CN110325635B - 使用工程化的核酸酶调控基因表达 - Google Patents

Abstract

本公开属于基因组工程化，特别是造血细胞的基因组的靶向修饰的领域。

Description

使用工程化的核酸酶调控基因表达

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年8月24日提交的美国临时申请号62/378,978、2017年1月9日提交的美国临时申请号62/443,981以及2017年8月15日提交的美国临时申请号62/545,778的权益，所述临时申请的工开内容特此以引用的方式整体并入。

技术领域

本公开属于基因组工程化，特别是造血细胞的基因组的靶向修饰的领域。

背景技术

当认为基因组测序成果已经揭示人基因组含有20,000与25,000之间个基因、但少于2000个转录调控因子时，明显的是，许多因素必须相互作用来控制其各种时间、发育和组织特异性表现中的基因表达。基因的表达受到与DNA元件相互作用的一般和特异性转录调控因子的高度复杂混合物控制。这些DNA元件包含局部DNA元件，如核心启动子及其相关的转录因子结合位点；以及远端元件，如增强子、沉默子、绝缘子和基因座控制区(LCR)(参见Matson等人(2006)Ann Rev Genome Hum Genet 7:29-50)。

增强子元件首先在SV40病毒基因组中鉴别，且然后在人免疫球蛋白重链基因座中发现。现在已知在许多基因的表达中发挥调控作用，增强子似乎主要影响基因表达的时间和空间模式。还已经发现增强子可起到调控在距靶向基因的核心启动子较大距离处的表达的作用，并且不依赖于相对于启动子的任何特定序列取向。增强子可位于核心启动子区上游或下游的数百千碱基处，其中它们可位于内含子序列中，或甚至位于基因的3'端之外。

已描述了用于靶向裂解基因组DNA的各种方法和组合物。此类靶向裂解事件可用于例如诱导靶向诱变、诱导细胞DNA序列的靶向缺失以及促进预定染色体基因座处的靶向重组。参见，例如美国专利号9,255,250；9,200,266；9,045,763；9,005,973；9,150,847；8,956,828；8,945,868；8,703,489；8,586,526；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；美国专利公布号2003/0232410；2005/0208489；2005/0026157；2005/0064474；2006/0063231；2008/0159996；2010/00218264；2012/0017290；2011/0265198；2013/0137104；2013/0122591；2013/0177983；2013/0196373；2015/0056705以及2015/0335708，所述专利的公开内容以引用的方式整体并入。

这些方法经常涉及使用工程化的裂解系统来诱导双链断裂(DSB)或靶DNA序列中的切口，以使得通过产生误差的过程如非同源末端连接(NHEJ)、供体的非同源定向末端捕获来修复断裂或使用修复模板进行修复(同源定向修复或HDR)可导致基因敲除或目标序列插入(靶向整合)。参见，例如美国专利号9,045,763；9,200,266；9,005,973；以及8,703,489。这些技术也可用于经由使用供体寡核苷酸来在基因组序列中引入位点特异性变化，包括引入基因组区的特异性缺失，或特异性点突变或局部改变(也称为基因校正)。裂解可经由使用特异性核酸酶如工程化的锌指核酸酶(ZFN)、转录活化因子样效应核酸酶(TALEN)来发生，或使用具有工程化的crRNA/tracr RNA(‘单引导RNA’)的CRISPR/Cas系统来引导特异性裂解。此外，基于Argonaute系统(例如，来自嗜热栖热菌，其被称为‘TtAgo’，参见Swarts等人(2014)Nature 507(7491):258-261)开发靶向核酸酶，所述系统还可具有用于基因组编辑和基因疗法的潜力。

红细胞(Red blood cell)(RBC)或红细胞(erythrocyte)是血液的主要细胞组分，并且占人体内细胞的四分之一。成熟RBC缺乏细胞核和许多其他细胞器，并且富含血红蛋白，血红蛋白是功能是将氧气从肺部运送至组织并将二氧化碳从组织中带出并返回肺部以便除去的金属蛋白。这种蛋白质占RBC的干重的大约97％，并且其使血液的携氧能力提高约70倍。血红蛋白是异四聚体，其包含两个α(α)样珠蛋白链和两个β(β)样珠蛋白链以及4个血红素基团。在成人中，α2β2四聚体被称为血红蛋白A(HbA)或成人血红蛋白。通常，α和β珠蛋白链以近似1:1的比例合成，并且就血红蛋白和RBC稳定化而言，此比例似乎是关键的。在发育中胎儿中，产生了不同形式的血红蛋白，胎儿血红蛋白(HbF)，其对氧的结合亲和力高于血红蛋白A，以使得氧可经由母亲的血流递送至婴儿的系统。基于它们在β珠蛋白基因座中的排列顺序，存在两种编码胎儿珠蛋白的基因，所述基因在序列上非常相似并且被称为HBG1(也称为Gγ)和HBG2(Aγ)。与成人血红蛋白一样，胎儿血红蛋白含有两个α珠蛋白链，但代替成人β-珠蛋白链，它具有两个胎儿γ(γ)-珠蛋白链(即，胎儿血红蛋白是α2γ2)。γγ在妊娠大约30周时，胎儿中γ珠蛋白的合成开始下降，同时β珠蛋白的产生增加。到大约10个月大时，新生儿的血红蛋白几乎都是α2β2，尽管一些HbF持续到成年期(总血红蛋白的大约1％-3％)。从γ-珠蛋白的产生转换至β-珠蛋白的调控非常复杂，并且主要涉及γ珠蛋白转录的下调与β珠蛋白转录的同时上调。

编码血红蛋白链的序列中的遗传缺陷可导致一组称为血红蛋白病的疾病，所述疾病包括镰状细胞性贫血以及α和β地中海贫血。在大多数患有血红蛋白病的患者中，编码γ珠蛋白的基因仍然存在，但是由于如上所述在约分娩时发生的正常基因阻遏而表达相对较低。

据估计，在美国5000人中有1人患有镰状细胞病(SCD)，主要是撒哈拉以南非洲裔(Roseff(2009)Immunohematology 25(2):67)。由于针对疟疾的保护，似乎存在镰状细胞突变的杂合携带者的益处，因此这种性状可能随着时间推移而被阳性选择，以使得估计在撒哈拉以南非洲，达28％的群体具有镰状细胞性状(Elguero等人(2015)PNAS USA112(22):7051)。镰状细胞病是由由于氨基酸#6处的缬氨酸取代为谷氨酸(在DNA水平下的GAG至GTG突变)所致的β珠蛋白基因中的突变引起的，其中所得血红蛋白被称为“血红蛋白S”“或”HbS。“在较低的氧条件下，HbS的脱氧形式的构象转变暴露在E螺旋与F螺旋之间的蛋白质上的疏水性补片。血红蛋白中β链的位置6处的缬氨酸的疏水性残基能够与疏水性补片缔合，从而导致HbS分子聚集并形成纤维状沉淀物。这些聚集体进而导致RBC的异常或“镰状化”，从而导致细胞柔性丧失。镰状化RBC不再能够挤入毛细血管床，并且可能导致镰状细胞患者的血管阻塞性危象。此外，镰状RBC比正常RBC更脆弱，并且倾向于溶血，从而最终导致患者贫血。

镰状细胞患者的治疗和管理是涉及抗生素治疗、疼痛管理和急性发作期间的输血的终生命题。一种方法是使用羟基脲，其部分地通过增加γ珠蛋白的产生来发挥其作用。然而，慢性羟基脲疗法的长期副作用仍然是未知的，并且治疗产生导致低患者依从性的不想要的副作用，且在患者之间具有可变功效(Brandow和Panepinto(2011)Am J Hematol 86(9):804-806)。尽管镰状细胞治疗的功效增加，但患者的预期寿命仍然仅在50岁中后期，并且相关的疾病发病率对患者的生活质量具有深远影响。

地中海贫血也是与血红蛋白有关的疾病并且通常涉及球蛋白链的表达降低。这可通过基因调控区中的突变或来自珠蛋白编码序列中的突变而发生，所述珠蛋白编码序列中的突变导致功能性珠蛋白的表达降低或水平降低。由α珠蛋白基因座中的突变引起的α地中海贫血主要与西非裔和南亚裔的人相关，并且可能导致疟疾抗性。由β珠蛋白基因座中的突变引起的β地中海贫血主要与通常来自希腊以及土耳其和意大利的沿海地区的地中海裔的人相关。在轻型地中海贫血中，β珠蛋白等位基因中的仅一种具有突变。个体将患有小红细胞性贫血，并且检测通常涉及低于正常的平均红细胞体积(<80fL)。患有轻型地中海贫血的受试者的等位基因是β+/β或β0/β(其中‘β+’是指允许发生一定量的β链形成的等位基因，'β'是指野生型β珠蛋白等位基因，并且‘β0’是指与完全不存在β-珠蛋白表达相关的β珠蛋白突变)。中间型地中海贫血受试者通常可控制正常生活，但可能需要偶尔输血，特别是在疾病或怀孕时，这取决于他们的贫血症的严重程度。这些患者的等位基因可以是β+/β+或βo/β+。当两种等位基因都具有地中海贫血突变时，发生重型地中海贫血。这是严重的小红细胞性和低色素性贫血。如果未经治疗，它导致贫血、脾肿大和严重的骨畸形，并且在20岁前进展至死亡。治疗包括定期输血；用于脾肿大的脾切除术以及输血引起的铁超负荷的螯合。如果可鉴别合适的供体，则骨髓移植也用于治疗患有严重地中海贫血的人，但是这种程序可具有显著风险。

已经提出用于治疗SCD和β地中海贫血两者的一种方法是增加γ珠蛋白的表达，目的是使HbF在功能上替代异常的成人血红蛋白。如上所述，用羟基脲治疗SCD患者被认为是成功的，这部分由于其对增加γ珠蛋白表达的影响。发现影响γ珠蛋白表达的第一组化合物是细胞毒性药物。通过药理学操作引起γ-球蛋白的从头合成的能力首次在实验动物中使用5-氮杂胞苷显示(DeSimone(1982)Proc Nat’l Acad Sci USA 79(14):4428-31)。随后的研究证实了5-氮杂胞苷增加患有β-地中海贫血和镰状细胞病的患者的HbF(Ley,等人,(1982)N.Engl.J.Medicine,307:1469-1475；以及Ley,等人,(1983)Blood 62:370-380)。此外，短链脂肪酸(例如丁酸酯和衍生物)已经在实验系统中显示增加HbF(Constantoulakis等人,(1988)Blood72(6):1961-1967)。此外，存在患有被称为‘遗传性胎儿血红蛋白持续增多症’(HPFH)的疾患的一部分人群体，其中HbF的量升高在成年期持续存在(HPFH杂合子中10％-40％(参见Thein等人(2009)Hum.Mol.Genet 18(R2):R216-R223)。这是一种罕见的疾患，但在不存在任何相关的β珠蛋白异常的情况下，即使当100％的个体血红蛋白是HbF时，也与任何显著临床表现无关。当患有β地中海贫血的个体还患有同时发生的HPFH时，HbF的表达可减轻疾病的严重程度(Potoka和Gladwin(2015)Am J Physiol Lung Cell MolPhysiol.308(4):L314–L324)。此外，镰状细胞病的自然病程的严重程度可因患者而显著不同，并且这种可变性可部分地追溯到一些患有较轻疾病的个体表达较高水平的HbF的事实。

增加HbF表达的一种方法涉及鉴别其产物在γ珠蛋白表达的调控中起作用的基因。一种这样的基因是BCL11A，由于其在淋巴细胞发育中的作用而首次被鉴别。BCL11A编码锌指蛋白，所述锌指蛋白被认为参与γ珠蛋白表达的发育阶段特异性调控。BCL11A在成体红细胞前体细胞中表达，并且其表达的下调导致γ珠蛋白表达的增加。此外，BCL11A mRNA的剪接在发育上受到调控。在胚胎细胞中，主要表达较短的BCL11AmRNA变体(称为BCL11A-S和BCL11A-XS)，而在成体细胞中，主要表达较长的BCL11A-L和BCL11A-XL mRNA变体。参见，Sankaran等人(2008)Science 322第1839页。BCL11A蛋白似乎与β珠蛋白基因座相互作用以改变其构象，并且因此改变其在不同发育阶段的表达。已经提出使用靶向BCL11A基因的抑制性RNA(参见，例如美国专利公布号2011/0182867)，但这种技术具有若干潜在缺点，即可能无法实现完全敲低，此类RNA的递送可能是有问题的并且所述RNA必须连续存在，从而需要多次终生治疗。

靶向BCL11A增强子序列提供了增加HbF的机制。参见例如，美国专利公布号2015/0132269和PCT公布号WO 2016/183298。全基因组关联研究已经鉴别了在BCL11A基因座处与HbF水平升高相关的一组遗传变异。这些变异是在BCL11A的非编码区中发现的小核苷酸多态性(SNP)的集合，其充当阶段特异性谱系限制性增强子区。进一步的研究表明，这种BCL11A增强子是红细胞中BCL11A表达所需的，但并不是其在B细胞中的表达所需的(参见Bauer等人(2013)Science 343:253-257)。在BCL11A基因的内含子2内发现了增强子区，并且鉴别了内含子2中DNA酶I超敏性的三个区域(通常指示与调控潜力相关的染色质状态)。根据距离BCL11A的转录起始位点的距离(千碱基)，这三个区域被鉴别为“+62”、“+58”和“+55”。这些增强子区的长度是大约350(+55)、550(+58)和350(+62)个核苷酸(Bauer 2013，同上)。

当开发用于人的治疗性治疗的核酸酶时，核酸酶必须具有最大的安全特性。具体地，核酸酶必须具有非常低水平的脱靶裂解。除用户指定的靶标以外的位置中的大量双链切割可导致脱靶基因的阻遏，并且在极少数情况下可导致染色体易位的发生(参见Hoban和Bauer(2016)Blood,127(21):2525-2535；以及Tsang等人(2017)Nature Methods,出版中)。可通过消除工程化核酸酶与基因组DNA之间的非特异性相互作用来实现特异性的改进(参见美国临时专利申请号62/378,978和62/443,981)。

因此，仍然需要用于改变BCL11A基因表达，例如用于治疗诸如镰状细胞病和β地中海贫血的血红蛋白病的另外高度特异性的方法和组合物。

发明内容

本发明描述了用于基因疗法和基因组工程化的高度特异性组合物和方法。具体地，所描述的方法和组合物涉及使BCL11A基因(例如，充当一种或多种另外基因的调节因子的基因)失活(例如，通过完全或部分地消除其表达)。特别地，本发明描述了用于干扰BCL11A基因中的增强子功能以减少或敲除其在特定细胞谱系(例如，红细胞)中的活性的方法和组合物。另外，本发明提供了用于干扰BCL11A增强子功能的方法和组合物，其中所述增强子序列不位于所述BCL11A基因的编码序列内，并且其中所提供的试剂表现出高度特异性活性。在这些情况下所产生的BCL11A基因的下调导致γ珠蛋白的表达增加，并且脱靶裂解事件的数量减少。

在一些方面，本发明包括一种非天然存在的锌指蛋白，所述锌指蛋白包含含有4、5或6个指的锌指蛋白(ZFP)，每个指包含识别DNA靶亚位点的识别螺旋区，其中所述识别螺旋区包含表1的单行中所示顺序的序列。在每个锌指内，7个氨基酸的识别螺旋区在(大约30个残基，包括锌配位残基)的锌指主链内编号为-1至+6。在某些实施方案中，本文所述的锌指蛋白的组分锌指中的1、2、3个或更多个还包含识别螺旋区外的一个或多个残基的突变，包括但不限于位置-5、位置-14或位置-5和-14两者处的氨基酸的突变(从用于识别螺旋区的-1至+6编号继续编号)被突变。参见例如，描述于美国临时专利申请62/378,978和62/443,981中的Qm4和Qm14突变。锌指蛋白的组分锌指可通过任何接头连接，例如，如美国专利号8,772,453中所描述。在某些实施方案中，对于命名为如下的蛋白质，所述ZFP包含如表1中所示的识别螺旋：63014(其结合至SEQ ID NO:1中所示的靶位点)和65722(其结合至SEQ IDNO:2中所示的靶位点)。

在某些实施方案中，如本文所述的锌指蛋白与功能结构域(例如，转录活化结构域、转录阻遏结构域、裂解结构域融合(以形成锌指核酸酶)等)。任何接头可用于可操作地连接裂解结构域和锌指蛋白，包括但不限于如美国专利号9,394,531和9,567,609中描述的接头。此外，当使用FokI裂解结构域时，可存在催化结构域、二聚化结构域中、磷酸接触残基(不在所述二聚化或催化结构域中)的进一步突变以及所述催化结构域、二聚化结构域和磷酸接触残基中任一者中的突变的组合，包括但不限于二聚化结构域的ELD或KKR突变、FokI结构域的残基525(K至S)的突变以及二聚化结构域的ELD或KKR突变与FokI结构域的残基525(K至S)的突变(相对于野生型编号)的组合。参见，美国专利号7888121；7914796；8034598；8,623,618和美国专利公布号2011/0201055以及美国临时专利申请号。62/378,978和62/443,981。

在某些实施方案中，锌指核酸酶(ZFN)可用于二聚化对中以在所述对的ZFN的一个或两个靶位点处或附近裂解，例如，表1的“左侧配偶体”(例如，63014)可与表1的“右侧配偶体”(例如，65722)形成二聚体以裂解BCL11A增强子序列。在某些实施方案中，所述ZFN对包含以下氨基酸序列：63014：

MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHGVPAAMAERPFQCRICMQNFSDQSNLRAHIRTHTGEKPFACDICGRKFARNFSLTMHTKIHTGSQKPFQCRICMQNFSSTGNLTNHIRTHTGEKPFACDICGRKFATSGSLTRHTKIHTHPRAPIPKPFQCRICMQNFSDQSNLRAHIRTHTGEKPFACDICGRKFAAQCCLFHHTKIH–接头-

ELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMERYVEENQTRDKHLNPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINFRS(SEQ ID NO:3)；以及

MDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDKMAPKKKRKVGIHGVPAAMAERPFQCRICMQKFARNDHRTTHTKIHTGEKPFQCRICMQNFSQKAHLIRHIRTHTGEKPFACDICGRKFAQKGTLGEHTKIHTGSQKPFQCRICMQNFSRGRDLSRHIRTHTGEKPFACDICGRKFARRDNLHSHTKIH–接头-

ELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVKENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFSGNYKAQLTRLNRKTNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF(SEQ ID NO:4)，其中所述接头序列可以是本领域中已知的任何接头序列，例如如美国专利号9,394,531和9,567,609中所描述。在某些实施方案中，63014的接头包含L7c5接头(LRGSISRARPLNPHP(SEQ ID NO:5))或由其组成，并且65722中使用的接头包含L0接头(LRGSQLVKS(SEQ ID NO:6)或由其组成，参见美国专利号9,567,609)。上文所示序列的接头的C末端的FokI裂解结构域序列还可包含与锌指蛋白可操作连接的替代FokI结构域。在某些实施方案中，所述FokI裂解结构域可包含所述催化结构域、二聚化结构域、磷酸接触残基的替代或另外的突变，以及所述催化结构域、二聚化结构域和磷酸接触残基中任一者的突变的组合。

在另一方面，本发明包括出于基因组工程化的目的将至少一种核酸酶(例如，结合至BCL11A增强子序列的核酸酶)递送至人干细胞或前体细胞(HSC/PC)。在某些实施方案中，所述核酸酶包含含有4、5或6个指的锌指蛋白(ZFP)，每个指包含识别靶亚位点的识别螺旋区，其中所述识别螺旋区包含表1的单行中所示顺序的序列。在其他实施方案中，所述ZFN核酸酶包含命名为63014/65722的核酸酶对。如本文所述的核酸酶还可包含接头(例如，在DNA结合结构域与裂解结构域之间，例如，如在9,567,609中所示的接头，包括但不限于LRGSISRARPLNPHP(SEQ ID NO:5)或(LRGSQLVKS(SEQ ID NO:6))。

在一些实施方案中，所述核酸酶作为肽递送，而在其他实施方案中，它作为编码至少一种核酸酶的核酸递送。在一些实施方案中，使用多于一种核酸酶。在一些优选的实施方案中，编码核酸酶的核酸是mRNA，并且在一些情况下，所述mRNA是受保护的。在一些方面，所述mRNA可经化学修饰(参见例如Kormann等人(2011)Nature Biotechnology 29(2):154-157)。在其他方面，所述mRNA可包含ARCA帽(参见美国专利号7,074,596和8,153,773)。在其他实施方案中，所述mRNA可包含未修饰的核苷酸和修饰的核苷酸的混合物(参见美国专利公布号2012/0195936)。在一个优选的实施方案中，编码所述核酸酶的核酸经由电穿孔递送至HSC/PC。在一些实施方案中，所述核酸酶在转录因子的结合位点处或附近裂解。在一些方面，所述转录因子是GATA-1。

在其他方面，本发明包括一种细胞或细胞系，其中例如与所述细胞的野生型序列相比，内源性BCL11A增强子序列通过如本文所述的核酸酶(例如，表1中所示)进行遗传修饰。对BCL11A增强子的遗传修饰导致珠蛋白(β和γ)基因表达的修饰。如本文所述的核酸酶修饰的细胞或细胞系在结构、功能以及结构和功能两者的组合方面与野生型可区分。所述遗传修饰的细胞或细胞系对于修饰可以是杂合的或纯合的。所述修饰可包括插入(例如，转基因插入)、缺失以及插入和缺失的组合；此类插入、缺失以及插入和缺失的组合通常被称为“插入缺失”。在一些优选的实施方案中，插入缺失导致转录因子结合位点的破坏。在某些实施方案中，所述修饰是在核酸酶结合位点、裂解位点以及结合位点与裂解位点的组合处或附近，例如，所述裂解位点上游或下游1-300个碱基对(或其间的任何值)内，更优选地所述结合位点、裂解位点以及表1中所示的结合位点与裂解位点的组合任一侧的1-100个碱基对(或其间的任何值)内，甚至更优选地所述结合位点、裂解位点以及结合位点与裂解位点的组合任一侧上的1至50个碱基对(或其间的任何值)内。在某些实施方案中，BCL11A增强子序列的遗传修饰在表1中所示的序列之内和/或之间(靶位点)。所述修饰还可包括对所述裂解位点中的一个或多个核苷酸的修饰。所述修饰还可包括对所述结合位点中的一个或多个核苷酸的修饰。所述修饰还可包括对所述裂解位点中以及所述结合位点中的一个或多个中的一个或多个核苷酸的修饰。在某些实施方案中，所述核酸酶靶位点中的一个或多个未被修饰。在其他实施方案中，所述核酸酶的靶位点中的至少一个被修饰。在某些实施方案中，所述修饰是在BCL11A增强子的“+58”区处或附近，例如，在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的任一个中所示的核酸酶结合位点处或附近。任何细胞或细胞系可通过如本文所述的核酸酶进行修饰，例如干细胞(造血干细胞，如CD34+造血干细胞)或红细胞(RBC)前体细胞。

还描述了在通过如本文所述的核酸酶修饰后获得的细胞或细胞系，例如起源于如本文所述的核酸酶修饰的细胞或细胞系的细胞或细胞系。还提供了起源于如本文所述的修饰的干细胞的部分或完全分化的细胞(例如，RBC或RBC前体细胞)。起源于核酸酶修饰的细胞的细胞可繁殖、分化以及体外繁殖和分化的(培养物)的组合，或可例如在离体施用核酸酶修饰的干细胞后在活受试者体内分化。本文公开的任何遗传修饰的细胞或细胞系可显示γ珠蛋白的表达增加。还提供了包含如本文所述的遗传修饰的细胞的组合物，如药物组合物。

在其他方面，本发明包括将供体核酸递送至靶细胞以提供遗传修饰的细胞，其中供体被整合至所述细胞中。所述供体可在编码表1的核酸酶的核酸之前、之后递送，或与所述核酸一起递送。所述供体核酸可包括待整合至细胞的基因组(例如内源基因座)中的外源序列(转基因)。在一些实施方案中，所述供体可包含由具有靶向裂解位点的同源区侧接的全长基因或其片段。在一些实施方案中，所述供体缺乏同源区并且通过同源性非依赖性机制(即NHEJ)来整合至靶基因座中。所述供体可包含任何核酸序列，例如在用作核酸酶诱导的双链断裂的同源定向修复的底物时，导致在内源染色体基因座(例如，BCL11A增强子区)处产生供体指定的缺失，或作为替代(或除此之外)导致待形成的内源性基因座的新颖等位基因形式(例如，清除转录因子结合位点的点突变)。在一些方面，该供体核酸是其中整合导致基因校正事件或靶向缺失的寡核苷酸。

在其他方面，所述核酸酶、供体以及所述核酸酶和供体两者的组合通过病毒、非病毒以及病毒和非病毒基因转移方法的组合来递送。在优选的实施方案中，所述供体经由腺相关病毒(AAV)递送至细胞。在一些情况下，所述AAV包含与衣壳血清型相比具有异源血清型的LTR。

在一些方面，包含增强子的DNA酶I超敏区(例如，BCL11A增强子的+58区)内的区域的缺失使用如表1中所示的一种或多种核酸酶来制备。这些缺失可包含约1个核苷酸至约551个核苷酸。因此，所述缺失可包括1、5、10、15、20、25、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550个核苷酸，或其间的任何值。在一些实施方案中，所述缺失包含用于一种或多种转录因子的结合区。在一些优选的实施方案中，所述缺失包含GATA-1结合位点，或GATA-1与其他因子的组合的结合位点。

在一些实施方案中，表1的DNA结合结构域与功能结构域融合。一些方面包括DNA结合结构域与能够调控基因表达的结构域的融合。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含与基因表达调节结构域融合的表1的DNA结合结构域，其中所述调节因子阻遏基因表达。

在一些实施方案中，使所述HSC/PC细胞与核酸酶、DNA结合蛋白以及本发明的核酸酶和DNA结合蛋白的组合(即，如表1中所示的ZFP)接触。在一些实施方案中，所述核酸酶、DNA结合蛋白以及核酸酶与DNA结合蛋白的组合作为核酸递送，并且在其他实施方案中，它们作为蛋白质递送。在一些实施方案中，所述核酸是编码DNA结合蛋白以及核酸酶与DNA结合蛋白的组合的mRNA，并且在其他实施方案中，所述mRNA可受保护。在一些实施方案中，所述mRNA可以是化学修饰的，可包含ARCA帽、未修饰的核苷酸和修饰的核苷酸的混合物以及ARCA帽与未修饰的核苷酸和修饰的核苷酸的混合物的组合。还提供了起源于这些细胞的细胞或细胞系，包括部分或完全分化的细胞。

在一些方面，在来自受试者的HSC/PC的单采血液成分术或来自收获的骨髓的纯化后，使所述HSC/PC与核酸酶、DNA结合蛋白以及本发明的核酸酶与DNA结合蛋白的组合离体接触。在一些实施方案中，本文所述的核酸酶引起BCL11A增强子区内的修饰，例如从而产生在结构上、功能上以及结构上和功能上的组合与野生型细胞、其他修饰的(例如，核酸酶修饰的)细胞以及野生型细胞与其他修饰的细胞的组合不同的遗传修饰的细胞。在其他实施方案中，将含有BCL11A增强子区修饰的HSC/PC引回到受试者体内。在一些情况下，使含有BCL11A增强子区修饰的HSC/PC在引入之前扩增。在其他方面，将所述遗传修饰的HSC/PC在骨髓移植中给予至受试者，其中所述HSC/PC在体内植入、分化并成熟。在一些实施方案中，在G-CSF诱导的动员、普乐沙福诱导的动员以及G-CSF与普乐沙福诱导的动员的组合后从受试者分离所述HSC/PC，并且在其他实施方案中，自人骨髓或人脐带分离细胞。在一些方面，在引入包含修饰的HSC/PC的移植物之前用温和的清髓性程序治疗受试者，而在其他方面，用强力的清髓性调节方案治疗受试者。在一些实施方案中，本发明的方法和组合物用于治疗或预防血红蛋白病。在一些方面，所述血红蛋白病是地中海贫血。在一些方面，血红蛋白病是β地中海贫血，而在其他方面，血红蛋白病是镰状细胞病。

在一些实施方案中，使所述HSC/PC进一步与供体分子接触。在一些实施方案中，所述供体分子通过病毒载体递送。所述供体分子可包含编码功能性多肽(例如，cDNA或其片段)、具有或不具有启动子的一个或多个序列。可在供体分子用于失活时包含另外的序列(编码序列或非编码序列)，包括但不限于编码2A肽、SA位点、IRES等的序列。

在一个方面，本发明的方法和组合物包括用于在体内接触HSC/PC的方法。所述核酸酶、DNA结合蛋白或核酸酶与DNA结合蛋白的组合通过本领域中已知的方法原位递送至HSC/PC。在一些实施方案中，本发明的核酸酶和/或DNA结合蛋白包含施用于有需要的受试者的病毒颗粒，而在其他实施方案中，所述核酸酶、DNA结合蛋白或核酸酶与DNA结合蛋白的组合包含纳米颗粒(例如脂质体)。在一些实施方案中，将所述病毒颗粒、纳米颗粒或病毒颗粒与纳米颗粒的组合递送至HSC/PC所存在的器官(例如骨髓)。

在另一个方面，本文描述了经由同源性非依赖性机制将供体核酸整合至细胞的基因组中的方法。所述方法包括在细胞的基因组中产生双链断裂(DSB)并且使用如本文所述的核酸酶裂解供体分子，以使得供体核酸整合在DSB的位点处。在某些实施方案中，供体核酸通过非同源性依赖性方法(例如，NHEJ)来整合。如上所指出，在体内裂解后，供体序列可以靶向方式整合至细胞基因组中的DSB位置处。供体序列可包含用于产生DSB的一种或多种核酸酶的一个或多个相同靶位点。因此，供体序列可由用于裂解期望整合的内源基因的一种或多种相同核酸酶来裂解。在某些实施方案中，供体序列包含来自用于诱导DSB的核酸酶的不同核酸酶靶位点。靶细胞的基因组中的DSB可通过任何机制来产生。在某些实施方案中，所述DSB通过一种或多种锌指核酸酶(ZFN)、包含锌指结合结构域以及裂解结构域或裂解半结构域的融合蛋白来产生，所述锌指结合结构域被工程化以结合目标区内的序列。

在一个方面，所述供体可编码目标调控蛋白(例如ZFP TF、TALE TF或CRISPR/CasTF)，所述调控蛋白结合至目标基因、调节目标基因的表达或结合至目标基因和调节目标基因的表达两者。在一个实施方案中，所述调控蛋白结合至DNA序列并阻止其他调控因子的结合。在另一个实施方案中，调控蛋白的结合可调节(即诱导或阻遏)靶DNA的表达。

在一些实施方案中，转基因HSC/PC细胞、转基因动物或转基因HSC/PC细胞与动物的组合包含编码人基因的转基因。在一些情况下，转基因动物包含在内源基因座处的敲除，以及用其人对应物置换内源基因，从而允许开发可分离研究人蛋白质的体内系统。此类转基因模型可用于筛选目的，以鉴别可与目标人蛋白质相互作用或修饰所述人蛋白质的小分子或大生物分子或其他实体。在一些方面，靶基因被整合至选定基因座(例如，安全港(safe-harbor))、干细胞(例如，胚胎干细胞、诱导多能干细胞、肝干细胞等)或通过本文描述的任何方法获得的动物胚胎中，且然后植入胚胎以使得活动物出生。然后将动物饲养至性成熟并使其产生后代，其中至少一些后代包含编辑的内源基因序列或整合的转基因。

在另一个方面，本文提供了一种改变细胞中的基因表达(例如，BCL11A、珠蛋白基因以及BCL11A与珠蛋白基因的组合)的方法，所述方法包括：在使得表达一种或多种蛋白质并改变基因的表达的条件下将如本文所述的一种或多种核酸酶(表1中所示)引入所述细胞中。在某些实施方案中，珠蛋白基因(例如，γ珠蛋白或β珠蛋白)的表达被改变(例如，增加)。本文描述的任何方法还可包括将供体序列(例如，在外源或内源启动子控制下的转基因或其片段)整合至所述细胞的基因组中，例如将供体整合在BCL11A基因中的核酸酶裂解位点处或附近。使用病毒载体、作为寡核苷酸、在质粒上以及选自使用病毒载体、作为寡核苷酸或在质粒上的一种或多种方法的组合，将供体序列引入所述细胞。基因表达被改变的细胞可以是例如红细胞(RBC)前体细胞、造血干细胞(例如，CD34+细胞)以及RBC前体细胞与造血干细胞的组合。

在其他实施方案中，本文提供了一种产生遗传修饰的细胞的方法，所述遗传修饰的细胞包含内源性BCL11A增强子序列内的基因组修饰(对所述BCL11A增强子序列的核苷酸序列的修饰)，所述方法包括以下步骤：a)使细胞与多核苷酸(例如DNA或mRNA)接触，所述多核苷酸编码包含4、5或6个锌指结构域的锌指核酸酶，其中所述锌指结构域中的每个包含表1的单行中所示顺序的识别螺旋区；b)使所述细胞经受有利于从所述多核苷酸表达所述锌指蛋白的条件；以及c)用足以产生所述遗传修饰的细胞的表达的锌指蛋白修饰所述内源性BCL11A增强子序列。在某些实施方案中，(例如，在步骤(a)之前)用至少一种细胞因子刺激所述细胞。可使用任何合适的方法，包括但不限于经由转染、使用非病毒载体、使用病毒载体、通过化学方式或通过暴露于电场(例如，电穿孔)来使所述多核苷酸与所述细胞接触。

还提供了包含本文所述的基因组修饰中的一种或组合的细胞，包括起源于通过本文所述的方法产生的细胞的细胞。

还提供了一种治疗需要增加珠蛋白基因表达的患者的方法，所述方法包括以足以增加所述患者中的珠蛋白基因表达的量向所述患者施用药物制剂，其中所述药物制剂包含如本文所述的遗传修饰的细胞、蛋白质、多核苷酸以及选自遗传修饰的细胞、蛋白质和多核苷酸的一者或多者的组合。在某些实施方案中，所述患者已知患者、疑似患有地中海贫血或镰状细胞病或处于发展地中海贫血或镰状细胞病的风险。

还提供了一种药盒，所述药盒包括本发明的核酸、蛋白质、遗传修饰的细胞以及选自所述核酸、蛋白质和遗传修饰的细胞中的一者或多者的组合。所述药盒可包括编码所述核酸酶的核酸(例如合适的表达载体中所含有的RNA分子或ZFN、TALEN或CRISPR/Cas系统编码基因)、核酸酶蛋白的等分部分、供体分子、合适的干细胞自我更新(“干性质(stemness)”)的改性剂、细胞、缓冲剂、说明书(例如，用于进行本发明的方法)以及类似物，包括这些药盒组分的各种组合。本发明包括但不限于遗传修饰的细胞(例如，干细胞，如造血(CD34+)干细胞或RBC前体细胞))，所述遗传修饰的细胞包含通过核酸酶产生的至少一种基因组修饰(例如，如表1的单行中所示)，其中所述基因组修饰在内源性BCL11A增强子序列内，并且进一步其中所述基因组修饰是选自由插入、缺失以及其组合组成的组，并且包括在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中的任一者处、附近或之间的修饰。在某些实施方案中，所述细胞是如本文所述的起源于干细胞的遗传修饰的分化细胞(例如，起源于造血干细胞或RBC前体细胞的RBC)。

所述核酸酶可包含至少一种锌指核酸酶(ZFN)(例如，如表1中所示)、至少一种TALEN以及至少一种ZFN与至少一种TALEN的组合。所述核酸酶可以蛋白质形式、作为编码所述核酸酶的多核苷酸或作为蛋白质形式与编码所述核酸酶的多核苷酸的组合引入所述细胞中。在某些实施方案中，所述基因组修饰包括插入，所述插入包括整合编码转基因的供体多核苷酸。还提供了药物组合物，所述药物组合物包含如本文所述的遗传修饰的细胞中的一种或多种。

还提供了一种包含锌指蛋白的DNA结合蛋白，所述锌指蛋白包含4、5或6个锌指结构域，所述锌指结构域包含识别螺旋区，其中所述锌指蛋白包含表1的单行中所示顺序的识别螺旋区。还提供了一种包含多个重复的TALE蛋白，所述重复结合至包含表1中所示的靶位点的一部分(例如，至少4、5、6或更多个)碱基对的序列。还提供了一种融合蛋白，所述融合蛋白包含如本文所述的锌指蛋白或TALE蛋白和野生型或工程化的裂解结构域或裂解半结构域，以及编码如本文所述的蛋白质(ZFP、TALE、ZFN、TALEN)的多核苷酸。还提供了细胞(例如，分离的干细胞，如造血(CD34+)干细胞)，所述细胞包含如本文所述的一种或多种多核苷酸、蛋白质以及多核苷酸与蛋白质的组合。还提供了药盒，所述药盒包括如本文所述的一种或多种蛋白质、多核苷酸、细胞或其组合。

还描述了一种改变细胞(例如，RBC前体细胞、造血干细胞以及RBC前体细胞与造血干细胞的组合)中的珠蛋白基因表达的方法，所述方法包括：在使得表达一种或多种蛋白质并改变(例如，增加)珠蛋白基因(例如，γ珠蛋白、β珠蛋白以及γ珠蛋白与β珠蛋白的组合)的表达的条件下将编码如本文所述的一种或多种核酸酶的一种或多种多核苷酸引入所述细胞中。在某些实施方案中，所述方法还包括例如使用病毒载体、作为寡核苷酸或在质粒上将供体序列整合至所述细胞的基因组中。所述供体序列可包含在内源或外源启动子控制下的转基因。

还提供了一种产生遗传修饰的细胞的方法，所述遗传修饰的细胞包含内源性BCL11A增强子序列(例如，如表1中所示的靶位点)内的基因组修饰，所述方法包括以下步骤：(a)使细胞与编码融合蛋白的多核苷酸接触，所述融合蛋白包含含有4、5或6个锌指结构域的锌指核酸酶，其中所述锌指结构域中的每个包含表1的单行中所示顺序的识别螺旋区；(b)使所述细胞经受有利于从所述多核苷酸表达所述融合蛋白的条件；以及(c)用足以产生所述遗传修饰的细胞的表达的融合蛋白修饰所述内源性BCL11A增强子序列。在某些实施方案中，所述方法还包括用至少一种细胞因子刺激所述细胞。所述多核苷酸可在所述细胞内递送，例如使用非病毒递送系统、病毒递送系统、递送媒介物以及选自非病毒递送系统、病毒递送系统和递送媒介物的组合，并且可包括使所述细胞经受电场或采用细胞膜破坏作为递送机制(所谓的'挤压技术'，参见例如Sharei等人(2015)PLOS ONE doi:10.1371/journal/pone.0118803)。

还提供了治疗需要增加珠蛋白基因表达的患者(例如，患者已知患者患有、疑似患有血红蛋白病如地中海贫血(例如，β-地中海贫血)或镰状细胞病或处于发展所述血红蛋白病的风险)的方法，所述方法包括以足以增加所述患者中的珠蛋白基因表达的量向所述患者施用如本文所述的药物组合物(例如，蛋白质、多核苷酸、细胞或选自蛋白质、多核苷酸和细胞的组合)。

鉴于总体公开内容，这些和其他方面将对本领域技术人员显而易见。

附图说明

图1A和1B是描绘寡核苷酸双链体整合位点测定的概述的示意图。图1示出所述测定的第一步，其中在补充寡核苷酸双链DNA存在下用ZFN处理细胞，所述双链DNA被捕获到所得裂解事件的一部分中。图1B示出子序列步骤，其中将细胞培养7天，分离基因组DNA，并且使用针对整合的寡核苷酸双链体的引物经由衔接子介导的PCR扩增位于供体整合位点侧翼的基因组区段。然后对扩增子进行测序以揭示候选裂解位点。

图2描绘使用51857/51949原始或亲本ZFN对通过寡核苷酸双链体整合位点测定鉴别的455个潜在脱靶基因座的位置。前63个基因座以灰色突出显示，并在后续插入缺失分析中进行分析。每个基因座通过指示最可能的裂解位置的染色体和碱基数目以及在所述基因座处检测到的整合体的数目的指示来鉴别。

图3A至3C描绘锌指支架内的示例性磷酸接触残基。图3A描绘与DNA分子的锌指相互作用，并且示出野生型精氨酸侧链的位置以及它如何与DNA分子的磷酸主链相互作用。图3B(SEQ ID No:7至17)描绘示例性ZFN序列，其示出其中此精氨酸位于每个锌指的一级序列中(经由粗体箭头指示的‘R’残基的垂直行)并且还突出显示被ZFP主链中的谷氨酰胺取代以消除相应的磷酸接触的那些精氨酸(单独加框的‘R’残基)。所述序列还显示识别螺旋区(其中残基-1至+3、+5和+6被加框且加阴影)以及C-末端锌指结构域与裂解结构域之间的接头的一部分(裂解结构域未示出)。图3C进一步描绘FokI裂解结构域中存在的另一个潜在主链接触赖氨酸侧链的空间位置，其在特异性优化期间可被取代为丝氨酸。

图4是比较通过在各种测试的基因座处用原始51857/51949对或优化的63014/65722对处理CD34细胞的修饰水平的图。跨底部或在x轴上示出被鉴别为潜在裂解靶标的基因座，其中每个位点的插入缺失百分比在垂直或y轴上示出。注意，y轴以对数尺度显示。深灰色条示出由51857/51949对裂解的基因座，以及检测到的裂解的量，而浅灰色条是由优化的对裂解的那些基因座，其中几乎所有测量的裂解都是在靶向BCL11a靶序列处。

图5A和5B是描绘在用BCL11A特异性ZFN和红细胞分化处理后在hCD34+细胞中制备的珠蛋白mRNA的相对比率的图。将源自两个健康人供体(PB-MR-003或PB-MR-004)的CD34+细胞用或不用ZFN对处理，且然后分析α、β和γ珠蛋白表达。用于确定ZFN处理后发现的γ珠蛋白mRNA的量的最佳方法是将表达的变化表示为γ珠蛋白与β珠蛋白的比率(图5A)，或γ珠蛋白与α珠蛋白mRNA的比率(图5B)。

图6是描绘在处理的CD34+细胞中产生的γ-珠蛋白的相对量的图。如上所述，使用源自健康人供体的两个CD34+细胞批次(PB-MR-003和PB-MR-004)。在此实验中，在63014/65722介导的两个供体批次中BCL11A增强子的破坏中，在HSPC的红细胞子代中观察到胎儿珠蛋白百分比升高约3-4倍至约15％-20％的水平。

图7是指示植入如上所述的63014/65722处理的供体批次(“+ZFN”)的小鼠中的相对人嵌合体的图。通过使用FACS检测在其表面上携带hCD45标记的细胞来测量人嵌合体。指示在移植后8或12周收集的外周血中人hCD45+细胞的百分比。数据表明此研究中的良好植入水平与未转染的对照(“(-)”)和ZFN转染的HSPC(“+ZFN”)植入后相当的人嵌合体。空心圆圈和三角形代表个体动物。

图8示出在植入小鼠的骨髓中检测到的嵌合体的百分比，其中通过在其细胞表面上的hCD45存在来鉴别人细胞。在植入后12周分析样品。

图9A至9D是描绘用识别谱系特异性细胞表面标志物的抗体通过在第12周获得的植入小鼠中的骨髓细胞的FACS分析测试的各种造血细胞谱系的重建的图。数据表明，在BCL11A特异性ZFN mRNA处理的CD34+细胞子代(“‘14/’22”)与未转染的细胞(“(-)”)之间注射后第12周骨髓中所有分析的人造血细胞谱系的可比较的表示。示出对于源自两个供体(“003”和“004”)的细胞，来自淋巴、骨髓、红细胞和HSPC的数据(分别图9A至9D)。数据表明，在Bcl11A ZFN mRNA处理的CD34+细胞子代与未转染的细胞之间注射后第12周骨髓中所有分析的人造血细胞谱系的可比较的表示。

图10是描绘通过深度测序测定的从植入小鼠的外周血分离的DNA中BCL11A靶标处的基因修饰的水平的图。示出输入细胞的数据(ZFN转染后2天，(“+”))，且然后植入后8或12周的血细胞的数据，并且证明基因修饰的良好保留。未转染的细胞在处理系中由“(-)”表示。

图11是描绘在ZFN处理的细胞(“+”)植入后骨髓细胞样品的BCL11A靶标处的基因修饰的量的图。未处理的细胞在处理系中由“(-)”表示。在BCL11A依赖性谱系(B细胞，表达CD19标志物；原始祖细胞，表达CD45和高水平的CD38)和BCL11A非依赖性(骨髓)谱系两者中均观察到可比较的修饰。尽管输入基因修饰水平在PB-MR-003供体样品中高于PB-MR-004供体样品，但PB-MR-004来源的细胞始终显示更高的修饰水平，即在小鼠中比在源自PB-MR-003来源的细胞中更好的修饰保留。

图12是描绘源自后的第12周骨髓细胞的红细胞中基因修饰的量的图。数据来自最初植入上述两种不同供体的小鼠，并且证明由ZFN处理介导的BCL11A修饰(“+ZFN”)在红细胞分化期间未显著改变。未用ZFN处理的细胞由“(-)ZFN”表示。

图13A和13B是描绘编码mRNA的γ-珠蛋白的相对量的图，其中γ-珠蛋白mRNA的浓度被描绘为γ珠蛋白/β珠蛋白mRNA的比率(图9A)或γ珠蛋白/α珠蛋白mRNA的比率(图9B)。在未转染的样品(“(-)ZFN”)和ZFN处理的样品(“+ZFN”)中，γ-珠蛋白与β珠蛋白的比率或γ-珠蛋白与α-珠蛋白mRNA的比率在来自同一组的个体小鼠的红细胞子代之间广泛不同。然而，尽管这种可变性和通过使用两种不同的人供体引入的可变性，但与其相应未转染的对应物相比，63014/65722处理的样品平均值显示γ珠蛋白mRNA水平的约1.5-2倍增加。

图14是描绘来自植入小鼠的骨髓源性细胞中γ-珠蛋白的量(表示为γ-珠蛋白/α-珠蛋白或γ-珠蛋白/总β样蛋白的比率)的差异的图，其中使骨髓细胞经受体外分化方案。在分化后16天测量蛋白质水平。确定了γ(γ)珠蛋白(Aγ和Gγ峰的和)与α(α)珠蛋白比率，以及γ珠蛋白(Aγ和Gγ峰的和)/相对于β样珠蛋白(Aγ、Gγ、β和δ-珠蛋白峰的和)比率。与PB-MR-003源性样品的较差红细胞分化一致，来自此供体的未转染的细胞中的γ-珠蛋白水平非常高(约30％)，并且因此ZFN处理(“+ZFN”)导致与未处理的细胞(“(-)ZFN”)相比，γ-珠蛋白水平仅增加1.2倍。PB-MR-004显示更典型的未转染的水平(约9％)，并且在通过小鼠12周后表现出γ-球蛋白水平增加约2倍。

具体实施方式

本文公开了用于调节BCL11A、γ珠蛋白以及BLC11A和γ珠蛋白表达的组合、以及用于治疗、预防或治疗和预防血红蛋白病的基因组工程化的组合物和方法。特别地，经由用如表1的单行所示的包含具有识别螺旋区的ZFP的核酸酶靶向，BCL11A的增强子的破坏在HSC/PC中有效地实现，并且导致随后红细胞生成期间相对γ珠蛋白表达的变化。BCL11A和γ珠蛋白表达的这种调节特别适用于治疗血红蛋白病(例如，β地中海贫血、镰状细胞病)，其中存在β珠蛋白表达不足或β-珠蛋白的突变形式的表达。使用本发明的方法和组合物，可通过改变红细胞前体细胞中γ珠蛋白的表达来克服由异常β珠蛋白引起的并发症和疾病相关的后遗症。

总则

除非另外指示，否则方法的实施以及本文公开的组合物的制备和用途采用分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA以及本领域技术内的相关领域中的常规技术。这些技术在文献中得以充分说明。参见例如，Sambrook等人MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,第二版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989和第三版,2001；Ausubel等人,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987和定期更新；丛书METHODS IN ENZYMOLOGY,AcademicPress,San Diego；Wolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION,第三版,AcademicPress,San Diego,1998；METHODS IN ENZYMOLOGY,第304卷,“Chromatin”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe编),Academic Press,San Diego,1999；以及METHODS IN MOLECULARBIOLOGY,第119卷,“Chromatin Protocols”(P.B.Becker编)Humana Press,Totowa,1999。

定义

术语“核酸”、“多核苷酸”以及“寡核苷酸”可互换使用，并且是指呈线性或环状构象以及呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。出于本公开的目的，这些术语不应解释为关于聚合物的长度进行限制。所述术语可涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖、磷酸部分(例如，硫代磷酸酯主链)以及选自碱基、糖和磷酸部分的组合中被修饰的核苷酸。一般而言，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即A的类似物将与T碱基配对。

术语“多肽”、“肽”以及“蛋白质”可互换使用来指氨基酸残基的聚合物。所述术语还适用于一种或多种氨基酸是对应的天然存在的氨基酸的化学类似物或修饰衍生物的氨基酸聚合物。

“结合”是指大分子之间(例如，蛋白质与核酸之间)的序列特异性、非共价相互作用。不是所有的结合相互作用组分都需要是序列特异性的(例如，与DNA主链中的磷酸残基接触)，只要相互作用总体上是序列特异性的即可。此类相互作用的特征通常在于10^-6M^-1或更低的解离常数(K_d)。“亲和力”是指结合强度：结合亲和力增加与K_d较低相关。

“结合蛋白”是能够结合至另一种分子的蛋白质。结合蛋白可结合至例如DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)、蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)，或者可结合至选自DNA分子、RNA分子或蛋白质的分子的组合。在蛋白质结合蛋白的情况下，它可结合至本身(以形成同二聚体、同三聚体等)，它可结合至一种或多种不同蛋白质的一种或多种分子，或者它可结合至本身以及一种或多种不同蛋白质的一种或多种分子两者。结合蛋白可具有多于一种类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合以及蛋白质结合活性。

“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)是通过一个或多个锌指以序列特异性方式结合DNA的蛋白质或较大蛋白质内的结构域，所述一个或多个锌指是其结构通过锌离子配位稳定的结合结构域内的氨基酸序列区。术语锌指DNA结合蛋白常缩写为锌指蛋白或ZFP。

“TALE DNA结合结构域”或“TALE”是包含一个或多个TALE重复结构域/单元的多肽。重复结构域参与TALE与其同源靶DNA序列的结合。单一“重复单元”(也称为“重复序列”)的长度通常是33-35个氨基酸，并且表出与天然存在TALE蛋白质内的其他TALE重复序列的至少一些序列同源性。

锌指和TALE结合结构域可经“工程化”以结合至预定核苷酸序列，例如经由天然存在的锌指或TALE蛋白的识别螺旋区的工程化(改变一个或多个氨基酸)。因此，工程化DNA结合蛋白(锌指或TALE)是非天然存在的蛋白质。用于将DNA结合蛋白工程化的方法的非限制性实例是设计和选择。设计的DNA结合蛋白是自然界中不存在的蛋白质，其设计/组成主要是合理标准的结果。用于设计的合理标准包括取代规则以及用于处理数据库中的信息的计算机化算法的应用，所述数据库存储了现有ZFP和/或TALE设计和结合数据的信息。参见，例如美国专利号6,140,081；6,453,242；6,534,261和8,585,526；还参见PCT公布号WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。

“选择的”锌指蛋白或TALE是未在自然界中发现的蛋白质，所述蛋白质的产生主要是经验过程(如噬菌体展示、相互作用陷阱或杂交选择)的结果。参见例如，美国专利号5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,200,759；8,586,526；PCT公布号WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197；WO 02/099084。

“TtAgo”是被认为参与基因沉默的原核Argonaute蛋白质。TtAgo来源于细菌嗜热栖热菌。参见例如，Swarts等人同上,G.Sheng等人(2013)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111,652)。“TtAgo系统”是所需要的所有组分，包括例如用于由TtAgo酶裂解的引导DNA。

“重组”是指在两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程，包括但不限于通过非同源末端连接(NHEJ)进行的供体捕获，以及同源重组。出于本公开的目的，“同源重组(HR)”是指这种交换的特定形式，所述交换在例如经由同源定向修复机制所进行的细胞中的双链断裂修复期间发生。这个过程需要核苷酸序列同源性，使用“供体”分子以作为“靶”分子(即，经历双链断裂的分子)的修复模板，并且这个过程分别被称为“无交叉基因转换”或“短序列段基因转换(short tract gene conversion)”，因为其导致基因信息从供体转移至所述靶。不希望受任何特定理论束缚，这种转移可涉及在断裂的靶标与供体之间形成的异源双链体DNA的错配校正，“合成依赖性链退火”，在所述退火中供体用来重新合成将成为靶标的一部分的基因信息、相关的过程或其组合。这种特化HR常常导致靶分子的序列改变，以使得供体多核苷酸的部分或全部序列被并入靶多核苷酸中。

在本公开的方法中，如本文所述的一种或多种靶向核酸酶在预定位点处的靶序列(例如，细胞染色质)中产生双链断裂(DSB)。DSB可通过同源定向修复或非同源定向修复机制而导致插入缺失。缺失可包括任何数目的碱基对。类似地，插入可包括任何数目的碱基对，包括例如“供体”多核苷酸的整合，任选地与断裂区中的核苷酸序列具有同源性。供体序列可以物理整合或，可替代地，供体多核苷酸被用作用于通过同源组合来修复断裂的模板，这将导致引入供体中的全部或部分核酸序列至细胞染色质中。因此，可改变细胞染色质中的第一序列，并且在某些实施方案中，可转换成存在于供体多核苷酸中的序列。因此，使用术语“置换(replace)”或“置换(replacement)”可理解为表示用另一核苷酸序列置换一个核苷酸序列(即，在信息意义上置换序列)，并且不一定需要用另一多核苷酸来物理或化学地置换一个多核苷酸。

在本文所述的任何方法中，另外的锌指蛋白或TALEN对可用于对细胞内另外的靶位点进行另外的双链裂解。

本文所述的任何方法可通过破坏目标基因表达的供体序列的靶向整合来用于任何大小的供体的插入或细胞中一种或多种靶序列的部分或完全灭活。还提供了具有部分或完全灭活的基因的细胞系。

在本文所述的任何方法中，外源核苷酸序列(“供体序列”或“转基因”)可包含与目标区中的基因组序列同源但不同的序列，因此刺激同源重组以在目标区插入不相同序列。因此，在某些实施方案中，与目标区中的序列同源的供体序列部分展现出与所置换的基因组序列约80％至99％之间(或其间的任何整数)的序列同一性。在其他实施方案中，例如如果具有超过100个连续碱基对的供体与基因组序列之间仅有1个核苷酸不同，供体与基因组序列之间的同源性高于99％。在某些情况下，供体序列的非同源部分可包含目标区中不存在的序列，这样使得新的序列引入目标区中。在这些情况下，非同源序列通常侧接具有50-1,000个碱基对(或其间的任何整数值)或大于1,000个碱基对的任何数目的序列，这些序列与目标区中的序列同源或相同。在其他实施方案中，供体序列与第一序列是非同源的，并且供体序列通过非同源重组机制插入基因组中。

“裂解”是指DNA分子的共价主链的断裂。可通过各种各样的方法来开始裂解，所述方法包括但不限于磷酸二酯键的酶水解或化学水解。单链裂解和双链裂解均是可能的，并且双链裂解可由于两个相异单链裂解事件而发生。DNA裂解可导致产生平末端或交错末端。在某些实施方案中，融合多肽用于靶向双链DNA裂解。

“裂解半结构域”是与第二多肽(相同的或不同的)连接形成具有裂解活性(优选地双链裂解活性)的复合物的多肽序列。术语“第一和第二裂解半结构域”；“+和-裂解半结构域”以及“右和左裂解半结构域”可交换使用，是指二聚化的裂解半结构域对。

“工程化的裂解半结构域”是已经修饰以便与另一裂解半结构域(例如，另一工程化的裂解半结构域)形成专性异二聚体的裂解半结构域。还参见美国专利号7,888,121；7,914,796；8,034,598；8,623,618和美国专利公布号2011/0201055，所述专利以引用的方式整体并入本文。

术语“序列”是指任何长度的核苷酸序列，所述核苷酸序列可以是DNA或RNA；可以是直链的、环状的或支链的，并且可以是单链或双链的。术语“供体序列”是指插入基因组中的核苷酸序列。供体序列可具有任何长度，例如2与100,000,000个核苷酸之间的长度(或其间或其上的任何整数值)，优选地约100与100,000个核苷酸之间的长度(或其间的任何整数)，更优选地约2000与20,000个核苷酸之间的长度(或其间的任何值)且甚至更优选地约5与15kb之间(或其间的任何值)。

“染色质”是包含细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包含核酸(主要为DNA)以及蛋白质，所述蛋白质包括组蛋白和非组蛋白染色体蛋白。大多数真核细胞染色质以核小体的形式存在，其中核小体核心包括近似150个与八聚物相关的DNA碱基对，所述八聚物包括组蛋白H2A、H2B、H3以及H4的每两个；并且接头DNA(取决于生物体具有可变长度)在核小体核心之间伸展。组蛋白H1分子一般与接头DNA缔合。出于本公开的目的，术语“染色质”意在涵盖所有类型的原核和真核的细胞核蛋白。细胞染色质包括染色体染色质和游离基因染色质。

“染色体”是包含细胞的基因组的全部或一部分的染色质复合物。细胞基因组的特征常常在于其核型，所述核型是包含细胞基因组的所有染色体的集合。细胞的基因组可包括一种或多种染色体。

“游离基因”是包含并非细胞染色体核型的一部分的核酸的复制型核酸、核蛋白复合物或其他结构。游离基因的实例包括质粒和某些病毒基因组。

“可接近区”是细胞染色质中的位点，在所述位点中存在于核酸中的靶位点可被识别靶位点的外源分子结合。不希望受任何具体理论束缚，据信可接近区是未被包装成核小体结构的区。可接近区的独特结构经常可通过其对化学和酶探针(例如核酸酶)的敏感性来检测。

“靶位点”或“靶序列”是定义结合分子将结合(条件是存在用于结合的充足条件)的核酸部分的核酸序列。

“外源”分子是通常不存在于细胞中，但可通过一种或多种基因、生物化学或其他方法来引入细胞中的分子。“通常存在于细胞中”是相对于细胞的具体发育阶段和环境条件而确定的。因此，例如，仅在胚胎肌肉发育期间存在的分子相对于成人肌肉细胞是外源分子。类似地，由热休克诱导产生的分子相对于非热休克细胞是外源分子。外源分子可以包括例如功能失常的内源分子的功能形式，或功能正常的内源分子的功能失常形式。

除了别的之外，外源分子可以是小分子，诸如通过组合化学过程产生的小分子，或大分子，诸如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何经修饰衍生物或包含上述分子中的一种或多种的任何复合物。核酸包括DNA和RNA，可以是单链或双链的；可以是直链、支链或环状的；而且可以是任何长度。核酸包括能够形成双链体的那些核酸以及形成三链体的核酸。参见，例如美国专利号5,176,996和5,422,251。蛋白质包括但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脱甲基化酶、乙酰基转移酶、脱乙酰酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶以及解旋酶。

外源分子可为与内源分子相同类型的分子，例如外源蛋白质或核酸。例如，外源性核酸可以包括感染性病毒基因组、引入细胞中的质粒或游离基因或通常不存在于细胞中的染色体。用于将外源分子引入细胞的方法是本领域技术人员已知的，并且包括但不限于脂质介导的传递(即，脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注入、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的传递以及病毒载体介导的传递。外源性分子也可为与内源性分子相同类型的分子，但是来源于与产生细胞的物种不同的物种。例如，可将人核酸序列引入到最初源自小鼠或仓鼠的细胞系中。

相比之下，“内源性”分子是在特定环境条件下在特定发育阶段通常存在于特定细胞中的分子。例如，内源核酸可以包括染色体、线粒体、叶绿体或其他细胞器的基因组、或天然存在的游离核酸。另外的内源分子可包括蛋白质，例如转录因子和酶。

如本文所用，术语“外源核酸的产物”包括多核苷酸和多肽产物，例如转录产物(多核苷酸，诸如RNA)和翻译产物(多肽)。

“融合”分子是两个或更多个亚基分子优选共价地连接的分子。亚基分子可为相同化学类型的分子，或者可为不同化学类型的分子。第一种类型的融合分子的实例包括但不限于融合蛋白(例如，在ZFP或TALE DNA结合结构域与一个或多个活化结构域之间融合)以及融合核酸(例如，编码上文所述的融合蛋白的核酸)。第二种类型的融合分子的实例包括但不限于形成三链体的核酸与多肽之间的融合以及小沟结合剂与核酸之间的融合。

细胞中融合蛋白的表达可以通过将融合蛋白递送至细胞或通过将编码融合蛋白的多核苷酸递送至细胞而引起，其中所述多核苷酸得到转录并且转录物得以翻译以产生融合蛋白。反式剪接、多肽裂解以及多肽连接也可能参与细胞中蛋白质的表达。本公开在别处提出了用于向细胞递送多核苷酸和多肽的方法。

出于本公开的目的，“基因”包括编码基因产物(参见下文)的DNA区，以及调控基因产物产生的所有DNA区，无论此类调控序列是否与编码序列、转录序列以及编码序列和转录序列的组合邻近。因此，基因包括但不一定限于启动子序列、终止子、翻译调控序列如核糖体结合位点和内核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点以及基因座控制区。

“基因表达”是指将包含在基因中的信息转变成基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、微小RNA、核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)或通过mRNA的翻译产生的蛋白质。基因产物还包括通过诸如加帽、聚腺苷酸化、甲基化以及编辑的方法来修饰的RNA，以及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化、肉豆蔻基化以及糖基化来修饰的蛋白质。

基因表达的“调节”是指基因活性的变化。表达的调节可包括但不限于基因活化和基因阻遏。基因编辑(例如，裂解、改变、灭活、随机突变)可用于调节表达。基因灭活是指与不包含如本文所述的ZFP、TALE或CRISPR/Cas系统的细胞相比的基因表达的任何减少。因此，基因失活可能是部分的或完全的。

“受保护的”mRNA是其中mRNA以某种方式被改变以增加mRNA的稳定性或翻译的mRNA。保护的实例包括使用2-硫尿苷(s2U)和5-甲基胞苷(m5C)置换达25％的细胞因子和尿苷残基。与其未修饰的对应物相比，所得mRNA表现出较低的免疫原性和更高的稳定性。(参见Karikó等人((2012),Molecular Therapy,第16卷,第11期,第1833–1844页)。其他变化包括添加所谓的ARCA帽，这增加了体外产生的mRNA的可翻译性(参见美国专利号7,074,596)。

“目标区”是任何细胞染色质区，例如像基因或基因内部或基因附近的非编码序列，其中结合外源分子是合乎需要的。结合可以是出于靶向DNA裂解、靶向重组以及靶向DNA裂解与靶向重组的组合的目的。目标区可以存在于例如染色体、附加体、细胞器基因组(例如，线粒体、叶绿体)或感染性病毒基因组中。目标区可处于基因编码区内、处于转录的非编码区(例如像前导序列、尾随序列或内含子)内或者处于编码区上游或下游内的非转录区内。目标区的长度可小至单个核苷酸对，或达2,000个核苷酸对，或任何整数值的核苷酸对。

“真核”细胞包括但不限于真菌细胞(诸如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人细胞(例如，T-细胞)。

术语“可操作的连接(operative linkage)”和“可操作地连接(operativelylinked)”(或“可操作地连接”(operably linked))关于并列的两种或更多种组分(诸如序列元件)可互换使用，其中组分被布置为使得组分正常发挥作用并且允许以下可能性：至少一种组分可介导施加在至少一种其他组分上的功能。作为说明，如果响应于一种或多种转录调控因子存在或不存在，转录调控序列控制编码序列转录水平，则转录调控序列(诸如启动子)可以可操作地连接至编码序列。转录调控序列一般以顺式形式与编码序列可操作地连接，但无需与编码序列直接相邻。例如，增强子是可操作地连接至编码序列的转录调控序列，虽然它们不是邻接的。

相对于融合多肽，术语“可操作地连接”可指以下事实：各组分在与其他组分连接的情况下进行与如果其未如此连接时将进行的功能相同的功能。例如，关于ZFP、TALE或CasDNA结合结构域融合至活化结构域的融合多肽，如果在融合多肽中ZFP、TALE或Cas DNA结合结构域部分能够结合其靶位点、其结合位点以及其靶位点与结合位点的组合，同时活化结构域能够上调基因表达，则所述ZFP、TALE或Cas DNA结合结构域和活化结构域处于可操作连接中。关于其中ZFP、TALE或Cas DNA结合结构域融合至裂解结构域的融合多肽，如果在融合多肽中，ZFP、TALE或Cas DNA结合结构域部分能够结合其靶位点、其结合位点以及其靶位点与其结合位点的组合，同时裂解结构域能够在靶位点附近裂解DNA，则所述ZFP、TALE或Cas DNA结合结构域和裂解结构域处于可操作连接。

蛋白质、多肽或核酸的“功能片段”是序列不同于全长蛋白质、多肽或核酸但保留与全长蛋白质、多肽或核酸相同的功能的蛋白质、多肽或核酸。功能片段可具有与相应的天然分子相比更多、更少或相同数量的残基，可含有一个或多个氨基酸或核苷酸取代，并且可以是具有与对应的天然分子更、更少或相同数量的残基与含有一个或多个氨基酸或核苷酸取代的组合。用于测定核酸功能(例如，编码功能、与另一核酸杂交的能力)的方法是本领域中熟知的。类似地，测定蛋白质功能的方法是熟知的。例如，多肽的DNA结合功能可以例如通过过滤结合、电泳迁移位移或免疫沉淀测定来测定。DNA裂解可通过凝胶电泳来测定。参见Ausubel等人，同上。蛋白质与另一种蛋白质相互作用的能力可通过例如免疫共沉淀、双杂交测定或基因和生物化学的互补作用来测定。

“载体”能够将基因序列转移至靶细胞。通常，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”意味着能够指导目标基因的表达并且可将基因序列转移至靶细胞的任何核酸构建体。因此，所述术语包括克隆和表达媒介物，以及整合载体。

术语“受试者”和“患者”可互换使用，并且是指哺乳动物诸如人患者和非人灵长类动物以及实验动物，诸如猪、牛、兔、狗、猫、大鼠、小鼠以及其他动物。因此，如本文所用的术语“受试者”或“患者”意指可施用本发明的干细胞的任何哺乳动物患者或受试者。本发明的受试者包括已暴露于一种或多种化学毒素(包括例如神经毒素)的那些受试者。

“干性质”是指任何细胞以干细胞样方式起作用的相对能力，即任何特定干细胞可具有的全能性、多能性或寡能性以及扩增的或无限的自我更新的程度。

核酸酶

本文描述了适用于在体内裂解携带转基因的供体分子的组合物(特别是核酸酶)以及用于裂解细胞的基因组以使得所述转基因以靶向方式整合至所述基因组中的核酸酶。在某些实施方案中，一种或多种核酸酶为天然存在的。在其他实施方案中，一种或多种核酸酶是非天然存在的，即在DNA结合结构域、裂解结构域以及DNA结合结构域与裂解结构域的组合方面进行工程化。例如，可改变天然存在的核酸酶的DNA结合结构域以结合至所选靶位点(例如，已工程化来结合至不同于同源结合位点的大范围核酸酶)。在其他实施方案中，所述核酸酶包含异源DNA结合结构域和裂解结构域(例如，锌指核酸酶；TAL效应物结构域DNA结合蛋白；具有异源裂解结构域的大范围核酸酶DNA结合结构域)。

A.DNA结合结构域

在某些实施方案中，用于细胞的基因组的体内裂解、靶向裂解以及细胞的基因组的体内裂解与靶向裂解的组合的一种或多种核酸酶的DNA结合结构域包含锌指蛋白。单一锌指蛋白由多个锌指结构域(例如，3、4、5、6个或更多个锌指结构域)组成。每个锌指结构域的长度是约30个氨基酸，它含有β转角(含有两个锌配位残基)和α螺旋(含有两个不变的锌配位残基)，它们以允许蛋白质结合至靶序列的特定构象保持。可使用在β转角中具有两个半胱氨酸(Cys)锌配位残基并且在α螺旋或非规范(CH3)中具有两个组氨酸(His)锌配位残基的规范(C2H2)锌指结构域。参见例如，美国专利号9,234,187。7个氨基酸的识别螺旋包含在β-转角的锌配位残基与α螺旋的锌配位残基之间。识别螺旋区在锌指结构域内编号为-1至+6并且这一识别区外的氨基酸(并且不包括锌配位残基)被称为主链残基。

优选地，所述锌指蛋白是非天然存在的，因为所述识别螺旋经工程化以结合至所选靶位点。参见例如，Beerli等人(2002)Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo等人(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340；Isalan等人(2001)Nature Biotechnol.19:656-660；Segal等人(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637；Choo等人(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416；美国专利号6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273；以及美国专利公布号2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061，所有文献均以引用的方式整体并入本文。

与天然存在的锌指蛋白相比，工程化的锌指结合结构域可具有新型结合特异性。工程化方法包括但不限于合理的设计和各种类型的选择。合理的设计包括例如使用包含三联体(或四联体)核苷酸序列和单独锌指氨基酸序列的数据库，其中每个三联体或四联体核苷酸序列与结合特定三联体或四联体序列的锌指的一个或多个氨基酸序列缔合。参见例如，共同拥有的美国专利号6,453,242和6,534,261，所述专利以引用的方式整体并入本文。

此外，在某些实施方案中，ZFP DNA结合结构域还包含对一个或多个组分锌指结构域的主链的一种或多种修饰。ZFP对靶DNA序列的特异性取决于锌指结构域与特定DNA碱基之间，特别是识别螺旋区与靶位点之间的序列特异性接触(通常每个识别螺旋结合至3个核苷酸的靶亚位点)。此外，锌指结构域还包含参与同DNA主链的磷酸的非特异相互作用的氨基酸残基。Elrod-Erickson等人((1996)Structure 4:1171)通过锌指蛋白及其同源DNA靶标的共结晶证明，存在能够通过形成氢键与DNA主链上的磷酸相互作用的特定氨基酸。采用众所周知的Zif268主链的锌指蛋白通常具有精氨酸作为其第二β-折叠链的氨基末端残基，其也是第二不变半胱氨酸的羧基末端的第二位置。此位置在每个锌指结构域内可称为(-5)，因为它是α-螺旋起始前的第5个残基(以及相对于编号-1至+6的识别螺旋的位置-5)。此位置的精氨酸可经由与其侧链胍基团形成带电荷的氢键而与DNA主链上的磷酸相互作用。Zif268主链中的锌指蛋白通常在为第一不变半胱氨酸的氨基末端的4个残基的位置处具有赖氨酸。此位置可在每个指内称为(-14)，因为它是锌指的α-螺旋起始前的第14个残基，在锌配位半胱氨酸残基之间具有两个残基(以及相对于编号-1至+6的识别螺旋区的位置-14)。赖氨酸可经由与其侧链氨基形成水介导的带电荷的氢键而与DNA主链上的磷酸相互作用。由于沿DNA主链都发现了磷酸基团，因此锌指与DNA分子之间的这种类型的相互作用通常被认为是非序列特异性的(J.Miller,Massachusetts Institute of TechnologyPh.D.Thesis,2002)。

最近的研究假设，一些核酸酶中的非特异性磷酸接触侧链也可产生那些核酸酶的一定量的非特异性(Kleinstiver等人(2016)Nature529(7587):490-5；Guilinger等人(2014)Nat Meth:429-435)。研究人员已经提出这些核酸酶可具有‘过量DNA结合能’，这意味着所述核酸酶对其DNA靶标的亲和力可能大于基本上结合和裂解靶位点所需的亲和力。因此，尝试降低TALE DNA结合结构域(Guilinger，同上)或Cas9DNA结合结构域(Kleinstiver，同上)中的阳离子电荷，以降低这些核酸酶的DNA结合能，从而产生增加的体外裂解特异性。然而，另外的研究(Sternberg等人(2015)Nature 527(7576):110-113)也表明一些阳离子氨基酸在Cas9核酸酶结构域的正确折叠和活化中的作用，所述阳离子氨基酸在Cas9DNA结合结构域的Kleinstiver研究中突变。因此，这些氨基酸在Cas9活性中的确切作用尚不清楚。

因此，本发明的方法和组合物包括ZFP DNA结合结构域(‘ZFP主链’)内的氨基酸的突变，所述氨基酸可与DNA主链上的磷酸非特异性相互作用，但它们不包含DNA识别螺旋中的变化。因此，本发明包括ZFP主链中阳离子氨基酸残基的突变，所述阳离子氨基酸残基不是核苷酸靶特异性所必需的。在一些实施方案中，ZFP主链中的这些突变包括将阳离子氨基酸残基突变为中性或阴离子氨基酸残基。在一些实施方案中，ZFP主链中的这些突变包括将极性氨基酸残基突变为中性或非极性氨基酸残基。在优选的实施方案中，相对于DNA结合螺旋在位置(-5)、位置(-9)、位置(-14)处进行突变，以及选自在位置(-5)、位置(-9)和位置(-14)处进行的突变的突变的组合。在一些实施方案中，锌指可包含(-5)、(-9)、(-14)处的一种或多种突变，以及选自(-5)、(-9)和(-14)处的突变的突变的组合。在其他实施方案中，多指锌指蛋白中的一个或多个锌指可包含(-5)、(-9)、(-14)以及选自(-5)、(-9)和(-14)的组合中的突变。在一些实施方案中，(-5)、(-9)、(-14)以及选自(-5)、(-9)和(-14)的组合处的氨基酸(例如精氨酸(R)或赖氨酸(K))被突变为丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、Ser(S)、Asp(D)、Glu(E)、Tyr(Y)和/或谷氨酰胺(Q)。

在本文所述的任何这些融合多肽中，ZFP配偶体还可包含锌指DNA结合结构域中的(-5)、(-9)、(-14)位置以及选自(-5)、(-9)和(-14)处的突变的突变的组合中的突变。在一些实施方案中，位置-5处的Arg(R)被改变为Tyr(Y)、Asp D)、Glu(E)、Leu(L)、Gln(Q)或Ala(A)。在其他实施方案中，位置(-9)处的Arg(R)被Ser(S)、Asp(D)或Glu(E)置换。在其他实施方案中，位置(-14)处的Arg(R)被Ser(S)或Gln(Q)置换。在其他实施方案中，所述融合多肽可包含锌指DNA结合结构域中的突变，其中(-5)、(-9)、(-14)位置以及选自(-5)、(-9)和(-14)处的突变的突变的组合处的氨基酸被改变为处于任何组合的以上列出的氨基酸中的任一者。

包括噬菌体展示和双杂交系统的示例性选择方法公开于美国专利5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466；6,200,759以及6,242,568；以及WO98/37186；WO 98/53057；WO00/27878；WO 01/88197以及GB 2,338,237中。此外，用于锌指结合结构域的结合特异性的增强已经在例如共同拥有的WO 02/077227中有所描述。

靶位点的选择；用于设计和构建融合蛋白(和编码所述融合蛋白的多核苷酸)的ZFP和方法为本领域技术人员已知并且详细描述于美国专利号6,140,081；5,789,538；6,453,242；6,534,261；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,200,759；PCT公布号WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197；WO 02/099084；WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536以及WO 03/016496中。

几乎任何接头(间隔区)都可用于DNA结合结构域的一个或多个组分(例如，锌指)之间、一个或多个DNA结合结构域之间、DNA结合结构域与功能结构域(例如，核酸酶)之间和一个或多个DNA结合结构域之间以及DNA结合结构域与功能结构域之间。合适的接头序列的非限制性实例包括美国专利号8,772,453；7,888,121；6,479,626；6,903,185；和7,153,949；以及美国专利公布号2009/0305419；2015/0064789和2015/0132269。因此，本文描述的蛋白质可包含本文所述的组合物的单独DNA结合组分之间、DNA结合结构域与功能结构域之间或一个或多个DNA结合结构域之间以及DNA结合结构域与功能结构域之间的合适接头的任何组合。

B.裂解结构域

任何合适的裂解结构域可以可操作地连接至如本文所述的DNA结合结构域以形成核酸酶。所述裂解结构域可与DNA结合结构域(例如，锌指DNA结合结构域和来自核酸酶的裂解结构域)异源。异源裂解结构域可从任何核酸内切酶或核酸外切酶获得。裂解结构域可来源于的示例性核酸内切酶包括但不限于限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶。参见例如，2002-2003Catalogue,New England Biolabs,Beverly,MA；以及Belfort等人(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388。裂解DNA的另外的酶是已知的(例如，S1核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺DNA酶I；微球菌核酸酶；酵母HO核酸内切酶；还参见Linn等人(编)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)。这些酶(或其功能片段)的一种或多种可以用作裂解结构域和裂解半结构域的来源。

类似地，裂解半结构域可来源于如上提出的对于裂解活性需要二聚化的任何核酸酶或其部分。一般而言，如果融合分子包含裂解半结构域，则裂解需要两个融合分子。可替代地，可使用包含两个裂解半结构域的单一蛋白质。所述两个裂解半结构域可来源于相同核酸内切酶(或其功能片段)，或者每个裂解半结构域均可来源于不同的核酸内切酶(或其功能片段)。另外，两种融合蛋白的靶位点是优选地相对于彼此布置的，这样使得两种融合蛋白与它们各自的靶位点的结合将裂解半结构域放置于使得裂解半结构域例如通过二聚作用来形成功能裂解结构域的彼此空间定位中。因此，在某些实施方案中，靶位点的近边由5-8个核苷酸或由15-18个核苷酸来隔开。然而，任何整数的核苷酸或核苷酸对可介于两个靶位点之间(例如，2至50个核苷酸对或更多)。一般而言，裂解的位点位于靶位点之间。

限制性核酸内切酶(限制酶)存在于许多物种中，并且能够以序列特异性方式结合至DNA(在识别位点处)，并且在结合位点处或附近裂解DNA。某些限制酶(例如IIS型)在远离识别位点的位点处裂解DNA，并且具有可分开的结合结构域和裂解结构域。例如，IIS型酶Fok I在距其一条链上的识别位点9个核苷酸处以及在距其另一条链上的识别位点13个核苷酸处催化DNA的双链裂解。参见例如，美国专利号5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4275-4279；Li等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764-2768；Kim等人(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:883-887；Kim等人(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。因此，在一个实施方案中，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制性酶的裂解结构域(或裂解半结构域)以及一个或多个锌指结合结构域，所述锌指结合结构域可以或可以不经工程化。

对于通过序列选择性(人工)核酸酶的最佳裂解特异性，期望安排条件以使得中靶结合和活性不饱和。在饱和条件下-根据定义-使用过量的核酸酶而不是实现完全中靶活性所必需的。这种过量不提供中靶益处，但仍可导致脱靶位点处的裂解增加。对于单体核酸酶，可容易地通过进行简单的剂量反应研究以鉴别和避免滴定曲线上的饱和稳定阶段来避免饱和条件。然而，对于二聚体核酸酶如ZFN、TALEN或dCas-Fok，如果单独单体的结合亲和力不同，则鉴别和避免饱和条件可能更复杂。在此类情况下，使用简单的1:1核酸酶比例的剂量反应研究将仅揭示较弱结合单体的饱和点。在这种情况下，如果，例如，单体亲和力相差10倍，则在1:1滴定研究中鉴别的饱和点处，高亲和力单体将以比其所需的浓度高10倍的浓度存在。所得的过量较高亲和力单体可进而导致脱靶活性增加，而不在预期靶标处提供任何有益的裂解增加，这潜在导致对任何给定核酸酶对的总体特异性降低。

裂解结构域与结合结构域分离的示例性IIS型限制酶是FokI。这种特定的酶作为二聚体是有活性的。Bitinaite等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10,570-10,575。因此，出于本公开的目的，认为用于所公开的融合蛋白中的Fok I酶的部分是裂解半结构域。因此，对于靶向双链裂解、使用锌指-Fok I融合靶向置换细胞序列以及靶向双链裂解与使用锌指-Fok I融合靶向置换细胞序列的组合，各自包含FokI裂解半结构域的两种融合蛋白可用于重构催化活性的裂解结构域。可替代地，还可使用含有锌指结合结构域和两个FokI裂解半结构域的单个多肽分子。在本公开的其他位置处提供了使用锌指Fok I融合体进行靶向裂解和靶向序列改变的参数。

裂解结构域或裂解半结构域可为保留裂解活性或保留进行多聚化(例如，二聚化)以形成功能裂解结构域的能力的蛋白质的任何部分。

示例性IIS型限制酶描述于美国专利号7,888,121中，所述专利整体并入本文。另外的限制酶也含有可分开的结合结构域和裂解结构域，并且这些酶为本公开所涵盖。参见例如，Roberts等人(2003)Nucleic Acids Res.31:418-420。

在某些实施方案中，裂解结构域包含使同源二聚化最小化或防止同源二聚化的一个或多个工程化的裂解半结构域(也称为二聚化结构域突变体)，如例如参见例如美国专利号7,914,796；8,034,598和8,623,618中所描述，所述专利的全部公开内容均以引用的方式整体并入本文。FokI的位置446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537和538处的氨基酸残基都是影响FokI裂解半结构域的二聚化的靶标，其中编号是相对于具有以下所示序列的晶体结构1FOK.pdb和2FOK.pdb(参见Wah等人(1997)Nature388:97-100)：

野生型FokI裂解半结构域(SEQ ID NO:18)

QLVKSELEEKKSELRHKLKYVPHEYIELIEIARNSTQDRILEMKVMEFFMKVYGYRGKHLGGSRKPDGAIYTVGSPIDYGVIVDTKAYSGGYNLPIGQADEMQRYVEENQTRNKHINPNEWWKVYPSSVTEFKFLFVSGHFKGNYKAQLTRLNHITNCNGAVLSVEELLIGGEMIKAGTLTLEEVRRKFNNGEINF

形成专性异二聚体的Fok I的示例性工程化裂解半结构域包括如下对，在所述对中第一裂解半结构域包括在Fok I的位置490和538处的氨基酸残基的突变，并且第二裂解半结构域包括在氨基酸残基486和499处的突变。

因此，在一个实施方案中，490处的突变用Lys(K)置换Glu(E)；538处的突变用Lys(K)置换Ile(I)；486处的突变用Glu(E)置换Gln(Q)；并且位置499处的突变用Lys(K)置换Ile(I)。具体地，本文所述的工程化的裂解半结构域通过使一个裂解半结构域中的位置490(E→K)和538(I→K)突变以产生指定为“E490K:I538K”的工程化的裂解半结构域，以及通过使另一裂解半结构域中的位置486(Q→E)和499(I→L)突变以产生指定为“Q486E:I499L”的工程化的裂解半结构域来制备。本文所述的工程化的裂解半结构域是经由ZFN同二聚体的异常裂解被最小化或消除的专性异二聚突变体。参见，例如美国专利公布号2008/0131962，所述专利的公开内容出于所有目的以引用的方式整体并入。在某些实施方案中，工程化的裂解半结构域包含在位置486、499以及496(相对于野生型FokI编号)处的突变，例如在位置486处用Glu(E)残基置换野生型Gln(Q)残基、在位置499处用Leu(L)残基置换野生型Ile(I)残基以及在位置496处用Asp(D)或Glu(E)残基(也分别称为“ELD”和“ELE”结构域)置换野生型Asn(N)残基的突变。在其他实施方案中，工程化的裂解半结构域包含在位置490、538以及537(相对于野生型FokI编号)处的突变，例如在位置490处用Lys(K)残基置换野生型Glu(E)残基、在位置538处用Lys(K)残基置换野生型Ile(I)残基以及在位置537处用Lys(K)残基或Arg(R)残基(也分别称为“KKK”和“KKR”结构域)置换野生型His(H)残基的突变。在其他实施方案中，工程化的裂解半结构域包含在位置490和537(相对于野生型FokI编号)处的突变，例如在位置490处用Lys(K)残基置换野生型Glu(E)残基以及在位置537处用Lys(K)或Arg(R)残基(也分别称为“KIK”和“KIR”结构域)置换野生型His(H)残基的突变。参见，例如美国专利号7,914,796；8,034,598和8,623,618。在其他实施方案中，工程化的裂解半结构域包含“Sharkey”、“Sharkey”突变以及“Sharkey”与“Sharkey”突变的组合(参见Guo等人(2010)J.Mol.Biol.400(1):96-107)。

因此，源自FokI的裂解半结构域可包含如SEQ ID NO:18中所示的一个或多个氨基酸残基中的突变，包括如上所述的二聚化结构域中的突变、催化结构域中的突变、其他氨基酸残基(如磷酸接触残基)中的突变，以及选自二聚化结构域中的突变、催化结构域中的突变和其他氨基酸残基(如磷酸接触残基)中的突变的突变的任何组合。突变包括取代(用不同残基取代野生型氨基酸残基)、插入(一个或多个氨基酸残基)、缺失(一个或多个氨基酸残基)以及选自取代、插入和缺失的突变的任何组合。在某些实施方案中，残基414-426、443-450、467-488、501-502、521-531中的一个或多个(相对于SEQ ID NO:18编号)以及此类残基的任何组合被突变，因为这些残基在Miller等人((2007)Nat Biotechnol 25:778-784)中描述的与其靶位点结合的ZFN的分子模型中位于DNA主链附近。在某些实施方案中，位置416、422、447、448和525处的一个或多个残基被突变。在某些实施方案中，突变包括用不同的残基(例如丝氨酸(S)残基)取代野生型残基。在某些实施方案中，本文所述的核酸酶的FokI裂解结构域包含ELD二聚化结构域突变、KKR二聚化结构域突变、K525S突变，以及选自ELD二聚化结构域突变或KKR二聚化结构域突变和K525S突变的任何组合。

本文所述的工程化的裂解半结构域可使用任何合适的方法来制备，例如通过野生型裂解半结构域(Fok I)的定点诱变来制备，如美国专利号7,888,121；7,914,796；8,034,598和8,623,618中所描述。此外，本文所述的裂解结构域可使用任何合适的接头与DNA结合结构域(例如，ZFP)融合，所述接头包括但不限于美国专利号9,394,531和9,567,609中描述的接头。

或者，可在体内在核酸靶位点处使用所谓的“分裂酶”技术来组装核酸酶(参见例如，美国专利公布号2009/0068164)。此类分裂酶的组分可在分开的表达构建体上表达，或者可在单独组分由例如自裂解2A肽或IRES序列分开的一个开放阅读框中连接。组分可以是单独锌指结合结构域或大范围核酸酶核酸结合结构域的结构域。

核酸酶可在使用之前针对活性来筛选，例如在基于酵母的染色体系统中，如WO2009/042163和20090068164所描述。核酸酶的表达可处于组成型启动子或诱导型启动子的控制之下，例如，在棉子糖、半乳糖以及棉子糖与半乳糖的组合存在下被活化(去阻遏)并且在葡萄糖存在下被阻遏的半乳糖激酶启动子。

如本文所述的核酸酶可在靶位点中产生一个或多个双链切口、一个或多个单链切口，以及一个或多个双链切口与一个或多个单链切口的组合。在某些实施方案中，核酸酶包含催化失活的裂解结构域(例如，FokI、Cas蛋白以及FokI与Cas蛋白的组合)。参见，例如美国专利号9,200,266；8,703,489和Guillinger等人(2014)Nature Biotech.32(6):577-582。催化失活的裂解结构域可与催化活性结构域组合来充当切口酶以产生单链切口。因此，可组合使用两种切口酶以在特定区域中产生双链切口。另外的切口酶也是本领域中已知的，例如McCaffery等人(2016)Nucleic Acids Res.44(2):e11.doi:10.1093/nar/gkv878.Epub 2015年10月19日。

靶位点

如以上所详细描述的，DNA结构域可被工程化以结合至任何所选序列。与天然存在的DNA结合结构域相比，工程化的DNA结合结构域可具有新型结合特异性。在某些实施方案中，所述DNA结合结构域结合至BCL11A增强子序列内的序列，例如靶位点(通常9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21个或甚至更多个碱基对)位于BCL11A的外显子2与外显子3之间，包括结合至BCL11A增强子序列中DNA酶I过敏位点内的序列的DNA结合结构域(例如，+58)，如表1中所示。工程化方法包括但不限于合理的设计和各种类型的选择。合理的设计包括例如使用包含三联体(或四联体)核苷酸序列和单独锌指氨基酸序列的数据库，其中每个三联体或四联体核苷酸序列与结合特定三联体或四联体序列的锌指的一个或多个氨基酸序列缔合。参见例如，共同拥有的美国专利号6,453,242和6,534,261，所述专利以引用的方式整体并入本文。还可进行TAL效应物结构域的合理设计。参见例如，美国专利公布号2011/0301073。

适用于DNA结合结构域的示例性选择方法(包括噬菌体展示和双杂交系统)公开于美国专利号5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466；6,200,759；和6,242,568；以及PCT公布号WO 98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；WO 01/88197和英国专利号GB 2,338,237中。此外，用于锌指结合结构域的结合特异性的增强已经在例如共同拥有的WO 02/077227中有所描述。

靶位点的选择；核酸酶和用于设计并构建融合蛋白(和编码所述蛋白质的多核苷酸)的方法为本领域技术人员已知并且详细描述于美国专利公布号2005/0064474和2006/0188987中，所述专利以引用的方式整体并入本文。

另外，如这些和其他参考文献中所公开，DNA结合结构域(例如，多指锌指蛋白)以及DNA结合结构域与功能结构域的融合体可使用任何合适的接头序列，包括例如5个或更多个氨基酸长度的接头来连接在一起。美国专利号8,772,453；7,888,121(例如“ZC”接头)；6,479,626；6,903,185；和7,153,949；美国公布号2009/0305419)和2015/0064789。本文所述的蛋白质可包括蛋白质的单独DNA结合结构域之间的合适接头的任何组合。还参见美国专利号8,586,526。

供体

在某些实施方案中，本公开涉及使用本文所述的BCL11A增强子区结合分子进行核酸酶介导的外源序列靶向整合至细胞基因组中。如上所述，插入外源序列(也称为“供体序列”或“供体”或“转基因”)，例如以缺失特定区、用于校正突变基因、缺失特定区与校正突变基因的组合或增加野生型基因的表达。将显而易见的是，供体序列通常与其所置于的基因组序列不同。供体序列可含有侧接两个同源区的非同源序列，以允许目标位置处的有效HDR，或可经由非同源定向修复机制如NHEJ来整合。另外，供体序列可包含含有与细胞染色质中的目标区不同源的序列的载体分子。供体分子可含有与细胞染色质同源的若干不连续区，并且例如当用作修复由在此描述的核酸酶中的一种诱导的DSB的底物时导致BCL11A增强子区(或其片段)的缺失。此外，为了通常不存在于目标区中的序列的靶向插入，所述序列可存在于供体核酸分子中并且侧接目标区中的序列的同源区。

用于插入的多核苷酸还可被称为“外源”多核苷酸、“供体”多核苷酸或分子或“转基因”。供体多核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA，并且可以线性或环状形式引入细胞中。参见例如，美国专利申请公布号2010/0047805和2011/0207221。供体序列优选包含在DNA MC中，其可以环状或线性形式引入细胞中。如果以线性形式引入，则供体序列的末端可通过为本领域技术人员已知的方法来保护(例如，免受核酸外切降解)。例如，一个或多个双脱氧核苷酸残基被添加至线性分子的3’端，并且自互补寡核苷酸任选地连接至一个或两个末端。参见例如，Chang等人(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:4959-4963；Nehls等人(1996)Science 272:886-889。用于保护外源多核苷酸免受降解的另外方法包括但不限于添加末端氨基和使用修饰的核苷酸间键联，例如像硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。如果以双链形式引入，则供体可包含一个或多个核酸酶靶位点，例如侧接待整合至细胞基因组中的转基因的核酸酶靶位点。参见例如，美国专利公布号2013/0326645。

多核苷酸可作为载体分子的一部分引入细胞中，所述载体分子具有另外的序列，例如像复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因。此外，供体多核苷酸可作为裸核酸、作为与诸如脂质体或泊洛沙姆的药剂复合的核酸来引入，或者可通过病毒(例如，腺病毒、AAV、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒和整合酶缺陷型慢病毒(IDLV))来递送。

在某些实施方案中，双链供体包括长度大于1kb(例如介于2与200kb之间，介于2与10kb之间(或其间的任何值))的序列(例如，编码序列，也被称为转基因)。例如，双链供体还包含至少一个核酸酶靶位点。在某些实施方案中，例如对于一对ZFN或TALEN，供体包含至少2个靶位点。通常，核酸酶靶位点处于转基因序列之外(例如转基因序列的5’和/或3’)，以裂解所述转基因。核酸酶裂解位点可支持任何核酸酶。在某些实施方案中，对于相同核酸酶，双链供体中含有的核酸酶靶位点用于裂解内源性靶标，裂解的供体通过同源性非依赖性方法整合至所述内源性靶标中。

通常插入供体，以使得其表达由整合位点处的内源启动子驱动，即驱动供体所插入的内源基因表达的启动子(例如，珠蛋白、AAVS1等)。然而，将显而易见的是，供体可包含启动子、增强子以及启动子与增强子的组合，例如组成型启动子或者诱导型或组织特异性启动子。

供体分子可插入内源性基因中以使得所有、一些或没有内源性基因得以表达。在其他实施方案中，转基因(例如，有或没有珠蛋白编码序列)被整合至任何内源基因座(例如安全港基因座)中。参见例如，美国专利公布号2008/0299580；2008/0159996和2010/00218264。

此外，虽然并非为表达所必需，但是外源序列还可包括转录或翻译调控序列，例如启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点，编码2A肽、聚腺苷酸化信号的序列以及其组合。

可使用本领域已知的标准技术诸如PCR来从质粒、细胞或其他来源中分离本文所述的供体序列上携带的转基因。供使用的供体可包含不同类型的拓扑结构，包括超螺旋环状、松弛环状、线性等。可替代地，它们可使用标准寡核苷酸合成技术来以化学方式合成。另外，供体可以是甲基化的，或者缺乏甲基化。供体可呈细菌或酵母人工染色体(BAC或YAC)的形式。

本文所述的双链供体多核苷酸可包含一个或多个非天然碱基、一个或多个主链以及一个或多个非天然碱基与一个或多个主链的组合。具体而言，可使用本文所述的方法来进行具有甲基化胞嘧啶的供体分子的插入，以在目标区域达到转录静止的状态。

外源(供体)多核苷酸可包含任何目标序列(外源序列)。示例性外源序列包括但不限于任何多肽编码序列(例如，cDNA)、启动子序列、增强子序列、表位标签、标记基因、裂解酶识别位点以及各种类型的表达构建体。标记基因包括但不限于编码介导抗生素抗性(例如，氨苄青霉素抗性、卡那霉素抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性、潮霉素抗性、杀稻瘟菌素抗性)的蛋白质的序列、编码彩色或荧光或发光蛋白(例如，绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶)和介导增强的细胞生长、基因扩增以及增强的细胞生长与基因扩增的组合的序列的蛋白质(例如，二氢叶酸还原酶)的序列。表位标签包括例如FLAG、His、Myc、串联亲和纯化(TAP)、HA、可生物素化的肽或任何可检测的氨基酸序列中的一种或多种拷贝。

在一个优选实施方案中，外源序列(转基因)包含编码在细胞中表达所需要的任何多肽的多核苷酸，所述多肽包括但不限于抗体、抗原、酶、受体(细胞表面或核)、激素、淋巴因子、细胞因子、报告多肽、生长因子及以上中任一种的功能性片段。编码序列可为例如cDNA。

例如，外源序列可包含编码在患有遗传疾病的受试者中缺乏或无功能的多肽的序列，所述遗传疾病包括但不限于以下遗传疾病中的任一种：软骨发育不全、全色盲、酸性麦芽糖酶缺乏症、腺苷脱氨酶缺乏症(OMIM No.102700)、肾上腺脑白质营养不良、艾卡尔迪综合征、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、α地中海贫血、雄激素不敏感综合征、阿佩尔综合征(apertsyndrome)、致心律失常性右心室发育不良、共济失调毛细血管扩张(ataxiatelangictasia)、巴斯综合征、β-地中海贫血、蓝橡皮疱痣综合征、卡纳万病、慢性肉芽肿病(CGD)、猫叫综合症、囊性纤维化、德尔肯氏病(dercum's disease)、外胚层发育不良、范科尼贫血(fanconi anemia)、进行性骨化性纤维发育不良症(fibrodysplasiaossificansprogressive)、脆性X综合征、半乳糖血症(galactosemis)、高雪氏病(Gaucher’sdisease)、全身性神经节苷脂贮积症(例如，GM1)、血色素沉着症、β-珠蛋白第6位密码子血红蛋白C突变(HbC)、血友病、亨廷顿氏病(Huntington's disease)、贺勒综合征(HurlerSyndrome)、低磷酸酯脢症、克氏综合征(Klinefleter syndrome)、克拉伯病(KrabbesDisease)、兰格-吉戴恩综合征(Langer-Giedion Syndrome)、白细胞粘附缺乏症(LAD，OMIMNo.116920)、脑白质营养不良、长QT综合征、马方综合征(Marfan syndrome)、莫比乌斯综合征(Moebius syndrome)、粘多糖贮积症(MPS)、指甲髌骨综合征、肾源性尿崩症、神经纤维瘤、尼曼-匹克病(Neimann-Pick disease)、成骨不全症(osteogenesis imperfecta)、紫质症、普拉德-威利综合征(Prader-Willi syndrome)、早衰症、普罗特斯综合征(Proteussyndrome)、成视网膜细胞瘤、雷特综合征(Rett syndrome)、鲁宾斯坦-泰必综合征(Rubinstein-Taybi syndrome)、沙费利波综合征(Sanfilippo syndrome)、严重联合免疫缺陷(SCID)、舒瓦克曼综合征(Shwachman syndrome)、镰状细胞病(镰状细胞贫血)、史密斯-马吉利综合征(Smith-Magenis syndrome)、史蒂克勒综合征(Stickler syndrome)、泰-萨二氏病(Tay-Sachs disease)、血小板减少伴桡骨缺失(TAR)综合征(ThrombocytopeniaAbsent Radius(TAR)syndrome)、特雷彻柯林斯综合征(Treacher Collins syndrome)、染色体三倍体症、结节性硬化症、特纳氏综合征(Turner's syndrome)、尿素循环障碍、冯希普尔-林道综合征(von Hippel-Landau disease)、瓦登伯格综合征(Waardenburgsyndrome)、威廉姆斯综合征(Williams syndrome)、威尔逊氏病(Wilson's disease)、维斯科特-奥尔德里奇综合征(Wiskott-Aldrich syndrome)、X连锁淋巴组织增生综合征(XLP，OMIM No.308240)。

可由靶向整合治疗的另外示例性疾病包括获得性免疫缺陷症、溶酶体贮积病(例如，高雪氏病、GM1、法布里病(Fabry disease)和泰-萨二氏病)、粘多糖病(例如，亨特氏病(Hunter’s disease)、贺勒氏病)、血红蛋白病(例如，镰状细胞疾病、HbC、α-地中海贫血、β-地中海贫血)以及血友病。

在某些实施方案中，外源序列可包含标记基因(以上所述)，从而允许选择已进行了靶向整合的细胞和编码另外功能性的连接序列。标记基因的非限制性实例包括GFP、药物选择标记以及类似基因。

可插入的另外基因序列可包含例如野生型基因以置换突变序列。例如，野生型因子IX基因序列可插入到干细胞的基因的内源性拷贝突变的基因组中。野生型拷贝可在内源基因座处插入，或者可以可替代地靶向至安全港基因座。

按照本说说明书的教义，此类表达盒的构建利用分子生物学领域中众所周知的方法(参见，例如，Ausubel或Maniatis)。在使用表达盒产生转基因动物之前，表达盒对与所选控制元件相关的应激诱导物(stress-inducer)的响应性可通过将表达盒引入合适的细胞系(例如，原代细胞、转化细胞或永生化细胞系)中来检测。

此外，虽然并非为表达所必需，但是外源序列还可包括转录或翻译调控序列，例如启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点、编码2A肽、聚腺苷酸化信号以及2A多肽与聚腺苷酸化信号的组合的序列。此外，目标基因的控制元件可以可操作地连接至报告基因以产生嵌合基因(例如，报告表达盒)。

还可实现非编码核酸序列的靶向插入。编码反义RNA、RNAi、shRNA和微小RNA(miRNA)的序列也可用于靶向插入。

在另外的实施方案中，供体核酸可包含作为用于另外核酸酶设计的特异性靶位点的非编码序列。随后，另外的核酸酶可在细胞中表达，以便通过插入另一种目标供体分子来裂解并且修饰原始供体分子。以此方式，可产生供体分子的反复整合，从而允许具体目标基因座处或安全港基因座处的性状叠加。

递送

如本文所述的核酸酶(表1)、编码这些核酸酶的多核苷酸、供体多核苷酸和包含本文所述的蛋白质、多核苷酸以及蛋白质和多核苷酸的组合的组合物可通过任何合适方式在体内或离体递送至任何细胞类型中。

合适的细胞包括真核(例如动物)和原核细胞以及真核和原核细胞系。从此类细胞产生的此类细胞或细胞系的非限制性实例包括COS、CHO(例如，CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)和perC6细胞以及昆虫细胞如草地贪夜蛾(Sf)，或真菌细胞如酵母属、毕赤酵母属和裂殖酵母属。在某些实施方案中，细胞系是CHO、MDCK或HEK293细胞系。合适的细胞还包括干细胞，例如像胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、造血干细胞、神经元干细胞以及间充质干细胞。

如本文所述的递送核酸酶的方法描述于例如美国专利号6,453,242、6,503,717、6,534,261、6,599,692、6,607,882、6,689,558、6,824,978、6,933,113、6,979,539、7,013,219和7,163,824中，所有这些专利的公开内容均全文以引用方式并入本文。

还可使用含有编码本文描述的一种或多种ZFN的序列的载体来递送如本文所述的核酸酶、供体构建体以及核酸酶与供体构建体的组合。可使用任何载体系统，包括但不限于质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体；疱疹病毒载体以及腺相关病毒载体等。还参见，美国专利号6,534,261；6,607,882；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219以及7,163,824，所述专利以引用方式整体并入本文。此外，将显而易见的是，这些载体中的任一种均可包含治疗所需要的一种或多种序列。因此，在将一种或多种核酸酶和供体构建体引入细胞中时，可在同一载体或不同载体(DNA MC)上携带所述核酸酶、供体多核苷酸以及核酸酶与供体多核苷酸的组合。当使用多个载体时，每个载体可包含编码一种或多种核酸酶、一种或多种供体构建体以及一种或多种核酸酶与一种或多种供体构建体的组合的序列。常规基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于将编码核酸酶、供体构建体以及核酸酶与供体构建体的组合的核酸引入细胞(例如，哺乳动物细胞)和靶组织中。非病毒载体递送系统包括DNA或RNA质粒、DNA MC、裸核酸以及与递送媒介物(诸如脂质体粒或泊洛沙姆)复合的核酸。合适的非病毒载体包括纳米轴载体，包括可从InCellArt(法国)商购的载体。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其在递送至细胞后具有附加型或整合基因组。关于体内递送工程化DNA结合蛋白和包含这些结合蛋白的融合蛋白的综述，参见例如Rebar(2004)Expert Opinion Invest.Drugs 13(7):829-839；Rossi等人(2007)NatureBiotech.25(12):1444-1454以及一般基因递送参考文献如Anderson,Science 256:808-813(1992)；Nabel&Felgner,TIBTECH11:211-217(1993)；Mitani&Caskey,TIBTECH 11:162-166(1993)；Dillon,TIBTECH 11:167-175(1993)；Miller,Nature 357:455-460(1992)；VanBrunt,Biotechnology 6(10):1149-1154(1988)；Vigne,Restorative Neurology andNeuroscience 8:35-36(1995)；Kremer&Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995)；Haddada等人,Current Topics in Microbiology and ImmunologyDoerfler and (编辑)(1995)；以及Yu等人,Gene Therapy 1:13-26(1994)。

核酸的非病毒递送方法包括电穿孔、脂转染、显微注射、基因枪、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质:核酸缀合物、裸DNA、人工病毒粒子以及DNA的试剂增强吸收。使用例如Sonitron 2000系统(Rich-Mar)的声致穿孔也可用于核酸的递送。

另外的示例性核酸输送系统包括由Amaxa Biosystems(Cologne，Germany)，Maxcyte，Inc.(Rockville,Maryland)、BTX Molecular Delivery Systems(Holliston,MA)和Copernicus Therapeutics Inc.(参见例如US6008336)。脂转染描述于例如美国专利号5,049,386；4,946,787；以及4,897,355中)，并且脂转染试剂为商业销售的(例如，Transfectam^TM和Lipofectin^TM)。适用于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括Felgner、WO 91/17424、WO 91/16024的那些脂质。

脂质:核酸复合物(包括靶向脂质体，诸如免疫脂质复合物)的制备是本领域技术人员熟知的(参见例如，Crystal,Science 270:404-410(1995)；Blaese等人,Cancer GeneTher.2:291-297(1995)；Behr等人,Bioconjugate Chem.5:382-389(1994)；Remy等人,Bioconjugate Chem.5:647-654(1994)；Gao等人,Gene Therapy 2:710-722(1995)；Ahmad等人,Cancer Res.52:4817-4820(1992)；美国专利号4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028以及4,946,787)。其他脂质:核酸复合物包括包含新型阳离子脂质、新型聚乙二醇化脂质以及新型阳离子脂质和新型聚乙二醇化脂质的组合(参见例如美国临时专利申请号62/432,042和62/458,373)。

额外的递送方法包括使用包装待递送到EnGeneIC递送媒介物(EDV)中的核酸。使用双特异性抗体(其中所述抗体的一条臂具有针对靶组织的特异性，而另一条臂具有针对EDV的特异性)将这些EDV特异性地递送到靶组织。所述抗体将EDV带至靶细胞表面，并且然后EDV通过胞吞作用被带入细胞中。一旦在细胞中，内容物就释放(参见MacDiarmid等人(2009)Nature Biotechnology 27(7):643)。

使用基于RNA或DNA病毒的系统来递送编码工程化的ZFP、TALE和CRISPR/Cas系统的核酸利用了使病毒靶向体内的特定细胞并将病毒有效载荷运输至核的高度进化的方法。病毒载体可直接施用于患者(体内)或其可用于在体外处理细胞并且向患者(活体外)施用修饰的细胞。用于递送ZFP的常规基于病毒的系统包括但不限于逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关、牛痘和单纯疱疹病毒载体用于基因转移。用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法使宿主基因组中的整合成为可能，常常导致插入的转基因长期表达。此外，已在许多不同细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。

逆转录病毒的趋向性可通过掺入外来包膜蛋白质、扩增靶细胞的潜在靶群体来改变。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并且通常产生高病毒效价的逆转录病毒载体。逆转录病毒基因转移系统的选择取决于靶组织。逆转录病毒载体包含包装能力为高达6-10kb外来序列的顺式作用长末端重复序列。最小顺式作用LTR足以用于复制和包装载体，其接着用于将治疗基因整合至靶细胞中以提供持久的转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠类白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)以及其组合的那些逆转录病毒载体(参见例如，Buchscher等人,J.Virol.66:2731-2739(1992)；Johann等人,J.Virol.66:1635-1640(1992)；Sommerfelt等人,Virol.176:58-59(1990)；Wilson等人,J.Virol.63:2374-2378(1989)；Miller等人,J.Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)。

在优选瞬时表达的应用中，可以使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中具有极高转导效率且不需要细胞分裂。在此类载体的情况下，已获得高效价和高水平的表达。此载体可在相对简单的系统中大量产生。腺相关病毒(“AAV”)载体还用于用靶核酸转导细胞，例如，体外产生核酸和肽，以及用于体内和离体基因治疗程序(参见，例如，West等人,Virology 160:38-47(1987)；美国专利号4,797,368；WO 93/24641；Kotin,Human Gene Therapy5:793-801(1994)；Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)。重组AAV载体的构建描述于许多出版物中，所述出版物包括美国专利号5,173,414；Tratschin等人,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin,等人,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat&Muzyczka,PNAS 81:6466-6470(1984)；以及Samulski等人,J.Virol.63:03822-3828(1989)。

至少六种病毒载体方法当前可用于临床试验中的基因转移，其利用涉及通过插入辅助细胞系的基因来补充缺陷性载体以产生转导剂的方法。

pLASN和MFG-S是已被用于临床试验中的逆转录病毒载体的实例(Dunbar等人,Blood 85:3048-305(1995)；Kohn等人,Nat.Med.1:1017-102(1995)；Malech等人,PNAS 94:22 12133-12138(1997))。PA317/pLASN是用于基因疗法试验中的第一治疗性载体。(Blaese等人,Science 270:475-480(1995))。已经观察到MFG-S包装载体的50％或更大的转导效率。(Ellem等人,Immunol Immunother.44(1):10-20(1997)；Dranoff等人,Hum.GeneTher.1:111-2(1997)。

重组腺相关病毒载体(rAAV)为基于缺陷性和非病原性细小病毒腺相关2型病毒的有前途的替代性基因递送系统。所有载体均来源于仅保留了侧接转基因表达盒的AAV145bp反向末端重复的质粒。由于整合到转导细胞基因组中所引起的有效基因转移和稳定的转基因递送是这种载体系统的关键特征。(Wagner等人,Lancet 351:91171702-3(1998)；Kearns等人,Gene Ther.9:748-55(1996))。还可根据本发明使用其他AAV血清型，包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh.10以及任何新型AAV血清型。

复制缺陷重组腺病毒载体(Ad)可以高效价产生并且容易感染许多不同细胞类型。大多数腺病毒载体被工程化以使转基因替代Ad E1a、E1b或E3基因；随后使复制缺陷性载体在反式提供缺失的基因功能的人293细胞中增殖。Ad载体可在体内转导多种类型的组织，包括非分裂性分化细胞，诸如肝、肾和肌肉中发现的那些细胞。常规Ad载体具有大的携带能力。在临床试验中使用Ad载体的一个实例涉及利用肌内注射来进行抗肿瘤免疫的多核苷酸疗法(Sterman等人,Hum.Gene Ther.7:1083-9(1998))。用于基因转移的腺病毒载体在临床试验中使用的另外实例包括Rosenecker等人,Infection 24:1 5-10(1996)；Sterman等人,Hum.Gene Ther.9:7 1083-1089(1998)；Welsh等人,Hum.Gene Ther.2:205-18(1995)；Alvarez等人,Hum.Gene Ther.5:597-613(1997)；Topf等人,Gene Ther.5:507-513(1998)；Sterman等人,Hum.Gene Ther.7:1083-1089(1998)。

封装细胞用于形成能够感染宿主细胞的病毒粒子。此类细胞包括HEK293和Sf9细胞，其可用于包装AAV和腺病毒；以及ψ2细胞或PA317细胞，其包装逆转录病毒。用于基因疗法的病毒载体通常由生产细胞系产生，所述细胞系将核酸载体封装至病毒粒子中。载体通常含有包装并随后整合至宿主中所需要的最少病毒序列(如果可适用)，其他病毒序列由编码待表达的蛋白质的表达盒置换。缺失的病毒功能由包装细胞系以反式供应。例如，用于基因疗法的AAV载体通常仅具有包装并整合至宿主基因组中所需要的来自AAV基因组的反向末端重复(ITR)序列。病毒DNA包装在细胞系中，所述细胞系含有编码其他AAV基因(即rep和cap)但缺乏ITR序列的辅助质粒。还使用腺病毒作为辅助病毒来感染细胞系。辅助病毒促进AAV载体的复制以及AAV基因从辅助质粒中的表达。由于缺乏ITR序列，辅助质粒未大量地包装。可通过例如腺病毒比AAV更敏感的热处理来减少受腺病毒的污染。在一些实施方案中，使用杆状病毒表达系统产生AAV(参见例如美国专利号6,723,551和7,271,002)。

从293或杆状病毒系统中纯化AAV颗粒通常涉及使产生病毒的细胞生长，随后从细胞上清液中收集病毒粒子，或裂解细胞以及从粗裂解物中收集病毒。然后通过本领域中已知的方法纯化AAV，所述方法包括离子交换色谱法(例如参见美国专利号7,419,817和6,989,264)、离子交换色谱法和CsCl密度离心(例如PCT公布WO2011094198A10)、免疫亲和力色谱法(例如WO2016128408)或使用AVB Sepharose纯化(例如GE Healthcare LifeSciences)。

在许多基因疗法应用中，需要基因疗法载体以针对具体组织类型的高度特异性来递送。因此，病毒载体通常被修饰来通过在病毒外表面上以与病毒外壳蛋白的融合蛋白形式表达配体来对给定细胞类型具有特异性。选择具有对已知存在于目标细胞类型上的受体的亲和性的配体。例如，Han等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9747-9751(1995)报道可对Moloney鼠白血病病毒进行修饰以表达融合至gp70的人调蛋白，并且重组病毒感染表达人表皮生长因子受体的某些人乳腺癌细胞。此原理可扩展至其他病毒-靶细胞对，其中靶细胞表达受体并且病毒表达包含细胞表面受体的配体的融合蛋白。例如，丝状噬菌体可被工程化以展示对实际上任何选定细胞受体具有特异性结合亲和力的抗体片段(例如，FAB或Fv)。虽然以上描述主要适用于病毒载体，但是相同原则可应用于非病毒载体。此类载体可被工程化以含有利于被特定靶细胞摄取的特异性摄取序列。

可通过向个体患者施用，通常通过如下所述的全身施用(例如，静脉内、腹膜内、肌内、皮下或颅内输注)或局部施用来在体内递送基因疗法载体。可替代地，载体可递送至活体外细胞诸如从个体患者移植的细胞(例如，淋巴细胞、骨髓穿刺液、组织活检物)或万能供血者造血干细胞，随后通常在选择已并入载体的细胞后将细胞再植入患者中。

含有核酸酶、供体构建体以及核酸酶与供体构建体的组合的载体(例如，逆转录病毒、腺病毒、脂质体等)也可直接施用至生物体以便在体内转导细胞。可替代地，可施用裸DNA。施用是通过通常用于将分子引入成与血液或组织细胞的最终接触的任何途径，包括但不限于注射、输注、局部施用和电穿孔。施用此类核酸的合适方法是可用的且为本领域技术人员所熟知，并且虽然一种以上途径可用于施用特定组合物，但是特定途径常常可提供比另一途径更直接且更有效的反应。

本文所述的适用于引入多核苷酸(例如，核酸酶编码、双链供体以及核酸编码与双链供体的组合)的载体包括非整合慢病毒载体(IDLV)。参见例如，Ory等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93:11382-11388；Dull等人(1998)J.Virol.72:8463-8471；Zuffery等人(1998)J.Virol.72:9873-9880；Follenzi等人(2000)Nature Genetics25:217-222；美国专利公布号2009/0117617。

药学上可接受的载体部分地通过所施用的具体组合物以及通过用来施用组合物的具体方法来确定。因此，如下所述，存在可用的药物组合物的广泛多种的合适制剂(参见例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版,1989)。

显然核酸酶编码序列和供体构建体可使用相同或不同系统来递送。例如，核酸酶和供体可由同一DNAMC携带。可替代地，供体多核苷酸可由MC携带，而一种或多种核酸酶可由标准质粒或AAV载体携带。此外，不同载体可通过相同或不同途径来施用(肌内注射、尾静脉注射、其他静脉内注射、腹膜内施用或肌内注射。载体可同时或以任何相继顺序来递送。

因此，本公开包括体内或离体治疗适合插入编码治疗性蛋白质的转基因的疾病和疾患。组合物以有效于在血清或靶器官或细胞中获得所需治疗性多肽浓度的量来向人类患者施用。施用可通过多核苷酸递送至所需靶细胞的任何方式进行。例如，涵盖体内和离体方法。静脉内注射至门静脉是优选的施用方法。其他体内施用模式包括例如直接注入肝叶或胆管和在肝脏远端的静脉内注射，包括经由肝动脉、直接注入肝实质、经由肝动脉注射和经由胆道系统的逆行注射。离体施用模式包括切除肝细胞或其他肝脏细胞的体外转导，随后将转导的、切除的肝细胞输注回到人患者的门脉管、肝实质或胆道系统中，参见例如，Grossman等人,(1994)Nature Genetics,6:335-341。

待施用的核酸酶和供体的有效量将因患者而变化，并且根据目标治疗性多肽而变化。因此，有效量最好由施用组合物的医师确定并且适当剂量可由本领域普通技术人员容易地确定。允许足够时间来整合并表达(通常例如4-15天)之后，治疗性多肽的血清或其他组织水平的分析和与施用之前的初始水平比较确定是否施用量太低、在正确范围内或太高。初始施用和后续施用的合适方案也是可变的，但是如果必要，典型的是在初始施用之后进行后续施用。后续施用能以可变的间隔施用，这些间隔的范围从每天一次到每年一次再到每几年一次。本领域技术人员应认识到可建议适当免疫抑制技术以便通过递送载体的免疫抑制来避免转导的抑制或阻滞，参见例如，Vilquin等人,(1995)Human Gene Ther.,6:1391-1401。

用于离体和体内施用的制剂包括液体或乳化液体中的悬浮液。活性成分经常与药学上可接受的并与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂包括例如水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等及其组合。此外，组合物可含有少量辅助物质，诸如润湿或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂或增强药物组合物的有效性的其他试剂。

细胞

本文还描述了细胞和细胞系，其中内源性BCL11A增强子序列被本文所述的核酸酶修饰(表1)。修饰可以是例如与细胞的野生型序列相比。细胞或细胞系对于修饰可以是杂合的或纯合的。对BCL11A序列的修饰可包括插入缺失。

所述修饰优选地在核酸酶结合位点、裂解位点以及结合位点与裂解位点的组合处或附近，例如，所述裂解位点上游或下游1-300个碱基对(或其间的任何值)内，更优选地所述结合位点、裂解位点或结合位点与裂解位点任一侧的1-100个碱基对(或其间的任何值)内，甚至更优选地所述结合位点、裂解位点或结合位点和裂解位点任一侧上的1至50个碱基对(或其间的任何值)内。在某些实施方案中，修饰在BCL11A增强子的“+58”区处或附近，例如，在表1的任何第一列中所示的核酸酶结合位点处或附近。

可修饰任何细胞或细胞系，例如干细胞，例如胚胎干细胞、诱导型多能干细胞、造血干细胞、神经元干细胞和间充质干细胞。如本文所述的细胞的其他非限制性实例包括T细胞(例如，CD4+、CD3+、CD8+等)；树突细胞；B细胞。还提供了干细胞的后代，包括部分或完全分化的细胞(例如，RBC或RBC前体细胞)。包含修饰的BCL11A序列的其他细胞系的非限制性实例包括COS、CHO(例如，CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)和perC6细胞以及昆虫细胞如草地贪夜蛾(Sf)，或真菌细胞如酵母属、毕赤酵母属和裂殖酵母属。

如本文所述的细胞适用于例如通过离体疗法治疗或预防病症。可将核酸酶修饰的细胞扩增，并且然后使用标准技术重新引入患者中。参见例如，Tebas等人(2014)New Eng JMed 370(10):901。在干细胞的情况下，在输注至受试者中之后，还发生这些前体体内分化成表达功能性转基因的细胞。还提供了包含如本文所述的细胞的药物组合物。此外，细胞可在向患者施用之前冷冻保存。

本文公开的任何修饰的细胞或细胞系可显示γ珠蛋白的表达增加。还提供了包含如本文所述的遗传修饰的细胞的组合物，如药物组合物。

应用

本文公开的方法和组合物用于修饰蛋白质的表达，或校正编码遗传疾病(如镰状细胞病或地中海贫血症)中表达的蛋白质的异常基因序列。因此，所述方法和组合物提供此类遗传疾病的治疗或预防。例如干细胞的基因组编辑可用于校正异常基因、插入野生型基因或改变内源基因的表达。作为非限制性实例，可将例如编码至少一种珠蛋白(例如，α珠蛋白、γ珠蛋白、β珠蛋白及其组合)的野生型基因插入细胞中(例如，使用如本文所述的一种或多种核酸酶插入内源性BCL11A增强子序列中)以提供在细胞中缺乏或缺少的珠蛋白，并且由此治疗遗传性疾病，例如由错误的珠蛋白表达引起的血红蛋白病。或者或另外，在施用或不施用适当供体的情况下进行基因组编辑可校正错误的内源性基因，例如校正α-或β-血红蛋白中的点突变，以恢复基因的表达或治疗遗传性疾病(例如镰状细胞病)，敲除或改变(过表达或阻遏)任何直接或间接珠蛋白调控基因(例如γ珠蛋白调控基因BCL11A或BCL11A-调控因子KLF1的失活)。具体地，本发明的方法和组合物可用于治疗或预防血红蛋白病。

本发明的核酸酶靶向已知在红细胞生成期间表达BCL11A所需的BCL11A增强子区，并且因此下调γ珠蛋白表达。此增强子区的修饰可产生具有增加的γ珠蛋白表达的红细胞，并且因此可有助于治疗或预防镰状细胞病或β地中海贫血。

以下实施例涉及其中核酸酶包含锌指核酸酶(ZFN)的本公开的示例性实施方案。应当理解，这仅出于示例的目的，并且可使用其他核酸酶，例如TtAgo和CRISPR/Cas系统、具有工程化的DNA结合结构域的归巢核酸内切酶(大范围核酸酶)、天然存在的工程化的归巢核酸内切酶(大范围核酸酶)DNA结合结构域的融合物，包括归巢核酸内切酶(大范围核酸酶)与工程化的DNA结合结构域的组合和天然存在的工程化的归巢核酸内切酶(大范围核酸酶)DNA结合结构域与异源裂解结构域的融合物，大范围核酸酶与TALE蛋白的融合物，包括异源裂解结构域的组合以及大范围核酸酶与TALE蛋白的融合物。

实施例

实施例1：锌指核酸酶的组装

针对人BCL11A基因组装ZFN，并且通过如下所述从转染的细胞分离的DNA的深度测序分析来测试活性。如所述产生对增强子区域的+58区具有特异性的ZFN。先前已经描述了ZFN对51857/51949(参见WO 2016/183298)。

实施例2：脱靶分析

为了分析ZFN对的脱靶裂解，进行了两阶段无偏特异性分析。在第一阶段(图1)，使用类似于由Tsai等人((2015),Nat Biotechnol33(2):187-197.doi:10.1038/nbt.3117)描述的程序的程序，经由寡核苷酸双链体整合位点测定鉴别了每个ZFN的候选脱靶位点。

寡核苷酸双链体整合位点测定是基于以下观察结果：核酸酶和双链DNA的短链段共同引入靶细胞中导致在经由NHEJ DNA修复途径修复一部分基因组裂解事件期间的双联体整合(Orlando等人,(2010),Nucleic Acids Res,38(15)e152.doi:10.1093/nar/gkq512；Gabriel等人,(2011),Nat Biotechnol.2011年8月7日；29(9):816-23.doi:10.1038/nbt.1948；Tsai等人,同上)。在整合后，双链体提供裂解事件的永久标签。然后经由将寡核苷酸衔接子连接至剪切的基因组DNA，随后进行2轮25个循环的巢式PCR以及对所得供体-基因组接点的深度测序来鉴别整合位点。此测定允许评价基因组内的所有潜在整合位点。

在K562细胞中进行整合位点测定以使供体递送、ZFN表达和供体整合最大化。此外，随着K562细胞迅速分裂(倍增时间大约24小时)，预期它们对ZFN裂解细胞靶标的能力施加最小的表观遗传限制。使用Amaxa穿梭机和针对ZFN的最大中靶活性优化的设置，将细胞(2x 10⁵)用0.47μg寡核苷酸双链体供体和400ng的每种ZFN编码mRNA电穿孔。对于oligo和mRNA的每种组合制备四个重复样品。在转染后第7天，分离每个样品的基因组DNA(QiagenDNeasy血液和组织试剂盒)，并且使用400ng(133000个单倍体基因组)作为图1中概述的扩增方案的输入。然后基本上如所述(Tsai等人同上)加工样品。使用v2 300循环测序试剂盒在MiSeq仪器(Illumina)上合并、定量和测序最终产物，使用配对末端150bp读数和8bp/16bp双重索引读数来检测扩增子的每个末端上的样品条形码。

为了产生候选脱靶位点的列表，过滤测序数据以获得正确的引发序列，随后修剪衔接子序列并映射至基因组。接下来，绘制接点坐标，并且使用双链体-基因组接点以及由DNA剪切引起的断裂的位置来鉴别不同的整合事件。然后处理整合事件以鉴别基因组内紧密接近的整合簇(彼此100bp内最少4个不同的整合事件，跨所有重复求和)。将驻留在hg38组件中不可作图的重叠群上的簇(即hg38中的chrUn)从进一步分析中除去。由于先前经验已经表明这些是扩增假象，还除去了映射至重复基因座的簇(在簇中跨所有序列的基因组的三次或更多次命中的中值)。如果剩余的簇来自至少2个重复ZFN处理的样品(总计4个)并且在ZFN处理的样品中相对于对照表现出≥5倍过量的整合事件，则将剩余的簇评分为候选ZFN裂解位点。通过ZFN处理的样品中的独特整合的总数对候选裂解位点进行排序。经由这种分析鉴别的候选基因座在图2中针对ZFN对51857/51949提供，按整合体计数排序。

实施例3：ZFN的优化

为了减少脱靶裂解，还采用了用于核酸酶优化的策略，其中选择性地除去非特异性磷酸接触以带来全面抑制脱靶裂解(Guilinger等人(2014)Nat Methods.11(4):429-35.doi:10.1038/nmeth.2845；Kleinstiver等人(2016)Nature 529(7587):490-5.doi:10.1038/nature16526；Slaymaker等人(2016)Science)351(6268):84-8.doi:10.1126/science.aad5227)(参见美国临时申请号62/443,981和62/378,978)。在锌指框架内与DNA的磷酸主链相互作用的关键位置(Pavletich和Pabo,(1991)Science 252(5007):809-17；Elrod-Erickson等人(1996)Structure 4(10):1171-80)(图3A-3B)以及还预测进行磷酸接触的右ZFN FokI结构域中的单个位置(图3C)处进行氨基酸取代。

通过允许从两个分离的mRNA中独立表达每个ZFN而进一步改进特异性，这使得能够优化递送比率。这些努力产生了与原始ZFN对高度相关的优化的ZFN对，不同之处在于降低与DNA磷酸主链的相互作用的能量、但最小化或不影响序列特异性碱基识别的取代。与此一致，整合位点测定产生了455个基因座，以获得用于原始51857/51949对的ZFN裂解的潜在靶标。对于优化的对，鉴别了更少数量的基因座以用于通过这种分析进一步检查为ZFN裂解的潜在靶标(总计72个)。对于两个对，BCL11A增强子内的预期靶标是排序最高的基因座。此外，在优化对的BCL11A增强子处注意到更高比例的整合事件，与其更大的特异性一致。

重要的是注意，在定义序列数据处理管道时，保守性地选择关键参数，以包括尽可能多的候选脱靶基因座而不是过滤掉它们的侧上出错。这样做是为了确保可能代表优化的ZFN的真实裂解位点的每个基因座将在后续的插入缺失研究中进行鉴别和测试，即使以接受更多可能成为假阳性的数量为代价。预期分析的第一阶段将产生每个ZFN对的大量候选基因座，其中大多数(特别是对于优化的ZFN)将不代表真正的脱靶裂解位点，而是代表将证明对后续插入缺失研究中的裂解阴性的背景事件。

在分析的第二阶段，筛选经由整合位点测定鉴别的候选脱靶基因座以获得ZFN处理的CD34+HSPC中的修饰证据(例如，插入缺失的存在)。

特别是，使用用于RNA转染的临床规模和临床条件(对于原始ZFN对120μg/mL的mRNA并且对于优化对100μg/mL的mRNA)，用原始和优化的ZFN对处理源自动员的外周血的人CD34+HSPC。在转染后2天分离基因组DNA，随后进行候选脱靶基因座的PCR扩增和深度测序以定量插入缺失水平。对于原始和优化的ZFN对，在此步骤筛选同一组的137个候选脱靶基因座，以及使用原始ZFN在早期研究中经由其他方法鉴别的较少数量的候选脱靶位点。

结果表明，优化的ZFN比原始ZFN明显更具特异性。这不仅从ZFN裂解的证据评分为阳性的基因座数目(对于原始对52对比对于优化的对3)，而且从观察到的插入缺失水平中显而易见，对于优化的对，其低得多。图4示出在此研究中表现出ZFN裂解的证据的每个基因座的插入缺失值的图(注意y轴的对数标度)。在所有此类基因座上聚集脱靶插入缺失表明脱靶活性降低300倍(对于原始对46.5％总脱靶插入缺失，对比对于优化的对0.15％脱靶插入缺失)。实现了脱靶活性的这种降低而在预期靶位点没有任何活性损失(对于原始对72.5％插入缺失对比对于优化的的ZFN 81.9％)。在这些研究中，原始对(或亲本对)是51857/51949，而优化的ZFN对是63014/65722(参见下文)。

核酸酶设计在以下表1中示出：

表1：对+58BCL11A增强子区具有特异性的ZFN对

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表1示出与每个ZFN有关的表征信息。从左侧开始，显示SBS编号(例如51857)，其中ZFN所结合至的DNA靶标显示在SBS编号下方。接下来显示指1-6或1-5的氨基酸识别螺旋设计(表1的细分第2列)。在适当的螺旋设计下表1中还显示所指示指的ZFP主链序列的突变，如美国临时专利申请号62/378,978和62/443,981中所描述。在表1中使用的注释中，“Qm5”表示在所指示指的位置-5处(相对于编号为-1至+6的螺旋)，此位置处的精氨酸已被谷氨酰胺(Q)取代；而“Qm14”表示通常存在于位置-14中的精氨酸(R)已被谷氨酰胺(Q)取代。“无”指示识别螺旋区外没有变化。因此，例如，SBS#63014包括指1、3和5中的Qm5突变，而指2、4和6不具有锌指主链的突变(例如，识别螺旋区外的锌指序列。

最后，表1的最右侧列显示用于将DNA结合结构域连接至FokI裂解结构域的接头(例如，“L7c5”(LRGSISRARPLNPHP(SEQ ID NO:5)，如例如美国专利号9,567,609中所描述)显示在所述列的顶行，具有FokI磷酸接触突变和二聚化突变的位点显示接头名称下方的框中。具体而言，Fok突变体框的顶行上指示二聚化结构域中发现的突变的类型(例如，如例如在美国专利号8,962,281中描述的ELD或KKR。在二聚化突变体名称下方显示FokI结构域中存在的任何突变，进行所述突变以用于除去底部显示的非特异性磷酸接触(例如K525S或R416S，其中氨基酸位置525或416处的丝氨酸残基分别取代为赖氨酸或精氨酸，如美国临时专利申请号62/378,978和62/443,981中所描述)。因此，例如，在SBS#63014中，接头是L7c5接头，并且FokI裂解结构域包括ELD二聚化突变体，并且没有磷酸接触突变。此外，对于SBS#65722，接头是L0接头(LRGSQLVKS(SEQ ID NO:6)，也称为‘标准’接头，参见美国专利号9,567,609)，并且FokI裂解结构域包括KKR二聚化突变和且K525S FokI磷酸接触突变。

测试所有ZFN的功能性(如通过如下文实施例4中所述测定插入缺失而确定的裂解活性)并发现其具有活性。

此外，为了确定哪种ZFN设计是最特异性的，在ZFN处理的CD34+HSPC中进行原始ZFN对的已知脱靶裂解位点的插入缺失分析。为实现此目的，使用临床条件和mRNA浓度(对于原始ZFN对120μg/mL，并且对于优化的对100μg/mL)，用原始和优化的ZFN对处理源自动员的外周血的人CD34+HSPC。在转染后2天从这些细胞和未处理的对照中分离基因组DNA，随后进行每个候选基因座的PCR扩增和深度测序以定量插入缺失水平。

通过使用300循环盒在Illumina MiSeq上的配对末端深度测序来确定每个基因座处的修饰水平。合并配对的序列，经由针对在所有碱基上≥15的质量评分过滤的SeqPrep修整衔接子，且然后映射至人基因组(hg38组件)。映射至不正确基因座的序列被丢弃。除去比野生型扩增子短>70bp或>70％的序列，以使引物-二聚体产物最小化。在靶扩增子与每个MiSeq读数之间进行Needleman-Wunsch比对(Needleman和Wunsch,(1970),J Mol Biol 48(3):443-53))以映射插入缺失。比对的序列中的插入缺失如Gabriel等人2011(同上)中定义，除了长度为1bp的插入缺失也被接受以避免计算真实事件。注意，由于高背景(对照样品中>1％修饰)或测序深度不足(<10000个读数)，一部分基因座未扩增或未测序或从分析中排斥。此分析的结果和与‘亲本’51857/51949ZFN对的比较在以下表2中提供。

表2：脱靶裂解分析

实施例4：ZFN在人CD34+细胞中的活性

对于体外测试，在CD34+细胞中测试了核酸酶。ZFN以mRNA的形式提供，其中在体外如下制备mRNA：将包含编码ZFN的基因的质粒线性化并用于使用mMessage T7Ultra试剂盒(Ambion/Applied Biosystems)的体外mRNA转录。然后使用/>mini试剂盒(Qiagen)纯化mRNA。

从动员的外周血中分离CD34+细胞，并在补充有青霉素、链霉素和谷氨酰胺以及StemSpan CC110的X-VIVO 10培养基中维持，并在37℃和5％CO2下孵育。在分离后或解冻后48小时转染细胞。将小等分部分与PBS(Corning)中的台盼蓝溶液0.4％(w/v)1:1混合，并在TC20自动细胞计数器(Bio-Rad)上测定细胞数目。

对于大规模转染，用MaxCyte Electroporation Buffer(Maxcyte)洗涤细胞，并在100μL的电穿孔缓冲液中以3至5e7细胞/mL重新悬浮。通常，使用60μg/mL与120μg/mL之间的mRNA浓度来筛选候选ZFN组。然后将细胞以3e6细胞/mL在生长培养基中在30℃下生长18小时，且然后在37℃下稀释至1e6细胞/mL持续另外24小时。为了确定裂解活性，在转染后2-3天分离基因组DNA，并经由MiSeq测序仪(Illumina)上的深度测序测量BCL11A增强子基因座处的基因修饰的水平。

将来自表1的ZFN对在CD34+细胞中进行测试，并且活性结果在以下表3中所示。

表3：ZFN对针对BCL11A靶标的活性

除了在红细胞分化之前分析CD34+细胞中的核酸酶活性外，编辑的细胞也体外分化成红细胞。遵循的方案是基于Giarratana等人,((2011)Blood 120(15):2945-53)。简言之，遵循以下方案：

第0天至第7天：将4x10⁴个CD34+细胞在分化培养基(EDM)(伊斯科夫氏改量的杜氏培养基[IMDM]，330μg/mL转铁蛋白，10μg/mL人胰岛素，2U/mL肝素钠，5％人AB+血浆)中在10^-6M氢化可的松、100ng/mL干细胞因子(SCF)、5ng/mL IL 3以及3IU/mL促红细胞生成素(EPO)存在下以2x104/mL的密度培养。

第4天：将细胞重新悬浮于含有SCF、IL-3、EPO和氢化可的松的新鲜EDM中。

第7天至第11天：将细胞以1.5×10⁵个细胞/新鲜mL的补充有SCF和EPO的EDM的密度重新悬浮。

第11天至第21天：在第11天，将细胞以1×10⁶/mL重新接种于补充有EPO的新鲜EDM中。随后在第14天将细胞以5×10⁶/mL重新接种于此相同培养基中。在第14天至第18天之间的此时间段期间生长平稳，此时细胞活力开始下降直到第21天终止培养。

通过使用具有AOPI红细胞测定模式的Nexcelom Bioscience Cellometer K2测量吖啶橙阳性和碘化丙啶排除(AOPI)，在荧光通道1(AO)设定为700毫秒并且荧光通道2(PI)设定为5000毫秒的情况下，在接种时和整个分化期间进行细胞计数。

使用以下方案在分化的第21天测定去核细胞的百分比。去核率在未转染的对照和ZFN转染的样品中相当，其中来自这两组的百分比为59％-63％：

1.细胞计数

2.100,000个细胞，以450x g离心，5分钟，RT。

3.重新悬浮于50μL PBS-BSA+1μL GlyA-FITC(DAKO)中。

4.在冰箱中染色15分钟。

5.添加1mL PBS-BSA，涡旋，离心。

6.重新悬浮于250μL的PBS-BSA-NucRed(每mL2滴NucRed)。

7.使用NucRed的APC通道在FACS Canto上获取。

8.有核红细胞将在GlyA阳性NucRed阴性/低级分中，并且有核红细胞将在双重GlyA-NucRed阳性级分中。

通过MiSeq深度测序在a)电穿孔后48小时b)在解冻细胞的当天(此时体外分化开始)和c)在体外红细胞分化的第14天收获的DNA样品中测量BCL11A基因修饰。当分化进行21天时，选择DNA分析的第14天时间点，因为它是在导致DNA回收损失的大部分红细胞细胞去核之前。观察到的BCL11A增强子处的修饰百分比与转染条件的细节一起列于表4中。

表4：通过MiSeq分析测定的BCL11A基因修饰水平

这些数据表明，用优化的对63014和65722mRNA进行的CD34+细胞转染导致在细胞冷冻和解冻后和红细胞分化后BCL11A增强子靶位点处的非常有效的基因修饰(>75％的修饰的等位基因)并且修饰保持非常好(>90％的修饰保留)。

选择ZFN对63014/65722用于进一步分析。这些ZFN的氨基酸序列在下文示出，其中各自包含核定位信号(NLS,Kalderon等人(1984)Cell 39(3Pt 2):499-509)和亲水性肽(Hopp等人(1988)Nat Biotechnol6:1204-10)，其增强了中靶ZFN活性，两者都与N-末端编码序列融合。因此，ZFN的mRNA和氨基酸序列如下：

63014mRNA(1725nt)

5’gggagacaagcuuugaauuacaagcuugcuuguucuuuuugcagaagcucagaaua aacgcucaacuuuggcagaucgaauucgccauggacuacaaagaccaugacggugauuauaaagaucaugacaucgauuacaaggaugacgaugacaagauggcccccaagaagaagaggaaggucggcauccacgggguacccgccgcuauggcugagaggcccuuccagugucgaaucugcaugcagaacuucagugaccaguccaaccugcgcgcccacauccgcacccacaccggcgagaagccuuuugccugugacauuugugggaggaaauuugcccgcaacuucucccugaccaugcauaccaagauacacacgggcagccaaaagcccuuccagugucgaaucugcaugcagaacuucaguuccaccggcaaccugaccaaccacauccgcacccacaccggcgagaagccuuuugccugugacauuugugggaggaaauuugccaccuccggcucccugacccgccauaccaagauacacacgcacccgcgcgccccgaucccgaagcccuuccagugucgaaucugcaugcagaacuucagugaccaguccaaccugcgcgcccacauccgcacccacaccggcgagaagccuuuugccugugacauuugugggaggaaauuugccgcccaguguugucuguuccaccauaccaagauacaccugcggggauccaucagcagagccagaccacugaacccgcacccggagcuggaggagaagaaguccgagcugcggcacaagcugaaguacgugccccacgaguacaucgagcugaucgagaucgccaggaacagcacccaggaccgcauccuggagaugaaggugauggaguucuucaugaagguguacggcuacaggggaaagcaccugggcggaagcagaaagccugacggcgccaucuauacagugggcagccccaucgauuacggcgugaucguggacacaaaggccuacagcggcggcuacaaucugccuaucggccaggccgacgagauggagagauacguggaggagaaccagacccgggauaagcaccucaaccccaacgagugguggaagguguacccuagcagcgugaccgaguucaaguuccuguucgugagcggccacuucaagggcaacuacaaggcccagcugaccaggcugaaccacaucaccaacugcaauggcgccgugcugagcguggaggagcugcugaucggcggcgagaugaucaaagccggcacccugacacuggaggaggugcggcgcaaguucaacaacggcgagaucaacuucagaucuugauaacucgagucuagaagcucgcuuucuugcuguccaauuucuauuaaagguuccuuuguucccuaaguccaacuacuaaacugggggauauuaugaagggccuugagcaucuggauucugccuaauaaaaaacauuuauuuucauugcugcgcuagaagcucgcuuucuugcuguccaauuucuauuaaagguuccuuuguucccuaaguccaacuacuaaacugggggauauuaugaagggccuugagcaucuggauucugccuaauaaaaaacauuuauuuucauugcugcgggacauucuuaauuaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacuag

(SEQ ID NO:28)。

63014氨基酸序列(识别螺旋区域加下划线；接头以大写字母斜体示出；指1、3和5主链残基的突变以双下划线示出；二聚化结构域突变(ELD)以粗体和斜体示出；亲水性肽以小写字母文本示出；并且核定位信号(NLS)以小写字母斜体示出)：

65722mRNA(1680个核苷酸)：

5’gggagacaagcuugaauacaagcuugcuuguucuuuuugcagaagcucagaauaaa cgcucaacuuuggcagaucgaauucgccuagagaucuggcggcggagagggcagaggaagucuucuaaccugcggugacguggaggagaaucccggcccuaggaccauggacuacaaagaccaugacggugauuauaaagaucaugacaucgauuacaaggaugacgaugacaagauggcccccaagaagaagaggaaggucggcauucaugggguacccgccgcuauggcugagaggcccuuccagugucgaaucugcaugcagaaguuugcccgcaacgaccaccgcaccacccauaccaagauacacacgggcgagaagcccuuccagugucgaaucugcaugcagaacuucagucagaaggcccaccugauccgccacauccgcacccacaccggcgagaagccuuuugccugugacauuugugggaggaaauuugcccagaagggcacccugggcgagcauaccaagauacacacgggaucucagaagcccuuccagugucgaaucugcaugcagaacuucagucgcggccgcgaccugucccgccacauccgcacccacaccggcgagaagccuuuugccugugacauuugugggaggaaauuugcccgccgcgacaaccugcacucccauaccaagauacaccugcggggaucccagcuggugaagagcgagcuggaggagaagaaguccgagcugcggcacaagcugaaguacgugccccacgaguacaucgagcugaucgagaucgccaggaacagcacccaggaccgcauccuggagaugaaggugauggaguucuucaugaagguguacggcuacaggggaaagcaccugggcggaagcagaaagccugacggcgccaucuauacag ugggcagccccaucgauuacggcgugaucguggacacaaaggccuacagcggcggcuacaaucugccuaucggccaggccgacgagaugcagagauacgugaaggagaaccagacccggaauaagcacaucaaccccaacgagugguggaagguguacccuagcagcgugaccgaguucaaguuccuguucgugagcggccacuucagcggcaacuacaaggcccagcugaccaggcugaaccgcaaaaccaacugcaauggcgccgugcugagcguggaggagcugcugaucggcggcgagaugaucaaagccggcacccugacacuggaggaggugcggcgcaaguucaacaacggcgagaucaacuucugauaacucgagucuagaagcucgcuuucuugcuguccaauuucuauuaaagguuccuuuguucccuaaguccaacuacuaaacugggggauauuaugaagggccuugagcaucuggauucugccuaauaaaaaacauuuauuuucauugcugcgcuagaagcucgcuuucuugcuguccaauuucuauuaaagguuccuuuguucccuaaguccaacuacuaaacugggggauauuaugaagggccuugagcaucuggauucugccuaauaaaaaacauuuauuuucauugcugcgggacauucuuaauuaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaacuag

(SEQ ID NO:30)。

65722氨基酸序列(识别螺旋区加下划线；接头以大写字母斜体示出；亲水性肽呈小写字母；核酸酶定位信号呈小写字母斜体；指1、2和4主链残基的突变以加双下划线示出；二聚化结构域突变(ELD)以粗体和斜体示出；并且FokI磷酸接触突变以波浪下划线示出：

实施例5：红细胞子代中珠蛋白水平的评估

对于以上表4中所示的两种细胞制剂，通过RT-qPCR测定在分化的第14天(在去核和红细胞成熟过程中总体mRNA水平显著下降之前)分离的细胞mRNA中的α-、β-和γ-珠蛋白mRNA的水平。γ-珠蛋白mRNA值相对于β-珠蛋白mRNA(图5A)或来自相同样品的α-珠蛋白mRNA值(图5B)标准化示出(使用定义为1的基于未转染的RT-PCR标准的比率的任意单位)。

在第21天(红细胞分化的终点)分离的蛋白质样品的反相HPLC用于确定ZFN介导的BCL11A红细胞增强子的修饰是否在蛋白质水平下升高胎儿血红蛋白。确定了γ珠蛋白(Aγ和Gγ峰的和)与α珠蛋白比率，以及γ珠蛋白(Aγ和Gγ峰的和)/相对于β样珠蛋白(Aγ、Gγ、β和δ-珠蛋白峰的和)比率，并且在图6中示出。

在此实验中，在63014/65722介导的BCL11A增强子的破坏中，在HSPC的红细胞子代中观察到胎儿珠蛋白百分比升高约3-4倍至约15％-20％的水平。

实施例6：NSG小鼠中编辑的细胞的植入

然后将编辑的人CD34+细胞注射到NSG小鼠中以评估植入。使用荧光活化细胞分选(FACS)在移植后8周、12周、16周和20周收集的外周血中以及在12周和20周收集的骨髓中测量人嵌合体的程度(即人CD45+细胞的百分比)。此外，为了测试ZFN修饰的细胞的植入水平，通过ZFN靶基因座的直接高通量测序评价BCL11A增强子基因座处的基因破坏水平，并与输入材料中测量的靶基因修饰的水平进行比较。

将来自两个健康供体(称为PB-MR-003和PB-MR-004)的HSPC用G-SCF和Plerixafor动员并如Yannaki等人((2012)Mol Ther20(1):230-8.doi:10.1038/mt.2011)中所描述进行纯化。使用Fresenius-Kabi Lovo装置对白细胞分离产物进行血小板消减，然后使用Miltenyi Biotech CliniMACS Plus仪器富集CD34+细胞。然后将纯化的细胞接种在培养物中用于转染。

在CD34+细胞纯化后两天，使用Maxcyte仪器在120μg/mL的编码亲本ZFN对63014/65722的单一mRNA或优化量的编码优化的ZFN对80μg/mL 63014和20μg/mL 65722的两个单独mRNA存在下对细胞进行电穿孔。在转染前，将等分部分的细胞留作未转染的对照。从PB-MR-003转染9500万个细胞，并且从PB-MR-004转染1.2亿个细胞。

在电穿孔后，进行在30℃下的瞬时过夜培养，且然后将细胞在37℃下再培养24小时。在电穿孔后两天，取出用于DNA分析的细胞等分部分，并且收获剩余的细胞、冷冻保存并储存在液氮中。

调理：在照射前用10mg/kg/天Baytril水处理小鼠1-2天，且在移植前用300RAD进行亚致命性照射16-24小时。经由尾静脉注射进行移植(参见下文)。然后小鼠接受新鲜的Baytril水。一周后更换Baytril水，并且在移植后14天停止Baytril水添加。

移植：在移植当天，在37℃预热X-Vivo 10/1％PSG+3细胞因子混合物(重组人干细胞因子(SCF)、重组人促血小板生成素(TPO)和重组人Flt-3配体(Flt-3L))，在环境温度下制备新鲜PBS/0.1％BSA(无菌/过滤)。将冷冻保存的细胞在37℃下解冻，沉淀，重新悬浮在预热的X-Vivo培养基中，再次沉淀，重新悬浮于PBS/0.1％BSA中并计数。在另一次沉淀后，将细胞团块重新悬浮于每只小鼠550μL的PBS/0.1％BSA中(基于细胞计数2x 10^6个细胞/mL)。然后将细胞在室温下用25号针注射到小鼠尾静脉中。研究组在以下表5中示出。

表5：用于编辑的hCD34+细胞的植入的给药组

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每天观察动物的一般健康状况，并在前2周每天称重，且然后每两周称重一次。在移植后8、12、16和20周从下颌下静脉(100μL)收集外周血，或者在移植后12和20周对于处死的动物经由心脏穿刺(1mL)收集外周血。在移植后12周对每组中的一半动物(每组5只小鼠)实施安乐死，并收集骨髓和末梢血用于分析。在移植后20周处死每组中剩余的动物(每组5只小鼠)。

血液收集、细胞收获和加工：经由下颌下静脉或心脏穿刺将外周血收集到EDTA管中，并以500x g离心5分钟以除去血浆。在磷酸盐缓冲盐水(PBS)牛血清白蛋白(BSA)洗涤和离心后，向团块中添加10X体积的溶血缓冲液，并将混合物在37℃下孵育15分钟，离心并再次洗涤。将沉淀的级分在1mL PBS BSA中复原；取出等分部分并以1,000x g离心5分钟，保留所得的团块用于基因分型。将上清液级分用于FACS分析。

将骨髓、股骨、胫骨和骨盆骨收集在含有胎牛血清(FCS)的伊斯科夫改良的杜氏培养基(IMDM)中；将总骨髓冲入PBS BSA溶液中并使用70μm尼龙过滤器过滤。用PBS BSA将体积调节至10mL，并将等分部分用于细胞计数(Cellometer)。

使用MiSeq深度测序分析ZFN活性。简言之，从注射后第8周和第12周获得的血液样品或从注射后12周的骨髓中分离来自注射未转染的对照CD34+HSPC或用靶向ZFN mRNA的增强子转染的CD34+HSPC的小鼠的基因组DNA。将目标区(含有BCL11A基因座内的ZFN结合位点PCR扩增，并通过Illumina平台(MiSeq)上的配对末端深度测序确定修饰的水平。

为了产生与Illumina MiSeq测序平台相容的文库，使用连续PCR中的两组融合引物将衔接子、条形码和流动细胞结合物(短DNA序列)连接至靶特异性扩增子。对于小鼠血液和骨髓样品中人BCL11A增强子修饰的MiSeq评价，由于这些样品中的低靶DNA量，必须调整方案。

以下引物用于MiSeq衔接子PCR：PRJIYLFN-f2：

ACA CGA CGC TCT TCC GAT CTN NNN AGT CCT CTT CTA CCC CAC CCA(SEQ IDNO:32)和

PRJIYLFN-r4：

GAC GTG TGC TCT TCC GAT CTC TAC TCT TAG ACA TAA CAC ACC AGG G(SEQ IDNO:33)。

为了分析，通过DNeasy分离来自小鼠骨髓样品的DNA，并且在每个PCR反应中使用大约100ng的DNA。通过组织XS分离来自小鼠血液样品的DNA，并在每个反应中使用15μL分离的DNA中的10μL。除DNA之外，向每个MiSeq PCR反应中添加以下：25μL HotStar Taq混合物(Qiagen)，各自0.5μL的上文列出的BCL11A增强子引物(浓度为100nM)，并且水添加至50μL总反应体积。典型的MiSeq PCR条件是：95℃变性持续15'，和94℃持续30”、62℃持续30”和72℃持续40”下的30个循环，接着72℃下10’延伸。在MiSeq PCR后，将PCR产物用水稀释在1:50与1:200之间，或者对于具有非常低的起始细胞数的样品未稀释。用1μL如上所述稀释的MiSeq PCR产物、25μL HotStar Taq混合物、1μL正向条形码引物、1μL反向条形码引物(均浓度为10nM)和水至50μL总反应体积来进行条形码PCR。条形码PCR条件是：95℃变性持续15'，和94℃持续30”、60℃持续30”和72℃持续30”下的18个循环，接着72℃下10’延伸。合并条形码PCR产物并在Illumina MiSeq测序仪上测序。结果在以上表5中示出。

嵌合体的FACS分析和细胞谱系测定。为了评估人嵌合体的程度，分别用hCD45-APCCy7(Biolegend)和hCD45-BV510(BD Biosciences)抗体染色外周血(植入后8、12、16和20周)和骨髓(植入后12和20周)中的细胞的分数，并且进行FACS分析。此外，通过用以下表6中描述的特异性抗体对骨髓细胞进行染色来进行造血细胞谱系分析：

表6：细胞标志物的抗体来源

此外，为了纯化和分选HSPC群体，使用了使用磁性细胞分离(MACS)的富集/消减策略。首先用CD19-生物素、CD3-生物素、B220-生物素、TER119-生物素和m-ckit-生物素(BDBiosciences)对骨髓细胞进行染色，且然后与抗生物素珠粒(Miltenyi Biotec)一起孵育。使用置于MACS磁场中的LS柱(Miltenyi Biotec)分离阳性级分和消减的级分。在分离后，将阳性级分用链霉抗生物素蛋白-APC、CD3-FITC、CD19-PE、CD45-BV510(BD Biosciences)染色，并且CD34-FITC(BD Biosciences)、Gly-A-PE(DAKO)、CD19-APC(BD)、Lin-APC(Biolegend)、链霉抗生物素蛋白-APC、CD45-BV510、CD33-PE-CF594(BD)和CD38-PECy-7(Biolegend)对消减的级分进行染色。

使用如上所述的标准程序将未转染的HSPC和63014/65722转染的HSPC移植到NSG小鼠中。通过使用FACS测量hCD45阳性细胞的分数来评估植入后这些小鼠中的人嵌合体的程度。

图7示出在移植后第8周和第12周收集的外周血中人CD45+细胞的百分比，并且图8示出在第12周收获的骨髓中的百分比。如所示，此研究中的植入水平在未转染的对照和63014/65722转染的HSPC植入后是可比较的人嵌合体。分布在所述组中的60只中仅3只小鼠不具有CD45+细胞，从而表明未能移植。

使用标准程序用识别谱系特异性细胞表面标志物的抗体通过在第12周获得的骨髓细胞的FACS分析来测试各种造血细胞谱系的重建。如图9中所示，观察到在BCL11A特异性ZFN编码mRNA处理的CD34+细胞子代与未转染的细胞之间注射后第12周骨髓中所有分析的人造血细胞谱系的可比较的表示。分离在植入后第12周处死的小鼠的骨髓，并使用识别所指示谱系标志物的抗体通过FACS分析各种造血细胞谱系的分布。除了在图9C中表达红细胞标志物Cd71+(Ter119)的细胞(其以整个群体中阳性染色细胞的百分比给出，因为红细胞不是CD45阳性的)之外，所有数字均作为对于所指示谱系标志物染色阳性的细胞对人CD45阳性细胞百分比的比率给出。

通过使用如上所述的MiSeq测序平台对ZFN靶区进行深度测序来评估BCL11A红细胞增强子的基因修饰的水平(具有插入和缺失[插入缺失]的等位基因的％)。对于来自第8周和第12周的血液样品，数据显示在图10中，并且对于来自第12周的骨髓样品和源自63014/65722处理的细胞的第12周骨髓细胞样品的分选的谱系，数据显示在图11中。为了比较，在转染后2天测量的插入缺失百分比(如表5中所列出)也显示在图10和11的图上。

此外，在不同时间点和各种谱系中，对于63014/65722处理的HSPC供体组，发现BCL11A红细胞增强子处的基因修饰的良好保留。在BCL11A依赖性(B细胞，‘CD19’；原始祖细胞，‘CD38H’)和BCL11A非依赖性(骨髓'CD33')谱系中均观察到可比较的修饰。尽管输入基因修饰水平在PB-MR-003供体样品中高于PB-MR-004供体样品，但PB-MR-004来源的细胞始终显示更高的修饰水平，即在小鼠中比在源自PB-MR-003来源的细胞中更好的修饰保留。

总体而言，所观察到的小鼠中BCL11A红细胞增强子处的基因修饰的保留与在使用靶向多种基因靶标的许多ZFN的先前小鼠实验中观察到的一致。

此外，由于人红细胞祖细胞不能在小鼠中分化，所以为了确定在这些细胞中发生的BCL11A靶向基因修饰的量，从小鼠中除去骨髓细胞并在体外分化。在这些实验中，在植入后第12周从处死的小鼠中取出骨髓来源的人细胞并如上所述在体外分化。通过在分化的第14天从细胞分离的DNA的高通量Miseq测序来测量BCL11A靶基因修饰。

修饰数据(插入缺失)呈现在图12中，其显示在红细胞分化的第14天的修饰水平。在体外分化的第14天的插入缺失百分比对于从一只小鼠分离的细胞产生的每种培养物而言显著变化，从而反映了在这些条件下获得的扩增的寡细胞性质。数据表明，在红细胞分化过程中，由63014/65722ZFN介导的BCL11A增强子修饰未显著改变。如在血液和骨髓样品中观察到的，PB-MR-004源性细胞的红细胞子代样品显示出比PB-MR-003源性细胞的红细胞子代更高的平均修饰水平。

各种珠蛋白mRNA的相对水平通过在体外红细胞分化的第14天从细胞分离的RNA的RT-PCR分析来测定，并且数据呈现在图13A中，其中对于来自每组的5种红细胞培养物，相对γ-珠蛋白与β珠蛋白mRNA和γ-珠蛋白与α-珠蛋白mRNA比率(图13B)达到平均值。在未转染的和63014/65722处理的样品中，γ-珠蛋白与β珠蛋白或γ-珠蛋白与α珠蛋白mRNA比率在来自同一组的个体小鼠的红细胞子代之间广泛不同。供体PB-MR-004源性的培养物平均显示比来自供体PB-MR-003的那些更低的γ-珠蛋白比率，这与对于PB-MR-004源性的样品所观察到的更好成熟一致。然而，尽管存在这种可变性，但与其相应未转染的对应物相比，ZFN处理的样品平均值显示γ珠蛋白mRNA水平增加约1.5-2倍。

通过HPLC分析评估了珠蛋白蛋白质水平。图14示出在分化的第16天收获的样品的珠蛋白蛋白质分析。确定了γ珠蛋白(Aγ和Gγ峰的和)与α珠蛋白比率，以及γ珠蛋白(Aγ和Gγ峰的和)/相对于β样珠蛋白(Aγ、Gγ、β和δ-珠蛋白峰的和)比率，并且在每个条形上方示出每个组的平均值。与PB-MR-003源性样品的较差红细胞分化一致，源自此供体的未转染的细胞中的γ-珠蛋白水平非常高(约30％)，并且因此ZFN处理导致γ-珠蛋白水平仅增加1.2倍。PB-MR-004显示更典型的未转染的水平(约9％)，并且在通过小鼠12周后表现出γ-球蛋白水平增加约2倍。

据认为，与γ珠蛋白水平<8.6％的患者相比，天然具有>8.6％的γ珠蛋白的患者占优势(Platt等人(1994)N Engl J Med,330:1639-44)。事实上，通过植入编辑的细胞实现嵌合10％-20％百分比的非镰状细胞RBC可能带来临床改善(Chang等人(2017)Mol TherMethods Clin Dev 4:137-148.doi 10.1016/j.omtm.2016.12.009)。因此，尽管不得不经历体外红细胞分化过程，但是嵌合细胞的百分比和检测到的γ-珠蛋白的水平指示治疗功效。

本文提及的所有专利、专利申请和公布特此以引用的方式整体并入。

虽然出于清楚理解的目的，已通过说明和实施例详细地提供了公开内容，但是将为本领域技术人员所显而易见的是，可在不背离本公开的精神或范围的情况下实施各种变化和修改。因此，前述描述和实施例不应被理解为具有限制性。

Claims (25)

1.一种锌指核酸酶(ZFN)，其包含第一ZFN和第二ZFN，其中所述第一ZFN包含如SEQ IDNO：29中所示的氨基酸序列，且所述第二ZFN包含如SEQ ID NO：31中所示的氨基酸序列。

2.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1所述的锌指核酸酶。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸是mRNA。

4.如权利要求3所述的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：28或SEQ ID NO：30。

5.一种细胞，其包含如权利要求1所述的锌指核酸酶或如权利要求2至4中任一项所述的多核苷酸。

6.如权利要求5所述的细胞，其中所述细胞是干细胞或前体细胞。

7.如权利要求6所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。

8.如权利要求5至7中任一项所述的细胞，其中所述细胞的基因组被所述锌指核酸酶修饰。

9.如权利要求8所述的细胞，其中所述基因组修饰是选自由插入、缺失以及它们的组合组成的组。

10.如权利要求9所述的细胞，其中所述基因组修饰位于BCL11A增强子序列的+58区域内。

11.一种细胞或细胞系，其由如权利要求5至10中任一项所述的细胞产生。

12.一种部分或完全分化的细胞，其起源于如权利要求5至11中任一项所述的细胞或细胞系。

13.如权利要求5至12中任一项所述的细胞，其中与没有所述基因组修饰的细胞相比，所述细胞表现出γ和/或β珠蛋白的表达增加。

14.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的锌指核酸酶、如权利要求2至4中任一项所述的多核苷酸或如权利要求5至13中任一项所述的细胞。

15.根据权利要求1所述的锌指核酸酶或如权利要求2至4中任一项所述的多核苷酸在制备用于修饰细胞中的内源性BCL11A增强子序列的药物中的用途。

16.如权利要求15所述的用途，其还包括将外源序列引入所述细胞中，以使得所述外源序列被插入所述内源性BCL11A增强子序列中。

17.如权利要求15所述的用途，其中所述修饰包括缺失。

18.如权利要求5至13中任一项所述的细胞在制备用于增加受试者中的珠蛋白产生的药物中的用途。

19.如权利要求18所述的用途，其中所述受试者是人，并且所述细胞是人干细胞或人前体细胞。

20.如权利要求19所述的用途，其中将所述细胞输注到患者体内，并且所述细胞在所述受试者体内移植、分化并成熟。

21.如权利要求18至20中任一项所述的用途，其中所述受试者患有血红蛋白病。

22.如权利要求21所述的用途，其中所述血红蛋白病是β-地中海贫血或镰状细胞病。

23.如权利要求2-4中任一项所述的多核苷酸在制备用于产生遗传修饰的细胞的药物中的用途，所述遗传修饰的细胞包含内源性BCL11A增强子序列内的基因组修饰，其中所述细胞与如权利要求2-4中任一项所述的多核苷酸接触，并且使所述细胞经受有利于从所述多核苷酸表达融合蛋白的条件。

24.如权利要求23所述的用途，其还包括用至少一种细胞因子刺激所述细胞。

25.一种药盒，其包含如权利要求1所述的锌指核酸酶、如权利要求2至4中任一项所述的多核苷酸和/或如权利要求5至13中任一项所述的细胞。