CN114369593B - 二氧化硅结合肽介导醇脱氢酶和胺脱氢酶共固定化级联反应制备手性胺的方法 - Google Patents

二氧化硅结合肽介导醇脱氢酶和胺脱氢酶共固定化级联反应制备手性胺的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及二氧化硅结合肽介导醇脱氢酶和胺脱氢酶共固定化级联反应制备手性胺的方法；采用重叠延伸PCR技术将二氧化硅结合肽的基因分别插入到介导醇脱氢酶和胺脱氢酶的基因序列的N末端并构建基因工程菌株；利用镍离子金属螯合亲和色谱柱及含高浓度的咪唑缓冲液纯化分离重组蛋白；利用二氧化硅纳米粒子作为固定化酶的载体，将重组蛋白共锚定在SNPs表面得到固定化酶CotB1p‑ADH&CotB1p‑AmDH@SNPs；将获得的固定化酶置于含有NAD+和外消旋醇的NH4Cl缓冲液中反应进行手性胺的制备。制得的双酶共固定化催化剂表现出较高的酶负载量和提高的催化活性与稳定性，在工业应用生产手性胺方面具有较大的潜力。

Description

二氧化硅结合肽介导醇脱氢酶和胺脱氢酶共固定化级联反应 制备手性胺的方法
技术领域
本发明涉及二氧化硅结合肽(CotB1p)介导醇脱氢酶(ADH)和胺脱氢酶(AmDH)共固定化级联反应制备手性胺的方法，属于生物催化技术领域。
背景技术
手性胺是指手性中心含有氨基的一类化合物，其在生物活性小分子中占有很大的比例，而且还是许多医药及农药的重要中间体，如用于糖尿病类的药物(西他列汀)，或用于农业生产的农药(草铵膦)。目前手性胺的合成方法主要包括化学催化合成法、生物催化合成法和化学-生物组合催化合成法。其中化学催化潜手性C＝N键的不对称还原反应已广泛用于工业生产。但是化学催化合成法不但使用了对环境有害的催化物质，而且产生了许多污染物质，严重违背了绿色工业的生产理念。生物催化合成法具有反应条件温和、选择性高、绿色无污染等优点，已引起广泛关注。一些常见的用于生物催化合成手性胺的酶包括：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)依赖型氧化还原酶、水解酶、黄素依赖性单胺氧化酶以及ω-转氨酶。然而，由于这些酶较差的催化反应效率，严重阻碍了他们的实际应用。与上述酶催化体系相比，来源于Aromatoleumaromaticum的ADH与新型嵌合AmDH构建的级联催化体系在制备手性胺方面具有较高的催化反应效率与底物杂交性，可将脂肪族、芳香族、大体积的外消旋醇转化为相应的手性胺。除此之外，ADH-AmDH级联催化体系中所需的昂贵的辅酶(β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD(H))能够自动再生，综上说明ADH-AmDH级联催化体系在实际生产手性胺方面具有较大的潜力。
然而，游离态的ADH与AmDH在操作过程中很难维持长期稳定性，而且催化反应结束后难以回收生产成本较高的ADH与AmDH，这些均阻碍了ADH-AmDH级联催化体系在工业领域的高效经济应用。酶固定化技术可提高酶在生物催化过程中的稳定性和重复利用性。目前为止，关于构建固定化ADH-AmDH级联催化体系的报道很少，而且已报道的固定化ADH-AmDH级联催化体系表现出制备过程复杂、成本高、重复利用性差等缺点。
固相结合肽通常由7-12个氨基酸组成，能够促进无机固体材料与生物分子的无缝结合，以实现生物分子的固定化。将固相结合肽的基因插入到目的蛋白的C端、N端或其他位点，使目的蛋白能够以较高的位点特异性和定位精度锚定在相应的固体(如二氧化硅、碳材料和金属)载体表面。此外，基于界面上的物理化学效应(包括范德华力、氢键和库仑力)以及表面扩散和结构变化，固相结合肽对给定的固体材料具有良好的结合亲和性。因此，固相结合肽在固定化酶方面已经被广泛地开发与利用。来自Bacillus cereus的孢壁蛋白(CotB1)的C末端的长度为13个氨基酸的短肽(CotB1p)对二氧化硅表现出较强的结合作用，而且二氧化硅作为载体具有孔径可调、比表面积高、化学和物理性能稳定、生物相容性好等优点，因此CotB1p在酶固定化方面具有很高的潜力与吸引力。因此，为实现ADH-AmDH级联催化体系在工业生产中经济可行地应用，并具有较长的操作稳定性与良好的重复使用性，利用CotB1p对ADH和AmDH在纳米级硅基载体表面进行固定化。然而，现有基于CotB1p的固定化酶研究报道局限于单酶和微米级的硅基载体，几乎没有研究利用CotB1p标签在纳米级硅基载体表面实现双酶的固定化。单酶催化满足不了工业应用中对各种化学品的生产需求。而且微米级的固定化载体具有较小的比表面积，不利于固定化酶与底物分子的接触。
综上所述，为了进一步发挥CotB1p在固定化酶方面的优势以及ADH-AmDH级联催化体系在工业生产手性胺的潜力，开发借助CotB1p在纳米级载体表面共固定双酶(ADH-AmDH)的催化体系至关重要。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，进而提供一种有效提高ADH-AmDH级联催化体系在手性胺生产方面的催化效率与稳定性的共固定化制备方法。
本发明提出利用CotB1p标签介导ADH和AmDH在二氧化硅纳米粒子表面共固定化的制备方法，并利用获得的共固定化双酶催化体系生产手性胺。该方法制得的双酶共固定化催化剂表现出较高的酶负载量和提高的催化活性与稳定性，整个制备过程快捷、方便、成本低和生物相容性好，在工业应用生产手性胺方面具有较大的潜力。
本发明的技术方案概述如下：
二氧化硅结合肽介导醇脱氢酶和胺脱氢酶共固定化级联反应制备手性胺的方法，包括如下步骤：
1)采用重叠延伸PCR技术将二氧化硅结合肽(CotB1p)的基因分别插入到醇脱氢酶(ADH)和胺脱氢酶(AmDH)的基因序列的N末端得到重组基因cotb1p-adh和cotb1p-amdh，然后将重组基因亚克隆到质粒pColdⅡ上，构建基因工程菌株；
2)上述工程菌株经诱导表达后，利用镍离子金属螯合亲和色谱柱及含高浓度的咪唑缓冲液纯化分离重组蛋白CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH；
3)利用二氧化硅纳米粒子(SNPs)作为固定化酶的载体，将重组蛋白共锚定在SNPs表面得到固定化酶CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs；
4)将获得的固定化酶置于含有NAD+和外消旋醇的NH4Cl缓冲液中反应进行手性胺的制备。
所述的步骤1)中，二氧化硅结合肽(CotB1p)基因序列为SEQ ID NO.1；醇脱氢酶(ADH)的基因序列为SEQ ID NO.2；胺脱氢酶(AmDH)的基因序列为SEQ ID NO.3。
所述的步骤1)中，重组基因cotb1p-adh序列分别为SEQ ID NO.4；cotb1p-amdh序列分别为SEQ ID NO.5。
所述的步骤1)中，质粒pColdⅡ基因序列为SEQ ID NO.6。
所述的步骤2)中，高浓度的咪唑缓冲液作为洗脱液将重组蛋白从镍离子金属螯合亲和色谱柱洗脱下来，咪唑浓度范围为400–500mM。
所述的步骤3)中，固定化酶体系包含5–15mg/mL SNPs、0.0067–0.02mg/mLCotB1p-ADH与0.16-0.2mg/mL CotB1p-AmDH，然后将固定化酶体系置于4℃空气浴摇床中120-200rpm孵育10-30min，然后以6500-8500g的离心速率收集固定化酶CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs。
所述的步骤3)中，SNPs粒径为20–30nm。
所述的步骤4)中，NAD+的浓度范围0.5–1mM，外消旋醇的浓度范围为10-30mM。
所述的步骤4)中，外消旋醇为(S)-2-己醇。
具体说明如下：
1)采用重叠延伸聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术将二氧化硅结合肽(CotB1p)的基因分别插入到醇脱氢酶(ADH)和胺脱氢酶(AmDH)基因序列的N末端得到两蛋白的重组基因，分别为cotb1p-adh和cotb1p-amdh，然后将重组基因亚克隆到质粒载体(pColdⅡ)的NdeⅠ与XhoⅠ的限制性酶切位点之间，并化转到感受态细胞(shuffleT7-B)中得到两蛋白的基因工程菌株；
2)诱导表达上述获得的两个基因工程菌株，超声破碎并离心收集细胞溶解物，利用镍离子金属螯合亲和色谱柱纯化重组蛋白，最后经高浓度咪唑缓冲液洗脱得到CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH；
3)酸化处理粒径为20–30nm的SNPs，清洗后通过离心收集得到固定化酶的载体，将一定量的SNPs、CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH置于Tris-HCl缓冲液中，孵育一段时间后，离心收集双酶共固定化体系(CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs)；
4)将获得的固定化酶置于含有NAD+和外消旋醇的NH4Cl缓冲液中，然后将反应体系置于30℃空气浴摇床中190rpm反应48h。
上述步骤1)中，二氧化硅结合肽(CotB1p)基因序列为SEQ ID NO.1，醇脱氢酶(ADH)的基因序列为SEQ ID NO.2，胺脱氢酶(AmDH)的基因序列为SEQ ID NO.3。
上述步骤1)中，重组基因cotb1p-adh和cotb1p-amdh序列分别为SEQ ID NO.4、SEQID NO.5。
上述步骤1)，质粒pColdⅡ的基因序列为SEQ ID NO.6。
上述步骤2)中，纯化重组蛋白时洗脱液中的咪唑浓度为400-500mM。
上述步骤3)中，对平均粒径为20-30nm的二氧化纳米粒子(SNPs)采用0.1M盐酸溶液处理36-60h，之后离心分离(8000-9000g)，并用大量去离子水反复清洗，得到固定化载体。
上述步骤3)中，固定化酶体系包含5–15mg/mL SNPs、0.0067–0.02mg/mL CotB1p-ADH与0.16-0.2mg/mL CotB1p-AmDH，然后将固定化酶体系置于4℃空气浴摇床中120-200rpm孵育10-30min，然后以6500-8500g的离心速率收集固定化酶(CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs)。
上述步骤4)中，CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs催化生产手性胺时，NAD+的浓度范围0.5-1mM，外消旋醇的浓度范围为10-30mM。
上述步骤4)中，CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs催化的底物包括但不限于(S)-2-己醇。
本发明设计的CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs在作用(S)-2-己醇生产(R)-2-氨基己烷时，其催化产率显著高于游离双酶级联催化体系。而且，CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs中双酶的转换数高于以往报道的ADH-AmDH共固定催化体系，说明在同等酶量下，本发明中的酶能够发挥更大的催化性能。除此之外，CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs还表现出增强的稳定性与优异的重复使用性。综上说明，本发明构建的CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs催化体系在实际应用中展现出巨大的潜力。
附图说明
图1为基因工程菌株的质粒谱图
图2为CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs的结构示意图
图3为共固定双酶与单独固定、游离双酶催化生成手性胺的结果比较。
图4为固定化酶与游离酶在30℃的热稳定性。
图5为共固定化酶的重复使用情况。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面将结合具体的实例对本发明提供的方法予以进一步的说明。
本发明采用重叠延伸PCR技术将CotB1p的基因插入到ADH和AmDH的N末端并构建基因工程菌株(如图1所示)，经诱导表达及纯化分离获得重组蛋白(CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH)，利用粒径为20–30nm的SNPs作为固定化酶的载体，借助CotB1p标签与SNPs之间较强的结合作用，将CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH共锚定在SNPs表面(CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs)。利用获得的CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs进行级联催化生产手性胺(如图2所示)。
本发明在CotB1p介导ADH和AmDH固定化级联反应制备手性胺的方法，其步骤如下：
1)酸化处理SNPs，之后用大量去离子水反复清洗并离心分离，得到固定化载体；
2)通过重叠延伸PCR技术将CotB1p(SEQ ID NO.1)的基因通过(G4S)2连接肽分别与ADH和AmDH的基因的N末端进行融合，得到的重组基因序列分别为cotb1p-adh和cotb1p-amdh，然后将重组基因亚克隆到质粒pColdⅡ中，其经测序验证后，转化大肠杆菌感受态细胞(shuffle T7-B)，获得基因工程菌株；
3)基因工程菌株通过两个阶段的培养，首先在37℃下生长至OD600nm＝1.0，然后在16℃下加入0.1M IPTG诱导CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH表达24h，诱导结束后离心收集表达菌株(4000g，30min)，将其于-20℃条件下保存以备待用；
4)将上述所获菌株重悬于裂解缓冲液(CotB1p-ADH:50mM Tris-HCl、50mM咪唑、pH8.0；CotB1p-AmDH:50mM KH2PO4、50mM咪唑、pH 8.0)中，超声破碎菌株并离心收集细胞溶解物，利用镍离子金属螯合亲和色谱柱对CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH分别进行纯化，用含高咪唑浓度的洗脱液(50mM Tris-HCl,pH 8.0)洗脱得到CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH，洗脱后的蛋白通过截留量为10KDa的超滤管置换到50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，最后利用BCA蛋白定量试剂盒检测所得CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH的浓度；
5)将一定浓度的CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH置于含有SNPs的Tris-HCl缓冲液(25mM，pH 8.0)中，孵育结束后，经洗涤、冷冻离心得到共固定化酶(CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs)；
6)将上述获得的CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs置于含有NAD+和外消旋醇的NH4Cl缓冲液中(2M,pH 8.7)，30℃、190rpm反应48h后加入KOH(10M)终止反应，然后利用乙酸乙酯萃取反应体系中的各物质，最后通过气相色谱-氢火焰离子检测器(GC-FID)检测萃取液中的手性胺的浓度情况。气相色谱检测条件为，以氮气为载气，流速是2mL/min，进样器与检测测温度均为250℃，柱温按以下程序升温：40℃保持8min、以20℃/min升至100℃保持1min、以20℃/min升至280℃保持2min。
7)向步骤6中所获萃取液中加入乙酸酐(400μL)和吡啶(20mg)，在25℃下孵育1h，然后加入水(500μL)除去过量的乙酸酐。然后利用手性色谱柱及GC-FID检测手性胺及其对映体的含量，并用对映体过量(ee)表示手性胺的纯度情况。气相色谱检测条件为，以氮气为载气，流速是2mL/min，进样器与检测测温度均为200℃，柱温按以下程序升温：60℃保持8min、以5℃/min升至100℃保持2min、以10℃/min升至180℃保持2min。
本发明所述1)酸化处理SNPs，其特征步骤是：
1)用0.1M盐酸溶液处理SNPs 36-60h，离心速率是8000-9000g；
2)SNPs的平均粒径为20-30nm。
本发明所述2)构建基因工程菌株，其特征步骤是：
1)二氧化硅结合肽(CotB1p)基因序列为SEQ ID NO.1，醇脱氢酶(ADH)的基因序列为SEQ ID NO.2，胺脱氢酶(AmDH)的基因序列为SEQ ID NO.3；
2)重组基因cotb1p-adh和cotb1p-amdh序列分别为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5；
3)重组基因亚克隆到质粒pColdⅡ(SEQ ID NO.6)的NdeⅠ与XhoⅠ的限制性酶切位点之间，重组质粒转化到大肠杆菌shuffle T7-B感受态细胞中。
本发明所述4)纯化重组蛋白，其特征步骤是：
1)洗脱液中的咪唑浓度为400-500mM。
本发明所述5)CotB1p标签介导的重组蛋白在SNPs表面的固定化，其特征步骤如下：
1)共固定双酶体系述置于4℃空气浴摇床中120-200rpm反应10-30min；离心速率是6500-8500g。
2)共固定双酶体系中，SNPs的浓度为5–15mg/mL，CotB1p-ADH浓度为0.0067–0.02mg/mL，CotB1p-AmDH浓度为0.16-0.2mg/mL。
本发明所述6)双酶共固定级联催化体系制备手性胺，其特征步骤是：
1)催化体系中含有0.5-1mM NAD+和10-30mM外消旋醇；
2)CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs催化的底物包括但不限于(S)-2-己醇。
实施例1：
1)通过重叠延伸PCR技术将CotB1p的基因(SEQ ID NO.1)通过(G4S)2连接肽分别与ADH(SEQ ID NO.2)、AmDH(SEQ ID NO.3)基因的N末端进行融合，分别得到基因序列为SEQID NO.4、SEQ ID NO.5的CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH，然后将融合后的基因亚克隆到质粒pColdⅡ(SEQ ID NO.6)的NdeⅠ与XhoⅠ的限制性酶切位点之间，形成重组质粒(pColdⅡ-CotB1p-ADH、pColdⅡ-CotB1p-AmDH)，其经测序验证后，转化大肠杆菌shuffle T7-B感受态细胞，获得基因工程菌株；
2)基因工程菌株通过两个阶段的培养，首先在37℃下生长至OD600nm＝1.0，然后在16℃下加入0.1M IPTG诱导重组蛋白表达24h，诱导结束后离心收集表达菌株(4000g,30min)，将其于-20℃条件下保存以备待用；
3)将上述所获菌株重悬于裂解缓冲液(CotB1p-ADH:50mM Tris-HCl、50mM咪唑、pH8.0；CotB1p-AmDH:50mM KH2PO4、50mM咪唑、pH 8.0)中，超声破碎菌株并离心收集细胞溶解物，利用镍离子金属螯合亲和色谱柱对重组蛋白进行纯化，用洗脱液(50mM Tris-HCl，500mM咪唑，pH 8.0)洗脱得到重组蛋白，洗脱后的蛋白通过截留量为10KDa的超滤管置换到50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，最后利用BCA蛋白定量试剂盒检测所得重组蛋白的浓度，CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH的表达量分别为1340mg/L、6670mg/L。若将两重组基因亚克隆到pET28a载体上，两重组蛋白的表达量低，相同条件下仅收获约61mg/L的CotB1p-ADH和222mg/L的CotB1p-AmDH。说明将重组基因亚克隆到pColdⅡ质粒中能够促进重组蛋白的表达。
4)利用0.1M盐酸溶液处理平均粒径为20nm的SNPs，48h后8500g离心去上清，并用大量去离子水反复清洗，得到固定化载体；
5)将CotB1p-ADH、CotB1p-AmDH分别稀释至0.0067mg/mL、0.16mg/mL，然后将它们置于含有5mg/mL SNPs的Tris-HCl缓冲液(25mM，pH 8.0)中，4℃、120rpm孵育10min，孵育结束后经洗涤、6500g冷冻离心,得到CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs。采用BCA蛋白测定法和两种酶活性检测法测定上清液中蛋白质含量，从而测定固定化酶的负载量。其中，两酶的活性通过检测胺化反应体系中NADH的生成(CotB1p-ADH)或消耗(CotB1p-AmDH)情况而得到。经计算得出CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH的酶载量分别为1.3、31.2mg/g SNPs。
6)取上述所制双酶共固定化催化剂10μL于含有30μL(S)-2-己醇(1M)、5μL NAD+(100mM)的965μL NH4Cl(2M,pH 8.7)中，30℃、190rpm反应48h，加入400μL KOH(10M)终止反应，然后利用乙酸乙酯(500μL×2)萃取反应体系中的各物质，最后通过GC-FID检测萃取液中的(R)-2-氨基己烷的浓度情况。气相色谱检测条件为，以氮气为载气，流速是2mL/min，进样器与检测测温度均为250℃，柱温按照以下程序升温：40℃保持8min、以20℃/min升至100℃保持1min、以20℃/min升至280℃保持2min。CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs的(R)-2-氨基己烷的产率为84％。为说明双酶于SNPs表面共固定化的优势，按相同酶浓度制备了单独固定化与游离酶体系。此外，单独固定化双酶催化体系是指将两酶分别置于5mg/mL SNPs的Tris-HCl缓冲液(25mM，pH 8.0)中而制得。将该两催化体系按照同等条件进行手性胺的制备，结果显示单独固定化与游离酶催化体系的(R)-2-氨基己烷产率分别为69％、66％，再次说明说明借助CotB1p标签的共固定化有利于ADH-AmDH级联体系催化效率的提升，而且双酶的共固定化还能够促进底物通道效应，进一步促进双酶催化级联反应的整体催化效率。
7)将上述CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs的反应体系进行衍生化处理，即向上述反应后的乙酸乙酯萃取液中加入400μL乙酸酐和20mg吡啶，25℃孵育1h后，加入500μL水除去过量的乙酸酐。之后通过GC-FID检测(R)-2-氨基己烷及其对映体的生成情况。气相色谱检测条件为，以氮气为载气，流速是2mL/min，进样器与检测测温度均为200℃，柱温按照以下程序升温：60℃保持8min、以5℃/min升至100℃保持2min、以10℃/min升至180℃保持2min。结果显示(R)-2-氨基己烷的ee值在99％以上，表明CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs在催化生成手性胺时，展现出良好的对映选择性。
实施例2：
1)通过重叠延伸PCR技术将CotB1p的基因(SEQ ID NO.1)通过(G4S)2连接肽分别与ADH(SEQ ID NO.2)、AmDH(SEQ ID NO.3)基因的N末端进行融合，分别得到基因序列为SEQID NO.4、SEQ ID NO.5的CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH，然后将融合后的基因亚克隆到质粒pColdⅡ(SEQ ID NO.6)的NdeⅠ与XhoⅠ的限制性酶切位点之间，形成重组质粒(pColdⅡ-CotB1p-ADH、pColdⅡ-CotB1p-AmDH)，其经测序验证后，转化大肠杆菌shuffle T7-B感受态细胞，获得基因工程菌株；
2)基因工程菌株通过两个阶段的培养，首先在37℃下生长至OD600nm＝1.0，然后在16℃下加入0.1M IPTG诱导CotB1p-ADH表达24h，诱导结束后离心收集表达菌株(4000g,30min)，将其于-20℃条件下保存以备待用；
3)将上述所获菌株重悬于裂解缓冲液(CotB1p-ADH:50mM Tris-HCl、50mM咪唑、pH8.0；CotB1p-AmDH:50mM KH2PO4、50mM咪唑、pH 8.0)中，超声破碎菌株并离心收集细胞溶解物，利用镍离子金属螯合亲和色谱柱对重组蛋白进行纯化，用洗脱液(50mM Tris-HCl，450mM咪唑，pH 8.0)洗脱得到重组蛋白，洗脱后的蛋白通过截留量为10KDa的超滤管置换到50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，最后利用BCA蛋白定量试剂盒检测所得重组蛋白的浓度，CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH的表达量分别为1305mg/L、6659mg/L。若将重组基因亚克隆到pET28a载体上，两重组蛋白的表达量低，相同条件下仅收获约56mg/L的CotB1p-ADH和198mg/L的CotB1p-AmDH。再次说明将重组基因亚克隆到pColdⅡ质粒中能够促进重组蛋白的表达。
4)利用0.1M盐酸溶液处理平均粒径为25nm的SNPs，36h后8000g离心去上清，并用大量去离子水反复清洗，得到固定化载体；
5)将CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH分别稀释至0.008mg/mL、0.2mg/mL，然后将它们置于含有10mg/mL SNPs的Tris-HCl缓冲液(25mM，pH 8.0)中，4℃、160rpm孵育20min，孵育结束后经洗涤、7500g冷冻离心,得到CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs。采用BCA蛋白测定法和两种酶活性检测法测定上清液中蛋白质含量，测定固定化酶的负载量。其中，两酶的活性通过检测胺化反应体系中NADH的生成(CotB1p-ADH)或消耗(CotB1p-AmDH)情况而得到。经计算得出CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH的酶载量分别为0.5、13.3mg/g SNPs。
6)取上述所制双酶共固定化催化剂10μL于含有10μL(S)-2-己醇(1M)、5μL NAD+(100mM)的975μL NH4Cl(2M,pH 8.7)中，30℃、190rpm反应48h，加入400μL KOH(10M)终止反应，然后利用乙酸乙酯(500μL×2)萃取反应体系中的各物质，最后通过GC-FID检测萃取液中的(R)-2-氨基己烷的浓度情况。气相色谱检测条件为，以氮气为载气，流速是2mL/min，进样器与检测测温度均为250℃，柱温按照以下程序升温：40℃保持8min、以20℃/min升至100℃保持1min、以20℃/min升至280℃保持2min。如图3所示，CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs的(R)-2-氨基己烷的产率为90％。为说明双酶于SNPs表面共固定化的优势，按相同酶浓度制备了单独固定化与游离酶体系。此外，单独固定化双酶催化体系是指将两酶分别置于10mg/mL SNPs的Tris-HCl缓冲液(25mM，pH 8.0)中而制得。将该两催化体系按照同等条件进行手性胺的制备，结果显示单独固定化与游离酶催化体系的(R)-2-氨基己烷产率分别为60％、48％(如图3所示)，说明说明借助CotB1p标签的共固定化有利于ADH-AmDH级联体系催化效率的提升，而且双酶的共固定化还能够促进底物通道效应，进一步促进双酶催化级联反应的整体催化效率。
7)将上述CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs的反应体系进行衍生化处理，即向上述反应后的乙酸乙酯萃取液中加入400μL乙酸酐和20mg吡啶，25℃孵育1h后，加入500μL水除去过量的乙酸酐。之后通过GC-FID检测(R)-2-氨基己烷及其对映体的生成情况。气相色谱检测条件为，以氮气为载气，流速是2mL/min，进样器与检测测温度均为200℃，柱温按照以下程序升温：60℃保持8min、以5℃/min升至100℃保持2min、以10℃/min升至180℃保持2min。结果显示(R)-2-氨基己烷的ee值在99％以上，再次表明CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs在催化生成手性胺时，展现出良好的对映选择性。
实施例3：
1)通过重叠延伸PCR技术将CotB1p的基因(SEQ ID NO.1)通过(G4S)2连接肽分别与ADH(SEQ ID NO.2)、AmDH(SEQ ID NO.3)基因的N末端进行融合，分别得到基因序列为SEQID NO.4、SEQ ID NO.5的CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH，然后将融合后的基因亚克隆到质粒pColdⅡ(SEQ ID NO.6)的NdeⅠ与XhoⅠ的限制性酶切位点之间，形成重组质粒(pColdⅡ-CotB1p-ADH、pColdⅡ-CotB1p-AmDH)，其经测序验证后，转化大肠杆菌shuffle T7-B感受态细胞，获得基因工程菌株；
2)基因工程菌株通过两个阶段的培养，首先在37℃下生长至OD600nm＝1.0，然后在16℃下加入0.1M IPTG诱导重组蛋白表达24h，诱导结束后离心收集表达菌株(4000g,30min)，将其于-20℃条件下保存以备待用；
3)将上述所获菌株重悬于裂解缓冲液(CotB1p-ADH:50mM Tris-HCl、50mM咪唑、pH8.0；CotB1p-AmDH:50mM KH2PO4、50mM咪唑、pH 8.0)中，超声破碎菌株并离心收集细胞溶解物，利用镍离子金属螯合亲和色谱柱对重组蛋白进行纯化，用洗脱液(50mM Tris-HCl，400mM咪唑，pH 8.0)洗脱得到重组蛋白，洗脱后的蛋白通过截留量为10KDa的超滤管置换到50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，最后利用BCA蛋白定量试剂盒检测所得重组蛋白的浓度，CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH的表达量分别为1296mg/L、6632mg/L。若将重组基因亚克隆到pET28a载体上，相同条件下仅收获约51mg/L的CotB1p-ADH和189mg/L的CotB1p-AmDH。再次说明pColdⅡ质粒载体有利于重组蛋白的表达。
4)利用0.1M盐酸溶液处理平均粒径为30nm的SNPs，60h后9000g离心去上清，并用大量去离子水反复清洗，得到固定化载体；
5)将0.02mg/mL CotB1p-ADH、0.18mg/mL CotB1p-AmDH置于含有15mg/mL SNPs的Tris-HCl缓冲液(25mM，pH 8.0)中，然后将固定化体系于4℃空气摇床中200rpm孵育30min，孵育结束后经洗涤、8500g冷冻离心,得到CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs。采用BCA蛋白测定法和两种酶活性检测法测定上清液中蛋白质含量，测定固定化酶的负载量。其中，两酶的活性通过检测胺化反应体系中NADH的生成(CotB1p-ADH)或消耗(CotB1p-AmDH)情况而得到。经计算得出CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH的酶载量分别为1.18、10.9mg/g SNPs。
6)取上述所制双酶共固定化催化剂10μL于含有20μL(S)-2-己醇(1M)、5μL NAD+(100mM)的965μL NH4Cl(2M,pH 8.7)中，30℃、190rpm反应48h，加入400μL KOH(10M)终止反应，然后利用乙酸乙酯(500μL×2)萃取反应体系中的各物质，最后通过GC-FID检测萃取液中的(R)-2-氨基己烷的浓度情况。气相色谱检测条件为，以氮气为载气，流速是2mL/min，进样器与检测测温度均为250℃，柱温按照以下程序升温：40℃保持8min、以20℃/min升至100℃保持1min、以20℃/min升至280℃保持2min。CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs的(R)-2-氨基己烷的产率为88％。为说明双酶于SNPs表面共固定化的优势，按相同酶浓度制备了单独固定化与游离酶体系。此外，单独固定化双酶催化体系是指将两酶分别置于15mg/mL SNPs的Tris-HCl缓冲液(25mM，pH 8.0)中而制得。将该两催化体系按照同等条件进行手性胺的制备，结果显示单独固定化与游离酶催化体系的(R)-2-氨基己烷产率分别为61％、50％，再次说明说明借助CotB1p标签的共固定化有利于ADH-AmDH级联体系催化效率的提升，而且双酶的共固定化还能够促进底物通道效应，进一步促进双酶催化级联反应的整体催化效率。
7)将上述CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs的反应体系进行衍生化处理，即向上述反应后的乙酸乙酯萃取液中加入400μL乙酸酐和20mg吡啶，25℃孵育1h后，加入500μL水除去过量的乙酸酐。之后通过GC-FID检测(R)-2-氨基己烷及其对映体的生成情况。气相色谱检测条件为，以氮气为载气，流速是2mL/min，进样器与检测测温度均为200℃，柱温按照以下程序升温：60℃保持8min、以5℃/min升至100℃保持2min、以10℃/min升至180℃保持2min。结果显示(R)-2-氨基己烷的ee值在99％以上，再次表明CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs在催化生成手性胺时，展现出良好的对映选择性。
实施例4：
以实施例2中制备得到的CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs为例，将其与以往文献的数据进行比较。如表1所示，CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs生产手性胺的产率几乎均高于之前报道的ADH-AmDH共固定化催化体系。除此之外，本发明CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs中双酶的用量显著低于以往文献报道的，因此导致CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs中双酶转换数(Turnover numbers,TONs)最高是以往文献报道的30倍，这些结果再次说明本发明制备的CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs具有较高的催化活性，在实际生产手性胺方面具有很大的潜力。
表1.本发明与文献数据对手性胺生产的比较
a数据未获得。
实施例5：
将实施例2中制备得到的固定化酶体系与游离酶体系分别置于50mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，于30℃下温浴60h，在不同的时间间隔内取等量的酶液并测定CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH活性，以确定游离酶和固定化酶体系的热稳定性。结果如图4a所示，游离CotB1p-ADH的催化活性在数小时内急剧下降至～15％，而固定化CotB1p-ADH的稳定性却显著提高，在60h时仍保持～33％的初始活性。与游离CotB1p-AmDH相比，固定化CotB1p-AmDH的半衰期明显增加，60h后固定化CotB1p-AmDH仍保持～30％的初始活性，而游离CotB1p-AmDH仅剩不到10％的初始活性(如图4b所示)。说明CotB1p标签介导酶在SNPs表面的固定化有利于提高酶的稳定性。
实施例1与3所制备的固定化体系同样较游离酶体系相比同样具有较高的稳定性，再次表明CotB1p标签介导酶在SNPs表面的固定化有利于提高酶的稳定性
实施例6：
探究实施例2中制备得到的CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs的重复使用性情况。在每次反应结束后，将回收的CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs置于含有10μL(S)-2-己醇(1M)，10μL NAD+(100mM)的970μL NH4Cl(2M,pH 8.7)中，30℃、190rpm反应1h。每次反应结束后，通过6500g离心回收CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs，并按照上述方法测定体系中手性胺的生成情况。结果如图5所示，在重复使用8次之后，CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs仍保留85％的初始活性，说明CotB1p标签介导的双酶共固定化为手性胺的可持续生产创造了一个稳定高效的级联生物催化体系。实施例1与3所制备的固定化体系同样具有较高的重复使用性，说明本发明所创建的双酶共固定体系在工业应用上具有一定的应用潜力。
本发明涉及一种二氧化硅结合肽(CotB1p)介导醇脱氢酶(ADH)和胺脱氢酶(AmDH)定向固定化级联反应制备手性胺的方法；包括CotB1p标签介导ADH和AmDH在SNPs表面的定向固定化的制备方法：将CotB1p标签插入到ADH和AmDH的N末端，从工程菌株的构建到重组蛋白(CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH)的表达与纯化；酸化处理粒径为20–30nm的SNPs作为固定化酶的载体；以预处理的SNPs为载体，通过CotB1p标签与SNPs之间的结合作用，将CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH定向共固定在SNPs表面，制得CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs；利用上述所得的双酶共固定体系将(S)-2-己醇转化为(R)-2-氨基己烷。与游离酶体系相比，CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs表现出增强的催化产率，这是由于CotB1p标签介导酶的定向固定化与底物通道效应所致。而且CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs具有增强的稳定性及重复使用性，促进了手性胺的持续高效生产。CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs的制备过程简单方便、成本低廉，在手性胺生产的实际应用领域具有一定的潜力与竞争性。
综上所述，本发明所述CotB1p标签介导ADH与AmDH在SNPs表面的共固定化不仅有助于促进整体催化活性的提升，而且还有助于改善酶催化剂的稳定性与重复使用性，在生产手性胺的实际应用中具有一定的优势。除此之外，ADH和AmDH的共固定催化体系的整个制备过程方便快捷、绿色环保，进一步促进了该双酶级联催化体系在工业领域的高效应用。
本发明提出的CotB1p标签介导ADH与AmDH在SNPs表面的共固定化级联反应制备手性胺的方法，已通过现场较佳实施例进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
序列表
<110> 天津大学
<120> 二氧化硅结合肽介导醇脱氢酶和胺脱氢酶共固定化级联反应制备手性胺的方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 42
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
tctggccgcg cacgggccca gagacagagt agccggggcc gc 42
<210> 2
<211> 981
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 2
acccaacgtc tgaaagacaa actggccgtg atcaccggcg gtgccaatgg tatcggtcgt 60
gcgattgcgg aacgtttcgc ggttgaaggt gccgacatcg cgatcgcgga tctggttcca 120
gccccagaag cggaagccgc cattcgcaat ctgggtcgcc gtgttctgac cgtgaaatgt 180
gacgtgagcc agccgggcga cgttgaggcg ttcggtaagc aagttatcag caccttcggc 240
cgctgcgata tcctcgtgaa taacgccggc atctacccgc tgattccgtt cgatgaactg 300
acgttcgagc agtggaaaaa gacgttcgag atcaacgttg acagcggctt cctcatggcg 360
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acgacctact ggctcaagat cgaggcctat acccactata tcagcaccaa agcggccaac 480
atcggtttta cccgtgccct cgcgagtgat ctgggcaaag acggtatcac cgttaacgcc 540
attgcgccaa gtctcgttcg caccgcgacg accgaagcga gtgccctcag tgcgatgttc 600
gacgtgctgc cgaatatgct gcaagccatc ccacgtctgc aagttccact ggatctcacc 660
ggtgcggcgg cctttctggc cagtgacgat gcgagcttca tcaccggcca aacgctggcc 720
gttgatggcg gtatggttcg tcatggtggt ggtggcagcg gcggtggtgg tagtagtacc 780
aagctctacg gcgatgtgaa cgacgatggc aaggtgaata gcaccgatgc ggtggcgctg 840
aaacgctatg tgctgcgcag cggcatcagc atcaataccg acaacgccga tctgaacgag 900
gatggccgcg tgaacagcac cgatctgggc atcctcaagc gctacatcct caaggaaatc 960
gacacgctgc catacaagaa t 981
<210> 3
<211> 1128
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
agtctggttg aaaaaacgag cattattaag gacttcacgc tgttcgagaa aatgagcgag 60
catgagcaag ttgtgttctg taacgatcca gcgaccggtc tgcgtgcgat catcgcgatc 120
catgatacga cgctgggtcc agcgctgggt ggctgccgta tgcagccgta caacagtgtg 180
gaggaagcgc tggaagatgc cctccgtctg agcaagggca tgacctacag ctgtgcggcc 240
agcgacgttg atttcggcgg cggtaaagcc gtgattattg gcgatccgca gaaggacaag 300
agcccagaac tgttccgcgc cttcggtcag tttgttgaca gtctgggcgg tcgtttttac 360
accggtaccg atatgggcac gaacatggag gacttcatcc acgcgatgaa ggagaccaac 420
tgtatcgtgg gtgtgccaga agcctacggc agcagtggta atccgagtcc ggcgaccgcg 480
tacggtgttt accgcggtat gaaagccgcc gccaaagaag cgttcggtag cgatagtctg 540
gagggtaaag tggttgccgt gcaaggcgtg ggcaatgttg cctatcacct ctgccgtcac 600
ctccatgaag aaggcgcgaa actgatcgtg acggacatca ataaagaggc cgtggcccgc 660
gcggtggaag aatttggtgc caaagccgtg gacccgaatg acatctacgg cgttgagtgc 720
gacatcttcg ccccatgcgc gctgggtggc atcatcaacg accagacgat cccgcagctc 780
aaggcgaaag tgattgcggg cagtgcgctg aatcaactga aagaaccgcg tcatggcgac 840
atgatccacg aaatgggcat cgtgtacgcc ccggactacg ttatcaacgc gggtggctgc 900
atcaacgttg cggatgagct ctacggctac aaccgcgagc gtgcgatgaa aaagatcgag 960
cagatttatg acaacatcga gaaagtgttc gccatcgcca agcgcgataa catcccaacc 1020
tacgttgccg ccgatcgcat ggcggaagaa cgtatcgaga ccatgcgtaa ggcgcgcagc 1080
caatttctgc agaacggcca ccatattctc agtcgtcgtc gtgcccgt 1128
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<211> 1053
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
tctggccgcg cacgggccca gagacagagt agccggggcc gcggcggggg agggagtggt 60
ggcggcggca gtacccaacg tctgaaagac aaactggccg tgatcaccgg cggtgccaat 120
ggtatcggtc gtgcgattgc ggaacgtttc gcggttgaag gtgccgacat cgcgatcgcg 180
gatctggttc cagccccaga agcggaagcc gccattcgca atctgggtcg ccgtgttctg 240
accgtgaaat gtgacgtgag ccagccgggc gacgttgagg cgttcggtaa gcaagttatc 300
agcaccttcg gccgctgcga tatcctcgtg aataacgccg gcatctaccc gctgattccg 360
ttcgatgaac tgacgttcga gcagtggaaa aagacgttcg agatcaacgt tgacagcggc 420
ttcctcatgg cgaaggcctt tgtgccgggc atgaaacgca atggctgggg ccgcattatc 480
aatctgacca gcacgaccta ctggctcaag atcgaggcct atacccacta tatcagcacc 540
aaagcggcca acatcggttt tacccgtgcc ctcgcgagtg atctgggcaa agacggtatc 600
accgttaacg ccattgcgcc aagtctcgtt cgcaccgcga cgaccgaagc gagtgccctc 660
agtgcgatgt tcgacgtgct gccgaatatg ctgcaagcca tcccacgtct gcaagttcca 720
ctggatctca ccggtgcggc ggcctttctg gccagtgacg atgcgagctt catcaccggc 780
caaacgctgg ccgttgatgg cggtatggtt cgtcatggtg gtggtggcag cggcggtggt 840
ggtagtagta ccaagctcta cggcgatgtg aacgacgatg gcaaggtgaa tagcaccgat 900
gcggtggcgc tgaaacgcta tgtgctgcgc agcggcatca gcatcaatac cgacaacgcc 960
gatctgaacg aggatggccg cgtgaacagc accgatctgg gcatcctcaa gcgctacatc 1020
ctcaaggaaa tcgacacgct gccatacaag aat 1053
<210> 5
<211> 1200
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
tctggccgcg cacgggccca gagacagagt agccggggcc gcggcggggg agggagtggt 60
ggcggcggca gtagtctggt tgaaaaaacg agcattatta aggacttcac gctgttcgag 120
aaaatgagcg agcatgagca agttgtgttc tgtaacgatc cagcgaccgg tctgcgtgcg 180
atcatcgcga tccatgatac gacgctgggt ccagcgctgg gtggctgccg tatgcagccg 240
tacaacagtg tggaggaagc gctggaagat gccctccgtc tgagcaaggg catgacctac 300
agctgtgcgg ccagcgacgt tgatttcggc ggcggtaaag ccgtgattat tggcgatccg 360
cagaaggaca agagcccaga actgttccgc gccttcggtc agtttgttga cagtctgggc 420
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agcgatagtc tggagggtaa agtggttgcc gtgcaaggcg tgggcaatgt tgcctatcac 660
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atcccgcagc tcaaggcgaa agtgattgcg ggcagtgcgc tgaatcaact gaaagaaccg 900
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<210> 6
<211> 4392
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caccgccgcc gc 4392

Claims (1)

1.二氧化硅结合肽介导醇脱氢酶和胺脱氢酶共固定化级联反应制备手性胺的方法，其特征是，包括如下步骤：
1） 采用重叠延伸PCR技术将二氧化硅结合肽CotB1p的基因分别插入到醇脱氢酶ADH和胺脱氢酶AmDH的基因序列的N末端得到重组基因cotb1p-adh和cotb1p-amdh，然后将重组基因亚克隆到质粒pCold Ⅱ上，构建基因工程菌株；
2） 上述工程菌株经诱导表达后，利用镍离子金属螯合亲和色谱柱及含高浓度的咪唑缓冲液纯化分离重组蛋白CotB1p-ADH和CotB1p-AmDH；
3） 利用二氧化硅纳米粒子SNPs作为固定化酶的载体，将两重组蛋白共锚定在SNPs表面得到固定化酶CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs；
4） 将获得的固定化酶置于含有NAD+和外消旋醇的NH4Cl缓冲液中反应进行手性胺的制备；其中：
步骤1) 中，二氧化硅结合肽CotB1p 基因序列为SEQ ID NO.1；醇脱氢酶ADH的基因序列为SEQ ID NO.2；胺脱氢酶AmDH的基因序列为SEQ ID NO.3；重组基因cotb1p-adh序列为SEQ ID NO.4；cotb1p-amdh序列为SEQ ID NO.5；质粒pCold Ⅱ的序列为SEQ ID NO. 6；
步骤2) 中，高浓度的咪唑缓冲液作为洗脱液将重组蛋白从镍离子金属螯合亲和色谱柱洗脱下来，咪唑浓度范围为400 – 500 mM；
步骤3)中，固定化酶体系包含5 – 15 mg/mL SNPs、 0.0067 – 0.02 mg/mL CotB1p-ADH与0.16 - 0.2 mg/mL CotB1p-AmDH，然后将固定化酶体系置于4°C空气浴摇床中120 -200 rpm孵育10 - 30 min，然后以6500 - 8500 g的离心速率收集固定化酶CotB1p-ADH&CotB1p-AmDH@SNPs；SNPs粒径为20 – 30 nm；
步骤4）中外消旋醇为(S)-2-己醇。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106574281A (zh) * 2014-07-03 2017-04-19 巴斯夫欧洲公司 醇类的氧化还原自足性生物催化胺化
JP2018033451A (ja) * 2016-08-24 2018-03-08 国立研究開発法人産業技術総合研究所 Ｓｉ−ｔａｇ融合異種酵素とメソポーラスシリカとの複合体
KR20200053289A (ko) * 2018-11-08 2020-05-18 한국전력공사 탄산무수화효소 및 실리카 친화성 펩타이드를 포함하는 융합 단백질 및 이의 제조방법
KR20200099976A (ko) * 2019-02-15 2020-08-25 고려대학교 세종산학협력단 실리카 형성 펩타이드를 포함하는 링커 조성물

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100158822A1 (en) * 2008-12-18 2010-06-24 E .I. Du Pont De Nemours And Company Peptides that bind to silica-coated particles
WO2016063926A1 (ja) * 2014-10-22 2016-04-28 国立大学法人広島大学 精製方法、精製キット、および、これらに用いられる酸化ケイ素結合タグ

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106574281A (zh) * 2014-07-03 2017-04-19 巴斯夫欧洲公司 醇类的氧化还原自足性生物催化胺化
JP2018033451A (ja) * 2016-08-24 2018-03-08 国立研究開発法人産業技術総合研究所 Ｓｉ−ｔａｇ融合異種酵素とメソポーラスシリカとの複合体
KR20200053289A (ko) * 2018-11-08 2020-05-18 한국전력공사 탄산무수화효소 및 실리카 친화성 펩타이드를 포함하는 융합 단백질 및 이의 제조방법
KR20200099976A (ko) * 2019-02-15 2020-08-25 고려대학교 세종산학협력단 실리카 형성 펩타이드를 포함하는 링커 조성물

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Conversion of alcohols to enantiopure amines through dual-enzyme hydrogen-borrowing cascades;Francesco G Mutti等;Science;第349卷(第6255期);摘要、第2页最后1段至第3页第2段、表2；附加信息第2-9、第31页 *

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