CN105567734A - 一种基因组dna序列精准编辑方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基因组DNA序列精准编辑方法,联合利用TALEN、CRISPR/Cas9等基因打靶技术和同源重组技术对基因组DNA序列精准编辑。本方法解决了现有技术中无法删除某特定序列等技术难点,能够定点、无缝隙地插入或删除特定的碱基序列,首次实现了真核细胞基因组DNA序列无缝隙的任意改造。
Description
技术领域:
本发明涉及一种基因组DNA序列精准编辑方法。具体涉及联合利用基因打靶技术和传统的同源重组技术,定点并无缝隙地插入或删除基因组中特定的碱基序列的方法。
背景技术:
在基因工程领域,研究人员们一直在试图修饰基因组的碱基序列,以求失活某个基因与获得某个新基因的功能。
大肠杆菌同源重组是20世纪90年代末发展起来的一种新的基因工程技术,可以不必依赖限制性酶切位点,而定点精确地完成诸如片段插入、删除及序列改变等等基因改造。大肠杆菌同源重组技术常用于染色体DNA的靶向修饰-基因敲入与敲除,以及空隙修复(gap-repair)方式获取目的基因。原理是以PCR方法合成两侧50-70bp的短同源序列,然后通过细菌内同源重组将短同源序列间的片段插入基因的目标位置或套取相应的基因目标片段。申请人曾于1999年利用大肠杆菌同源重组技术成功敲除了细菌与铁代谢有关的cyay基因(Lietal.Knock-outofthecyaygeneinEscherichiacolidoesnotaffectcellularironcontentandseneitivitytooxidants.FEBSLetters1999,456:13-6)。
但是,利用同源基因重组技术,突变率非常低,甚至不到万分之一,仅适用于繁殖较快单细胞生物,如细菌,可以利用某种抗菌素的活性进行大量筛选。
基因打靶技术是另一种用于基因组定点改造的技术。近年来有较大发展,如2011年,Daniel等(DanielF,etal.ModularlyassembleddesignerTALeffectornucleasesfortargetedgeneknockoutandgenereplacementineukaryotes.NucleicAcidsRes2011,39:6315-25)将TALEDNA结合motif与FokI核酸酶融合,推出与(ZFNs)同类型的双链DNA剪刀,称之为TALEN(TranscriptionActivator-LikeEffectorNuclease)。2012年,Jinek等又报道一种更为简单、高效和低成本的基因打靶工具——CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)/Cas9(CRISPRassociated)靶向基因改造(敲除、敲入)技术(JinekM,etal.Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science2012,337(6096):816-21)。
然而,基因打靶技术的发展仅仅局限于提高基因打靶效率,而不能提高基因打靶的精准性以及突变的可控性。即,仅能将打靶的位点定位在某个基因的某个区域(通常为数个或数十个碱基),而且,突变的内容是随机发生,有时插入了一些碱基,有时缺失了一些碱基,插入或缺失的碱基数目也不能随意控制。无法满足基因工程有时需要精准修饰某个基因的需求。
因此,对基因突变精准定点,并且对突变(删除或插入)的内容实现完全任意可控,对两个等位基因进行同样修饰或改造等DNA序列精准编辑技术的开发,非常有必要。
目前尚未见到有关将同源基因重组技术和基因打靶技术结合,用于对基因组DNA序列精准编辑。由于这两种技术的原理完全不同,而且,依据现有DNA修复的理论知识,即使二者联合,仅能插入某特定序列,却无法删除某特定序列。
发明内容:
本发明的目的是提供一种基因组DNA序列精准编辑技术,实现可精准定点、无缝隙地插入或删除特定的碱基序列。
本发明联合利用基因打靶技术(包括TALEN、CRISPR/Cas9等)和传统的同源重组技术实现了上述发明目的。
所述TALEN或CRISPR/Cas9是本领域公认的普遍熟知的术语,TALEN或CRISPR/Cas9是能够特异性地分别与靶点的两侧或单侧结合,从而导致靶点处DAN双链断开的质粒。其中,TALEN是一对质粒,CRISPR/Cas9是单质粒。
2011年,Daniel等(DanielF,etal.ModularlyassembleddesignerTALeffectornucleasesfortargetedgeneknockoutandgenereplacementineukaryotes.NucleicAcidsRes2011,39:6315-25)将TALEDNA结合motif与FokI核酸酶融合,推出与锌指酶同类型的双链DNA剪刀,称之为TALEN(TranscriptionActivator-LikeEffectorNuclease)。
所述CRISPR/Cas9是2012年,Jinek等报道一种更为简单、高效和低成本的基因打靶工具——CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)/Cas9(CRISPRassociated)靶向基因改造(敲除、敲入)技术(JinekM,etal.Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivebacterialimmunity.Science2012,337(6096):816-21)。
如果仅根据现有技术的方法将同源基因重组和基因打靶技术两种技术进行简单组合,将无法实现本发明的目的。
这是因为,不仅两种技术的原理完全不同,而且,依据现有DNA修复的理论知识,即使联合应用二者,也仅有可能实现插入某特定序列,并不能删除某特定序列。
本发明不是简单的将传统的同源重组与现代的基因打靶技术相结合,而是根据各自的特征进行合理利用。首先TALEN或CRISPR/Cas9需要左右臂或gRNA序列与目的基因完全结合才能发挥断裂双链DNA的效应,因此首先我们将TALEN的一条臂或CRISPR/Cas9的gRNA设计在目标位点上(打靶位点在目标位点的上游或下游),将其转染进细胞后就不会对donorDNA进行切割,当得到单等位基因编辑的目的细胞后,我们又将打靶位点设计在目标位点,这样就避免TALEN或CRISPR/Cas9对已经编辑的一条链进行切割。此外在利用同源重组的过程中,首先我们在打靶的同时转入含有经过修饰过的donorDNA,使断裂的DNA双链在修复的时候能与之进行同源重组,并最终得到经过校正的DNA链。后来,在得到一条单等位基因修饰的链后,进行第二轮打靶时,便不再使用donorDNA,因为已经修饰的一条链即是同源重组的最好模板。
本发明人开创了一种基因组DNA序列精准编辑方法,按如下步骤进行:
1)构建一个两侧由相关基因同源序列组成、其中含有该基因预期突变内容的donorDNA;
2)以预期突变位点附近为靶点设计相应的TALEN或CRISPR/Cas9;
3)将该预先构造好的donorDNA与TELEN或CRISPR/Cas9同时转染到操作细胞内;实现TELEN或CRISPR/Cas9导致该基因靶点处双链断开,随后,部分断端会以donorDNA为模板修复断端,从而发生由TELEN或CRISPR/Cas9介导的基因同源重组;
4)通过单细胞克隆培养与基因测序,筛选出相关基因发生预期突变的细胞株。
上述步骤2)中,TALEN的其中一条臂或CRISPR/Cas9的gRNA应覆盖插入特定序列的位点或与欲删除序列部分或完全重叠,使donorDNA模板上不存在相同的结合位点,从而避免了TALEN或CRISPR/Cas9破坏donorDNA。
上述步骤4)完成后,如果发现两个等位基因均发生了预期突变,基因组DNA序列精准编辑即告成功;如果发现一个等位基因发生了符合预期的突变,而另一个等位基因仍处于野生型态,可重复进行上述步骤3)和步骤4)操作,直到筛选出两个等位基因均发生预期突变的细胞株;如果发现一个等位基因发生了符合预期的突变,而另一个等位基因却发生了不符合预期的非特性突变发生时,则需要针对该突变的等位基因重新设计TELEN或CRISPR/Cas9,这是因为这种非特异性突变可能改变了原来设计的TELEN或CRISPR/Cas9的有效性。然后重复进行上述步骤3)和步骤4)操作,直到筛选出两个等位基因均发生预期突变的细胞株。
本发明发生同源重组的机理:
包括5个步骤:(1)产生双链断裂:目标部位的双链DNA被FokI切断;(2)入侵:两个5’到3’末端插入到打开的DonorDNA双链,与相应的同源序列退火,其中至少有一个异源的尾巴“漂浮在空中”;(3)修剪:这些“漂浮在空中”的异源尾巴被一些不明身份的DNA内切酶切除;(4)SDSA(synthesis-dependentstrandannealing,合成依赖链退火):以DonorDNA序列为模板进行边合成边退火;(5)Re-annealing:两个新合成的DNA单链离开供体DNA模板进行再退火,如果有必要还可能继续以对方为模板进行SDSA,直到两条链均完全修复。
本发明的以上方法已成功运用于CD195基因的定点删除改造。作为实施例,证明了本方法的效果:
本发明实验选择了来源于人类胶质瘤的U87细胞株作为实验的细胞模型,并通过对其CD195两个等位基因的32个碱基进行了定点删除改造,建立了基因型为CD195delta32/delta32的U87细胞株亚群,从而验证了上述发明可行性、准确性与实用性。
本发明实验中所操作的CD195基因号为NG_012637.1,位于3号染色体1.31,所删除的32个碱基对的特定位点是3321-3352,即
TATCAATTCTGGAAGAATTTCCAGACATTAAA。
技术路线是:首先利用重叠延伸(overlapextension)PCR技术,获得一段含有CD195delta32的基因片段(donorDNA),然后将其与针对CD195基因特定位点设计的TALEN质粒对(TALENs)电转入U87细胞内,导致欲删除32个碱基序列附近DNA双链断裂(DSB),并在自然修复的过程中发生donorDNA与野生型CD195基因之间同源重组,从而获得CD195delta32突变基因。通常一次实验仅能获得单个CD195等位基因delta32突变,重复实验即可获得双等位基因的delta32突变(即突变纯合子CD195delta32/delta32)。而且,重复实验时,由于已发生delta32突变的CD195基因是最理想的donorDNA,因此,无需另外添加donorDNA。
首先利用重叠延伸(overlapextension)PCR技术,获得一段含有CD195delta32的基因片段(donorDNA)。然后以CD195delta32一侧为靶点设计TALEN或CRISPR/Cas9(此处TALEN的其中一条臂或CRISPR/Cas9的gRNA与CD195delta32有重叠序列,以避免TALEN或CRISPR/Cas9打到donorDNA)。将CD195delta32donorDNA与TELEN或CRISPR/Cas9同时转染到操作细胞内。提取打靶细胞基因组DNA,PCR扩增打靶位点前后约500bp左右的片段,采用T7E1酶切分析打靶效率。待打靶效率达到50%左右即可进行单细胞克隆培养,进一步通过T7E1酶切分析与基因测序,筛选出CD195delta32单等位基因修饰的细胞株。
该步骤之后重新设计TELEN或CRISPR/Cas9,此时TALEN或CRISPR/Cas9的打靶区域设定在目标位点,且TALEN的两条臂或CRISPR/Cas9的gRNA应含有需要修饰的序列,以避免打到已经修饰的一条链。将新设计的TELEN或CRISPR/Cas9直接转染CD195delta32单等位基因修饰的细胞,经单细胞克隆培养、PCR、T7E1酶切及基因测序分析,最终筛选出CD195delta32/delta32双等位基因突变的细胞株。
本发明虽然仅公开了精准编辑基因的一个实例,但由于任何基因都是由DNA序列组成,而本方法对目的基因位点本身及其附近序列并无特殊要求,并且,无论是插入突破或是删除突变,所发生同源重组的实质就是基因置换(genereplacement).因此,本发明对于基因的精确编辑具有普遍适用性。本领域人员完全可以用本发明开创的此方法任意改造其它所有基因,所不同之处仅在于构建一个含有相关基因同源序列和突变内容的DNA模板(donorDNA)和针对该基因突变位点附近设计特异性的TALEN或CRIPR/Cas9。
单纯基因打靶技术(TALEN或CRIPR/Cas9)仅能某个基因的某段区域内的不可控突变,既可能是插入,也可能是缺失,且插入或缺失的碱基对数也是随机不可控的;而单单纯的同源重组技术虽然能够精准控制突变内容,单突变发生的频率太低,以致于没有任何实用价值。
本发明的精准基因编辑方法有广阔的用途范围,可用于所有需要基因改造的项目,既可以用正常基因替代突变基因进行性状改良和基因治疗,也可以用突变基因代替正常基因进行基因功能的研究等。
本发明的效果
1、解决了基因编辑技术将基因打靶技术和基因同源重组技术联合使用不能实现基因的定点插入或删除特定序列的难题;
2、不仅大幅提高了基因突变的发生率,还能对突变的位点与内容实施精准控制。
3、本方法可以选择整个基因组的任意位点进行双等位基因精准控制编辑,且不留下任何无关的基因或碱基序列。
4、发现了一种新的DNA自身修复机制,即,在缺失突变时,与donorDNA非同源的断端可以被不明核酸酶修剪掉,然后再进行退火(annealing)、复制(见实施例)而完成自身修复。而在通常情况下,这些断端是无法退火,作延伸复制的。因此本发明解决了另一个技术难题。
附图说明:
图1重叠PCR反应示意图
CD195delta32donorDNA构建。首先分别采用F1/R1及F2/R2扩增同源臂(A和B),然后将得到的产物(分别为836bp和786bp)为模板,以引物F1/R2进行扩增,得到不含32bpCD195delta32donorDNA(A+B=1602bp),最后将序列正确的CD195delta32donorDNA连接到T-载体上。
图2TALEN靶点选择与设计
CD195-TALENsandCD195delta1-TALENs设计。
A.CD195-TALENs:分别设计3条左臂(L4307,L4309,L4310)和2条右臂(R4324,R4325)。其中2条右臂几乎位于将要删除的32bp范围内,Spacer长14-18bp。
B.CD195delta1-TALENs:分别设计三条左臂(L4334,L4335,L4336)和2条右臂(R4351,R4352)。所有这5条臂都或多或少的与将要删除的31bp有重叠。spacer长15-18bp。
图3TALEN介导的基因同源重组
TALENs介导的同源重组:
AT7E1酶切分析CD195-TALENs转染CD4+U87细胞后的打靶效率。打靶一轮、二轮、三轮后的效率分别为14.80%,38.20%及50.04%。M:100bpmarker;wildtype:野生型细胞;1-3泳道:分别为打靶一轮、二轮、三轮后的T7E1酶切产物电泳图。
B不同阶段CD195delta32/delta1基因型CD4+U87细胞打靶位点前后PCR产物电泳图,泳道1:CD195-TALENs转染前;泳道2:CD195-TALENs转染后;泳道3:CD195delta1-TALENs质粒转染后。CD195delta32条带(168bp)的灰度值是CD195delta1条带的2.87倍;泳道4:野生型细胞作为阴性对照;泳道5:CD195delta32donorDNA作为阳性对照。
C野生型及CD195delta32/delta1型CD4+U87细胞序列鉴定。
DCD195delta1-TALENs转染CD195delta32/delta1CD4+U87细胞后,PCR检测34个单克隆细胞的分型,从图中可见16,18及25号克隆只有CD195delta32一条带。M:100bpmarker;1-34:single-cellCD195delta1-TALENs转染后,挑取的1-34号单细胞克隆;wildtype:野生型细胞作为阴性对照;donor:CD195delta32donor作为阳性对照。
E16,18及25号克隆序列测定。
图4同源重组原理示意图
TALENs介导的同源重组机制。首先利用TALENs上的FokI对DNA双链进行切割,产生双链断裂(DSB),然后两个5’到3’末端插入到模板打开的两条链中并与相应的区域进行退火,在这一过程中至少有一条链含有“漂浮在空中”的非同源尾巴。这些非同源尾巴会被一些未知名的内切酶剪切掉并进一步与Donor或模板DNA进行合成依赖的链退火(synthesis-dependentstrandannealing,SDSA)。最后两条新合成的链离开donorDNA模板,彼此退火进行下一轮SDSA直到DSB被完全修复。
具体实施方式
1.实验材料与方法:
1.1实验材料
CD4+U87细胞(北京工业大学曾毅院士赠送),常用限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB(北京)有限公司。TaqDNA高保真聚合酶购自LifeTechnology公司;PBS、胰酶消化液、双抗、TaqPCRMastermix、PCR产物纯化试剂盒、质粒小提试剂盒、DNA分子量标准购自天根生化科技(北京)有限公司。细胞培养瓶,移液管、离心管等购自Corning公司。FBS购自Gibco公司,DMEM及DMEM/F12购自HyClone公司。SDS-PAGE凝胶快速配制试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司。Opti-MEM优化培养液、脂质体2000购自invitrogen公司,G418、嘌呤霉素购自上海生工生物技术有限公司。
1.2引物合成
PCR中涉及到的引物序列如下表所列,全部由上海生工生物技术有限公司合成。
表1引物序列
2.实验方法:
2.1PCR
本实验中所有的PCR均参照表2的参数进行PCR。
表2PCR反应体系
95℃1min,58℃1min,72℃2.5min;35cycle
2.2细胞培养
CD4+U87细胞培养:用含10%胎牛血清、0.1U/L青-链霉素的DMEM培养液,在5%CO2、饱和湿度及37℃下进行培养。
2.3CD195delta32/delta32Donor的构建
根据图1的技术路线,我们首先以野生型CD4+U87细胞基因组为模板,分别以F1/R1及F2/R2为引物进行PCR扩增,然后再以该两种PCR产物为模板,以F1/R2为引物进行重叠PCR,并将得到的产物连接到T载体进行测序。最后以测序正确的T载体为Donor进行后续实验。
2.3.1其中PCR产物连接到T载体具体方法如下:
根据酶切产物浓度加入合适比例的目的片段和载体;
T4DNA连接酶1μL
T4连接酶buffer2μL
用ddH2O补足体积至20μL,16℃连接过夜。
2.3.2细菌的转化
(1)取出一支感受态细胞,冰上融化。
(2)取适量连接产物(或质粒DNA)加入到融化的感受态细胞中,轻轻旋转混匀,冰上静置30min。
(3)将步骤(2)的产物在42℃水浴中热击90s,然后迅速置于冰上5min。
(4)向转化好的产物中加入500μL不含抗生素的LB培养液,37℃、150r/min振荡培养40-60min。
(5)取上述菌液200μL涂布在预制的含卡那霉素或者氨苄青霉素的固体LB平板上,正面放置25-30min,待菌液完全被培养基吸收后,37℃培养箱中倒置培养12-16h。
2.3.3质粒的小量提取
按天根质粒小提试剂盒说明书进行操作,具体过程如下:
(1)收集上述步骤中的细菌悬液,5000rpm离心5min,小心去掉上清,得到沉淀。
(2)向细菌沉淀中加入250μL缓冲液P1充分混匀。然后再加入250μL缓冲液P2轻柔混匀,室温5min使细菌充分裂解。
(3)向步骤(2)中加入300μL缓冲液P3轻轻混匀。12000r/min离心10min,收集上清至离心柱中,12000r/min离心1min。
(4)弃掉滤液,向离心柱中加入500μL缓冲液PB,12000r/min离心1min。
(5)弃掉滤液,加入750μL缓冲液PE洗涤,12000r/min离心1min。
(6)重复步骤(5),弃掉滤液后12000r/min空离1min去除残留在离心柱膜上的液体。
(7)将离心柱置于另一干净的1.5mLEP管中,在膜的中央滴加50μL预热的去离子水,静置2-3min,12000r/min离心1min,得到含质粒DNA的洗脱液-20℃储存备用。
2.4CD195TALEN质粒的构建
按上海斯丹赛生物技术有限公司TALEN试剂盒使用说明书进行操作:
(1)按试剂盒要求对CD195设计5个TALEN引物(可组合为6对),2个TALEN左臂识别序列、3个TALEN右臂识别序列;
(2)将左、右臂识别序列的最后一位碱基去掉,然后按每一个或两个碱基组合为一个模块,首个标记为1,最后一个标记为9,依次类推进行标记。
(3)从试剂盒中取出相应编号的9个模块,每个模块取1.5μL依次加入到同一个PCR管中;
(4)取出溶液1、溶液2置冰上溶解,溶液3放置于37℃水浴锅中溶解(注意:请完全混匀);
(5)按如下体系依次加样于步骤3的PCR管中,最后加水补至20μL,短暂离心混匀。
左臂TALEN连接体系右臂TALEN连接体系:
9个模块总体积:13.5μL
左、右臂TALEN骨架载体:1.5μL
溶液3:2.0μL
溶液1:1μL
溶液2:1μL
ddH2O:1μL
总体积:20μL
(6)将混匀后的PCR管放入PCR仪中进行连接反应。
连接程序如下:
37℃5min
16℃10min
80℃10min
12℃1min
(7)取出PCR管并加入溶液41μL、溶液50.5μL(溶液5请37℃预先融化),混匀,在PCR仪或水浴锅中37℃孵育一小时。
(8)将步骤7的最终产物(20μL)加入预先融化的含感受态细胞的EP管中,轻轻混匀,在冰上放置30min,然后42℃热激45s,再迅速放置于冰上3min。
(9)在超净工作台中向步骤(8)的EP管中加入500μL不含抗生素的LB溶液,37℃,250rpm振摇30min。
(10)将步骤9转化的菌液4000rpm离心5min。
(11)在超净工作台中弃去EP管中的大部分上清,留下约100μL,并将沉淀轻轻吹打混匀,均匀涂布于含卡那霉素抗性的LB平板中,37℃培养12-16h。
(12)次日待菌落长大后,挑取24个单克隆,将单克隆分别接种于装有5mLLB培养液(含Ka+)的15mL离心管中。
(13)将挑好单克隆的离心管置于37℃,250rpm的摇床中培养16h左右。
(14)次日采用菌落PCR检测,阳性克隆提取质粒进行双酶切检测,酶切体系如下:
(15)将酶切正确的质粒送测序,并与设计的标准序列进行比对,得到最终正确的质粒。测序正向引物序列为:CTCCCCTTCAGCTGGACAC,测序反向引物序列为:AGCTGGGCCACGATTGAC。
2.5CD195TALEN质粒转染CD4+U87细胞
测序比对正确的质粒转化到高拷贝的DH5α中扩大培养,提取质粒,得到高浓度和高纯度质粒,按L1×R1、L1×R2、L2×R1、L2×R2、L3×R1、L3×R2组合将TALEN质粒左右臂共转染到将要敲除细胞株中,具体操作如下:
(1)取生长状态良好的CD4+U87细胞胰酶消化后以80%的密度重新接种到新的培养瓶中,37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中进行培养。
(2)次日,再次用胰酶消化细胞,含FBS的培养液终止消化,并计数。
(3)1200rpm离心5min。
(4)离心的间隙,取一新的六孔板,向每孔中加入2mLHeLa细胞培养液,置于培养箱中平衡。
(5)弃掉上清,用2mLOpti-MEM培养液重悬细胞。
(6)1200rpm离心5min,弃掉上清。
(7)再次用Opti-MEM培养液重悬细胞,使细胞密度为1×106/90μL。
(8)混匀细胞,取90μL细胞悬液至一无菌Eppendof管中,共有7管,其中1管为对照。
(9)向细胞悬液中加入CD195TALEN质粒,按L1×R1、L1×R2、L2×R1、L2×R2、L3×R1、L3×R2组合的左、右臂质粒各5μL(约5μg),轻轻吹打混匀。
(10)将细胞、质粒混合物移入电击杯中,盖上盖子。
(11)设置电击参数为:电压150V、脉冲5次、2次重复,预测欧姆值,然后开始电击。
(12)电击完毕后,取出电机杯,用小吸管将杯内的细胞移入到步骤(4)中的六孔板中,注意尽量将细胞吸干净。
(13)将电击后的细胞置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中进行培养。以未转染的细胞作为对照。
2.6CD195TALEN质粒打靶筛选与效率检测
2.6.1CD195TALEN质粒打靶筛选
由于TALEN左臂质粒含有嘌呤霉素抗性基因,采用合适浓度的嘌呤霉素对打靶的细胞进行正向筛选,具体步骤如下:
(1)待上述步骤中打靶的细胞贴壁后,次日取出细胞显微镜下观察细胞状态,并换上新的培养液。
(2)向细胞培养液中加入嘌呤霉素,使其终浓度为3μg/mL,混匀后放回培养箱继续培养。
(3)嘌呤霉素连续处理3天后换为正常培养液继续培养,此时存活的细胞应该很少。
(4)继续培养10天左右,待细胞密度达到80%左右即可消化传代。
(5)传代时取部分细胞按4.2.1的方法提取基因组DNA。
2.6.2CD195TALEN质粒打靶效率的鉴定
由于TALEN质粒结合到目的基因DNA双链后会形成FokI二聚体,进而对DNA双链进行切割产生缺口,DNA自身对缺口进行修复时会随机丢失几个到几十个不等的碱基,这些DNA在与正常DNA进行退火时会形成不完全互补的双链。T7核酸内切酶I(T7endonucleaseI,T7E1)主要用于识别不完全配对DNA、十字型结构DNA、Holliday结构或交叉DNA、异源双链DNA或者以更慢的速度切割或切刻双链DNA,并切割错配碱基5′端的第一、第二或第三个磷酸二酯键。因此T7E1可以初步判断TALEN质粒的打靶效率,具体步骤如下:
(1)以提取到的基因组DNA为模板,以打靶位点前后约500bp的引物进行PCR扩展(引物序列见表1),扩增体系和参数为:
表3PCR反应体系
95℃5min,(95℃30s,58℃30s,58℃30s)35cycles,72℃10min。
(2)1%的琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行检测。
(3)根据PCR产物的浓度按以下体系进行T7E1酶切鉴定:
表4T7E1酶切反应体系
充分混合后,退火
退火程序:(PCR仪)
95℃5min
95℃2sec
-0.1℃/cycle,20times
75℃1sec
(4)退火产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。
(5)根据灰度分析打靶效率,选择打靶效率最高的一种组合进行后续打靶。本研究中我们发现以L4309/R4324为组合的TALEN打靶效率最高,因此决定以该对TALEN和CD195delta32DonorDNA片段共同电转入CD4+U87细胞系。连续转染3次后,经检测发现靶向基因突变效率达到约50%,其中获得2个双等位基因突变的单细胞克隆(即纯合突变效率为6.9%)。在这2个双等位基因突变的单细胞克隆中,有1个的基因型是CD195delta32/delta1,为了获得纯合的CD195delta32/delta32的单细胞克隆,进行第二轮CD195delta1-TALENs构建及基因打靶。
2.6.3第二轮CD195delta1-TALENs构建及基因打靶(见图2、图3D/E)
利用斯丹赛公司的TALENkit试剂盒,按照产品说明书,针对CD195delta1设计并合成了三条左臂和两条右臂TALEN(具体方法同上),经验证后发现以L4336/R4352为组合的TALENs打靶效率最高,因此决定以该对TALENs和CD195delta32DonorDNA片段共同电转入CD195delta32/delta1CD4+U87单细胞克隆中。连续转染3次后,经检测发现靶向基因突变效率约37.5%,并最终获得3个CD195delta32/delta32双等位基因突变的单细胞克隆(即纯合突变效率为8.8%)。
2.实验结果
2.1CD195delta32donorDNA构建
按图1的实验流程,我们首先分别采用F1/R1及F2/R2扩增同源臂A和B,得到大小分别为836bp(A)和786bp(B)的产物,然后以A和B混合物为模板、以F1/R2为引物进行扩增,得到1602bp的产物,该产物经测序证实为不含32bp的CD195delta32donorDNA。最后将序列正确的CD195delta32donorDNA连接到T-载体上保存备用。
2.2CD195-TALENs与CD195delta1-TALENs构建与鉴定
利用斯丹赛公司的TALEN试剂盒,按照产品说明书,将右臂设计为与CD195delta32全部或部分重叠的TALEN,得到如图2A所示3条左臂(L4307,L4309,L4310)和2条右臂(R4324,R4325)。同样根据TALEN设计原则,将打靶位点设计在CD195delta32区域,得到如图2B所示的CD195delta1-TALENs:三条左臂(L4334,L4335,L4336)和2条右臂(R4351,R4352)。将上述各对TALEN左右臂交叉组合,转染细胞,经T7E1酶切鉴定,最终筛选出打靶效率最高的TALEN各一对,分别为L4309/R4324(CD195-TALENs)和L4336/R4352(CD195delta1-TALENs)。
2.3TALENs介导的同源重组
CD195-TALENs与donor同时转染CD4+U87细胞后,T7E1酶切分析打靶效率,发现打靶一轮、二轮、三轮后的效率分别为14.80%,38.20%及50.04%(图3A)。将第三轮打靶后的细胞挑取单个细胞进行培养,并经过测序分析(图3C)最终挑选出一个含有CD195delta32/delta1突变的细胞株。对该细胞株继续进行打靶,分别用CD195-TALENs与CD195delta1-TALENs进行打靶。PCR检测打靶效率,我们发现CD195-TALENs对CD195delta32/delta1突变的细胞株无法发挥DNA双链切割的作用,而CD195delta1-TALENs却能对其进行切割。如图3B所示CD195delta1-TALENs转染后CD195delta32条带的灰度值CD195delta1条带的2.87倍。将连续转染3次后的细胞挑取单个细胞进行培养,PCR检测34个单克隆细胞的分型,从图3D中可见16,18及25号克隆只有CD195delta32一条带。将该3个克隆的PCR产物进行测序(图3E),验证它们均为CD195delta32/delta32纯合子。我们分析TALENs介导的同源重组机制如图4所示:首先利用TALENs上的FokI对DNA双链进行切割,产生双链断裂(DSB),然后两个5’到3’末端插入到模板打开的两条链中并与相应的区域进行退火,在这一过程中至少有一条链含有“漂浮在空中”的非同源尾巴。这些非同源尾巴会被一些未知名的内切酶剪切掉并进一步与Donor或模板DNA进行合成依赖的链退火(synthesis-dependentstrandannealing,SDSA)。最后两条新合成的链离开donorDNA模板,彼此退火进行下一轮SDSA直到DSB被完全修复。
同源重组机理:
本发明发生同源重组的机理包括5个步骤(图4):(1)产生双链断裂:目标部位的双链DNA被FokI切断;(2)入侵:两个5’到3’末端插入到打开的DonorDNA双链,与相应的同源序列退火,其中至少有一个异源的尾巴“漂浮在空中”;(3)修剪:这些“漂浮在空中”的异源尾巴被一些不明身份的DNA内切酶切除;(4)SDSA(synthesis-dependentstrandannealing,合成依赖链退火):以DonorDNA序列为模板进行边合成边退火;(5)Re-annealing:两个新合成的DNA单链离开供体DNA模板进行再退火,如果有必要还可能继续以对方为模板进行SDSA,直到两条链均完全修复。
通过以上基因测序,充分表明:所修饰基因的两个等位基因均已发生了预设定的突变。证明用本发明方法对CD195基因进行了精准编辑。
Claims (10)
1.一种基因组DNA序列精准编辑方法,按如下步骤进行:
1)构建一个两侧由同源序列组成的任意突变基因;
2)以目标位点一侧为靶点设计相应的TALEN或CRISPR/Cas9;
3)将该预先构造好的donorDNA与TELEN或CRISPR/Cas9同时转染到操作细胞内;导致该基因靶点处双链断开,并且随后部分断端会以donorDNA为模板进行修复;
4)通过单细胞克隆培养与基因测序,筛选出单等位基因修饰的细胞株;
当两个等位基因均发生了预期突变,基因组DNA序列精准编辑即告成功;
所述donorDNA含突变内容和相关基因的同源序列;所述TALEN或CRISPR/Cas9是能够特异性地分别与靶点的两侧或单侧结合从而导致靶点处DAN双链断开的质粒;TALEN是一对质粒,CRISPR/Cas9是单质粒。
2.权利要求1所述的方法,步骤2)中,TALEN的其中一条臂或CRISPR/Cas9的gRNA覆盖插入特定序列的位点或与欲删除序列部分或完全重叠,使donorDNA模板上不存在TALEN或CRISPR/Cas9的结合位点。
3.权利要求1或2所述的方法,当步骤4)完成后,如果一个等位基因发生了符合预期的突变,而另一个等位基因未发生改变,重复进行上述步骤3)和步骤4),至筛选出两个等位基因均发生预期突变的细胞株。
4.权利要求1或2所述的方法,当步骤4)完成后,如果发现一个等位基因发生了符合预期的突变,而另一个等位基因发生了非预期的突变时,针对所突变的等位基因重新设计TELEN或CRISPR/Cas9,然后重复进行上述步骤3)和步骤4)操作,至筛选出两个等位基因均发生预期突变的细胞株。
5.一种获得基因组DNA双等位基因相同突变的方法,按权利要求4所述方法操作,至筛选出两个等位基因均发生相同预期突变的细胞株。
6.权利要求1或2所述的方法,DNA序列精准编辑的位点选自整个基因组任意位点。
7.权利要求1或2所述的方法在基因组DNA序列改造中的应用。
8.权利要求7所述的应用,所述基因组DNA序列改造,是在整个基因组的任意位点定点并无缝隙地插入或删除基因组中特定的碱基序列,且不留下任何无关的基因或碱基序列。
9.一种DNA在缺失突变时的自身修复方法,首先利用重叠延伸(overlapextension)PCR技术,获得含相关同源序列和突变内容的donorDNA,然后将其连同与针对该序列设计的TALEN或CRISPR/Cas9一起转染到操作细胞内,后者导致DNA双链断开,部分断开处两侧的5’到3’断端将与donorDNA发生退火,并以donorDNA为模板合成延伸,然后离开donorDNA模板,相互退火在一起,从而即可获得与donorDNA中所设计的突变内容相同的突变。
10.CD195基因DNA序列精准编辑方法,首先利用重叠延伸PCR技术,获得donorDNA,然后将其与针对CD195基因特定位点设计的TALEN质粒对电转入U87细胞内,导致欲删除32个碱基序列附近DNA双链断裂,并在自然修复的过程中发生donorDNA与野生型CD195基因之间同源重组,从而获得CD195delta32突变基因;所述donorDNA是一段含有CD195delta32的基因片段。
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