CN110241098B

CN110241098B - 酿脓链球菌的CRISPR核酸酶SpCas9的截短型高特异性变异体及其应用

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Publication number: CN110241098B
Application number: CN201910488074.7A
Authority: CN
Inventors: 黄强; 杜文豪; 汤洪海; 薛冬梅
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2019-06-05
Filing date: 2019-06-05
Publication date: 2021-04-30
Anticipated expiration: 2039-06-05
Also published as: CN110241098A

Abstract

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体为一种来源于酿脓链球菌的CRISPR核酸酶SpCas9的截短型高特异性变体及其应用。本发明Cas9核酸酶变体（THSpCas9），属于CRISPR‑Cas9系统，具有野生型CRISPR‑Cas9核酸酶基因编辑功能，CRISPR‑Cas9核酸酶是将野生型CRISPR‑Cas9核酸的氨基酸序截掉8个即第494‑501位的氨基酸后重组所得到;野生型CRISPR‑Cas9核酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或者，所述CRISPR‑Cas9核酸酶含有如SEQ ID NO.1所示90%的氨基酸序列，即SEQ ID NO.2。采用所述Cas9核酸酶变体（THSpCas9）能够提高编辑特异性，实现对基因组DNA片段的特定位置的精准编辑。

Description

酿脓链球菌的CRISPR核酸酶SpCas9的截短型高特异性变异体及其应用

技术领域

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及一种来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR-Cas9核酸酶SpCas9的截短型高特异性蛋白变体THSpCas9及其用途。

背景技术

由细菌免疫系统经漫长进化而产生的CRISPR-Cas9系统是一种革命性的基因编辑技术，被称为“基因魔剪”，可方便地对基因组特定基因的DNA链进行高效切割编辑，该系统的出现，大大克服了传统编辑技术耗时长的缺点，仅需数周就可以实现过去利用传统技术耗时一年之久才能完成的编辑^[1-11]。其中，来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的CRISPR-Cas9核酸酶SpCas9是目前最为广泛使用的CRISPR核酸酶^[12]，被广泛应用到多个领域，包括医学研究以及生物技术等，比如细胞或动物模型的构建快速、功能基因的筛选便捷以及遗传疾病的治疗彻底^[13-24]。

虽然，CRISPR-Cas9系统的优势促使其能够广泛应用于许多领域，并最近在医学领域的研究上也异军突起，但仍有许多问题制约着其发展，尤其是得到一个精准靶向特异性疾病基因位点的CRISPR-Cas9核酸酶，至今是临床应用的瓶颈问题。然而，由于靶基因组极其复杂，sgRNA会与其他类似靶序列的基因位点发生局部匹配，进一步激活Cas9切割DNA，产生脱靶现象，从而影响DNA片段的正确遗传编辑，进而限制了该技术在精准医疗方面的应用^[25]。

因而，基于上述问题，探寻高特异性Cas9核酸酶从而有效地实现DNA片段的精准遗传编辑是十分必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于酿脓链球菌的CRISPR-Cas9核酸酶SpCas9的截短型高特异性变体及其用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。

本发明提供一种截短型高特异性CRISPR-Cas9核酸酶(THSpCas9)，所述CRISPR-Cas9核酸酶是将野生型CRISPR-Cas9核酸的氨基酸序截掉8(第494-501位)个氨基酸后重组所得，具有野生型CRISPR-Cas9核酸酶基因编辑功能，与野生型核酸酶相比，更能特异性靶向基因编辑位点，实现精准编辑。

所述野生型SpCas9核酸酶的核苷酸序列和氨基酸序列分别为SEQ.ID.NO.1和SEQ.ID.NO.2所示。

所述CRISPR-Cas9核酸酶(THSpCas9)的核苷酸序列和氨基酸序列分别为SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4所示，与野生型SpCas9的相似度达90％以上。

本发明还提供一种多核苷酸序列，可以转录和翻译所述的CRISPR-Cas9核酸酶(THSpCas9)。

本发明还提供一种表达载体，其含有上述多核苷酸序列。

本发明还提供一种宿主细胞，可以用于转化上述表达载体。

本发明提供一种制备所述CRISPR-Cas9核酸酶(THSpCas9)的方法，具体步骤包括：首先，构建所述CRISPR-Cas9核酸酶的多核苷酸序列表达载体；然后，将所述表达载体转化至宿主细胞，筛选并挑出单克隆；最后，将所述单克隆诱导表达，并通过亲和层析、离子交换等方法从表达产物中分离出所述的CRISPR-Cas9核酸酶。

本发明还提供上述CRISPR-Cas9核酸酶、多核苷酸序列以及表达载体均可作为基因组编辑工具用途用于基因组DNA片段的相关编辑。

本发明中所述的编辑可以是单点编辑、也可以是编辑位点大于等于两个的多点编辑。

所述编辑的手段包括删除、突变、插入、倒位、移位、重复或易位。

所述CRISPR-Cas9编辑工具包括与靶标DNA片段匹配的引导sgRNA。

所述的CRISPR-Cas9核酸酶与能够介导它的sgRNA组合，能够对基因进行编辑。

与现有技术相比，本发明的CRISPR-Cas9(TSpCas9)，属于CRISPR-Cas9免疫系统，含有如SEQ.ID.NO.3和SEQ.ID.NO.4的核苷酸序列和氨基酸序列，能够提高基因编辑特异性，实现对基因组DNA片段的特定位置的精准编辑，具有潜在的精准生物医学应用价值。

附图说明

图1为分子动力学模拟预测THSpCas9氨基酸截短位点。

图2为Pet21-6His-TEV-THSpCas9质粒构建。

图3为Pet21-6His-TEV-THSpCas9质粒筛选与培养。

图4为THSpCas9目标蛋白的纯化方法。

图5为THSpCas9目标蛋白纯化获取的过程。

图6为THSpCas9目标蛋白的电泳鉴定。

图7为体外脱靶检测原理图。

图8为野生型SpCas9体外在靶和脱靶效应的检测。

图9为截短型THSpCas9体外在靶和脱靶效应的检测。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步描述本发明。

实施例中所用的实验方法，如无特定说明，均为常规方法。实施例中所用的材料、试剂等，如无特定说明，均为从商业途径获得。

一、CRISPR-Cas9核酸酶

本发明的CRISPR-Cas9核酸酶(THSpCas9)，其是将野生型的SpCas9第494-501位氨基酸截掉所得，属于CRISPR-Cas9系统，具有野生型CRISPR-Cas9(SpCas9)核酸酶基因编辑功能，与野生型核酸酶相比，更能特异性靶向基因编辑位点，实现精准编辑。

二、编码CRISPR-Cas9核酸酶的多核苷酸

转录和翻译所述CRISPR-Cas9(THSpCas9)的多核苷酸序列，包括DNA或RNA。DNA还可以细分为质粒DNA、基因组DNA或人工合成的DNA。

编码所述CRISPR-Cas9(THSpCas9)的多核苷酸序列，可以利用该领域科研或技术人员所熟悉的相关分子生物学技术来制备，其不局限于重组DNA技术和化学合成方法。

三、表达载体

所述表达载体含有编码所述CRISPR-Cas9核酸酶(THSpCas9)的多核苷酸序列。该表达载体可以通过科研或技术人员所熟悉的分子生物学方法来构建，包括DNA重组技术和DNA合成技术等，主要将CRISPR-Cas9核酸酶(THSpCas9)的DNA有效连接到载体上的克隆位点中，然后通过转录翻译等过程表达目的蛋白THSpCas9。

四、宿主细胞

所述宿主细胞可以用于表达CRISPR-Cas9核酸酶的重组质粒所转化。宿主细胞主要包括原核细胞(如细菌)，低等真核细胞(如酵母)，高等真核细胞(如哺乳动物细胞)等。常用的宿主细胞如大肠杆菌、DH5α、毕赤酵母、HEK293、CHO、Hela细胞等。

五、CRISPR-Cas9核酸酶(THSpCas9)及其编码该酶的核苷酸序列和所述表达载体的用途

本发明的CRISPR-Cas9核酸酶(THSpCas9)及其编码该酶的多核苷酸序列和所述的表达载体能够用于基因组DNA片段的编辑或用于制备基因编辑工具。CRISPR-Cas9核酸酶(THSpCas9)编辑包括单位点和多位点编辑，其编辑手段包括删除、突变、插入、倒位、移位、重复或易位等。

六、基因编辑工具及其方法

本发明的基因编辑工具属于CRISPR-Cas9系统，CRISPR-Cas9(THSpCas9)在特定的sgRNA的引导下可以在目的基因DNA片段PAM(NGG)位点上游3到4位间剪切底物DNA片段。该编辑过程可以在体内或体内进行。当sgRNA是单个的时候可以进行单点编辑，当sgRNA是两个或两个以上时可以进行多位点编辑。

如本发明的一些实施方式中所列举的，CRISPR-Cas9核酸酶(THSpCas9)在sgRNA的引导下，可以在体外对底物DNA(920bp)进行剪切，其产物为760bp和260bp。

在本发明中，Cas9可作为CRISPR-Cas9核酸酶的简称使用，其含义与CRISPR-Cas9核酸酶相同。本发明中的截短型高特异性蛋白为THSpCas9，即对野生型SpCas9第494-501位氨基酸对应的质粒片段去掉，将剩余部分氨基酸的质粒连接并表达得到的蛋白。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围并不局限为下述特定的具体实施方案，还应理解为，本发明实施例中的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下例实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件操作，或者按照各生产厂商所建议的条件操作。

除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、重组DNA技术及相关领域的常规技术。

实施例1，构建CRISPR-Cas9核酸酶(TSpCas9)的质粒

1.分子动力学模拟

如图1a所示，使用野生型SpCas9蛋白质结构序列(PDB code:5y36)；如图1b所示，利用Rosetta软件进行蛋白截短预测出最优的截短方式；如图1c所示，通过分子动力学模拟软件NAMD进行短程模拟预测截短后结构稳定性，然后用可视化软件Pymol和VMD观察截短后蛋白结构。

2.突变体质粒的构建

以pet21-6His-TEV-SpCas9为模板，截掉494(6764bp)～501(6787bp)位氨基酸，然后，重组成截短的SpCas9，将其称为THSpCas9。其质粒构建思路如图2所示：

(1)利用引物494F和494R在质粒Pet21-6His-TEV-SpCas9上扩增出含有限制性单酶切位点NsiI-HF的载体片段，并通过AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit(购于Axygen)对扩增产物进行纯化回收；

(2)使用限制性内切酶NsiI-HF(购于NEB)酶切回收后的载体片段，并通过AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit纯化回收；

(3)使用T4ligase(购于Takara)将酶切纯化回收后的载体片段进行连接，将此连接产物称为pet21-6His-TEV-THSpCas9-NsiI-HF；

(4)将连接产物转入DH5α感受态细胞(购于TIANGEN)，挑单克隆，测序；

(5)测序成功后，提质粒，设计引物494-1F，494-1R，494-2F，494-2R，用快速定点突变试剂盒(购于赛百盛公司)将NsiI-HF酶切位点(ATGCAT)突变去掉，即可获得pet21-6His-TEV-THSpCas9。

①采购扩增试剂盒

所用扩增试剂盒Fast HiFidelity PCR Kit从天根生化科技(北京)有限公司订购。

②采购引物

所用引物均从上海生工生物工程有限公司订购，引物的5’端均加有所需的酶切位点和该酶切位点的保护碱基。序列如下：

494F：TGCATGCATCTGCCTAACGAAAAGGTGCTTG(SEQ.ID.NO.5)

494R：TGCATGCATTTCGATGAAGGACTGGGCAG(SEQ.ID.NO.6)

494-1F：CCAGTCCTTCATCGAACATCTGCCTAACGAA(SEQ.ID.NO.7)

494-1R：TTCGTTAGGCAGATGTTCGATGAAGGACTGG(SEQ.ID.NO.8)

494-2F：CCAGTCCTTCATCGAACTGCCTAACGAAAAG(SEQ.ID.NO.9)

494-2R：CTTTTCGTTAGGCAGTTCGATGAAGGACTGG(SEQ.ID.NO.10)。

扩增体系如下：

PCR反应条件：

③割胶回收试剂盒采购

所用割胶回收试剂盒AxyPrepTM DNA Gel Extraction Kit从Axygen公司订购，割胶回收操作均按其说明书进行。

④限制内切酶及T4连接酶

所用限制内切酶NsiI-HF和T4连接酶均从NEB公司订购订购。

酶切反应体系

按该反应体系37℃孵育至少2小时，并电泳割胶纯化回收。

连接反应体系

该反应体系16℃孵育至少2小时，并转化大肠杆菌DH5α筛选单克隆pet21-6His-TEV-THSpCas9-NsiI-HF，培养细菌，抽提质粒，抽提方法见Qiagen质粒小提试剂盒使用说明。

PCR反应条件：

反应结束后加入1ul(10U/ul)MutazymeT M酶37℃温育一小时，并转化大肠杆菌DH5α筛选单克隆pet21-6His-TEV-THSpCas9，培养细菌，抽提质粒，抽提方法见Qiagen质粒小提试剂盒使用说明。其结果如图2所示，显示了截短型高特异性THSpCas9的构建过程；图3显示了THSpCas9质粒的筛选与培养过程。

实施例2，制备CRISPR-Cas9(TSpCas9)核酸酶

1、蛋白表达

(1)打开超净台，用含75％酒精的棉球擦拭桌面以及各种器具，开紫外灯照射20min，启动风机备用；

(2)移液枪吸10μl表达Pet21-6His-TEV-TSpCas9的Rosetta(DE3)(购于TIANGEN)菌液转至6ml含有双抗(Amp与Cm)的LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养过夜；

(3)将过夜培养的菌液按照体积比为1：100转至500ml含双抗的LB(购于生工)液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养。在培养过程中，随时检测菌液的OD值；

(4)当菌液的OD值接近0.4～0.8时，加入蛋白诱导剂IPTG，使其终浓度为0.1mM，然后16℃，200r/min振荡培养20h；

(5)收集菌液，5000r/min离心5min使菌体沉淀，弃上清，并称重Pet21-6His-TEV-THSpCas9菌体。

2蛋白纯化

(1)向菌体中加入预先冰浴且PMSF终浓度为0.1mM的裂解液(20mM HEPES，500mMKCl，pH7.5；1g菌体加入5ml)，涡旋仪重悬使菌块分散混匀，细胞超声破碎仪破碎细胞，超声3sec停3sec，一次10min，超声两次，超声过程均在冰浴中进行；

(2)向破碎的菌液中加入终浓度为10μg/ml RNase(生工)，5μg/ml DNase I(生工)，冰浴处理30min后，4℃10000r/min离心45～60min，收集上清；

(3)将上清与预先用平衡液(20mM HEPES，500mM KCl，1％蔗糖，pH7.5)处理的Qiagen Ni-NTA介质孵育，此过程在冰浴上进行，并加以振荡(150r/min)，1.5h后静置，待Qiagen Ni-NTA沉淀；

(4)将Qiagen Ni-NTA装载到重力柱中，BioLogic LP系统的监测下，分别以流速为2ml/min的平衡液和洗脱液(20mM HEPES，500mM KCl，500mM咪唑，1％蔗糖，pH7.5)，20、30、40、50、100、250、500Mm洗脱液冲洗Qiagen Ni-NTA，并收集蛋白；

(5)将不同咪唑浓度下的蛋白溶液跑SDS-PAGE(购于EpiZyme Scientific)电泳，考马斯亮蓝染色，脱色剂脱色，观察目的蛋白的表达和挂柱效果。

所述蛋白THSpCas9的纯化结果如图6所示，其显示该目的蛋白THSpCas9的表达和纯化情况，从上清液观察，目的蛋白THSpCas9表达较多，从穿流液观察，Ni-NTA吸附的能力适中，从洗脱液观察，30、50和100mM咪唑洗脱液下的目的蛋白THSpCas9相对较纯，可以收集浓缩做活性检测。

实施例3，检验CRISPR-Cas9(THSpCas9)核酸酶在靶和脱靶剪切活性

所用底物DNA(SEQ ID NO.11)，主要利用引物QG-F：TAGTCCTGTCGGGTTTCG(SEQ IDNO.12)和QG-R：TTCCATTCGCCATTCAGG(SEQ ID NO.13)通过常规PCR扩增获取。其反应体系和扩增条件如下：

扩增体系如下：

PCR反应条件：

割胶回收试剂盒采购

所用割胶回收试剂盒AxyPrep^TM DNA Gel Extraction Kit从Axygen公司订购，割胶回收操作均按其说明书进行，可以获得较纯的底物DNA(SEQ ID NO.14)。

利用不同的sgRNA，如图7中1到8号所示所示，从PAM远端第20个碱基开始，依次设计与target DNA 存在两个碱基不匹配的sgRNA，共8个，进行体外转录纯化，引导THSpCas9的体外切割活性来评价THSpCas9的脱靶效应，Cas9与sgRNA以等摩尔混合，而根据实验需要，底物DNA可调为Cas9摩尔质量的0.2～1倍。将反应体系置37℃孵育，1h后70℃作用10min，最后电泳检测目的蛋白的体外切割活性。其反应体系如下:

首先，评价野生型SpCas9在体外的脱靶效应，如图8所示，与0号sgRNA引导的SpCas9剪切活性相比(泳道3)，1到8号sgRNA引导的SpCas9均能够在体外剪切底物DNA(泳道4到11)，生成产物1和产物2。尽管只有部分sgRNA的引导活性强，即1到4号sgRNA引导的SpCas9体外剪切活性比较强(泳道4到7)，5到8号sgRNA引导的SpCas9体外剪切活性却依次减弱(8号到11号)，但是，该结果依然反应野生型SpCas9在体外的脱靶效应比较严重。由此说明，野生型SpCas9有较强的脱靶效应，尤其在1到4号sgRNA的引导下更为突出。

其次，评价截短型高特异性THSpCas9在体外的脱靶效应，如图9所示，与0号sgRNA引导的THSpCas9剪切活性相比(泳道3)，1到8号sgRNA引导的截短型高特异性THSpCas9在体外剪切底物DNA的剪切活性均明显降低(泳道4到11)。由此说明在sgRNA与底物DNA完全互补的情况下，THSpCas9保留了野生型SpCas9核酸酶的切割活性；同时，在sgRNA与底物DNA存在两个碱基错配的情况下，和野生型SpCas9相比较，THSpCas9对于对底物DNA的容错率更低，体外剪切特异性更高。

因而THSpCas9具有野生型CRISPR-Cas9核酸酶基因编辑功能，与野生型核酸酶相比，更能特异性靶向基因编辑位点，实现精准编辑。

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序列表

<110> 复旦大学

<120> 酿脓链球菌的CRISPR核酸酶SpCas9的截短型高特异性变异体及其应用

<130> 001

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4104

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggcgacaaga agtactccat tgggctcgat atcggcacaa acagcgtcgg ctgggccgtc 60

attacggacg agtacaaggt gccgagcaaa aaattcaaag ttctgggcaa taccgatcgc 120

cacagcataa agaagaacct cattggcgcc ctcctgttcg actccgggga gacggccgaa 180

gccacgcggc tcaaaagaac agcacggcgc agatataccc gcagaaagaa tcggatctgc 240

tacctgcagg agatctttag taatgagatg gctaaggtgg atgactcttt cttccatagg 300

ctggaggagt cctttttggt ggaggaggat aaaaagcacg agcgccaccc aatctttggc 360

aatatcgtgg acgaggtggc gtaccatgaa aagtacccaa ccatatatca tctgaggaag 420

aagcttgtag acagtactga taaggctgac ttgcggttga tctatctcgc gctggcgcat 480

atgatcaaat ttcggggaca cttcctcatc gagggggacc tgaacccaga caacagcgat 540

gtcgacaaac tctttatcca actggttcag acttacaatc agcttttcga agagaacccg 600

atcaacgcat ccggagttga cgccaaagca atcctgagcg ctaggctgtc caaatcccgg 660

cggctcgaaa acctcatcgc acagctccct ggggagaaga agaacggcct gtttggtaat 720

cttatcgccc tgtcactcgg gctgaccccc aactttaaat ctaacttcga cctggccgaa 780

gatgccaagc ttcaactgag caaagacacc tacgatgatg atctcgacaa tctgctggcc 840

cagatcggcg accagtacgc agaccttttt ttggcggcaa agaacctgtc agacgccatt 900

ctgctgagtg atattctgcg agtgaacacg gagatcacca aagctccgct gagcgctagt 960

atgatcaagc gctatgatga gcaccaccaa gacttgactt tgctgaaggc ccttgtcaga 1020

cagcaactgc ctgagaagta caaggaaatt ttcttcgatc agtctaaaaa tggctacgcc 1080

ggatacattg acggcggagc aagccaggag gaattttaca aatttattaa gcccatcttg 1140

gaaaaaatgg acggcaccga ggagctgctg gtaaagctta acagagaaga tctgttgcgc 1200

aaacagcgca ctttcgacaa tggaagcatc ccccaccaga ttcacctggg cgaactgcac 1260

gctatcctca ggcggcaaga ggatttctac ccctttttga aagataacag ggaaaagatt 1320

gagaaaatcc tcacatttcg gataccctac tatgtaggcc ccctcgcccg gggaaattcc 1380

agattcgcgt ggatgactcg caaatcagaa gagaccatca ctccctggaa cttcgaggaa 1440

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Glu Asp Ile Val Leu Thr Leu Thr Leu Phe Glu Asp Arg Glu Met Ile

610 615 620

Glu Glu Arg Leu Lys Thr Tyr Ala His Leu Phe Asp Asp Lys Val Met

625 630 635 640

Lys Gln Leu Lys Arg Arg Arg Tyr Thr Gly Trp Gly Arg Leu Ser Arg

645 650 655

Lys Leu Ile Asn Gly Ile Arg Asp Lys Gln Ser Gly Lys Thr Ile Leu

660 665 670

Asp Phe Leu Lys Ser Asp Gly Phe Ala Asn Arg Asn Phe Met Gln Leu

675 680 685

Ile His Asp Asp Ser Leu Thr Phe Lys Glu Asp Ile Gln Lys Ala Gln

690 695 700

Val Ser Gly Gln Gly Asp Ser Leu His Glu His Ile Ala Asn Leu Ala

705 710 715 720

Gly Ser Pro Ala Ile Lys Lys Gly Ile Leu Gln Thr Val Lys Val Val

725 730 735

Asp Glu Leu Val Lys Val Met Gly Arg His Lys Pro Glu Asn Ile Val

740 745 750

Ile Glu Met Ala Arg Glu Asn Gln Thr Thr Gln Lys Gly Gln Lys Asn

755 760 765

Ser Arg Glu Arg Met Lys Arg Ile Glu Glu Gly Ile Lys Glu Leu Gly

770 775 780

Ser Gln Ile Leu Lys Glu His Pro Val Glu Asn Thr Gln Leu Gln Asn

785 790 795 800

Glu Lys Leu Tyr Leu Tyr Tyr Leu Gln Asn Gly Arg Asp Met Tyr Val

805 810 815

Asp Gln Glu Leu Asp Ile Asn Arg Leu Ser Asp Tyr Asp Val Asp His

820 825 830

Ile Val Pro Gln Ser Phe Leu Lys Asp Asp Ser Ile Asp Asn Lys Val

835 840 845

Leu Thr Arg Ser Asp Lys Asn Arg Gly Lys Ser Asp Asn Val Pro Ser

850 855 860

Glu Glu Val Val Lys Lys Met Lys Asn Tyr Trp Arg Gln Leu Leu Asn

865 870 875 880

Ala Lys Leu Ile Thr Gln Arg Lys Phe Asp Asn Leu Thr Lys Ala Glu

885 890 895

Arg Gly Gly Leu Ser Glu Leu Asp Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln

900 905 910

Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr Lys His Val Ala Gln Ile Leu Asp

915 920 925

Ser Arg Met Asn Thr Lys Tyr Asp Glu Asn Asp Lys Leu Ile Arg Glu

930 935 940

Val Lys Val Ile Thr Leu Lys Ser Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys

945 950 955 960

Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg Glu Ile Asn Asn Tyr His His Ala

965 970 975

His Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Val Val Gly Thr Ala Leu Ile Lys Lys

980 985 990

Tyr Pro Lys Leu Glu Ser Glu Phe Val Tyr Gly Asp Tyr Lys Val Tyr

995 1000 1005

Asp Val Arg Lys Met Ile Ala Lys Ser Glu Gln Glu Ile Gly Lys Ala

1010 1015 1020

Thr Ala Lys Tyr Phe Phe Tyr Ser Asn Ile Met Asn Phe Phe Lys Thr

1025 1030 1035 1040

Glu Ile Thr Leu Ala Asn Gly Glu Ile Arg Lys Arg Pro Leu Ile Glu

1045 1050 1055

Thr Asn Gly Glu Thr Gly Glu Ile Val Trp Asp Lys Gly Arg Asp Phe

1060 1065 1070

Ala Thr Val Arg Lys Val Leu Ser Met Pro Gln Val Asn Ile Val Lys

1075 1080 1085

Lys Thr Glu Val Gln Thr Gly Gly Phe Ser Lys Glu Ser Ile Leu Pro

1090 1095 1100

Lys Arg Asn Ser Asp Lys Leu Ile Ala Arg Lys Lys Asp Trp Asp Pro

1105 1110 1115 1120

Lys Lys Tyr Gly Gly Phe Asp Ser Pro Thr Val Ala Tyr Ser Val Leu

1125 1130 1135

Val Val Ala Lys Val Glu Lys Gly Lys Ser Lys Lys Leu Lys Ser Val

1140 1145 1150

Lys Glu Leu Leu Gly Ile Thr Ile Met Glu Arg Ser Ser Phe Glu Lys

1155 1160 1165

Asn Pro Ile Asp Phe Leu Glu Ala Lys Gly Tyr Lys Glu Val Lys Lys

1170 1175 1180

Asp Leu Ile Ile Lys Leu Pro Lys Tyr Ser Leu Phe Glu Leu Glu Asn

1185 1190 1195 1200

Gly Arg Lys Arg Met Leu Ala Ser Ala Gly Glu Leu Gln Lys Gly Asn

1205 1210 1215

Glu Leu Ala Leu Pro Ser Lys Tyr Val Asn Phe Leu Tyr Leu Ala Ser

1220 1225 1230

His Tyr Glu Lys Leu Lys Gly Ser Pro Glu Asp Asn Glu Gln Lys Gln

1235 1240 1245

Leu Phe Val Glu Gln His Lys His Tyr Leu Asp Glu Ile Ile Glu Gln

1250 1255 1260

Ile Ser Glu Phe Ser Lys Arg Val Ile Leu Ala Asp Ala Asn Leu Asp

1265 1270 1275 1280

Lys Val Leu Ser Ala Tyr Asn Lys His Arg Asp Lys Pro Ile Arg Glu

1285 1290 1295

Gln Ala Glu Asn Ile Ile His Leu Phe Thr Leu Thr Asn Leu Gly Ala

1300 1305 1310

Pro Ala Ala Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr

1315 1320 1325

Thr Ser Thr Lys Glu Val Leu Asp Ala Thr Leu Ile His Gln Ser Ile

1330 1335 1340

Thr Gly Leu Tyr Glu Thr Arg Ile Asp Leu Ser Gln Leu Gly Gly Asp

1345 1350 1355 1360

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tgcatgcatc tgcctaacga aaaggtgctt g 31

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgcatgcatt tcgatgaagg actgggcag 29

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ccagtccttc atcgaacatc tgcctaacga a 31

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttcgttaggc agatgttcga tgaaggactg g 31

<210> 9

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccagtccttc atcgaactgc ctaacgaaaa g 31

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cttttcgtta ggcagttcga tgaaggactg g 31

<210> 11

<211> 3046

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa 60

atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 120

agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 180

ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 240

gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 300

gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 360

tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 420

acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 480

aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 540

cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 600

gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 660

cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 720

tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 780

tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 840

ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 900

tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 960

gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 1020

ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1080

tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1140

agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1200

aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1260

cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt 1320

agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 1380

tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 1440

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 1500

gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 1560

ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 1620

gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 1680

ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 1740

ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 1800

acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 1860

gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 1920

cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca 1980

gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga 2040

gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt 2100

gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca 2160

agctcgaaat taaccctcac taaagggaac aaaagctgga gctccaccgc ggtggcggcc 2220

gctctagaac tagtggatcc cccgggctgc aggaattcga tatcaagctt atcgattacc 2280

gctccagtcg ttcatgaggt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt 2340

atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctctcgagg gggggcccgg tacccaattc 2400

gccctatagt gagtcgtatt acaattcact ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga 2460

aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct tgcagcacat ccccctttcg ccagctggcg 2520

taatagcgaa gaggcccgca ccgatcgccc ttcccaacag ttgcgcagcc tgaatggcga 2580

atggaaattg taagcgttaa tattttgtta aaattcgcgt taaatttttg ttaaatcagc 2640

tcatttttta accaataggc cgaaatcggc aaaatccctt ataaatcaaa agaatagacc 2700

gagatagggt tgagtgttgt tccagtttgg aacaagagtc cactattaaa gaacgtggac 2760

tccaacgtca aagggcgaaa aaccgtctat cagggcgatg gcccactacg tgaaccatca 2820

ccctaatcaa gttttttggg gtcgaggtgc cgtaaagcac taaatcggaa ccctaaaggg 2880

agcccccgat ttagagcttg acggggaaag ccggcgaacg tggcgagaaa ggaagggaag 2940

aaagcgaaag gagcgggcgc tagggcgctg gcaagtgtag cggtcacgct gcgcgtaacc 3000

accacacccg ccgcgcttaa tgcgccgcta cagggcgcgt caggtg 3046

<210> 12

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tagtcctgtc gggtttcg 18

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ttccattcgc cattcagg 18

<210> 14

<211> 920

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tagtcctgtc gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg 60

ggggcggagc ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg 120

ctggcctttt gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat 180

taccgccttt gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc 240

agtgagcgag gaagcggaag agcgcccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc 300

gattcattaa tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa 360

cgcaattaat gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc 420

ggctcgtatg ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga 480

ccatgattac gccaagctcg aaattaaccc tcactaaagg gaacaaaagc tggagctcca 540

ccgcggtggc ggccgctcta gaactagtgg atcccccggg ctgcaggaat tcgatatcaa 600

gcttatcgat taccgctcca gtcgttcatg aggttagagc tagaaatagc aagttaaaat 660

aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctctc gagggggggc 720

ccggtaccca attcgcccta tagtgagtcg tattacaatt cactggccgt cgttttacaa 780

cgtcgtgact gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct 840

ttcgccagct ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc 900

agcctgaatg gcgaatggaa 920

Claims

1.一种CRISPR-Cas9核酸酶，属于CRISPR-Cas9系统，具有野生型CRISPR-Cas9核酸酶基因编辑功能，所述CRISPR-Cas9核酸酶是将野生型CRISPR-Cas9核酸的氨基酸序列截掉8个即第494-501位的氨基酸后重组所得: 所述野生型CRISPR-Cas9核酸酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas9核酸酶，其特征在于，在同等反应条件下，所述CRISPR-Cas9核酸酶与野生型CRISPR-Cas9核酸酶相比，基因编辑特异性提高。

3.根据权利要求1所述的CRISPR-Cas9核酸酶，其特征在于，所述野生型CRISPR-Cas9核酸酶为来源于酿脓链球菌的免疫系统SpCas9蛋白。

4.一种多核苷酸，其能够编码如权利要求1-3中任意一项所述的CRISPR-Cas9核酸酶。

5.一种表达载体，其包含如权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其包含权利要求5所述的表达载体。

7.一种制备权利要求1-3任意一项所述的CRISPR-Cas9核酸酶的方法，具体步骤包括：首先构建权利要求5所述的表达载体；然后，将所述表达载体转化至宿主细胞，筛选并挑出单克隆；最后，将所述单克隆诱导表达，并通过亲和层析、离子交换方法从表达产物中分离出所述的CRISPR-Cas9核酸酶。

8.权利要求1-3中任意一项所述CRISPR-Cas9核酸酶、权利要求4中所述的多核苷酸、权利要求5中所述的表达载体的用途，用于体外非治疗目的的基因组单位点或多位点基因编辑。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述编辑是单点编辑，或者是编辑位点大于等于两个的多点编辑；编辑方式为基因的删除、突变、插入、倒位、移位、重复或易位。

10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述CRISPR-Cas9核酸酶作为编辑工具包括与靶标DNA片段匹配的引导sgRNA。

11.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，是将权利要求5所述表达载体和与之匹配的引导sgRNA一同转入宿主细胞，对基因进行编辑。

12.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述单位点或多位点基因编辑，是利用权利要求1-3中任意一项所述CRISPR-Cas9核酸酶对双链DNA进行剪切，并通过宿主细胞的修复系统对断裂的缺口进行修复。

13.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述单位点或多位点基因编辑，是改变单位点或多位点编辑时的碱基突变特征。