JP7067793B2 - 核酸塩基編集因子およびその使用 - Google Patents

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Description

政府の援助
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号R01 EB022376（旧R01 GM065400）、国立衛生研究所によって授与されたトレーニング助成金番号F32 GM 112366-2およびF32 GM 106601-2、ならびに国立衛生研究所によって授与されたハーバード生物物理ＮＩＨトレーニング助成金T32 GM008313の下における政府の援助によってなされた。政府は本発明にある種の権利を有する。
関連出願
本願は、２０１５年１０月２３日出願のU.S.S.N.62/245,828、２０１６年１月１５日出願のU.S.S.N.62/279,346、２０１６年３月２２日出願のU.S.S.N.62/311,763、２０１６年４月１３日出願のU.S.S.N.62/322,178、２０１６年６月３０日出願のU.S.S.N.62/357,352、２０１６年８月３日出願のU.S.S.N.62/370,700、２０１６年９月２２日出願のU.S.S.N.62/398,490、２０１６年１０月１４日出願のU.S.S.N.62/408,686、および２０１６年６月３０日出願のU.S.S.N.62/357,332のＵ．Ｓ．仮特許出願の米国特許法§１１９（ｅ）の下における優先権を主張する；これらのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれる。
核酸配列の標的特異的編集、例えばゲノムDNAへの標的特異的切断または特定の改変の標的特異的導入は、遺伝子機能の研究のためには高度に有望なアプローチであり、ヒト遺伝子疾患の新たな治療法を提供するポテンシャルをもまた有する１。理想的な核酸編集テクノロジーは３つの特性を所有する：（１）所望の改変を実装する高い効率；（２）最小限のオフターゲット活性；および（３）所与の核酸中のいずれかの部位、例えばヒトゲノム中のいずれかの部位を正確に編集するようにプログラムされる能力２。現行のゲノム操作ツールは、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）３、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）４、および最も最近ではRNA誘導型DNAエンドヌクレアーゼCas9５を包含し、ゲノム中における配列特異的なDNA切断を生ぜしめる。このプログラム可能な切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によって切断部位におけるDNAの変異、または相同組換え修復（ＨＤＲ）によって切断部位の周辺のDNAの置き換えをもたらし得る６，７。
現行のテクノロジーの１つの欠点は、ＮＨＥＪおよびＨＤＲ両方が確率的なプロセスであり、これらが典型的には控えめな遺伝子編集効率と、所望の変改と競合し得る不要の遺伝子変改とをもたらすということである８。原理的には、多くの遺伝子疾患はゲノム中の特定の場所における特定のヌクレオチド変化を生ぜしめることによって処置され得るので（例えば、疾患に関連する遺伝子の特定のコドンにおけるCからTへの変化）９、かかる高精度遺伝子編集を達成するためのプログラム可能なやり方の開発は、強力な新たな研究ツール、かつ遺伝子編集に基づくヒト治療の潜在的な新たなアプローチということになるであろう。
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（CRISPR）システムは最近発見された原核生物の適応免疫システムであり１０、これは改変されて、種々の生物および細胞株におけるロバストで一般的なゲノム操作を可能にしている１１。CRISPR-Cas（CRISPR関連）システムは蛋白質-RNA複合体であり、これは、塩基対形成によって標的DNA配列に複合体を局在させるためのガイドとしてRNA分子（sgRNA）を用いる１２。それから、天然のシステムにおいては、Cas蛋白質はエンドヌクレアーゼとして働いて、標的のDNA配列を切断する１３。システムが機能するためには、標的DNA配列はsgRNAに対して相補的であり、かつ相補領域の３’末端に「プロトスペーサー隣接モチーフ」（PAM）をもまた含有しなければならない１４。
公知のCas蛋白質のなかで、S. pyogenes Cas9はゲノム操作のためのツールとして主として広く用いられてきた１５。このCas9蛋白質は２つの別々のヌクレアーゼドメインを含有する大きいマルチドメイン蛋白質である。点変異がヌクレアーゼ活性を喪失させるようにCas9に導入されて、sgRNAによってプログラムされた様式でDNAに結合するその能力をなお保持する不活性型Cas9（dCas9）をもたらし得る１６。原理的には、別の蛋白質またはドメインに融合したときに、dCas9は単純に適切なsgRNAとの共発現によってその蛋白質を実質的にいずれかのDNA配列にターゲティングし得る。
ゲノム操作目的にとってのdCas9複合体のポテンシャルは甚大である。sgRNAによってプログラムされたゲノム中の特定の部位に蛋白質を持っていくそのユニークな能力は、理論上は、転写活性化因子、転写リプレッサー、ヒストン修飾蛋白質、インテグラーゼ、およびリコンビナーゼを包含する、ヌクレアーゼを超えた種々の部位特異的ゲノム操作ツールへと発展させられ得る１１。それらの潜在的な用途のいくつかは、転写活性化因子とのdCas9融合体によって最近実装されて、RNA誘導型の転写活性化因子１７，１８、転写リプレッサー１６，１９，２０、およびクロマチン修飾酵素を提供した２１。それらの融合体の種々のsgRNAとの単純な共発現は、標的遺伝子の特異的発現をもたらす。これらの先駆的研究は、ゲノムの正確な操作のためのたやすくプログラム可能な配列特異的エフェクターの設計および構築への道を敷いた。
重要なことに、ヒト疾患の要因である蛋白質変異の８０～９０％は、一ヌクレオチドのみの置換、欠失、または挿入から生起する６。一塩基遺伝子修正のための大部分の現行の戦略は、操作されたヌクレアーゼ（これは、二本鎖切断ＤＳＢの作出、次に確率的で非効率的な相同組換え修復ＨＤＲに頼っている）およびDNA-RNAキメラオリゴヌクレオチドを包含する２２。後者の戦略には、編集されるべきヌクレオチドを除いて、ゲノムDNA中の特定の配列と塩基対形成するようなRNA／DNA配列の設計が関わる。もたらされるミスマッチは、細胞の内在性の修復システムによって認識および修理され、キメラまたはゲノムどちらかの配列の変化に至る。これらの戦略の両方は、低い遺伝子編集効率および不要の遺伝子変改という悩みがある。なぜなら、これらは、ＨＤＲの確率性とＨＤＲおよび非相同末端結合ＮＨＥＪの間の競合と両方を被るからである２３～２５。ＨＤＲ効率は、ゲノム中の標的遺伝子の場所２６、細胞周期の状態２７、および細胞／組織の型２８に応じて変わる。よって、確率性を有さず酵素様の効率を有するゲノムDNA中の正確な場所の塩基改変の特異的な型を実装するための直接的でプログラム可能なやり方の開発は、遺伝子編集に基づく研究ツールおよびヒト治療の強力な新たなアプローチということになる。
本開示のいくつかの側面は、リンカーによって融合されたdCas9ドメインおよびシチジンデアミナーゼドメインのある種の構成が、標的シチジン残基を効率的に脱アミノ化することに有用であるという認識に基づく。本開示の他の側面は、シチジンデアミナーゼドメインがリンカーによってヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）のＮ末端に融合された核酸塩基編集融合蛋白質が、二本鎖DNA標的分子中の標的核酸を効率的に脱アミノ化することができたという認識に関する。例えば下の例３および４参照。これらは、本明細書において塩基編集因子ともまた言われる融合蛋白質が、他の塩基編集因子、例えばUGIドメインなしの塩基編集因子よりも少ないindelを創り、標的核酸を効率的に脱アミノ化するということを実証している。いくつかの態様において、融合蛋白質はヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）ドメインおよびアポリポ蛋白質B mRNA編集複合体1（APOBEC1）デアミナーゼドメインを含み、デアミナーゼドメインは、アミノ酸配列SGSETPGTSESATPES（配列番号７）を含むリンカーによってdCas9ドメインのＮ末端に融合されている。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）ドメインは、配列番号２６３に示されているアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、デアミナーゼはラットAPOBEC1である（配列番号２８４）。いくつかの態様において、デアミナーゼはヒトAPOBEC1である（配列番号２８２）。いくつかの態様において、デアミナーゼはpmCDA1である（配列番号５７３８）。いくつかの態様において、デアミナーゼはヒトAPOBEC3Gである（配列番号２７５）。いくつかの態様において、デアミナーゼは（配列番号５７３９～５７４１）のいずれか１つのヒトAPOBEC3Gバリアントである。
本開示のいくつかの側面は、リンカーによって融合されたdCas9ドメインおよびシチジンデアミナーゼドメインのある種の構成が、標的シチジン残基を効率的に脱アミノ化するために有用であるという認識に基づく。本開示の他の側面は、アポリポ蛋白質B mRNA編集複合体1（APOBEC1）デアミナーゼドメインがアミノ酸配列SGSETPGTSESATPES（配列番号７）を含むリンカーによってヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）のＮ末端に融合した核酸塩基編集融合蛋白質が、二本鎖DNA標的分子中の標的核酸を効率的に脱アミノ化することができたという認識に関する。いくつかの態様において、融合蛋白質はヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）ドメインおよびアポリポ蛋白質B mRNA編集複合体1（APOBEC1）デアミナーゼドメインを含み、デアミナーゼドメインは、アミノ酸配列SGSETPGTSESATPES（配列番号７）を含むリンカーによってdCas9ドメインのＮ末端に融合される。
いくつかの態様において、融合蛋白質は、配列番号５９１に示されているアミノ酸配列のアミノ酸残基１１～１６２９を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は、配列番号５９１に示されているアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は配列番号５７３７、５７４３、５７４５、および５７４６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
本開示のいくつかの側面は、対象のゲノム、例えばヒトのゲノム中の単一部位を編集することを包含する核酸の標的特異的編集に有用である戦略、システム、試薬、方法、およびキットを提供する。いくつかの態様においては、Cas9（例えば、dCas9、ヌクレアーゼ活性Cas9、またはCas9ニッカーゼ）とデアミナーゼまたはデアミナーゼドメインとの融合蛋白質が提供される。いくつかの態様においては、標的特異的な核酸編集のための方法が提供される。いくつかの態様においては、標的特異的な核酸編集蛋白質、例えば、Cas9とデアミナーゼまたはデアミナーゼドメインとの融合蛋白質の生成のための試薬およびキットが提供される。
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供されるCas9蛋白質を含む融合蛋白質を提供し、これは第２の蛋白質（例えば、シチジンデアミナーゼドメインなどの酵素ドメイン）に融合されており、それゆえに融合蛋白質を形成している。いくつかの態様において、第２の蛋白質は酵素ドメインまたは結合ドメインを含む。いくつかの態様において、酵素ドメインはヌクレアーゼ、ニッカーゼ、リコンビナーゼ、デアミナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、転写活性化因子、または転写リプレッサードメインである。いくつかの態様において、酵素ドメインは核酸編集ドメインである。いくつかの態様において、核酸編集ドメインはデアミナーゼドメインである。いくつかの態様において、デアミナーゼはシトシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはアポリポ蛋白質B mRNA編集複合体（APOBEC）ファミリーデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC1デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC2デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Aデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Bデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Cデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Dデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Eデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Fデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Gデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Hデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC4デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは活性化誘導デアミナーゼ（AID）である。デアミナーゼがいずれかの好適な生物（例えば、ヒトまたはラット）からであり得るということは理解されるはずである。いくつかの態様において、デアミナーゼはヒト、チンパンジー、ゴリラ、猿、牛、犬、ラット、またはマウスからである。いくつかの態様において、デアミナーゼはラットAPOBEC1である（配列番号２８４）。いくつかの態様において、デアミナーゼはヒトAPOBEC1である（配列番号２８２）。いくつかの態様において、デアミナーゼはpmCDA1である。
本開示のいくつかの側面は、（ｉ）配列番号２６３のアミノ酸配列を含むヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）ドメインと；（ｉｉ）アポリポ蛋白質B mRNA編集複合体1（APOBEC1）デアミナーゼドメインとを含む融合蛋白質を提供し、デアミナーゼドメインは、SGSETPGTSESATPES（配列番号７）のアミノ酸配列を含むリンカーによってdCas9ドメインのＮ末端に融合されている。いくつかの態様において、デアミナーゼはラットAPOBEC1である（配列番号２８４）。いくつかの態様において、デアミナーゼはヒトAPOBEC1である（配列番号２８２）。いくつかの態様において、融合蛋白質は配列番号５９１のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は配列番号５７３７のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、デアミナーゼはpmCDA1である（配列番号５７３８）。いくつかの態様において、デアミナーゼはヒトAPOBEC3Gである（配列番号２７５）。いくつかの態様において、デアミナーゼは配列番号５７３９～５７４１のいずれか１つのヒトAPOBEC3Gバリアントである。
本開示のいくつかの側面は、（ｉ）Cas9ニッカーゼドメインと（ｉｉ）アポリポ蛋白質B mRNA編集複合体1（APOBEC1）デアミナーゼドメインとを含む融合蛋白質を提供し、デアミナーゼドメインはCas9ニッカーゼドメインのＮ末端に融合されている。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼドメインは、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のD10X変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、XはD以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のD10A変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のアミノ酸位置８４０、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応するアミノ酸位置にヒスチジンを含む。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼドメインのアミノ酸配列は、配列番号２６７に示されているアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、デアミナーゼはラットAPOBEC1である（配列番号２８４）。いくつかの態様において、デアミナーゼはヒトAPOBEC1である（配列番号２８２）。いくつかの態様において、デアミナーゼはpmCDA1である。
本開示のいくつかの側面は、（ｉ）Cas9ニッカーゼドメインと（ｉｉ）アポリポ蛋白質B mRNA編集複合体1（APOBEC1）デアミナーゼドメインとを含む融合蛋白質を提供し、デアミナーゼドメインはCas9ニッカーゼドメインのＮ末端に融合されている。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼドメインは、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のD10X変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、XはD以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のD10A変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のアミノ酸位置８４０、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応するアミノ酸位置にヒスチジンを含む。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼドメインのアミノ酸配列は、配列番号２６７に示されているアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、デアミナーゼはラットAPOBEC1である（配列番号２８４）。いくつかの態様において、デアミナーゼはヒトAPOBEC1である（配列番号２８２）。いくつかの態様において、デアミナーゼはpmCDA1である。
本開示の他の側面は、デアミナーゼドメインとdCas9ドメインとウラシルグリコシラーゼ阻害剤（UGI）ドメインとを含む融合蛋白質が、核酸分子中の標的ヌクレオチドを脱アミノ化するための改善された効率を実証するという認識に関する。いずれかの具体的な理論によって拘束されようとすることはないが、U:Gヘテロ二本鎖DNAの存在に対する細胞のDNA修復応答が、細胞における核酸塩基編集効率の減少の要因であり得る。ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）は細胞内のDNAからのUの除去を触媒し、これは、U:G対からC:G対への復帰変異を最も共通のアウトカムとする塩基除去修復を開始させ得る。本明細書において実証されているように、ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤（UGI）はヒトUDG活性を阻害し得る。いずれかの具体的な理論によって拘束されようとすることはないが、塩基除去修復は、単一鎖に結合、編集された塩基をブロック、UGIを阻害、塩基除去修復を阻害、編集された塩基を保護、および／または編集されない鎖の「修理」を促進する分子などによって阻害され得る。それゆえに、本開示は、UGIドメインに融合されたdCas9-シチジンデアミナーゼドメインを含む融合蛋白質を企図する。
いくつかの態様において、融合蛋白質は、ヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）ドメインと；核酸編集ドメインと；ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（UGI）ドメインとを含む。いくつかの態様において、dCas9ドメインは、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のD10X変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、XはD以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、dCas9ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のD10A変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、dCas9ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のH840X変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、XはH以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、dCas9ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のH840A変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、dCas9ドメインは、配列番号２６３に示されているアミノ酸配列を含む。
本開示のさらなる側面は、Cas9ニッカーゼをCas9ドメインとして用いる融合蛋白質が、核酸を編集するための改善された効率を実証するという認識に関する。例えば、本開示の側面は、Cas9ニッカーゼとデアミナーゼドメインとUGIドメインとを含む融合蛋白質が、核酸を編集するための改善された効率を実証するという認識に関する。例えば、ヌクレオチドを編集するための改善された効率は、下で実施例の項に記載されている。
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかが、indelの有意な割合を生成することなしに、特定のヌクレオチド塩基を改変することができるという認識に基づく。本明細書において用いられる「indel」は核酸中のヌクレオチド塩基の挿入または欠失を言う。かかる挿入または欠失は遺伝子のコード領域内のフレームシフト変異に至り得る。いくつかの態様においては、核酸中に多数の挿入または欠失（すなわちindel）を生成することなしに、核酸中の特定のヌクレオチドを効率的に改変する（例えば、変異させるかまたは脱アミノ化する）塩基編集因子を創ることが望ましい。ある種の態様において、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかは、indelと比べて、意図される改変（例えば、点変異または脱アミノ化）のより高い割合を生成することができる。
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかが、意図されない点変異などの意図されない変異の有意な数を生成することなしに、核酸（例えば対象のゲノム中の核酸）中に点変異などの意図される変異を効率的に生成することができるという認識に基づく。
いくつかの態様において、融合蛋白質は、Cas9ニッカーゼドメイン、核酸編集ドメイン、およびウラシルグリコシラーゼ阻害剤（UGI）ドメインを含む。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のD10X変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、XはD以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のD10A変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼドメインのアミノ酸配列は、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のアミノ酸位置８４０、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応するアミノ酸位置にヒスチジンを含む。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼドメインのアミノ酸配列は、配列番号２６７に示されているアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、融合蛋白質のデアミナーゼドメインはdCas9ドメインまたはCas9ニッカーゼのＮ末端に融合される。いくつかの態様において、UGIドメインはdCas9ドメインまたはCas9ニッカーゼのＣ末端に融合される。いくつかの態様において、dCas9ドメインまたはCas9ニッカーゼと核酸編集ドメインとはリンカーによって融合される。いくつかの態様において、dCas9ドメインまたはCas9ニッカーゼとUGIドメインとはリンカーによって融合される。
ある種の態様においては、リンカーが、本発明のペプチドまたはペプチドドメインのいずれかをリンクするために用いられ得る。リンカーは共有結合ほども単純であり得、または、これは長さが多くの原子であるポリマーリンカーであり得る。ある種の態様において、リンカーはポリペプチド（polpeptide）であるか、またはアミノ酸に基づく。他の態様において、リンカーはペプチド様ではない。ある種の態様において、リンカーは共有結合である（例えば、炭素－炭素結合、ジスルフィド結合、炭素－ヘテロ原子結合など）。ある種の態様において、リンカーはアミド結合の炭素－窒素結合である。ある種の態様において、リンカーは、環状または非環状の、置換または無置換の、分岐または非分岐の、脂肪族またはヘテロ脂肪族リンカーである。ある種の態様において、リンカーはポリマー性である（例えば、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど）。ある種の態様において、リンカーはアミノアルカン酸のモノマー、二量体、またはポリマーを含む。ある種の態様において、リンカーはアミノアルカン酸を含む（例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータ－アラニン、３－アミノプロパン酸、４－アミノ酪酸、５－ペンタン酸など）。ある種の態様において、リンカーはアミノヘキサン酸（Ａｈｘ）のモノマー、二量体、またはポリマーを含む。ある種の態様において、リンカーは炭素環部分に基づく（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン）。他の態様において、リンカーはポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。他の態様において、リンカーはアミノ酸を含む。ある種の態様において、リンカーはペプチドを含む。ある種の態様において、リンカーはアリールまたはヘテロアリール部分を含む。ある種の態様において、リンカーはフェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドからリンカーへの求核剤の取り付けを促すための官能部分（例えば、チオール、アミノ）を包含し得る。いずれかの求電子剤がリンカーの一部として用いられ得る。例示的な求電子剤は、活性エステル、活性アミド、マイケルアクセプター、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシル、およびイソチオシアネートを包含するが、これに限定されない。
いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列(GGGGS)n（配列番号５）、(G)n、(EAAAK)n（配列番号６）、(GGS)n、(SGGS)n（配列番号４２８８）、SGSETPGTSESATPES（配列番号７）、(XP)n、またはそのいずれかの組み合わせを含み、nは独立して１および３０の間の整数であり、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーはアミノ酸配列(GGS)nを含み、nは１、３、または７である。いくつかの態様において、リンカーはアミノ酸配列SGSETPGTSESATPESを含む（配列番号７）。
いくつかの態様において、融合蛋白質は構造[核酸編集ドメイン]-[任意のリンカー配列]-[dCas9またはCas9ニッカーゼ]-[任意のリンカー配列]-[UGI]を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は構造[核酸編集ドメイン]-[任意のリンカー配列]-[UGI]-[任意のリンカー配列]-[dCas9もしくはCas9ニッカーゼ]；[UGI]-[任意のリンカー配列]-[核酸編集ドメイン]-[任意のリンカー配列]-[dCas9もしくはCas9ニッカーゼ]；[UGI]-[任意のリンカー配列]-[dCas9もしくはCas9ニッカーゼ]-[任意のリンカー配列]-[核酸編集ドメイン]；[dCas9もしくはCas9ニッカーゼ]-[任意のリンカー配列]-[UGI]-[任意のリンカー配列]-[核酸編集ドメイン]；または[dCas9もしくはCas9ニッカーゼ]-[任意のリンカー配列]-[核酸編集ドメイン]-[任意のリンカー配列]-[UGI]を含む。
いくつかの態様において、核酸編集ドメインはデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、核酸編集ドメインはデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、デアミナーゼはシチジンデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはアポリポ蛋白質B mRNA編集複合体（APOBEC）ファミリーデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC1デアミナーゼ、APOBEC2デアミナーゼ、APOBEC3Aデアミナーゼ、APOBEC3Bデアミナーゼ、APOBEC3Cデアミナーゼ、APOBEC3Dデアミナーゼ、APOBEC3Fデアミナーゼ、APOBEC3Gデアミナーゼ、APOBEC3Hデアミナーゼ、またはAPOBEC4デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは活性化誘導デアミナーゼ（AID）である。いくつかの態様において、デアミナーゼはヤツメウナギCDA1（pmCDA1）デアミナーゼである。
いくつかの態様において、デアミナーゼはヒト、チンパンジー、ゴリラ、猿、牛、犬、ラット、またはマウスからである。いくつかの態様において、デアミナーゼはヒトからである。いくつかの態様において、デアミナーゼはラットからである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、（配列番号２８４）に示されているアミノ酸配列を含むラットAPOBEC1デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、（配列番号２８２）に示されているアミノ酸配列を含むヒトAPOBEC1デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはpmCDA1である（配列番号５７３８）。いくつかの態様において、デアミナーゼはヒトAPOBEC3Gである配列番号２７５）。いくつかの態様において、デアミナーゼは（配列番号５７３９～５７４１）のいずれか１つのヒトAPOBEC3Gバリアントである。いくつかの態様において、デアミナーゼは、配列番号２６６～２８４または５７２５～５７４１に示されているアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。
いくつかの態様において、UGIドメインは、配列番号６００と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、UGIドメインは、配列番号６００に示されているアミノ酸配列を含む。
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供されるCas9蛋白質またはCas9融合蛋白質とCas9蛋白質またはCas9融合蛋白質に結合したガイドRNAとを含む複合体を提供する。
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供されるCas9蛋白質、融合蛋白質、または複合体を用いる方法を提供する。例えば、本開示のいくつかの側面は、DNA分子を（ａ）本明細書において提供されるCas9蛋白質または融合蛋白質およびガイドRNAと；あるいは（ｂ）本明細書において提供されるgRNAとのCas9蛋白質、Cas9融合蛋白質、またはCas9蛋白質もしくは融合蛋白質複合体と接触させることを含む方法を提供し、ガイドRNAは約１５～１００ヌクレオチドの長さであり、標的配列に対して相補的である少なくとも１０個の一続きのヌクレオチドの配列を含む。
本開示のいくつかの側面は、（ａ）本明細書において提供されるCas9蛋白質またはCas9融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列と；（ｂ）（ａ）の配列の発現を駆動する異種プロモーターとを含む、核酸コンストラクトを含むキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、さらに、ガイドRNAバックボーンをコードする発現コンストラクトを含み、コンストラクトは、ガイドRNAバックボーン中への標的配列と同一または相補的な核酸配列のクローニングを許すように位置したクローニング部位を含む。
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される融合蛋白質のCas9蛋白質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示のいくつかの側面は、かかるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターは、ポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む。
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供されるCas9蛋白質、融合蛋白質、核酸分子、および／またはベクターを含む細胞を提供する。
上のレポーターシステムの例示的な態様の記載は、例解の目的のためにのみ提供されており、限定することを意味されていない。追加のレポーターシステム、例えば上で詳細に記載されている例示的なシステムのバリエーションもまた本開示によって包摂される。
上の概要は、限定しない様式で、本明細書において開示されるテクノロジーの態様、利点、特徴、および使用のいくつかを例解することを意味されている。本明細書において開示されるテクノロジーの他の態様、利点、特徴、および使用は、発明を実施するための形態、図面、実施例、および特許請求の範囲から明らかであろう。
図１は、一本鎖DNA基質に対するデアミナーゼのデアミナーゼ活性を示している。ランダム化されたPAM配列（NNN PAM）を用いた一本鎖DNA基質を、負のコントロールとして用いた。古典的PAM配列を用いた（NGG PAM）。
図２は、一本鎖DNA基質に対するCas9:デアミナーゼ融合蛋白質の活性を示している。
図３は、Cas9:デアミナーゼ:sgRNA複合体による二本鎖DNA基質結合を図解している。
図４は、二本鎖DNA脱アミノ化アッセイを図解している。
図５は、Cas9融合体が二本鎖DNA標的配列の位置３～１１をターゲティングし得るということを実証している（図５の概略に従って付番）。上のゲル：１μＭのrAPOBEC1-GGS-dCas9、１２５ｎＭのdsDNA、１当量のsgRNA。中央のゲル：１μＭのrAPOBEC1-(GGS)3（配列番号５９６）-dCas9、１２５ｎＭのdsDNA、１当量のsgRNA。下のゲル：１．８５μＭのrAPOBEC1-XTEN-dCas9、１２５ｎＭのdsDNA、１当量のsgRNA。
図６は、正しいガイドRNA、例えば正しいsgRNAがデアミナーゼ活性に要求されるということを実証している。
図７は、デアミナーゼ-dCas9:sgRNA複合体によるインビボ標的配列の標的DNA結合のメカニズムを例解している。
図８は、例示的な疾患関連標的配列の上首尾な脱アミノ化を示している。
図９は、His6-rAPOBEC1-XTEN-dCas9を用いたインビトロのC->T編集効率を示している。
図１０は、HEK293T細胞におけるC->T編集効率がUGIとの融合によって大いに向上するということを示している。
図１１Ａから１１Ｃは、NBE1が、インビトロの特異的なガイドRNAによってプログラムされたC->U変換を媒介するということを示している。図１１Ａ：核酸塩基編集戦略．ガイドRNA（緑色）によって規定されるローカスに標的C（赤色）を有するDNAは、dCas9（青色）によって結合され、これはDNA基質の局所的変性を媒介する。テザリングされたAPOBEC1酵素（橙色）によるシチジン脱アミノ化は、標的CをUに変換する。もたらされたG:Uヘテロ二本鎖は、DNA複製または修復後に、永久的にA:T塩基対に変換され得る。Uが鋳型DNA鎖中にある場合には、これは、転写後には、G->A変異を含有するRNA転写物をもまたもたらすであろう。図１１Ｂ：およそ５ヌクレオチドの活性ウインドウを示す脱アミノ化アッセイ．３７℃における２ｈのdsDNA基質とのNBE1-sgRNA複合体のインキュベーション後に、５’フルオロフォア標識されたDNAを単離し、３７℃においてUSER酵素（ウラシルDNAグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼVIII）と１ｈインキュベーションして、いずれかのウラシルの部位におけるDNA切断を誘導した。もたらされたDNAを変性ポリアクリルアミドゲルによって分離し、いずれかのフルオロフォアがリンクした鎖を可視化した。各レーンは、プロトスペーサー内の標的Cの位置に従って、または標的Cが存在しない場合には「-」によって、標識されており、PAMから遠位の塩基を位置１としてカウントする。図１１Ｃ：NBE1の配列特異性およびsgRNA依存性を示すデアミナーゼアッセイ。位置７に標的Cを有するDNA基質を、正しいsgRNA、ミスマッチのsgRNA、またはsgRNAなしどちらかによって、図１１ＢのようにNBE1とインキュベーションした。C->U編集は、ミスマッチのsgRNAまたはsgRNAなしでは観察されない。正のコントロールサンプルは、Uが位置７に合成的に組み込まれたDNA配列を含有する。
図１２Ａから１２Ｂは、インビトロの核酸塩基編集効率に対する配列文脈および標的C位置の効果を示している。図１２Ａ：インビトロの編集効率に対する、標的Cの周辺の配列を変化させることの効果。プロトスペーサー配列5'-TTATTTCGTGGATTTATTTA-3'（配列番号２６４）内のC7について、標的鎖の８０％という脱アミノ化収率（両方の鎖からの合計のシーケンシングリードの４０％）を１．０と定義した。位置１～６および８～１３における全ての可能な一塩基変異を含有する基質の相対的脱アミノ化効率が示されている。値およびエラーバーは、異なる日に行われた２つ以上の独立した生物学的レプリケートの平均および標準偏差を反映している。図１２Ｂ：インビトロの編集効率に対する各NCモチーフの位置効果。各NC標的モチーフを、右に示されている配列に示されているようにプロトスペーサー内の位置１から８まで変えた（PAMは赤色で示されている。プロトスペーサープラスプロトスペーサーの５’の１塩基もまた示されている）。NBE1とのインキュベーション後に、付番された標的C位置のそれぞれにTを含有する合計の配列リードのパーセンテージがグラフに示されている。インビトロの最大の可能な脱アミノ化収率は、合計のシーケンシングリードの５０％（標的鎖の１００％）であるということに注意。値およびエラーバーは、異なる日に行われた２つまたは３つの独立した生物学的レプリケートの平均および標準偏差を反映している。図１２Ｂは、上から下にそれぞれ配列番号２８５から２９２を図示している。
図１３Ａから１３Ｃはヒト細胞の核酸塩基編集を示している。図１３Ａ：核酸塩基編集因子によってターゲティングされる６つの哺乳類細胞ゲノムローカスのプロトスペーサー（黒色）およびPAM（赤色）配列。標的Cは、プロトスペーサー内のそれらの位置に対応する下付きの番号によって示されている。図１３Ａは、上から下にそれぞれ配列番号２９３から２９８を図示している。図１３Ｂ：HEK293T細胞を、NBE1、NBE2、またはNBE3、および適切なsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後に、ゲノムDNAを抽出し、ハイスループットDNAシーケンシングによって６つのローカスについて分析した。示されている標的位置にTを有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージとして定義される、細胞のC->T変換パーセンテージが、NBE1、NBE2、およびNBE3では全ての６つのゲノムローカスについて、ドナーＨＤＲ鋳型ありのwt Cas9では６つの部位の３つ（EMX1、HEK293部位３、およびHEK293部位４）について示されている。値およびエラーバーは、異なる日に行われた３つの独立した生物学的レプリケートの平均および標準偏差を反映している。図１３Ｃ：HEK293T細胞の処置後に、方法に記載されているように計算されたindel形成の頻度が、NBE2およびNBE3では全ての６つのゲノムローカスについて、またはwt Cas9およびＨＤＲの一本鎖DNA鋳型では６つの部位の３つ（ＥＭＸ１、ＨＥＫ２９３部位３、およびＨＥＫ２９３部位４）について示されている。値は、異なる日に行われた少なくとも３つの独立した生物学的レプリケートの平均を反映している。
図１４Ａから１４Ｃは、哺乳類細胞の３つの疾患に関係する変異のNBE2およびNBE3によって媒介される修正を示している。各部位について、プロトスペーサーの配列が変異の名称の右に示されており、PAMは緑色で強調され、変異の要因である塩基は太字で、プロトスペーサー内のその位置に対応する下付きの番号によって示されている。各疾患関連アレルの上のアミノ酸配列は、赤色の核酸塩基編集後の修正されたアミノ酸配列と一緒に示されている。各配列の下は、対応する塩基を有する合計のシーケンシングリードのパーセンテージである。細胞を、NBE2またはNBE3、および適切なsgRNAをコードするプラスミドによってヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクションの２日後に、ゲノムDNAを抽出し、ＨＴＳによって分析して、病因性変異の修正を評価した。図１４Ａ：マウスアストロサイトにおいて、アルツハイマー病関連APOE4アレルが、合計のリードの１１％（ヌクレオフェクションされたアストロサイトの４４％）においてNBE3によってAPOE3'に変換されている。２つの近傍のCもまたTに変換されているが、もたらされる蛋白質の予測配列に変化はない（配列番号２９９）。図１４Ｂは、癌関連p53 N239D変異が、変異についてヘテロ接合である処置されたヒトリンパ腫細胞の１１％（ヌクレオフェクションされた細胞の１２％）においてNBE2によって修正されている（配列番号３００）。図１４Ｃは、p53 Y163C変異が、ヌクレオフェクションされたヒト乳癌細胞の７．６％において、NBE3によって修正されている（配列番号３０１）。
図１５Ａから１５Ｄは、核酸塩基編集に対するデアミナーゼ-dCas9リンカー長および組成の効果を示している。GGS（図１５Ａ）、(GGS)3；（配列番号５９６）（図１５Ｂ）、XTEN（図１５Ｃ）、または(GGS)7（配列番号５９７）のデアミナーゼ-Cas9リンカーを有する核酸塩基編集因子の脱アミノ化ウインドウを示す、ゲルに基づくデアミナーゼアッセイ（図１５Ｄ）。３７℃における２ｈの１２５μＭのdsDNA基質との１．８５μＭの編集因子-sgRNA複合体のインキュベーション後に、色素がコンジュゲーションされたDNAを単離し、USER酵素（ウラシルDNAグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼVIII）と３７℃において追加の１時間インキュベーションして、DNAバックボーンをいずれかのウラシルの部位において切断した。もたらされたDNAを変性ポリアクリルアミドゲルによって分離し、色素がコンジュゲーションされた鎖をイメージングした。各レーンは、プロトスペーサー内における標的Cの位置に従って、または標的Cが存在しない場合には「-」によって付番されている。8Uは、Uが位置８に合成的に組み込まれた正のコントロール配列である。
図１６Ａから１６Ｂは、NBE1が、疾患に関係する変異をインビトロで修正することができるということを示している。図１６Ａ：７つの疾患に関係する変異のプロトスペーサーおよびPAM配列（赤色）。各ケースの疾患関連の標的Cは、プロトスペーサー内のその位置を反映する下付きの番号によって示されている。両方のAPOE4 SNP以外の全ての変異について、標的Cは鋳型（非コード）鎖上に在る。図１６Ａは、上から下にそれぞれ配列番号３０２から３０８を図示している。図１６Ｂ：NBE1とのインキュベーション、DNA単離、およびUを含有する位置においてDNAを切断するためのUSER酵素とのインキュベーションの前（-）および後（+）の各dsDNAオリゴヌクレオチドを示す、デアミナーゼアッセイ。プロトスペーサー内の種々の位置にUを含有する合成オリゴヌクレオチドのUSER酵素とのインキュベーションからの正のコントロールレーンを、Uの位置を示す対応する番号によって示している。
図１７はNBE1の処理能力を示している。８つの連続的なCを含有する６０ｍｅｒのDNAオリゴヌクレオチドのプロトスペーサーおよびPAM（赤色）が上に示されている。オリゴヌクレオチド（１２５ｎＭ）をNBE1（２μＭ）と３７℃において２ｈインキュベーションした。DNAを単離し、ハイスループットシーケンシングによって分析した。観察された最も高頻度の９つの配列について、合計のリードのパーセントを示している。編集された鎖の大多数（＞９３％）は、Tに変換された１つよりも多くのCを有する。この図は配列番号３０９を図示している。
図１８Ａから１８Ｈは、UGIをNBE1に融合してNBE2を創る効果を示している。図１８Ａ：核酸塩基編集因子によってターゲティングされた６つの哺乳類細胞ゲノムローカスのプロトスペーサーおよびPAM（赤色）配列。編集可能なCは、プロトスペーサー内のそれらの位置に対応する標識によって示されている。図１８Ａは、上から下にそれぞれ配列番号２９３から２９８を図示している。図１８Ｂから１８Ｇ：HEK293T細胞を、NBE1、NBE2、またはNBE1およびUGI、ならびに適切なsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後に、ゲノムDNAを抽出し、ハイスループットDNAシーケンシングによって６つのローカスについて分析した。示されている標的位置にTを有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージとして定義される、細胞のC->T変換パーセンテージが、NBE1、NBE１およびUGI、ならびにNBE2について全ての６つのゲノムローカスにおいて示されている。図１８Ｈ：目当てのプロトスペーサーの周辺の５１０個のCにおけるC->T変異率が、NBE1、NBE1プラス別個のプラスミド上のUGI、NBE2、および無処置の細胞について示されている。データは、１．５×１０６細胞からの３，０００，０００個のDNAシーケンシングリードの結果を示している。値は、異なる日に行われた少なくとも２つの生物実験の平均を反映している。
図１９は、U2OSおよびHEK293T細胞におけるNBE2の核酸塩基編集効率を示している。NBE2による細胞のC->T変換パーセンテージが、HEK293T細胞およびU2OS細胞の６つの標的ゲノムローカスのそれぞれについて示されている。HEK293T細胞はlipofectamine 2000を用いてトランスフェクションし、U2OS細胞はヌクレオフェクションした。U2OSヌクレオフェクション効率は７４％であった。プラスミド送達の３日後に、ゲノムDNAを抽出し、ＨＴＳによって６つのゲノムローカスにおける核酸塩基編集について分析した。値およびエラーバーは、異なる日になされた少なくとも２つの生物実験の平均および標準偏差を反映している。
図２０は、核酸塩基編集が複数回の細胞分裂後も存続しているということを示している。BE2による細胞のC->T変換パーセンテージが、細胞を継代する前および後のHEK293T細胞の２つのゲノムローカスについて表示されている。HEK293T細胞を、Lipofectamine 2000を用いてトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後に、細胞を収穫し、半分に分けた。１つの半分をＨＴＳ分析に付し、別の半分はおよそ５回の細胞分裂だけ増殖することを許し、それから収穫し、ＨＴＳ分析に付した。
図２１は、原理的に核酸塩基編集によって修正され得るClinVarからの遺伝子バリアントを示している。ヒト遺伝子バリエーションおよびそれらの対応する表現型のNCBI ClinVarデータベース６８を、現行の核酸塩基編集テクノロジーによって修正され得る遺伝子疾患について検索した。結果は、左に挙げられている連続した制限を課すことによってフィルタリングした。ｘ軸は、その制限および上の全ての制限を満たす事例の数を対数スケールで示している。
図２２は、６つのゲノムローカスにおける編集可能なCのインビトロ同定そ示している。６つの異なるゲノム部位にマッチする配列を有する合成の８０ｍｅｒを、NBE1とインキュベーションし、それから核酸塩基編集についてＨＴＳによって分析した。各部位について、プロトスペーサーの配列は部位の名称の右に示されており、PAMは赤色で強調されている。各配列の下は、対応する塩基を有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージである。標的Cは、インビトロの変換効率が＞１０％である場合に「編集可能」と見なされた。非標的鎖は核酸塩基編集の基質ではないので、最大の収率は合計のDNAシーケンシングリードの５０％であるということに注意。この図は、上から下にそれぞれ配列番号２９３から２９８を図示している。
図２３は、EMX1オフターゲットにおけるNBE1、NBE2、およびNBE3の活性を示している。HEK293T細胞を、Lipofectamine 2000を用いて、NBE1、NBE2、またはNBE3、およびEMX1配列にマッチするsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後に、ゲノムDNAを抽出し、ＰＣＲによって増幅し、オンターゲットローカス、プラスGUTDE-seq法を用いて以前に決定されたEMX1 sgRNAの上位１０個の公知のCas9オフターゲットローカスについて、ハイスループットDNAシーケンシングによって分析した５５。EMX1オフターゲット５ローカスは増幅せず、示されていない。オンターゲットおよびオフターゲットプロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の配列が表示されている。プロトスペーサー内の元々のCの各位置にTを有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージとして定義される、細胞のC->T変換パーセンテージが、NBE1、NBE2、およびNBE3について示されている。右端には、各配列について報告されたシーケンシングリードの合計数が表示されている。この図は、上から下にそれぞれ配列番号２９３および３１０から３１８を図示している。
図２４は、FANCFオフターゲットにおけるNBE1、NBE2、およびNBE3の活性を示している。HEK293T細胞を、Lipofectamine 2000を用いて、NBE1、NBE2、またはNBE3、およびFANCF配列にマッチするsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後に、ゲノムDNAを抽出し、ＰＣＲによって増幅し、オンターゲットローカス、プラスGUTDE-seq法を用いて以前に決定されたFANCF sgRNAの公知のCas9オフターゲットローカスの全てについて、ハイスループットDNAシーケンシングによって分析した５５。オンターゲットおよびオフターゲットプロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の配列が表示されている。プロトスペーサー内の元々のCの各位置にTを有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージとして定義される、細胞のC->T変換パーセンテージが、NBE1、NBE2、およびNBE3について示されている。右端には、各配列について報告されたシーケンシングリードの合計数が表示されている。この図は、上から下にそれぞれ配列番号２９４および３１９から３２６を図示している。
図２５は、HEK293部位２オフターゲットにおけるNBE1、NBE2、およびNBE3の活性を示している。HEK293T細胞を、Lipofectamine 2000を用いて、NBE1、NBE2、またはNBE3、およびHEK293部位２配列にマッチするsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後に、ゲノムDNAを抽出し、ＰＣＲによって増幅し、オンターゲットローカス、プラスGUTDE-seq法を用いて以前に決定されたHEK293部位２のsgRNAの公知のCas9オフターゲットローカスの全てについて、ハイスループットDNAシーケンシングによって分析した５５。オンターゲットおよびオフターゲットプロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の配列が表示されている。プロトスペーサー内の元々のCの各位置にTを有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージとして定義される、細胞のC->T変換パーセンテージが、NBE1、NBE2、およびNBE3について示されている。右端には、各配列について報告されたシーケンシングリードの合計数が表示されている。この図は、上から下にそれぞれ配列番号２９５、３２７、および３２８を図示している。
図２６は、HEK293部位３オフターゲットにおけるNBE1、NBE2、およびBE3の活性を示している。HEK293T細胞を、Lipofectamine 2000を用いて、NBE1、NBE2、またはNBE3、およびHEK293部位３配列にマッチするsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後に、ゲノムDNAを抽出し、ＰＣＲによって増幅し、オンターゲットローカス、プラスGUTDE-seq法を用いて以前に決定されたHEK293部位３のsgRNAの公知のCas9オフターゲットローカスの全てについて、ハイスループットDNAシーケンシングによって分析した５５。オンターゲットおよびオフターゲットプロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の配列が表示されている。プロトスペーサー内の元々のCの各位置にTを有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージとして定義される、細胞のC->T変換パーセンテージが、NBE1、NBE2、およびNBE3について示されている。右端には、各配列について報告されたシーケンシングリードの合計数が表示されている。この図は、上から下にそれぞれ配列番号２９６および６５９から６６３を図示している。
図２７は、HEK293部位４オフターゲットにおけるNBE1、NBE2、およびNBE3の活性を示している。HEK293T細胞を、Lipofectamine 2000を用いて、NBE1、NBE2、またはNBE3、およびHEK293部位４配列にマッチするsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後に、ゲノムDNAを抽出し、ＰＣＲによって増幅し、オンターゲットローカス、プラスGUTDE-seq法を用いて以前に決定されたHEK293部位４のsgRNAの上位１０個の公知のCas9オフターゲットローカスについて、ハイスループットDNAシーケンシングによって分析した５５。オンターゲットおよびオフターゲットプロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の配列が表示されている。プロトスペーサー内の元々のCの各位置にTを有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージとして定義される、細胞のC->T変換パーセンテージが、NBE1、NBE2、およびNBE3について示されている。右端には、各配列について報告されたシーケンシングリードの合計数が表示されている。この図は、上から下にそれぞれ配列番号２９７および６６４から６７３を図示している。
図２８は非標的Cの変異率を示している。ここでは、試験された６つのオンターゲットおよび３４個のオフターゲットローカスの周辺の２，５００個の別々のシトシンにおけるC->T変異率が示されており、およそ１．８×１０６細胞に由来する合計で１４，７００，０００個の配列リードに相当する。
図２９Ａから２９Ｃは、ヒト細胞における塩基編集を示している。図２９Ａは、哺乳類細胞における可能な塩基編集アウトカムを示している。最初の編集はU:Gミスマッチをもたらした。ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）によるUの認識および切り出しは、塩基除去修復（ＢＥＲ）を開始させ、これはC:G初期状態への復帰変異に至る。ＢＥＲはBE2およびBE3によって妨害され、これはUDGを阻害した。U:Gミスマッチはミスマッチ修復（ＭＭＲ）によってもまたプロセシングされ、これはミスマッチのニックが入った鎖を選好的に修復した。BE3は、Gを含有する編集されない鎖にニックを入れ、U:Gミスマッチから所望のU:AまたはT:Aアウトカムへの解消を選好した。図２９Ｂは、下の例において材料と方法に記載されているように処置されたHEK293T細胞を示している。示されている標的位置にTを有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージは、BE1、BE2、またはBE3による処置、またはドナーＨＤＲ鋳型ありのwt Cas9による処置を示している。図２９Ｃは、図２９Ｂの処置後のindel形成の頻度を示している。値は図３４に挙げられている。図２９Ｂおよび２９Ｃでは、値およびエラーバーは、異なる日に行われた３つの独立した生物学的レプリケートの平均およびｓ．ｄ．を反映している。
図３０Ａから３０Ｂは、哺乳類細胞において、２つの疾患に関係する変異のBE3によって媒介される修正を示している。青色のPAMおよび赤色の標的塩基を有するプロトスペーサーの配列が、プロトスペーサー内のその位置を示す下付きの番号によって変異の右に示されている。各配列の下は、対応する塩基を有する合計のシーケンシングリードのパーセンテージである。細胞は、材料と方法に記載されているように処置した。図３０Ａは、アルツハイマー病関連APOE4アレルが、マウスアストロサイトにおいてBE3によって合計のリードの７４．９％においてAPOE3rに変換したということを示している。２つの近傍のCもまたTに変換されたが、もたらされる蛋白質の予測配列に変化はなかった。wt Cas9およびドナーssDNAによるこれらの細胞の同一の処置は０．３％のみの修正をもたらし、２６．１％のindel形成である。図３０Ｂは、０．７％のindel形成であり、ヌクレオフェクションされたヒト乳癌細胞の７．６％においてBE3によって修正された癌関連p53 Y163C変異を示している。wt Cas9およびドナーssDNAによるこれらの細胞の同一の処置は、変異修正をもたらさず、６．１％のindel形成である。この図は、上から下にそれぞれ配列番号６７５から６８０を図示している。
図３１は、HEK293部位２オフターゲットにおけるBE1、BE2、およびBE3の活性を示している。HEK293T細胞を、Lipofectamine 2000を用いて、BE1、BE2、またはBE3、およびHEK293部位２配列にマッチするsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後に、ゲノムDNAを抽出し、ＰＣＲによって増幅し、オンターゲットローカス、プラスGUTDE-seq法を用いてJoungらによって（６３）、クロマチン免疫沈降ハイスループットシーケンシング（ChIP-seq）実験を用いてAdliらによって（１８）以前に決定されたHEK293部位２のsgRNAの公知のCas9およびdCas9オフターゲットローカスの全てについて、ハイスループットDNAシーケンシングによって分析した。オンターゲットおよびオフターゲットプロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の配列が表示されている。プロトスペーサー内の元々のCの各位置にTを有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージとして定義される、細胞のC->T変換パーセンテージが、BE1、BE2、およびBE3について示されている。右端には、報告されたシーケンシングリードの合計数および報告されたChIP-seqシグナル強度が各配列について表示されている。この図は、上から下にそれぞれ配列番号６８１から６８８を図示している。
図３２は、HEK293部位３オフターゲットにおけるBE1、BE2、およびBE3の活性を示している。HEK293T細胞を、Lipofectamine 2000を用いて、BE1、BE2、またはBE3、およびHEK293部位３配列にマッチするsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後に、ゲノムDNAを抽出し、ＰＣＲによって増幅し、オンターゲットローカス、プラスJoungらによってGUIDE-seq法５４を用い、クロマチン免疫沈降ハイスループットシーケンシング（ChIP-seq）実験６１を用いて以前に決定されたHEK293部位３のsgRNAの公知のCas9オフターゲットローカスの全ておよび上位５つの公知のdCas9オフターゲットローカスについて、ハイスループットDNAシーケンシングによって分析した。オンターゲットおよびオフターゲットプロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の配列が表示されている。プロトスペーサー内の元々のCの各位置にTを有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージとして定義される、細胞のC->T変換パーセンテージが、BE1、BE2、およびBE3について示されている。右端には、報告されたシーケンシングリードの合計数および報告されたChIP-seqシグナル強度が各配列について表示されている。この図は、上から下にそれぞれ配列番号６８９から６９９を図示している。
図３３は、HEK293部位４オフターゲットにおけるBE1、BE2、およびBE3の活性を示している。HEK293T細胞を、Lipofectamine 2000を用いて、BE1、BE2、またはBE3、およびHEK293部位４配列にマッチするsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後に、ゲノムDNAを抽出し、ＰＣＲによって増幅し、オンターゲットローカス、プラスGUIDE-seq法５４を用い、クロマチン免疫沈降ハイスループットシーケンシング（ChIP-seq）実験６１を用いて以前に決定されたHEK293部位４のsgRNAの上位１０個の公知のCas9オフターゲットローカスおよび上位５つの公知のdCas9オフターゲットローカスについて、ハイスループットDNAシーケンシングによって分析した。オンターゲットおよびオフターゲットプロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の配列が表示されている。プロトスペーサー内の元々のCの各位置にTを有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージとして定義される、細胞のC->T変換パーセンテージが、BE1、BE2、およびBE3について示されている。右端には、報告されたシーケンシングリードの合計数および報告されたChIP-seqシグナル強度が各配列について表示されている。この図は上から下にそれぞれ配列番号７００から７１２を図示している。
図３４は、マウスアストロサイトにおけるアルツハイマー病関連APOE4アレルからAPOE3rへのBE3によって媒介される修正後の、非プロトスペーサー塩基の変異率を示している。図３０Ａおよび図３４Ｂからのプロトスペーサーのどちらかの側の５０塩基のDNA配列が、プロトスペーサーに対する相対的な各塩基の位置によって示されている。PAMから遠位のプロトスペーサーの側は正の番号によって指定されており、一方で、PAMを包含する側は負の番号によって指定されており、PAMは青色で示されている。各配列の下は、無処置の細胞、BE3とAPOE4 C158R変異をターゲティングするsgRNAとによって処置された細胞、またはBE3とVEGFAローカスをターゲティングするsgRNAとによって処置された細胞について、対応する塩基を有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージである。いずれのBE3処置サンプルも、無処置のコントロールのものよりも上の変異率をもたらさなかった。この図は、上から下にそれぞれ配列番号７１３から７１６を図示している。
図３５は、HCC1954ヒト細胞における癌関連p53 Y163C変異のBE3によって媒介される修正後の、非プロトスペーサー塩基の変異率を示している。図３０Ｂおよび図３９Ｂからのプロトスペーサーのどちらかの側の５０塩基のDNA配列が、プロトスペーサーに対する相対的な各塩基の位置によって示されている。PAMから遠位のプロトスペーサーの側は正の番号によって指定されており、一方でPAMを包含する側は負の番号によって指定されており、PAMは青色で示されている。各配列の下は、無処置の細胞、BE3とTP53 Y163C変異をターゲティングするsgRNAとによって処置された細胞、またはBE3とVEGFAローカスをターゲティングするsgRNAとによって処置された細胞について、対応する塩基を有する合計のシーケンシングリードのパーセンテージである。BE3処置されたどのサンプルも、無処置のコントロールのものよりも上の変異率をもたらさなかった。この図は、上から下にそれぞれ配列番号７１７から７２０を図示している。
図３６Ａから３６Ｆは、塩基編集に対するデアミナーゼ、リンカー長、およびリンカー組成の効果を示している。図３６Ａはゲルに基づくデアミナーゼアッセイを示しており、ssDNAに対するrAPOBEC1、pmCDA1、hAID、hAPOBEC3G、rAPOBEC1-GGS-dCas9、rAPOBEC1-(GGS)3（配列番号５９６）-dCas9、およびdCas9-(GGS)3（配列番号５９６）-rAPOBEC1の活性を示している。酵素は、哺乳類細胞ライセート由来のインビトロ転写翻訳システムによって発現し、１．８μＭの色素がコンジュゲーションされたssDNAおよびUSER酵素（ウラシルDNAグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼＶＩＩＩ）と３７℃において２時間インキュベーションした。もたらされたDNAを変性ポリアクリルアミドゲルによって分離し、イメージングした。正のコントロールは、Uが標的Cと同じ位置に合成的に組み込まれた配列である。図３６Ｂは、図３６Ｃから３６Ｆに用いた発現および精製された蛋白質のクマシー染色された変性ＰＡＧＥゲルを示している。図３６Ｃから３６Ｆはゲルに基づくデアミナーゼアッセイを示しており、GGS（図３６Ｃ）、(GGS)3（配列番号５９６）（図３６Ｄ）、XTEN（図３６Ｅ）、または(GGS)7（配列番号５９７）のデアミナーゼ-Cas9リンカーを有する塩基編集因子の脱アミノ化ウインドウを示している（図３６Ｆ）。２時間の３７℃における１２５ｎＭのdsDNA基質とのsgRNAと複合体化した１．８５μＭのデアミナーゼ-dCas9融合体のインキュベーション後に、色素がコンジュゲーションされたDNAを単離し、USER酵素と３７℃において１時間インキュベーションして、いずれかのウラシルの部位においてDNAバックボーンを切断した。もたらされたDNAを変性ポリアクリルアミドゲルによって分離し、色素がコンジュゲーションされた鎖をイメージングした。各レーンは、プロトスペーサー内の標的Cの位置に従って、または標的Cが存在しない場合には「-」によって付番した。8Uは、Uが位置８に合成的に組み込まれた正のコントロール配列である。
図３７Ａから３７Ｃは、BE1塩基編集効率が哺乳類細胞において劇的に減少するということを示している。図３７Ａ：塩基編集因子によってターゲティングされる６つの哺乳類細胞ゲノムローカスのプロトスペーサー（黒色および赤色）およびPAM（青色）配列。標的Cは、プロトスペーサー内のそれらの位置に対応する下付きの番号によって赤色で示されている。図３７Ｂは、６つの異なるゲノム部位にマッチする配列を有する合成の８０ｍｅｒをBE1とインキュベーションし、それからＨＴＳによって塩基編集について分析したということを示している。各部位について、プロトスペーサーの配列が部位の名称の右に示されており、PAMは青色で強調されている。各配列の下は、対応する塩基を有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージである。我々は、インビトロの変換効率が＞１０％である場合に標的Cを「編集可能」と見なした。非標的鎖はBE1によって影響されないので、最大の収率は合計のDNAシーケンシングリードの５０％であるということに注意。値は単一の実験から示されている。図３７Ｃは、HEK293T細胞が、BE1および適切なsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションされたということを示している。トランスフェクションの３日後に、ゲノムDNAを抽出し、ハイスループットDNAシーケンシングによって６つのローカスについて分析した。示されている標的位置にTを有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージとして定義される、細胞のC->T変換パーセンテージが、BE1について全ての６つのゲノムローカスにおいて示されている。HEK293T細胞からの全てのデータの値およびエラーバーは、異なる日に行われた３つの独立した生物学的レプリケートの平均および標準偏差を反映している。図３７Ａは、上から下にそれぞれ配列番号７２１から７２６を図示している。図３７Ｂは、上から下にそれぞれ配列番号７２７から７３２を図示している。
図３８は、塩基編集が複数回の細胞分裂後も存続しているということを示している。BE2およびBE3による細胞のC->T変換パーセンテージが、細胞を継代する前および後のHEK293T細胞のHEK293部位３および４について示されている。HEK293T細胞を、BE2またはBE3、およびHEK293部位３または４をターゲティングするsgRNAを発現するプラスミドによってヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクションの３日後に、細胞を収穫し、半分に分けた。１つの半分をＨＴＳ分析に付し、別の半分はおよそ５回の細胞分裂だけ増殖することを許し、それから収穫し、ＨＴＳ分析に付した。値およびエラーバーは、少なくとも２つの生物実験の平均および標準偏差を反映している。
図３９Ａから３９Ｃは非標的C/G変異率を示している。ここでは、試験された６つのオンターゲットおよび３４個のオフターゲットローカスの周辺の２，５００個の別々のシトシンおよびグアニンにおけるC->TおよびG->A変異率が示されており、およそ１．８×１０６細胞に由来する合計で１４，７００，０００個の配列リードに相当する。図３９Ａおよび３９Ｂは、BE1、BE2、およびBE3による細胞の非標的C->TおよびG->A変換パーセンテージが、全ての２，５００個のシトシン／グアニンについて、プロトスペーサーに対する相対的なそれらの位置に対して個々にプロットされているということを示している。PAMから遠位のプロトスペーサーの側は正の番号によって指定されており、一方で、PAMを包含する側は負の番号によって指定されている。図３９Ｃは、BE1、BE2、およびBE3による細胞の平均の非標的C->TおよびG->A変換パーセンテージと、最も高い個々の変換パーセンテージおよびもっとも低い個々の変換パーセンテージとが示されているということを示している。
図４０Ａから４０Ｂは、哺乳類細胞における２つの疾患に関係する変異のBE3によって媒介される修正の追加のデータセットを示している。各部位について、プロトスペーサーの配列が変異の名称の右に示されており、PAMは青色で強調されており、変異の要因である塩基は、プロトスペーサー内のその位置に対応する下付きの番号によって赤色太字で示されている。各疾患関連アレルの上のアミノ酸配列は、緑色の塩基編集後の修正されたアミノ酸配列と一緒に示されている。各配列の下は、対応する塩基を有する合計のシーケンシングリードのパーセンテージである。細胞は、BE3および適切なsgRNAをコードするプラスミドによってヌクレオフェクションした。ヌクレオフェクションの２日後に、ゲノムDNAをヌクレオフェクションされた細胞から抽出し、ＨＴＳによって分析して病因性変異の修正を評価した。図４０Ａは、アルツハイマー病関連APOE4アレルが、正しいsgRNAによって処置されたときにのみ、マウスアストロサイトにおいて合計のリードの５８．３％についてBE3によってAPOE3rに変換されるということを示している。２つの近傍のCもまたTに変換されるが、もたらされる蛋白質の予測配列に変化はない。wt Cas9およびドナーssDNAによるこれらの細胞の同一の処置は０．２％の修正をもたらし、２６．７％のindel形成である。図４０Ｂは、癌関連p53 Y163C変異が、正しいsgRNAによって処置されたときにのみ、ヌクレオフェクションされたヒト乳癌細胞の３．３％においてBE3によって修正されるということを示している。wt Cas9およびドナーssDNAによるこれらの細胞の同一の処置は、検出可能な変異修正をもたらさず、８．０％のindel形成であった。図４０Ａから４０Ｂは、上から下にそれぞれ配列番号７３３から７４０を図示している。
図４１は、例示的なUSER（ウラシル特異的切り出し試薬）酵素に基づくアッセイの概略図を示しており、これは、一本鎖DNA（ssDNA）基質に対する種々のデアミナーゼの活性を試験するために用いられ得る。
図４２は、pmCDA-nCas9-UGI-NLSコンストラクトの概略、ならびに塩基編集因子（rAPOBEC1）および負のコントロール（無処置）に対して相対的なHeK-3部位におけるその活性である。
図４３は、pmCDA1-XTEN-nCas9-UGI-NLSコンストラクトの概略、ならびに塩基編集因子（rAPOBEC1）および負のコントロール（無処置）に対して相対的なHeK-3部位におけるその活性である。
図４４は、シチジンデアミナーゼ（CDA）またはAPOBECを用いて標的CがTに変換された合計のシーケンシングリードのパーセントを示している。
図４５は、デアミナーゼ（CDA）またはAPOBECを用いて標的CがAに変換された合計のシーケンシングリードのパーセントを示している。
図４６は、デアミナーゼ（CDA）またはAPOBECを用いて標的CがGに変換された合計のシーケンシングリードのパーセントを示している。
図４７は、huAPOBEC3G-XTEN-nCas9-UGI-NLSコンストラクトの概略、ならびに変異した形態（huAPOBEC3G*(D316R_D317R)-XTEN-nCas9-UGI-NLS、塩基編集因子（rAPOBEC1）、および負のコントロール（無処置）に対して相対的なHeK-2部位におけるその活性である。
図４８は、例７の選択アッセイに用いたLacZコンストラクトの概略を示している。
図４９は、異なるプラスミドおよびコンストラクトからの復帰変異データを示している。
図５０は、lacZ復帰変異の検証および復帰変異クローンの精製を示している。
図５１は、例７に用いた脱アミノ化選択プラスミドを図示する概略である。
図５２は、クロラムフェニコール復帰変異アッセイの結果を示している（pmCDA1融合体）。
図５３Ａから５３Ｂは、２つのコンストラクトのDNA修正誘導を実証している。
図５４は、クロラムフェニコール復帰変異アッセイの結果を示している（huAPOBEC3G融合体）。
図５５は、EMX1オフターゲットにおけるBE3およびHF-BE3の活性を示している。配列は、上から下に、配列番号２８６～２９２、２９９～３０１に対応する。
図５６は、BE3およびHF-BE3のオンターゲット塩基編集効率を示している。
図５７は、変異が様々な程度にシチジン脱アミノ化に影響するということを実証するグラフである。それぞれ触媒反応を軽度に障害する変異の組み合わせは、他のものと比べて１つの位置における選択的な脱アミノ化を許す。FANCF部位はGGAATC6C7C8TTC11TGCAGCACCTGGであった（配列番号３０３）。
図５８は、次世代塩基編集因子を図示する概略である。
図５９は、Cas9バリアントから作られた新たな塩基編集因子を例解する概略である。
図６０は、異なるNGA PAM部位の塩基編集されたパーセンテージを示している。
図６１は、NGCG PAM EMX（VRER BE3）およびC1TC3C4C5ATC8AC10ATCAACCGGT（配列番号３０４）スペーサーを用いて、シチジンの塩基編集されたパーセンテージを示している。
図６２は、異なるNNGRRT PAM部位からもたらされた塩基（based）編集されたパーセンテージを示している。
図６３は、異なるNNHRRT PAM部位からもたらされた塩基（based）編集されたパーセンテージを示している。
図６４Ａから６４Ｃは、異なるTTTN PAM部位からCpf1 BE2を用いてもたらされた塩基編集されたパーセンテージを示している。用いたスペーサーは：TTTCCTC3C4C5C6C7C8C9AC11AGGTAGAACAT（図６４Ａ、配列番号３０５）、TTTCC1C2TC4TGTC8C9AC11ACCCTCATCCTG（図６４Ｂ、配列番号３０６）、およびTTTCC1C2C3AGTC7C8TC10C11AC13AC15C16C17TGAAAC（図６４Ｃ、配列番号３０７）であった。
図６５は、シチジンデアミナーゼ点変異導入の速度論的調節によって達成された選択的な脱アミノ化を図示する概略である。
図６６は、細胞培養物においてスペーサー内の複数のシチジンによって探査された、脱アミノ化ウインドウに対する種々の変異の効果を示すグラフである。用いたスペーサーは：TGC3C4C5C6TC8C9C10TC12C13C14TGGCCC（配列番号３０８）であった。
図６７は、細胞培養物においてスペーサー内の複数のシチジンによって探査された、脱アミノ化ウインドウに対する種々の変異の効果を示すグラフである。用いたスペーサーは：AGAGC5C6C7C8C9C10C11TC13AAAGAGAであった（配列番号３０９）。
図６８は、シチジンの限定された数を有するFANCF部位に対する種々の変異の効果を示すグラフである。用いたスペーサーは：GGAATC6C7C8TTC11TGCAGCACCTGG（配列番号３０３）であった。三重変異体（W90Y、R126E、R132E）が第６の位置のシチジンを選好的に編集するということに注意。
図６９は、シチジンの限定された数を有するHEK3部位に対する種々の変異の効果を示すグラフである。用いたスペーサーは：GGCC4C5AGACTGAGCACGTGATGG（配列番号３１０）であった。二重および三重変異体が第４の位置のシチジンよりも第５の位置のシチジンを選好的に編集するということに注意。
図７０は、シチジンの限定された数を有するEMX1部位に対する種々の変異の効果を示すグラフである。用いたスペーサーは：GAGTC5C6GAGCAGAAGAAGAAGGG（配列番号３１１）であった。三重変異体が第６ではなく第５の位置のシチジンのみを編集するということに注意。
図７１は、シチジンの限定された数を有するHEK2部位に対する種々の変異の効果を示すグラフである。用いたスペーサーは：GAAC4AC6AAAGCATAGACTGCGGG（配列番号３１２）であった。
図７２は、不死化アストロサイトにおけるBE3、および変異W90Y R132Eを含むBE3のオンターゲット塩基編集効率を示している。
図７３は、３つのCpf1融合体コンストラクトの概略を図示している。
図７４は、BE3およびHF-BE3（EMX1、FANCF、およびRNF2）のプラスミド送達の比較を示している。
図７５は、BE3およびHF-BE3（HEK3およびHEK4）のプラスミド送達の比較を示している。
図７６は、全ての１０個の部位におけるEMX-1のオフターゲット編集を示している。
図７７は、GAGTCCGAGCAGAAGAAGAAG（配列番号３１３）スペーサーを用いたHEK細胞へのデアミナーゼ蛋白質リポフェクションを示している。EMX-1オンターゲットおよびEMX-1オフターゲット部位２を調べた。
図７８は、GGAATCCCTTCTGCAGCACCTGG（配列番号３１４）スペーサーを用いたHEK細胞へのデアミナーゼ蛋白質リポフェクションを示している。FANCFオンターゲットおよびFANCFオフターゲット部位１を調べた。
図７９は、GGCCCAGACTGAGCACGTGA（配列番号３１５）スペーサーを用いたHEK細胞へのデアミナーゼ蛋白質リポフェクションを示している。HEK-3オンターゲット部位を調べた。
図８０は、GGCACTGCGGCTGGAGGTGGGGG（配列番号３１６）スペーサーを用いたHEK細胞へのデアミナーゼ蛋白質リポフェクションを示している。HEK-4オンターゲット、オフターゲット部位１、部位３、および部位４。
図８１は、sgHR_13（GTCAGGTCGAGGGTTCTGTC（配列番号３１７）スペーサー；C8標的：G51->ストップ）、sgHR_14（GGGCCGCAGTATCCTCACTC（配列番号３１８）スペーサー；C7標的；C7標的：Q68->ストップ）、およびsgHR_15（CCGCCAGTCCCAGTACGGGA（配列番号３１９）スペーサー；C10およびC11は標的である：W239またはW237->ストップ）について、sgRNA活性のインビトロアッセイの結果を示している。
図８２は、sgHR_17（CAACCACTGCTCAAAGATGC（配列番号３２０）スペーサー；C4およびC5は標的である：W410->ストップ）およびsgHR_16（CTTCCAGGATGAGAACACAG（配列番号３２１）スペーサー；C4およびC5は標的である：W273->ストップ）について、インビトロアッセイの結果を示している。
図８３は、ゼブラフィッシュ胚におけるsgHR_13と複合体化したBE3蛋白質の直接的なインジェクションを示している。
図８４は、ゼブラフィッシュ胚におけるsgHR_16と複合体化したBE3蛋白質の直接的なインジェクションを示している。
図８５は、ゼブラフィッシュ胚におけるsgHR_17と複合体化したBE3蛋白質の直接的なインジェクションを示している。
図８６は、シトシン->チミン変化を作ることができる塩基編集因子を用いて作られ得る例示的な核酸変化を示している。
図８７はアポリポ蛋白質E（APOE）アイソフォームの図解を示しており、塩基編集因子（例えばBE3）を用いて、１つのAPOEアイソフォーム（例えばAPOE4）を、アルツハイマー病の減少したリスクに関連する別のAPOEアイソフォーム（例えばAPOE3r）に編集し得るということを実証している。
図８８は、マウスアストロサイトにおけるAPOE4からAPOE3rへの塩基編集を示している。
図８９は、アルギニン残基３７における蛋白質の尚早な短縮を引き起こすためのPRNPの塩基編集を示している。
図９０は、UDG（これをUGIは阻害する）をノックアウトすることがC->T塩基編集の効率のクリーンさを劇的に改善するということを示している。
図９１は、ニッカーゼを有するがUGIを有さない塩基編集因子の使用が、アウトカムの混合物に至り、非常に高いindel率であるということを示している。
図９２Ａから９２Ｇは、SaBE3、SaKKH-BE3、VQR-BE3、EQR-BE3、およびVRER-BE3が、ヒト細胞において非NGG PAMを含有する標的部位における効率的な塩基編集を媒介するということを示している。図９２Ａは、S. pyogenesおよびS. aureus Cas9を用いる塩基編集因子の構造を示している。図９２Ｂは、代替のまたは緩んだPAM要件を有する最近キャラクタリゼーションされたCas9バリアントを示している。図９２Ｃおよび９２Ｄは、例１２に記載されているように示されている塩基編集因子バリアントによって処置されたHEK293T細胞を示している。示されている標的位置においてCがTに変換された合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージ（トランスフェクションされた細胞の濃縮なし）が示されている。試験された各標的のPAＭ配列がＸ軸の下に示されている。チャートは、NNGRRT PAMを有するゲノムローカスにおけるSaBE3およびSaKKH-BE3（図９２Ｃ）、NNNRRT PAMを有するゲノムローカスにおけるSaBE3およびSaKKH-BE3（図９２Ｄ）、NGAG PAM（図９２Ｅ）およびNGAH PAM（図９２Ｆ）を有するゲノムローカスにおけるVQR-BE3およびEQR-BE3、ならびにNGCG PAMを有するゲノムローカスにおけるVRER-BE3（図９２Ｇ）の結果を示している。値およびエラーバーは、少なくとも２つの生物学的レプリケートの平均および標準偏差を反映している。
図９３Ａから９３Ｃは、シチジンデアミナーゼドメインに変異を有する塩基編集因子が、狭まった編集ウインドウを見せるということを実証している。図９３Ａから９３Ｃは、変異体塩基編集因子および適切なsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションされたHEK293T細胞を示している。トランスフェクションの３日後に、ゲノムDNAを抽出し、示されているローカスについてハイスループットDNAシーケンシングによって分析した。示されている標的位置においてCがTに変化した合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージ（トランスフェクションされた細胞の濃縮なし）が、EMX1部位、HEK293部位３、FANCF部位、HEK293部位２、部位Ａ、および部位Ｂローカスについて示されている。図９３Ａは、塩基編集ウインドウを狭めるある種のシチジンデアミナーゼ変異を例解している。追加の変異のキャラクタリゼーションについては図９８参照。図９３Ｂは、ゲノムローカスにおける編集ウインドウ幅に影響を及ぼすシチジンデアミナーゼ変異の効果を示している。有益な変異を組み合わせることは、編集ウインドウを狭めることに相加的効果を有する。図９３Ｃは、YE1-BE3、YE2-BE3、EE-BE3、およびYEE-BE3が塩基編集の産物分布に影響を及ぼし、BE3とは対象的に、圧倒的に一重改変された産物を生ずるということを示している。値およびエラーバーは、少なくとも２つの生物学的レプリケートの平均および標準偏差を反映している。
図９４Ａおよび９４Ｂは、原理的に本研究において開発された塩基編集因子によって修正され得るClinVarからの遺伝子バリアントを示している。ヒト遺伝子バリエーションおよびそれらの対応する表現型のNCBI ClinVarデータベースを、理論上は塩基編集によって修正され得る遺伝子疾患について検索した。図９４Ａは、ClinVarデータベース中の全ての病因性のT->C変異について、変改されたPAM特異性を有する塩基編集因子の使用による塩基編集のターゲティング範囲の改善を実証している。白い画分は、BE3、またはBE3および本研究において開発された５つの改変されたPAM塩基編集因子どちらかのPAM要件に基づいてアクセス可能な、病因性のT->C変異の割合を示している。図９４Ｂは、ClinVarデータベース中の全ての病因性のT->C変異について、狭まった活性ウインドウを有する塩基編集因子の使用による塩基編集のターゲティング範囲の改善を示している。BE3は、図９３Ａから９３Ｃに示されているように同等の効率で位置４～８のCを編集すると思われた。YEE-BE3は、その活性ウインドウ内においてC5＞C6＞C7＞他のものの選好性によって編集すると思われた。白い画分は、他のCの同等の編集なしにBE3によって編集され得る（左）、または他のCの同等の編集なしにBE3もしくはYEE-BE3によって編集され得る（右）病因性のT->C変異の割合を示している。
図９５Ａから９５Ｃは、塩基編集ウインドウ幅に対する短縮されたガイドRNAの効果を示している。HEK293T細胞を、BE3および異なる５’短縮長のsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションした。処置された細胞は、例に記載されているように分析した。図９５Ａは、プロトスペーサーおよびPAM配列（上、配列番号４２７０）、ならびに示されている標的位置にTを有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージとして定義される細胞のC->T変換パーセンテージを、EMX1ゲノムローカス内の部位について示している。この部位において、塩基編集ウインドウを、１７ｎｔの短縮されたgRNAの使用によって変改した。図９５Ｂは、プロトスペーサーおよびPAM配列（上、配列番号４２７０）、ならびに示されている標的位置にTを有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージとして定義される細胞のC->T変換パーセンテージを、HEK部位３および部位４ゲノムローカス内の部位について示している。これらの部位においては、塩基編集ウインドウの変化は観察されなかったが、sgRNAが短縮されるにつれて全ての基質塩基の編集効率の線形の減少が見られた。
図９６は、塩基編集ウインドウ幅に対するAPOBEC1-Cas9リンカー長の効果を示している。HEK293T細胞を、XTEN、GGS、(GGS)3（配列番号５９６）、(GGS)5（配列番号４２７１）、または(GGS)7（配列番号５９７）のrAPOBEC1-Cas9リンカーを有する塩基編集因子、およびsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションした。処置された細胞は、例に記載されているように分析した。示されている標的位置にTを有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージとして定義される、細胞のC->T変換パーセンテージが、異なるリンカーを有する種々の塩基編集因子について示されている。
図９７Ａから９７Ｃは、塩基編集ウインドウ幅に対するrAPOBEC変異の効果を示している。図９７Ｃは、部位Ａまたは部位ＢどちらかをターゲティングするsgRNA、および示されているBE3点変異体を発現するプラスミドによってトランスフェクションされたHEK293T細胞を示している。処置された細胞は、例に記載されているように分析した。プロトスペーサー内およびプロトスペーサーから３塩基対以内の全てのCが表示されており、細胞のC->T変換パーセンテージが示されている。編集効率が半数値を上回るヌクレオチドの計算された数として定義される「編集ウインドウ幅」が、全ての試験された変異体について表示されている。
図９８は、哺乳類細胞における塩基編集の産物分布に対するAPOBEC1変異の効果を示している。HEK293T細胞を、BE3またはその変異体、および適切なsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションした。処置された細胞は、例に記載されているように分析した。示されている標的位置にTを有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージとして定義される、細胞のC->T変換パーセンテージが示されている（左）。C->T変換を含有する合計のシーケンシングリードのパーセントが右に示されている。BE3点変異体は、１つの標的シチジンのみを有する部位のHEK部位４における塩基編集効率には有意に影響しない。
図９９は、BE3およびHF-BE3について、オンターゲット編集のプラスミド（plasma）送達の比較を示している。
図１００は、BE3の蛋白質およびプラスミド（plasma）送達について、オンターゲット編集の比較を示している。
図１０１は、HF-BE3の蛋白質プラスミド（plasma）送達（devliery）について、オンターゲット編集の比較を示している。
図１０２は、リポフェクションとHF変異を実装することと両方が、オフターゲット脱アミノ化イベントを減少させるということを示している。ひし形は、オフターゲットが検出されず、特異性比を１００に設定したということを示している。
図１０３は、Cがプロトスペーサー内の偶数位置に置かれた合成基質（NNNNTC2TC4TC6TC8TC10TC12TC14TC16TC18TC20NGG、配列番号４２７２）に対するインビトロC->T編集を示している。
図１０４は、Cがプロトスペーサー内の奇数位置に置かれた合成基質（NNNNTC2TC4TC6TC8TC10TC12TC14TC16TC18TC20NGG、配列番号４２７２）に対するインビトロC->T編集を示している。
図１０５は、プラスミドｖｓ．蛋白質送達による塩基編集の特異性比を図示する２つのグラフを包含する。
図１０６Ａから１０６Ｂは非NGG PAM部位に対するBE3活性を示している。HEK293T細胞を、BE3および適切なsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションした。処置された細胞は、例に記載されているように分析した。図１０６Ａは、SaBE3またはSaKKH-BE3によって効率的にターゲティングされ得る部位について、BE3活性を示している。BE3はNAG PAMに対して低いが有意な活性を示す。図１０６Ｂは、BE3が、VQR-BE3またはVRER-BE3とは対照的に、NGAまたはNGCG PAMを有する部位における有意に縮減した編集を有するということを示している。
図１０７Ａから１０７Ｂは、VQR-BE3およびSaKKH-BE3に対するAPOBEC1変異の効果を示している。HEK293T細胞を、VQR-BE3、SaKKH-BE3、またはその変異体、および適切なsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションした。処置された細胞は方法に記載されているように分析した。示されている標的位置にTを有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージとして定義される、細胞のC->T変換パーセンテージが示されている。図１０７Ａは、ウインドウを調節する変異がVQR-BE3に適用されて、NGA PAMによって標的化可能な部位における選択的な塩基編集を可能にし得るということを示している。図１０７Ｂは、SaKKH-BE3に適用されたときに、変異が、標的ウインドウ内の塩基選択性を付与することなしに、塩基編集効率の総体的減少を引き起こすということを示している。
図１０８はヌクレオチド編集の概略図を示している。次の略語を用いている：（MMR）－ミスマッチ修復、（BE3ニッカーゼ）－Cas9ニッカーゼドメインを含む塩基編集因子３を言う、（UGI）－ウラシルグリコシラーゼ阻害剤、（UDG）－ウラシルDNAグリコシラーゼ、（APOBEC）－APOBECシチジンデアミナーゼを言う。定義
本明細書および請求項において用いられる単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈が明瞭に別様に示さない限り、単数および複数の参照を包含する。それゆえに、例えば、「物質」の参照は単一の物質および複数のかかる物質を包含する。
用語「Cas9」または「Cas9ヌクレアーゼ」は、Cas9蛋白質またはその断片（例えば、Cas9の活性型、不活性型、もしくは部分的活性型のDNA切断ドメインおよび／またはCas9のgRNA結合ドメインを含む蛋白質）を含むRNA誘導型ヌクレアーゼを言う。Cas9ヌクレアーゼは、場合によってはcasn1ヌクレアーゼまたはCRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat）関連ヌクレアーゼともまた言われる。CRISPRは適応免疫システムであり、これは可動性遺伝子エレメント（ウイルス、転移エレメント、および接合型プラスミド）に対する防御を提供する。CRISPRクラスターは、祖先由来の可動性エレメントおよび標的侵入核酸に対して相補的な配列、スペーサーを含有する。CRISPRクラスターは転写およびプロセシングされ、CRISPR RNA（crRNA）になる。ＩＩ型CRISPRシステムにおいては、pre-crRNAの正しいプロセシングは、trans-encoded small RNA（tracrRNA）、内在性リボヌクレアーゼ３（rnc）、およびCas9蛋白質を要求する。tracrRNAは、pre-crRNAのリボヌクレアーゼ３によって支援されるプロセシングのガイドとしての用をなす。爾後に、Cas9/crRNA/tracrRNAはスペーサーに対して相補的な直鎖状または環状dsDNA標的をエンド的に切断する。crRNAに対して相補的でない標的鎖は、第１にエンド的に切られ、それから３’－５’エキソ的にトリミングされる。天然において、DNA結合および切断は典型的には蛋白質および両方のRNAを要求する。しかしながら、シングルガイドRNA（「sgRNA」または単純に「gNRA」）が、crRNAおよびtracrRNA両方の側面を単一のRNA種に組み込むように操作され得る。例えば、Jinek M., Chylinski K., Fonfara I, Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)参照。その内容全体は参照によってここで組み込まれる。Cas9はCRISPRリピート配列中の短いモチーフ（PAMまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識して、自己を非自己から見分けることを助ける。Cas9ヌクレアーゼ配列および構造は当業者に周知である（例えば、"Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)；"CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z. A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)；および"A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I, Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)参照。そのそれぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。Cas9オーソログは種々の種について記載されており、S. pyogenesおよびS. thermophilusを包含するが、これに限定されない。追加の好適なCas9ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づいて当業者には明らかであろう。かかるCas9ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-737に開示されている生物およびローカスからのCas9配列を包含し、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、Cas9ヌクレアーゼは不活性型（例えば不活性化型）DNA切断ドメインを有し、すなわちCas9はニッカーゼである。
ヌクレアーゼ不活性化型Cas9蛋白質は、交換可能に「dCas9」蛋白質（ヌクレアーゼ「不活性」なCas9）と言われ得る。不活性型DNA切断ドメインを有するCas9蛋白質（またはその断片）を生成するための方法は公知である（例えば、Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression" (2013) Cell. 28; 152(5): 1173-83参照。そのそれぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。例えば、Cas9のDNA切断ドメインは、２つのサブドメイン、HNHヌクレアーゼサブドメインおよびRuvC1サブドメインを包含することが公知である。HNHサブドメインはgRNAに対して相補的な鎖を切断するのに対して、RuvC1サブドメインは非相補鎖を切断する。これらのサブドメイン内の変異は、Cas9のヌクレアーゼ活性を抑制し得る。例えば、変異D10AおよびH840AはS. pyogenes Cas9のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する（Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., Cell. 28; 152(5): 1173-83 (2013)）。いくつかの態様においては、Cas9の断片を含む蛋白質が提供される。例えば、いくつかの態様において、蛋白質は、２つのCas9ドメインの１つ：（１）Cas9のgRNA結合ドメイン；または（２）Cas9のDNA切断ドメインを含む。いくつかの態様において、Cas9またはその断片を含む蛋白質は、「Cas9バリアント」と言われる。Cas9バリアントはCas9またはその断片との相同性を持ち合う。例えば、Cas9バリアントは、野生型Cas9と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの態様において、Cas9バリアントは、野生型Cas9と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはより多くのアミノ酸変化を有し得る。いくつかの態様において、Cas9バリアントはCas9の断片（例えば、gRNA結合ドメインまたはDNA切断ドメイン）を含み、断片は、野生型Cas9の対応する断片と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの態様において、断片は、対応する野生型Cas9のアミノ酸長の少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％である。
いくつかの態様において、断片は少なくとも100アミノ酸長である。いくつかの態様において、断片は、少なくとも100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、または少なくとも1300アミノ酸長である。いくつかの態様において、野生型Cas9は、Streptococcus pyogenes由来のCas9（NCBI参照配列：NC_017053.1、配列番号１（ヌクレオチド）、配列番号２（アミノ酸））に対応する。
Figure 0007067793000001
Figure 0007067793000002
Figure 0007067793000003
Figure 0007067793000004
いくつかの態様において、野生型Cas9は、配列番号３（ヌクレオチド）および／または配列番号４（アミノ酸）に対応するか、またはそれを含む：
Figure 0007067793000005
Figure 0007067793000006
Figure 0007067793000007
Figure 0007067793000008
いくつかの態様において、野生型Cas9は、Streptococcus pyogenes由来のCas9（NCBI参照配列：NC_002737.2、配列番号８（ヌクレオチド）；およびユニポート参照配列：Q99ZW2、配列番号１０（アミノ酸））に対応する。
Figure 0007067793000009
Figure 0007067793000010
Figure 0007067793000011
Figure 0007067793000012
Figure 0007067793000013
いくつかの態様において、Cas9は：Corynebacterium ulcerans（NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1）；Corynebacterium diphtheria（NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1）；Spiroplasma syrphidicola（NCBI Ref: NC_021284.1）；Prevotella intermedia（NCBI Ref: NC_017861.1）；Spiroplasma taiwanense（NCBI Ref: NC_021846.1）；Streptococcus iniae（NCBI Ref: NC_021314.1）；Belliella baltica（NCBI Ref: NC_018010.1）；Psychroflexus torquisl（NCBI Ref: NC_018721.1）；Streptococcus thermophilus（NCBI Ref: YP_820832.1）、Listeria innocua（NCBI Ref: NP_472073.1）、Campylobacter jejuni（NCBI Ref: YP_002344900.1）、もしくはNeisseria meningitidis（NCBI Ref: YP_002342100.1）からのCas9、または例５において挙げられている生物のいずれかからのCas9を言う。
いくつかの態様において、dCas9は、Cas9ヌクレアーゼ活性を不活性化する1つ以上の変異を有するCas9アミノ酸配列に対応するか、またはその一部または全部を含む。例えば、いくつかの態様において、dCas9ドメインはD10Aおよび／またはH840A変異を含む。
dCas9（D10AおよびH840A）：
Figure 0007067793000014
Figure 0007067793000015
いくつかの態様において、Cas9ドメインは、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列におけるD10A変異を含み、一方で、位置８４０、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する位置の残基はヒスチジンのままである。いずれかの具体的な理論によって拘束されようとすることはないが、触媒残基H840の存在は、標的Cの反対のGを含有する編集されない（例えば脱アミノ化されない）鎖を切断するCas9の活性を回復させる。H840の回復（例えば、A840から）は、Cを含有する標的鎖の切断をもたらさない。かかるCas9バリアントは、gRNAによって定義される標的配列に基づいて特定の場所に単一鎖のDNA切断（ニック）を創る能力があり、編集されない鎖の修復に至り、最終的には編集されない鎖のG->A変化をもたらす。このプロセスの概略図は図１０８に示されている。簡潔には、C-G塩基対のCは、デアミナーゼ、例えばAPOBECデアミナーゼ（deamonase）によってUに脱アミノ化され得る。Gを有する編集されない鎖にニックを入れることは、ミスマッチ修復メカニズムによるGの除去を促す。UGIはUDGを阻害し、これはUの除去を防止する。
他の態様においては、D10AおよびH840A以外の変異を有するdCas9バリアントが提供され、これは例えばヌクレアーゼ不活性化型Cas9（dCas9）をもたらす。かかる変異は、例として、D10およびH820における他のアミノ酸置換、またはCas9のヌクレアーゼドメイン内の他の置換を包含する（例えば、HNHヌクレアーゼサブドメインおよび／またはRuvC1サブドメインにおける置換）。いくつかの態様においては、dCas9のバリアントまたはホモログ（例えば、配列番号１０のバリアント）が提供され、これらが、配列番号１０と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの態様においては、dCas9のバリアント（例えば、配列番号１０のバリアント）が提供され、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００アミノ酸、またはより多くだけ配列番号１０よりも短いかまたは長いアミノ酸配列を有する。
いくつかの態様において、本明細書において提供されるCas9融合蛋白質は、Cas9蛋白質の全長アミノ酸配列、例えば本明細書において提供されるCas9配列の１つを含む。しかしながら、他の態様において、本明細書において提供される融合蛋白質は、全長Cas9配列ではなくその断片のみを含む。例えば、いくつかの態様において、本明細書において提供されるCas9融合蛋白質はCas9断片を含み、断片はcrRNAおよびtracrRNAまたはsgRNAに結合するが、例えばそれがヌクレアーゼドメインの短縮版のみを含むか、またはヌクレアーゼドメインを全く含まないという点で、機能的なヌクレアーゼドメインを含まない。好適なCas9ドメインおよびCas9断片の例示的なアミノ酸配列は本明細書において提供されており、Cas9ドメインおよび断片の追加の好適な配列は当業者には明らかであろう。
いくつかの態様において、Cas9は：Corynebacterium ulcerans（NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1）；Corynebacterium diphtheria（NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1）；Spiroplasma syrphidicola（NCBI Ref: NC_021284.1）；Prevotella intermedia（NCBI Ref: NC_017861.1）；Spiroplasma taiwanense（NCBI Ref: NC_021846.1）；Streptococcus iniae（NCBI Ref: NC_021314.1）；Belliella baltica（NCBI Ref: NC_018010.1）；Psychroflexus torquisI（NCBI Ref: NC_018721.1）；Streptococcus thermophilus（NCBI Ref: YP_820832.1）；Listeria innocua（NCBI Ref: NP_472073.1）；Campylobacter jejuni (NCBI Ref: YP_002344900.1）；またはNeisseria meningitidis（NCBI Ref: YP_002342100.1）からのCas9を言う。
本明細書において用いられる用語「デアミナーゼ」または「デアミナーゼドメイン」は、脱アミノ化反応を触媒する蛋白質または酵素を言う。いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインはシチジンデアミナーゼであり、シチジンまたはデオキシシチジンからそれぞれウリジンまたはデオキシウリジンへの加水分解的脱アミノ化を触媒する。いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインはシチジンデアミナーゼドメインであり、シトシンからウラシルへの加水分解的脱アミノ化を触媒する。いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、ある生物、例えばヒト、チンパンジー、ゴリラ、猿、牛、犬、ラット、またはマウスからの天然に存在するデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、ある生物からの天然に存在するデアミナーゼの、天然に存在しないバリアントである。例えば、いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、ある生物からの天然に存在するデアミナーゼと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。
本明細書において用いられる用語「有効量」は、所望の生物学的応答を誘起するために十分である生物活性物質の量を言う。例えば、いくつかの態様において、ヌクレアーゼの有効量は、ヌクレアーゼによって特異的に結合および切断される標的部位の切断を誘導するために十分であるヌクレアーゼの量を言い得る。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質、例えばヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメインと核酸編集ドメイン（例えば、デアミナーゼドメイン）とを含む融合蛋白質の有効量は、融合蛋白質によって特異的に結合および編集される標的部位の編集を誘導するために十分である融合蛋白質の量を言い得る。当業者によって理解されるであろうが、物質、例えば融合蛋白質、ヌクレアーゼ、デアミナーゼ、リコンビナーゼ、ハイブリッド蛋白質、蛋白質二量体、蛋白質（または蛋白質二量体）とポリヌクレオチドとの複合体、またはポリヌクレオチドの有効量は、例えば所望の生物学的応答、例えば、編集されるべき特定のアレル、ゲノム、または標的部位、ターゲティングされようとする細胞または組織、および用いられようとする物質のような種々の因子に依存して変わり得る。
本明細書において用いられる用語「リンカー」は、２つの分子または部分、例えば、例えばヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメインおよび核酸編集ドメイン（例えば、デアミナーゼドメイン）などの融合蛋白質の２つのドメインをリンクする化学基または分子を言う。いくつかの態様において、リンカーは、Cas9ヌクレアーゼドメインを包含するRNAによってプログラム可能なヌクレアーゼのgRNA結合ドメインと核酸編集蛋白質の触媒ドメインとを連結する。いくつかの態様において、リンカーはdCas9と核酸編集蛋白質とを連結する。典型的には、リンカーは、２つの基、分子、または他の部分の間に位置するか、またはそれらによってフランキングされ、共有結合によって各１つに繋がれ、それゆえに２つを繋ぐ。いくつかの態様において、リンカーはアミノ酸または複数のアミノ酸である（例えば、ペプチドまたは蛋白質）。いくつかの態様において、リンカーは有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。いくつかの態様において、リンカーは長さが５～１００アミノ酸、例えば長さが５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１５０、または１５０～２００アミノ酸である。より長い、またはより短いリンカーもまた企図される。
本明細書において用いられる用語「変異」は、別の残基による配列、例えば核酸もしくはアミノ酸配列中の残基の置換、または配列中の１つ以上の残基の欠失もしくは挿入を言う。典型的には、本明細書において、変異は、元々の残基、次に配列中における残基の位置および新たに置換された残基のアイデンティティーを同定することによって記載される。本明細書において提供されるアミノ酸置換（変異）を作るための種々の方法は当分野において周知であり、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))によって提供されている。
本明細書において用いられる用語「核酸」および「核酸分子」は、核酸塩基と酸部分とを含む化合物、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーを言う。典型的には、ポリマー核酸、例えば３つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子は直鎖状分子であり、その中の隣接するヌクレオチド同士はホスホジエステル結合によって違いにリンクされている。いくつかの態様において、「核酸」は個々の核酸残基を言う（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）。いくつかの態様において、「核酸」は、３つ以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を言う。本明細書において用いられる用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、ひとつながりの少なくとも３ヌクレオチド）を言うために交換可能に用いられ得る。いくつかの態様において、「核酸」はRNAならびに一本および／または二本鎖DNAを包摂する。核酸は、天然に、例えばゲノム、転写物、mRNA、tRNA、rRNA、siRNA、snRNA、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体、または他の天然に存在する核酸分子の文脈で存在し得る。他方で、核酸分子は、天然に存在しない分子、例えば、組換体DNAもしくはRNA、人工染色体、操作されたゲノム、またはその断片、あるいは合成DNA、RNA、DNA/RNAハイブリッドであり得、あるいは、天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオシドを包含する。さらにその上に、用語「核酸」、「DNA」、「RNA」、および／または類似の用語は、核酸アナログ、例えばホスホジエステルバックボーン以外を有するアナログを包含する。核酸は、天然のソースから精製、組換発現システムを用いて産生および任意に精製、化学合成などされ得る。適切なところでは、例えば化学合成された分子のケースにおいては、核酸は、ヌクレオシドアナログ、例えば化学修飾された塩基または糖を有するアナログ、およびバックボーン改変を含み得る。核酸配列は、別様に示されない限り５’から３’方向に提示される。いくつかの態様において、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシドアナログ（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および2－チオシチジン）；化学修飾された塩基；生物学的に改変された塩基（例えば、メチル化塩基）；インターカレーションされた塩基；修飾された糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合）であるか、またはそれを含む。
本明細書において用いられる用語「核酸編集ドメイン」は、核酸（例えば、DNAまたはRNA）に１つ以上の改変（例えば、シチジン残基の脱アミノ化）を作ることができる蛋白質または酵素を言う。例示的な核酸編集ドメインは、デアミナーゼ、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、リコンビナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、アセチルトランスフェラーゼ、転写活性化因子、または転写リプレッサードメインを包含するが、これに限定されない。いくつかの態様において、核酸編集ドメインはデアミナーゼである（例えばシチジンデアミナーゼ、例えばAPOBECまたはAIDデアミナーゼ）。
本明細書において用いられる用語「増殖性疾患」は、細胞または細胞集団が異常に高まった増殖速度を見せるという点で細胞または組織ホメオスタシスが乱れているいずれかの疾患を言う。増殖性疾患は、過増殖性疾患、例えば前新生物性の過形成状態および新生物疾患を包含する。新生物疾患は細胞の異常な増殖を特徴とし、良性および悪性新生物両方を包含する。悪性新生物は癌ともまた言われる。
用語「蛋白質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は本明細書においては交換可能に用いられ、ペプチド（アミド）結合によって一緒にリンクされたアミノ酸残基のポリマーを言う。用語は、いずれかのサイズ、構造、または機能の蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドを言う。典型的には、蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは少なくとも３アミノ酸の長さであろう。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々の蛋白質または蛋白質のコレクションを言い得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチド中のアミノ酸の１つ以上は、例えば、化学的実体、例えば炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化、または他の改変のためのリンカーなどの追加によって改変され得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、単分子でもまたあり得、または多分子複合体であり得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在する蛋白質またはペプチドの単に断片であり得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在、組換体、もしくは合成、またはそのいずれかの組み合わせであり得る。本明細書において用いられる用語「融合蛋白質」は、少なくとも２つの異なる蛋白質からの蛋白質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを言う。１つの蛋白質は、融合蛋白質のアミノ末端（Ｎ末端）部分またはカルボキシ末端（Ｃ末端）部分（protein）に位置し得、それゆえにそれぞれ「アミノ末端融合蛋白質」または「カルボキシ末端融合蛋白質」を形成する。蛋白質は、異なるドメイン、例えば、核酸編集蛋白質の核酸結合ドメイン（例えば、標的部位への蛋白質の結合を導くCas9のgRNA結合ドメイン）および核酸切断ドメインまたは触媒ドメインを含み得る。いくつかの態様において、蛋白質は、蛋白質性の一部、例えば核酸結合ドメインを構成するアミノ酸配列と、有機化合物、例えば核酸切断物質として働き得る化合物とを含む。いくつかの態様において、蛋白質は、核酸、例えばRNAとの複合体であるか、またはそれと会合している。本明細書において提供される蛋白質のいずれかは、当分野において公知のいずれかの方法によって産生され得る。例えば、本明細書において提供される蛋白質は組換体蛋白質発現および精製によって産生され得、これはペプチドリンカーを含む融合蛋白質に特に適している。組換体蛋白質発現および精製のための方法は周知であり、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))に記載されているものを包含し、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
用語「RNAによってプログラム可能なヌクレアーゼ」および「RNA誘導型ヌクレアーゼ」は本明細書においては交換可能に用いられ、切断の標的ではない１つ以上のRNAと複合体を形成する（例えば、それと結合または会合する）ヌクレアーゼを言う。いくつかの態様において、RNAによってプログラム可能なヌクレアーゼは、RNAとの複合体であるときに、ヌクレアーゼ:RNA複合体と言われ得る。典型的には、結合されたRNA（単数または複数）はガイドRNA（gRNA）と言われる。gRNAは、２つ以上のRNAの複合体としてまたは単一のRNA分子として存在し得る。単一のRNA分子として存在するgRNAはシングルガイドRNA（sgRNA）と言われ得るが、「gRNA」は、単分子としてまたは２つ以上の分子の複合体としてどちらかで存在するガイドRNAを言うために交換可能に用いられる。典型的には、単一のRNA種として存在するgRNAは２つのドメインを含む：（１）標的核酸との相同性を持ち合う（例えば、かつ標的へのCas9複合体の結合を導く）ドメイン；および（２）Cas9蛋白質に結合するドメイン。いくつかの態様において、ドメイン（２）は、tracrRNAとして公知の配列に対応し、ステムループ構造を含む。例えば、いくつかの態様において、ドメイン（２）は、Jinek et al., Science 337:816-821(2012)によって提供されているtracrRNAと同一または相同であり、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。gRNAの他の例（例えば、ドメイン２を包含するもの）は、「Switchable Cas9 Nucleases And Uses Thereof」と題する２０１３年９月６日出願のU.S.仮特許出願U.S.S.N.61/874,682および「Delivery System For Functional Nucleases」と題する２０１３年９月６日出願のU.S.仮特許出願U.S.S.N.61/874,746,に見出され得、それぞれの内容全体はそれらの全体が参照によってここで組み込まれる。いくつかの態様において、gRNAはドメイン（１）および（２）の２つ以上を含み、「延長型gRNA」と言われ得る。例えば、延長型gRNAは、例えば２つ以上のCas9蛋白質に結合し、本明細書に記載される２つ以上の別々の領域において標的核酸に結合するであろう。gRNAは標的を相補するヌクレオチド配列を含み、これが前記標的部位へのヌクレアーゼ/RNA複合体の結合を媒介し、ヌクレアーゼ:RNA複合体の配列特異性を提供する。いくつかの態様において、RNAによってプログラム可能なヌクレアーゼは（CRISPR関連システム）Cas9エンドヌクレアーゼ、例えばStreptococcus pyogenesからのCas9（Csn1）である（例えば、"Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J. J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)；"CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471 :602-607(2011)；および"A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I, Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)参照。そのそれぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
RNAによってプログラム可能なヌクレアーゼ（例えばCas9）は標的DNA切断部位へのRNA:DNAハイブリダイゼーションを用いるので、原理的には、これらの蛋白質は、ガイドRNAによって規定されるいずれかの配列にターゲティングされる能力がある。RNAによってプログラム可能なヌクレアーゼ、例えばCas9を部位特異的切断に（例えば、ゲノムを改変するために）用いる方法は、当分野において公知である（例えば、Cong, L. et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013)；Mali, P. et al., RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013)；Hwang, W.Y. et al., Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013)；Jinek, M. et al., RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013); Dicarlo, J.E. et al., Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013)；Jiang, W. et al., RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)参照；そのそれぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。
本明細書において用いられる用語「対象」は、個体生物、例えば個体哺乳動物を言う。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は非ヒト霊長類である。いくつかの態様において、対象はげっ歯類である。いくつかの態様において、対象は羊、山羊、畜牛、猫、または犬である。いくつかの態様において、対象は脊椎動物、両生類、爬虫類、魚類、昆虫、ハエ、または線虫である。いくつかの態様において、対象は研究動物である。いくつかの態様において、対象は遺伝子操作されており、例えば遺伝子操作された非ヒト対象である。対象は、どちらかの性、および発達のいずれかのステージであり得る。
用語「標的部位」は、デアミナーゼまたはデアミナーゼを含む融合蛋白質（例えば、本明細書において提供されるdCas9-デアミナーゼ融合蛋白質）によって脱アミノ化される核酸分子中の配列を言う。
用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載される疾患もしくは異常またはその１つ以上の症状を後戻りさせるか、軽減するか、その始まりを遅らせるか、またはその進行を阻害することを狙った臨床的介入を言う。本明細書において用いられる用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載される疾患もしくは異常またはその１つ以上の症状を後戻りさせるか、軽減するか、その始まりを遅らせるか、またはその進行を阻害することを狙った臨床的介入を言う。いくつかの態様において、処置は、１つ以上の症状が発生した後におよび／または疾患が診断された後に投与され得る。他の態様において、処置は、症状の不在下において、例えば、症状を防止するかもしくはその始まりを遅らせるか、または疾患の始まりもしくは進行を阻害するために投与され得る。例えば、処置は、（例えば、症状の既往に照らして、および／または遺伝学的または他の易罹患性因子に照らして）症状の始まりに先立って易罹患性の個体に投与され得る。処置は、症状が解消した後にもまた、例えばそれらの再発を防止するかまたは遅らせるために継続され得る。
蛋白質または核酸の文脈において本明細書において用いられる用語「組換体」は、天然に存在せず、ヒトによる操作の産物である蛋白質または核酸を言う。例えば、いくつかの態様において、組換体蛋白質または核酸分子は、いずれかの天然に存在する配列と比較して少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの変異を含むアミノ酸またはヌクレオチド配列を含む。
本明細書において用いられる用語「核酸塩基編集因子（NBE）」または「塩基編集因子（BE）」は、本明細書に記載されるCas9融合蛋白質を言う。いくつかの態様において、融合蛋白質は、デアミナーゼに融合されたヌクレアーゼ不活性型Cas9（dCas9）を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は、デアミナーゼに融合されたCas9ニッカーゼを含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は、デアミナーゼに融合され、さらにUGIドメインに融合されたヌクレアーゼ不活性型Cas9を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は、デアミナーゼに融合され、さらにUGIドメインに融合されたCas9ニッカーゼを含む。いくつかの態様において、融合蛋白質のdCas9は配列番号１０のD10AおよびH840A変異、または配列番号１１～２６０のいずれかにおける対応する変異を含み、これはCas9蛋白質のヌクレアーゼ活性を不活性化する。いくつかの態様において、融合蛋白質はD10A変異を含み、配列番号１０の残基８４０におけるヒスチジン、または配列番号１１～２６０のいずれかにおける対応する変異を含み、これは、Cas9を、核酸二本鎖の１つの鎖のみを切断することができるようにする。Cas9ニッカーゼの例は下で配列番号６７４に示されている。用語「核酸塩基編集因子（NBE）」および「塩基編集因子（BE）」は交換可能に用いられ得る。
本明細書において用いられる用語「ウラシルグリコシラーゼ阻害剤」または「UGI」は、ウラシルDNAグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害することができる蛋白質を言う。
本明細書において用いられる用語「Cas9ニッカーゼ」は、二本鎖核酸分子（例えば、二本鎖DNA分子）の１つの鎖のみを切断することができるCas9蛋白質を言う。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼはD10A変異を含み、配列番号１０のH840の位置におけるヒスチジン、または配列番号１１～２６０のいずれかにおける対応する変異を有する。例えば、Cas9ニッカーゼは、配列番号６７４に示されているアミノ酸配列を含み得る。かかるCas9ニッカーゼは活性なHNHヌクレアーゼドメインを有し、DNAの非標的鎖、すなわちgRNAによって結合される鎖を切断する能力がある。さらに、かかるCas9ニッカーゼは不活性型RuvCヌクレアーゼドメインを有し、DNAの標的鎖、すなわち塩基編集が望まれる鎖を切断する能力がない。
例示的なCas9ニッカーゼ（クローニングベクターpPlatTET-gRNA2；アクセッションNo.BAV54124）。
Figure 0007067793000016
Figure 0007067793000017
本開示のいくつかの側面は、ヌクレオチド配列に結合することができるドメイン（例えば、Cas9またはCpf1蛋白質）と酵素ドメイン、例えば、例えばデアミナーゼドメインなどのDNA編集ドメインとを含む融合蛋白質を提供する。デアミナーゼによる核酸塩基の脱アミノ化はそれぞれの残基における点変異に至り得、これは本明細書において核酸編集と言われる。それゆえに、Cas9バリアントまたはドメインとDNA編集ドメインとを含む融合蛋白質は、核酸配列の標的特異的編集のために用いられ得る。かかる融合蛋白質は、インビトロのDNAの標的特異的編集に、例えば、変異体細胞または動物の生成に；標的の変異の導入に、例えば、エクスビボの細胞の、例えば爾後に同じまたは別の対象に再導入される対象から得られた細胞の遺伝子欠損の修正に；および標的の変異の導入、例えば、対象の疾患関連遺伝子の遺伝子欠損の修正または不活性化変異の導入に有用である。典型的には、本明細書に記載される融合蛋白質のCas9ドメインはいずれかのヌクレアーゼ活性を有さず、代わりにCas9断片またはdCas9蛋白質もしくはドメインである。本明細書に記載されるCas9融合蛋白質の使用のための方法もまた提供される。
核酸塩基編集因子のCas9ドメイン
限定しない例示的なCas9ドメインが本明細書において提供される。Cas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性なCas9ドメイン、ヌクレアーゼ（nucleasae）不活性型Cas9ドメイン、またはCas9ニッカーゼであり得る。いくつかの態様において、Cas9ドメインはヌクレアーゼ活性なドメインである。例えば、Cas9ドメインは、二本鎖核酸の両方の鎖（例えば、二本鎖DNA分子の両方の鎖）を切るCas9ドメインであり得る。いくつかの態様において、Cas9ドメインは、配列番号１０～２６３に示されているアミノ酸配列のいずれか１つを含む。いくつかの態様において、Cas9ドメインは、配列番号１０～２６３に示されているアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Cas9ドメインは、配列番号１０～２６３に示されているアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個以上、またはより多くの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Cas9ドメインは、配列番号１０～２６３に示されているアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも（at leat）４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、または少なくとも１２００個の同一の一続きのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、Cas9ドメインはヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメイン（dCas9）である。例えば、dCas9ドメインは、二本鎖核酸分子のどちらかの鎖を切断することなしに、二本鎖核酸分子に（例えば、gRNA分子を介して）結合し得る。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ不活性型dCas9ドメインは、配列番号１０に示されているアミノ酸配列のD10X変異およびH840X変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、Xはいずれかのアミノ酸変化である。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ不活性型dCas9ドメインは、配列番号１０に示されているアミノ酸配列のD10A変異およびH840A変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。１つの例として、ヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメインは、配列番号２６３に示されているアミノ酸配列を含む（クローニングベクターpPlatTET-gRNA2、アクセッションNo.BAV54124）。
Figure 0007067793000018
Figure 0007067793000019
追加の好適なヌクレアーゼ不活性型dCas9ドメインは、本開示の範囲内であり、本開示および当分野の知識に基づいて当業者には明らかであろう。かかる追加の例示的な好適なヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメインは、D10A/H840A、D10A/D839A/H840A、およびD10A/D839A/H840A/N863A変異体ドメインを包含するが、これに限定されない（例えば、Prashant et al., CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838参照。その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの態様において、dCas9ドメインは、本明細書において提供されるdCas9ドメインのいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Cas9ドメインは、配列番号１０～２６３に示されているアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０個以上、またはより多くの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Cas9ドメインは、配列番号１０～２６３に示されているアミノ酸配列のいずれか１つと比較して、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも（at leat）４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、または少なくとも１２００個の一続きのアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、Cas9ドメインはCas9ニッカーゼである。Cas9ニッカーゼは、二本鎖核酸分子（例えば、二本鎖DNA分子）の１つの鎖のみを切断することができるCas9蛋白質であり得る。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼは二本鎖核酸分子の標的鎖を切断し、これは、Cas9ニッカーゼが、Cas9に結合しているgRNA（例えばsgRNA）と塩基対形成する（それに対して相補的である）鎖を切断するということを意味する。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼは配列番号１０のD10A変異を含み、位置８４０のヒスチジン、または配列番号１１～２６０のいずれかにおける変異を有する。例えば、Cas9ニッカーゼは、配列番号６７４に示されているアミノ酸配列を含み得る。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼは、二本鎖核酸分子の非標的の塩基編集されない鎖を切断し、これは、Cas9ニッカーゼが、Cas9に結合しているgRNA（例えばsgRNA）と塩基対形成しない鎖を切断するということを意味する。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼは配列番号１０のH840A変異を含み、位置１０のアスパラギン酸残基、または配列番号１１～２６０のいずれかにおける対応する変異を有する。いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼは、本明細書において提供されるCas9ニッカーゼのいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。追加の好適なCas9ニッカーゼは本開示の範囲内であり、本開示および当分野の知識に基づいて当業者には明らかであろう。
縮減されたPAM排他性を有するCas9ドメイン
本開示のいくつかの側面は、異なるPAM特異性を有するCas9ドメインを提供する。典型的には、Cas9蛋白質、例えばS. pyogenesからのCas9（spCas9）は、具体的な核酸領域に結合するためには古典的NGG PAM配列を要求する。これは、ゲノム中の所望の塩基を編集する能力を限定し得る。いくつかの態様において、本明細書において提供される塩基編集融合蛋白質は、正確な場所に置かれることを必要とし得、例えば標的塩基は４塩基領域（例えば、「脱アミノ化ウインドウ」）内に置かれ、これがPAMのおよそ１５塩基上流である。Komor, A.C., et al., "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage" Nature 533, 420-424 (2016)参照。その内容全体はここで参照によって組み込まれる。従って、いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、古典的（例えばNGG）PAM配列を含有しないヌクレオチド配列に結合することができるCas9ドメインを含有し得る。非古典的PAM配列に結合するCas9ドメインは当分野において記載されており、当業者には明らかであろう。例えば、非古典的PAM配列に結合するCas9ドメインはKleinstiver, B. P., et al., "Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities" Nature 523, 481-485 (2015)；およびKleinstiver, B. P., et al., "Broadening the targeting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition" Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)に記載されており；それぞれの内容全体はここで参照によって組み込まれる。
いくつかの態様において、Cas9ドメインはStaphylococcus aureusからのCas9ドメインである（SaCas9）。いくつかの態様において、SaCas9ドメインは、ヌクレアーゼ活性なSaCas9、ヌクレアーゼ不活性型SaCas9（SaCas9d）、またはSaCas9ニッカーゼ（SaCas9n）である。いくつかの態様において、SaCas9はアミノ酸配列配列番号４２７３を含む。いくつかの態様において、SaCas9は、配列番号４２７３のN579X変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、XはN以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、SaCas9は、配列番号４２７３のN579A変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、SaCas9ドメイン、SaCas9dドメイン、またはSaCas9nドメインは、非古典的PAMを有する核酸配列（seuqnce）に結合し得る。いくつかの態様において、SaCas9ドメイン、SaCas9dドメイン、またはSaCas9nドメインは、NNGRRT PAM配列を有する核酸配列に結合し得る。いくつかの態様において、SaCas9ドメインは、配列番号４２７３のE781X、N967X、およびR1014X変異の１つ以上、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、SaCas9ドメインは、配列番号４２７３のE781K、N967K、およびR1014H変異の１つ以上、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける１つ以上の対応する変異を含む。いくつかの態様において、SaCas9ドメインは、配列番号４２７３のE781K、N967K、またはR1014H変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。
いくつかの態様において、本明細書で提供される融合蛋白質のいずれかのCas9ドメインは、配列番号４２７３～４２７５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、または少なくとも99.5％同一である。いくつかの態様において、本明細書で提供される融合蛋白質のいずれかのCas9ドメインは、配列番号４２７３～４２７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書で提供される融合蛋白質のいずれかのCas9ドメインは、配列番号４２７３～４２７５のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
例示的なSaCas9配列
Figure 0007067793000020
 下線部、太字の配列番号４２７３のN579残基を（例えばA579に）変異させて、SaCas9ニッカーゼを得ることができる。
例示的なSaCas9n配列
Figure 0007067793000021
 配列番号４２７４のN579から変異されてSaCas9ニッカーゼを得ることができる、配列番号ｘｘのA579残基を下線および太字で示す。
例示的なSaKKH Cas9
Figure 0007067793000022
Figure 0007067793000023
 配列番号４２７５のN579から変異されてSaCas9ニッカーゼを得ることができる、配列番号４２７５のA579残基を下線および太字で示す。配列番号４２７５のE781、N967、およびR1014から変異されてSaKKH Cas9を得ることができる、配列番号４２７５のK781、K967、およびH1014残基を下線および斜体で示す。
いくつかの態様において、Cas9ドメインはStreptococcus pyogenesからのCas9ドメインである（SpCas9）。いくつかの態様において、SpCas9ドメインはヌクレアーゼ活性なSpCas9、ヌクレアーゼ不活性型SpCas9（SpCas9d）、またはSpCas9ニッカーゼ（SpCas9n）である。いくつかの態様において、SpCas9はアミノ酸配列配列番号４２７６を含む。いくつかの態様において、SpCas9は、配列番号４２７６のD9X変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、XはD以外のいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、SpCas9は、配列番号４２７６のD9A変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、SpCas9ドメイン、SpCas9dドメイン、またはSpCas9nドメインは、非古典的PAMを有する核酸配列（seuqnce）に結合し得る。いくつかの態様において、SpCas9ドメイン、SpCas9dドメイン、またはSpCas9nドメインは、NGG、NGA、またはNGCG PAM配列を有する核酸配列に結合し得る。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、配列番号４２７６のD1134X、R1334X、およびT1336X変異の１つ以上、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、配列番号４２７６のD1134E、R1334Q、およびT1336R変異の１つ以上、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、配列番号４２７６のD1134E、R1334Q、およびT1336R変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、配列番号４２７６のD1134X、R1334X、およびT1336X変異の１つ以上、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、配列番号４２７６のD1134V、R1334Q、およびT1336R変異の１つ以上、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、配列番号４２７６のD1134V、R1334Q、およびT1336R変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、配列番号４２７６のD1134X、G1217X、R1334X、およびT1336X変異の１つ以上、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、配列番号４２７６のD1134V、G1217R、R1334Q、およびT1336R変異の１つ以上、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、SpCas9ドメインは、配列番号４２７６のD1134V、G1217R、R1334Q、およびT1336R変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのCas9ドメインは、配列番号４２７６～４２８０のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのCas9ドメインは、配列番号４２７６～４２８０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのCas9ドメインは配列番号４２７６～４２８０のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
例示的なSpCas9
Figure 0007067793000024
Figure 0007067793000025
 例示的なSpCas9n
Figure 0007067793000026
Figure 0007067793000027
 例示的なSpEQR Cas9
Figure 0007067793000028
Figure 0007067793000029
 配列番号４２７８のD1134、R1334、およびT1336から変異されてSpEQR Cas9を得ることができる、配列番号４２７８のE1134、Q1334、およびR1336残基を下線および太字で示す。
例示的なSpVQR Cas9
Figure 0007067793000030
Figure 0007067793000031
 配列番号４２７９のD1134、R1334、およびT1336から変異されてSpVQR Cas9を得ることができる、配列番号４２７９のV1134、Q1334およびR1336残基を下線および太字で示す。
例示的なSpVRER Cas9
Figure 0007067793000032
 配列番号４２８０のD1134、G1217、R1334およびT1336から変異されてSpVRER Cas9を得ることができる、配列番号４２８０のV1134、R1217、Q1334およびR1336残基を下線および太字で示す。
以下は、非古典的（例えば非NGG）PAM配列を有する核酸配列に結合することができる例示的な融合蛋白質（例えば塩基編集蛋白質）である：
Figure 0007067793000033
Figure 0007067793000034
Figure 0007067793000035
Figure 0007067793000036
Figure 0007067793000037
Figure 0007067793000038
Figure 0007067793000039
Figure 0007067793000040
ハイ・フィデリティ塩基編集因子
本開示のいくつかの側面は、高いフィデリティを有するCas9ドメインを含むCas9融合蛋白質（例えば、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれか）を提供する。本開示の追加の側面は、野生型Cas9ドメインと比較してCas9ドメインとDNAの糖－リン酸バックボーンとの間の減少した静電的相互作用を有するCas9ドメインを含む、Cas9融合蛋白質（例えば、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれか）を提供する。いくつかの態様において、Cas9ドメイン（例えば、野生型Cas9ドメイン）は、Cas9ドメインとDNAの糖－リン酸バックボーンとの間の会合を減少させる１つ以上の変異を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供されるCas9融合蛋白質のいずれかは、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のN497X、R661X、Q695X、および／もしくはQ926X変異の１つ以上、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含み、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、本明細書において提供されるCas9融合蛋白質のいずれかは、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のN497A、R661A、Q695A、および／もしくはQ926A変異の１つ以上、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、Cas9ドメインは、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のD10A変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、Cas9ドメイン（例えば、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかの）は、配列番号３２５に示されているアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は、配列番号２８５に示されているアミノ酸配列を含む。高いフィデリティを有するCas9ドメインは当分野において公知であり、当業者には明らかであろう。例えば、高いフィデリティを有するCas9ドメインはKleinstiver, B.P., et al., "High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects." Nature 529, 490-495 (2016)；およびSlaymaker, I.M., et al., "Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity." Science 351, 84-88 (2015)に記載されており、それぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
本明細書において提供される塩基編集因子、例えば塩基編集因子２（BE2）または塩基編集因子３（BE3）は、本明細書に記載されるCas9ドメインを改変することによってハイ・フィデリティ塩基編集因子に変換されて、ハイ・フィデリティ塩基編集因子、例えばハイ・フィデリティ塩基編集因子２（HF-BE2）またはハイ・フィデリティ塩基編集因子３（HF-BE3）を創り得るということは理解されるはずである。いくつかの態様において、塩基編集因子２（BE2）はデアミナーゼドメイン、dCas9、およびUGIドメインを含む。いくつかの態様において、塩基編集因子３（BE3）はデアミナーゼドメイン、nCas9ドメイン、およびUGIドメインを含む。
配列番号１０のCas9に対して相対的に太字および下線によって変異が示されているCas9ドメイン
Figure 0007067793000041
Figure 0007067793000042
Figure 0007067793000043
Cas9融合蛋白質
本明細書において開示されるCas9ドメインのいずれか（例えば、ヌクレアーゼ活性Cas9蛋白質、ヌクレアーゼ不活性型dCas9蛋白質、またはCas9ニッカーゼ蛋白質）は第２の蛋白質に融合され得、それゆえに、本明細書において提供される融合蛋白質は、本明細書において提供されるCas9ドメインと第２の蛋白質または「融合パートナー」とを含む。いくつかの態様において、第２の蛋白質はCas9ドメインのＮ末端に融合される。しかしながら、他の態様において、第２の蛋白質はCas9ドメインのＣ末端に融合される。いくつかの態様において、Cas9ドメインに融合される第２の蛋白質は核酸編集ドメインである。いくつかの態様において、Cas9ドメインおよび核酸編集ドメインはリンカーによって融合される。一方で、他の態様において、Cas9ドメインおよび核酸編集ドメインは互いに直接的に融合される。いくつかの態様において、リンカーは、(GGGS)n（配列番号２６５）、(GGGGS)n（配列番号５）、(G)n、(EAAAK)n（配列番号６）、(GGS)n、(SGGS)n、（配列番号４２８８）、SGSETPGTSESATPES（配列番号７）、もしくは(XP)nモチーフ、またはこれらのいずれかの組み合わせを含み、nは独立して１および３０の間の整数であり、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは(GGS)nモチーフを含み、nは１、３、または７である。いくつかの態様において、リンカーは(GGS)nモチーフを含み、nは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。いくつかの態様において、リンカーはSGSETPGTSESATPES（配列番号７）のアミノ酸配列を含む（例においてはXTENリンカーともまた言われる）。リンカーの長さは、例において例解されているように編集されるべき塩基に影響を及ぼし得る。例えば、３アミノ酸の長さのリンカー（例えば、(GGS)1）はPAM配列に対して相対的に２～５、２～４、２～３、３～４塩基の編集ウインドウを与え得、一方で、９アミノ酸リンカー（例えば、(GGS)3（配列番号５９６））はPAM配列に対して相対的に２～６、２～５、２～４、２～３、３～６、３～５、３～４、４～６、４～５、５～６塩基の編集ウインドウを与え得る。１６アミノ酸リンカー（例えば、XTENリンカー）は、PAM配列に対して相対的に２～７、２～６、２～５、２～４、２～３、３～７、３～６、３～５、３～４、４～７、４～６、４～５、５～７、５～６、６～７塩基の並外れて強い活性を有するウインドウを与え得、２１アミノ酸リンカー（例えば、(GGS)7（配列番号５９７））は、PAM配列に対して相対的に３～８、３～７、３～６、３～５、３～４、４～８、４～７、４～６、４～５、５～８、５～７、５～６、６～８、６～７、７～８塩基の編集ウインドウを与え得る。様々なリンカー長は、本開示のdCas9融合蛋白質がPAM配列から異なる距離の核酸塩基を編集することを許し得るという新規の知見は、有意な臨床的重要性を提供する。なぜなら、PAM配列は、遺伝子内の修正されるべき疾患を引き起こす変異に対して様々な距離であり得るからである。ここに例として記載されるリンカー長が限定することを意味されていないということは理解されるであろう。
いくつかの態様において、第２の蛋白質は酵素ドメインを含む。いくつかの態様において、酵素ドメインは核酸編集ドメインである。かかる核酸編集ドメインは、限定なしに、ヌクレアーゼ、ニッカーゼ、リコンビナーゼ、デアミナーゼ、メチルトランスフェラーゼ、メチラーゼ、アセチラーゼ、またはアセチルトランスフェラーゼであり得る。本開示に従って用いられ得る限定しない例示的な結合ドメインは、転写活性化因子ドメインおよび転写リプレッサードメインを包含する。
デアミナーゼドメイン
いくつかの態様において、第２の蛋白質は核酸編集ドメインを含む。いくつかの態様において、核酸編集ドメインはC->U塩基変化を触媒し得る。いくつかの態様において、核酸編集ドメインはデアミナーゼドメインである。いくつかの態様において、デアミナーゼはシチジンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはアポリポ蛋白質B mRNA編集複合体（APOBEC）ファミリーデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC1デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC2デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Aデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Bデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Cデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Dデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Eデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Fデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Gデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Hデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC4デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは活性化誘導デアミナーゼ（AID）である。いくつかの態様において、デアミナーゼは脊椎動物デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは無脊椎動物デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはヒト、チンパンジー、ゴリラ、猿、牛、犬、ラット、またはマウスデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはヒトデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはラットデアミナーゼ、例えばrAPOBEC1である。いくつかの態様において、デアミナーゼはPetromyzon marinusシチジンデアミナーゼ1（pmCDA1）である。いくつかの態様において、デアミナーゼ（deminase）はヒトAPOBEC3Gである（配列番号２７５）。いくつかの態様において、デアミナーゼはヒトAPOBEC3Gの断片である（配列番号５７４０）。いくつかの態様において、デアミナーゼはD316R D317R変異を含むヒトAPOBEC3Gバリアントである（配列番号５７３９）。いくつかの態様において、デアミナーゼはヒトAPOBEC3Gの断片（frantment）であり、配列番号２７５におけるD316R D317R変異に対応する変異を含んでいる（配列番号５７４１）。
いくつかの態様において、核酸編集ドメインは、配列番号２６６～２８４、６０７～６１０、５７２４～５７３６、または５７３８～５７４１のいずれか１つのデアミナーゼドメインと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。いくつかの態様において、核酸編集ドメインは、配列番号２６６～２８４、６０７～６１０、５７２４～５７３６、または５７３８～５７４１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
塩基編集因子の編集ウインドウを調節するデアミナーゼドメイン
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかのデアミナーゼドメイン触媒活性を、例えばデアミナーゼドメインに点変異を作ることによって調節することが、融合蛋白質（例えば塩基編集因子）の処理能力に影響するという認識に基づく。例えば、塩基編集融合蛋白質中のデアミナーゼドメインの触媒活性を消去しないが縮減する変異は、デアミナーゼドメインが標的残基に隣接する残基の脱アミノ化を触媒することをより蓋然的でなくし得、それによって、脱アミノ化ウインドウを狭める。脱アミノ化ウインドウを狭める能力は、特定の標的残基に隣接する残基の不要の脱アミノ化を防止し得、これはオフターゲット効果を減少させ得るかまたは防止し得る。
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、縮減したデアミナーゼ触媒活性を有するデアミナーゼドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼドメイン）を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、適切なコントロールと比較して縮減したデアミナーゼ触媒活性を有するデアミナーゼドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼドメイン）を含む。例えば、適切なコントロールは、デアミナーゼへの１つ以上の変異の導入に先立つデアミナーゼのデアミナーゼ活性であり得る。他の態様において、適切なコントロールは野生型デアミナーゼであり得る。いくつかの態様において、適切なコントロールは野生型アポリポ蛋白質B mRNA編集複合体（APOBEC）ファミリーデアミナーゼである。いくつかの態様において、適切なコントロールは、APOBEC1デアミナーゼ、APOBEC2デアミナーゼ、APOBEC3Aデアミナーゼ、APOBEC3Bデアミナーゼ、APOBEC3Cデアミナーゼ、APOBEC3Dデアミナーゼ、APOBEC3Fデアミナーゼ、APOBEC3Gデアミナーゼ、またはAPOBEC3Hデアミナーゼである。いくつかの態様において、適切なコントロールは活性化誘導デアミナーゼ（AID）である。いくつかの態様において、適切なコントロールはPetromyzon marinusからのシチジンデアミナーゼ１（pmCDA1）である。いくつかの態様において、デアミナーゼ（deaminse）ドメインは、適切なコントロールと比較して、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも（at lest）７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％少ないデアミナーゼ触媒活性を有するデアミナーゼドメインであり得る。
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、rAPOBEC1（配列番号２８４）のH121X、H122X、R126X、R126X、R118X、W90X、W90X、およびR132Xからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含み、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、rAPOBEC1（配列番号２８４）のH121R、H122R、R126A、R126E、R118A、W90A、W90Y、およびR132Eからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、hAPOBEC3G（配列番号２７５）のD316X、D317X、R320X、R320X、R313X、W285X、W285X、R326Xからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含み、Xはいずれかのアミノ酸である。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、hAPOBEC3G（配列番号２７５）のD316R、D317R、R320A、R320E、R313A、W285A、W285Y、R326Eからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、rAPOBEC1（配列番号２８４）のH121RおよびH122R変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、rAPOBEC1（配列番号２８４）のR126A変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、rAPOBEC1（配列番号２８４）のR126E変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、rAPOBEC1（配列番号２８４）のR118A変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、rAPOBEC1（配列番号２８４）のW90A変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、rAPOBEC1（配列番号２８４）のW90Y変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、rAPOBEC1（配列番号２８４）のR132E変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、rAPOBEC1（配列番号２８４）のW90YおよびR126E変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、rAPOBEC1（配列番号２８４）のR126EおよびR132E変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、rAPOBEC1（配列番号２８４）のW90YおよびR132E変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、rAPOBEC1（配列番号２８４）のW90Y、R126E、およびR132E変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、hAPOBEC3G（配列番号２７５）のD316RおよびD317R変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、hAPOBEC3G（配列番号２７５）のR320A変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、hAPOBEC3G（配列番号２７５）のR320E変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、hAPOBEC3G（配列番号２７５）のR313A変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、hAPOBEC3G（配列番号２７５）のW285A変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、hAPOBEC3G（配列番号２７５）のW285Y変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、hAPOBEC3G（配列番号２７５）のR326E変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、hAPOBEC3G（配列番号２７５）のW285YおよびR320E変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、hAPOBEC3G（配列番号２７５）のR320EおよびR326E変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、hAPOBEC3G（配列番号２７５）のW285YおよびR326E変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、hAPOBEC3G（配列番号２７５）のW285Y、R320E、およびR326E変異、または別のAPOBECデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むAPOBECデアミナーゼを含む。
本開示のいくつかの側面は、（ｉ）ヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメインと；（ｉｉ）核酸編集ドメインとを含む融合蛋白質を提供する。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメイン（dCas9）は、配列番号１０～２６３のいずれか１つによって提供されるCas9のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み、Cas9のヌクレアーゼ活性を不活性化する変異を含む。Cas9のヌクレアーゼドメインを不活性にする変異は当分野において周知である。例えば、Cas9のDNA切断ドメインは、２つのサブドメイン、HNHヌクレアーゼサブドメインおよびRuvC1サブドメインを包含することが公知である。HNHサブドメインはgRNAに対して相補的な鎖を切断するのに対して、RuvC1サブドメインは非相補鎖を切断する。これらのサブドメイン内の変異はCas9のヌクレアーゼ活性を抑制し得る。例えば、変異D10AおよびH840AはS. pyogenes Cas9のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する（Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., Cell. 28; 152(5): 1173-83 (2013)）。いくつかの態様において、本開示のdCas9は、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のD10A変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、本開示のdCas9は、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のH840A変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、本開示のdCas9は、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のD10AおよびH840A変異両方、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。いくつかの態様において、Cas9は、さらに、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列の位置８４０におけるヒスチジン残基、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。触媒残基H840の存在は、標的Cと反対のGを含有する編集されない鎖を切断するCas9の活性を回復させる。H840の回復は、Cを含有する標的鎖の切断はもたらさない。いくつかの態様において、dCas9は配列番号２６３のアミノ酸配列を含む。Cas9のヌクレアーゼドメインを不活性化する他の変異もまた本開示のdCas9に包含され得るということは理解されるはずである。
本明細書において開示される変異を含むCas9またはdCas9ドメインは、全長のCas9またはその断片であり得る。いくつかの態様において、Cas9またはその断片を含む蛋白質は「Cas9バリアント」と言われる。Cas9バリアントはCas9またはその断片との相同性を持ち合う。例えば、Cas9バリアントは、野生型Cas9と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％である。いくつかの態様において、Cas9バリアントはCas9の断片（例えば、gRNA結合ドメインまたはDNA切断ドメイン）を含み、断片は、野生型Cas9、例えば配列番号１０のアミノ酸配列を含むCas9の対応する断片と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。
本開示のCas9融合蛋白質のいずれかは、さらに核酸編集ドメイン（例えば、核酸を改変することができる酵素、例えばデアミナーゼ）を含み得る。いくつかの態様において、核酸編集ドメインはDNA編集ドメインである。いくつかの態様において、核酸編集ドメインはデアミナーゼ活性を有する。いくつかの態様において、核酸編集ドメインはデアミナーゼまたはデアミナーゼドメインを含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、デアミナーゼはシチジンデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはアポリポ蛋白質B mRNA編集複合体（APOBEC）ファミリーデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC1ファミリーデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）である。いくつかの核酸編集ドメインおよびかかるドメインを包含するCas9融合蛋白質は、本明細書に詳細に記載されている。追加の好適な核酸編集ドメインは、本開示および当分野の知識に基づいて当業者には明らかであろう。
本開示のいくつかの側面は、核酸編集ドメインに融合されたCas9ドメインを含む融合蛋白質を提供し、核酸編集ドメインはCas9ドメインのＮ末端に融合されている。いくつかの態様において、Cas9ドメインおよび核酸編集-編集ドメインはリンカーによって融合される。いくつかの態様において、リンカーは、(GGGS)n（配列番号２６５）、(GGGGS)n（配列番号５）、(G)n、(EAAAK)n（配列番号６）、(GGS)n、(SGGS)n（配列番号４２８８）、SGSETPGTSESATPES（配列番号７）モチーフ（例えば、Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to Fok1 nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82参照；内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）、もしくは(XP)nモチーフ、またはこれらのいずれかの組み合わせを含み、nは独立して１および３０の間の整数である。いくつかの態様において、nは、独立して１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、もしくは３０、または１つよりも多くのリンカーもしくは１つよりも多くのリンカーモチーフが存在する場合にはそのいずれかの組み合わせである。いくつかの態様において、リンカーは(GGS)nモチーフを含み、nは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。いくつかの態様において、リンカーは(GGS)nモチーフを含み、nは１、３、または７である。いくつかの態様において、リンカーはアミノ酸配列SGSETPGTSESATPES（配列番号７）を含む。追加の好適なリンカーモチーフおよびリンカー構成は当業者には明らかであろう。いくつかの態様において、好適なリンカーモチーフおよび構成は、Chen et al., Fusion protein linkers: property, design and functionality. Adv Drug Deliv Rev. 2013; 65(10): 1357-69に記載されているものを包含し、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。追加の好適なリンカー配列は本開示に基づいて当業者には明らかであろう。いくつかの態様において、本明細書において提供される例示的なCas9融合蛋白質の一般的構造は、構造：
[NH2]-[核酸編集ドメイン]-[Cas9]-[COOH]または
[NH2]-[核酸編集ドメイン]-[リンカー]-[Cas9]-[COOH]
を含み、
NH2は融合蛋白質のＮ末端であり、COOHは融合蛋白質のＣ末端である。
本開示の融合蛋白質は１つ以上の追加の特徴を含み得る。例えば、いくつかの態様において、融合蛋白質は核局在配列（NLS）を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質のNLSは核酸編集ドメインとCas9ドメインとの間に局在する。いくつかの態様において、融合蛋白質のNLSはCas9ドメインのＣ末端に局在する。
存在し得る他の例示的な特徴は、局在配列、例えば細胞質局在配列、搬出配列、例えば核外移行配列、または他の局在配列、および融合蛋白質の可溶化、精製、もしくは検出に有用である配列タグである。本明細書において提供される好適な蛋白質タグは、ビオチンカルボキシラーゼキャリア蛋白質（BCCP）タグ、mycタグ、カルモジュリンタグ、FLAGタグ、ヘマグルチニン（HA）タグ、ヒスチジンタグまたはHisタグともまた言われるポリヒスチジンタグ、マルトース結合蛋白質（MBP）タグ、nusタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（GST）タグ、緑色蛍光蛋白質（GFP）タグ、チオレドキシンタグ、Sタグ、Softag（例えば、Softag 1、Softag 3）、strepタグ、ビオチンリガーゼタグ、FlAsHタグ、V5タグ、およびSBPタグを包含するが、これに限定されない。追加の好適な配列は当業者には明らかであろう。いくつかの態様において、融合蛋白質は１つ以上のHisタグを含む。
いくつかの態様において、核酸編集ドメインはデアミナーゼである。例えば、いくつかの態様において、デアミナーゼドメインを有する例示的なCas9融合蛋白質の一般的構造は、構造：
[NH2]-[NLS]-[デアミナーゼ]-[Cas9]-[COOH]、
[NH2]-[Cas9]-[デアミナーゼ]-[COOH]、
[NH2]-[デアミナーゼ]-[Cas9]-[COOH]、または
[NH2]-[デアミナーゼ]-[Cas9]-[NLS]-[COOH]、
を含み、
NLSは核局在配列であり、NH2は融合蛋白質のＮ末端であり、COOHは融合蛋白質のＣ末端である。核局在配列は当分野において公知であり、当業者には明らかであろう。例えば、NLS配列はPlank et al., PCT/EP2000/011690に記載されており、その内容は、例示的な核局在配列のそれらの開示について、参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、NLSはアミノ酸配列PKKKRKV（配列番号７４１）またはMDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLC（配列番号７４２）を含む。いくつかの態様においては、リンカーがCas9とデアミナーゼとの間に挿入される。いくつかの態様において、NLSはCas9ドメインのＣ末端に位置する。いくつかの態様において、NLSはCas9ドメインのＮ末端に位置する。いくつかの態様において、NLSはデアミナーゼとCas9ドメインとの間に位置する。いくつかの態様において、NLSはデアミナーゼドメインのＮ末端に位置する。いくつかの態様において、NLSはデアミナーゼドメインのＣ末端に位置する。
核酸編集ドメインの１つの例示的な好適な型は、例えばAPOBECファミリーのシチジンデアミナーゼである。シチジンデアミナーゼ酵素のアポリポ蛋白質B mRNA編集複合体（APOBEC）ファミリーは、コントロールされた有益な様式で変異導入を開始させる用をなす１１個の蛋白質を包摂する２９。１つのファミリーメンバー、活性化誘導シチジンデアミナーゼ（AID）は、鎖の偏りがある転写依存的な様式でssDNA中のシトシンをウラシルに変換することによる抗体の成熟の要因である３０。アポリポ蛋白質B編集複合体３（APOBEC3）酵素は、逆転写されたウイルスssDNA中のシトシンの脱アミノ化によるある種のHIV-1株に対する防御をヒト細胞に提供する３１。これらの蛋白質は全て、触媒活性のためにZn2+配位モチーフ（His-X-Glu-X23-26-Pro-Cys-X2-4-Cys；配列番号５９８）と結合した水分子とを要求する。Glu残基は、脱アミノ化反応において、求核攻撃のために水分子を活性化して水酸化亜鉛にするために働く。各ファミリーメンバーはそれ自身の具体的な「ホットスポット」において選好的に脱アミノ化し、hAIDのWRC（WはAまたはTであり、RはAまたはGである）からhAPOBEC3FのTTCまでの範囲である３２。APOBEC3Gの触媒ドメインの最近の結晶構造は、６つのαヘリックスによってフランキングされた５本鎖βシートコアを含んでなる二次構造を明らかにしており、これはファミリー全体で保存されていると信じられている３３。活性中心ループは、ssDNA結合と「ホットスポット」アイデンティティーを決定することと両方の要因であることが示されている３４。これらの酵素の過剰発現はゲノム不安定性および癌にリンクされており、それゆえに配列特異的ターゲティングの重要性を強調している３５。
本開示のいくつかの側面は、APOBEC酵素などのシチジンデアミナーゼ酵素の活性がゲノムDNA中の特定の部位に導かれ得るという認識に関する。いずれかの具体的な理論によって拘束されようとすることはないが、Cas9を認識物質として用いる利点は、（１）Cas9の配列特異性が、単純にsgRNA配列を変化させることによって容易に変改され得るということと；（２）Cas9が、dsDNAを変性させることによってその標的配列に結合し、一本鎖であるDNAのストレッチ、よってデアミナーゼの適当な基質をもたらすということとを包含する。他の触媒ドメイン、または他のデアミナーゼからの触媒ドメインもまた、Cas9との融合蛋白質を創るために用いられ得るということと、本開示がこの点で限定されないということとは理解されるはずである。
本開示のいくつかの側面は、Cas9:デアミナーゼ融合蛋白質が、図３の付番スキームに従う位置３～１１のヌクレオチドを効率的に脱アミノ化し得るという認識に基づく。Cas9:デアミナーゼ融合蛋白質によってターゲティングされ得るヌクレオチドについて本明細書において提供される結果に鑑みて、当業者は、脱アミノ化されるべきヌクレオチドを含む標的配列に融合蛋白質をターゲティングするための好適なガイドRNAを設計する能力があるであろう。
いくつかの態様において、デアミナーゼドメインおよびCas9ドメインはリンカーによって互いに融合される。特定の用途について、デアミナーゼ活性のための最適な長さを達成するために、デアミナーゼドメイン（例えばAID）とCas9ドメインとの間の種々のリンカー長および柔軟性が使用され得る（例えば、形態(GGGGS)n（配列番号５）、(GGS)n、および(G)nの非常に柔軟なリンカーから、形態(EAAAK)n（配列番号６）、(SGGS)n（配列番号４２８８）、SGSETPGTSESATPES（配列番号７）（例えば、Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to Fok1 nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82参照；内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）、および(XP)nのより剛直なリンカーまでの範囲である）３６。いくつかの態様において、リンカーは(GGS)nモチーフを含み、nは１、３、または７である。いくつかの態様において、リンカーはSGSETPGTSESATPES（配列番号７）モチーフを含む。
本開示の側面に従ってCas9ドメインに融合され得るいくつかの例示的な好適な核酸編集ドメイン、例えばデアミナーゼおよびデアミナーゼドメインが、下で提供されている。いくつかの態様においては、それぞれの配列の活性ドメイン、例えば局在シグナル（核局在配列。核外移行シグナルなし、細胞質局在シグナル）なしのドメインが用いられ得るということは理解されるはずである。
ヒトAID：
Figure 0007067793000044
マウスAID：
Figure 0007067793000045
イヌAID：
Figure 0007067793000046
ウシAID：
Figure 0007067793000047
ラットAID：
Figure 0007067793000048
マウスAPOBEC-3：
Figure 0007067793000049
Figure 0007067793000050
ラットAPOBEC-3：
Figure 0007067793000051
アカゲザルAPOBEC-3G：
Figure 0007067793000052
チンパンジーAPOBEC-3G：
Figure 0007067793000053
 （斜体：核酸編集ドメイン；下線：細胞質局在シグナル）
ミドリザルAPOBEC-3G：
Figure 0007067793000054
ヒトAPOBEC-3G：
Figure 0007067793000055
ヒトAPOBEC-3F：
Figure 0007067793000056
ヒトAPOBEC-3B：
Figure 0007067793000057
Figure 0007067793000058
ラットAPOBEC-3B：
Figure 0007067793000059
ウシAPOBEC-3B：
Figure 0007067793000060
チンパンジーAPOBEC-3B：
Figure 0007067793000061
ヒトAPOBEC-3C：
Figure 0007067793000062
 （斜体：核酸編集ドメイン）
ゴリラAPOBEC-3C：
Figure 0007067793000063
ヒトAPOBEC-3A：
Figure 0007067793000064
アカゲザルAPOBEC-3A：
Figure 0007067793000065
ウシAPOBEC-3A：
Figure 0007067793000066
ヒトAPOBEC-3H：
Figure 0007067793000067
アカゲザルAPOBEC-3H：
Figure 0007067793000068
Figure 0007067793000069
ヒトAPOBEC-3D：
Figure 0007067793000070
ヒトAPOBEC-1：
Figure 0007067793000071
マウスAPOBEC-1：
Figure 0007067793000072
ラットAPOBEC-1：
Figure 0007067793000073
ヒトAPOBEC-2：
Figure 0007067793000074
Figure 0007067793000075
マウスAPOBEC-2：
Figure 0007067793000076
ラットAPOBEC-2：
Figure 0007067793000077
ウシAPOBEC-2：
Figure 0007067793000078
Petromyzon marinus CDA1 (pmCDA1)：
Figure 0007067793000079
ヒトAPOBEC3G D316R_D317R：
Figure 0007067793000080
Figure 0007067793000081
ヒトAPOBEC3G A鎖：
Figure 0007067793000082
ヒトAPOBEC3G A鎖 D120R_D121R：
Figure 0007067793000083
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質は、核酸編集酵素の全長アミノ酸、例えば上で提供されている配列の１つを含む。しかしながら、他の態様において、本明細書において提供される融合蛋白質は、核酸編集酵素の全長配列ではなくその断片のみを含む。例えば、いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質はCas9ドメインと核酸編集酵素の断片とを含み、例えば、断片は核酸編集ドメインを含む。核酸編集ドメインの例示的なアミノ酸配列は上の配列中では斜体文字として示されており、かかるドメインの追加の好適な配列は当業者には明らかであろう。
本発明の側面に従って用いられ得る、例えばヌクレアーゼ不活性型Cas9ドメインに融合され得る追加の好適な核酸編集酵素配列、例えばデアミナーゼ酵素およびドメイン配列は、本開示に基づいて当業者には明らかであろう。いくつかの態様において、かかる追加の酵素配列は、本明細書において提供される配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％類似であるデアミナーゼ酵素またはデアミナーゼドメイン配列を包含する。追加の好適なCas9ドメイン、バリアント、および配列は当業者には明らかであろう。かかる追加の好適なCas9ドメインの例は、D10A、D10A/D839A/H840A、およびD10A/D839A/H840A/N863A変異体ドメインを包含するが、これに限定されない（例えば、Prashant et al., CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838参照。その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの態様において、Cas9は、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列の位置８４０におけるヒスチジン残基、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含む。触媒残基H840の存在は、標的Cと反対のGを含有する編集されない鎖を切断するCas9の活性を回復させる。H840の回復は、Cを含有する標的鎖の切断はもたらさない。
Cas9ドメインとデアミナーゼドメインとを含む融合蛋白質を生成するための追加の好適な戦略は、当分野の一般的知識と組み合わせた本開示に基づいて当業者には明らかであろう。リンカーを用いて、またはリンカーの使用なしに、本開示の側面に従って融合蛋白質を生成するための好適な戦略もまた、本開示および当分野の知識に鑑みて当業者には明らかであろう。例えば、Gilbert et al., CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 2013; 154(2):442-51は、２つのNLSをリンカー（SPKKKRKVEAS、配列番号５９９）として用いたVP64とのCas9のＣ末端融合体が転写活性化に使用され得るということを示した。Mali et al., CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. 2013; 31(9):833-8は、リンカーなしのVP64とのＣ末端融合体が転写活性化に使用され得るということを報告しており、Maeder et al., CRISPR RNA-guided activation of endogenous human genes. Nat Methods. 2013; 10: 977-979は、Gly4Ser（配列番号５）リンカーを用いたVP64とのＣ末端融合体が転写活性化因子として使用され得るということを報告している。最近、dCas9-Fok1ヌクレアーゼ融合体が上首尾に生成されており、親のCas9酵素と比較して改善された酵素特異性を見せる（Guilinger JP, Thompson DB, Liu DR. Fusion of catalytically inactive Cas9 to Fok1 nuclease improves the specificity of genome modification. Nat. Biotechnol. 2014; 32(6): 577-82、およびTsai SQ, Wyvekens N, Khayter C, Foden JA, Thapar V, Reyon D, Goodwin MJ, Aryee MJ, Joung JK. Dimeric CRISPR RNA-guided Fokl nucleases for highly specific genome editing. Nat Biotechnol. 2014; 32(6):569-76. PMID: 24770325においては、SGSETPGTSESATPES（配列番号７）またはGGGGS（配列番号５）リンカーがそれぞれFok1-dCas9融合蛋白質に用いられている）。
本開示のいくつかの側面は、（ｉ）Cas9酵素またはドメイン（例えば、第１の蛋白質）と；（ｉｉ）核酸編集酵素またはドメイン（例えば、第２の蛋白質）とを含む融合蛋白質を提供する。いくつかの側面において、本明細書において提供される融合蛋白質は、さらに、（ｉｉｉ）プログラム可能なDNA結合蛋白質、例えばジンクフィンガードメイン、TALEまたは第２のCas9蛋白質（例えば第３の蛋白質）を包含する。いずれかの具体的な理論によって拘束されようとすることはないが、プログラム可能なDNA結合蛋白質（例えば、第２のCas9蛋白質）を（ｉ）Cas9酵素またはドメイン（例えば、第１の蛋白質）と；（ｉｉ）核酸編集酵素またはドメイン（例えば、第２の蛋白質）とを含む融合蛋白質に融合することは、標的核酸配列に対する融合蛋白質の特異性を改善するために、または古典的PAM（NGG）配列を含有しない標的核酸配列に結合するための融合蛋白質の特異性もしくは結合親和性を改善するために有用であり得る。いくつかの態様において、第３の蛋白質はCas9蛋白質である（例えば、第２のCas9蛋白質）。いくつかの態様において、第３の蛋白質は、本明細書において提供されるCas9蛋白質のいずれかである。いくつかの態様において、第３の蛋白質は、Cas9蛋白質（例えば、第１の蛋白質）のＮ末端において融合蛋白質に融合される。いくつかの態様において、第３の蛋白質は、Cas9蛋白質（例えば、第１の蛋白質）のＣ末端において融合蛋白質に融合される。いくつかの態様において、Cas9ドメイン（例えば、第１の蛋白質）および第３の蛋白質（例えば、第２のCas9蛋白質）はリンカー（例えば、第２のリンカー）によって融合される。いくつかの態様において、リンカーは、(GGGGS)n（配列番号５）、(G)n、(EAAAK)n（配列番号６）、(GGS)n、(SGGS)n（配列番号４２８８）、SGSETPGTSESATPES（配列番号７）、もしくは(XP)nモチーフ、またはこれらのいずれかの組み合わせを含み、nは独立して１および３０の間の整数である。いくつかの態様において、本明細書において提供される例示的なCas9融合蛋白質の一般的構造は、構造：
[NH2]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[Cas9]-[第３の蛋白質]-[COOH]；
[NH2]-[第３の蛋白質]-[Cas9]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[COOH]；
[NH2]-[Cas9]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[第３の蛋白質]-[COOH]；
[NH2]-[第３の蛋白質]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[Cas9]-[COOH]；
[NH2]-[UGI]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[Cas9]-[第３の蛋白質]-[COOH]；
[NH2]-[UGI]-[第３の蛋白質]-[Cas9]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[COOH]；
[NH2]-[UGI]-[Cas9]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[第３の蛋白質]-[COOH]；
[NH2]-[UGI]-[第３の蛋白質]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[Cas9]-[COOH]；
[NH2]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[Cas9]-[第３の蛋白質]-[UGI]-[COOH]；
[NH2]-[第３の蛋白質]-[Cas9]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[UGI]-[COOH]；
[NH2]-[Cas9]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[第３の蛋白質]-[UGI]-[COOH]；または
[NH2]-[第３の蛋白質]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[Cas9]-[UGI]-[COOH]；
を含み、
NH2は融合蛋白質のＮ末端であり、COOHは融合蛋白質のＣ末端である。いくつかの態様において、上の一般的構造に用いられる「]-[」は任意のリンカー配列の存在を示している。他の例において、本明細書において提供される例示的なCas9融合蛋白質の一般的構造は、構造：
[NH2]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[Cas9]-[第２のCas9蛋白質]-[COOH]；
[NH2]-[第２のCas9蛋白質]-[Cas9]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[COOH]；
[NH2]-[Cas9]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[第２のCas9蛋白質]-[COOH]；
[NH2]-[第２のCas9蛋白質]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[Cas9]-[COOH]；
[NH2]-[UGI]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[Cas9]-[第２のCas9蛋白質]-[COOH]；
[NH2]-[UGI]-[第２のCas9蛋白質]-[Cas9]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[COOH]；
[NH2]-[UGI]-[Cas9]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[第２のCas9蛋白質]-[COOH]；
[NH2]-[UGI]-[第２のCas9蛋白質]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[Cas9]-[COOH]；
[NH2]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[Cas9]-[第２のCas9蛋白質]-[UGI]-[COOH]；
[NH2]-[第２のCas9蛋白質]-[Cas9]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[UGI]-[COOH]；
[NH2]-[Cas9]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[第２のCas9蛋白質]-[UGI]-[COOH]；または
[NH2]-[第２のCas9蛋白質]-[核酸編集酵素もしくはドメイン]-[Cas9]-[UGI]-[COOH]、
を含み、
NH2は融合蛋白質のＮ末端であり、COOHは融合蛋白質のＣ末端である。いくつかの態様において、上の一般的構造に用いられる「]-[」は任意のリンカー配列の存在を示している。いくつかの態様において、第２のCas9はdCas9蛋白質である。いくつかの例において、本明細書において提供される例示的なCas9融合蛋白質の一般的構造は、図３に示されている構造を含む。例示的なCas9融合蛋白質の一般的構造のいずれかの中の提供される蛋白質のいずれかが、本明細書において提供されるリンカーの１つ以上によって繋がれ得るということは理解されるはずである。いくつかの態様において、リンカー同士は同じである。いくつかの態様において、リンカー同士は異なる。いくつかの態様において、例示的なCas9融合蛋白質の一般的構造のいずれかの中の提供される蛋白質の１つ以上は、リンカーによって融合されない。いくつかの態様において、融合蛋白質は、さらに核ターゲティング配列、例えば核局在配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質はさらに核局在配列（NLS）を含む。いくつかの態様において、NLSは融合蛋白質のＮ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSは融合蛋白質のＣ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSは第３の蛋白質のＮ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSは第３の蛋白質のＣ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSはCas9蛋白質のＮ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSはCas9蛋白質のＣ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSは核酸編集酵素またはドメインのＮ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSは核酸編集酵素またはドメインのＣ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSはUGI蛋白質のＮ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSはUGI蛋白質のＣ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSは１つ以上のリンカーによって融合蛋白質に融合される。いくつかの態様において、NLSはリンカーなしで融合蛋白質に融合される。
ウラシルグリコシラーゼ阻害剤融合蛋白質
本開示のいくつかの側面は、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（UGI）ドメインを含む融合蛋白質に関する。いくつかの態様において、Cas9ドメイン（例えば、ヌクレアーゼ活性なCas9ドメイン、ヌクレアーゼ不活性型dCas9ドメイン、またはCas9ニッカーゼ）を含む本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかは、さらに、直接的にまたはリンカーによってどちらかでUGIドメインに融合され得る。本開示のいくつかの側面は、増大した核酸塩基編集効率を有するデアミナーゼ-dCas9融合蛋白質、デアミナーゼ-ヌクレアーゼ活性Cas9融合蛋白質、およびデアミナーゼ-Cas9ニッカーゼ融合蛋白質を提供する。いずれかの具体的な理論によって拘束されようとすることはないが、U:Gヘテロ二本鎖DNAの存在に対する細胞のDNA修復応答が、細胞の核酸塩基編集効率の減少の要因であり得る。例えば、ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）は細胞内のDNAからのUの除去を触媒し、これは、U:G対からC:G対の復帰変異を最も共通のアウトカムとする塩基除去修復を開始させ得る。下の例において実証されているように、ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤（UGI）はヒトUDG活性を阻害し得る。それゆえに、本開示は、さらにUGIドメインに融合されたdCas9-核酸編集ドメインを含む融合蛋白質を企図する。本開示は、さらにUGIドメインに融合されたCas9ニッカーゼ-核酸編集ドメインを含む融合蛋白質をもまた企図する。UGIドメインの使用が、C->U変化を触媒することができる核酸編集ドメインの編集効率を増大させ得るということは理解されるはずである。例えば、UGIドメインを含む融合蛋白質は、C残基を脱アミノ化することがより効率的であり得る。いくつかの態様において、融合蛋白質は、構造：
[デアミナーゼ]-[任意のリンカー配列]-[dCas9]-[任意のリンカー配列]-[UGI]；
[デアミナーゼ]-[任意のリンカー配列]-[UGI]-[任意のリンカー配列]-[dCas9]；
[UGI]-[任意のリンカー配列]-[デアミナーゼ]-[任意のリンカー配列]-[dCas9]；
[UGI]-[任意のリンカー配列]-[dCas9]-[任意のリンカー配列]-[デアミナーゼ]；
[dCas9]-[任意のリンカー配列]-[デアミナーゼ]-[任意のリンカー配列]-[UGI]；または
[dCas9]-[任意のリンカー配列]-[UGI]-[任意のリンカー配列]-[デアミナーゼ]、
を含む。
他の態様において、融合蛋白質は、構造：
[デアミナーゼ]-[任意のリンカー配列]-[Cas9ニッカーゼ]-[任意のリンカー配列]-[UGI]；
[デアミナーゼ]-[任意のリンカー配列]-[UGI]-[任意のリンカー配列]-[Cas9ニッカーゼ]；
[UGI]-[任意のリンカー配列]-[デアミナーゼ]-[任意のリンカー配列]-[Cas9ニッカーゼ]；
[UGI]-[任意のリンカー配列]-[Cas9ニッカーゼ]-[任意のリンカー配列]-[デアミナーゼ]；
[Cas9ニッカーゼ]-[任意のリンカー配列]-[デアミナーゼ]-[任意のリンカー配列]-[UGI]；または
[Cas9ニッカーゼ]-[任意のリンカー配列]-[UGI]-[任意のリンカー配列]-[デアミナーゼ]、
を含む。
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質はリンカー配列を含まない。いくつかの態様においては、任意のリンカー配列の１つまたは両方が存在する。
いくつかの態様において、上の一般的構造に用いられる「-」は任意のリンカー配列の存在を示している。いくつかの態様において、UGIを含む融合蛋白質は、さらに核ターゲティング配列、例えば核局在配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質はさらに核局在配列（NLS）を含む。いくつかの態様において、NLSは融合蛋白質のＮ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSは融合蛋白質のＣ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSはUGI蛋白質のＮ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSはUGI蛋白質のＣ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSはCas9蛋白質のＮ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSはCas9蛋白質のＣ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSはデアミナーゼのＮ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSはデアミナーゼのＣ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSは第２のCas9のＮ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSは第２のCas9のＣ末端に融合される。いくつかの態様において、NLSは１つ以上のリンカーによって融合蛋白質に融合され得る。いくつかの態様において、NLSはリンカーなしで融合蛋白質に融合され得る。いくつかの態様において、NLSは、本明細書において提供または参照されるNLS配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、NLSは、配列番号７４１または配列番号７４２に示されているアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様において、UGIドメインは、野生型UGI、または配列番号６００に示されているUGIを含む。いくつかの態様において、本明細書において提供されるUGI蛋白質は、UGIの断片、およびUGIまたはUGI断片と相同な蛋白質を包含する。例えば、いくつかの態様において、UGIドメインは、配列番号６００に示されるアミノ酸配列の断片を含む。いくつかの態様において、UGI断片は、配列番号６００に示されているアミノ酸配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、UGIは、配列番号６００に示されるアミノ酸配列と相同なアミノ酸配列、または配列番号６００に示されるアミノ酸配列の断片と相同なアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、UGIもしくはUGIの断片またはUGIもしくはUGI断片のホモログを含む蛋白質は、「UGIバリアント」と言われる。UGIバリアントはUGIまたはその断片との相同性を持ち合う。例えば、UGIバリアントは、野生型UGI、または配列番号６００に示されているUGIと少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または少なくとも９９．９％同一である。いくつかの態様において、UGIバリアントはUGIの断片を含み、断片は、野生型UGI、または配列番号６００に示されているUGIの対応する断片と少なくとも７０％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、少なくとも９９．５％同一、または少なくとも９９．９％である。いくつかの態様において、UGIは次のアミノ酸配列を含む：
>sp|P14739|UNGI_BPPB2ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤
Figure 0007067793000084
好適なUGI蛋白質およびヌクレオチド配列が本明細書において提供されており、追加の好適なUGI配列は当業者に公知であり、例えばWang et al., Uracil-DNA glycosylase inhibitor gene of bacteriophage PBS2 encodes a binding protein specific for uracil-DNA glycosylase. J. Biol. Chem. 264: 1163-1171(1989)；Lundquist et al., Site-directed mutagenesis and characterization of uracil-DNA glycosylase inhibitor protein. Role of specific carboxylic amino acids in complex formation with Escherichia coli uracil-DNA glycosylase. J. Biol. Chem. 272:21408-21419(1997)；Ravishankar et al., X-ray analysis of a complex of Escherichia coli uracil DNA glycosylase (EcUDG) with a proteinaceous inhibitor. The structure elucidation of a prokaryotic UDG. Nucleic Acids Res. 26:4880-4887(1998)；およびPutnam et al., Protein mimicry of DNA from crystal structures of the uracil-DNA glycosylase inhibitor protein and its complex with Escherichia coli uracil-DNA glycosylase. J. Mol. Biol. 287:331-346(1999)に公開されているものを包含し、それぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
追加の蛋白質がウラシルグリコシラーゼ阻害剤であり得るということは理解されるはずである。例えば、ウラシルDNAグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害する（例えば、立体的にブロックする）ことができる他の蛋白質は、本開示の範囲内である。加えて、塩基除去修復をブロックまたは阻害するいずれかの蛋白質もまた、本開示の範囲内である。いくつかの態様においては、DNAに結合する蛋白質が用いられる。別の態様においては、UGIの代理物が用いられる。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、一本鎖DNAに結合する蛋白質である。例えば、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、Erwinia tasmaniensis一本鎖結合蛋白質であり得る。いくつかの態様において、一本鎖結合蛋白質はアミノ酸配列（配列番号３２２）を含む。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、ウラシルに結合する蛋白質である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、DNA中のウラシルに結合する蛋白質である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は触媒不活性型のウラシルDNAグリコシラーゼ蛋白質である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、DNAからウラシルを切り出さない触媒不活性型のウラシルDNAグリコシラーゼ蛋白質である。例えば、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤はUdgXである。いくつかの態様において、UdgXはアミノ酸配列（配列番号３２３）を含む。別の例として、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は触媒不活性型UDGである。いくつかの態様において、触媒不活性型UDGはアミノ酸配列（配列番号３２４）を含む。他のウラシルグリコシラーゼ阻害剤が本開示の範囲内であり、当業者には明らかであろうということは理解されるはずである。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、配列番号３２２～３２４のいずれか１つと相同である蛋白質である。いくつかの態様において、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤は、配列番号３２２～３２４のいずれか１つと少なくとも５０％同一、少なくとも５５％同一、少なくとも６０％同一、少なくとも６５％同一、少なくとも７０％同一、少なくとも７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％同一、少なくとも９８％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である蛋白質である。
Erwinia tasmaniensis SSB（熱安定性（themostable）一本鎖DNA結合蛋白質）
Figure 0007067793000085
Figure 0007067793000086
Figure 0007067793000087
Figure 0007067793000088
いくつかの態様において、核酸編集ドメインはデアミナーゼドメインである。いくつかの態様において、デアミナーゼはシトシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはアポリポ蛋白質B mRNA編集複合体（APOBEC）ファミリーデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC1デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC2デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Aデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Bデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Cデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Dデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Eデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Fデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Gデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC3Hデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼはAPOBEC4デアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼは活性化誘導デアミナーゼ（AID）である。いくつかの態様において、デアミナーゼ（demianse）はラットAPOBEC1である（配列番号２８２）。いくつかの態様において、デアミナーゼ（demianse）はヒトAPOBEC1である（配列番号２８４）。いくつかの態様において、デアミナーゼはPetromyzon marinusシチジンデアミナーゼ１（pmCDA1）である。いくつかの態様において、デアミナーゼ（demianse）はヒトAPOBEC3Gである（配列番号２７５）。いくつかの態様において、デアミナーゼはヒトAPOBEC3Gの断片である（配列番号５７４０）。いくつかの態様において、デアミナーゼは、D316R D317R変異を含むヒトAPOBEC3Gバリアントである（配列番号５７３９）。いくつかの態様において、デアミナーゼはヒトAPOBEC3Gの断片（frantment）であり、配列番号２７５におけるD316R D317R変異に対応する変異を含んでいる（配列番号５７４１）。
いくつかの態様において、リンカーは(GGGS)n（配列番号２６５）、(GGGGS)n（配列番号５）、(G)n、(EAAAK)n（配列番号６）、(GGS)n、SGSETPGTSESATPES（配列番号７）、もしくは(XP)nモチーフ、またはこれらのいずれかの組み合わせを含み、nは独立して１および３０の間の整数である。
好適なUGI蛋白質およびヌクレオチド配列が本明細書において提供されており、追加の好適なUGI配列は当業者に公知であり、例えばWang et al., Uracil-DNA glycosylase inhibitor gene of bacteriophage PBS2 encodes a binding protein specific for uracil-DNA glycosylase. J. Biol. Chem. 264: 1163-1171(1989)；Lundquist et al., Site-directed mutagenesis and characterization of uracil-DNA glycosylase inhibitor protein. Role of specific carboxylic amino acids in complex formation with Escherichia coli uracil-DNA glycosylase. J. Biol. Chem. 272:21408-21419(1997)；Ravishankar et al., X-ray analysis of a complex of Escherichia coli uracil DNA glycosylase (EcUDG) with a proteinaceous inhibitor. The structure elucidation of a prokaryotic UDG. Nucleic Acids Res. 26:4880-4887(1998)；およびPutnam et al., Protein mimicry of DNA from crystal structures of the uracil-DNA glycosylase inhibitor protein and its complex with Escherichia coli uracil-DNA glycosylase. J. Mol. Biol. 287:331-346(1999)に公開されているものを包含し、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、任意のリンカーは(GGS)nモチーフを含み、nは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０である。いくつかの態様において、任意のリンカーは(GGS)nモチーフを含み、nは１、３、または７である。いくつかの態様において、任意のリンカーはアミノ酸配列SGSETPGTSESATPES（配列番号７）を含み、これは例においてはXTENリンカーともまた言われる。
いくつかの態様において、Cas9ニッカーゼは、ゲノムがインビボで編集される生物において、編集されない鎖上の塩基の除去をさらに促し得る。本明細書に記載されるCas9ニッカーゼは、配列番号１０のD10A変異、または配列番号１１～２６０のいずれかにおける対応する変異を含み得る。いくつかの態様において、本開示のCas9ニッカーゼは、配列番号１０の変異８４０におけるヒスチジン、または配列番号１１～２６０のいずれかにおける対応する残基を含み得る。Cas9ニッカーゼを含むかかる融合蛋白質は、標的DNA配列の単一鎖、例えば編集されようとしていない鎖を切断し得る。いずれかの具体的な理論によって拘束されようとすることはないが、この切断は、デアミナーゼによって作られたC->U編集を後戻りさせるミスマッチ修復メカニズムを阻害し得る。
ガイドRNAとのCas9複合体
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかと融合蛋白質のCas9ドメイン（例えば、dCas9、ヌクレアーゼ活性Cas9、またはCas9ニッカーゼ）に結合したガイドRNAとを含む複合体を提供する。
いくつかの態様において、ガイドRNAは１５～１００ヌクレオチドの長さであり、標的配列に対して相補的である少なくとも１０個の一続きのヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様において、ガイドRNAは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ガイドRNAは、標的配列に対して相補的である１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の一続きのヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様において、標的配列はDNA配列である。いくつかの態様において、標的配列は哺乳動物のゲノム中の配列である。いくつかの態様において、標的配列はヒトのゲノム中の配列である。いくつかの態様において、標的配列の３’末端は古典的PAM配列（NGG）に直ちに隣接する。いくつかの態様において、ガイドRNAは、疾患または異常に関連する配列に対して相補的である。いくつかの態様において、ガイドRNAは、表１～３のいずれか１つに開示されている遺伝子から選択される遺伝子の変異を有する、疾患または異常に関連する配列に対して相補的である。いくつかの態様において、ガイドRNAは、表２または表３によって提供されるガイド配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。本開示の複合体によってターゲティングされ得るヒトゲノム中の例示的な配列は、本明細書においては表１～３に提供されている。
Cas9融合蛋白質を用いる方法
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供されるCas9蛋白質、融合蛋白質、または複合体を用いる方法を提供する。例えば、本開示のいくつかの側面は、DNA分子を（ａ）本明細書において提供されるCas9蛋白質または融合蛋白質のいずれか、および少なくとも１つのガイドRNA；あるいは（ｂ）本明細書において提供される少なくとも１つのgRNAとのCas9蛋白質、Cas9融合蛋白質、またはCas9蛋白質もしくは融合蛋白質複合体と接触させることを含む方法を提供し、ガイドRNAは約１５～１００ヌクレオチドの長さであり、標的配列に対して相補的である少なくとも１０個の一続きのヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様において、標的配列の３’末端は古典的PAM配列（NGG）に直ちには隣接しない。いくつかの態様において、標的配列の３’末端はAGC、GAG、TTT、GTG、またはCAA配列に直ちに隣接する。
いくつかの態様において、標的DNA配列は、疾患または異常に関連する配列を含む。いくつかの態様において、標的DNA配列は疾患または異常に関連する点変異を含む。いくつかの態様において、Cas9蛋白質、Cas9融合蛋白質、または複合体の活性は点変異の修正をもたらす。いくつかの態様において、標的DNA配列は疾患または異常に関連するT->C点変異を含み、変異体C塩基の脱アミノ化は、疾患または異常に関連しない配列をもたらす。いくつかの態様において、標的DNA配列は蛋白質をコードし、点変異はコドン中にあり、野生型コドンと比較して変異体コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらす。いくつかの態様において、変異体Cの脱アミノ化は、変異体コドンによってコードされるアミノ酸の変化をもたらす。いくつかの態様において、変異体Cの脱アミノ化は、野生型アミノ酸をコードするコドンをもたらす。いくつかの態様において、接触は、対象に対してインビボである。いくつかの態様において、対象は疾患または異常を有するか、またはそれと診断されている。いくつかの態様において、疾患または異常は、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、表皮剥離性角質増殖症（ＥＨＫ）、シャルコー・マリー・トゥース病４Ｊ型、神経芽腫（ＮＢ）、フォン・ヴィレブランド病（ｖＷＤ）、先天性ミオトニー、遺伝性腎アミロイドーシス、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、遺伝性リンパ浮腫、家族性アルツハイマー病、ＨＩＶ、プリオン病、慢性乳児神経皮膚関節症候群（ＣＩＮＣＡ）、デスミン関連ミオパチー（ＤＲＭ）、変異体PI3KCA蛋白質、変異体CTNNB1蛋白質、変異体HRAS蛋白質、または変異体p53蛋白質に関連する新生物疾患である。
いくつかの態様は、本明細書において提供されるCas9 DNA編集融合蛋白質を用いるための方法を提供する。いくつかの態様において、融合蛋白質は、標的核酸塩基、例えばC残基を脱アミノ化することによって核酸に点変異を導入するために用いられる。いくつかの態様において、標的核酸塩基の脱アミノ化は、遺伝子欠損の修正、例えば遺伝子産物の機能喪失に至る点変異の修正をもたらす。いくつかの態様において、遺伝子欠損は、疾患または異常、例えばリソソーム蓄積異常または例えばＩ型糖尿病などの代謝疾患に関連する。いくつかの態様において、本明細書において提供される方法は、疾患または異常に関連する遺伝子産物をコードする遺伝子またはアレルに不活性化点変異を導入するために用いられる。例えば、いくつかの態様においては、不活性化点変異を癌遺伝子に導入するために（例えば、増殖性疾患の処置に）Cas9 DNA編集融合蛋白質を使用する方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様においては、不活性化変異はコード配列中に未成熟ストップコドンを創り得、これが、短縮された遺伝子産物、例えば全長蛋白質の機能を欠く短縮された蛋白質の発現をもたらす。
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法の目的は、ゲノム編集によって、機能不全の遺伝子の機能を回復させることである。本明細書において提供されるCas9デアミナーゼ融合蛋白質は、例えばヒト細胞培養物の疾患関連変異を修正することによって、遺伝子編集に基づくヒト治療についてインビトロでバリデーションされ得る。本明細書において提供される融合蛋白質、例えばCas9ドメインと核酸デアミナーゼドメインとを含む融合蛋白質が、いずれかの単一のT->CまたはA->G点変異を修正するために用いられ得るということは当業者によって理解されるであろう。第１のケースにおいては、変異体CからUに戻る脱アミノ化は変異を修正し、後者のケースにおいては、変異体Gと塩基対形成しているCの脱アミノ化、次に複製の１ラウンドが変異を修正する。
提供される融合蛋白質によってインビトロまたはインビボで修正され得る例示的な疾患に関係する変異は、PI3KCA蛋白質のH1047R（A3140G）多型である。ホスホイノシチド－３－キナーゼ触媒アルファサブユニット（PI3KCA）蛋白質は、ホスファチジルイノシトールのイノシトール環の３－ＯＨ基をリン酸化するために働く。PI3KCA遺伝子は多くの異なる癌腫において変異していることが見出されており、それゆえに、これは強力な癌遺伝子であると見なされる３７。事実、A3140G変異は例えばHCT116、SKOV3、およびT47D細胞株などの数個のNCI-60癌細胞株に存在しており、これらはAmerican Type Culture Collection（ATCC）からたやすく利用可能である３８。
いくつかの態様において、修正されるべき変異をはらむ細胞、例えば点変異、例えばPI3KCA蛋白質にH1047R置換をもたらすPI3KCA遺伝子のエキソン２０のA3140G点変異をはらむ細胞は、Cas9デアミナーゼ融合蛋白質、およびコードするPI3KCA遺伝子中のそれぞれの変異部位に融合蛋白質をターゲティングする適切に設計されたsgRNAをコードする発現コンストラクトと接触させられる。コントロール実験が行われ得、sgRNAは、PI3KCA遺伝子内にある非C残基に融合酵素をターゲティングするように設計される。処置された細胞のゲノムDNAが抽出され、PI3KCA遺伝子の関係する配列がＰＣＲ増幅およびシーケンシングされて、融合蛋白質の活性をヒト細胞培養物によって評価し得る。
PI3KCAの点変異を修正する例は例解の目的で提供されており、本開示を限定することを意味されていないということは理解されるであろう。当業者は、本開示のDNA編集融合蛋白質が、他の癌、および他の増殖性疾患を包含する癌以外の疾患に関連する他の点変異および変異を修正するために用いられ得るということを理解するであろう。
疾患関連遺伝子およびアレルの点変異の上首尾な修正は、治療および基礎研究に用途を有する遺伝子修正のための新たな戦略を開く。Cas9とデアミナーゼ酵素またはドメインとの開示される融合体のような、部位特異的な一塩基改変システムは、「逆」遺伝子治療にもまた用途を有し、ある種の遺伝子機能が故意に抑圧または喪失される。それらのケースにおいて、Trp（TGG）、Gln（CAAおよびCAG)、またはArg（CGA）残基を未成熟ストップコドン（TAA、TAG、TGA）に部位特異的変異させることは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで蛋白質機能を喪失させるために用いられ得る。
本開示は、本明細書において提供されるCas9 DNA編集融合蛋白質によって修正され得る点変異に関連するかまたはそれによって引き起こされる疾患と診断された、対象の処置のための方法を提供する。例えば、いくつかの態様においては、かかる疾患、例えば上に記載されているPI3KCA点変異に関連する癌を有する対象に、点変異を修正または疾患関連遺伝子に不活性化変異を導入するCas9デアミナーゼ融合蛋白質の有効量を投与することを含む方法が提供される。いくつかの態様において、疾患は増殖性疾患である。いくつかの態様において、疾患は遺伝子疾患である。いくつかの態様において、疾患は新生物疾患である。いくつかの態様において、疾患は代謝疾患である。いくつかの態様において、疾患はリソソーム蓄積症である。点変異を修正または疾患関連遺伝子に不活性化変異を導入することによって処置され得る他の疾患は、当業者には公知であろう。本開示はこの点で限定されない。
本開示は、追加の疾患または異常、例えば、デアミナーゼによって媒介される遺伝子編集によって修正され得る点変異に関連するかまたはそれによって引き起こされる疾患または異常の処置のための方法を提供する。いくつかのかかる疾患は本明細書に記載されており、本明細書において提供される戦略および融合蛋白質によって処置され得る追加の好適な疾患は、本開示に基づいて当業者には明らかであろう。例示的な好適な疾患および異常が下に挙げられている。それぞれの配列中の特定の位置または残基の付番は、具体的な蛋白質および用いられる付番スキームに依存するということは理解されるであろう。付番は、例えば成熟蛋白質の前駆体および成熟蛋白質それ自体では異なり得、種間の配列の違いは付番に影響し得る。当業者は、当分野において周知の方法によって、例えば配列アラインメントおよび相同な残基の決定によって、いずれかの相同な蛋白質およびそれぞれのコードする核酸中のそれぞれの残基を同定する能力があるであろう。例示的な好適な疾患および異常は、限定なしに、嚢胞性線維症（例えば、Schwank et al., Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients. Cell stem cell. 2013; 13: 653-658；およびWu et. al., Correction of a genetic disease in mouse via use of CRISPR-Cas9. Cell stem cell. 2013; 13: 659-662参照。これらのいずれも、遺伝子欠損を修正するためにデアミナーゼ融合蛋白質を用いてはいない）；フェニルケトン尿症－例えば、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ遺伝子の位置８３５（マウス）もしくは２４０（ヒト）または相同な残基におけるフェニルアラニンからセリンへの変異（T>C変異）－例えばMcDonald et al., Genomics. 1997; 39:402-405参照；ベルナール・スーリエ症候群（ＢＳＳ）－例えば、血小板糖糖蛋白質ＩＸの位置５５もしくは相同な残基におけるフェニルアラニンからセリンへの変異、または残基２４もしくは相同な残基におけるシステインからアルギニン（T>C変異）－例えばNoris et al., British Journal of Haematology. 1997; 97: 312-320およびAli et al., Hematol. 2014; 93: 381-384参照；表皮剥離性角質増殖症（ＥＨＫ）－例えば、ケラチン１の位置１６０または１６１（開始メチオニンをカウントする場合）または相同な残基におけるロイシンからプロリンへの変異（T>C変異）－例えばChipev et al., Cell. 1992; 70: 821-828参照、www.uniprot.orgのUNIPROTデータベースのアクセッション番号P04264もまた参照；慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）－例えば、α１－アンチトリプシンのプロセシングされた形態の位置５４もしくは５５（開始メチオニンをカウントする場合）または相同な残基、あるいは非プロセシング形態の残基７８もしくは相同な残基におけるロイシンからプロリンへの変異（T>C変異）－例えばPoller et al., Genomics. 1993; 17: 740-743参照、UNIPROTデータベースのアクセッション番号P01011もまた参照；シャルコー・マリー・トゥース病４Ｊ型－例えば、FIG4の位置４１または相同な残基におけるイソロイシンからトレオニンへの変異（T>C変異）－例えばLenk et al, PLoS Genetics. 2011; 7: e1002104参照；神経芽腫（ＮＢ）－例えば、カスパーゼ９の位置１９７または相同な残基におけるロイシンからプロリンへの変異（T>C変異）－例えばKundu et al., 3 Biotech. 2013, 3:225-234参照；フォン・ヴィレブランド病（ｖＷＤ）－例えば、フォン・ヴィレブランド因子のプロセシングされた形態の位置５０９もしくは相同な残基、またはフォン・ヴィレブラン因子の非プロセシング形態の位置１２７２もしくは相同な残基におけるシステインからアルギニンへの変異（T>C変異）－例えばLavergne et al., Br. J. Haematol. 1992参照、UNIPROTデータベースのアクセッション番号P04275もまた参照；82: 66-72；先天性ミオトニー－例えば、筋肉型塩化物イオンチャネル遺伝子CLCN1の位置２７７または相同な残基におけるシステインからアルギニンへの変異（T>C変異）－例えばWeinberger et al., The J. of Physiology. 2012; 590: 3449-3464参照；遺伝性腎アミロイドーシス－例えば、アポリポ蛋白質ＡＩＩのプロセシングされた形態の位置７８もしくは相同な残基、または非プロセシング形態の位置１０１もしくは相同な残基におけるストップコドンからアルギニンへの変異（T>C変異）－例えばYazaki et al., Kidney Int. 2003; 64: 11-16参照；拡張型心筋症（ＤＣＭ）－例えば、FOXD4遺伝子の位置１４８または相同な残基におけるトリプトファンからアルギニンへの変異（T>C変異）、例えばMinoretti et. al., Int. J. of Mol. Med. 2007; 19: 369-372参照；遺伝性リンパ浮腫－例えば、VEGFR3チロシンキナーゼの位置１０３５または相同な残基におけるヒスチジンからアルギニンへの変異（A>G変異）、例えばIrrthum et al, Am. J. Hum. Genet. 2000; 67: 295-301参照；家族性アルツハイマー病－例えば、プレセニリン１の位置１４３または相同な残基におけるイソロイシンからバリンへの変異（A>G変異）、例えばGallo et. al., J. Alzheimer's disease. 2011; 25: 425-431参照；プリオン病－例えば、プリオン蛋白質の位置１２９または相同な残基におけるメチオニンからバリンへの変異（A>G変異）－例えばLewis et. al., J. of General Virology. 2006; 87: 2443-2449参照；慢性乳児神経皮膚関節症候群（ＣＩＮＣＡ）－例えば、クリオピリンの位置５７０または相同な残基におけるチロシンからシステインへの変異（A>G変異）－例えばFujisawa et. al. Blood. 2007; 109: 2903-2911参照；ならびにデスミン関連ミオパチー（ＤＲＭ）－例えば、αβクリスタリンの位置１２０または相同な残基におけるアルギニンからグリシンへの変異（A>G変異）－例えばKumar et al., J. Biol. Chem. 1999; 274: 24137-24141参照、を包含する。全ての参照およびデータベースエントリーの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
本開示は、病因性のT>CまたはA>G変異を含む遺伝子のリストを提供する。それらの遺伝子の名称、それらのそれぞれの配列番号、それらの遺伝子ＩＤ、および変異部位をフランキングする配列が、本明細書において提供される（表２および３）。いくつかの場合においては、それらの遺伝子の変異を修正するために用いられ得るgRNA配列が開示される（表２および３）。
いくつかの態様において、Cas9-デアミナーゼ融合蛋白質は古典的PAMを認識し、よって、それぞれフランキング配列中に古典的PAM、例えばNGGを有する病因性のT>CまたはA>G変異を修正し得る（表２および３、配列番号２５４０～２７０２および５０８４～５２６０に挙げられている）。例えば、古典的PAMを認識するCas9蛋白質は、配列番号１０によって提供されるStreptococcus pyogenes Cas9のアミノ酸配列、または配列番号１０のRuvCおよびHNHドメインを含むその断片と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。
本明細書において開示されるCas9:核酸編集酵素／ドメイン融合蛋白質を、標的部位、例えば編集されるべき点変異を含む部位にターゲティングするためには、典型的には、Cas9:核酸編集酵素／ドメイン融合蛋白質をガイドRNA、例えばsgRNAと一緒に共発現することが必要であるということは当業者には明らかであろう。本明細書の他所により詳細に説明されているように、典型的には、ガイドRNAは、Cas9結合を許すtracrRNAフレームワークと、配列特異性をCas9:核酸編集酵素／ドメイン融合蛋白質に付与するガイド配列とを含む。いくつかの態様において、ガイドRNAは構造5'-[ガイド配列]-guuuuagagcuagaaauagcaaguuaaaauaaaggcuaguccguuaucaacuugaaaaaguggcaccgagucggugcuuuuu-3'（配列番号６０１）を含み、ガイド配列は、標的配列に対して相補的である配列を含む。典型的には、ガイド配列は２０ヌクレオチドの長さである。Cas9:核酸編集酵素／ドメイン融合蛋白質を特定のゲノム標的部位にターゲティングするための好適なガイドRNAの配列は、本開示に基づいて当業者には明らかであろう。典型的には、かかる好適なガイドRNA配列は、編集されるべき標的ヌクレオチドの５０ヌクレオチド以内上流または下流の核酸配列に対して相補的であるガイド配列を含む。Cas9:核酸編集酵素／ドメイン融合蛋白質を特定の標的配列にターゲティングするために好適ないくつかの例示的なガイドRNA配列が、下で提供されている。
塩基編集因子効率
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかが、indelの有意な割合を生成することなしに特定のヌクレオチド塩基を改変することができるという認識に基づく。本明細書において用いられる「indel」は、核酸へのヌクレオチド塩基の挿入または欠失を言う。かかる挿入または欠失は、遺伝子のコード領域内のフレームシフト変異に至り得る。いくつかの態様においては、核酸中に多数の挿入または欠失（すなわちindel）を生成することなしに、核酸中の特定のヌクレオチドを効率的に改変する（例えば変異させるかまたは脱アミノ化する）塩基編集因子を創ることが望ましい。ある種の態様において、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかは、indelと比べて、意図される改変（例えば、点変異または脱アミノ化）のより高い割合を生成することができる。いくつかの態様において、本明細書において提供される塩基編集因子は、１：１超である意図される点変異対indelの比を生成することができる。いくつかの態様において、本明細書において提供される塩基編集因子は、少なくとも１．５：１、少なくとも２：１、少なくとも２．５：１、少なくとも３：１、少なくとも３．５：１、少なくとも４：１、少なくとも４．５：１、少なくとも５：１、少なくとも５．５：１、少なくとも６：１、少なくとも６．５：１、少なくとも７：１、少なくとも７．５：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１２：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも２００：１、少なくとも３００：１、少なくとも４００：１、少なくとも５００：１、少なくとも６００：１、少なくとも７００：１、少なくとも８００：１、少なくとも９００：１、もしくは少なくとも１０００：１、またはより多くである意図される点変異対indelの比を生成することができる。意図される変異およびindelの数は、いずれかの好適な方法、例えば下の例に用いられている方法を用いて決定され得る。
いくつかの態様において、本明細書において提供される塩基編集因子は、核酸のある領域におけるindelの形成を限定することができる。いくつかの態様において、領域は、塩基編集因子によってターゲティングされるヌクレオチド、または塩基編集因子によってターゲティングされるヌクレオチドから２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド以内の領域である。いくつかの態様において、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかは、核酸のある領域におけるindelの形成を、１％未満、１．５％未満、２％未満、２．５％未満、３％未満、３．５％未満、４％未満、４．５％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、または２０％未満に限定することができる。ある核酸領域において形成されるindelの数は、核酸（例えば、細胞のゲノム中の核酸）が塩基編集因子に対して暴露される時間の量に依存する。いくつかの態様において、indelの数または割合は、塩基編集因子に対する核酸（例えば、細胞のゲノム中の核酸）の暴露の少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１０日、または少なくとも１４日の後に決定される。
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかが、意図されない点変異などの意図されない変異の有意な数を生成することなしに、核酸（例えば、対象のゲノム中の核酸）中の点変異などの意図される変異を効率的に生成することができるという認識に基づく。いくつかの態様において、意図される変異は、意図される変異を創るように特異的に設計されたgRNAに結合した特異的な塩基編集因子によって生成する変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、疾患または異常に関連する変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、疾患または異常に関連するシトシン（C）->チミン（T）点変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、疾患または異常に関連するグアニン（G）->アデニン（A）点変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、遺伝子のコード領域内のシトシン（C）->チミン（T）点変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、遺伝子のコード領域内のグアニン（G）->アデニン（A）点変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、ストップコドン、例えば未成熟ストップコドンを遺伝子のコード領域内に創る点変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、ストップコドンを消去する変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、遺伝子のスプライシングを変改する変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、遺伝子の制御配列（例えば、遺伝子プロモーターまたは遺伝子リプレッサー）を変改する変異である。いくつかの態様において、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかは、１：１超である意図される変異対意図されない変異の比（例えば、意図される点変異：意図されない点変異）を生成することができる。いくつかの態様において、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかは、少なくとも１．５：１、少なくとも２：ｌ、少なくとも２．５：１、少なくとも３：ｌ、少なくとも３．５：１、少なくとも４：ｌ、少なくとも４．５：１、少なくとも５：１、少なくとも５．５：１、少なくとも６：１、少なくとも６．５：１、少なくとも７：１、少なくとも７．５：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１２：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも１５０：１、少なくとも２００：１、少なくとも２５０：１、少なくとも５００：１、もしくは少なくとも１０００：１、またはより多くである、意図される変異対意図されない変異の比（例えば、意図される点変異：意図されない点変異）を生成することができる。本明細書において「塩基編集因子効率」の項に記載されている塩基編集因子の性質が、本明細書において提供される融合蛋白質、または融合蛋白質を用いる方法のいずれかに適用され得るということは理解されるはずである。
核酸を編集するための方法
本開示のいくつかの側面は、核酸を編集するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、核酸の核酸塩基（例えば、二本鎖DNA配列の塩基対）を編集するための方法である。いくつかの態様において、方法は、ａ）核酸（例えば、二本鎖DNA配列）の標的領域を、塩基編集因子（例えば、シチジンデアミナーゼドメインに融合したCas9ドメイン）およびガイド核酸（例えばgRNA）を含む複合体と接触させ、標的領域が標的の核酸塩基対を含むステップと、ｂ）前記標的領域において鎖分離を誘導するステップと、ｃ）標的領域の単一鎖上の前記標的核酸塩基対の第１の核酸塩基を第２の核酸塩基に変換するステップと、ｄ）前記標的領域の１つの鎖だけを切るステップと、を含み、第１の核酸塩基に対して相補的な第３の核酸塩基が、第２の核酸塩基に対して相補的な第４の核酸塩基によって置き換えられ；方法は、核酸中における２０％未満のindel形成をもたらす。いくつかの態様においてステップｂが省かれるということは理解されるはずである。いくつかの態様において、第１の核酸塩基はシトシンである。いくつかの態様において、第２の核酸塩基は脱アミノ化されたシトシンまたはウラシルである。いくつかの態様において、第３の核酸塩基はグアニンである。いくつかの態様において、第４の核酸塩基はアデニンである。いくつかの態様において、第１の核酸塩基はシトシンであり、第２の核酸塩基は脱アミノ化されたシトシン、またはウラシルであり、第３の核酸塩基はグアニンであり、第４の核酸塩基はアデニンである。いくつかの態様において、方法は、１９％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、４％、２％、１％、０．５％、０．２％未満、または０．１％未満のindel形成をもたらす。いくつかの態様において、方法は、さらに、第４の核酸塩基に対して相補的である第５の核酸塩基によって第２の核酸塩基を置き換えることを含み、それによって、意図される編集された塩基対を生成する（例えば、C:G->T:A）。いくつかの態様において、第５の核酸塩基はチミンである。いくつかの態様においては、意図される塩基対の少なくとも５％が編集される。いくつかの態様においては、意図される塩基対の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％が編集される。
いくつかの態様において、標的ヌクレオチド中の意図される産物対意図されない産物の比は、少なくとも２：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、もしくは２００：１、またはより多くである。いくつかの態様において、意図される点変異対indel形成の比は、１：１、１０：１、５０：１、１００：１、５００：１、もしくは１０００：１超、またはより多くである。いくつかの態様において、切られる単一鎖（ニックが入る鎖）はガイド核酸にハイブリダイゼーションする。いくつかの態様において、切られる単一鎖は、第１の核酸塩基を含む鎖とは反対である。いくつかの態様において、塩基編集因子はCas9ドメインを含む。いくつかの態様において、第１の塩基はシトシンであり、第２の塩基はG、C、A、またはTではない。いくつかの態様において、第２の塩基はウラシルである。いくつかの態様において、第１の塩基はシトシンである。いくつかの態様において、第２の塩基はG、C、A、またはTではない。いくつかの態様において、第２の塩基はウラシルである。いくつかの態様において、塩基編集因子は、編集された鎖の塩基除去（escision）修復を阻害する。いくつかの態様において、塩基編集因子は、編集されない鎖を保護またはそれに結合する。いくつかの態様において、塩基編集因子はUGI活性を含む。いくつかの態様において、塩基編集因子はニッカーゼ活性を含む。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対はPAM部位の上流である。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対は、PAM部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド上流である。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対はPAM部位の下流である。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対は、PAM部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド下流である。いくつかの態様において、方法は古典的（例えばNGG）PAM部位を要求しない。いくつかの態様において、核酸塩基編集因子はリンカーを含む。いくつかの態様において、リンカーは長さが１～２５アミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは長さが５～２０アミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸である。いくつかの態様において、標的領域は標的ウインドウを含み、標的ウインドウは標的核酸塩基対を含む。いくつかの態様において、標的ウインドウは１～１０ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、標的ウインドウは長さが１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、または１ヌクレオチドである。いくつかの態様において、標的ウインドウは長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドである。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対は標的ウインドウ内にある。いくつかの態様において、標的ウインドウは、意図される編集された塩基対を含む。いくつかの態様において、方法は、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかを用いて行われる。いくつかの態様において、標的ウインドウは脱アミノ化ウインドウである。
いくつかの態様において、本開示は、ヌクレオチドを編集するための方法を提供する。いくつかの態様において、本開示は、二本鎖DNA配列の核酸塩基対を編集するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、ａ）二本鎖DNA配列の標的領域を、塩基編集因子およびガイド核酸（例えばgRNA）を含む複合体と接触させ、標的領域が標的核酸塩基対を含むこと、ｂ）前記標的領域において鎖分離を誘導すること、ｃ）標的領域の単一鎖上の前記標的核酸塩基対の第１の核酸塩基を第２の核酸塩基に変換すること、ｄ）前記標的領域の１つの鎖だけを切ること、を含み、第１の核酸塩基に対して相補的な第３の核酸塩基が、第２の核酸塩基に対して相補的な第４の核酸塩基によって置き換えられ、第２の核酸塩基が、第４の核酸塩基に対して相補的な第５の核酸塩基によって置き換えられ、それによって、意図される編集された塩基対を生成し、意図される編集された塩基対を生成する効率は少なくとも５％である。いくつかの態様においてステップｂが省かれるということは理解されるはずである。いくつかの態様においては、意図される塩基対の少なくとも５％が編集される。いくつかの態様においては、意図される塩基対の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％が編集される。いくつかの態様において、方法は、１９％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、４％、２％、１％、０．５％、０．２％未満、または０．１％未満のindel形成を引き起こす。いくつかの態様において、標的ヌクレオチドにおける意図される産物対意図されない産物の比は、少なくとも２：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、もしくは２００：１、またはより多くである。いくつかの態様において、意図される点変異対indel形成の比は、１：１、１０：１、５０：１、１００：１、５００：１、もしくは１０００：１超、またはより多くである。いくつかの態様において、切られる単一鎖はガイド核酸にハイブリダーゼーションする。いくつかの態様において、切られる単一鎖は、第１の核酸塩基を含む鎖とは反対である。いくつかの態様において、第１の塩基はシトシンである。いくつかの態様において、第２の核酸塩基はG、C、A、またはTではない。いくつかの態様において、第２の塩基はウラシルである。いくつかの態様において、塩基編集因子は編集された鎖の塩基除去（escision）修復を阻害する。いくつかの態様において、塩基編集因子は編集されない鎖を保護またはそれに結合する。いくつかの態様において、核酸塩基編集因子はUGI活性を含む。いくつかの態様において、核酸塩基編集因子（edit）はニッカーゼ活性を含む。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対はPAM部位の上流である。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対は、PAM部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド上流である。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対はPAM部位の下流である。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対は、PAM部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド下流である。いくつかの態様において、方法は古典的（例えばNGG）PAM部位を要求しない。いくつかの態様において、核酸塩基編集因子はリンカーを含む。いくつかの態様において、リンカーは長さが１～２５アミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは長さが５～２０アミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸である。いくつかの態様において、標的領域は標的ウインドウを含み、標的ウインドウは標的核酸塩基対を含む。いくつかの態様において、標的ウインドウは１～１０ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、標的ウインドウは長さが１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、または１ヌクレオチドである。いくつかの態様において、標的ウインドウは長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドである。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対は、標的ウインドウ内に存在する。いくつかの態様において、標的ウインドウは意図される編集された塩基対を含む。いくつかの態様において、核酸塩基編集因子は本明細書において提供される塩基編集因子のいずれか１つである。
キット、ベクター、細胞
本開示のいくつかの側面は、（ａ）本明細書において提供されるCas9蛋白質またはCas9融合蛋白質をコードするヌクレオチド配列と；（ｂ）（ａ）の配列の発現を駆動する異種プロモーターとを含む、核酸コンストラクトを含むキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、さらに、ガイドRNAバックボーンをコードする発現コンストラクトを含み、コンストラクトは、ガイドRNAバックボーン中への標的配列と同一または相補的な核酸配列のクローニングを許すように位置したクローニング部位を含む。
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される融合蛋白質のCas9蛋白質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示のいくつかの側面は、かかるポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターは、ポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む。
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供されるCas9蛋白質、融合蛋白質、融合蛋白質をコードする核酸分子、Cas9蛋白質およびgRNAを含む複合体、ならびに／またはベクターを含む細胞を提供する。
上のレポーターシステムの例示的な態様の記載は、例解の目的でのみ提供されており、限定することを意味されていない。追加のレポーターシステム、例えば上で詳細に記載されている例示的なシステムのバリエーションもまた、本開示によって包摂される。
例１：Cas9デアミナーゼ融合蛋白質
多数のCas9：デアミナーゼ融合蛋白質が生成され、生成された融合物のデアミナーゼ活性が特徴付けられた。以下のデアミナーゼを試験した：
Figure 0007067793000089
Figure 0007067793000090
Figure 0007067793000091
ssDNAに対するデアミナーゼ活性．脱アミノ化のためのUSER（ウラシル特異的切り出し試薬）酵素に基づくアッセイを使用して、一本鎖DNA（ssDNA）基質に対する種々のデアミナーゼの活性を試験した。USER酵素はNew England Biolabsから得た。ssDNA基質には、標的シトシン残基を異なる位置に提供した。ssDNAのシトシン標的残基の脱アミノ化は標的シトシンからウラシルへの変換をもたらす。USER酵素はウラシル塩基を切り出し、ssDNAバックボーンをその位置で切断し、ssDNA基質をDNAの２つのより短い断片に切る。いくつかのアッセイにおいて、ssDNA基質は、１つの末端を色素によって、例えば５’のCy3標識（下のスキーム中の＊）によって標識される。鎖の脱アミノ化、切り出し、および切断後に、基質は電気泳動に付され得、基質とそれから遊離したいずれかの断片とは、標識を検出することによって可視化され得る。Cy5がイメージングされる（images）ところでは、標識を有する断片のみがイメージングによって可視であろう。
１つのUSER酵素アッセイにおいては、試験された種々のデアミナーゼの標的配列にマッチするssDNA基質を用いた。試験されたデアミナーゼをコードする発現カセットを、以前に研究室で用いたCMVバックボーンプラスミド（Addgeneプラスミド５２９７０）に挿入した。デアミナーゼ蛋白質は、TNT Quick Coupled転写／翻訳システム（Promega）を用いて製造者の推奨に従って発現した。インキュベーションの９０ｍｉｎの後に、ライセートの５ｍＬを、５’Cy3標識されたssDNA基質およびUSER酵素（NEB）の１単位と３時間インキュベーションした。DNAを１０％ＴＢＥ－ＰＡＧＥゲルによって分離し、DNAはCy色素イメージングを用いてイメージングした。USER酵素アッセイの概略図（schematic reparesentation）は図４１に示されている。
図１は、Doench 1、Doench 2、G7’およびVEGF Target 2などのssDNA基質に対して試験したデアミナーゼのデアミナーゼ活性を示す。rAPOBEC1酵素は、古典的なNGG PAMを用いて一本鎖DNA基質に対して相当量の脱アミノ化を示したが、ネガティブコントロールの非古典的なNNN PAMを用いた場合では示さなかった。
APOBECファミリーのデアミナーゼとのCas9融合蛋白質が生成された。以下の融合物を構築し、ssDNAに対して試験した：
Figure 0007067793000092
Figure 0007067793000093
Figure 0007067793000094
Figure 0007067793000095
Figure 0007067793000096
Figure 0007067793000097
Figure 0007067793000098
図２は、Ｎ末端デアミナーゼ融合体が一本鎖DNA基質に対する有意な活性を示したということを示している。この理由から、Ｎ末端構造のみをさらなる実験に選んだ。
図３は、デアミナーゼdCas9：sgRNA複合体による二本鎖DNA基質結合を示す。多数の二本鎖デアミナーゼ基質配列が生成された。配列は以下の通りである。図３による構造はこれらの配列（36bp：下線、sgRNA標的配列：太字；PAM：四角；21bp：斜体）において同定される。すべての基質を5’-Cy3標識で標識した：
Figure 0007067793000099
Figure 0007067793000100
図４は二本鎖DNA脱アミノ化アッセイの結果を示している。融合体を発現し、Ni-NTAおよびセファロースクロマトグラフィー両方によって、Ｎ末端Ｈｉｓ６タグによって精製した。dsDNA基質によって脱アミノ化を評価するために、以前のスライドに示されている種々のdsDNA基質を１：８のdsDNA:融合蛋白質比でインキュベーションし、３７℃において２時間インキュベーションした。ひとたび融合体のdCas9部分がDNAに結合すると、これはDNAへのUSER酵素のアクセスをブロックする。よって、インキュベーション後に融合蛋白質を変性させ、dsDNAをスピンカラムによって精製し、次に、USER酵素との４５ｍｉｎのインキュベーション、およびもたらされたDNA基質および基質断片の１０％ＴＢＥ－尿素ゲルによる分離をした。
図５は、Cas9融合体が二本鎖DNA標的配列の位置３～１１をターゲティングし得るということを実証している（図３の概略に従って付番）。上のゲル：１μＭのrAPOBEC1-GGS-dCas9、１２５ｎＭのdsDNA、１ｅｑのsgRNA。中央のゲル：１μＭのrAPOBEC1-(GGS)3-dCas9、１２５ｎＭのdsDNA、１ｅｑのsgRNA。下のゲル：１．８５μＭのrAPOBEC1-XTEN-dCas9、１２５ｎＭのdsDNA、１ｅｑのsgRNA。これらのゲルからのデータに基づくと、位置３～１１（図３の付番に従う）はデアミナーゼの活性に対して充分に暴露されて、試験された融合蛋白質によってターゲティングされる。最も蓋然的には、他の位置へのデアミナーゼのアクセスはdCas9蛋白質によってブロックされる。
さらに、データは、３アミノ酸のみのリンカー（GGS）が、デアミナーゼがDNAの一本鎖部分にアクセスすることを可能にすることにとって最適ではないということを示している。９アミノ酸リンカー［(GGS)3］（配列番号５９６）、およびより構造化された１６アミノ酸リンカー（XTEN）は、より効率的な脱アミノ化を許す。
図６は、正しいガイドRNA、例えば正しいsgRNAが、デアミナーゼ活性には要求されるということを実証している。ゲルは、デアミナーゼをdCas9に融合すると、デアミナーゼ酵素が配列特異的になり（例えば、融合体をeGFP sgRNAと用いることは脱アミノ化をもたらさない）、dsDNAを脱アミノ化する能力をもまたデアミナーゼに付与するということを示している。デアミナーゼ酵素の本来の基質はssDNAであり、sgRNAを追加しなかったときには脱アミノ化は起こらなかった。これは、APOBECデアミナーゼそれ自体ではdsDNAを脱アミノ化しないという報告された知識と一致している。データは、Cas9が短いウインドウ内の二本鎖DNAヘリックスを開き、一本鎖DNAを露出させ、これはそれからシチジン脱アミノ化のためにAPOBECデアミナーゼにとってアクセス可能であるということを示している。用いたsgRNA配列は下で提供されている。配列（３６ｂｐ：下線；sgRNA標的配列：太字；PAM：枠囲み；２１ｂｐ：斜体）
DNA配列８：
Figure 0007067793000101
例２：DNA標的配列の脱アミノ化
例示的な脱アミノ化標的．本明細書に記載されるdCas9:デアミナーゼ融合蛋白質は、細胞にインビトロもしくはエクスビボで、または対象にインビボで送達され得、標的ヌクレオチドがPAMに対して位置３～１１にあるときには、C->TまたはG->A変移を生ぜしめるために用いられ得る。例示的な脱アミノ化ターゲットは、限定なしに次を包含する：CCR5短縮：CCR5のQ93、Q102、Q186、R225、W86、またはQ261をコードするコドンのいずれかが脱アミノ化されてストップコドンを創り得、これはＨＩＶ処置への用途を有するCCR5の非機能的な短縮をもたらす。APOE4変異：C11RおよびC57R変異体APOE4蛋白質をコードする変異体コドンが脱アミノ化されて、アルツハイマーの処置への用途を有する野生型アミノ酸に復帰変異し得る。eGFP短縮：Q158、Q184、Q185をコードするコドンのいずれかが脱アミノ化されてストップコドンを創り得、またはM1をコードするコドンが脱アミノ化されてIをコードし得、これらの全ては、レポーターシステムへの用途を有するeGFP蛍光の損失をもたらす。eGFP回復：実質的な蛍光を見せないT65AまたはY66C変異体GFPをコードする変異体コドンが脱アミノ化されて、野生型アミノ酸を回復させ、蛍光を付与し得る。PIK3CA変異：K111E変異体PIK3CAをコードする変異体コドンが脱アミノ化されて、癌への用途を有する野生型アミノ酸残基を回復させ得る。CTNNB1変異：T41A変異体CTNNB1をコードする変異体コドンが脱アミノ化されて、癌への用途を有する野生型アミノ酸残基を回復させ得る。HRAS変異：Q61R変異体HRASをコードする変異体コドンが脱アミノ化されて、癌への用途を有する野生型アミノ酸残基を回復させ得る。P53変異：Y163C、Y236C、またはN239D変異体p53をコードする変異体コドンのいずれかが脱アミノ化されて、癌への用途を有する野生型アミノ酸配列をコードし得る。二本鎖DNA中のこれらの標的配列を脱アミノ化することの実行可能性が、図７および８において実証されている。図７は、デアミナーゼ-dCas9:sgRNA複合体によるインビボの標的配列の標的DNA結合のメカニズムを例解している。
図８は、例示的な疾患関連標的配列の上首尾な脱アミノ化を示している。上のゲル：CCR5 Q93：ｐｏｓ．１０のコード鎖標的（位置２、５、６、８、９に潜在的なオフターゲット）；CCR5 Q102：ｐｏｓ．９のコード鎖標的（位置１、１２、１４に潜在的なオフターゲット）；CCR5 Q186：ｐｏｓ．９のコード鎖標的（位置１、５、１５に潜在的なオフターゲット）；CCR5 R225：ｐｏｓ．６のコード鎖標的（潜在的なオフターゲットなし）；eGFP Q158：ｐｏｓ．５のコード鎖標的（位置１、１３、１６に潜在的なオフターゲット）；eGFP Q184/185：ｐｏｓ．４および７のコード鎖標的（位置３、１２、１４、１５、１６、１７、１８に潜在的なオフターゲット）；eGFP M1：ｐｏｓ．１２の鋳型鎖標的（位置２、３、７、９、１１に潜在的なオフターゲット）（位置７および９を小さい程度にターゲティングする）；eGFP T65A：ｐｏｓ．７の鋳型鎖標的（位置１、８、１７に潜在的なオフターゲット）；PIK3CA K111E：ｐｏｓ．２の鋳型鎖標的（位置５、８、１０、１６、１７に潜在的なオフターゲット）；PIK3CA K111E：ｐｏｓ．１３の鋳型鎖標的（位置１１、１６、１９に潜在的なオフターゲット）X。下のゲル：CCR5 W86：ｐｏｓ．２および３の鋳型鎖標的（位置１、１３に潜在的なオフターゲット）X；APOE4 C11R：ｐｏｓ．１１のコード鎖標的（位置７、１３、１６、１７に潜在的なオフターゲット）；APOE4 C57R：ｐｏｓ．５のコード鎖標的（位置７、８、１２に潜在的なオフターゲット）；eGFP Y66C：ｐｏｓ．１１の鋳型鎖標的（位置１、４、６、８、９、１６に潜在的なオフターゲット）；eGFP Y66C：ｐｏｓ．３の鋳型鎖標的（位置１、８、１７に潜在的なオフターゲット）；CCR5 Q261：ｐｏｓ．１０のコード鎖標的（位置３、５、６、９、１８に潜在的なオフターゲット）；CTNNB1 T41A：ｐｏｓ．７の鋳型鎖標的（位置１、１３、１５、１６に潜在的なオフターゲット）X；HRAS Q61R：ｐｏｓ．６の鋳型鎖標的（位置１、２、４、５、９、１０、１３に潜在的なオフターゲット）；p53 Y163C：ｐｏｓ．６の鋳型鎖標的（位置２、１３、１４に潜在的なオフターゲット）；p53 Y236C：ｐｏｓ．８の鋳型鎖標的（位置２、４に潜在的なオフターゲット）；p53 N239D：ｐｏｓ．４の鋳型鎖標的（位置６、８に潜在的なオフターゲット）。疾患標的の例示的なDNA配列は下に提供されている（PAM（5'-NGG-3'）および標的位置は枠囲みされている）：
Figure 0007067793000102
Figure 0007067793000103
例３：ウラシルグリコシラーゼ阻害剤融合は脱アミノ化効率を改善する
dCas9:デアミナーゼ融合蛋白質による哺乳類細胞における直接的でプログラム可能な核酸塩基編集の効率は、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（UGI）をdCas9:デアミナーゼ融合蛋白質に融合することによって有意に改善され得る。
図９は、rAPOBEC1-XTEN-dCas9を用いたヒトHEK293細胞におけるインビトロC→T編集効率を示す：
Figure 0007067793000104
Figure 0007067793000105
Figure 0007067793000106
 プロトスペーサー配列は以下の通りであった：
Figure 0007067793000107
図１０は、UGIドメインがrAPOBEC1：dCas9融合蛋白質に融合されるとき、HEK293T細胞における同じプロテオスペーサー配列のC→T編集効率が大幅に強化されることを示す。
Figure 0007067793000108
Figure 0007067793000109
Figure 0007067793000110
図９および１０のパーセンテージは、標的配列の両方の鎖をシーケンシングすることから示されている。鎖の１つのみが脱アミノ化の基質であるので、このアッセイにおける最大の可能な脱アミノ化値は５０％である。従って、脱アミノ化効率は表に示されているパーセンテージの倍である。例えば、５０％という値は二本鎖標的配列の１００％の脱アミノ化に関する。ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（UGI）をdCas9:デアミナーゼ融合蛋白質に融合したときには（例えば、rAPOBEC1-XTEN-dCas9-[UGI]-NLS）、細胞における編集効率の有意な増大が観察された。この結果は、哺乳類細胞において、U:G塩基対からウラシル塩基を切り出すDNA修復機構がDNA編集の律速プロセスであるということを示している。UGIをdCas9:デアミナーゼ融合蛋白質にテザリングすることは、編集収率を大いに増大させる。
UGIなしでは、ヒト細胞における典型的な編集効率は～２～１４％の収率範囲であった（図９および図１０、「XTEN」エントリー）。UGIありでは（図１０、「UGI」エントリー）、編集は～６～４０％の範囲で観察された。それゆえに、UGI融合体を用いることは、点変異を修正することに加えて過剰なindelをもまた作り出すＨＤＲを経由して点変異を修正する現行の代替的な方法よりも、効率的である。indelはcas9:デアミナーゼ:UGI融合体による処置からはもたらされないということが観察された。
例４：二本鎖DNA切断なしのゲノムDNA中の標的ヌクレオチドの直接的でプログラム可能な変換
現行のゲノム編集テクノロジーは、遺伝子修正への第１のステップとして、目当ての標的ローカスに二本鎖DNA切断を導入する３９，４０。大部分の遺伝子疾患は単一の核酸塩基から異なる核酸塩基への変異から生起するが、かかる変化を復帰変異させるための現行のアプローチは非常に非効率的であり、典型的には、二本鎖DNA切断に対する細胞の応答の帰結として、標的ローカスにおける大量のランダムな挿入および欠失（indel）を誘導する３９，４０。本明細書においては、二本鎖DNAバックボーン切断を要求することなしに、プログラム可能な様式の１つの標的核酸塩基から別のものへの直接的変換を可能にするゲノム編集のための新たな戦略、核酸塩基編集の開発が報告される。CRISPR/Cas9の融合体を操作した。ガイドRNAによってプログラムされる能力を保持するシチジンデアミナーゼ酵素APOBEC1は、二本鎖DNA切断を誘導せず、シチジンからウラシルへの直接的変換を媒介し、それによって、DNA複製、DNA修復、または鋳型鎖がターゲティングされる場合には転写後に、C->T（またはG->A）置換を生ぜしめる。もたらされる「核酸塩基編集因子」は、およそ５ヌクレオチドのウインドウ内のシチジンを変換するし、ヒト疾患に関係する種々の点変異をインビトロで効率的に修正し得る。４つの形質転換されたヒトおよびマウス細胞株において、それぞれウラシルグリコシラーゼ阻害剤（UGI）を融合し、編集されない鎖をターゲティングするCas9ニッカーゼを用いる第２および第３世代核酸塩基編集因子は、核酸塩基編集に対する細胞のDNA修復応答を克服し得、ヒト細胞内の合計の細胞のDNAの３７％または（～１５～７５％）までの永久的な修正をもたらし、最小限の（典型的には≦１％）indel形成である。対照的に、同じ標的における古典的なCas9によって媒介されるＨＤＲは平均で０．７％の修正を生み、４％のindel形成であった。核酸塩基編集因子を用いて、ヒト乳癌およびリンパ腫細胞においては２つの発癌性p53変異を野生型アレルに復帰変異させ、マウスアストロサイトにおいてはApoE4のアルツハイマー病関連Argコドンを非疾患関連Cysコドンに変換した。塩基編集は、点変異のゲノム編集の範囲および効率を拡大する。
Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat（CRISPR）システムは原核生物の適応免疫システムであり、これは種々の生物および細胞株においてゲノム操作を媒介するように改作されてきた４１。CRISPR/Cas9蛋白質-RNA複合体はガイドRNAとの塩基対形成によって標的DNA配列に局在し、本来的には、ガイドRNAによって規定されるローカスにおいてDNA二本鎖切断（ＤＳＢ）を作り出す。ＤＳＢに応答して、内在性のDNA修復プロセスは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によってDNA切断の部位に主としてランダムな挿入または欠失（indel）をもたらす。相同なDNA鋳型の存在下においては、切断部位の周辺のDNAは相同組換え修復（ＨＤＲ）によって置き換えられ得る。疾患関連遺伝子の単純な破壊が十分である（例えば、いくつかの機能獲得型疾患を処置するために）ときには、標的特異的DNA切断、次にindel形成が有効であり得る。しかしながら、大部分の公知の遺伝子疾患では、遺伝子の確率的な破壊よりもむしろ標的ローカスにおける点変異の修正が、疾患の底にある原因を対処または研究するために必要とされる６８。
この必要を動機として、研究者は、ＨＤＲの効率を増大させ、ＮＨＥＪを抑圧するために鋭意の努力を投入した。例えば、ＮＨＥＪ経路の必須酵素のリガーゼＩＶの低分子阻害剤は、ＨＤＲ効率を増大させることが示されている４２，４３。しかしながら、この戦略は典型的にはＨＤＲを下方制御する有糸分裂後細胞では難しく、その治療上の妥当性は、非標的細胞のリガーゼＩＶを阻害する潜在的リスクによって限定される。向上したＨＤＲ効率は、化学的に同調された細胞へのCas9-ガイドRNA複合体の時間調節された送達によって達成され得る。なぜなら、ＨＤＲ効率は高度に細胞周期依存的であるからである４４。しかしながら、細胞を同調させることは高度に破壊的であるので、かかるアプローチは細胞培養による研究用途に限定される。これらの開発にもかかわらず、ＨＤＲを用いて点変異を置き換えるための現行の戦略は、大部分の文脈において、特に未改変の非分裂細胞には非常に非効率的である（典型的には～０．１から５％）４２，４３，４５，４６，７５。加えて、ＨＤＲは二本鎖切断の解消の間にＮＨＥＪと競合し、一般的には、indelが遺伝子置き換えよりも大量なアウトカムである。これらの観察は、二本鎖DNA切断を作り出すことに頼らないゲノムDNAの特異的改変を実装するための代替的なアプローチを開発する必要を強調している。ＮＨＥＪ経路の必須酵素のリガーゼＩＶの低分子阻害剤は、ＨＤＲ効率を増大させることが示されている４２，４３。しかしながら、この戦略は典型的にはＨＤＲを下方制御する有糸分裂後細胞では難しく、その治療上の妥当性は、非標的細胞のリガーゼＩＶを阻害する潜在的リスクによって限定される。向上したＨＤＲ効率は、化学的に同調された細胞へのCas9-ガイドRNA複合体の時間調節された送達によってもまた達成され得る。なぜなら、ＨＤＲ効率は高度に細胞周期依存的であるからである４４。しかしながら、細胞を同調させることは高度に破壊的であるので、かかるアプローチは細胞培養による研究用途に限定される。いくつかのケースにおいては、上首尾なＨＤＲの産物がPAM配列の変異を含有し、よってもはや爾後のCas9改変の基質ではないようにＨＤＲ鋳型を設計し、ＨＤＲ産物の総体的収率を増大させることが可能であるが７５、かかるアプローチは産物配列に制約を課す。最近、この戦略は、非標的鎖に対して相補的であるssDNAドナーおよび高効率リボ核蛋白質（ＲＮＰ）送達とカップリングされて、ＨＤＲの効率を実質的に増大させたが、それらのケースにおいてさえも、ＨＤＲ対ＮＨＥＪアウトカムの比は比較的低い（＜２）８３。
DNAバックボーン切断を要求することなしの、プログラム可能な標的ローカスにおける１つの核酸塩基から別のものへの変換の直接的な触媒反応は、望まれないランダムなindelを目当てのローカスに導入することなしに、ＨＤＲに対して相対的に遺伝子修正の効率を増大させ得るということが見込まれた。そのヌクレアーゼ活性を不活性化するAsp10AlaおよびHis840Ala変異を含有する触媒不活性型Cas9（dCas9）は、ガイドRNAによってプログラムされた様式でDNAに結合するその能力を保持しているが、DNAバックボーンを切断しない１６，４７。原理的には、１つの核酸塩基から別のものへの直接的変換を媒介する酵素または化学触媒とのdCas9のコンジュゲーションは、RNAによってプログラムされた核酸塩基編集を可能にし得る。シトシン（C）の脱アミノ化はシチジンデアミナーゼによって触媒され２９、ウラシル（U）をもたらし、これはチミン（T）の塩基対形成特性を有する。ガイドRNAによって規定されるDNAローカスにおいてCをUに変換するそれらの能力を試験するために、dCas9をシチジンデアミナーゼ酵素に融合した。大部分の公知のシチジンデアミナーゼはRNAに作用し、DNAを受け入れることが公知である少ない例は一本鎖DNAを要求する４８。dCas9-標的DNA複合体についての最近の研究は、置き換えられるDNA鎖の少なくとも９ヌクレオチドがCas9:ガイドRNA:DNAの「Ｒループ」複合体の形成によって非対合化するということを明らかにしている１２。実に、Cas9のＲループ複合体の構造中において、置き換えられるDNA鎖上のプロトスペーサーの始めの１１ヌクレオチドは乱雑になっており、それらの動きが高度には制限されていないということを示唆している７６。非鋳型鎖上のシトシンにおけるCas9ニッカーゼによって誘導される変異は、細胞のシチジンデアミナーゼ酵素によるそれらのアクセス性から生起し得るということもまた推測されている７７。dCas9-標的DNA複合体についての最近の研究は、非鋳型鎖上の少なくとも２６塩基が、Cas9がその標的DNA配列に結合するときに非対合化するということを明らかにしている４９。Ｒループ中の一本鎖DNAのこのストレッチのサブセットは、dCas9がテザリングされたシチジンデアミナーゼの基質としての用をなして、DNA中のCからUの直接的でプログラム可能な変換を生ぜしめ得ると推論された（図１１Ａ）。
４つの異なるシチジンデアミナーゼ酵素（hAID、hAPOBEC3G、rAPOBEC1、およびpmCDA1）を、哺乳類細胞ライセート由来のインビトロ転写－翻訳システムによって発現し、ssDNA脱アミノ化について評価した。４つの酵素のうち、rAPOBEC1は試験された条件下において最も高いデアミナーゼ活性を示し、dCas9融合実験に選んだ（図３６Ａ）。rAPOBEC1をdCas9のＣ末端に付加することはデアミナーゼ活性を喪失させるが、dCas9のＮ末端への融合は、未融合の酵素のものに同等のレベルのssDNAに対するデアミナーゼ活性を維持する。４つのrAPOBEC1-dCas9融合体を、異なる長さおよび組成のリンカーによって発現および精製し（図３６Ｂ）、各融合体を、インビトロにおいて、シングルガイドRNA（sgRNA）によってプログラムされたdsDNA脱アミノ化について評価した（図１１Ａから１１Ｃおよび図１５Ａから１５Ｄ）。効率的、配列特異的、sgRNA依存的なC->U変換がインビトロで観察された（図１１Ａから１１Ｃ）。変換効率は、長さが９アミノ酸を超えるrAPOBEC1-dCas9リンカーを用いて最高であった。脱アミノ化に感受性の位置の数（脱アミノ化「活性ウインドウ」）は、リンカー長が３から２１アミノ酸に延長されると増大した（図３６Ｃから３６Ｆ、１５Ａから１５Ｄ）。１６残基XTENリンカー５０は、これらの２つの特性の間における有望なバランスを提供することが見出され、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）から遠位の末端を位置１としてカウントして、プロトスペーサー内の位置４から８のおよそ５ヌクレオチドという効率的な脱アミノ化ウインドウであった。rAPOBEC1-XTEN-dCas9蛋白質は第１世代核酸塩基編集因子（NBE1）としての用をなした。
理論上はC->T核酸塩基編集によって修正され得るヒト疾患に関係する７つの変異を選出し、対応する配列の二本鎖DNAの８０ｍｅｒを合成し、インビトロでこれらの変異を修正するNBE1の能力を評価した（図１６Ａから１６Ｂ）。NBE1は、インビトロのこれらの７つの標的の６つについて、標的Cの、または複数のCが存在するときには活性ウインドウ内の少なくとも１つのCの効率的な編集と一致する産物を生み、４４％という平均の見かけ上の編集効率であった（図１６Ａから１６Ｂ）。複数のCが脱アミノ化ウインドウ内に存在する３つのケースにおいて、それらのシトシンのいくつかまたは全ての脱アミノ化の証拠が観察された。試験された７つのケースの１つのみにおいて、編集された産物の実質的な収率が観察された（図１６Ａから１６Ｂ）。APOBEC1基質の好ましい配列文脈はCCまたはTCであると報告されているが５１、標的ローカスへのdCas9結合によって媒介されるデアミナーゼとその一本鎖DNA基質との増大した有効モル濃度は、この制限を緩め得るということが予期された。NBE1の配列文脈の一般性を解き明かすために、単一の修理されるCをプロトスペーサー内の位置７に含有する６０ｍｅｒの二本鎖DNAオリゴヌクレオチド、ならびにプロトスペーサー塩基１～６および８～１３を他の３塩基のそれぞれに個々に変えた全ての３６個の一重変異したバリアントを編集するその能力をアッセイした。これらの３７個の配列のそれぞれを、インビトロのCas9アッセイの標準的な条件と類似に、１．９μＭのNBE1、対応するsgRNAの１．９μＭ、および１２５ｎＭのDNAによって２ｈ処置した５２。ハイスループットDNAシーケンシング（ＨＴＳ）は、標的鎖の５０から８０％のC->U変換（両方のDNA鎖から生起する合計の配列リードの２５から４０％。これらの１つはNBE1の基質ではない）を明らかにした（図１２Ａ）。標的Cの周辺のヌクレオチドは、編集効率に対する少ない効果を有した。これは、標的Cの直ちに５’の塩基がGではない限り配列文脈からは独立しており、そのケースにおいては編集効率は実質的により低かった（図１２Ａから１２Ｂ）。インビトロのNBE1活性を、プロトスペーサー内の位置１から８の全ての４つのNCモチーフについて評価した（図１２Ａから１２Ｂ）。一般的に、基質に対するNBE1活性は、順序TC≧CC≧AC＞GCを辿ることが観察され、最大の編集効率は、標的Cが位置７またはその近くであるときに達成された。加えて、核酸塩基編集因子は高処理能力であり、５塩基活性ウインドウ内の同じDNA鎖上の全てのCの大部分をUに効率的に変換するであろうということが観察された（図１７）。
BE1は試験管内では基質を効率的に処理する一方で、細胞内においては、可能なDNA修復アウトカムのツリー構造が、塩基編集の最初のU:G産物の運命を決定する（図２９Ａ）。ヒト細胞における核酸塩基編集の有効性を試験するために、NBE1コドン使用頻度を哺乳類発現に合わせて最適化し、Ｃ末端核局在配列（NLS）を付加し５３、ヒト細胞内のCをTに変換するその能力を、ヒトゲノム中の６つのよく研究された標的部位における１４個のCによってアッセイした（図３７Ａ）５４。各プロトスペーサー内の編集可能なCを、NBE1を６つの異なるゲノム部位に対応する合成の８０ｍｅｒとインキュベーションすること、次にＨＴＳによって、インビトロで確認した（図１３Ａから１３Ｃ、図２９Ｂおよび図２５）。次に、HEK293T細胞を、NBE1および６つの標的sgRNAの１つをコードするプラスミドによってトランスフェクションし、核酸塩基編集が起こることを３日間許し、ゲノムDNAを細胞から抽出し、ＨＴＳによってローカスを分析した。標的ローカスにおける細胞のC->T編集が全ての６つのケースにおいて観察されたが、核酸塩基編集の効率は合計のDNA配列の１．１％から６．３％または０．８％～７．７％であり（標的鎖の２．２％から1２．６％に対応する）、インビトロの核酸塩基編集と比較して効率の６．３倍から３７倍または５倍から３６倍の減少であった（図１３Ａから１３Ｃ、図２９Ｂおよび図２５）。基質CがTによって先行されているときには、いくらかの塩基編集が、位置４から８という典型的なウインドウの外において起こるということが観察された。我々はこれをTC基質に対するAPOBEC1の通常でなく高い活性に帰している４８。
U:Gヘテロ二本鎖DNAの存在に対する細胞のDNA修復応答が、細胞における核酸塩基編集効率の大きい減少の要因であるかどうかを問うた（図２９Ａ）。ウラシルDNAグリコシラーゼ（UDG）は、細胞内のDNAからのUの除去を触媒し、塩基除去修復（BER）を開始させ、U:G対からC:G対への復帰変異を最も共通のアウトカムとする（図２９Ａ）５５。B. subtilisバクテリオファージPBS1からの８３残基蛋白質、ウラシルDNAグリコシラーゼ阻害剤（UGI）は、ヒトUDG活性を強力にブロックする（ＩＣ５０＝１２ｐＭ）５６。UGIをNBE1のＣ末端に融合して、第２世代核酸塩基編集因子BE2を作り出し、全ての６つのゲノムローカスについて編集アッセイを繰り返した。ヒト細胞における編集効率は、BE2ではNBE1よりも平均で３倍高く、シーケンシングされた合計のDNAの２２．８％まで（標的鎖の４５．６％まで）の遺伝子変換効率をもたらした（図１３Ａから１３Ｃおよび図２９Ｂ）。ヒト細胞において塩基編集を試験するために、BE1コドン使用頻度を哺乳類発現に合わせて最適化し、Ｃ末端核局在配列（NLS）を付加した５３。
UGIを過剰発現する別個のプラスミドをBE1とコトランスフェクションしたときには、類似の編集効率が観察された（図１８Ａから１８Ｈ）。しかしながら、NBE1へのUGIの直接的な融合が、モニターされたゲノムの非標的の場所におけるC->T変異の有意な増大をもたらさなかった一方で、未融合のUGIの過剰発現は、ゲノムの他所におけるC->T変異の頻度を検出可能に増大させた（図１８Ａから１８Ｈ）。BE2によって媒介される核酸塩基編集の一般性を、U2OS細胞において同じ６つのゲノム標的の編集効率を評価することによって確認し、HEK293T細胞のものと類似の結果を観察した（図１９）。重要なことに、NBE2は典型的にはいずれかの検出可能なindelをもたらさず（図１３Ｃおよび図２９Ｃ）、二本鎖DNA切断へのＨＥＪの公知のメカニズム依存性と一致していた５７，７８。一緒になって、これらの結果は、UGIをNBE1にコンジュゲーションすることがヒト細胞における核酸塩基編集の効率を大いに増大させ得るということを示している。
ヒト細胞における核酸塩基編集の性能を、試験されたゲノムローカスの２つについて、HEK293T細胞の複数回の細胞分裂中の編集効率をモニターすることによって確認した。ゲノムDNAは２つの時点において収穫した：NBE2および適切なsgRNAを発現するプラスミドによるトランスフェクションの３日後、および細胞を継代し、それらを追加の４日間育てた後（およそ５回の爾後の細胞分裂）。編集効率の有意な変化は、非継代細胞（編集は、３つの異なる標的Cについて、標的鎖の４．６％から６．６％において観察された）と継代細胞（編集は、同じ３つの標的Cについて、標的鎖の４．６％から６．４％において観察された）との間において観察されず、核酸塩基編集が細胞分裂中に永久的になっているということを確認した（図２０）。稀な場合においては、Indelが細胞の修復プロセスによるU:G損傷のプロセシングから生起するであろう。これには、indelに至ることが公知である単一鎖切断中間体が関わる８４。数百の内在性のU:G損傷が毎日ヒト細胞あたり自然発生的なシチジンデアミナーゼから生成するということを考慮すると８５、U:G損傷修復からの合計のindel頻度が、単一の標的ローカスにおけるBE1またはBE2活性から増大することは非蓋然的であるということが予期であった。
細胞における核酸塩基編集の効率をさらに増大させるためには、編集されない鎖にニックを入れることが、編集されたUのより小さい画分が細胞によって除去されることをもたらし得るということが予期された。なぜなら、真核生物のミスマッチ修復機構は、ミスマッチの二本鎖のいずれかの切断された鎖にDNA修復を導くために鎖不連続性を用いるからである（図２９Ａ）５８，７９，８０。触媒His残基をCas9 HNHドメインの位置８４０において回復させ４７，５９、第３世代核酸塩基編集因子BE3をもたらした。これは、標的Cと反対のGを含有する編集されない鎖にニックを入れるが、Cを含有する標的鎖は切断しない。BE3はなおCas9のAsp10Ala変異を含有するので、これは二本鎖DNA切断を誘導しない。編集されない鎖にニックを入れるというこの戦略は、ヒト細胞における核酸塩基編集効率をNBE2に対して相対的に追加の１．４から４．８倍増強し、合計のDNA配列の３６．３％までが、HEK293T細胞内の同じ６つのヒトゲノム標的における標的C->T変換を含有することをもたらした（図１３Ａから１３Ｃおよび図２９Ｂ）。重要なことに、平均して０．８％であるindelの小さい頻度（６つの異なるローカスについて、０．２％から１．６％の範囲である）のみが、NBE3処置では観察された（図１３Ｃ、図２９Ｃ、および図３４）。対照的に、細胞を野生型Cas9、sgRNA、およびこれらのローカスの３つにおけるＨＤＲを媒介するための一本鎖DNAドナー鋳型によって処置したときには、平均して０．７％のみであるC->T変換効率が観察され、平均して３．９％である大分高い相対的なindel形成であった（図１３Ａから１３Ｃおよび図２９Ｃ）。アレル変換対ＮＨＥＪアウトカムの比は、平均してBE2では＞１，０００、BE3では２３、野生型Cas9では０．１７であった（図３ｃ）。我々は、HEK293部位３および４のゲノムローカスについて、HEK293T細胞の複数回の細胞分裂中の編集効率をモニターすることによって、ヒト細胞における塩基編集の性能を確認した（図３８）。併せて、これらの結果は、核酸塩基編集が、Cas9によって媒介されるＨＤＲよりも大分効率的な標的特異的一塩基編集をヒト細胞において生ぜしめ得、かなり少ないindel形成（NBE3）またはindel形成なし（NBE2）であるということを確証している。
次に、ヒト細胞におけるNBE1、NBE2、およびNBE3のオフターゲット活性を評価した。Cas9、dCas9、およびCas9ニッカーゼのオフターゲット活性は盛んに研究されてきた（図２３から２４および３１から３３）５４，６０～６２。図１２Ａから１２Ｂにおいて観察された配列文脈非依存性と一致して、rAPOBEC1の配列選好性は、標的Cから１つよりも多くの塩基だけ離れたDNA塩基からは独立していることが示されているので６３、核酸塩基編集因子の潜在的なオフターゲット活性はオフターゲットのCas9結合から生起すると思われた。Cas9オフターゲット部位のある画分のみが核酸塩基編集の活性ウインドウ内にCを有するであろうから、オフターゲット核酸塩基編集部位は古典的Cas9バリアントのオフターゲット部位のサブセットであるはずである。研究された６つの部位のそれぞれについて、GUIDE-seq法を用いて以前に決定されたヒト細胞の上位１０個の公知のCas9オフターゲットローカスをシーケンシングした（図２３から２７および３１から３３）５４，６１。検出可能なオフターゲット核酸塩基編集は、公知のdCas9オフターゲットローカスのあるサブセットのみ（NBE1およびNBE2では１６／３４、４７％、BE3では１７／３４、５０％）において観察された。全てのケースにおいて、オフターゲット塩基編集基質は、５塩基の標的ウインドウ内にCを含有した。一般的に、オフターゲットC->T変換は、オフターゲットのCas9ヌクレアーゼによって媒介されるゲノム改変頻度に倣っていた（図２３から２７）。およそ１．８×１０６細胞に由来する合計で１４，７００，０００個の配列リードに相当する、試験された６つのオンターゲットおよび３４個のオフターゲットローカスの周辺の２，５００個の別々のシトシンにおけるC->T変換をもまたモニターし、無処置の細胞のものと比較して、NBE1、NBE2、またはNBE3処置によるこれらの他の部位のいずれかにおけるC->T変換の検出可能な増大は観察されなかった（図２８）。併せると、これらの知見は、核酸塩基編集因子のオフターゲット基質がCas9オフターゲット基質のあるサブセットを包含しているということと、ヒト細胞において、核酸塩基編集因子は、ここで用いられる方法によって検出され得るレベルではゲノム中に非標的C->T変換を誘導しないということとを示唆している。編集効率の実質的な変化は、非継代HEK293T細胞（編集は、BE2では３つの標的Cについてシーケンシングされた鎖の１．８％から２．６％において、BE3では６．２％から１４．３％において観察された）と塩基編集後におよそ５回の細胞分裂を経た細胞（編集は、BE2では同じ標的Cについてシーケンシングされた鎖の１．９％から２．３％において、BE3では６．４％から１４．５％において観察された）との間においては観察されず、これらの細胞における塩基編集が永続的であるということを確認した（拡張データ図６）。
最後に、哺乳類細胞において３つの疾患に関係する変異を修正する核酸塩基編集のポテンシャルを試験した。アポリポ蛋白質E遺伝子バリアントAPOE4はアミノ酸位置112および158の２つのArg残基をコードしており、晩期発症型アルツハイマー病の最も大きい最も共通の遺伝学的リスク因子である６４。位置１１２または１５８にCys残基を有するApoEバリアントは、APOE2（Cys112/Cys158）、APOE3（Cys112/Arg158）、およびAPOE3'（Arg112/Cys158）を包含し、APOE4よりも実質的に低いアルツハイマー病リスクを付与することが示されているか６５、または推定されている８１。インビトロでAPOE4をAPOE3'に変換するNBE1の能力を励みとして（図１６Ａから１６Ｂ）、この変換を、内在性のマウスAPOE遺伝子がヒトAPOE4によって置き換えられた不死化マウスアストロサイト（Taconic）において試した。NBE3および適切なsgRNAをコードするDNAを、ヌクレオフェクションによってそれらのアストロサイト内に送達し（２５％のヌクレオフェクション効率）、２日たった全ての処置された細胞からゲノムDNAを抽出し、ＨＴＳによって編集効率を測定した。Arg158からCys158への変換が、合計のDNAシーケンシングリードの５８～７５％（ヌクレオフェクションされたアストロサイトの４４％）において観察された（図１４Ａから１４Ｃおよび図３０Ａ）。予想されたように、コドン１５８の第３の位置における合計のDNAの３６～５０％の編集、およびLeu159の第１の位置における合計のDNAの３８～５５％の編集もまた観察された。なぜなら、これらのCの全ての３つは活性な核酸塩基編集ウインドウ内にあるからである。しかしながら、他の２つのC->T変換のいずれも、ApoE3'蛋白質のアミノ酸配列の変化をもたらさない。なぜなら、TGCおよびTGT両方はCysをコードし、CTGおよびTTG両方はLeuをコードするからである。１×１０６細胞に由来する＞１，５００，０００個のシーケンシングリードから、NBE3処置後の標的ローカスにおける１．７％のindelの証拠が観察された（図３５）。対照的に、wt Cas9およびドナーssDNAによるアストロサイトの同一の処置は、標的ローカスにおける０．１～０．３％のAPOE4修正および２６～４０％のindelをもたらし、Cas9およびＨＤＲを用いる一塩基修正の以前の報告と一致する効率であった４５，７５（図３０Ａおよび図４０Ａ）。同一に、しかしVEGFAローカスをターゲティングするsgRNAによって処置されたアストロサイトは、APOE4塩基編集の証拠を表示しなかった（図３４および図４０Ａ）。これらの結果は、それらの処理能力がゲノムDNA中に１つよりも多くのヌクレオチド変化をもたらすときでさえも、核酸塩基編集因子が、編集の主産物として蛋白質のコード配列中に正確な一アミノ酸変化をいかに生ぜしめ得るかということを実証している。Cas9、dCas9、およびCas9ニッカーゼのオフターゲット活性は盛んに研究されてきた５４，６０～６２。一般的に、BE1、BE2、およびBE3によるオフターゲットC->T変換は、オフターゲットのCas9ヌクレアーゼによって媒介されるゲノム改変頻度に倣っていた。
ドミナントネガティブp53変異Tyr163CysおよびAsn239Aspは、癌の数個の型に強く関連している６６，６７。これらの変異の両方は、鋳型鎖上のC->T変換によって修正され得る（図１６Ａから１６Ｂ）。p53 Tyrl63Cys変異についてホモ接合のヒト乳癌細胞株（HCC1954細胞）を、NBE3、およびTyr163Cysを修正するようにプログラムされたsgRNAをコードするDNAによってヌクレオフェクションした。HCC1954細胞のヌクレオフェクション効率は＜１０％であったので、IRFPを発現するプラスミドをこれらの細胞に共ヌクレオフェクションして、処置の２日後の蛍光活性化セルソーティングによるヌクレオフェクションされた細胞の単離を可能にした。ゲノムDNAのＨＴＳは、ヌクレオフェクションされたHCC1954細胞の７．６％におけるTyr163Cys変異の修正を明らかにした（図３０Ｂおよび図４０Ａから４０Ｂ）。p53 Asn239Aspについてヘテロ接合であるヒトリンパ腫細胞株（ST486細胞）もまた、NBE2、およびAsn239Aspを修正するようにプログラムされたsgRNAをコードするDNAによってヌクレオフェクションし、９２％のヌクレオフェクション効率であった）。Asn239Asp変異の修正が、処置されたST486細胞の１１％において観察された（ヌクレオフェクションされたST486細胞の１２％）。HEK細胞における知見と一致して、indelはNBE2によるST486細胞の処置からは観察されず、０．６％のindel形成がNBE3によるHCC1954細胞の処置から観察された。プロトスペーサーの両側の少なくとも５０塩基対以内の他のDNA変化は、２×１０５細胞に由来する＞２，０００，０００個のシーケンシングリードから、無処置のコントロールのものよりも上の頻度では検出されなかった（図１４Ａから１４Ｃ、図３０Ｂ、および表１）。併せて、これらの結果は、我々の知る限り現行では他の方法を用いて達成可能でない効率および他のゲノム改変イベントの欠如による、ゲノムDNA中の３つの疾患関連アレルからそれらの野生型形態への変換ということになる。
ヒト遺伝子疾患に対処するための核酸塩基編集因子の潜在的な妥当性を解き明かすために、NCBIのClinVarデータベース６８を、原理的にこのアプローチによって修正され得る公知の遺伝子疾患について検索した。第１に、ClinVarを、一塩基多型（ＳＮＰ）のみを調べ、それからいずれかの非病因性のバリアントを除去することによってフィルタリングした。２４，６７０個の病因性ＳＮＰのうち、３，９５６個はT->CまたはA->G置換どちらかによって引き起こされる。このリストを、SNPを脱アミノ化活性ウインドウ内に位置させるであろう近傍のNGG PAMを有するバリアントのみを包含するようにさらにフィルタリングし、ここで記載される核酸塩基編集因子によって原理的に修正され得る１，０８９個の臨床的に関係する病因性遺伝子バリアントをもたらした（図２１および表１）。ヒト遺伝子疾患に対処するための塩基編集因子の潜在的な妥当性を解き明かすために、NCBIのClinVarデータベース６８を、原理的にこのアプローチによって修正され得る公知の遺伝子疾患について検索した。第１に、ClinVarを、一塩基多型（ＳＮＰ）のみを調べ、それからいずれかの非病因性のバリアントを除去することによってフィルタリングした。２４，６７０個の病因性ＳＮＰのうち、３，９５６個はT->CまたはA->G置換どちらかによって引き起こされる。このリストを、SNPを脱アミノ化活性ウインドウ内に位置させるであろう近傍のNGG PAMを有するバリアントのみを包含するようにさらにフィルタリングし、ここで記載される塩基編集因子によって原理的に修正され得る９１１個の臨床的に関係する病因性遺伝子バリアントをもたらした。これらのうち、２８４個は塩基編集活性ウインドウ内に１つのCのみを含有する。これらの病因性変異の詳細なリストは表１に見出され得る。
表１．NGG PAMを有するヒト疾患に関連する９１１個の塩基編集可能な遺伝子バリアントのリスト（下では、配列番号７４７から１８６８が上から下にそれぞれ載っている）。プロトスペーサーおよびPAM配列中の「Y」は、編集されるべき塩基、例えばCを示す（下では、配列番号７４７から１８６８が上から下にそれぞれ載っている）。
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いくつかの態様において、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかは、疾患または異常を処置するために用いられ得る。例えば、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかは、本明細書において提供される疾患または異常のいずれかに関連する１つ以上の変異を修正するために用いられ得る。処置され得る例示的な疾患または異常は、限定なしに、３－メチルグルタコン酸尿症２型、４６，ＸＹ性腺異形成、４－アルファ－ヒドロキシフェニルピルビン酸ヒドロキシラーゼ欠損症、６－ピルボイルテトラヒドロプテリン合成酵素欠損症、色盲、酸不安定サブユニット欠損症、先端異骨症、手掌角化症（acroerythrokeratoderma）、ＡＣＴＨ不応症、ＡＣＴＨ非依存性大結節性副腎皮質過形成、活性化ＰＩ３Ｋデルタ症候群、急性間欠性ポルフィリン症、急性骨髄性白血病、アダムズ・オリバー症候群１／５／６、アデニロコハク酸リアーゼ欠損症、副腎白質ジストロフィー、成人型神経セロイドリポフスチン症、眼球運動失行を伴う成人発症型失調症、睡眠相前進症候群、加齢黄斑変性、アラジール症候群、アレキサンダー病、アラン・ハーンドン・ダドリー症候群、Ｘ連鎖劣性アルポート症候群、小児交互性片麻痺、肺静脈のアライメント不整を伴う肺胞毛細血管異形成、エナメル質形成不全症、アミロイド形成性トランスサイレチンアミロイドーシス、筋萎縮性側索硬化症、貧血（Ｇ６ＰＤ欠損症による非球状溶血性）、貧血（鉄芽球性、ピリドキシン不応性、常染色体劣性）、無爪症、アンチトロンビンＩＩＩ欠損症、大動脈瘤、再生不良性貧血、アポリポ蛋白質Ｃ２欠損症、見かけ上のミネラルコルチコイド過剰、アロマターゼ欠損症、不整脈原性右室心筋症、家族性肥大型心筋症、肥大型心筋症、先天性多発性関節拘縮症、アスパルチルグルコサミン尿症（Aspartylglycosaminuria）、窒息性胸郭ジストロフィー、ビタミンＥ欠損を伴う運動失調、運動失調（痙性）、心房細動、心房中隔欠損、非典型溶血性尿毒症症候群、常染色体優性ＣＤ１１Ｃ＋／ＣＤ１Ｃ＋樹状細胞欠損症、ミトコンドリアDNA欠失を伴う常染色体優性進行性外眼筋麻痺、バライトサー・ウィンター（Baraitser-Winter）症候群、バーター症候群、基底核（Basa ganglia）石灰化、ベックウィズ・ヴィーデマン症候群、良性家族性新生児痙攣、良性型肩甲腓骨型筋ジストロフィー、ベルナール・スーリエ症候群、ベータサラセミア・インターメディア、ベータ－Ｄ－マンノシドーシス、ビエッティクリスタリン角膜網膜ジストロフィー、胆汁酸吸収不良、ビオチニダーゼ欠損症、ベルエソン・フォルスマン・レーマン症候群、ブーシェ・ノイハウザー（Boucher Neuhauser）症候群、ボーエン・コンラディ症候群、短指症、ブラウン・ヴィアレット・ファンラール症候群、ブルガダ症候群、心臓不整脈、心臓顔皮膚症候群、心筋症、カルネヴァーレ症候群、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩＩ欠損症、カーペンター症候群、白内障、カテコラミン誘発多形性心室頻拍、セントラルコア病、染色体１、９および１６のセントロメア不安定性および免疫不全、常染色体優性脳動脈症、脳・眼・顔・骨格症候群、セロイドリポフスチン症、シャルコー・マリー・トゥース病、コレスタノール蓄積症、軟骨石灰化症、軟骨異形成症、慢性進行性多発性硬化症、コエンザイムＱ１０欠損症、コーエン症候群、第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子複合欠損症、複合免疫不全、複合型酸化的リン酸化欠損症、複合型部分１７－アルファ－ヒドロキシラーゼ／１７－２０－リアーゼ欠損症、補体ｄ因子欠損症、複合型完全１７－アルファ－ヒドロキシラーゼ／１７，２０－リアーゼ欠損症、桿体錐体ジストロフィー、先天性拘縮性クモ状指趾症、グリコシル化の先天性異常、先天性脂肪腫性過成長、卵巣の新生物、ＰＩＫ３ＣＡ関連過成長スペクトラム、先天性ＱＴ延長症候群、先天性筋ジストロフィー、先天性筋肥大・脳症候群、先天性筋無力症候群、線維タイプ不均等症を伴う先天性ミオパチー、アイヒスフェルト型先天性筋ジストロフィー、先天停止性夜盲、角膜ジストロフィー、コルネリア・デランゲ症候群、頭蓋骨幹端骨異形成症、クリグラー・ナジャール症候群、クルーゾン症候群、骨ジストロフィーを伴う皮膚弛緩症、チアノーゼ、嚢胞性線維症、シスチン症、チトクロムｃオキシダーゼ欠損症、ミトコンドリア複合体Ｉ欠損症、Ｄ－２－ヒドロキシグルタル酸尿症、ダノン病、迷路形成不全、小耳、および小歯症を伴う難聴（ＬＡＭＭ）、難聴、アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ欠損症、フェロキシダーゼ欠損症、ＵＤＰ－グルコース－ヘキソース－１－リン酸ウリジリルトランスフェラーゼ欠損症、デジェリン・ソッタス病、デビュクオア症候群、ＤＦＮＡ、糖尿病２型、糖尿病・難聴症候群、ダイアモンド・ブラックファン貧血、捻曲性骨異形成症、ジヒドロプテリジン還元酵素欠損症、ジヒドロピリミジナーゼ欠損症、拡張型心筋症、播種性非定型マイコバクテリア感染、遠位型関節拘縮症、遠位遺伝性運動ニューロパチー、ドンナイ・バロー（Donnai Barrow）症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、遺伝性汎発性色素異常症、先天性角化不全症、ジストニア、早期乳児てんかん性脳症、エーラス・ダンロス症候群、アイヒスフェルト型先天性筋ジストロフィー、エメリー・ドレフュス型筋ジストロフィー、エナメル腎症候群、反対型栄養障害型表皮水疱症、疱疹状表皮水疱症、てんかん、反復発作性運動失調、変動性紅斑角皮症、赤芽球性プロトポルフィリン症、運動不耐、滲出性硝子体網膜症、ファブリー病、第Ｖ因子欠損症、第ＶＩＩ因子欠損症、第ｘｉｉｉ因子欠損症、家族性大腸腺腫症、乳癌、卵巣癌、寒冷蕁麻疹、慢性乳児神経皮膚関節症候群、片麻痺性片頭痛、高コレステロール血症、肥大型心筋症、低アルファリポ蛋白血症、低カリウム血症・低マグネシウム血症、若年性痛風、高リポ蛋白血症、限局性アミロイドーシス、ビタミンＤ不応性低リン血症性くる病、ＦＧ症候群、外眼筋線維症、フィンランド型先天性ネフローゼ症候群、焦点性てんかん、巣状分節性糸球体硬化症、前頭鼻異形成、前頭側頭型認知症、フルクトースビスホスファターゼ（Fructose-biphosphatase）欠損症、ガムストープ・ウォールファールト（Gamstorp-Wohlfart）症候群、ガングリオシドシアリダーゼ欠損症、ＧＡＴＡ１関連血小板減少症、ゴーシェ病、巨大軸索性ニューロパチー、グランツマン血小板無力症、糸球体嚢胞腎、糸球体症、グルココルチコイド不応症、グルコース－６－リン酸輸送障害、グルタル酸尿症、糖原病、ゴーリン症候群、全前脳胞症、ＧＲＡＣＩＬＥ症候群、出血性末梢血管拡張症、ヘモクロマトーシス、ヘモグロビンＨ症、溶血性貧血、血球貪食症候群、結腸の癌腫、マイアー（Myhre）症候群、白質脳症、遺伝性第ＩＸ因子欠乏症、遺伝性第ＶＩＩＩ因子欠乏症、遺伝性第ＸＩ因子欠損症疾患、遺伝性フルクトース尿症、遺伝性非ポリポーシス大腸新生物、遺伝性膵炎、遺伝性熱変形赤血球症、楕円赤血球症、ヘテロタキシー、異所性灰白質、組織球・骨髄細網症、組織球症・リンパ節腫大プラス症候群、アルドラーゼＡ欠損によるＨＮＳＨＡ、ホロカルボキシラーゼ合成酵素欠損症、ホモシステイン血症、ハウエル・エバンス症候群、胞状奇胎、高カルシウム尿性高カルシウム血症、高免疫グロブリンＤ、メバロン酸尿症、高インスリン血性低血糖症、高カリウム性周期性四肢麻痺、フォン・オイレンブルクの先天性パラミオトニー、高リポ蛋白血症、高マンガン血症、高メチオニン血症、高リン血症、高血圧、低マグネシウム血症、低ベータリポ蛋白血症、低カルシウム血症、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、低ゴナドトロピン性性腺機能低下症、低汗性外胚葉形成不全症、高ＩｇＭ免疫不全、低汗性Ｘ連鎖外胚葉形成不全症、低マグネシウム血症、副甲状腺機能低下症、特発性肺線維症、免疫不全、免疫グロブリンＡ欠損症、乳児低ホスファターゼ症、乳児ジストニア・パーキンソニズム、インスリン依存型糖尿病、中間型メープルシロップ尿症、坐骨膝蓋骨異形成、膵島細胞過形成、成長ホルモン単独欠損症、ルトロピン単独欠損症、イソ吉草酸血症、ジュベール症候群、若年性ポリポーシス症候群、若年網膜分離症、カルマン症候群、カルタゲナー症候群、クーゲルベルグ・ウェランダー病、格子状角膜ジストロフィー、レーバー先天性黒内障、レーバー遺伝性視神経萎縮症、左室緻密化障害、リー症候群、ミトコンドリア複合体Ｉ欠損症、妖精症、関節拘縮症、前角細胞病、白血球粘着不全症、白質ジストロフィー、白質脳症、卵巣白質ジストロフィー（Ovarioleukodystrophy）、L－フェリチン欠損症、リ・フラウメニ症候群、肢帯型筋ジストロフィー－ジストログリカノパチー、ロイス・ディーツ症候群、ＱＴ延長症候群、大頭症／自閉症症候群、黄斑角膜ジストロフィー、黄斑ジストロフィー、悪性高熱症素因、前立腺の悪性腫瘍、メープルシロップ尿症、マーデンウォーカー様症候群、マルファン症候群、マリー・ウンナ遺伝性乏毛症、マスト細胞症、胎便関連性腸閉塞、中鎖アシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損症、メルニック・フレイザー症候群、精神遅滞、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、中皮腫、異染性白質ジストロフィー、骨幹端軟骨異形成症、メトヘモグロビン血症、メチルマロン酸尿症、ホモシスチン尿症、小頭症、脈絡網膜症、リンパ浮腫、小眼球症、軽症型非ＰＫＵ型高フェニルアラニン血症、ミッチェル・ライリー症候群、ミトコンドリア３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ欠損症、ミトコンドリア複合体Ｉ欠損症、ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症、ミトコンドリアミオパチー、ムコリピドーシスＩＩＩ、ムコ多糖症、多種スルファターゼ欠損症、筋無力症候群、結核菌、ミエロペルオキシダーゼ欠損症、マイアー（Myhre）症候群、ミオクロニーてんかん、筋原線維性ミオパチー、ミオグロビン尿症、ミオパチー、近視、先天性ミオトニー、ナバホ神経肝症、ネマリンミオパチー、胃の新生物、腎性尿崩症、ネフロン癆、ネフローゼ症候群、神経線維腫症、中性脂肪蓄積症、ニーマン・ピック病、非ケトーシス型高グリシン血症、ヌーナン症候群、ヌーナン症候様異常、ノーラム（Norum）病、黄斑変性、Ｎ末端アセチルトランスフェラーゼ欠損症、眼皮膚白皮症、眼歯指異形成、大堂症候群、視神経無形成、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ欠損症、口腔顔面指趾症候群、骨形成不全症、大理石骨病、卵巣形成不全、爪甲肥厚、非表皮融解性掌蹠角化症、パピヨン・ルフェーブル症候群、ハイム・ムンク症候群、歯周炎、ピーリングスキン症候群、ペンドレッド症候群、ペルオキシソーム脂肪酸アシルＣｏＡレダクターゼ１異常、ペルオキシソーム生合成異常、ファイファー症候群、フェニルケトン尿症、フェニルケトン尿症、非ＰＫＵ型高フェニルアラニン血症、下垂体ホルモン欠損症、毛孔性紅色粃糠疹、結節性多発動脈炎、多発性嚢胞腎、多嚢胞性脂肪膜性骨異形成症、多小脳回症、橋小脳低形成症、汗孔角化症、脊髄後索型運動失調、原発性肢端紅痛症、高シュウ酸尿症、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症、進行性偽リウマチ性異形成症、プロピオン酸血症、仮性半陰陽、偽性低アルドステロン症、弾性線維性仮性黄色腫様異常、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ欠損症、ピリドキサール－５－リン酸依存性てんかん、腎異形成、網膜色素変性、小脳性運動失調、骨異形成、細網異形成症、網膜色素変性、アッシャー症候群、網膜芽細胞腫、網膜症、ＲＲＭ２Ｂ関連ミトコンドリア病、ルビンスタイン・テイビ症候群、シュナイダークリスタリン角膜ジストロフィー、脂腺腫瘍、重症先天性好中球減少症、乳児重症ミオクロニーてんかん、重症Ｘ連鎖ミオチュブラーミオパチー、指爪甲形成不全症、顔面異形、乏毛症、短肋骨胸郭異形成症、シアル酸蓄積症、シアリドーシス、鉄芽球性貧血、小径線維ニューロパチー、スミス・マゲニス症候群、ソースビー（Sorsby）眼底ジストロフィー、痙性運動失調、痙性対麻痺、精子形成不全、球状赤血球症、スフィンゴミエリン／コレステロールリピドーシス、脊髄小脳性運動失調、裂手裂足症、脊椎骨端骨幹端異形成症、致死性扁平椎異形成症、頭頸部の扁平上皮癌、スターガルト病、スクラーゼ・イソマルターゼ欠損症、乳幼
児突然死症候群、大動脈弁上部狭窄症（Supravalvar aortic stenosis）、サーファクタント代謝異常、タンジール病、タットン・ブラウン・ラーマン、胸部大動脈瘤および大動脈解離、血栓傾向、甲状腺ホルモン不応症、ＴＮＦ受容体関連周期性発熱症候群（ＴＲＡＰＳ）、歯数不足症、トルサード・ド・ポワント、大血管転位、トリーチャー・コリンズ症候群、結節性硬化症症候群、チロシナーゼ陰性型眼皮膚白皮症、チロシナーゼ陽性型眼皮膚白皮症、チロシン血症、ＵＤＰグルコース－４－エピメラーゼ欠損症、ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー、ベスレムミオパチー、アッシャー症候群、ＵＶ高感受性症候群、ファンデルワウデ症候群、膝窩翼状片症候群、極長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、膀胱尿管逆流症、硝子体網膜脈絡膜症、フォン・ヒッペル・リンドウ病、フォン・ヴィレブランド病、ワールデンブルグ症候群、ワルシャワ染色体不安定（breakage）症候群、WFS1関連異常、ウィルソン病、色素性乾皮症、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、Ｘ連鎖遺伝性運動感覚ニューロパチー、Ｘ連鎖重症複合免疫不全、およびツェルウェーガー症候群を包含する。
核酸塩基編集の開発は、ゲノム編集の範囲および有効性両方を進歩させる。ここで記載される核酸塩基編集因子は、実質的にindel形成なしの編集（NBE2）、またはindel形成の低い頻度（ここでは典型的には≦１％）を有するより効率的な編集（NBE3）の選択肢を研究者に提供する。塩基編集の産物が当然のことながらもはや基質ではないということは、蓋然的に、従来のCas9用途の妨げと得る爾後の産物転換を防止することによって編集効率に寄与する。細胞の状態および細胞の型によって大いに変わる二本鎖DNA切断および確率的なDNA修復プロセスへの依存を除去することによって、核酸塩基編集は、クリーンに実装され得るゲノム改変の型、それらの改変の効率、および編集を適用可能な細胞の型を拡大するポテンシャルを有する。改善されたDNA特異性を有する最近の操作されたCas9バリアント６９，７０，８２または送達方法７１、および変改されたPAM特異性を有するCas9バリアント７２をこの戦略と統合して、改善されたDNA特異性を有するかまたは一層広い範囲の疾患関連変異をターゲティングし得る追加の核酸塩基編集因子を提供し得るということは蓋然的である。これらの知見は、追加の核酸塩基転換を触媒する酵素とのdCas9の追加の融合体を操作することが、核酸塩基編集によって作られ得る可能なDNA塩基変化の画分を増大させるであろうということをもまた示唆している。これらの結果は、プログラム可能なゲノムおよびエピゲノム塩基編集の追加の型を可能にし得る、メチラーゼおよびデメチラーゼを包含する他のDNA修飾酵素の融合体の構造をもまた示唆している。
材料と方法
クローニング．本稿において用いられる全てのコンストラクトおよびプライマーのDNA配列は、補足的な配列に挙げられている。NBE1、NBE2、およびNBE3をコードする遺伝子を含有するプラスミドは、Addgeneから利用可能であろう。ＰＣＲは、VeraSeq ULtra DNAポリメラーゼ（Enzymatics）またはQ5 Hot Start High-Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を用いて行った。NBEプラスミドはUSERクローニング（New England Biolabs）を用いて構築した。デアミナーゼ遺伝子はgBlocks遺伝子断片（Integrated DNA Technologies）を用いて合成し、Cas9遺伝子は以前に報告されたプラスミド１８から得た。デアミナーゼおよび融合遺伝子は、pCMV（哺乳類コドン最適化されている）またはpET28b（E. coliコドン最適化されている）バックボーン中にクローニングした。sgRNA発現プラスミドは、部位特異的変異導入を用いて構築した。簡潔には、補足的な配列に挙げられているプライマーを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（New England Biolabs）を用いて製造者の説明書に従って５’リン酸化した。次に、ＰＣＲを、Q5 Hot Start High-Fidelityポリメラーゼ（New England Biolabs）を用いて、リン酸化プライマーおよび鋳型としてのプラスミドpFYF1320（EGFP sgRNA発現プラスミド）によって、製造者の説明書に従って行った。ＰＣＲ産物をDpnI（２０Ｕ、New England Biolabs）と３７℃において１ｈインキュベーションし、QIAprepスピンカラム（Qiagen）によって精製し、Quickリガーゼ（New England Biolabs）を用いて製造者の説明書に従ってライゲーションした。DNAベクター増幅はMach1コンピテントセル（Thermo Fisher Scientific）を用いて実施した。
ssDNAによるインビトロデアミナーゼアッセイ．全てのssDNA基質の配列は補足的な配列に挙げられている。全てのCy3標識された基質はIntegrated DNA Technologies（IDT）から得た。デアミナーゼは、TNT T7 Quick Coupled転写／翻訳キット（Promega）を用いて製造者の説明書に従って、プラスミドの１μｇを用いてインビトロで発現した。蛋白質発現後に、ライセートの５μＬを、CutSmart緩衝液（New England Biolabs）（５０ｍＭ酢酸カリウム、２９ｍＭのトリス酢酸、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１００ｕｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ７．９）中においてssDNA（１．８μＭ）の３５μＬおよびUSER酵素（１単位）と組み合わせ、３７℃において２ｈインキュベーションした。切断されたU含有基質を１０％ＴＢＥ－尿素ゲル（Bio-Rad）上で全長の未改変基質から分離した。
His6-rAPOBEC1-リンカー-dCas9融合体の発現および精製．E. Coli BL21 STAR (DE3)コンピテントセル（Thermo Fisher Scientific）を、GGS、(GGS)3（配列番号５９６）、XTEN、または(GGS)7（配列番号５９７）リンカーを有するpET28b-His6-rAPOBEC-リンカー-dCas9をコードするプラスミドによって形質転換した。もたらされた発現株を、カナマイシンの１００μｇ／ｍＬを含有するルリア－ベルターニ（ＬＢ）ブロスによって３７℃において一晩育てた。細胞を同じ増殖培地によって１：１００希釈し、３７℃においてＯＤ６００＝～０．６まで育てた。培養物を２ｈの期間かけて４℃に冷却し、イソプロピル－β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．５ｍＭで追加して、蛋白質発現を誘導した。～１６ｈ後に、細胞を４，０００ｇの遠心によって集め、リシス緩衝液（５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）－ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１ＭのＮａＣｌ、２０％グリセロール、１０ｍＭトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ、Soltec Ventures））中に再懸濁した。細胞をソニケーションによってリシスし（６Ｗ出力で２０ｓパルスオン、２０ｓパルスオフを合計８ｍｉｎ）、ライセート上清を１５ｍｉｎの２５，０００ｇでの遠心後に単離した。ライセートをHis-Purニッケル－ニトリロ酢酸（ニッケル－ＮＴＡ）樹脂（Thermo Fisher Scientific）と４℃において１ｈインキュベーションして、Hisタグ融合蛋白質を捕捉した。樹脂をカラムに移し、リシス緩衝液の４０ｍＬによって洗浄した。Hisタグ融合蛋白質を、２８５ｍＭイミダゾールを添加したリシス緩衝液によって溶出し、限外濾過（Amicon-Millipore、１００ｋＤａ分子量カットオフ）によって１ｍＬの合計体積に濃縮した。蛋白質を、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）－ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．１ＭのＮａＣｌ、２０％グリセロール、１０ｍＭのＴＣＥＰを含有する低塩精製緩衝液によって２０ｍＬに希釈し、SP Sepharose Fast Flow樹脂（GE Life Sciences）にローディングした。樹脂をこの低塩緩衝液の４０ｍＬによって洗浄し、蛋白質を、５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）－ＨＣｌ、ｐＨ７．０、０．５ＭのＮａＣｌ、２０％グリセロール、１０ｍＭＴＣＥＰを含有する活性緩衝液の５ｍＬによって溶出した。溶出された蛋白質はＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上で定量した。
sgRNAのインビトロ転写．Ｔ７プロモーター、次に２０ｂｐのsgRNA標的配列を含有する直鎖状DNA断片を、補足的な配列に挙げられているプライマーを用いて、製造者の説明書に従ってTranscriptAid T7高収率転写キット（ThermoFisher Scientific）によってインビトロ転写した。sgRNA産物はMEGAclearキット（Thermo Fisher Scientific）を用いて製造者の説明書に従って精製し、ＵＶ吸光度によって定量した。
Cy3をコンジュゲーションしたdsDNA基質の調製．８０ヌクレオチドの未標識鎖の配列が補足的な配列に挙げられており、ＰＡＧＥ精製オリゴヌクレオチドとしてIDTに注文した。補足的な配列に挙げられている２５ｎｔのCy3標識プライマーは、各８０ｎｔ基質の３’末端に対して相補的である。このプライマーはＨＰＬＣ精製オリゴヌクレオチドとしてIDTに注文した。Cy3標識されたdsDNA基質を創るために、８０ｎｔ鎖（１００μＭ溶液の５μＬ）を、ｄＮＴＰ（１００ｍＭ溶液の０．７５μＬ）を有するNEBuffer 2（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．９溶液の３８．２５μＬ、New England Biolabs）中においてCy3標識プライマー（１００μＭ溶液の５μＬ）と組み合わせ、９５℃において５ｍｉｎ加熱し、次に、０．１℃／ｓの速度での４５℃への徐冷をした。このアニーリング期間後に、Klenow exo-（５Ｕ、New England Biolabs）を追加し、反応を３７℃において１ｈインキュベーションした。溶液をBuffer PB（２５０μＬ、Qiagen）およびイソプロパノール（５０μＬ）によって希釈し、QIAprepスピンカラム（Qiagen）によって精製し、トリス緩衝液の５０μＬによって溶出した。
dsDNAによるデアミナーゼアッセイ．精製された融合蛋白質（活性緩衝液中の１．９μＭの２０μＬ）を適切なsgRNAの１当量と組み合わせ、常温において５ｍｉｎインキュベーションした。Cy3標識されたdsDNA基質を１２５ｎＭの終濃度で追加し、もたらされた溶液を３７℃において２ｈインキュベーションした。dsDNAを、Buffer PB（１００μＬ、Qiagen）およびイソプロパノール（２５μＬ）の追加によって融合体から分離し、EconoSpinマイクロスピンカラム（Epoch Life Science）によって精製し、CutSmart緩衝液（New England Biolabs）の２０μＬによって溶出した。USER酵素（１Ｕ、New England Biolabs）を精製された編集されたdsDNAに追加し、３７℃において１ｈインキュベーションした。Cy3標識鎖を、反応溶液の５μＬをＤＭＳＯに基づくローディング緩衝液（５ｍＭトリス、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、１２．５％グリセロール、０．０２％ブロモフェノールブルー、０．０２％キシレンシアン、８０％ＤＭＳＯ）の１５μＬと組み合わせることによって、その相補物から十分に変性させた。全長のC含有基質を、１０％ＴＢＥ-尿素ゲル（Bio-Rad）上においていずれかの切断されたUを含有する編集された基質から分離し、GE Amersham Typhoonイメージャーによってイメージングした。
ハイスループットシーケンシング（ＨＴＳ）のためのインビトロ編集されたdsDNAの調製．補足的な配列に挙げられているオリゴヌクレオチドをIDTから得た。相補配列をトリス緩衝液中において組み合わせ（１００μＭ溶液の５μＬ）、９５℃に５ｍｉｎ加熱することによってアニーリングし、次に０．１℃／ｓの速度での４５℃への徐冷をして、６０ｂｐのdsDNA基質を創った。精製された融合蛋白質（活性緩衝液中の１．９μＭの２０μＬ）を適切なsgRNAの１当量と組み合わせ、常温において５ｍｉｎインキュベーションした。６０ｍｅｒのdsDNA基質を１２５ｎＭの終濃度で追加し、もたらされた溶液を３７℃において２ｈインキュベーションした。dsDNAをBuffer PB（１００ｐＬ、Qiagen）およびイソプロパノール（２５ｐＬ）の追加によって融合体から分離し、EconoSpinマイクロスピンカラム（Epoch Life Science）によって精製し、トリス緩衝液の２０μＬによって溶出した。もたらされた編集されたＤＮＡ（１μＬを鋳型として用いた）を、補足的な配列に規定されているＨＴＳプライマーペアおよびVeraSeq Ultra（Enzymatics）を製造者の説明書に従って用いて、増幅の１３サイクルによってＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ反応産物はRapidTip（Diffinity Genomics）を用いて精製し、精製されたDNAは、シーケンシングアダプターを含有するプライマーによるＰＣＲによって増幅し、精製し、MiSeqハイスループットDNAシーケンサー（Illumina）によって以前に記載されているようにシーケンシングした７３。
細胞培養．HEK293T（ATCC CRL-3216）、U2OS（ATCC-HTB-96）、およびST486細胞（ATCC）は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（１×、Amresco）を添加したダルベッコ改変イーグル培地プラスGlutaMax（Thermo Fisher）によって、３７℃において５％ＣＯ２で維持した。HCC1954細胞（ATCC CRL-2338）は、上に記載されているように添加したRPMI-1640培地（Thermo Fisher Scientific）によって維持した。APOE遺伝子のApoE4アイソフォームを含有する不死化ラットアストロサイト（Taconic Biosciences）は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２００μｇ／ｍＬジェネティシン（Thermo Fisher Scientific）を添加したダルベッコ改変イーグル培地プラスGlutaMax（Thermo Fisher Scientific）によって培養した。
トランスフェクション．HEK293T細胞を４８ウェルコラーゲンコートBioCoatプレート（Corning）に播種し、およそ８５％コンフルエントでトランスフェクションした。簡潔には、NBE発現プラスミドの７５０ｎｇおよびsgRNA発現プラスミドの２５０ｎｇを、ウェルあたりLipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）の１．５μＬを用いて製造者のプロトコールに従ってトランスフェクションした。アストロサイト、U2OS、HCC1954、HEK293T、およびST486細胞を、適切なAMAXA NUCLEOFECTOR（商標）IIプログラムを用いて製造者の説明書に従ってトランスフェクションした。infrared RFP（Addgeneプラスミド45457）７４の４０ｎｇをヌクレオフェクション溶液に追加して、これらの細胞株におけるヌクレオフェクション効率を評価した。アストロサイト、U2OS、およびST486細胞では、ヌクレオフェクション効率はそれぞれ２５％、７４％、および９２％であった。HCC1954細胞では、ヌクレオフェクション効率は＜１０％であった。よって、トリプシン処理後に、HCC1954細胞を４０ミクロン濾過器（Fisher Scientific）によって濾過し、ヌクレオフェクションされたHCC1954細胞を、iRFPシグナル（ａｂｓは６４３ｎｍ、ｅｍは６７０ｎｍ）を用いてBeckman Coulter MoFlo XDPセルソーターによって集めた。他の細胞はヌクレオフェクションされた細胞の濃縮なしで用いた。
ゲノムDNAサンプルのハイスループットDNAシーケンシング．トランスフェクションされた細胞を３ｄ後に収穫し、ゲノムDNAを、Agencourt DNAdvanceゲノムDNA単離キット（Beckman Coulter）を用いて製造者の説明書に従って単離した。目当てのオンターゲットおよびオフターゲットゲノム領域を、補足的な配列に挙げられているフランキングＨＴＳプライマーペアによるＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅は、鋳型としてゲノムDNAの５ｎｇを用いて、製造者の説明書に従ってPhusion high-fidelity DNAポリメラーゼ（Thermo Fisher）によって実施した。サイクル数は、反応が増幅の線形の範囲内で止まることを保証するように各プライマーペアについて別個に決定した（EMX1、FANCF、HEK293部位２、HEK293部位３、HEK293部位４、およびRNF2プライマーについて、それぞれ３０、２８、２８、２８、３２、および３２サイクル）。ＰＣＲ産物はRapidTip（Diffinity Genomics）を用いて精製した。精製されたDNAを、シーケンシングアダプターを含有するプライマーによるＰＣＲによって増幅した。産物をゲル精製し、QUANT-IT（商標）PicoGreen dsDNAアッセイキット（Thermo Fisher）およびKAPA Library Quantification Kit-Illumina（KAPA Biosystems）を用いて定量した。サンプルは、以前に記載されているようにIllumina MiSeqによってシーケンシングした７３。
データ分析．シーケンシングリードはMiSeqレポーター（Illumina）を用いて自動で重複除去し、個々のFASTQファイルは、補足的な解説に提供されているカスタムのMatlabスクリプトによって分析した。各リードを、Smith-Watermanアルゴリズムを用いて適切な参照配列に対してペアワイズアラインメントした。Ｑスコアが３１よりも下のベースコールはＮによって置き換え、それゆえに、ヌクレオチド頻度を計算する際には除外した。この処置は、およそ１，０００分の１の予想されるMiSeqベースコールエラー率を生む。リードおよび参照配列がギャップを含有しないアラインメントされた配列はアラインメントテーブルに保管し、これから、塩基頻度を各ローカスについて作表し得た。
Indel頻度は、以前に記載されている基準を用いて、補足的な解説に示されているカスタムのMatlabスクリプトによって定量した７１。シーケンシングリードを、indelが起こり得るウインドウの両側をフランキングする２つの１０ｂｐ配列との厳密なマッチについてスキャンした。厳密なマッチが見つからなかった場合には、リードは分析から除外した。このindelウインドウの長さが参照配列と厳密にマッチする場合には、リードは、indelを含有しないとして分類された。indelウインドウが参照配列よりも２塩基以上長いかまたは短い場合には、シーケンシングリードはそれぞれ挿入または欠失として分類された。
本明細書において、例えば背景技術、発明の概要、発明を実施するための形態、実施例、および／または参照の項において言及される全ての刊行物、特許、特許出願、公開、およびデータベースエントリー（例えば、配列データベースエントリー）は、各個々の刊行物、特許、特許出願、公開、およびデータベースエントリーが参照によって具体的に個々に本明細書に組み込まれる場合のように、それらの全体が参照によってここに組み込まれる。相反のケースにおいては、本明細書のいずれかの定義を包含して、本願がコントロールする。
補足的な配列
sgRNAトランスフェクションプラスミドを生成するために用いたプライマー．rev_sgRNA_plasmidは全てのケースに用いた。pFYF1320プラスミドを、材料と方法の項に見られるように鋳型として用いた。下では、配列番号３２９～３３８が上から下にそれぞれ載っている。
Figure 0007067793000138
インビトロデアミナーゼアッセイに用いた全てのssDNA基質の配列．下では、配列番号３３９～３４１が上から下にそれぞれ載っている。
Figure 0007067793000139
ゲルに基づくデアミナーゼアッセイのためのsgRNAのＴ７転写の基質として供するためのＰＣＲ産物を生成するために用いたプライマー．rev_gRNA_T7は全てのケースに用いた。pFYF1320プラスミドを、材料と方法の項に見られるように鋳型として用いた。下では、配列番号３４２～３６５が上から下にそれぞれ載っている。
Figure 0007067793000140
ゲルに基づくdsDNAデアミナーゼアッセイに用いた８０ヌクレオチドの未標識鎖およびCy3標識ユニバーサルプライマーの配列．下では、配列番号３６６～３９０が上から下にそれぞれ載っている。
Figure 0007067793000141
ハイスループットシーケンシングのためのsgRNAのＴ７転写の基質として供するためのＰＣＲ産物を生成するためのプライマー．rev_gRNA_T7（上）を全てのケースに用いた。pFYF1320プラスミドを、材料と方法の項に見られるように鋳型として用いた。下では、配列番号３９１～４４２が上から下にそれぞれ載っている。
Figure 0007067793000142
Figure 0007067793000143
ハイスループットシーケンシング（ＨＴＳ）のためのインビトロ編集されるdsDNAの配列．編集される鎖の配列が示されている。示されている全ての配列の逆相補物もまた得た。dsDNA基質は、材料と方法に記載されているように相補鎖をアニーリングすることによって得られた。EMX1、FANCF、HEK293部位２、HEK293部位３、HEK293部位４、およびRNF2ローカスに相当するオリゴヌクレオチドは、元々はゲルに基づくデアミナーゼアッセイへの使用のために設計されており、よって、同じ２５ｎｔ配列をそれらの５’末端に有する（Cy3プライマーのものにマッチする）。下では、配列番号４４３～４９４が上から下にそれぞれ載っている。
Figure 0007067793000144
Figure 0007067793000145
インビトロ編集されるdsDNAのＨＴＳのためのプライマー．下では、配列番号４９５～５０３が上から下にそれぞれ載っている。
Figure 0007067793000146
全ての哺乳類細胞培養実験からの、オンターゲットおよびオフターゲット部位のＨＴＳのためのプライマー．下では、配列番号５０４～５７９および１８６９～１９００が上から下にそれぞれ載っている。
Figure 0007067793000147
Figure 0007067793000148
Figure 0007067793000149
Figure 0007067793000150
ＨＤＲ研究に用いた一本鎖オリゴヌクレオチドドナー鋳型（ssODN）の配列．
Figure 0007067793000151
Figure 0007067793000152
デアミナーゼ遺伝子gBlocks遺伝子断片
Figure 0007067793000153
Figure 0007067793000154
NBE1、NBE2およびNBE3のアミノ酸配列。
E. Coli発現のためのNBE1（His6-rAPOBEC1-XTEN-dCas9）（配列番号５９１）
Figure 0007067793000155
 ヒトAPOBEC1（hAPOBEC1-XTEN-dCas9-NLS）（配列番号５７３７）を用いた哺乳類発現のための代替NBE1
Figure 0007067793000156
Figure 0007067793000157
Figure 0007067793000158
Figure 0007067793000159
 pmCDA1-XTEN-nCas9-UGI-NLS（哺乳類コンストラクト）（配列番号５７４３）
Figure 0007067793000160
Figure 0007067793000161
Figure 0007067793000162
Figure 0007067793000163
Figure 0007067793000164
Figure 0007067793000165
Figure 0007067793000166
ベースコールMATLABスクリプト
Figure 0007067793000167
Figure 0007067793000168
Figure 0007067793000169
INDEL検出Matlabスクリプト
Figure 0007067793000170
Figure 0007067793000171
Figure 0007067793000172
例５：Cas9バリアント配列
本開示は、Cas9バリアント、例えば１つ以上の生物からのCas9蛋白質を提供し、これは１つ以上の変異を含み得る（例えば、dCas9またはCas9ニッカーゼを創るため）。いくつかの態様において、下でアステリスク（asterek）によって同定されているCas9蛋白質のアミノ酸残基の１つ以上は、変異させられ得る。いくつかの態様において、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のD10および／またはH840残基、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、変異している。いくつかの態様において、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のD10残基、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、D以外のいずれかのアミノ酸残基に変異している。いくつかの態様において、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のD10残基、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、Aに変異している。いくつかの態様において、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のH840残基、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する残基は、Hである。いくつかの態様において、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のH840残基、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、H以外のいずれかのアミノ酸残基に変異している。いくつかの態様において、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のH840残基、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異は、Aに変異している。いくつかの態様において、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列のD10残基、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する残基は、Dである。
種々の種からのいくつものCas9配列をアラインメントして、配列番号１０または配列番号１１のD10およびH840の対応する相同なアミノ酸残基が他のCas9蛋白質中に同定され、相同なアミノ酸残基の対応する変異を有するCas9バリアントの生成を許し得るかどうかを決定した。アラインメントはNCBI Constraint-based Multiple Alignment Tool（COBALT（st-va.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobaltにおいてアクセス可能）を用いて、次のパラメータによって実施した。アラインメントパラメータ：Gap Penalties -11, -1；End-Gap Penalties -5, -1．CDD Parameters：Use RPS BLASTオン；Blast E-value 0.003；Find Conserved columns and Recomputeオン．Query Clustering Parameters：Use query clustersオン；Word Size 4；Max cluster distance 0.8；Alphabet Regular。
４つのCas9配列の例示的なアラインメントを下に提供する。アラインメント中のCas9配列は、配列１（S1）：配列番号１１|WP_010922251|gi 499224711|II型CRISPR RNA誘導型エンドヌクレアーゼCas9 [Streptococcus pyogenes]；配列２（S2）：配列番号１２|WP_039695303|gi 746743737|II型CRISPR RNA誘導型エンドヌクレアーゼCas9 [Streptococcus gallolyticus]；配列３（S3）：配列番号１３|WP_045635197|gi 782887988|II型CRISPR RNA誘導型エンドヌクレアーゼCas9 [Streptococcus mitis]; 配列４（S4）：配列番号１４|5AXW_A|gi 924443546|Staphylococcus aureus Cas9である。HNHドメイン（太字かつ下線）およびRuvCドメイン（枠囲み）が４つの配列のそれぞれについて同定されている。S1中のアミノ酸残基１０および８４０とアラインメントされた配列中の相同なアミノ酸とは、それぞれのアミノ酸残基の次のアステリスクによって同定されている。
Figure 0007067793000173
Figure 0007067793000174
Figure 0007067793000175
アラインメントは、当分野において公知のアラインメントプログラムおよびアルゴリズムを用いて、参照配列または参照残基とアラインメントするアミノ酸配列または残基を同定することによって、参照Cas9アミノ酸配列またはアミノ酸残基に対して相同であるアミノ酸配列およびアミノ酸残基が、異なる種からのCas9配列を包含するがこれに限定されないCas9配列バリアントから同定され得るということを実証している。本開示は、配列番号１１～１４中のアステリスクによって同定されているアミノ酸残基の１つ以上（例えば、それぞれS1、S2、S3、およびS4）が本明細書に記載されるように変異した、Cas9バリアントを提供する。配列番号１１～１４においてアステリスクによって同定されている残基に対応する配列番号１０のCas9の残基D10およびH840は、本明細書において「相同な」または「対応する」残基と言われる。かかる相同な残基は、例えば上に記載されているように配列アラインメントによって、参照配列または残基とアラインメントする配列または残基を同定することによって同定され得る。類似に、本明細書における配列番号１０中の同定された変異、例えば配列番号１０の残基１０および８４０の変異に対応するCas9配列の変異は、本明細書において「相同な」または「対応する」変異と言われる。例えば、上の４つのアラインメントされた配列について、配列番号１０またはＳ１（配列番号１１）のD10A変異に対応する変異は、Ｓ２ではD11A、Ｓ３ではD10A、Ｓ４ではD13Aであり；配列番号１０またはＳ１（配列番号１１）のH840Aに対応する変異は、Ｓ２ではH850A、Ｓ３ではH842A、Ｓ４ではH560Aである。
異なる種からの合計で２５０個のCas9配列（配列番号１１～２６０）を、上で概述されている同じアルゴリズムおよびアラインメントパラメータを用いてアラインメントした。配列番号１０の残基１０および８４０に対して相同なアミノ酸残基を、上で概述されている同じ様式で同定した。アラインメントは下に提供されている。HNHドメイン（太字かつ下線）およびRuvCドメイン（枠囲み）が４つの配列のそれぞれについて同定されている。配列番号１０のアミノ酸残基１０および８４０に対応する単一の残基はアラインメント中の配列番号１１において枠囲みされており、アラインメントされた配列中の対応するアミノ酸残基の同定を許す。
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例６：次世代C->T編集因子
塩基編集因子３（BE3）コンストラクトの代替物としてのシチジンデアミナーゼの他のファミリーを調べた。標的化可能な基質を拡大するための狭いかまたは異なる編集ウインドウ、代替の配列特異性を有し、より高い活性を有するように、異なるC->T編集因子を開発した。
例４に記載されている方法を用いて、HeK-3部位におけるpmCDA1（Petromyzon marinusからのシチジンデアミナーゼ１）活性を評価する（図４２）。pmCDA1-nCas9-UGI-LS（nCas9は、本明細書に記載されるCas9ニッカーゼを示す）コンストラクトは、rAPOBEC1（BE3）ではアクセス可能でないいくつかの部位（例えば、位置９、５、４、および３における相補鎖上のC塩基）について活性である。
HeK-2部位におけるpmCDA1活性が図４３に与えられている。pmCDA1-XTEN-nCas9-UGI-LSコンストラクトは「G」に隣接した部位に対して活性であり、一方で、rAPOBEC1アナログ（BE3コンストラクト）は、「G」に隣接している「C」、例えば相補鎖上の位置１１のC塩基に対して低い活性を有する。
標的CがTに変換された（図４４）、CがAに変換された（図４５）、およびCがGに変換された（図４６）合計のシーケンシングリードのパーセントが、CDAおよびAPOBEC1（BE3コンストラクト）について示されている。
HeK-2部位におけるhuAPOBEC3G活性が図４７に示されている。２つのコンストラクトを用いた：huAPOBEC3G-XTEN-nCas9-UGI-LSおよびhuAPOBEC3G*(D316R_D317R)-XTEN-nCas9-UGI-LS。huAPOBEC3 G-XTEN-nCas9-UGI-LSコンストラクトは、図４７に示されているようにrAPOBEC1（BE3）とは異なる配列特異性を有し、APOBEC1と比較して位置４におけるAPOBEC3Gの減少した活性によって示されているように、編集ウインドウは狭く見える。huAPOBEC3Gに作られた変異（D316RおよびD317R）は、ssDNA結合を増大させ、編集される部位を拡大することに対する観察可能な効果をもたらした（図４７のAPOBEC3GをAPOBEC3G RRと比較）。変異はAPOBEC3G結晶構造に基づいて選んだ：Holden et al, Crystal structure of the anti-viral APOBEC3G catalytic domain and functional implication. Nature. (2008); 121-4参照。その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
例７：E. coliにおけるpmCDA1/huAPOBEC3G/rAPOBEC1研究
A->T変換について、LacZ選択最適化を、LacZがＦプラスミド上にコードされた細菌株を用いて行った。シチジンデアミナーゼによるG->AがLacZ活性を回復させるように、極めて重要なグルタミン酸残基を変異させた（例えば、GAG->GGG、Glu->Gly変異）（図４８）。株CC102を選択アッセイのために選択した。APOBEC1およびCDAコンストラクトを選択アッセイに用いて、G->A変換を最適化した。
デアミナーゼコンストラクトをコードするプラスミドのコピー数の、LacZ復帰変異頻度に対する効果を評価するために、CDAおよびAPOBEC1デアミナーゼを異なる複製起点（ゆえに異なるコピー数）、SC101、CloDF3、RSF1030、およびPUCを有する４つのプラスミド（コピー数：PUC＞RSF1030＞CloDF3＞SC101）にクローニングし、誘導性プロモーター下に置いた。プラスミドは、変異したLacZ遺伝子を含有するＦプラスミドを持つE. coli細胞に個々に形質転換した。デアミナーゼの発現を誘導し、LacZ活性を各コンストラクトについて検出した（図４９）。図４９に示されているように、CDAは、デアミナーゼがクローニングされているプラスミドコピー数にかかわらず、全ての場合においてAPOBEC1よりも有意に高い活性を見せた。さらに、コピー数の観点では、デアミナーゼ活性はそれらがクローニングされているプラスミドのコピー数と正に相関した。すなわちPUC＞CloDF3＞SC101。
LacZ復帰変異は、LacZローカスにおけるゲノムDNAのシーケンシングによって確認した。修正されたLacZ遺伝子を含有するゲノムDNAを得るために、細胞はX-galを含有する培地によって育てた。LacZ活性を有する細胞は青色コロニーを形成する。青色コロニーを選択し、ラクトースを含有する最小培地によって育てた。細胞をスピンダウンし、洗浄し、最小培地プレート（ラクトース）に再プレーティングした。それから、最も高い希釈の青色コロニーを選択し、そのゲノムDNAをLacZローカスについてシーケンシングした（図５０）。
クロラムフェニコール復帰変異アッセイを設計して、異なるシチジンデアミナーゼ（例えば、CDAおよびAPOBEC1）の活性を試験した。クロラムフェニコール耐性を細菌に付与する変異体CAT1遺伝子を持つプラスミドが、複製起点としてRSF1030によって構築されている。蛋白質を不活性にするH195R（CAC->CGC）変異を有するCAT1蛋白質をコードする、変異体CAT1遺伝子（図５１）。CGCコドン中のG塩基と塩基対形成したCの脱アミノ化は、コドンを再びCACコドンに変換し、蛋白質の活性を回復させるであろう。図５２に示されているように、CDAは、E. coliにおいて、クロラムフェニコール耐性遺伝子の活性（acitivyt）を回復させる点でrAPOBECに優っている。選択プラスミド（pNMG_ch_5）を有するS1030におけるｃｈｌｏｒの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）はおよそ１μｇ／ｍＬであった。rAPOBEC-XTEN-dCas9-UGIおよびCDA-XTEN-dCas9-UGI両方が、選択プラスミド上のDNA修正を誘導した（図５３）。
次に、huAPOBEC3G-XTEN-dCas9-UGI蛋白質を同じアッセイによって試験した。興味深いことに、huAPOBEC3G-XTEN-dCas9-UGIは、rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI融合蛋白質とは異なる配列特異性を見せた。rAPOBEC1-XTEN-dCas9-UGI融合体（これでは、位置３、６、および８が編集された）と比較して、位置８のみがAPOBEC3G-XTEN-dCas9-UGI融合体によって編集された（図５４）。
例８：より少ないオフターゲット編集によるC->T塩基編集因子
現行の塩基編集テクノロジーは、ゲノムDNA中のC:G塩基対からT:A塩基対への配列特異的変換を許す。これは、シチジンデアミナーゼ酵素によるシトシンからウラシルへの直接的な触媒的変換を経由してされ、それゆえに、従来のゲノム編集テクノロジーとは違って、第１のステップとしてDNAに二本鎖DNA切断（ＤＳＢ）を導入しない。Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J. A., and Liu, D.R. (2016), "Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage." Nature 533, 420-424参照；その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。代わりに、触媒不活性型SpCas9（dCas9）またはSpCas9ニッカーゼ（dCas9(A840H)）が、シチジンデアミナーゼ酵素、例えばrAPOBEC1、pmCDA1、またはhAPOBEC3Gにテザリングされる。目当てのゲノムローカスはsgRNAによってコードされ、DNA結合および局所的変性は融合体のdCas9部分によって促される。しかしながら、まさにwt dCas9およびwt Cas9がオフターゲットDNA結合および切断を見せるように、現行の塩基編集因子もまたCas9オフターゲットローカスにおけるC->T編集を見せ、これは、それらの治療上の有用性を限定している。
蛋白質とその標的DNAの糖－リン酸バックボーンとの間における非特異的な静電的相互作用を中和する単に３から４つの変異のSpCas9への導入が、SpCas9のDNA結合特異性を増大させるということが報告されている。Kleinstiver, B.P., Pattanayak, V., Prew, M.S., Tsai, S.Q., Nguyen, N.T., Zheng, Z., and Joung, J.K. (2016) "High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects." Nature 529, 490-495; and Slaymaker, I.M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D.A., Yan, W.X., and Zhang, F. (2015) "Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science 351, 84-88参照、それぞれの内容全体はここに参照によって本明細書に組み込まれる。よって、４つの報告された中和変異を、最初に報告された塩基編集因子BE3（配列番号２８５）に組み込み、この酵素のオフターゲットC->T編集もまた抜本的に縮減されており（図５５）、オンターゲット編集の減少はない（図５６）ということを見出した。
図５５に示されているように、HEK293T細胞を、Lipofectamine 2000を用いて、BE3またはHF-BE3、およびEMX1配列にマッチするsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後に、ゲノムDNAを抽出し、ＰＣＲによって増幅し、オンターゲットローカス、プラスJoungらによってGUTDE-seq法を用いて以前に決定されているEMX1 sgRNAの上位１０個の公知のCas9オフターゲットローカスについて、ハイスループットDNAシーケンシングによって分析した。Tsai, S.Q., Zheng, Z., Nguyen, N.T., Liebers, M., Topkar, V.V., Thapar, V., Wyvekens, N., Khayter, C, Iafrate, A.J., Le, L.P., et al. (2015) "GUTDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases." Nat Biotech 33, 187-197参照；その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。EMX1オフターゲット５ローカスは増幅せず、示されていない。オンターゲットおよびオフターゲットプロトスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）の配列が表示されている（図５５）。プロトスペーサー内の元々のCの各位置にTを有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージとして定義される、細胞のC->T変換パーセンテージが、BE3およびHF-BE3について示されている。
図５６においては、HEK293T細胞を、Lipofectamine 2000を用いて、BE3またはHF-BE3、および示されているゲノムローカスにマッチするsgRNAを発現するプラスミドによってトランスフェクションした。トランスフェクションの３日後に、ゲノムDNAを抽出し、ＰＣＲによって増幅し、ハイスループットDNAシーケンシングによってオンターゲットローカスについて分析した。各プロトスペーサー内の標的Cに全ての４つの塩基を有する合計のDNAシーケンシングリードのパーセンテージが、BE3またはHF-BE3による処置について示されている（図５６）。indel形成の頻度も同じく示されている。
HF-BE3の一次蛋白質配列（配列番号２８５）：
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例９：塩基編集テクノロジーの標的範囲および精度を増大させるための、Cas9を用いる塩基編集因子の開発と、塩基編集因子の処理能力の調節
従来のゲノム編集プラットフォームとは違って、塩基編集テクノロジーは、二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することなしに、DNAの正確な一ヌクレオチド変化を許す。Komor, A. C. et al., Nature 533, 420-424 (2016)参照。塩基編集因子の現行の世代はもっぱらNGG PAMを用いる。これは、ゲノム中の所望の塩基を編集するその能力を限定する。なぜなら、塩基編集因子は正確な場所に置かれることを必要とし、標的塩基はPAMからおよそ１５塩基上流の４塩基領域（「脱アミノ化ウインドウ」）内に置かれるからである。Komor, A. C. et al., Nature 533, 420-424 (2016)参照。その上に、シチジンデアミナーゼの高い処理能力を原因として、塩基編集因子はその脱アミノ化ウインドウ内の全てのシチジンをチミジンに変換し得、これは研究者が所望のもの以外のアミノ酸変化を誘導し得る。Komor, A. C. et al., Nature 533, 420-424 (2016)参照。
Cas9バリアントを有する塩基編集因子の開発によって塩基編集の範囲を拡大する
異なるPAM特異性を有するCas9ホモログおよび他のRNA誘導型DNA結合因子を、塩基編集因子の構造に組み込んだ。Kleinstiver, B. P. et al., Nature 523, 481-485 (2015)；Kleinstiver, B. P. et al. Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)；およびZetsche, B. et al., Cell 163, 759-771 (2015)参照；それぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。さらにその上に、種々のCas9蛋白質のPAM特異性を広げたイノベーションを組み込んで、塩基編集因子の標的範囲を一層拡大した。Kleinstiver, B. P. et al., Nature 523, 481-485 (2015)；およびKleinstiver, B. P. et al., Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)参照。塩基編集因子の現行のパレットが表４にまとめられている。
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 rAPOBEC1の部位特異的変異導入によって塩基編集因子の処理能力を調節する
塩基編集因子の処理能力は、デアミナーゼ酵素中に点変異を作ることによって調節され得ると推論された。関係するタイムスケール内で、塩基編集因子が平均でシチジン脱アミノ化の１ラウンドをなお触媒し得るが、別の脱アミノ化にアクセスおよびそれを触媒することは非蓋然的であるような、デアミナーゼの触媒活性を軽度に縮減する変異の組み込みを追求した。事実上、もたらされる塩基編集因子はより狭い脱アミノ化ウインドウを有するであろう。
本研究において探査したrAPOBEC1変異が表５に挙げられている。変異のいくつかはrAPOBEC1触媒反応の軽度の見かけ上の障害をもたらし、これは、複数のシチジンが脱アミノ化ウインドウ内に見出されるときには、別のものと比べて１つのシチジンの選好的な編集として顕出した。これらの変異のいくつかを組み合わせることは相加的効果を有し、塩基編集因子が基質シチジンをより高い厳格さで識別することを許した。二重変異体および三重変異体のいくつかは、互いに直に隣り合った複数のシチジンのうち、１つのシチジンの選択的編集を許した（図５７）。
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 塩基編集因子のPAM拡大および処理能力調節
他のRNA誘導型DNA結合因子を用いることによってゲノム中の編集可能なシチジンを拡大するするために、塩基編集因子の次世代を設計した（図５８）。NGG PAMを用いることは「ウインドウ」内に単一の標的のみを許すのに対して、複数の異なるPAMの使用は、Cas9がどこにも位置して選択的な脱アミノ化を生ぜしめることを許す。種々の新たな塩基編集因子をCas9バリアントから作り出した（図５９および表４）。異なるPAM部位（NGA、図６０；NGCG、図６１；NNGRRT、図６２；およびNNHRRT、図６３）を調査した。選択的脱アミノ化が、シチジンデアミナーゼ点変異導入の速度論的調節によって上首尾に達成された（図６５および表５）。
それから、脱アミノ化ウインドウに対する種々の変異の効果を、細胞培養物において複数のシチジンを有するスペーサーを用いて検討した（図６６および６７）。
さらに、シチジンの限定された数を有する異なるゲノム部位に対する種々の変異の効果を調べた（図６８から７１）。スペーサー中の脱アミノ化ウインドウ（windown）内のおよそ１つのシチジンが編集され、一方で、シチジンの残りは無傷で残されるであろうということが見出された。総体的には、編集の選好性は次の通りである：C6＞C5＞＞C7≒C4。
Cpf1を用いる塩基編集
Cas9ホモログCpf1は、AsCpf1、LbCpf1として、またはいずれかの他の種から得られ得る。BE2およびBE3均等物を包含する融合コンストラクトの概略が図７３に示されている。BE2均等物はCas9の代わりに触媒不活性なCpf2酵素（dCpf1）を用い、一方で、BE3均等物はCpf1変異体を包含し、これは標的鎖にニックを入れる。下の概略は、その上に図解されている２つのイノベーションを組み合わせるための異なる融合構造を図示している（図７３）。Cpf1 BE2を用いたHEK293T細胞のTTTN PAM部位の塩基編集結果を、異なるスペーサーについて調べた（図６４Ａから６４Ｃ）。いくつかの態様において、Cpf1は、本明細書において提供される塩基編集因子のいずれかにおいてCas9ドメインの代わりに用いられ得る。いくつかの態様において、Cpf1は、配列番号３１３と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．５％同一である蛋白質である。
Cpf1の全長蛋白質配列（配列番号３１３）：
Figure 0007067793000393
Figure 0007067793000394
例１０：塩基編集の増大したフィデリティ
BE3およびHF-BE3のプラスミド送達の間における違いを調べ、２つが同等の効率でオンターゲットローカスを編集するということが見出された（図７４および７５）。しかしながら、HF-BE3はBE3よりも大分少ないオフターゲットローカスを編集し、HF-BE3がBE3よりも大分高いDNA特異性を有するということを意味した（図７６）。HEK細胞へのデアミナーゼ蛋白質リポフェクションはBE3の蛋白質送達が、同等のオンターゲット活性、しかしBE3のプラスミドDNA送達よりも大分良い特異性をもたらすということを実証した。改善されたトランスフェクション手続きおよびより良いプラスミドを用いて（ｎ＝２）、実験は次の条件を用いた：蛋白質送達は１２５ｎＭのCas9:sgRNA複合体であり、プラスミド送達は７５０ｎｇのBE3/HF-BE3プラスミド＋２５０ｎｇのsgRNAプラスミドであり、リポフェクションはウェルあたりLipofectamine 2000の１．５μＬによってであった。EMX-1オフターゲット部位２およびFANCFオフターゲット部位１は、アッセイされたオフターゲットの全てと比較して、BE3による最も多いオフターゲット編集を示し（図７７および７８）、一方で、HEK-3は送達方法のいずれかについてオフターゲットの有意な編集を示さなかった（図７９）。HEK-4はオンターゲット部位におけるいくらかのC->G編集を示し、一方で、そのオフターゲット部位１、３、および４は全てのアッセイされた部位の中で最も多いオフターゲット編集を示した（図８０）。
ゼブラフィッシュへのマイクロインジェクションによるBE3蛋白質の送達
TYRガイドRNAを、インビトロアッセイによってsgRNA活性について試験した（図８１および８２）。％ＨＴＳリードは、精製されたBE3蛋白質との２ｈインキュベーションおよびもたらされる産物のＰＣＲの間に、どのくらい多くのC残基がT残基に変換されたかを示している。実験は、そのゲノム的文脈の６０ｂｐ中の標的脱アミノ化部位を有する８０ｍｅｒの合成DNA基質（substate）を用いた。これは％編集されたDNA鎖と同じではない。なぜなら、１つの鎖のみにはニックが入っており、そのため、産物はＰＣＲによって増幅されないからである。編集されたＨＴＳリードの割合はｘ／（２－ｘ）に等しく、ｘは編集されたＴＨＳリードの実際の割合である。６０％の編集では、編集された塩基の実際の割合は７５％である。「オフターゲット」は、オフターゲットsgRNAに結合させた一方で同じDNA基質とインキュベーションされたBE3に相当する。sgRNAのsgRH_13、sgHR_17、およびおそらくsgHR_16は、インビボのインジェクション実験では有望な標的に見えるということが見出された。
BE3蛋白質の送達をインビボでゼブラフィッシュによって試験した。ゼブラフィッシュ胚（ｎ＝１６～２４）に、スクランブル（scramled）sgRNA、sgHR_13、sgHR_16、またはsgHR_17どちらか、および精製されたBE3をインジェクションした。各条件からの３個の胚を独立して（単一の胚）分析し、各条件について、インジェクションされた胚の全てをプールし、プールとしてシーケンシングした。結果は図８３から８５に示されている。
例１１：疾患を処置するための塩基編集因子の使用
本明細書において提供される塩基編集因子または複合体（例えば、BE3）は核酸を改変するために用いられ得る。例えば、塩基編集因子は、核酸（例えば、DNA）中のシトシンをチミンに変化させるために用いられ得る。かかる変化は、とりわけ蛋白質のアミノ酸配列を変改するか、開始コドンを壊すかもしくは作り出すか、ストップコドンを作り出すか、スプライシングドナーを破壊する（distupt）か、スプライシングアクセプターを破壊するか、または制御配列を編集するために作られ得る。可能なヌクレオチド変化の例は図８６に示されている。
本明細書において提供される塩基編集因子または複合体（例えばBE3）は、対象のアポリポ蛋白質Ｅのアイソフォームを編集するために用いられ得る。例えば、アポリポ蛋白質Ｅアイソフォームは、アルツハイマー病を発生するより低いリスクに関連するアイソフォームを生むように編集され得る。アポリポ蛋白質Ｅは、アミノ酸１１２および１５８が異なる４つのアイソフォームを有する。APOE4は、晩期発症型アルツハイマー病の最も大きい最も共通の遺伝学的リスク因子である。核酸配列CGCによってコードされるAPOE4のアルギニン残基１５８は、CGC核酸配列を残基１５８のシステインをコードするTGCに変化させるように塩基編集因子（例えばBE3）を用いることによって、システインに変化させられ得る。この変化はAPOE3rアイソフォームを生み、これはより低いアルツハイマー病リスクに関連する。図８７参照。
塩基編集因子BE3がマウスアストロサイトのAPOE4をAPOE3rに編集するために用いられ得るかどうかを試験した（図８８）。APOE4マウスアストロサイトをCas9+鋳型またはBE3によってヌクレオフェクションし、APOE4のアルギニン１５８をコードする核酸をターゲティングした。Cas9+鋳型は０．３％の編集のみを生み、２６％のindelであった。一方で、BE3は７５％の編集を生み、５％のindelであった。２つの追加の塩基編集されたシトシンはサイレントであり、アミノ酸配列の変化を生まない（図８８）。
本明細書において提供される塩基編集因子または複合体は、プリオン蛋白質疾患、例えばクロイツフェルト・ヤコブ病および致死性家族性不眠症を、例えばPRNP遺伝子に変異を導入することによって処置するために用いられ得る。復帰変異のPRNP変異は治療結果を生み得、PRNPのindel（intel）は病因性であり得る。従って、塩基編集因子（例えばBE3）を用いてPRNPを変異させて、PRNP遺伝子に未成熟ストップコドンを導入し得るかどうかを試験した。そのガイドRNAと会合したBE3をHEK細胞または膠芽腫細胞に導入し、PRNP遺伝子を編集して、残基３７のコードされたアルギニンをストップコドンに変化させることができた。BE3は４１％の編集を生んだ（図８９）。
編集され得る追加の遺伝子は次を包含する：増大したアルツハイマーのリスクを処置するためのArg112およびArg158のAPOE編集；アルツハイマーのリスクを減少させるためのAla673のAPP編集；致死性家族性不眠症および他のプリオン蛋白質疾患を処置するためのArg37のPRNP編集；デュシェンヌ型筋ジストロフィーを処置するためのエキソン２３および５１のスプライシング部位のDMD編集；肥満リスクを処置するためのイントロン１のFTO編集；ペンドレッド症候群（遺伝学的難聴）を処置するためのエキソン８のPDS編集；先天性難聴を処置するためのエキソン８のTMC1編集；慢性肉芽腫症を処置するための種々の患者に関係する変異のCYBB編集。本明細書において提供される塩基編集因子を用いて処置され得る追加の疾患が下の表６に示されている。
UGIもまた鍵となる役割を果たす。UDG（これをUGIは阻害する）をノックアウトすることは、C->T塩基編集のクリーンさおよび効率を劇的に改善することが示された（図９０）。さらにその上に、UGIなしのニッカーゼを有する塩基編集因子はアウトカムの混合物を生ずることが示され、非常に高いindel率であった（図９１）。
例１２：塩基編集のターゲティング範囲を拡大する
塩基編集はゲノム編集の新たなアプローチであり、これは、触媒的に欠損したStreptococcus pyogenes Cas9とシチジンデアミナーゼと塩基除去修復の阻害とを含有する融合蛋白質を用いて、二本鎖DNA切断を生成することなしに、ドナーDNA鋳型を要求することなしに、過剰な確率的な挿入および欠失を誘導することなしに、DNA中のプログラム可能な一ヌクレオチドC-T（またはG-A）変化を誘導する１。塩基編集によってターゲティングされ得る部位の数を２．５倍拡大するための異なるプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）特異性を有する天然のおよび操作されたCas9バリアントを用いる、５つの新たなC-T（またはG-A）塩基編集因子の開発が、本明細書に記載されている。加えて、見かけ上の編集ウインドウの幅をおよそ５ヌクレオチドから１または２ヌクレオチドに狭める変異したシチジンデアミナーゼドメインを含有する新たな塩基編集因子を操作し、以前には同等の効率で編集されたであろう隣同士のCヌクレオチドの識別を可能にした。一緒になって、これらの開発は、塩基編集のターゲティング範囲を実質的に増大させる。
CRISPR-Cas9ヌクレアーゼは標的特異的ゲノム編集を媒介するために広く用いられてきた２。大部分のゲノム編集用途では、Cas9がシングルガイドRNA（sgRNA）をの複合体を形成し、sgRNA配列によって規定される標的部位に二本鎖DNA切断（ＤＳＢ）を誘導する。細胞は主に非相同（non-homologuous）末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路によってこのＤＳＢに応答し、これは、遺伝子を破壊するフレームシフト変異を引き起こし得る確率的な挿入または欠失（indel）をもたらす。ＤＳＢをフランキングする配列に対する相同性の高い程度を有するドナーDNA鋳型の存在下においては、相同組換え修復（ＨＤＲ）として公知の代替的な経路によって遺伝子修正が達成され得る３，４。残念ながら、大部分の非撹乱条件下においては、ＨＤＲは非効率的であり、細胞の状態および細胞の型に依存的であり、indelのより大きい頻度によって支配されている３，４。ヒト疾患に関連する公知の遺伝子バリエーションの大部分は点変異であるので５、正確な点変異をより効率的にクリーンに作り得る方法が必要とされる。
塩基編集は、ＤＳＢを誘導することなしにプログラム可能な様式でT:A塩基対によるC:G塩基対の標的特異的な置き換えを可能にし１、最近記載された。塩基編集は、Streptococcus pyogenes Cas9（SpCas9）の触媒不活性化型（dCas9）またはニッカーゼ形態と、APOBEC1などのシチジンデアミナーゼと、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（UGI）などの塩基除去修復の阻害剤との融合蛋白質を用いて、sgRNAによって規定される５ヌクレオチドウインドウ内のシチジンをウリジンに変換する１。第３世代塩基編集因子BE3は、種々の細胞株において、疾患に関係する点変異を包含するC:G塩基対をT:A塩基対に変換し、他のゲノム編集方法を用いて達成され得るものよりも高い効率および低いindel頻度である１。爾後の研究は、デアミナーゼ-dCas9融合体アプローチを種々の状況においてバリデーションしている６，７。
BE3による効率的な編集は、プロトスペーサーのPAMから遠位の末端の近くの５ヌクレオチドウインドウ（位置４～８。PAMを位置２１～２３としてカウントする）内に標的Cを置く、NGG PAMの存在を要求する１。このPAM要件は、BE3によって効率的にターゲティングされ得るヒトゲノム中の部位の数を実質的に限定している。なぜなら、目当ての多くの部位は、標的Cの１３から１７ヌクレオチド下流のNGGを欠いているからである。その上に、BE3の高い活性および処理能力は、編集ウインドウ内のすべてのCからTへの変換をもたらし、これは潜在的に、望まれない変化を標的ローカスに導入し得る。本明細書においては、これらの限定の両方に対処する新たなC:G->T:A塩基編集因子が記載されている。
DNAに結合し、一本鎖DNAバブルを含有する「Ｒループ」複合体を形成するいずれかのCas9ホモログが８、原理的には塩基編集因子に変換され得るということが考えられた。これらの新たな塩基編集因子は、非NGG PAM部位が編集されることを許すことによって、標的化可能なローカスの数を拡大するであろう。Staphylococcus aureusからのCas9ホモログ（SaCas9）はSpCas9よりもかなり小さく（１０５３ｖｓ．１３６８残基）、哺乳類細胞における効率的なゲノム編集を媒介し得、NNGRRT PAM９を要求する。BE3中のSpCas9をSaCas9によって置き換えて、SaBE3を創り、SaBE3、および６つのヒトゲノムローカスをターゲティングするsgRNAをコードするプラスミドによってHEK293T細胞をトランスフェクションした（図９２Ａおよび９２Ｂ）。３ｄ後に、ゲノムローカスをハイスループットDNAシーケンシング（ＨＴＳ）に付して、塩基編集効率を定量した。SaBE3は、ヒト細胞内の種々のゲノム部位における標的CのC->T塩基編集を可能にし、非常に高い変換効率（トランスフェクションされた細胞の濃縮なしで、CからTに変換された合計のDNA配列のおよそ５０～７５％）が、位置６～１１のCをターゲティングすることから生起した。一般的に、NNGRRT含有標的部位におけるSaBE3の効率は、NGG含有標的部位におけるBE3のものを上回った１。多分そのより高い平均効率を原因として、SaBE3は、古典的BE3活性ウインドウの外の位置においてもまた標的Cの検出可能な塩基編集をもたらし得る（図９２Ｃ）。比較して、BE3は、同じ条件下において、公知のSpCas9 PAM選好性に従う有意に縮減した編集を示した（０～１１％）（図１０６Ａ）１０。これらのデータは、SaBE3が、BE3にはアクセス可能でない部位における非常に効率的な塩基編集を促し得るということを示している。
PAM特異性を拡大または変改する最近操作されたCas9バリアントを適用することによって、塩基編集因子のターゲティング範囲をさらに拡大した。最近、Joungらは、NGA（VQR-Cas9）、NGAG（EQR-Cas9）、またはNGCG（VRER-Cas9）PAM配列を受容する３つのSpCas9変異体を報告した１１。加えて、Joungらは、そのPAM要件をNNNRRTに緩める３つの変異を含有するSaCas9バリアント（SaKKH-Cas9）を操作した１２。BE3のSpCas9部分をこれらの４つのCas9バリアントによって置き換えて、VQR-BE3、EQR-BE3、VRER-BE3、およびSaKKH-BE3を生じた。これらはそれぞれNNNRRT、NGA、NGAG、およびNGCG PAMをターゲティングする。HEK293T細胞を、各新たな塩基編集因子について、これらのコンストラクト、および６つのゲノムローカスをターゲティングするsgRNAをコードするプラスミドによってトランスフェクションし、ＨＴＳを用いてC->T塩基変換を測定した。
SaKKH-BE3は、処置された濃縮されていない細胞の６２％までの効率で、NNNRRT PAMを有する部位を編集した（図９２Ｄ）。予想されたように、SaBE3は、NNNHRRT（H＝A、C、またはT）であるPAMを含有する標的を効率的に編集する能力がなかった（図９２Ｄ）。VQR-BE3、EQR-BE3、およびVRER-BE3は、予想されるPAM要件を有するゲノムローカスにおいて、処置された未濃縮の細胞の５０％までというより控えめな、しかしなお実質的な塩基編集効率を見せ、BE3のものに類似の編集ウインドウであった（図９２Ｅおよび９２Ｆ）。VQR-BE3、EQR-BE3、およびVRER-BE3の塩基編集効率は、一般的には、対応するCas9ヌクレアーゼの報告されているPAM要件に密接に倣っていた；例えば、EQR-BE3は、NGAH PAM配列を含有する標的を効率的に編集する能力がなかった（図９２Ｆ）。対照的に、BE3は、蓋然的にはそのPAM制限を原因として、NGAまたはNGCG PAMを有する部位を効率的に編集する能力がなかった（０～３％）（図１０６Ｂ）。
併せて、SaBE3、SaKKH-BE3、VQR-BE3、EQR-BE3、およびVRER-BE3の特性は、塩基編集因子が、Cas9ホモログおよび操作されたバリアントを活用するそれらの能力を促すモジュール性を見せるということを確証している。
次に、変改された活性ウインドウ幅を有する塩基編集因子を開発した。BE3の活性ウインドウ内の全てのCは効率的にTに変換され得る１。このウインドウの幅を調節する能力は、BE3活性ウインドウ内に存在するCのあるサブセットのみを編集することが重要であるケースにおいて有用であろう。
APOBEC1とdCas9との間のリンカーの長さは、インビトロでAPOBEC1によってアクセス可能である塩基の数を調節することが以前に観察されている１。しかしながら、HEK293T細胞においては、リンカー長を変えることは編集ウインドウの幅を有意に調節せず、複雑な細胞内環境においては、dCas9およびシチジンデアミナーゼの相対的配置および柔軟性はリンカー長によって強くは決定されないということを示唆した（図９６）。次に、sgRNAの５’末端を短縮することが、RNA-DNAヘテロ二本鎖の形成時のデアミナーゼにアクセス可能な一本鎖DNAの長さを縮減することによって、塩基編集ウインドウを狭め得るということが考えられた。HEK293T細胞を、BE3、および編集ウインドウ内に複数のCを有するローカスをターゲティングする異なるスペーサー長のsgRNAをコードするプラスミドによってコトランスフェクションした。１７から１９塩基のスペーサーを有する短縮されたsgRNAを用いたときには、塩基編集の幅の一貫した変化は観察されなかった（図９５Ａから９５Ｃ）。sgRNAスペーサーを１７塩基よりも少なくまで短縮することは、活性の大きい損失をもたらした（図９５Ａ）。
代替的なアプローチとして、デアミナーゼドメインの変異が、複数の可能なメカニズムによって編集ウインドウの幅を狭め得るということが考えられた。第１に、いくつかの変異は、デアミナーゼ活性部位へのCの非最適な提示の許容性を縮減するやり方で、基質結合、結合されたDNAの立体配座、または活性部位への基質アクセス性を変改し得る。第２に、APOBEC1の高い活性は蓋然的にDNA結合イベントあたり複数のCの脱アミノ化に寄与するので１，１３，１４、塩基編集因子のデアミナーゼドメインの触媒効率を縮減する変異は、それがDNAから解離する前に脱アミノ化の連続したラウンドを触媒することを防止し得る。ひとたびいずれかのC:G->T:A編集イベントが起こると、sgRNAはもはや標的DNA配列とパーフェクトマッチせず、標的ローカスへの塩基編集因子の再結合はより好都合ではないであろう。両方の戦略を、元々の編集ウインドウ内の複数のシチジンを見分ける新たな塩基編集因子を発見しようという努力の中で試験した。
利用可能なAPOBEC1構造の不在を考慮して、その活性部位含有ドメイン対APOBEC1のものの４２％の配列類似性を持ち合う同じファミリーのシチジンデアミナーゼ、APOBEC3Gの触媒活性を調節することが以前に報告されている数個の変異を同定した１５。対応するAPOBEC1変異をBE3に組み込み、塩基編集効率および編集ウインドウ幅に対するそれらの効果を、HEK293T細胞において、Cを位置３、４、５、６、８、９、１０、１２、１３、および１４に含有する（部位Ａ）か；またはCを位置５、６、７、８、９、１０、１１、および１３に含有する（部位Ｂ）２つのCリッチなゲノム部位について評価した。
APOBEC1変異R118AおよびW90Aは、それぞれ、塩基編集効率の劇的な損失に至った（図９７Ｃ）。R132Eは編集効率の一般的減少に至ったが、編集ウインドウの形状を変化させることまたは（the）実質的に狭めることをしなかった（図９７Ｃ）。対照的に、実質的な編集効率を維持しながら、編集ウインドウの幅を狭める数個の変異が見出された（図９３Ａおよび９７Ｃ）。「編集ウインドウ幅」は、その中では編集効率がその標的の半数値を上回る人為的に計算されたウインドウ幅に相当すると定義した。試験された２つのCリッチなゲノム部位について、BE3の編集ウインドウ幅は５．０（部位Ａ）および６．１（部位Ｂ）ヌクレオチドであった。
APOBEC1のR126はssDNAのリン酸バックボーンと相互作用すると予測されている１３。以前の研究は、対応する変異をAPOBEC3Gに導入することが、触媒反応を少なくとも５倍減少させたということを示している１４。興味深いことに、BE3のAPOBEC1中に導入されたときに、R126AおよびR126Eは、最も強く編集された位置（C5、C6、およびC7）においてBE3に対して相対的に活性を増大させるかまたは維持し、一方で、他の位置における編集活性は減少させた（図９３Ａおよび９７Ｃ）。よって、これらの２つの変異のそれぞれは、部位Ａおよび部位Ｂにおける編集ウインドウの幅をそれぞれ４．４および３．４ヌクレオチドに（R126A）、または４．２および３．１ヌクレオチドに（R126E）狭めた（図９３Ａおよび９７Ｃ）。
APOBEC1のW90（APOBEC3GのW285に対応する）は、APOBEC3G活性部位の疎水性ポケットを形成し、基質結合を手助けすると予測されている１３。この残基をAlaに変異させることは、APOBEC3Gの触媒活性を廃止した１３。BE3において、W90Aはほとんど完全に塩基編集効率を廃止した（図９７Ｃ）。対照的に、W90Yは塩基編集活性を控えめにのみ減少させ、一方で、部位Ａおよび部位Ｂにおける編集ウインドウ幅をそれぞれ３．８および４．９ヌクレオチドに狭めるということが見出された（図９３Ａ）。これらの結果は、シチジンデアミナーゼドメインの変異が、対応する塩基編集因子の活性ウインドウ幅を狭め得るということを実証している。
塩基編集活性を抜本的に縮減することなしに編集ウインドウを狭める３つの変異、W90Y、R126E、およびR132Eを組み合わせ、二重および三重変異した塩基編集因子にした。二重変異体W90Y+R126Eは、BE3様の最大編集効率だが、実質的に狭まった編集ウインドウ幅（部位Ａおよび部位Ｂにおける幅＝それぞれ２．９および３．０ヌクレオチド）を有する塩基編集因子（YE1-BE3）をもたらした（図９３Ａ）。W90Y+R132E塩基編集因子（YE2-BE3）は、控えめにより低い編集効率（BE3と比較して、試験された５つの部位ついて平均して１．４倍低い最大編集収率であった）、および実質的に狭まった編集ウインドウ幅（部位Ａおよび部位Ｂにおける幅＝それぞれ２．７および２．８ヌクレオチド）をもまた見せた（図９７Ｃ）。R126E+R132E二重変異体（EE-BE3）は、YE2-BE3と類似の最大編集効率および編集ウインドウ幅を示した（図９７Ｃ）。三重変異体W90Y+R126E+R132E（YEE-BE3）は、２．０倍低い平均最大編集収率、しかしＣ６位置以外では非常に少ない編集、ならびに２．１および１．４ヌクレオチドという編集ウインドウ幅をそれぞれ部位Ａおよび部位Ｂについて見せた（図９７Ｃ）。併せると、これらのデータは、シチジンデアミナーゼドメインの変異が編集ウインドウ幅に強く影響し得るということを示しており、いくつかのケースにおいては、編集効率に対しては最小限のまたは控えめな効果のみである。
BE3活性ウインドウ内に複数のCを含有する４つのよく研究されたヒトゲノム部位をターゲティングし、BE3、YE1-BE3、YE2-BE3、EE-BE3、およびYEE-BE3の塩基編集アウトカムをHEK293T細胞においてさらに比較した１。これらの標的ローカスは、標的Cを位置４および５（HEK部位３）、位置４および６（HEK部位２）、位置５および６（EMX1）、または位置６、７、８、および１１（FANCF）に含有した。BE3は、位置４～８の活性ウインドウ内のいずれかのCを編集することについて少ない（＜１．２倍）選好性を見せた。対照的に、YE1-BE3は、C4と比べてC5を編集する１．３倍の選好性（HEK部位３）、C4と比べてC6の２．６倍の選好性（HEK部位２）、C6と比べてC5の２．０倍の選好性（EMX1）、およびC7と比べてC6の１．５倍の選好性（FANCF）を見せた（図９３Ｂ）。YE2-BE3およびEE-BE3は、YE1-BE3よりもやや高い位置特異性（より狭い活性ウインドウ）を見せ、平均してC4と比べてC5を編集する２．４倍の選好性（HEK部位３）、C4と比べてC6の９．５倍の選好性（HEK部位２）、C6と比べてC5の２．９倍の選好性（EMX1）、およびC6と比べてC7の２．６倍の選好性（FANCF）であった（図９３Ｂ）。YEE-BE3は最高の位置選択性を示し、C4と比べてC5を編集する２．９倍の選好性（HEK部位３）、C4と比べてC6の２９．７倍の選好性（HEK部位２）、C6と比べてC5の７．９倍の選好性（EMX1）、C6と比べてC7の７．９倍の選好性（FANCF）であった（図９３Ｂ）。知見は、両方のヌクレオチドがBE3編集ウインドウ内にあるときでさえも、変異体塩基編集因子が隣接するC同士を識別し得るということを確証している。
これらの４つの変異体およびBE3の産物分布をさらにＨＴＳによって分析して、それらの見かけ上の処理能力を評価した。BE3は、処置されたHEK293T細胞において圧倒的にT4-T5（HEK部位３）、T4-T6（HEK部位２）、およびT5-T6（EMX1）産物を生成し、単一のTを含有する産物よりも、平均で７．４倍多くの２つのTを含有する産物をもたらした。対照的に、YE1-BE3、YE2-BE3、EE-BE3、およびYEE-BE3は、一重編集されたC4-T5、C4-T6、およびT5-C6産物について実質的により高い選好性を示した（図９３Ｃ）。YE1-BE3は、１．４という平均一重T対二重T産物比を有する産物を生んだ。YE2-BE3およびEE-BE3は、それぞれ４．３および５．１という平均一重T対二重T産物比を有する産物を生んだ（図９３Ｃ）。上の結果と一致して、YEE-BE3三重変異体は、３つのゲノムローカスについて平均１４．３倍だけ一重T産物を選好した（図９３Ｃ）。１つのCのみが標的ウインドウ内にある標的部位では（HEK部位４、位置C5）、全ての４つの変異体はBE3と同等の編集効率を見せた（図９８）。これらの知見は、これらのBE3変異体が減少した見かけ上の処理能力を有し、BE3編集ウインドウ内に複数のCを含有する標的部位において単一のCのみの変換を選好し得るということを示している。これらのデータは、これらの変異体塩基編集因子についてC5＞C6＞C7≒C4という位置選好性をもまた示唆しているが、この選好性は標的配列に依存して異なり得る。
APOBEC1のウインドウを調節する変異をVQR-BE3に適用し、NGA PAMによってターゲティングされる部位における基質の選択的な塩基編集を許した（図１０７Ａ）。しかしながら、それらの変異をSaKKH-BE3に適用したときには、基質選択性の改善なしに、塩基編集効率の線形の減少が観察され、BE3およびそのバリアントのものとは異なるこの塩基編集因子の速度論的平衡および基質アクセス性を示唆した（図１０７Ｂ）。
本研究に記載される変改されたPAM特異性を有する５つの塩基編集因子は、一緒になって、原理的に塩基編集によって編集され得るClinVarデータベース中の疾患関連変異の数を、２．５倍増大させる（図９４Ａおよび９４Ｂ）。類似に、狭まった編集ウインドウを有する塩基編集因子の開発は、非標的Cの同等の改変なしに塩基編集によって修正され得る正しく位置したNGG PAMを有するClinVarエントリーの画分をおよそ倍化させる（BE3の３１％からYEE-BE3の５９％に）（図９４Ａおよび９４Ｂ）。
まとめると、塩基編集のターゲティング範囲は、異なるPAM特異性を有するCas9バリアントを用いる塩基編集因子を開発することと、様々な編集ウインドウ幅を有するデアミナーゼ変異体のコレクションを開発することとによって、実質的に拡大した。理論上は、塩基編集は、一本鎖特異的ヌクレオチドデアミナーゼ酵素の基質としての用をなし得る一本鎖DNAのバブルを作り出す他のプログラム可能なDNA結合蛋白質（例えばCpf1１６）を用いて可能であるはずである。
材料と方法
クローニング．ＰＣＲはQ5 Hot Start High-Fidelity DNAポリメラーゼ（New England Biolabs）を用いて行った。BEおよびsgRNAのプラスミドはUSERクローニング（New England Biolabs）を用いて構築し、以前に報告されているプラスミドから得た１。DNAベクター増幅はNEB 10-betaコンピテントセル（New England Biolabs）を用いて実施した。
細胞培養．HEK293T（ATCC CRL-3216）は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地プラスGlutaMax（Thermo Fisher）によって、３７℃において５％ＣＯ２で培養した。APOE遺伝子のApoE4アイソフォームを含有する不死化ラットアストロサイト（Taconic Biosciences）は、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２００μｇ／ｍＬジェネティシン（Thermo Fisher Scientific）を添加したダルベッコ改変イーグル培地プラスGlutaMax（Thermo Fisher Scientific）によって維持した。
トランスフェクション．HEK293T細胞を４８ウェルコラーゲンコートBioCoatプレート（Corning）に播種し、およそ８５％コンフルエントでトランスフェクションした。BEの７５０ｎｇおよびsgRNA発現プラスミドの２５０ｎｇを、ウェルあたりLipofectamine 2000（Thermo Fisher Scientific）の１．５μＬを用いて製造者のプロトコールに従ってトランスフェクションした。
ゲノムDNAサンプルのハイスループットDNAシーケンシング．トランスフェクションされた細胞を３ｄ後に収穫し、ゲノムDNAを、Agencourt DNAdvanceゲノムDNA単離キット（Beckman Coulter）を用いて製造者の説明書に従って単離した。目当てのゲノム領域は、補足的な配列に挙げられているフランキングＨＴＳプライマーペアによるＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ増幅は、Phusion hot-start II DNAポリメラーゼ（ThermoFisher）によって製造者の説明書に従って実施した。ＰＣＲ産物はRapidTip（Diffinity Genomics）を用いて精製した。二次ＰＣＲを行ってシーケンシングアダプターを取り付けた。産物をゲル精製し、KAPA Library Quantification Kit-Hlumina（KAPA Biosystems）を用いて定量した。サンプルは以前に記載されているようにIllumina MiSeqによってシーケンシングした１。
データ分析．ヌクレオチド頻度は、以前に記載されているMATLABスクリプトを用いて評価した１。簡潔には、リードをSmith-Watermanアルゴリズムによって参照配列に対してアラインメントした。Ｑスコアが３０よりも下のベースコールは、プレースホルダーヌクレオチド（N）によって置き換えた。この品質閾値は、１０００分の１という予想される理論上のエラー率を有するヌクレオチド頻度をもたらす。
塩基編集処理能力の分析はカスタムのpythonスクリプトを用いて行った。このプログラムは、シーケンシングリードを、標的部位をフランキングするべき７ヌクレオチド配列についてパーフェクトマッチによって決定された２０ヌクレオチドプロトスペーサー配列にトリミングする。それから、それらの標的をコンソリデーションし、アバンダンスによってソーティングして、塩基編集産物の頻度を評価した。
ヒト疾患関連変異のClinVarデータベースのバイオインフォマティクス分析を、小さい調整はあるが、以前に記載されているものと類似の様式で行った１。それらの調整は、カスタマイズ可能な長さおよび配列のPAMを有する標的の同定を可能にする。加えて、この改善されたスクリプトは標的C位置の優先度ランキングを包含しており（C5＞C6＞C7＞C8≒C4）、それゆえに、オンターゲットCがウインドウ内の唯一のシトシンであるか、または編集ウインドウ内のいずれかのオフターゲットCよりも高い予測される編集効率を有する位置に置かれているかどちらかの標的部位の同定を可能にする。
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例１３：
改善されたトランスフェクション手続きおよびより良いプラスミドを用いて、生物学的レプリケート（ｎ＝３）を用いて４つのHF変異をBE3のCas9部分に実装した。変異（muation）は、プラスミド送達ではオンターゲット編集に有意に影響（effect）しない（図９９）。試験された濃度において、BE3蛋白質送達は動く；しかしながら、オンターゲット編集はプラスミド送達よりも低い（図１００）。HF変異が実装されたBE3の蛋白質送達は、オンターゲット編集効率を縮減するが、いくつかの編集された細胞をなお生む（図１０１）。
リポフェクションとHF変異を実装することと両方は、オフターゲット脱アミノ化イベントを減少させることが示された。図１０２に示されている４つの部位について、最も高いGUTDE-Seqリードおよび脱アミノ化イベントを有するオフターゲット部位（sitest）（OT）をアッセイした（Komor et al, Nature, 2016）。特異性比を、最も近い対応するCにおいてオンターゲット編集によってオフターゲット編集を除算することによって計算した。オフターゲット編集が検出可能ではなかったケースにおいては、比を１００に設定した。それゆえに、より高い特異性比は、より特異的なコンストラクトを示す。BE3プラスミド送達は、BE3の蛋白質送達、HF-BE3のプラスミド送達、またはHF-BE3の蛋白質送達よりも大分高いオフターゲット／オンターゲット編集を示した（図１０２および１０５）。
精製された蛋白質HF-BE3およびBE3を、最も許容的なモチーフを有するスペーサー内の異なる位置においてC残基をT残基に変換するそれらの能力についてインビトロで分析した。BE3およびHF-BE3蛋白質両方は塩基編集の同じ「ウインドウ」を有することが見出された（図１０３および１０４）。
疾患標的のリストが表９において与えられている。表９において編集されるべき塩基は太字かつ下線で示されている。
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本開示の塩基編集因子または複合体によってターゲティングされ得るヒトゲノム中の追加の例示的な遺伝子は、本明細書においては表７および８によって提供される。表７は、例えばBE3核酸塩基編集因子を用いてシトシン（C）をチミン（T）に変化させることによって修正され得る遺伝子変異を包含する。表８は、例えばBE3核酸塩基編集因子を用いてグアニン（G）をアデニン（A）に変化させることによって修正され得る遺伝子変異を包含する。
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均等物と範囲
当業者は、本明細書に記載される態様の多くの均等物を認識するか、または慣例的な実験作業だけを用いて確かめる能力があるであろう。本開示の範囲は、上の記載に限定されることを意図されておらず、むしろ付加されている請求項に示されている通りである。
「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、それと逆に示されないかまたは文脈から別様に明白でない限り、１つまたは１つよりも多くを意味し得る。ある群の２つ以上のメンバーの間に「または」を包含する請求項または記載は、それと逆に示されないかまたは文脈から別様に明白でない限り、群のメンバーの１つ、１つよりも多く、または全てが存在する場合には、満足されると見なされる。２つ以上の群のメンバー間に「または」を包含する群の開示は、群の厳密に１つのメンバーが存在する態様、群の１つよりも多くのメンバーが存在する態様、および群のメンバーの全てが存在する態様を提供する。簡潔性の目的のために、それらの態様は本明細書において個々に書き出していないが、それらの態様のそれぞれが本明細書において提供されており、具体的に請求または放棄され得るということは理解されるであろう。
本発明は、１つ以上の限定、要素、節、または記述用語が請求項の１つ以上からまたは明細書の１つ以上の関係する部分から別の請求項に導入される全てのバリエーション、組み合わせ、および順列を包摂するということは理解されるはずである。例えば、別の請求項に従属するある請求項は、同じ基礎請求項に従属するいずれかの他の請求項に見出される限定の１つ以上を包含するように改変され得る。さらにその上に、別様に示されない限り、または矛盾もしくは不一致が生起するであることが当業者に明白でない限り、請求項が組成物を記載しているところでは、適宜、本明細書において開示される作るもしくは用いる方法のいずれかに従って、または当分野において公知の方法に従って、組成物を作るまたは用いる方法が包含されるということは理解されるはずである。
要素がリストとして、例えばマーカッシュ群フォーマットで提示されているところでは、要素のあらゆる可能な下位群もまた開示されるということと、いずれかの要素または要素の下位群が群から除去され得るということとは理解されるはずである。用語「含む」は開放的であることを意図されており、追加の要素またはステップの包含を許容するということもまた注意される。一般的に、ある態様、産物、または方法が具体的な要素、特徴、またはステップを含むと言われるところでは、かかる要素、特徴、またはステップからなるかまたは本質的になる態様、産物、または方法も同じく提供されるということは理解されるはずである。簡潔性の目的のために、それらの態様は本明細書において個々に書き出されていないが、それらの態様のそれぞれが本明細書において提供されており、具体的に請求または放棄され得るということは理解されるであろう。
範囲が与えられているところでは、エンドポイントが包含される。さらにその上に、いくつかの態様において、別様に示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表されている値は、記された範囲内のいずれかの特定の値を、文脈が明瞭に別様に述べていない限り範囲の下限の単位の十分の一までとり得るということは理解されるはずである。簡潔性の目的のために、各範囲内の値は本明細書において個々に書き出さなかったが、それらの値のそれぞれが本明細書において提供されており、具体的に請求または放棄され得るということは理解されるはずである。別様に示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表されている値は所与の範囲内のいずれかの部分範囲をとり得、部分範囲のエンドポイントは範囲の下限の単位の十分の一と同じ程度の正確度で表されるということもまた理解されるはずである。
加えて、本発明のいずれかの具体的な態様が請求項のいずれか１つ以上から明示的に除外され得るということは理解されるであろう。範囲が与えられているところでは、範囲内のいずれかの値が請求項のいずれか１つ以上から明示的に除外され得る。本発明の組成物および／または方法のいずれかの態様、要素、特徴、用途、または側面は、いずれか１つ以上の請求項から除外され得る。簡潔性の目的のために、１つ以上の要素、特徴、目的、または側面が除外された態様の全てが本明細書に明示的に示されているわけではない。

Claims (53)

  1. （ｉ）Ｃａｓ９ドメイン、（ｉｉ）シチジンデアミナーゼドメインおよび（ｉｉｉ）ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインを含み、Ｃａｓ９ドメインが、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）ドメインまたはＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ドメインである、融合蛋白質。
  2. Ｃａｓ９ドメインが、配列番号６７４によって提供されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
  3. Ｃａｓ９ドメインが、配列番号１０～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合蛋白質。
  4. Ｃａｓ９ドメインが、ヌクレオチド二本鎖のヌクレオチド標的鎖を切るＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ドメインであり、ヌクレオチド標的鎖が、Ｃａｓ９ニッカーゼドメインと会合したｇＲＮＡに結合する鎖である、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
  5. Ｃａｓ９ドメインが、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列におけるＤ１０Ａ変異、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける対応する変異を含むＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ドメインである、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
  6. Ｃａｓ９ドメインが、配列番号１０によって提供されるアミノ酸配列におけるＮ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、またはＱ９２６Ａ変異の１つ以上、または配列番号１１～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける１つ以上の対応する変異を含むＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）ドメインである、請求項１～５のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
  7. 請求項１～６のいずれか一項に記載の融合蛋白質であって、シチジンデアミナーゼドメインが、
    （ｉ）アポリポ蛋白質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）デアミナーゼファミリーからのデアミナーゼである；
    （ｉｉ）配列番号２６６～２８４、６０７～６１０、５７２４～５７３６、および５７３８～５７４１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む；
    （ｉｉｉ）配列番号２６６～２８４、６０７～６１０、５７２４～５７３６、および５７３８～５７４１から選択されるアミノ酸配列を含む；
    （ｉｖ）配列番号２８４のＷ９０Ｙ、Ｒ１２６Ｅ、およびＲ１３２Ｅからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むラットＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯＢＥＣ１）デアミナーゼである；
    （ｖ）配列番号５７２４のＷ９０Ｙ、Ｑ１２６Ｅ、およびＲ１３２Ｅからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むヒトＡＰＯＢＥＣ１（ｈＡＰＯＢＥＣ１）デアミナーゼである；
    （ｖｉ）配列番号２７５のＷ２８５Ｙ、Ｒ３２０Ｅ、およびＲ３２６Ｅからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含むヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ）デアミナーゼである；
    （ｖｉｉ）活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）である；または
    （ｖｉｉｉ）Petromyzon marinusからのシチジンデアミナーゼ１（ｐｍＣＤＡ１）である、
    前記融合蛋白質。
  8. ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼ、およびＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼからなる群から選択される、請求項７に記載の融合蛋白質。
  9. ＵＧＩドメインが、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）活性を阻害することができるドメインを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
  10. ＵＧＩドメインが、配列番号６００と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の融合蛋白質。
  11. ＵＧＩドメインが、配列番号６００のアミノ酸配列を含む、請求項９または１０に記載の融合蛋白質。
  12. 請求項１～１１のいずれか一項に記載の融合蛋白質であって、構造：
    （ａ）ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓ９ドメイン］－［ＵＧＩドメイン］－ＣＯＯＨ；
    （ｂ）ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓ９ドメイン］－［ＵＧＩドメイン］－［第２のＣａｓ９ドメイン］－ＣＯＯＨ；または
    （ｃ）ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓ９ドメイン］－［第２のＣａｓ９ドメイン］－［ＵＧＩドメイン］－ＣＯＯＨ、ここで、“］－［”のそれぞれが任意のリンカーを含む、
    を含む、前記融合蛋白質。
  13. （ｉｉ）のシチジンデアミナーゼドメインおよび（ｉ）のＣａｓ９ドメインが、アミノ酸配列（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２６５）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号６）、（ＧＧＳ）ｎ、（ＳＧＧＳ）ｎ（配列番号４２８８）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）、（ＸＰ） ｎ 、またはその組み合わせを含むリンカーによってリンクされ、ｎが独立して端を含めて１および３０の間の整数であり、および、Ｘがいずれかのアミノ酸である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
  14. Ｃａｓ９ドメインおよびＵＧＩドメインが、アミノ酸配列（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２６５）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号５）、（Ｇ）ｎ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号６）、（ＧＧＳ）ｎ、（ＳＧＧＳ）ｎ（配列番号４２８８）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号７）、（ＸＰ） ｎ 、またはその組み合わせを含むリンカーによってリンクされ、ｎが独立して端を含めて１および３０の間の整数であり、および、Ｘがいずれかのアミノ酸である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
  15. 核局在配列（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
  16. ＮＬＳが、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号７４１）またはＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ（配列番号７４２）を含む、請求項１５に記載の融合蛋白質。
  17. 構造：ＮＨ２－［シチジンデアミナーゼドメイン］－［Ｃａｓ９ドメイン］－［ＵＧＩドメイン］－［ＮＬＳ］－ＣＯＯＨを含み、およびここで、“］－［”のそれぞれが任意のリンカーを含む、請求項１５または１６に記載の融合蛋白質。
  18. ＵＧＩドメインおよびＮＬＳが、アミノ酸配列（ＳＧＧＳ） ｎ （配列番号４２８８）を含むリンカーによってリンクされる、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
  19. 融合蛋白質が、配列番号２８５、５９３、５９４、６５８、および５７４２～５７４６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
  20. 配列番号２８５、５９３、５９４、６５８、および５７４２～５７４６のいずれか１つによって提供されるアミノ酸配列を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
  21. Ｃａｓ９ドメインが、Staphylococcus aureus Ｃａｓ９ニッカーゼ（ＳａＣａｓ９ｎ）を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
  22. ＳａＣａｓ９ｎが、配列番号４２７４によって提供されるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の融合蛋白質。
  23. ＳａＣａｓ９ドメインが、配列番号４２７３のＥ７８１Ｋ、Ｎ９６７Ｋ、またはＲ１０１４Ｈ変異の１つ以上、または配列番号１０～２６０によって提供されるアミノ酸配列のいずれかにおける１つ以上の対応する変異を含む、請求項２１に記載の融合蛋白質。
  24. 核酸分子を請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合蛋白質およびガイドＲＮＡと接触させることを含む、核酸を編集するための方法であって、ガイドＲＮＡが、生物のゲノム中の標的配列に対して相補的である少なくとも１０個の一続きのヌクレオチドの配列を含み、および、標的核酸塩基対を含み、ここで接触させるステップが、インビトロ、エクスビボまたは非ヒト動物のインビボで行われる、前記方法。
  25. 標的核酸塩基対が、疾患または異常に関連するＴからＣへの点変異を含み、およびここで、変異体Ｃ核酸塩基の脱アミノ化が、疾患または異常に関連しない配列をもたらす、請求項２４に記載の方法。
  26. 疾患または異常が、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、表皮剥離性角質増殖症（ＥＨＫ）、シャルコー・マリー・トゥース病４Ｊ型、神経芽腫（ＮＢ）、フォン・ヴィレブランド病（ｖＷＤ）、先天性ミオトニー、遺伝性腎アミロイドーシス、拡張型心筋症（ＤＣＭ）、遺伝性リンパ浮腫、家族性アルツハイマー病、ＨＩＶ、プリオン病、慢性乳児神経皮膚関節症候群（ＣＩＮＣＡ）、デスミン関連ミオパチー（ＤＲＭ）、変異体PI3KCA蛋白質、変異体CTNNB1蛋白質、変異体HRAS蛋白質、または変異体p53蛋白質に関連する新生物疾患である、請求項２５に記載の方法。
  27. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合蛋白質、および融合蛋白質のＣａｓ９ドメインに結合したガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む、複合体。
  28. ガイドＲＮＡが、１５～１００ヌクレオチドの長さであり、および標的配列に対して相補的である少なくとも１０個の一続きのヌクレオチドの配列を含む、請求項２７に記載の複合体。
  29. 標的配列がＤＮＡ配列である、請求項２７または２８に記載の複合体。
  30. 標的配列が原核生物または真核生物のゲノム中にある、例えば哺乳動物のゲノム中にある、任意にここで哺乳動物がヒトである、請求項２９に記載の複合体。
  31. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードする、ポリヌクレオチド。
  32. 請求項３１に記載のポリヌクレオチドおよび融合蛋白質をコードするポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモーターを含む、ベクター。
  33. 請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合蛋白質、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の複合体、請求項３１に記載のポリヌクレオチド、または請求項３２に記載のベクターを含む、細胞。
  34. 医薬としての使用のための、請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
  35. 二本鎖ＤＮＡ配列の標的領域を請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合蛋白質およびガイド核酸を含む複合体と接触させることを含む、二本鎖ＤＮＡ配列の核酸塩基対を編集するための方法であって、標的領域が標的核酸塩基対を含み、当該標的核酸塩基対の第１の核酸塩基が第２の核酸塩基に変換され、およびさらに、第１の核酸塩基に対して相補的な第３の核酸塩基が第２の核酸塩基に対して相補的な第４の核酸塩基によって置き換わり、ここで接触させるステップが、インビトロ、エクスビボまたは非ヒト動物のインビボで行われる、前記方法。
  36. 接触させるステップが、二本鎖ＤＮＡ配列における２０％未満のindel形成をもたらす、請求項２４～２６および３５のいずれか一項に記載の方法。
  37. ２０％、１９％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、４％、２％、または１％未満のindel形成をもたらす、請求項２４～２６、３５および３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 意図される編集された核酸塩基対を生成する効率が、少なくとも５％であり、および／または、効率が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％である、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 接触させるステップが、塩基編集によって標的核酸塩基対において、少なくとも２：１の意図される産物対意図されない産物をもたらす、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 標的核酸塩基対における意図される産物対意図されない産物の比が、少なくとも２：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、または２００：１である、請求項３９に記載の方法。
  41. 意図される編集された核酸塩基対対indel形成の比が、１：１、１０：１、５０：１、１００：１、５００：１、または１０００：１超である、請求項４０に記載の方法。
  42. 接触させるステップが、当該標的領域の１つの鎖だけを切ることをもたらし、および、切られた鎖が、ガイド核酸にハイブリダイゼーションする、請求項３５～４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 切られた単一鎖が、第１の核酸塩基を含む鎖の反対である、請求項４２に記載の方法。
  44. 当該第１の核酸塩基がシトシンである、および／または、第２の核酸塩基がウラシルである、請求項４２または４３に記載の方法。
  45. 融合蛋白質がニッカーゼ活性を含む、請求項２４～２６および３５～４４のいずれか一項に記載の方法。
  46. 意図される編集された核酸塩基対が、ＰＡＭ部位の上流であり、および／または、意図される編集された核酸塩基対が、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド上流である、請求項３５～４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 意図される編集された核酸塩基対が、ＰＡＭ部位の下流である、および／または、意図される編集された核酸塩基対が、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド下流である、請求項３５～４５のいずれか一項に記載の方法。
  48. 古典的ＰＡＭ部位を要求しない、請求項２４～２６および３５～４５のいずれか一項に記載の方法。
  49. 標的領域が標的ウインドウを含み、任意にここで標的ウインドウが標的核酸塩基対を含む、請求項３５～４８のいずれか一項に記載の方法。
  50. 標的ウインドウが、１～１０個のヌクレオチド、例えば、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３、１～２、または１個のヌクレオチドの長さを含む、請求項４９に記載の方法。
  51. （ａ）請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合蛋白質および（ｂ）二本鎖ＤＮＡ分子中の標的核酸塩基対に対して（ａ）の融合蛋白質をターゲティングするガイドＲＮＡの、ＤＮＡを編集するためのキットの製造における使用であって、任意にＤＮＡを編集することが、当該標的核酸塩基対の第１の核酸塩基の第２の核酸塩基への変換に好適な条件下、ＤＮＡ分子を（ａ）および（ｂ）と接触させることを含む、前記使用。
  52. 接触させるステップが、標的領域において二本鎖ＤＮＡの分離を誘導する、請求項５１に記載の使用。
  53. （ａ）請求項１～２３のいずれか一項に記載の融合蛋白質および（ｂ）二本鎖ＤＮＡ分子中の標的核酸塩基対に対して（ａ）の融合蛋白質をターゲティングするガイドＲＮＡの、医薬の製造における使用。
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