む他のAAV血清型もまた、本発明に従って使用され得る。一部の実施形態では、ウイルス核酸のLTR配列のウイルス起源がカプシド配列のウイルス起源にとって異種である、キメラAAVが使用される。非限定的な例には、AAV2に由来するLTRおよびAAV5、AAV6、AAV8またはAAV9に由来するカプシドを有するキメラウイルス(即ち、それぞれ、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/8およびAAV2/9)が含まれる。
レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス(MuLV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、サル免疫不全ウイルス(SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、およびそれらの組合せに基づくものが含まれる(例えば、Buchscherら、J. Virol. 66巻:2731~2739頁(1992年);Johannら、J. Virol. 66巻:1635~1640頁(1992年);Sommerfeltら、Virol. 176巻:58~59頁(1990年);Wilsonら、J. Virol. 63巻:2374~2378頁(1989年);Millerら、J. Virol. 65巻:2220~2224頁(1991年);PCT/US94/05700を参照のこと)。
本明細書に記載される構築物は、アデノウイルスベクター系中にも組み込まれ得る。アデノウイルスベースのベクターは、多くの細胞型において非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。かかるベクターを用いて、高い力価および高いレベルの発現が得られている。このベクターは、比較的単純な系で大量に産生され得る。
pLASNおよびMFG-Sは、臨床試験において使用されているレトロウイルスベクターの例である(Dunbarら、Blood 85巻:3048~305頁(1995年);Kohnら、Nat. Med. 1巻:1017~102頁(1995年);Malechら、PNAS 94巻:22号、12133~12138頁(1997年))。PA317/pLASNは、遺伝子治療試験で使用された最初の治療的ベクターであった(Blaeseら、Science 270巻:475~480頁(1995年))。50%またはそれよりも高い形質導入効率が、MFG-Sパッケージングされたベクターについて観察されている(Ellemら、Immunol Immunother. 44巻(1号):10~20頁(1997年);Dranoffら、Hum. Gene Ther. 1巻:111~2頁(1997年))。
複製欠損組換えアデノウイルスベクター(Ad)もまた、本明細書に記載されるポリヌクレオチドと共に使用され得る。ほとんどのアデノウイルスベクターは、導入遺伝子がAd E1a、E1bおよび/またはE3遺伝子を置き換えるように操作される;引き続いて、複製欠損ベクターは、欠失された遺伝子機能をトランスで供給するヒト293細胞中で増殖する。Adベクターは、非分裂性の分化した細胞、例えば、肝臓、腎臓および筋肉中で見出される細胞を含む、複数の型の組織をin vivoで形質導入できる。従来のAdベクターは、大きい運搬能を有する。臨床試験におけるAdベクターの使用の一例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド治療を含んだ(Stermanら、Hum. Gene Ther. 7巻:1083~9頁(1998年))。臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用のさらなる例には、Roseneckerら、Infection 24巻:1号、5~10頁(1996年);Stermanら、Hum. Gene Ther. 9巻:7号、1083~1089頁(1998年);Welshら、Hum. Gene Ther. 2巻:205~18頁(1995年);Alvarezら、Hum. Gene Ther. 5巻:597~613頁(1997年);Topfら、Gene Ther. 5巻:507~513頁(1998年);Stermanら、Hum. Gene Ther. 7巻:1083~1089頁(1998年)が含まれる。
パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することが可能なウイルス粒子を形成するために使用される。かかる細胞には、AAVおよびアデノウイルスをパッケージングする293細胞、ならびにレトロウイルスをパッケージングするψ2細胞またはPA317細胞が含まれる。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子中にパッケージングする産生細胞系によって生成される。ベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主中への引き続く組み込み(適用可能な場合)に必要とされる最小のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられる。欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞系によってトランスで供給される。例えば、遺伝子治療において使用されるAAVベクターは、典型的には、パッケージングおよび宿主ゲノム中への組み込みに必要とされるAAVゲノム由来の逆位末端リピート(ITR)配列のみを保有する。ウイルスDNAは、他のAAV遺伝子、即ちrepおよびcapをコードするがITR配列を欠如するヘルパープラスミドを含有する細胞系においてパッケージングされる。細胞系には、ヘルパーとしてのアデノウイルスも感染する。ヘルパーウイルスは、AAVベクターの複製およびヘルパープラスミドからのAAV遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ITR配列の欠如に起因して顕著な量ではパッケージングされない。アデノウイルスによる混入は、例えば、アデノウイルスがAAVよりも感受性が高い熱処理によって低減され得る。一部の実施形態では、AAVは、バキュロウイルス発現系を使用して産生される。
多くの遺伝子治療適用では、特定の組織型に対する高い程度の特異性を有する遺伝子治療ベクターを送達することが望ましい。従って、ウイルスベクターは、ウイルスの外側表面上にウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、所与の細胞型に対する特異性を有するように改変され得る。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが公知の受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Hanら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92巻:9747~9751頁(1995年)は、モロニーマウス白血病ウイルスが、gp70と融合したヒトヘレグリンを発現するように改変され得ること、および組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染することを報告した。この原理は、他のウイルス-標的細胞対に拡張でき、このとき、標的細胞は受容体を発現し、ウイルスは、細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する。例えば、繊維状ファージは、事実上任意の選択された細胞受容体に対する特異的な結合親和性を有する抗体断片(例えば、FABまたはFv)をディスプレイするように操作され得る。上の記載は、ウイルスベクターに主に当てはまるが、同じ原理が非ウイルスベクターに適用され得る。かかるベクターは、特異的標的細胞による取込みに有利な特異的取込み配列を含有するように操作され得る。
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、1つまたは複数の非天然の塩基および/または骨格を含み得る。特に、本明細書に記載される発現カセットは、転写静止の状態を達成するために、目的の領域中にメチル化シトシンを含み得る。
さらに、本明細書に記載される発現構築物は、さらなる転写もしくは翻訳調節または他の配列、例えば、さらなるプロモーター、エンハンサー、インスレーター、内部リボソーム進入部位、2Aペプチドをコードする配列および/またはポリアデニル化シグナルもまた含み得る。さらに、目的の遺伝子の制御エレメントは、キメラ遺伝子を創出するためにレポーター遺伝子に作動可能に連結し得る(例えば、レポーター発現カセット)。
導入遺伝子
本明細書に記載される構築物は、任意の導入遺伝子の肝送達のために使用され得る。
本明細書に記載される構築物は、任意の導入遺伝子の肝送達のために使用され得る。
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、1つもしくは複数のこれらの遺伝子の発現を上方調節もしくは下方調節する1つもしくは複数の転写因子、1つもしくは複数のこれらの遺伝子を切断する1つもしくは複数のヌクレアーゼ、および/または1つもしくは複数のこれらの遺伝子を阻害もしくは活性化する1つもしくは複数の配列が含まれるがこれらに限定されない、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子の1つまたは複数のモジュレーターを含む配列をコードする。1つまたは複数のこれらの遺伝子中の標的部位に結合する例示的な人工転写因子および/またはヌクレアーゼは、本明細書に記載される。
他の実施形態では、導入遺伝子は、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子のcDNA配列をコードする。これらの導入遺伝子は、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子の内因性変異体コピーが本明細書に記載されるヌクレアーゼによってノックアウトされた細胞において使用され得る。cDNA配列は、ゲノム中に組み込まれ得る、または染色体外で(例えば、エピソームで)維持され得る。
導入遺伝子には、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、マーカー遺伝子、切断酵素認識部位および種々の型の発現構築物もまた含まれ得る。提供され得るマーカー遺伝子には、抗生物質耐性(例えば、アンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、G418耐性、ピューロマイシン耐性)を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ)ならびに増強された細胞成長および/または遺伝子増幅を媒介するタンパク質(例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ)をコードする配列が含まれるがこれらに限定されない。エピトープタグには、例えば、FLAG、His、myc、Tap、HAまたは任意の検出可能なアミノ酸配列の1つまたは複数のコピーが含まれる。
好ましい実施形態では、導入遺伝子は、抗体、抗原、酵素、受容体(細胞表面または核)、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、増殖因子、および上記のいずれかの機能的断片が含まれるがこれらに限定されない、細胞におけるその発現が所望される任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。コード配列は、例えばcDNAであり得る。
他の実施形態では、導入遺伝子は、リソソーム蓄積障害(例えば、ゴーシェ、ファブリー、ハンター、ハーラー、ニーマン(Neimann)-ピックなど)、代謝障害、ならびに/または血液障害、例えば、血友病およびヘモグロビン異常症などが含まれるがこれらに限定されない任意の遺伝疾患において欠如している欠損したタンパク質の機能的バージョンをコードする。例えば、米国特許出願公開第20140017212号および同第20140093913号;米国特許第9,255,250号および同第9,175,280号を参照のこと。
例えば、導入遺伝子は、以下の遺伝疾患のいずれかが含まれるがこれらに限定されない遺伝疾患を有する対象において欠如しているまたは非機能的であるポリペプチドをコードする配列を含み得る:軟骨無形成症、色覚異常、酸性マルターゼ欠損症、アデノシンデアミナーゼ欠損症(OMIM番号102700)、副腎白質ジストロフィー、アイカルディ症候群、アルファ-1アンチトリプシン欠損症、アルファ-サラセミア、アンドロゲン不感性症候群、アペール症候群、不整脈原性右室心筋症、異形成症、毛細血管拡張性運動失調症(ataxia telangictasia)、バース症候群、ベータ-サラセミア、青色ゴム乳首様母斑症候群、カナバン病、慢性肉芽腫性疾患(CGD)、ネコ鳴き症候群、嚢胞性線維症、ダーカム病、外胚葉異形成症、ファンコニ貧血、進行性骨化性線維異形成症(fibrodysplasiaossificans progressive)、脆弱X症候群、ガラクトース血症(galactosemis)、ゴーシェ病、全身性ガングリオシドーシス(gangliosidoses)(例えば、GM1)、ヘモクロマトーシス、ベータ-グロビンの6番目のコドン中のヘモグロビンC変異(HbC)、血友病、ハンチントン病、ハーラー症候群、低ホスファターゼ症、クラインフェルター症候群(Klinefleter syndrome)、クラッベ病、ランガー-ギデオン症候群、白血球粘着欠損症(LAD、OMIM番号116920)、白質ジストロフィー、QT延長症候群、マルファン症候群、メビウス症候群、ムコ多糖症(MPS)、爪膝蓋骨症候群、腎性尿崩症(nephrogenic diabetes insipdius)、神経線維腫症、ニーマン-ピック病、骨形成不全症、ポルフィリン症、プラダー-ウィリー症候群、早老症、プロテウス症候群、網膜芽細胞腫、レット症候群、ルビンシュタイン-テイビ症候群、サンフィリッポ症候群、重症複合免疫不全(SCID)、シュワッハマン症候群、鎌状赤血球症(鎌状赤血球貧血)、スミス-マゲニス症候群、スティックラー症候群、テイ-サックス病、血小板減少橈骨欠損(TAR)症候群、トリーチャーコリンズ症候群、トリソミー、結節性硬化症、ターナー症候群、尿素サイクル異常症、フォンヒッペル-リンダウ病(von Hippel-Landau disease)、ワールデンブルグ症候群、ウィリアムズ症候群、ウィルソン病、ウィスコット-アルドリッチ症候群、X連鎖リンパ増殖症候群(XLP、OMIM番号308240)、後天性免疫不全、リソソーム蓄積疾患(例えば、ゴーシェ病、GM1、ファブリー病およびテイ-サックス病)、ムコ多糖症(mucopolysaccahidosis)(例えば、ハンター病、ハーラー病)、ヘモグロビン異常症(例えば、鎌状赤血球症、HbC、α-サラセミア、β-サラセミア)および血友病。
本明細書に記載される発現され得るタンパク質(短縮されたバージョンなどのその機能的断片を含む)の非限定的な例には、フィブリノーゲン、プロトロンビン、組織因子、第V因子、第VII因子、第IX因子、第X因子、第XI因子、第XII因子(ハーゲマン因子)、第XIII因子(フィブリン安定化因子)、フォンヴィルブランド因子、プレカリクレイン、高分子量キニノーゲン(フィッツジェラルド因子)、フィブロネクチン、アンチトロンビンIII、ヘパリンコファクターII、プロテインC、プロテインS、プロテインZ、プロテインZ関連プロテアーゼ阻害剤、プラスミノーゲン、アルファ2-抗プラスミン、組織プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-1、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤-2、グルコセレブロシダーゼ(GBA)、α-ガラクトシダーゼA(GLA)、イズロン酸スルファターゼ(IDS)、イズロニダーゼ(IDUA)、酸性スフィンゴミエリナーゼ(SMPD1)、MMAA、MMAB、MMACHC、MMADHC(C2orf25)、MTRR、LMBRD1、MTR、プロピオニル-CoAカルボキシラーゼ(PCC)(PCCAおよび/またはPCCBサブユニット)、グルコース-6-リン酸トランスポーター(G6PT)タンパク質またはグルコース-6-ホスファターゼ(G6Pase)、LDL受容体(LDLR)、ApoB、LDLRAP-1、PCSK9、ミトコンドリアタンパク質、例えば、NAGS(N-アセチルグルタミン酸シンテターゼ)、CPS1(カルバモイルリン酸シンテターゼI)、およびOTC(オルニチントランスカルバミラーゼ)、ASS(アルギニノコハク酸シンテターゼ)、ASL(アルギニノコハク酸(argininosuccinase acid)リアーゼ)および/もしくはARG1(アルギナーゼ)、ならびに/または溶質輸送体ファミリー25(SLC25A13、アスパラギン酸/グルタミン酸輸送体)タンパク質、UGT1A1もしくはUDPグルクロノシルトランスフェラーゼ(glucuronsyltransferase)ポリペプチドA1、フマリルアセト酢酸ヒドラーゼ(fumarylacetoacetate hydrolyase)(FAH)、アラニン-グリオキシル酸アミノトランスフェラーゼ(AGXT)タンパク質、グリオキシル酸レダクターゼ/ヒドロキシピルビン酸レダクターゼ(GRHPR)タンパク質、トランスサイレチン遺伝子(TTR)タンパク質、ATP7Bタンパク質、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ(PAH)タンパク質、リポタンパク質リアーゼ(LPL)タンパク質ならびに/あるいは治療的単鎖抗体が含まれる。
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、マーカー遺伝子(上記)を含み得、標的化組み込みを受けた細胞、およびさらなる機能性をコードする連結された配列の選択を可能にする。マーカー遺伝子の非限定的な例には、GFP、薬物選択マーカーなどが含まれる。
本明細書に記載される構築物は、非コード導入遺伝子の送達にも使用され得る。アンチセンスRNA、RNAi、shRNAおよびmicroRNA(miRNA)をコードする配列もまた、標的化挿入のために使用され得る。
ある特定の実施形態では、導入遺伝子には、1kb長よりも大きい、例えば、2~200kbの間、2~10kbの間(またはそれらの間の任意の値)の配列(例えば、導入遺伝子とも呼ばれるコード配列)が含まれる。導入遺伝子は、1つまたは複数のヌクレアーゼ標的部位もまた含み得る。
(例えば、ヌクレアーゼ媒介性組み込みを介して)組み込まれる場合、導入遺伝子は、内因性遺伝子の全て、一部が発現されるように、またはいずれの内因性遺伝子も発現されないように、内因性遺伝子中に挿入され得る。
ヌクレアーゼ/転写因子
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子モジュレーターは、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子を不活性化する1つまたは複数のヌクレアーゼを含む。さらに、ヌクレアーゼは、標的遺伝子中に、例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1もしくはHAO1遺伝子および/またはセーフハーバー遺伝子(例えば、アルブミン)中に、1つまたは複数の導入遺伝子を組み込むためにも使用され得る。好ましくは、導入遺伝子構築物の組み込みは、1つまたは複数のヌクレアーゼ(例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(「ZFN」)、TALEN、TtAgo、CRISPR/Casヌクレアーゼ系およびホーミングエンドヌクレアーゼ)による標的遺伝子の切断後に標的化され、構築物は、相同組換え修復(HDR)によって、または非相同末端結合(NHEJ)駆動性プロセスの間の末端捕捉によって組み込まれる。例えば、全ての目的のためにその開示の全体が本明細書で参照により組み込まれる、米国特許第9,255,250号;同第9,200,266号;同第9,045,763号;同第9,005,973号;同第9,150,847号;同第8,956,828号;同第8,945,868号;同第8,703,489号;同第8,586,526号;同第6,534,261号;同第6,599,692号;同第6,503,717号;同第6,689,558号;同第7,067,317号;同第7,262,054号;同第7,888,121号;同第7,972,854号;同第7,914,796号;同第7,951,925号;同第8,110,379号;同第8,409,861号;米国特許出願公開第20030232410号;同第20050208489号;同第20050026157号;同第20050064474号;同第20060063231号;同第20080159996号;同第201000218264号;同第20120017290号;同第20110265198号;同第20130137104号;同第20130122591号;同第20130177983号;同第20130196373号および同第20150056705号を参照のこと。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子モジュレーターは、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子を不活性化する1つまたは複数のヌクレアーゼを含む。さらに、ヌクレアーゼは、標的遺伝子中に、例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1もしくはHAO1遺伝子および/またはセーフハーバー遺伝子(例えば、アルブミン)中に、1つまたは複数の導入遺伝子を組み込むためにも使用され得る。好ましくは、導入遺伝子構築物の組み込みは、1つまたは複数のヌクレアーゼ(例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(「ZFN」)、TALEN、TtAgo、CRISPR/Casヌクレアーゼ系およびホーミングエンドヌクレアーゼ)による標的遺伝子の切断後に標的化され、構築物は、相同組換え修復(HDR)によって、または非相同末端結合(NHEJ)駆動性プロセスの間の末端捕捉によって組み込まれる。例えば、全ての目的のためにその開示の全体が本明細書で参照により組み込まれる、米国特許第9,255,250号;同第9,200,266号;同第9,045,763号;同第9,005,973号;同第9,150,847号;同第8,956,828号;同第8,945,868号;同第8,703,489号;同第8,586,526号;同第6,534,261号;同第6,599,692号;同第6,503,717号;同第6,689,558号;同第7,067,317号;同第7,262,054号;同第7,888,121号;同第7,972,854号;同第7,914,796号;同第7,951,925号;同第8,110,379号;同第8,409,861号;米国特許出願公開第20030232410号;同第20050208489号;同第20050026157号;同第20050064474号;同第20060063231号;同第20080159996号;同第201000218264号;同第20120017290号;同第20110265198号;同第20130137104号;同第20130122591号;同第20130177983号;同第20130196373号および同第20150056705号を参照のこと。
任意のヌクレアーゼが、導入遺伝子(例えば、発現構築物)の標的化組み込みのために使用され得る。
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーDNA結合ドメインおよび切断(ヌクレアーゼ)ドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を含む。例えば、米国特許第9,255,250号;同第9,200,266号;同第9,045,763号;同第9,005,973号;同第9,150,847号;同第8,956,828号;同第8,945,868号;同第8,703,489号;同第8,586,526号;同第6,534,261号;同第6,599,692号;同第6,503,717号;同第6,689,558号;同第7,067,317号;同第7,262,054号;同第7,888,121号;同第7,972,854号;同第7,914,796号;同第7,951,925号;同第8,110,379号;同第8,409,861号を参照のこと。
他の実施形態では、ヌクレアーゼは、TALエフェクターDNA結合ドメインおよび切断(ヌクレアーゼ)ドメインを含むTALENを含む。例えば、米国特許第8,586,526号および米国特許出願公開第20130196373号を参照のこと。
なおさらなる実施形態では、ヌクレアーゼは、標的部位の認識のためのシングルガイドRNAおよび1つまたは複数の切断ドメインを含むCRISPR/Casヌクレアーゼ系を含む。例えば、米国特許出願公開第20150056705号を参照のこと。
ヌクレアーゼの切断ドメインは、偏性ヘテロダイマーを形成する天然に存在しない(操作された)切断ドメインを含む、野生型または変異型であり得る。例えば、米国特許第8,623,618号;同第7,888,121号;同第7,914,796号;および同第8,034,598号ならびに米国特許出願公開第20110201055号を参照のこと。
ヌクレアーゼは、標的部位において、1つまたは複数の二本鎖および/または一本鎖カットを作製し得る。切断および/または改変の部位は、ダイマーとして機能するヌクレアーゼを使用する場合、標的部位内および/または2つの標的部位間にあり得る。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、触媒的に不活性な切断ドメインを含む(例えば、FokIおよび/またはCasタンパク質)。例えば、米国特許第9,200,266号;同第8,703,489号およびGuillingerら(2014年)Nature Biotech. 32巻(6号):577~582頁を参照のこと。触媒的に不活性な切断ドメインは、触媒的に活性なドメインと組み合わさって、ニッカーゼとして、一本鎖カットを作製するように作用し得る。従って、2つのニッカーゼが組み合わせて使用されて、特異的領域において二本鎖カットを作製し得る。McCafferyら(2016年)Nucleic Acids Res. 44巻(2号):e11頁. doi: 10.1093/nar/gkv878.2015年10月19日に電子出版など、さらなるニッカーゼもまた当該分野で公知である。
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、セーフハーバー遺伝子(例えば、CCR5、HPRT、AAVS1、ATPA1、CLYBL、Rosa、アルブミンなど)を切断する。例えば、米国特許第7,888,121号;同第7,972,854号;同第7,914,796号;同第7,951,925号;同第8,110,379号;同第8,409,861号;同第8,586,526号;米国特許出願公開第20030232410号;同第20050208489号;同第20050026157号;同第20060063231号;同第20080159996号;同第201000218264号;同第20120017290号;同第20110265198号;同第20130137104号;同第20130122591号;同第20130177983号および同第20130177960号を参照のこと。好ましい実施形態では、発現カセットが肝臓細胞の内因性アルブミン遺伝子座中に組み込まれるように、ヌクレアーゼは、内因性アルブミン遺伝子を切断する。アルブミン特異的ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第9,150,847号;ならびに米国特許出願公開第20130177983号および同第20150056705号に記載されている。
本明細書に記載されるヌクレアーゼに加えて、またはその代わりに、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子が、1つまたは複数の操作された転写因子の使用によってモジュレート(下方調節)され得る。操作されたヌクレアーゼを用いる場合と同様、操作された転写因子は、典型的には、少なくとも1つのDNA結合ドメイン(例えば、標的化された遺伝子を結合する)および機能的ドメイン(例えば、転写調節ドメイン)を含む。PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子発現をモジュレートした任意の操作された転写因子が使用され得る。
A.DNA結合ドメイン
ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、TALE DNA結合ドメイン、またはメガヌクレアーゼ由来のDNA結合ドメイン、またはCRIPSR/Cas DNA結合複合体(例えば、シングルガイドRNA)が含まれるがこれらに限定されない任意のDNA結合ドメインが、本明細書に記載されるヌクレアーゼおよび転写因子において使用され得る。ある特定の実施形態では、人工転写因子または人工ヌクレアーゼのDNA結合ドメインは、本明細書に開示される標的部位のいずれかに示される、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24またはそれよりも多くのヌクレオチドの標的部位に結合する。
ジンクフィンガーDNA結合ドメイン、TALE DNA結合ドメイン、またはメガヌクレアーゼ由来のDNA結合ドメイン、またはCRIPSR/Cas DNA結合複合体(例えば、シングルガイドRNA)が含まれるがこれらに限定されない任意のDNA結合ドメインが、本明細書に記載されるヌクレアーゼおよび転写因子において使用され得る。ある特定の実施形態では、人工転写因子または人工ヌクレアーゼのDNA結合ドメインは、本明細書に開示される標的部位のいずれかに示される、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24またはそれよりも多くのヌクレオチドの標的部位に結合する。
ある特定の実施形態では、DNA結合ドメインは、天然に存在するまたは操作された(天然に存在しない)TALエフェクターDNA結合ドメインを含む。例えば、その全体が本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第8,586,526号を参照のこと。Xanthomonas属の植物病原性細菌は、重要な作物植物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。Xanthomonasの病原性は、25よりも多くの異なるエフェクタータンパク質を植物細胞中に注射する、保存されたIII型分泌(T3S)系に依存する。これらの注射されたタンパク質には、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームをマニピュレートする、転写活性化因子様エフェクター(TALE)がある(Kayら(2007年)Science 318巻:648~651頁を参照のこと)。これらのタンパク質は、DNA結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最もよく特徴付けられたTALEの1つは、Xanthomonas campestris pv.Vesicatoria由来のAvrBs3である(Bonasら(1989年)Mol Gen Genet 218巻:127~136頁およびWO2010079430を参照のこと)。TALEは、タンデムリピートの集中したドメインを含有し、各リピートは、およそ34アミノ酸を含有し、これらは、これらのタンパク質のDNA結合特異性にとって重要である。さらに、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する(総説については、Schornackら(2006年)J Plant Physiol 163巻(3号):256~272頁を参照のこと)。さらに、植物病原性細菌Ralstonia solanacearumでは、R.solanacearum次亜種1株GMI1000および次亜種4株RS1000におけるbrg11およびhpx17と称する2つの遺伝子が、XanthomonasのAvrBs3ファミリーに対して相同であることが見出されている(Heuerら(2007年)Appl and Envir Micro 73巻(13号):4379~4384頁を参照のこと)。これらの遺伝子は、ヌクレオチド配列が互いに98.9%同一であるが、hpx17のリピートドメインにおける1,575塩基対の欠失により異なる。しかし、両方の遺伝子産物は、XanthomonasのAvrBs3ファミリータンパク質と、40%未満の配列同一性を有する。
従って、一部の実施形態では、標的遺伝子座中の標的部位に結合するDNA結合ドメインは、植物病原体Xanthomonas(Bochら(2009年)Science 326巻:1509~1512頁ならびにMoscouおよびBogdanove(2009年)Science 326巻:1501頁を参照のこと)およびRalstonia(Heuerら(2007年)Applied and Environmental Microbiology 73巻(13号):4379~4384頁;米国特許第8,586,526号;同第8,420,782号および同第8,440,431号を参照のこと)に由来するものと類似のTALエフェクター由来の操作されたドメインである。
ある特定の実施形態では、DNA結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、選択された標的部位に結合するように操作されているという点で、天然に存在しない。例えば、それらの全体が本明細書に参照により全て組み込まれる、Beerliら(2002年)Nature Biotechnol. 20巻:135~141頁;Paboら(2001年)Ann. Rev. Biochem.70巻:313~340頁;Isalanら(2001年)Nature Biotechnol. 19巻:656~660頁;Segalら(2001年)Curr. Opin. Biotechnol.12巻:632~637頁;Chooら(2000年)Curr. Opin. Struct. Biol. 10巻:411~416頁;米国特許第7,888,121号;同第7,972,854号;同第6,453,242号;同第6,534,261号;同第6,599,692号;同第6,503,717号;同第6,689,558号;同第7,030,215号;同第6,794,136号;同第7,067,317号;同第7,262,054号;同第7,070,934号;同第7,361,635号;同第7,253,273号を参照のこと。
操作されたジンクフィンガー結合またはTALEドメインは、天然に存在するジンクフィンガーまたはTALEタンパク質と比較して、新規の結合特異性を有し得る。操作方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的設計には、例えば、三つ組(または四つ組)ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列を結合するジンクフィンガーの1つまたは複数のアミノ酸配列と会合する。例えば、それらの全体が本明細書に参照により組み込まれる、米国特許第8,586,526号;同第6,453,242号および同第6,534,261号を参照のこと。
ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第5,789,538号;同第5,925,523号;同第6,007,988号;同第6,013,453号;同第6,410,248号;同第6,140,466号;同第6,200,759号;および同第6,242,568号;ならびにWO98/37186;WO98/53057;WO00/27878;WO01/88197およびGB2,338,237に開示されている。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、WO02/077227に記載されている。
さらに、これらおよび他の参考文献に開示されるように、DNAドメイン(例えば、マルチフィンガーのジンクフィンガータンパク質またはTALEドメイン)は、例えば、5またはそれよりも多くのアミノ酸長のリンカーを含む、任意の適切なリンカー配列を使用して一緒に連結され得る。リンカー配列の非限定的な例については、米国特許第6,479,626号;同第6,903,185号;同第7,153,949号;同第9,567,609号;ならびに米国特許出願公開第20170218349号および同第20170211075号もまた参照のこと。本明細書に記載されるDNA結合タンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガー間の適切なリンカーの任意の組合せを含み得る。さらに、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、WO02/077227に記載されている。
標的部位の選択;DNA結合ドメイン、ならびに融合分子(およびそれをコードするポリヌクレオチド)の設計および構築のための方法は、当業者に公知であり、米国特許第6,140,081号;同第5,789,538号;同第6,453,242号;同第6,534,261号;同第5,925,523号;同第6,007,988号;同第6,013,453号;同第6,200,759号;WO95/19431;WO96/06166;WO98/53057;WO98/54311;WO00/27878;WO01/60970;WO01/88197;WO02/099084;WO98/53058;WO98/53059;WO98/53060;WO02/016536およびWO03/016496ならびに米国特許出願公開第20110301073号に詳細に記載されている。
なおさらなる実施形態では、DNA結合ドメインは、機能的ドメインと組み合わせた、DNA結合シングルガイドRNAを含む(例えば、CRISPR/Cas転写因子)。例えば、米国特許第8,697,359号を参照のこと。
B.機能的ドメイン
DNA結合ドメインは、本明細書に記載される遺伝子モジュレーション(例えば、抑圧)において有用な任意の機能的ドメインに作動可能に連結し得る。従って、異種調節(機能的)ドメイン(またはその機能的断片)と関連した本明細書に記載されるDNA結合ドメイン(例えば、ZFPまたはTALE、CRISPR/Cas構成成分、例えばシングルガイドRNA)を含む人工ヌクレアーゼおよび転写因子もまた提供される。一般的なドメインには、例えば、転写因子ドメイン(活性化因子、リプレッサー、共活性化因子、共リプレッサー)、サイレンサー、癌遺伝子(例えば、myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mosファミリーのメンバーなど);DNA修復酵素ならびにそれらの関連の因子およびモディファイアー;DNA再編成酵素ならびにそれらの関連の因子およびモディファイアー;クロマチン関連タンパク質およびそれらのモディファイアー(例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ);ならびにDNA改変酵素(例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ)ならびにそれらの関連の因子およびモディファイアーが含まれる。従って、本発明は、本明細書に記載されるDNA結合ドメインおよび転写調節ドメインを含む人工転写因子、ならびにDNA結合ドメインおよび1つまたは複数のヌクレアーゼドメインを含む人工ヌクレアーゼを提供する。
DNA結合ドメインは、本明細書に記載される遺伝子モジュレーション(例えば、抑圧)において有用な任意の機能的ドメインに作動可能に連結し得る。従って、異種調節(機能的)ドメイン(またはその機能的断片)と関連した本明細書に記載されるDNA結合ドメイン(例えば、ZFPまたはTALE、CRISPR/Cas構成成分、例えばシングルガイドRNA)を含む人工ヌクレアーゼおよび転写因子もまた提供される。一般的なドメインには、例えば、転写因子ドメイン(活性化因子、リプレッサー、共活性化因子、共リプレッサー)、サイレンサー、癌遺伝子(例えば、myc、jun、fos、myb、max、mad、rel、ets、bcl、myb、mosファミリーのメンバーなど);DNA修復酵素ならびにそれらの関連の因子およびモディファイアー;DNA再編成酵素ならびにそれらの関連の因子およびモディファイアー;クロマチン関連タンパク質およびそれらのモディファイアー(例えば、キナーゼ、アセチラーゼおよびデアセチラーゼ);ならびにDNA改変酵素(例えば、メチルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼ、リガーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ)ならびにそれらの関連の因子およびモディファイアーが含まれる。従って、本発明は、本明細書に記載されるDNA結合ドメインおよび転写調節ドメインを含む人工転写因子、ならびにDNA結合ドメインおよび1つまたは複数のヌクレアーゼドメインを含む人工ヌクレアーゼを提供する。
ある特定の実施形態では、機能的ドメインは、転写調節ドメイン、例えば、抑圧ドメインを含む。例示的な抑圧ドメインには、KRAB A/B、KOX、TGF-ベータ誘導性初期遺伝子(TIEG)、v-erbA、SID、MBD2、MBD3、DNMTファミリーのメンバー(例えば、DNMT1、DNMT3A、DNMT3B)、RbおよびMeCP2が含まれるがこれらに限定されない。例えば、Birdら(1999年)Cell 99巻:451~454頁;Tylerら(1999年)Cell 99巻:443~446頁;Knoepflerら(1999年)Cell 99巻:447~450頁;およびRobertsonら(2000年)Nature Genet. 25巻:338~342頁を参照のこと。さらなる例示的な抑圧ドメインには、ROM2およびAtHD2Aが含まれるがこれらに限定されない。例えば、Chemら(1996年)Plant Cell 8巻:305~321頁;およびWuら(2000年)Plant J. 22巻:19~27頁を参照のこと。
本明細書に記載されるDNA結合ドメインと機能的ドメインとの間での融合分子(またはそれをコードする核酸)の形成では、抑圧ドメインまたは抑圧ドメインと相互作用する分子のいずれかが機能的ドメインとして適切であることが、当業者に明らかである。リプレッサー(例えば、タンパク質または複合体)をリクルートすることおよび/または標的遺伝子に対する活性(例えば、ヒストン脱メチル化など)を抑圧することが可能な本質的に任意の分子が、抑圧ドメインとして有用であり、結果的に、特許請求された本発明の実施において使用され得る。融合分子における機能的ドメインとしての使用に適切なインスレータードメイン、局在化ドメインならびにクロマチンリモデリングタンパク質、例えば、ISWI含有ドメインおよび/またはメチル結合ドメインタンパク質は、例えば、米国特許第6,919,204号および同第7,053,264号に記載されている。
転写活性化ドメインの非限定的な例。活性化を達成するのに適切なドメイン(転写活性化ドメイン)には、HSV VP16活性化ドメイン;核ホルモン受容体;核因子カッパBlのp65サブユニット、または人工キメラ機能的ドメイン、例えば、VP64およびデグロンが含まれる。さらなる例示的な活性化ドメインには、Oct1、Oct-2A、Sp1、AP-2およびCTF1ならびにp300、CBP、PCAF、SRC1 PvALF、AtHD2A、ERF-2、OsGAI、HALF-1、C1、AP1、ARF-5、-6、-7および-8、CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP、ならびにTRAB1が含まれる。
ある特定の実施形態では、DNA結合ドメインによって結合される標的部位は、細胞クロマチンのアクセス可能な領域中に存在する。アクセス可能な領域は、例えば、米国特許第6,511,808号に記載されるように決定され得る。標的部位が細胞クロマチンのアクセス可能な領域中に存在しない場合、1つまたは複数のアクセス可能な領域が、WO01/83793に記載されるように生成され得る。さらなる実施形態では、融合分子のDNA結合ドメインは、その標的部位がアクセス可能な領域中にあるかないかにかかわらず、細胞クロマチンに結合することが可能である。例えば、かかるDNA結合ドメインは、リンカーDNAおよび/またはヌクレオソームDNAに結合することが可能である。この型の「パイオニア」DNA結合ドメインの例は、ある特定のステロイド受容体および肝細胞核因子3(HNF3)において見出される。Cordingleyら(1987年)Cell 48巻:261~270頁;Pinaら(1990年)Cell 60巻:719~731頁;およびCirilloら(1998年)EMBO J. 17巻:244~254頁。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるタンパク質および系の少なくとも1つの構成成分は、天然に存在する(例えば、天然に存在する機能的ドメインである)。他の実施形態では、本明細書に記載される組成物は、全ての天然に存在しない、即ち、DNA結合ドメインおよび機能的ドメインにおいて操作された構成成分から構成される。例えば、天然に存在するドメインのDNA結合ドメインは、選択された標的部位に結合するように変更され得る。
ある特定の実施形態では、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子モジュレーターは、CRISPR/Cas転写因子系を構成する。系のRNA構成成分をコードするCRISPR(クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート)遺伝子座、およびタンパク質をコードするcas(CRISPR関連)遺伝子座(Jansenら、2002年. Mol. Microbiol. 43巻:1565~1575頁;Makarovaら、2002年. Nucleic Acids Res. 30巻:482~496頁;Makarovaら、2006年. Biol. Direct 1巻:7頁;Haftら、2005年. PLoS Comput. Biol. 1巻:e60頁)は、CRISPR/Cas系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるCRISPR遺伝子座は、CRISPR関連(Cas)遺伝子、ならびにCRISPR媒介性核酸切断の特異性をプログラミングすることが可能な非コードRNAエレメントの組合せを含有する。
S.pyogenesにおいて最初に記載されたII型CRISPRは、最もよく特徴付けられた系の1つであり、4つの逐次的ステップで、標的化DNA二本鎖破断を実行する。第1に、2つの非コードRNAであるpre-crRNAアレイおよびtracrRNAが、CRISPR遺伝子座から転写される。第2に、tracrRNAが、pre-crRNAのリピート領域にハイブリダイズし、個々のスペーサー配列を含有する成熟crRNAへのpre-crRNAのプロセシングを媒介し、プロセシングは、Cas9タンパク質の存在下で二本鎖特異的RNase IIIによって生じる。第3に、成熟crRNA:tracrRNA複合体が、crRNA上のスペーサーと標的認識のためのさらなる要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)の隣の標的DNA上のプロトスペーサーとの間のワトソン-クリック塩基対合を介して、Cas9を標的DNAに指向させる。さらに、tracrRNAは、crRNAとその3’末端において塩基対合するので、これも存在しなければならず、この会合がCas9活性を誘発する。最後に、Cas9が、標的DNAの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖破断を創出する。CRISPR/Cas系の活性は、3つのステップ:(i)「獲得」と呼ばれるプロセスにおける、さらなる攻撃を防止するための、CRISPRアレイ中へのエイリアンDNA配列の挿入、(ii)関連するタンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシング、その後の、(iii)エイリアン核酸によるRNA媒介性の干渉を含む。従って、細菌細胞では、いわゆる「Cas」タンパク質のいくつかは、CRISPR/Cas系の天然の機能に関与し、例えばエイリアンDNAの挿入などの機能において役割を果たす。
II型CRISPR系は、多くの異なる細菌において見出されている。Fonfaraら((2013年)Nuc Acid Res 42巻(4号):2377~2590頁)による、公に入手可能なゲノムに対するBLAST検索は、347種の細菌においてCas9オルソログを見出した。さらに、このグループは、S.pyogenes、S.mutans、S.therophilus、C.jejuni、N.meningitides、P.multocidaおよびF.novicida由来のCas9オルソログを使用したDNA標的のin vitro CRISPR/Cas切断を実証した。従って、用語「Cas9」とは、1つのDNA結合ドメインおよび2つのヌクレアーゼドメインを含むRNAガイドされるDNAヌクレアーゼを指し、Cas9をコードする遺伝子は、任意の適切な細菌に由来し得る。
野生型Cas9タンパク質は、少なくとも2つのヌクレアーゼドメインを有する:一方のヌクレアーゼドメインは、HNHエンドヌクレアーゼと類似しているが、他方はRuvエンドヌクレアーゼドメインと似ている。HNH型ドメインは、crRNAに対して相補的なDNA鎖の切断を担うようであるが、Ruvドメインは、非相補鎖を切断する。Cas9ヌクレアーゼは、ヌクレアーゼドメインの1つだけが機能的であるように操作され得、Casニッカーゼを創出する(Jinekら、同書を参照のこと)。ニッカーゼは、酵素の触媒ドメイン中のアミノ酸の特異的変異によって、またはそれがもはや機能的でないようなドメインの一部もしくは全ての短縮によって、生成され得る。Cas9は2つのヌクレアーゼドメインを含むので、このアプローチは、いずれかのドメインに対して行われ得る。二本鎖破断は、2つのかかるCas9ニッカーゼの使用によって、標的DNA中で達成され得る。ニッカーゼは、各々がDNAの一方の鎖を切断し、2つの使用は、二本鎖破断を創出する。
crRNA-tracrRNA複合体の必要性は、crRNAおよびtracrRNAのアニーリングによって通常形成されるヘアピンを含む操作された「シングルガイドRNA」(sgRNA)の使用によって回避され得る(Jinekら(2012年)Science 337巻:816頁およびCongら(2013年)Sciencexpress/10.1126/science.1231143を参照のこと)。S.pyrogenesでは、操作されたtracrRNA:crRNA融合物、即ちsgRNAは、二本鎖RNA:DNAヘテロダイマーがCas会合したRNAと標的DNAとの間で形成する場合に、標的DNAを切断するようにCas9を導く。Cas9タンパク質とPAM配列を含有する操作されたsgRNAとを含むこの系は、RNAガイドされるゲノム編集のために使用されており(Ramalingam同書を参照のこと)、ZFNおよびTALENと類似した編集効率で、in vivoでのゼブラフィッシュ胚ゲノム編集のために有用である(Hwangら(2013年)Nature Biotechnology 31巻(3号):227頁を参照のこと)。さらに、CRISPR/Cas転写因子も記載されている。例えば、米国特許第8,697,359号;Platekら(2014年)Plant Biotechnology J. doi: 10.1111/pbi.12284およびPerez-Pineraら(2013年)Nature Methods 10巻:973~976頁)を参照のこと。
キメラまたはsgRNAは、本明細書に記載される転写調節のための任意の所望の標的に対して相補的な配列を含むように操作され得る。一部の実施形態では、ガイド配列は、約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75もしくはそれよりも多くのヌクレオチド長、または約5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、75もしくはそれよりも多くのヌクレオチド長よりも長い。一部の実施形態では、ガイド配列は、約75、50、45、40、35、30、25、20、15、12またはそれよりも少ないヌクレオチド長未満である。ある特定の実施形態では、RNAは、標的に対して相補的で形態G[n19]の22塩基と、その後の形態NGGのプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)とを含む。従って、1つの方法では、sgRNAは、目的の遺伝子におけるDNA結合ドメイン(例えば、ZFP、TALE)の公知の標的の利用によって設計され得る。さらに、sgRNAは、(i)ZFNヘテロダイマーの標的配列を、関連するゲノム(ヒト、マウス、または特定の植物種の)の参照配列とアラインさせること;(ii)ZFNハーフ部位間のスペーサー領域を同定すること;(iii)スペーサー領域に最も近いモチーフG[N20]GGの位置を同定すること(1つよりも多いかかるモチーフがスペーサーと重複する場合、スペーサーに対して中心にくるモチーフが選択される);(iv)そのモチーフをsgRNAのコアとして使用することによって、公知の対になったヌクレアーゼ部位に対して設計され得る。この方法は、証明されたヌクレアーゼ標的に有利に依存する。あるいは、sgRNAは、G[n20]GG式に従う適切な標的配列を単に同定することによって、任意の目的の領域を標的化するように設計され得る。相補的領域と共に、sgRNAは、sgRNAのtracrRNA部分のテイル領域に伸びるさらなるヌクレオチドを含み得る(Hsuら(2013年)Nature Biotech doi:10.1038/nbt.2647を参照のこと)。テイルは、+67~+85ヌクレオチド、またはそれらの間の任意の数のものであり得、好ましい長さは+85ヌクレオチドである。短縮されたsgRNA、「tru-gRNA」もまた使用され得る(Fuら(2014年)Nature Biotech 32巻(3号):279頁を参照のこと)。tru-gRNAでは、相補的領域は、17または18ヌクレオチド長に減少される。
さらに、代替的なPAM配列もまた利用され得、このとき、PAM配列は、S.pyogenesのCas9を使用するNGG(Hsu、2014年、同書)に対する代替法として、NAGであり得る。さらなるPAM配列には、最初のGを欠如するものも含まれ得る(SanderおよびJoung(2014年)Nature Biotech 32巻(4号):347頁)。S.pyogenesにコードされるCas9 PAM配列に加えて、他の細菌供給源由来のCas9タンパク質に対して特異的な他のPAM配列が使用され得る。例えば、以下に示されるPAM配列(SanderおよびJoung、同書、ならびにEsveltら(2013年)Nat Meth 10巻(11号):1116頁から適応させた)は、これらのCas9タンパク質に対して特異的である:
種 PAM
S.pyogenes NGG
S.pyogenes NAG
S.mutans NGG
S.thermophilius NGGNG
S.thermophilius NNAAAW
S.thermophilius NNAGAA
S.thermophilius NNNGATT
C.jejuni NNNNACA
N.meningitides NNNNGATT
P.multocida GNNNCNNA
F.novicida NG
種 PAM
S.pyogenes NGG
S.pyogenes NAG
S.mutans NGG
S.thermophilius NGGNG
S.thermophilius NNAAAW
S.thermophilius NNAGAA
S.thermophilius NNNGATT
C.jejuni NNNNACA
N.meningitides NNNNGATT
P.multocida GNNNCNNA
F.novicida NG
従って、S.pyogenes CRISPR/Cas系との使用のための適切な標的配列は、以下のガイドラインに従って選択され得る:[n17、n18、n19またはn20](G/A)G。あるいは、PAM配列は、ガイドラインG[n17、n18、n19、n20](G/A)Gに従い得る。非S.pyogenes細菌に由来するCas9タンパク質について、同じガイドラインが使用され得、このとき、代替的PAMが、S.pyogenes PAM配列を置換する。
潜在的なオフターゲット配列を回避する、特異性の可能性が最も高い標的配列を選択することが最も好ましい。これらの望ましくないオフターゲット配列は、以下の性状を考慮することによって同定され得る:i)利用されるCas9タンパク質と共に機能することが公知のPAM配列が後に続く標的配列中の類似性:ii)所望の標的配列から3つ未満のミスマッチを有する類似の標的配列;iii)ii)と類似の標的配列であって、ミスマッチがPAM近位領域ではなくPAM遠位領域中に全て位置する(「シード」領域と呼ばれることもある、PAMに直接隣接するまたは近位のヌクレオチド1~5(Wuら(2014年)Nature Biotech doi:10.1038/nbt2889)が認識にとって最も重要であるといういくつかの証拠が存在し、従って、シード領域中に位置するミスマッチを有する推定オフターゲット部位は、sgRNAによって認識される可能性が最も低い場合がある);およびiv)ミスマッチが、連続して間隔を空けられることがない、または4ヌクレオチドよりも大きく間隔を空けられる、類似の標的配列(Hsu、2014年、同書)。従って、どのCRIPSR/Cas系が用いられていても、ゲノム中の潜在的なオフターゲット部位の数の分析を実施することによって、上記これらの基準を使用して、sgRNAに適切な標的配列が同定され得る。
一部の実施形態では、CRISPR-Cpf1系が使用される。Francisella sppにおいて同定されたCRISPR-Cpf1系は、ヒト細胞においてロバストなDNA干渉を媒介するクラス2 CRISPR-Cas系である。機能的に保存されてはいるが、Cpf1およびCas9は、それらのガイドRNAおよび基質特異性においてを含む多くの態様において異なる(Fagerlundら、(2015年)Genom Bio 16巻:251頁を参照のこと)。Cas9タンパク質とCpf1タンパク質との間の主な差異は、Cpf1がtracrRNAを利用せず、従って、crRNAのみを必要とするということである。FnCpf1 crRNAは、42~44ヌクレオチド長(19ヌクレオチドのリピートおよび23~25ヌクレオチドのスペーサー)であり、単一のステム-ループを含有し、これにより、二次構造を保持する配列変化を許容する。さらに、Cpf1 crRNAは、Cas9によって必要とされる約100ヌクレオチドよりも顕著に短い操作されたsgRNAであり、FnCpflのためのPAM要件は、変位させた鎖上の5’-TTN-3’および5’-CTA-3’である。Cas9およびCpf1は共に、標的DNA中に二本鎖破断を作製するが、Cas9は、ガイドRNAのシード配列内に平滑末端カットを作製するためにそのRuvC様およびHNH様ドメインを使用する一方で、Cpf1は、シードの外側に粘着カットを産生するためにRuvC様ドメインを使用する。Cpf1は、重要なシード領域から離れて粘着カットを作製するので、NHEJは標的部位を破壊せず、従って、所望のHDR組換え事象が生じるまで、Cpf1が同じ部位をカットし続けることができることを確実にする。従って、本明細書に記載される方法および組成物では、用語「Cas」は、Cas9タンパク質およびCpf1タンパク質の両方を含むと理解される。従って、本明細書で使用する場合、「CRISPR/Cas系」とは、ヌクレアーゼおよび/または転写因子系の両方を含む、CRISPR/Casおよび/またはCRISPR/Cpf1系の両方を指す。
ある特定の実施形態では、Casタンパク質は、天然に存在するCasタンパク質の「機能的誘導体」であり得る。ネイティブ配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、ネイティブ配列ポリペプチドと共通する質的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」には、ネイティブ配列の断片、ならびにネイティブ配列ポリペプチドの誘導体およびその断片が含まれるがこれらに限定されないが、ただし、それらは、対応するネイティブ配列ポリペプチドと共通する生物学的活性を有するものとする。本明細書で企図される生物学的活性は、DNA基質を断片へと加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドの両方のアミノ酸配列バリアント、共有結合的改変、およびそれらの融合物を包含する。一部の態様では、機能的誘導体は、天然に存在するCasタンパク質の単一の生物学的特性を含み得る。他の態様では、機能的誘導体は、天然に存在するCasタンパク質の生物学的特性のサブセットを含み得る。Casポリペプチドの適切な誘導体またはそれらの断片には、Casタンパク質の変異体、融合物、共有結合的改変、またはそれらの断片が含まれるがこれらに限定されない。Casタンパク質またはその断片、ならびにCasタンパク質の誘導体またはその断片を含むCasタンパク質は、細胞から取得可能でありもしくは化学的に合成され、またはこれらの2つの手順の組合せによって取得可能であり得る。細胞は、Casタンパク質を天然に産生する細胞、またはCasタンパク質を天然に産生し、内因性Casタンパク質をより高い発現レベルで産生するようにもしくは外因性に導入された核酸からCasタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞であり得、この核酸は、内因性Casと同じまたは異なるCasをコードする。一部の例では、細胞は、Casタンパク質を天然には産生せず、Casタンパク質を産生するように遺伝子操作される。
特異的遺伝子に標的化される例示的なCRISPR/CasシングルガイドRNAは、例えば、米国特許出願公開第20150056705号に開示されている。
従って、本明細書に記載される組成物および系は、細胞中に導入された場合に、組成物(または系)がPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子発現をモジュレートするように、選択された遺伝子中の1つまたは複数の標的部位に特異的に結合する1つまたは複数のDNA結合ドメインおよび少なくとも1つの機能的ドメインを含む。
標的部位
上に詳細に記載したように、本明細書に記載される人工ヌクレアーゼおよび/または転写因子のDNA結合ドメインは、選択された任意の配列に結合するように操作され得る。操作されたDNA結合ドメインは、天然に存在するDNA結合ドメインと比較して、新規の結合特異性を有し得る。ある特定の実施形態では、DNA結合ドメインは、本明細書(例えば、表1、3、5、7、11、13、14および16)に示される標的部位の配列または12もしくはそれよりも多くの塩基対(連続または非連続)に結合するDNA結合ドメインを含め、本明細書に記載される肝臓特異的遺伝子内の配列、例えば、標的部位(典型的には、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21またはさらにはそれよりも多くの塩基対)に結合する。操作方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的設計には、例えば、三つ組(または四つ組)ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列を結合するジンクフィンガーの1つまたは複数のアミノ酸配列と会合する。例えば、それらの全体が本明細書に参照により組み込まれる、共有の米国特許第6,453,242号および同第6,534,261号を参照のこと。TALエフェクタードメインおよびシングルガイドRNAの合理的設計もまた公知である。例えば、米国特許第8,771,985号および米国特許出願公開第20150056705号を参照のこと。
上に詳細に記載したように、本明細書に記載される人工ヌクレアーゼおよび/または転写因子のDNA結合ドメインは、選択された任意の配列に結合するように操作され得る。操作されたDNA結合ドメインは、天然に存在するDNA結合ドメインと比較して、新規の結合特異性を有し得る。ある特定の実施形態では、DNA結合ドメインは、本明細書(例えば、表1、3、5、7、11、13、14および16)に示される標的部位の配列または12もしくはそれよりも多くの塩基対(連続または非連続)に結合するDNA結合ドメインを含め、本明細書に記載される肝臓特異的遺伝子内の配列、例えば、標的部位(典型的には、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21またはさらにはそれよりも多くの塩基対)に結合する。操作方法には、合理的設計および種々の型の選択が含まれるがこれらに限定されない。合理的設計には、例えば、三つ組(または四つ組)ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースを使用することが含まれ、ここで、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列を結合するジンクフィンガーの1つまたは複数のアミノ酸配列と会合する。例えば、それらの全体が本明細書に参照により組み込まれる、共有の米国特許第6,453,242号および同第6,534,261号を参照のこと。TALエフェクタードメインおよびシングルガイドRNAの合理的設計もまた公知である。例えば、米国特許第8,771,985号および米国特許出願公開第20150056705号を参照のこと。
送達
ヌクレアーゼ、転写因子および/または導入遺伝子(例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1阻害剤)は、任意の適切な手段によって任意の細胞型中に、好ましくは肝臓に(全身的にまたは肝送達を介して)、in vivoまたはex vivoで送達され得る。同様に、標的化組み込みのためにヌクレアーゼと組み合わせて使用される場合、ヌクレアーゼは、例えば、非ウイルスベクター、ウイルスベクターを使用してポリヌクレオチドおよび/もしくはタンパク質形態で、ならびに/またはRNA形態で、例えばmRNAとして、送達され得る。
ヌクレアーゼ、転写因子および/または導入遺伝子(例えば、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1阻害剤)は、任意の適切な手段によって任意の細胞型中に、好ましくは肝臓に(全身的にまたは肝送達を介して)、in vivoまたはex vivoで送達され得る。同様に、標的化組み込みのためにヌクレアーゼと組み合わせて使用される場合、ヌクレアーゼは、例えば、非ウイルスベクター、ウイルスベクターを使用してポリヌクレオチドおよび/もしくはタンパク質形態で、ならびに/またはRNA形態で、例えばmRNAとして、送達され得る。
核酸の非ウイルス送達の方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、他のナノ粒子、ポリカチオンまたは脂質:核酸コンジュゲート、ネイキッドDNA、人工ビリオン、およびDNAの薬剤増強性の取込みが含まれる。例えばSonitron 2000系(Rich-Mar)を使用するソノポレーション(sonoporation)もまた、核酸の送達に使用され得る。さらなる例示的な核酸送達系には、AmaxaBiosystems(Cologne、Germany)、Maxcyte,Inc.(Rockville、Maryland)、BTX Molecular Delivery Systems(Holliston、MA)およびCopernicus Therapeutics Inc.によって提供されるものが含まれる(例えば、US6008336を参照のこと)。
好ましい実施形態では、発現構築物はAAVベクターである。任意選択のヌクレアーゼは、mRNAの形態で、または1つもしくは複数のウイルスベクター(AAV、Adなど)を使用して、投与され得る。投与は、ポリヌクレオチドが所望の標的細胞に送達される任意の手段によってであり得る。in vivoおよびex vivoの両方の方法が企図される。門静脈への静脈内注射は、投与の好ましい方法である。他のin vivo投与様式には、例えば、肝臓の葉もしくは胆管中への直接的注射、および肝動脈を介するものを含む、肝臓に対して遠位の静脈内注射、肝臓実質中への直接的注射、肝動脈を介した注射、および/または胆樹を介した逆行性注射が含まれる。ex vivo様式の投与には、摘出された肝細胞または肝臓の他の細胞のin vitro形質導入と、その後の、ヒト患者の門脈脈管構造、肝臓実質または胆樹中への形質導入された摘出された肝細胞の戻し注入が含まれる。例えば、Grossmanら、(1994年)Nature Genetics、6巻:335~341頁を参照のこと。
1つよりも多いポリヌクレオチド(例えば、本明細書に記載される構築物およびポリヌクレオチド形態のヌクレアーゼ)の送達を含む系では、2つまたはそれよりも多くのポリヌクレオチドが、1つまたは複数の同じおよび/または異なるベクターを使用して送達される。例えば、ポリヌクレオチド形態のヌクレアーゼは、mRNAの形態で送達され得、本明細書に記載される肝臓特異的構築物は、他のモダリティ、例えば、ウイルスベクター(例えば、AAV)、ミニサークルDNA、プラスミドDNA、直鎖DNA、リポソーム、ナノ粒子などを介して送達され得る。
薬学的に許容される担体は、投与される特定の組成物によって、ならびに組成物を投与するために使用される特定の方法によって、一部決定される。従って、以下に記載されるような、医薬組成物の広範な種々の適切な製剤が利用可能である(例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第17版、1989年を参照のこと)。
投与される発現カセット(ならびに任意選択のヌクレアーゼおよび/または改変された細胞)の有効量は、患者ごとに変動する。従って、有効量は、組成物(例えば、細胞)を投与する医師によって最良に決定され、適切な投薬量は、当業者によって容易に決定され得る。治療的ポリペプチドの血清または他の組織レベルの分析、および投与前の初期レベルとの比較は、投与されている量が低すぎるか、正しい範囲内か、高すぎるかを決定できる。初回および引き続く投与のための適切なレジームも変動し得るが、初回投与とその後の必要に応じた引き続く投与によって代表される。引き続く投与は、毎日から毎年から数年ごとまでの範囲の、変動する間隔で投与され得る。当業者は、適切な免疫抑制技術が、送達ベクターの免疫抑制によって形質導入の阻害または遮断を回避するために推奨され得ることを理解する。例えば、Vilquinら、(1995年)Human Gene Ther.、6巻:1391~1401頁を参照のこと。
ex vivoおよびin vivoの両方の投与のための製剤には、液体または乳化された液体中の懸濁液(例えば、遺伝子改変された細胞、リポソームまたはナノ粒子の)が含まれる。活性成分は、薬学的に許容され、活性成分と適合性の賦形剤と混合される場合が多い。適切な賦形剤には、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組合せが含まれる。さらに、組成物は、微量の補助物質、例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤、安定化剤または医薬組成物の有効性を増強する他の試薬を含有し得る。
用途
本明細書に開示される方法および組成物は、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1阻害性導入遺伝子の提供を介するもの(転写因子、ヌクレアーゼなど)を含め、内因性PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子の発現をモジュレートすることによって、任意のPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1関連障害に対する治療を提供する際に有用である。さらに、方法および組成物は、かかる障害の処置または予防のための、変異体PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子のノックアウト、および野生型PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1 cDNAの提供のための方法を提供する。細胞は、in vivoで改変され得るまたはex vivoで改変され、引き続いて、対象に投与され得る。従って、方法および組成物は、かかるPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1関連障害の処置および/または予防を提供する。従って、本明細書に記載される組成物および方法は、例えば、TTR媒介性アミロイドーシス、A1AT欠損症、遺伝性血管性浮腫、家族性高コレステロール血症/スタチン耐性高コレステロール血症および高シュウ酸尿症を含む障害を処置または予防するために使用され得る。
本明細書に開示される方法および組成物は、PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1阻害性導入遺伝子の提供を介するもの(転写因子、ヌクレアーゼなど)を含め、内因性PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子の発現をモジュレートすることによって、任意のPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1関連障害に対する治療を提供する際に有用である。さらに、方法および組成物は、かかる障害の処置または予防のための、変異体PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子のノックアウト、および野生型PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1 cDNAの提供のための方法を提供する。細胞は、in vivoで改変され得るまたはex vivoで改変され、引き続いて、対象に投与され得る。従って、方法および組成物は、かかるPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1関連障害の処置および/または予防を提供する。従って、本明細書に記載される組成物および方法は、例えば、TTR媒介性アミロイドーシス、A1AT欠損症、遺伝性血管性浮腫、家族性高コレステロール血症/スタチン耐性高コレステロール血症および高シュウ酸尿症を含む障害を処置または予防するために使用され得る。
以下の実施例は、任意選択で使用されるヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)またはCRISPR/Cas系を含む、本開示の例示的な実施形態を含む。これが例証のみを目的としており、他のヌクレアーゼ、例えば、本明細書に記載される標的部位に結合する操作されたDNA結合ドメインを有するTALEN、ホーミングエンドヌクレアーゼ(メガヌクレアーゼ)、ならびに/または天然に存在するもしくは操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ(メガヌクレアーゼ)DNA結合ドメインおよび異種切断ドメインの融合物、ならびに/またはメガヌクレアーゼおよびTALEタンパク質の融合物が使用され得ることが理解される。さらに、本明細書に記載される発現構築物は、不十分なタンパク質産生によって引き起こされる障害の処置および/または予防において同じ結果を生じるために、(AAV以外の)他のベクター上にあってもよいことが理解される。
(実施例1)
PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子をモジュレートする組成物の設計、構築および一般的特徴付け
PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子をモジュレートする組成物の設計、構築および一般的特徴付け
Urnovら(2005年)Nature 435巻(7042号):646~651頁、Perezら(2008年)Nature Biotechnology 26巻(7号):808~816頁に本質的に記載され、米国特許第8,586,526号および同第6,534,261号に記載されるように、転写調節またはヌクレアーゼドメインに作動可能に連結した、マウスまたはヒトのいずれかのPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子に結合するジンクフィンガー、CasおよびTALEタンパク質を設計し、プラスミド、AAVもしくはアデノウイルスベクター中に取り込み、またはmRNAにする。
CRISPR/Cas系における使用のためのsgRNAを、当該分野で公知の方法によって合成により作製する(Hsuら、(2013年)Nature Biotech doi:10.1038/nbt.2647またはSternbergら、(2014年)Nature 507巻:62頁を参照のこと)。sgRNAを、上記のように操作し、内因性PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子中の配列(例えば、本明細書に示される標的配列)を標的化するように設計する。
ヒトまたはマウスのPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1特異的ヌクレアーゼを、mRNAとしてヒト細胞(例えば、K562)またはマウス細胞中に導入し、切断活性について分析する。簡潔に述べると、細胞に、標準的なプロトコールに従って、BTX96ウェルエレクトロポレーター(BTX)を使用して2つの用量のmRNA(2つのZFNの合計で2または6μg)をトランスフェクトする。次いで、細胞を、さらに7日間拡大増殖させる。細胞を7日目に取り出し、ディープシークエンシング(Miseq、Illumina)を使用して、オンターゲットPCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1改変について分析する。
PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1特異的CRISPR/Cas実験について、Cas9をpVAXプラスミド上で供給し、sgRNAを、U6プロモーターの制御下でプラスミド上で供給する。プラスミドを、100ngの各々または400ngの各々のいずれかで混合し、1実行あたり2e5の細胞で混合する。Amaxa系を使用して細胞をトランスフェクトする。簡潔に述べると、Amaxaトランスフェクションキットを使用し、核酸を、標準的なAmaxaシャトルプロトコールを使用してトランスフェクトする。トランスフェクション後、細胞を室温で10分間休ませ、次いで、予め加温したRPMI中に再懸濁する。次いで、細胞を、37℃で標準的条件で成長させる。ゲノムDNAをトランスフェクションの7日後に単離し、MiSeq分析に供する。
全てのヌクレアーゼがそれらの標的部位に結合し、(標的遺伝子の切断において)機能的に活性であることが見出された。
(実施例2)
PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子発現をモジュレートする組成物の設計、構築および一般的特徴付け
PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1に標的化されたジンクフィンガータンパク質を、Zhangら(2000年)J Biol Chem 275巻(43号):33850~33860頁に本質的に記載されるように操作した。ZFPを評価したところ、それらの標的部位に結合し、それを切断することが示された。リンカーおよびZFN構造は、以前に記載されている(米国特許出願公開第20170218349号および同第20170211075号)。例えば、リンカーL0はLRGSQLVKS(配列番号139)であり、リンカーN7aはSGTPHEVGVYTL(配列番号140)であり、リンカーN6aはSGAQGSTLDF(配列番号141)であり、リンカーL8c4はLRGSYAPMPPLALASP(配列番号142)である。
PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1遺伝子発現をモジュレートする組成物の設計、構築および一般的特徴付け
PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1またはHAO1に標的化されたジンクフィンガータンパク質を、Zhangら(2000年)J Biol Chem 275巻(43号):33850~33860頁に本質的に記載されるように操作した。ZFPを評価したところ、それらの標的部位に結合し、それを切断することが示された。リンカーおよびZFN構造は、以前に記載されている(米国特許出願公開第20170218349号および同第20170211075号)。例えば、リンカーL0はLRGSQLVKS(配列番号139)であり、リンカーN7aはSGTPHEVGVYTL(配列番号140)であり、リンカーN6aはSGAQGSTLDF(配列番号141)であり、リンカーL8c4はLRGSYAPMPPLALASP(配列番号142)である。
ヌクレアーゼを、K562細胞において活性について試験し、ここで、パートナーヌクレアーゼをコードする各mRNA 2μgを、100μLのトランスフェクション体積で添加した。全てのタンパク質がそれらの標的に結合し、切断を誘導した。対の組合せの例示的な結果を以下の表2に示し、表中、「%インデル」は活性を示す。%インデルを、ディープシークエンシング(MiSeq、Illumnia)によって測定し、次いで、切断部位において挿入および/または欠失を含む対立遺伝子のパーセントについて分析した。表2は、これらの例示的なZFN対が全て活性であったことを実証している。
M.mulatta PCSK9遺伝子を標的化するヌクレアーゼを、Rhesus macaque細胞系MK2において活性について試験した。例示的な対の組合せの結果を、以下の表4に示す。全てのタンパク質がそれらの標的に結合し、切断を誘導した。ヌクレアーゼ対の各パートナーをコードするmRNAの総用量が示され、これを、100μLのトランスフェクション体積で添加した。活性を、ディープシークエンシング(MiSeq、Illumnia)によって測定した%インデルとして示し、次いで、切断部位において挿入および/または欠失を含む対立遺伝子のパーセントについて分析する。
上に示されるマウスPCSK9遺伝子(mPCSK9)を標的化するヌクレアーゼを、0.1ugの総ZFN mRNA用量でマウス肝臓細胞系Hepa1-6において活性について試験した。このとき、用量の半分は、各個々のZFNである。ZFNを、100μLのトランスフェクション体積で添加した。全てのタンパク質がそれらの標的に結合し、切断を誘導した。対の組合せの例示的な活性(%インデル)結果を、図6に示される特異的部位において、以下の表6A~6Gに示す。%インデルを、ディープシークエンシング(MiSeq、Illumnia)によって測定し、次いで、切断部位において挿入および/または欠失を含む対立遺伝子のパーセントについて分析した。
形質導入されたHepa1-6細胞上清中の分泌されたmPCSK9タンパク質の%インデルとノックダウンとの間の相関を計算する。2つの用量を評価し(低用量は0.5ugの総ZFN mRNA用量であり、高用量は4ugの総ZFN mRNA用量である)、mPCSK9タンパク質濃度を、形質導入の3日後(「3DPT」)にELISAによって測定する。分析は、ZFNによって誘導されたパーセントインデルと相関する、上清中のmPCSK9濃度における減少を実証している。
II.SERPINAのヌクレアーゼ標的化
ジンクフィンガーヌクレアーゼを、Z変異(図1)、表7の位置に隣接するSERPINA遺伝子を切断するように設計した(Yusaら(2011年)Nature 478巻(7369号):391~394頁もまた参照のこと)。ジンクフィンガータンパク質を、HepG2細胞およびK562細胞において試験した。結果を以下の表8に示す。「リンカー」は、DNA結合ドメインが、DNA結合ドメインのN末端においてFokIヌクレアーゼドメインに付着されることを示す。
ジンクフィンガーヌクレアーゼを、Z変異(図1)、表7の位置に隣接するSERPINA遺伝子を切断するように設計した(Yusaら(2011年)Nature 478巻(7369号):391~394頁もまた参照のこと)。ジンクフィンガータンパク質を、HepG2細胞およびK562細胞において試験した。結果を以下の表8に示す。「リンカー」は、DNA結合ドメインが、DNA結合ドメインのN末端においてFokIヌクレアーゼドメインに付着されることを示す。
次いで、例示的なZFNを、「Z」変異を担うG→A変異を修正するオリゴヌクレオチドドナーと組み合わせて使用した。さらに、オリゴヌクレオチドは、一度組み込まれたオリゴヌクレオチドの切断を防止するZFN標的配列中のサイレントなヌクレオチド変更を含んだ(図1B)。特に、SBS番号25264のフィンガー2および4によって認識されるヌクレオチド(それぞれ、TCAおよびCGA)を、これらの三つ組がTGAおよびCAAになるように変更する(バリアントSMS24)。これらの新たな配列は、SBS番号25264のZFNによってはもはや標的化されず、従って、一旦オリゴヌクレオチドが組み込まれると、切断はもはや生じない。このSMS24 SERPINA1バリアントオリゴヌクレオチドは、切断部位に隣接するSERPINA1配列に対して相同な相同性アームもまた含んだ。SMS24バリアントオリゴヌクレオチドをSERPINA1特異的ZFNと共に使用した場合、オリゴヌクレオチドの標的化組み込みは、HepG2細胞における対立遺伝子のおよそ4%およびK562細胞における対立遺伝子の25%で生じた(表9を参照のこと)。
次に、修正的オリゴヌクレオチドおよびSERPINA1特異的ZFNを、その生殖系列中に組み込まれたヒトSERPINA1遺伝子のPiZバリアントおよそ10コピーを含む株であるPiZマウス(Carlsonら(1989年)J. Clin Invest. 83巻:1183~1190頁)においてin vivoで試験した。PiZマウスは、変異体ヒトSERPINA1(「SA1-ATZ」)についてトランスジェニックであり、肝細胞におけるATZ蓄積および肝臓線維症を示す。SMS24オリゴヌクレオチドおよびZFN対は共に、静脈内経路を介してAAV8ベクターによって送達し、マウスの群を、分子的、組織学的および生化学的分析のために、処置の2週間後および6ヶ月後に屠殺した。未処置の年齢/性別が一致したPiZマウスを、対照として使用した。表10は、実験の概要および注射スケジュールを示す。
実験中の各コホートの半分を、注射の2週間後に屠殺し、肝臓組織を、切断部位におけるNHEJまたは標的化組み込み(TI)を有する対立遺伝子のパーセントについて調査した。結果は、より高い用量のZFNが、増加した切断活性をもたらし(図2A)、オリゴヌクレオチドドナーの存在下でのより高い用量のZFNが、より高い量のTIをもたらす(図2B)ことを実証した。注射の6ヶ月後に、コホートの残り半分を屠殺した。肝臓分析により、2週間よりも6ヶ月の時点において、全てのコホートにおいて、NHEJ活性を示す対立遺伝子のより大きいパーセントが存在したことが示された(図3C)。NHEJ保有細胞のパーセントにおける明確な増加は、PiZ対立遺伝子のノックアウトを保有する細胞についての選択的利点を示し得る。対照的に、修正的オリゴを含む検出されたTIの量は、2週間の時点の試料と顕著には異ならなかった(図3B)。より具体的には、処置の2週間後に、肝SA1-ATZ遺伝子プールのディープシークエンシングは、低用量または高用量のrAAV-ZFNを受けているマウスにおいて、それぞれ8+4%または23+8%の非相同末端結合(NHEJ)を示した。rAAV-TIを低用量または高用量のrAAV-ZFNと共に共投与した場合、正常AAT配列の標的化挿入(TI)による遺伝子修復は、0.25+0.2%および0.5+0.4のSA1-ATZ遺伝子において生じた。ZFN処置は、6ヶ月の時点で肝臓中のPiZ小球含有肝細胞の数を低減させ、これは、ジアスターゼ/過ヨウ素酸シッフ染色によってアッセイされる、ゲノム編集された肝細胞による肝臓再増殖を示している。この時点で、血清ヒトATZレベルは、対照と比較して、低用量群および高用量群においてそれぞれ30+6および40+5%減退した。処置の6ヶ月後に、SA1-ATZ遺伝子中にNHEJを有する細胞の百分率は、低用量または高用量のrAAV-ZFNのレシピエントのそれぞれ64+8%および58+20%に増加した。高用量rAAV-ZFN+rAAV-TIを受けているマウスでは、SA1-ATZ遺伝子の最大で1.7%が遺伝子修正を示した。並行して、血清ATZレベルは、低用量および高用量のrAAV-ZFNレシピエントにおいてそれぞれ47%および70%減退し、シリウスレッド染色によって測定した肝臓線維症は、対照と比較して大きく低減された。
従って、SA1-ATZ導入遺伝子のin vivoでのヌクレアーゼ媒介性編集は、PiZマウス肝細胞に増殖利益を提供して、肝臓を大幅に再増殖させ肝線維症を逆転させるようであり、このことは、ATDに対する治療剤としてのその使用を示している。
III.TTRのヌクレアーゼ標的化
TTR特異的ジンクフィンガータンパク質を上記のように作製して、マウスおよびヒトのTTRを標的化した。TTR遺伝子中のいくつかの領域を、潜在的な標的化のために同定した(例えば、図4を参照のこと)。例示的なタンパク質ならびに標的部位および例示的なリンカーおよびFokI変異を、以下の表11に示す。
TTR特異的ジンクフィンガータンパク質を上記のように作製して、マウスおよびヒトのTTRを標的化した。TTR遺伝子中のいくつかの領域を、潜在的な標的化のために同定した(例えば、図4を参照のこと)。例示的なタンパク質ならびに標的部位および例示的なリンカーおよびFokI変異を、以下の表11に示す。
全てのマウス特異的ヌクレアーゼを、B16-F10細胞(図5A)、初代マウス肝細胞(図5B)またはHepa1-6細胞(図8Aおよび8B)において試験したところ、活性であることが見出された。mTTRエクソン1、部位C(59919/59642)およびエクソン2、部位H(59771/59245)を標的化するリードZFNを、ヒトApoEエンハンサーおよびヒトSERPINA1プロモーターを含有する個々のAAV発現カセットベクター中にクローニングし、次いで、血清型AAV8中にパッケージングした。次いで、AAV ZFNを、高用量(マウス1匹あたりZFNあたり1.5e11vg)または低用量(マウス1匹あたりZFNあたり2.5e10vg)で野生型C57BL6マウス中に静脈内注射し、28日後に肝臓を遺伝子改変のために回収し、血漿をmTTRタンパク質ノックダウンについて分析した。図6Aは、肝臓内でのロバストな編集を示すが、図6Bは、mTTR標的化されたZFN AAVベクターに特異的な循環mTTRタンパク質ノックダウンの高いレベルを示している。
全てのヒト特異的ZFNをヒト肝臓細胞系HepG2において試験したところ、活性であることが見出された(例示的な対の活性については、以下の表12を参照のこと)。簡潔に述べると、用量の半分が各個々のZFNである総ZFN mRNA用量を、表12に示し、これを、100μLのトランスフェクション体積で添加した。全てのタンパク質がそれらの標的に結合し、切断を誘導した。遺伝子のエクソン1およびエクソン3を結合するZFNの対の組合せの例示的な活性(%インデル)結果。%インデルを、ディープシークエンシング(MiSeq、Illumnia)によって測定し、次いで、切断部位において挿入および/または欠失を含む対立遺伝子のパーセントについて分析した。
マウスTTR遺伝子(mTTR)を結合するZFNの特異性を決定するために、ZFN対を、B16-F10細胞において以前に記載された方法(Tsaiら(2015年)Nat Biotechnol 33巻:187~197頁)と類似の方法を使用した候補オフターゲット部位の不偏同定に供した。簡潔に述べると、B16-F10細胞に、BTXエレクトロポレーションデバイスを使用して、ZFNをコードするmRNA、ならびにバーコード化ssDNAオリゴをエレクトロポレートして、二本鎖DNA切断、およびssDNAオリゴのNHEJ媒介性組み込みを受けた部位の不偏同定を可能にした。次いで、Miseq次世代シーケンシング(NGS)によって組み込まれたオリゴを含有すると同定された見出された上位24の部位を、リポフェクションを介してZFN mRNAで形質導入した初代マウス肝細胞において確認した(図5B)。ZFN処置したマウス肝細胞由来のゲノムDNAを、潜在的ZFN結合部位を取り囲むおよそ200bpのアンプリコンを生成するPCRによって増幅した。等モルライブラリーを構築するために、PCR産物を、C1000 Thermal Cycler(BIO-RAD)でのIlluminaシーケンシングプラットフォームのためのKAPA Library Quantification Kit(KAPABIOSYSTEMS)を用いて定量し、MiSeq Reagent v.3(Illumina)を使用するMiSeq Illumina Platformで配列決定した。次いで、挿入ならびに欠失および挿入(インデル)の定量を実施した。簡潔に述べると、生のペアードエンド読み出しを接合し、特異的ゲノム標的配列とアラインさせた。ZFN標的部位を包含する40bp領域内に位置する≧1bpのインデルを有する配列を、ヌクレアーゼ誘導されたゲノム改変とみなした。GFPコードmRNAをエレクトロポレートした対照と比較して、ボンフェローニp値≦0.05を生じた全ての部位を、オフターゲット部位とみなした。
触媒活性または潜在的に非特異的なDNA結合のいずれかに影響を与えるFokIに対する変異(米国特許出願第15/685,580号)と同様に、ジンクフィンガー骨格中およびFokIドメイン中の両方における、ゲノムDNAへの非特異的結合を受けるZFP内の残基に対する改変を、いくつかのZFNにおいて変異させた(1~6残基におけるRからQへの変化)。作製した変異を、以下、以下の表13に示す。
次いで、これらのバリアントを、オンターゲットおよびオフターゲット切断活性について試験した。図8Aは、Hepa1-6細胞における、59771/59790対に起源するリード変異体ZFNのオンターゲット活性を示す。図8Bは、これらのリードZFNについて同定された上位3つのオフターゲット部位のインデル合計を示し、変異体ZFNについて、オフターゲット切断における減少を実証している。
活性を上記のように分析し、以下の表15に示す。総ZFN mRNA用量は、用量の半分が各個々のZFNであることを意味する。これを、100μLのトランスフェクション体積で添加した。全てのタンパク質がそれらの標的に結合し、切断を誘導した。遺伝子のエクソン4を結合するZFNの対の組合せの例示的な活性(%インデル)結果。%インデルを、ディープシークエンシング(MiSeq、Illumnia)によって測定し、次いで、切断部位において挿入および/または欠失を含む対立遺伝子のパーセントについて分析した。
V.KLKB1のヌクレアーゼ標的化
以下の表16に示されるKLKB1特異的ジンクフィンガータンパク質を上記のように作製して、マウスKLKB1を標的化した。KLKB1遺伝子中のいくつかのエクソンを、マウス肝臓細胞系Hepa1-6における標的化のために選択した。
以下の表16に示されるKLKB1特異的ジンクフィンガータンパク質を上記のように作製して、マウスKLKB1を標的化した。KLKB1遺伝子中のいくつかのエクソンを、マウス肝臓細胞系Hepa1-6における標的化のために選択した。
示される全てのヌクレアーゼがそれらの標的部位に結合し、活性であった。以下の表17は、100μLのトランスフェクション体積で添加した各ZFN mRNAを1:1の質量比で使用した、個々のZFN mRNA用量を示す、示された対の活性を示している。全てのタンパク質がそれらの標的に結合し、切断を誘導した。遺伝子の種々のコード領域を結合するZFNの対の組合せの例示的な活性(%インデル)結果。%インデルを、ディープシークエンシング(MiSeq、Illumnia)によって測定し、次いで、切断部位において挿入および/または欠失を含む対立遺伝子のパーセントについて分析した。
本明細書で言及される全ての特許、特許出願および刊行物は、それらの全体が本明細書に参照により組み込まれる。
本開示は、理解の明確さを目的として例示および例としていくらか詳細に提供されてきたが、種々の変化および改変が、本開示の精神または範囲から逸脱することなく実施され得ることが、当業者に明らかである。従って、上述の説明および例は、限定として解釈すべきではない。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
内因性PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子の発現が野生型と比較して変更された、肝臓細胞。
(項目2)
前記内因性遺伝子の配列が、DNA結合ドメインおよび切断ドメインを含む少なくとも1つのヌクレアーゼを使用して前記遺伝子を切断することによって変更される、項目1に記載の肝臓細胞。
(項目3)
前記DNA結合ドメインが、前記内因性遺伝子中の標的部位に結合する、項目2に記載の肝臓細胞。
(項目4)
前記標的部位が、表1、3、5、7、11、13、14および16に示される標的部位の少なくとも12ヌクレオチドを含む、項目3に記載の肝臓細胞。
(項目5)
外因性配列を、切断された前記内因性遺伝子中に組み込むことをさらに含む、項目2に記載の肝臓細胞。
(項目6)
前記外因性配列が、導入遺伝子を含む、前記遺伝子中に変異を導入する、または前記内因性遺伝子中の変異を修正する、項目5に記載の肝臓細胞。
(項目7)
DNA結合ドメインおよび転写調節ドメインを含む人工転写因子をさらに含み、前記人工転写因子が、前記内因性遺伝子の発現を変更する、項目1に記載の肝臓細胞。
(項目8)
内因性PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子中の標的部位に結合するDNA結合ドメイン、ならびに機能的ドメインを含む、融合分子。
(項目9)
前記DNA結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質、TALエフェクタードメインタンパク質またはシングルガイドRNA(sgRNA)を含む、項目8に記載の融合分子。
(項目10)
前記機能的ドメインが、転写調節ドメインまたは切断ドメインを含む、項目8または9に記載の融合分子。
(項目11)
項目8から10のいずれかに記載の融合分子をコードするポリヌクレオチドであって、mRNAの形態であるか、またはウイルスもしくは非ウイルスベクター上にある、ポリヌクレオチド。
(項目12)
項目1から7のいずれか一項に記載の肝臓細胞、または項目8から10のいずれかに記載の融合分子、または項目11に記載のポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
(項目13)
TTR媒介性アミロイドーシス、A1AT欠損症、遺伝性血管性浮腫、家族性高コレステロール血症/スタチン耐性高コレステロール血症および高シュウ酸尿症の処置のための、項目12に記載の医薬組成物の使用。
(項目14)
項目1から7のいずれか一項に記載の肝臓細胞、または項目8から10のいずれかに記載の融合分子、または項目11に記載のポリヌクレオチドを含む、キット。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目1)
内因性PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子の発現が野生型と比較して変更された、肝臓細胞。
(項目2)
前記内因性遺伝子の配列が、DNA結合ドメインおよび切断ドメインを含む少なくとも1つのヌクレアーゼを使用して前記遺伝子を切断することによって変更される、項目1に記載の肝臓細胞。
(項目3)
前記DNA結合ドメインが、前記内因性遺伝子中の標的部位に結合する、項目2に記載の肝臓細胞。
(項目4)
前記標的部位が、表1、3、5、7、11、13、14および16に示される標的部位の少なくとも12ヌクレオチドを含む、項目3に記載の肝臓細胞。
(項目5)
外因性配列を、切断された前記内因性遺伝子中に組み込むことをさらに含む、項目2に記載の肝臓細胞。
(項目6)
前記外因性配列が、導入遺伝子を含む、前記遺伝子中に変異を導入する、または前記内因性遺伝子中の変異を修正する、項目5に記載の肝臓細胞。
(項目7)
DNA結合ドメインおよび転写調節ドメインを含む人工転写因子をさらに含み、前記人工転写因子が、前記内因性遺伝子の発現を変更する、項目1に記載の肝臓細胞。
(項目8)
内因性PCSK9、TTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子中の標的部位に結合するDNA結合ドメイン、ならびに機能的ドメインを含む、融合分子。
(項目9)
前記DNA結合ドメインが、ジンクフィンガータンパク質、TALエフェクタードメインタンパク質またはシングルガイドRNA(sgRNA)を含む、項目8に記載の融合分子。
(項目10)
前記機能的ドメインが、転写調節ドメインまたは切断ドメインを含む、項目8または9に記載の融合分子。
(項目11)
項目8から10のいずれかに記載の融合分子をコードするポリヌクレオチドであって、mRNAの形態であるか、またはウイルスもしくは非ウイルスベクター上にある、ポリヌクレオチド。
(項目12)
項目1から7のいずれか一項に記載の肝臓細胞、または項目8から10のいずれかに記載の融合分子、または項目11に記載のポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
(項目13)
TTR媒介性アミロイドーシス、A1AT欠損症、遺伝性血管性浮腫、家族性高コレステロール血症/スタチン耐性高コレステロール血症および高シュウ酸尿症の処置のための、項目12に記載の医薬組成物の使用。
(項目14)
項目1から7のいずれか一項に記載の肝臓細胞、または項目8から10のいずれかに記載の融合分子、または項目11に記載のポリヌクレオチドを含む、キット。
Claims (20)
- 前記内因性遺伝子の配列が、一対のジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)を使用して前記遺伝子を切断することによって変更され、前記対の前記ジンクフィンガーヌクレアーゼの少なくとも一方が、前記ジンクフィンガータンパク質および切断ドメインを含む、請求項1に記載の肝臓細胞。
- 前記ZFN対が、配列番号65と配列番号66;配列番号220と配列番号221;配列番号86と配列番号87または配列番号222;配列番号232と配列番号233;配列番号239と配列番号240;配列番号241と配列番号242;配列番号243と配列番号244;配列番号245と配列番号246;または配列番号247と配列番号248に結合する、請求項2に記載の肝臓細胞。
- 切断された前記内因性遺伝子中に組み込まれた外因性配列をさらに含む、請求項2に記載の肝臓細胞。
- 前記外因性配列が、導入遺伝子を含む、前記遺伝子中に変異を導入する、または前記内因性遺伝子中の変異を修正する、請求項4に記載の肝臓細胞。
- 前記肝臓細胞が、DNA結合ドメインおよび転写調節ドメインを含む人工転写因子をさらに含み、前記人工転写因子が、前記内因性遺伝子の発現を変更する、請求項1に記載の肝臓細胞。
- 前記人工転写因子が、前記内因性遺伝子の発現を活性化または抑圧する、請求項6に記載の肝臓細胞。
- 請求項1に記載の肝臓細胞を含む医薬組成物。
- 前記肝臓細胞に由来する遺伝子改変された細胞をさらに含む、請求項8に記載の医薬組成物。
- 請求項1に記載の肝臓細胞を産生するin vitroまたはex vivoの方法であって、前記内因性遺伝子の発現を変更する人工転写因子または人工ヌクレアーゼを前記肝臓細胞に投与するステップを含む、方法。
- 前記機能的ドメインが、転写調節ドメインまたは切断ドメインを含む、請求項11に記載の融合分子。
- 請求項11に記載の融合分子をコードするポリヌクレオチド。
- 前記ポリヌクレオチドがmRNAの形態である、請求項13に記載のポリヌクレオチド。
- 1つまたは複数の請求項13に記載のポリヌクレオチドを含む、1つまたは複数のウイルスもしくは非ウイルスベクター。
- 1つまたは複数の請求項13に記載のポリヌクレオチドを含む、医薬組成物。
- 肝臓細胞においてTTR、SERPINA1、KLKB1および/またはHAO1遺伝子の発現を変更する方法であって、前記遺伝子の発現が減少するような条件下で1つまたは複数の請求項13に記載のポリヌクレオチドを前記細胞に導入するステップを含む、方法。
- 前記融合分子が、前記遺伝子中に1つまたは複数の挿入および/または欠失を導入することによって、前記遺伝子の発現を変更する人工ヌクレアーゼを含む、請求項17に記載の方法。
- TTR媒介性アミロイドーシス、A1AT欠損症、遺伝性血管性浮腫、および高シュウ酸尿症を処置する方法であって、必要とする対象に請求項16に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
- 請求項13に記載のポリヌクレオチドを含む、キット。
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