CN111154707B

CN111154707B - 基因工程化大肠杆菌及褪黑素的生产方法

Info

Publication number: CN111154707B
Application number: CN202010057352.6A
Authority: CN
Inventors: 祁峰; 黄建忠; 沈培杰; 杨金花; 江贤章; 李清晨; 林金新
Original assignee: Fujian Normal University
Current assignee: Fujian Normal University
Priority date: 2020-01-19
Filing date: 2020-01-19
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2040-01-19
Also published as: CN111154707A

Abstract

本发明公开了一种基因工程化大肠杆菌及褪黑素的生产方法。本发明的基因工程化大肠杆菌包含N‑乙酰转移酶基因和O‑甲基转移酶基因，且所述N‑乙酰转移酶基因和O‑甲基转移酶基因能够在所述大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的N‑乙酰转移酶和O‑甲基转移酶。本发明利用基因工程化大肠杆菌生产褪黑素，反应条件温和。

Description

基因工程化大肠杆菌及褪黑素的生产方法

技术领域

本发明涉及一种基因工程化大肠杆菌及褪黑素的生产方法。

背景技术

褪黑素是由哺乳动物大脑中的松果体合成的一类具有生物活性的物质，化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺。从结构上看，褪黑素是一种色氨酸衍生物，具有1个吲哚母环、1个侧链乙酰胺基团和1个芳环取代甲氧基。

在制药与保健品领域，褪黑素作为一种内分泌激素，可以通过调节昼夜节律作用，从而改善人类睡眠、延缓衰老。在农业中，褪黑素的用途也十分广泛。外源添加的褪黑素可以促进植物种子发芽和幼苗生长。此外，褪黑素还可以刺激植物免疫系统，提高植物抗逆性。

通常，褪黑素可以通过复杂的化学方法合成。例如，CN110229092A公开了一种化学合成褪黑素的方法，以5-甲氧基吲哚、碳酰氯和氢化铝锂为原料通过多步反应制备得到褪黑素。又如，CN104496882A公开了一种褪黑素的合成方法，由丙二酸二乙酯与丙烯腈为原料，经过加成、酯的氨解、偶合、重排、酰胺的水解、脱羧及酰化等步骤得到褪黑素。化学合成法步骤繁琐、污染大且得率底。

此外，褪黑素还可以从动植物组织中提取。CN109258464A公开了一种通过新疆雪莲愈伤组织合成褪黑素的方法。将新疆雪莲愈伤组织在黑暗环境中预处理，然后将预处理得到的新疆雪莲愈伤组织在低气压环境中进行光照培养而获得褪黑素。动植物组织提取法存在原料供应少、提取率低的问题。

近年来，生物催化方法取得快速进展，其具有工艺简单、生产周期短、易于放大等优势，有望成为大规模生产褪黑素的理想途径。但是，现有技术中缺少相关途径的探索和研究。本领域内仍然需要生物合成褪黑素的新方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种基因工程化大肠杆菌，其具有产生N-乙酰转移酶和O-甲基转移酶的能力。本发明的另一个目的在于提供上述基因工程化大肠杆菌的制备方法。本发明再一个目的在于提供一种褪黑素的生产方法，其利用上述基因工程化大肠杆菌进行褪黑素的微生物合成。

大肠杆菌属于埃希氏菌属，革兰氏阴性菌，是人肠道的普遍寄生菌。它可以在很多类型的培养基上生长，繁殖速度快，一般对人无毒无害。大肠杆菌的基因组约为4.6MB，属于人类最早测序的生物之一。

本发明发现将来自于人源基因组的N-乙酰转移酶和来自于水稻基因组的O-甲基转移酶基因转化到大肠杆菌进行表达，产生具有活性的N-乙酰转移酶和O-甲基转移酶，从而可以将底物血清素转化为褪黑素。至少基于上述部分发现完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

一方面，本发明提供一种基因工程化大肠杆菌，其包含N-乙酰转移酶基因和O-甲基转移酶基因，且所述N-乙酰转移酶基因和O-甲基转移酶基因能够在所述基因工程化大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的N-乙酰转移酶和O-甲基转移酶。

本发明的基因工程化大肠杆菌表示对常规的大肠杆菌通过基因重组技术改造得到的菌株。根据本发明的一个实施方式，通过基因重组技术在那些不具有或缺少N-乙酰转移酶和O-甲基转移酶活性的野生型或其它人工改造大肠杆菌中引入外来物种的基因来使这些基因表达，从而产生或带来增量的N-乙酰转移酶和O-甲基转移酶活性，从而获得基因工程化大肠杆菌。优选地，常规的大肠杆菌可以为大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655，其可购自ATCC(保藏编号ATCC700926)。这些大肠杆菌属于市售产品，因而不需要额外的保藏证据及遗传资源登记资料。

本发明的N-乙酰转移酶基因可以为来源于除了大肠杆菌之外的其他微生物、动物或植物的N-乙酰转移酶基因，例如，人源(Homo sapiens)N-乙酰转移酶基因。N-乙酰转移酶基因在基因工程化大肠杆菌胞内表达形成具有活性的N-乙酰转移酶。根据本发明的一个实施方式，N-乙酰转移酶基因如SEQ ID NO：10所示。

本发明的O-甲基转移酶基因可以为来源于除了大肠杆菌之外的其他微生物、动物或植物的O-甲基转移酶基因，例如，来自于水稻(Oryza sativa)的O-甲基转移酶基因。O-甲基转移酶基因在基因工程化大肠杆菌的胞内表达形成具有活性的O-甲基转移酶。根据本发明的一个实施方式，O-甲基转移酶基因的基因序列如SEQ ID NO：11所示。

根据本发明的基因工程化大肠杆菌，优选地，所述N-乙酰转移酶基因为人源的N-乙酰转移酶基因；所述O-甲基转移酶基因为来自水稻的O-甲基转移酶基因；所述基因工程化大肠杆菌源自大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655。

根据本发明的基因工程化大肠杆菌，优选地，所述N-乙酰转移酶基因的碱基序列如SEQ ID NO：10所示；且所述O-甲基转移酶基因的碱基序列如SEQ ID NO：11所示。

另一方面，本发明提供一种基因工程化大肠杆菌的制备方法，其包括构建重组质粒的步骤和转化所述重组质粒至大肠杆菌的步骤。

构建重组质粒的步骤包括：先获得N-乙酰转移酶NAT基因片段和O-甲基转移酶OMT基因片段，再以pTrc99A质粒为模板扩增得到pTrc99A载体骨架，用无缝连接的方法将三个片段连接构建重组质粒，得到重组质粒pTrc99A-NAT-OMT。具体地，使用第一引物从人的基因组中扩增得到N-乙酰转移酶NAT基因，使用第二引物从水稻的基因组中扩增得到O-甲基转移酶OMT基因，使用第三引物以pTrc99A质粒为模板扩增得到pTrc99A载体骨架；在设计引物时向引物中添加各自同源臂，扩增得到的N-乙酰转移酶基因NAT、O-甲基转移酶基因OMT和pTrc99A骨架三个片段都具有前后匹配的同源臂，将所述三个片段连接得到重组质粒pTrc99A-NAT-OMT。

根据本发明的一个实施方式，本发明的基因工程化大肠杆菌的制备方法包括：

构建重组质粒的步骤；和

转化所述重组质粒至大肠杆菌的步骤；

其中，所述构建重组质粒的步骤包括：使用第一引物从人的基因组中扩增得到N-乙酰转移酶NAT基因，使用第二引物从水稻的基因组中扩增得到O-甲基转移酶OMT基因，使用第三引物以pTrc99A质粒为模板扩增得到pTrc99A载体骨架；在设计引物时向引物中添加各自同源臂，扩增得到的N-乙酰转移酶NAT基因、O-甲基转移酶OMT基因和pTrc99A骨架三个片段都具有前后匹配的同源臂，将所述三个片段连接得到重组质粒pTrc99A-NAT-OMT。

根据本发明的制备方法，优选地，所述第一引物对中各引物的序列分别如SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示；所述第二引物对中各引物的序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4所示；所述第三引物对中各引物的序列分别如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6所示。

转化所述重组质粒至大肠杆菌的步骤包括：(1)制备化学感受态的大肠杆菌；(2)质粒转化；和(3)质粒验证。化学感受态的大肠杆菌可以由氯化钙法获得。质粒转化使用热激转化的方式进行。质粒验证包括：挑选能够在具有氨苄青霉素(Amp)抗性的培养基上生长的阳性菌株，提取质粒验证，将验证通过的菌株置于-80℃保存待用。优选地，所述质粒验证使用的引物对中各引物的序列分别如SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示。

根据本发明的制备方法，优选地，所述转化所述重组质粒至大肠杆菌的步骤包括：

(1)采用氯化钙法制备化学感受态的大肠杆菌；

(2)使用热激转化的方式进行质粒转化；和

(3)质粒验证；

其中，所述质粒验证使用的引物对中各引物的序列分别如SEQID NO：7和SEQ IDNO：8所示。

再一方面，本发明提供一种褪黑素的生产方法，包括使用上述任一的基因工程化大肠杆菌的步骤。

当在N-乙酰转移酶基因和O-甲基转移酶基因在基因工程化大肠杆菌的胞内表达形成具有活性的N-乙酰转移酶和O-甲基转移酶时，酶的活性并未对大肠杆菌内的其他代谢途径产生较大影响，大肠杆菌活性保持正常，并且将血清素转化为褪黑素。具体过程参见图2。作为可转化为褪黑素的物质为血清素，可以以底物的方式加入到转化液中。将上述基因工程化大肠杆菌在培养基中培养，得到种子液；将种子液中的菌体扩大培养，离心获得扩大后的菌体；将扩大后的菌体接入含有诱导剂和底物的转化液中进行全细胞转化，获得所述褪黑素。

根据本发明提供的生产方法，优选地，包括以下步骤：将上述基因工程化大肠杆菌在具有氨苄青霉素抗性的培养基中培养，得到种子液；将种子液中的菌体扩大培养，离心获得扩大后的菌体；将扩大后的菌体接入含有底物血清素的转化液中进行全细胞转化，获得所述褪黑素。

根据本发明提供的生产方法，优选地，基因工程化大肠杆菌以OD₆₀₀＝5～60的浓度接种至培养基上。其中，OD₆₀₀表示含基因工程化大肠杆菌的培养基在600nm波长处的吸光值。根据本发明的一个实施方式，基因工程化大肠杆菌以OD₆₀₀＝30的浓度接种至培养基上。

根据本发明提供的生产方法，优选地，在所述转化液中，血清素的浓度为5～100mM。血清素的浓度优选为10mM。根据本发明的一个实施方式，所述转化液由缓冲液和底物组成。缓冲液为pH 6～7，例如为6.8的Tris-HCl溶液。Tris-HCl溶液的浓度可以为10～100mM，例如50mM。

在某些实施方案中，本发明的生产方法进一步包括褪黑素的检测步骤。使用高效液相色谱法测定褪黑素含量，定量分析使用C18柱和UV检测器。

本发明通过基因工程的方式将N-乙酰转移酶基因和O-甲基转移酶基因转化至常规的大肠杆菌中形成基因工程化大肠杆菌，其具备产生N-乙酰转移酶和O-甲基转移酶的能力。进一步地，本发明利用该基因工程化大肠杆菌，通过全细胞催化的手段将特定底物转化为褪黑素。该方法的反应条件温和。此外，产物易于分离、反应规模可放大。

附图说明

图1为本发明的pTrc99A-NAT-OMT质粒载体的构建示意图。

图2为本发明的血清素转化为褪黑素的过程图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

本发明中，名词术语既包括单数形式，也包括复数形式，除非上下文另行明确指出。例如，“样品”包括一种或多种样品和为本领域技术人员所已知的其等同物等等。本发明中所述的“至少之一”或“至少一种”不仅仅指包含“一个”或“一种”的情况，更重要的还包含“多个”或“多种”的情况。

本发明中所述的具体方法、步骤以及其中所使用的试剂、材料等，除非另作说明，否则均为本领域内通常已知的，并且也容易地通过公开出版物获知或通过购买获得。具体出版物可参见，例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物等。

下面描述实施例使用的原料：

LB培养基：包括胰蛋白胨，酵母提取物和氯化钠。

液体LB培养基：每1L去离子水中含有10g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5g氯化钠。

无抗LB平板培养基：在液体LB培养基的基础上，加入1.5％(w/v)琼脂粉，然后121℃高压灭菌20min；待培养基冷却至50℃左右时，将培养基倒至无菌培养皿，得到无抗LB平板培养基。

具有氨苄霉素抗性的LB平板培养基：向无抗LB平板培养基中加入氨苄青霉素，使氨苄青霉素浓度为100μg/mL，获得具有氨苄青霉素抗性的LB平板培养基。

实施例1

通过在大肠杆菌内构建外源合成褪黑素生物合成途径，以血清素作为底物，可以经全细胞催化将血清素转化为褪黑素，从而实现利用大肠杆菌工程菌来生产褪黑素。具体步骤如下：

1.构建pTrc99A-NAT-OMT重组质粒

使用Gibson Assembly(NEB公司，美国)无缝连接的方法构建pTrc99A-NAT-OMT重组质粒。先根据NCBI提供的Homo sapiens NAT基因序列(SEQ ID NO：10)和Oryza sativaOMT基因序列(SEQ ID NO：11)，用第一引物NAT-F(SEQ ID NO：1)和NAT-R(SEQ ID NO：2)、第二引物OMT-F(SEQ ID NO：3)和OMT-R(SEQ ID NO：4)，分别以人和水稻的基因组为模板PCR扩增得到NAT和OMT基因。然后，以pTrc99A质粒(SEQ ID NO：9)为模板，使用第三引物pTrc99A-F(SEQ ID NO：5)和pTrc99A-R(SEQ ID NO：6)扩增得到pTrc99A载体骨架。在设计引物时向引物中添加了各自同源臂，扩增得到的NAT、OMT和pTrc99A骨架三个片段都具有前后匹配的同源臂。最后，利用Gibson连接技术将三个片段连接构建重组质粒，得到重组质粒pTrc99A-NAT-OMT。

2.化学感受态的大肠杆菌的制备

将大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655(购自ATCC，保藏编号ATCC700926)接种至无抗LB平板培养基上，37℃温度下过夜培养，获得单菌落。挑取长势良好的单菌落接种至3mL液体LB培养基，在37℃和220rpm的条件下培养12h。接着，将种子液按1％的接种量接种至50mL液体LB培养基，在37℃和220rpm的条件下培养大肠杆菌。当OD₆₀₀为0.6时，停止培养，迅速将培养物置于冰中冷却。然后，将菌液转移至预冷的50mL离心管中，以3500rpm离心10min，弃上清液，收集菌体至EP管中。接着，用25mL预冷无菌的0.1M的CaCl₂冲洗菌体两次，以3500rpm离心10min，再次弃上清液，收集菌体。最后，用2mL预冷0.1M的CaCl₂(含10wt％甘油)重悬菌体，按每管100μL分装至预冷的1.5mL离心管，得到化学感受态的大肠杆菌，置于-80℃保存待用。

3.质粒转化

将一管容纳有化学感受态的大肠杆菌的离心管置于冰上，然后加入0.5μL的重组质粒pTrc99A-NAT-OMT，冰浴处理30min，用42℃热水浴处理90s，然后立即冰浴处理2min。随后，将650μL的LB培养基加入容纳有化学感受态的大肠杆菌的离心管内，将离心管置于37℃摇床，150rpm培养1h；摇床培养后，500rpm离心2min，留少许上清液重悬细胞，并涂布至具有氨苄青霉素抗性的LB平板培养基上，37℃过夜培养。挑取转化子菌落进行PCR验证，验证引物pTrc-JD-F(SEQ ID NO：7)和pTrc-JD-R(SEQ ID NO：8)为pTrc99A质粒骨架上的序列。将验证通过的菌株置于甘油管中，得到含有pTrc99A-NAT-OMT质粒的大肠杆菌，置于-80℃保存待用。

4.工程菌菌体培养及全细胞催化

将含有pTrc99A-NAT-OMT质粒的大肠杆菌接种至具有氨苄青霉素抗性的LB平板培养基，37℃过夜培养。挑取长势良好的单菌落，接种至3mL具有氨苄青霉素抗性的试管LB培养基，在37℃和220rpm下培养12h，得到种子液。将种子液按1vol％接种至125mL的LB培养基。在37℃和220rpm的条件下培养至OD₆₀₀为0.6～1，添加0.5wt‰异丙基-丙基培养硫代半乳糖苷IPTG。在28℃和220rpm的条件下培养14h，在4℃和4000rpm的条件下离心，获得培养后的菌体。

5.全细胞催化

将培养后的菌体以OD₆₀₀＝30的菌体浓度加入到转化液中进行全细胞转化。转化液由pH 6.8的50mM Tris-HCl缓冲液和10mM的血清素组成。在30℃和220rpm的条件下反应24h，在反应后的转化液中获得褪黑素。

6.褪黑素产量的检测

首先取一定量的反应后的转化液，用甲醇稀释适当倍数，离心后取上清液，上清液经过0.22μm的滤膜过滤后转移至液相瓶。接着，使用高效液相色谱仪HPLC对液相瓶中的褪黑素进行测定。

检测条件设定如下：

流动相A为高纯水，占50wt％；

流动相B为甲醇，占50wt％；

流速为1mL/min；

进样量10μL；

洗脱方式为等度洗脱；

反向柱为C18，检测器选用紫外检测器，波长设定为220nm。

经过检测，基因工程化的大肠杆菌的褪黑素最高产量为0.45mg/L。未经过转化的大肠杆菌则不能合成褪黑素。

本发明通过简单的基因工程改造方法可以使大肠杆菌合成褪黑素。

序列表

<110> 福建师范大学

<120> 基因工程化大肠杆菌及褪黑素的生产方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

tggaattcag gaggaattaa atgagcaccc agagcaccca 40

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ctaagctttt aattgaattc ttaacagccg ctattacggc 40

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcaattaaaa gcttaggagg atgaagaaca agaagtacga 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aggtcgactc tagaggatcc ttaactcgga tgggtacggc 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gccgtaccca tccgagttaa ggatcctcta gagtcgacct 40

<210> 6

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgggtgctct gggtgctcat ttaattcctc ctgaattcca 40

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

aacaaaagtg tctataatca 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gatttaatct gtattagtgg 20

<210> 9

<211> 3430

<212> DNA

<213> pTrc99A质粒序列

<400> 9

gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc 60

ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc 120

gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc 180

tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga 240

taacaatttc acacaggaaa cagaccatgg aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta 300

gagtcgacct gcaggcatgc aagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc 360

tgatacagat taaatcagaa cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca 420

gtagcgcggt ggtcccacct gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg 480

atggtagtgt ggggtctccc catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga 540

aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc 600

ctgagtagga caaatccgcc gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg 660

tggcgggcag gacgcccgcc ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg 720

acggatggcc tttttgcgtt tctacaaact ctttttgttt atttttctaa atacattcaa 780

atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 840

agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 900

ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 960

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tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 1140

acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 1200

aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 1260

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gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 1380

cgatgcctac agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 1440

tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 1500

tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 1560

ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 1620

tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 1680

gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 1740

ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1800

tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1860

agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1920

aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1980

cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt 2040

agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 2100

tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 2160

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 2220

gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 2280

ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 2340

gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 2400

ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 2460

ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 2520

acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 2580

gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 2640

cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 2700

tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc 2760

gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc 2820

gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg 2880

gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agcagatcaa 2940

ttcgcgcgcg aaggcgaagc ggcatgcatt tacgttgaca ccatcgaatg gtgcaaaacc 3000

tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa 3060

ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc 3120

gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg 3180

gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac tggcgggcaa acagtcgttg 3240

ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg 3300

attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc 3360

ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg cgcaacgcgt cagtgggctg 3420

atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg tggaagctgc ctgcactaat 3480

gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca tcaacagtat tattttctcc 3540

catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc 3600

gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat 3660

aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc 3720

atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg gcatcgttcc cactgcgatg 3780

ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg ccattaccga gtccgggctg 3840

cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat 3900

atcccgccgt caaccaccat caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac 3960

cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca 4020

ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg 4080

gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg 4140

caacgcaatt aatgtgagtt agcgcgaatt gatctg 4176

<210> 10

<211> 624

<212> DNA

<213>人(Homo sapiens) NAT基因序列

<400> 10

atgagcaccc agagcaccca tccgctgaaa ccggaagcac cgcgcctgcc gccgggtatt 60

ccggaaagcc cgagctgtca gcgccgtcat accctgccgg caagcgaatt tcgctgtctg 120

accccggaag atgccgttag cgcctttgaa attgaacgtg aagcattcat tagcgtgctg 180

ggtgtttgtc cgctgtatct ggatgaaatt cgccattttc tgaccctgtg tccggaactg 240

agcctgggtt ggtttgaaga aggttgcctg gtggccttta ttattggcag cctgtgggat 300

aaagaacgtc tgatgcagga aagcctgacc ctgcatcgta gcggcggcca tattgcccat 360

ctgcatgtgc tggccgttca tcgcgccttt cgtcagcagg gtcgcggtcc gattctgctg 420

tggcgttatc tgcatcatct gggcagccag ccggccgttc gccgtgcagc actgatgtgt 480

gaagatgcac tggttccgtt ttatgaacgt tttagctttc atgccgtggg cccgtgtgca 540

attaccgttg gtagtctgac ctttatggaa ctgcattgta gtctgcgtgg tcatccgttt 600

ctgcgccgta atagcggctg ttaa 644

<210> 11

<211> 1200

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)OMT基因序列

<400> 11

atgaagaaca agaagtacga aaagaagaaa acaatggttg aacatctgga tcgcgcccag 60

cagtggcgta gcattaccaa tcatctgctg ggcgaactgg atggcccggg tgtgggcgtt 120

gatgttggtg gcctggaagc aggtgaaagc ggtggtgcag gtgaactgcc ggaactgccg 180

ctggttccgc tgctggccgc cggtgttgtg ggtgaacatg atcatgttga tgttgaacat 240

ccgctgctgc cgcgtcgtcg tgtgggcgca ctgcgtcagc atgcactgca tcatcatcat 300

ctgccggtgc tgcgtcagcg cgttgttgca gttctggaac agccgcgcgc cgtgctggtg 360

gctcctgttg ttgaagatcc gctgcatcag gatggtgtgg cagcagccgg tcatggcggt 420

gaacatgttg ccgccgatgt tctgcatccg ggcgaacgcc gccgtctggg tgacgatgtt 480

ggcgaagtgg ttgtggaccc tccggatgtt cgtgttgcag gtgacgatgg cggtcatagt 540

ggtgcccatg ccgcagccga tgttgatgat ggcggtggcg gtgtggaagc cggcgtggaa 600

gttgaacagc tgctgggcga tgatgatggc gtggtgctgc atgcactggt tgaagatgca 660

gttgaagccg gtgttcgtgc cgttgttctg gaacgccgtc atccggtgcg cctggttgaa 720

cgcgatgccg cagttcagga ttgcgttctg aaagttgtgc cggccctgca tgaagatctg 780

gtgctggttc atgaaggtga aggcggtcat ggtgacgcag ttctggttgg ccgccagccg 840

ctggcccatc gtcgtggtgg tgtggcagcg ggtgaactgg ccgttggtgc actgctgcat 900

ctggccccgg atgatgtggt gggtggtgaa caggccgaac atgccgttca tcatgttggt 960

cgccgtcgcg tgcgtctggg ccgtcaactg gtgggtcatc tgcgccgtcg tcagcagcgc 1020

cgtctgcctc ctagcagtgg tgacggcggt ggcctgcagc gtctggaaca ggcccagctg 1080

gatggtgttc tggaacgtca tcgtcaggat cgtcgtcgcc gtcagctgca gcgcgtgcat 1140

gcccgtctgc tggtgggtcg ccgtggccat gttggcggct gccgtaccca tccgagttaa 1238

Claims

1.一种基因工程化大肠杆菌的制备方法，其包括：

构建重组质粒的步骤；和

转化所述重组质粒至大肠杆菌的步骤；

其中，所述构建重组质粒的步骤包括：使用第一引物从人的基因组中扩增得到N-乙酰转移酶NAT基因，使用第二引物从水稻的基因组中扩增得到O-甲基转移酶OMT基因，使用第三引物以pTrc99A质粒为模板扩增得到pTrc99A载体骨架；在设计引物时向引物中添加各自同源臂，扩增得到的N-乙酰转移酶NAT基因、O-甲基转移酶OMT基因和pTrc99A骨架三个片段都具有前后匹配的同源臂，将所述三个片段连接得到重组质粒pTrc99A-NAT-OMT；

其中，所述第一引物对中各引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；所述第二引物对中各引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；所述第三引物对中各引物的序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；

其中，所述基因工程化大肠杆菌包含N-乙酰转移酶基因和O-甲基转移酶基因，且所述N-乙酰转移酶基因和O-甲基转移酶基因能够在所述基因工程化大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的N-乙酰转移酶和O-甲基转移酶；所述N-乙酰转移酶基因为人源的N-乙酰转移酶基因；所述O-甲基转移酶基因为来自水稻的O-甲基转移酶基因；所述基因工程化大肠杆菌源自大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655；所述N-乙酰转移酶基因的碱基序列如SEQ IDNO:10所示；所述O-甲基转移酶基因的碱基序列如SEQ ID NO:11所示。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述转化所述重组质粒至大肠杆菌的步骤包括：

(1)采用氯化钙法制备化学感受态的大肠杆菌；

(2)使用热激转化的方式进行质粒转化；和

(3)质粒验证；

其中，所述质粒验证使用的引物对中各引物的序列分别如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。