CN106867952B

CN106867952B - 一株大肠杆菌基因工程菌及利用其生产l-苏氨酸的方法

Info

Publication number: CN106867952B
Application number: CN201710012891.6A
Authority: CN
Inventors: 谢希贤; 马明利; 陈宁; 鄢芳清; 徐庆阳; 马倩; 刘涛; 王俊朋
Original assignee: Tianjin University of Science and Technology
Current assignee: Tianjin University of Science and Technology
Priority date: 2017-01-09
Filing date: 2017-01-09
Publication date: 2019-10-18
Anticipated expiration: 2037-01-09
Also published as: CN106867952A

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株大肠杆菌基因工程菌及利用其生产L‑苏氨酸的方法。所述基因工程菌是将出发菌株的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)的启动子P_ppc替换为6‑磷酸葡萄糖脱氢酶基因(zwf)的启动子P_zwf，从而达到能通过甜菜碱调节其L‑苏氨酸生产能力的目的。在发酵过程中通过添加甜菜碱，可以使摇瓶发酵L‑苏氨酸产量达到50‑55g/L；5L发酵罐产量达到120‑150g/L，糖酸转化率达到59‑61％。

Description

一株大肠杆菌基因工程菌及利用其生产L-苏氨酸的方法

技术领域：

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株大肠杆菌基因工程菌及利用其生产L-苏氨酸的方法。

背景技术：

启动子为RNA聚合酶特异性识别和结合的DNA序列。启动子是基因的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子就像“开关”，决定基因的活动，但启动子本身并不控制基因活动，而是通过与称为转录因子的这种蛋白质结合而控制基因活动的。启动子位于结构基因5'端上游的一段DNA序列，能够指导全酶(holoenzyme)同模板正确结合，活化RNA聚合酶，启动基因转录。

目前常用的启动子类型有组成型启动子(能够使基因在所有细胞中都能启动表达的启动子)和诱导型启动子(在某些特定的物理或化学信号的刺激下，该种类型的启动子可以大幅度地提高基因的转录水平)。组成型启动子不受外界条件的影响，所启动基因的表达具有持续性，但不表现时空特异性；而诱导型启动子可以通过外界的物理化学信号人为地调控结构基因的表达。

现有技术中的组成型启动子，表达强度不具有时空特异性，不可以人为地调控；而诱导型启动子需要添加IPTG、乳糖等外源物质，其成本较高，诱导剂有时候对菌体生长还有一定的副作用；温度诱导启动子则对温度较为敏感，对设备温度控制要求较高，而且温度的改变有时候也会影响细胞的正常代谢。

大肠杆菌的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶由ppc基因编码，催化磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate，PEP)和CO₂反应生成草酰乙酸(Oxaloacetate，OAA)。反应方程式如下：PEP+CO₂＝OAA+Pi。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的活性增强，有助于增加草酰乙酸的积累，从而增加天冬氨酸的积累。天冬氨酸是L-苏氨酸合成的直接前体物，因此磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶是L-苏氨酸合成的一个关键酶。另一方面，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶催化的反应能固定一分子CO₂，增强细胞磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性，将增强细胞的CO₂固定反应，从而提高细胞代谢产物生产的糖酸转化率。反之，磷酸烯醇式丙酮酸将生成丙酮酸，转化为乙酰辅酶A后进入TCA循环。TCA循环虽然有利于细胞生成ATP，但同时生成两分子的CO₂。因此过多的TCA循环将导致细胞较低的糖酸转化率。对L-苏氨酸发酵生产而言，增强磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达是提高L-苏氨酸产量和糖酸转化率的有效方法。但是也有研究表明，过强的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶表达会影响细胞的正常代谢和生长，进而影响L-苏氨酸的合成和积累。因此，调节细胞不同时期的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性，调整CO₂固定反应和TCA循环的代谢流量对于L-苏氨酸发酵至关重要。

申请人在研究过程中发现甜菜碱能够有效地提高6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(zwf)的启动子P_zwf的表达强度，且启动子P_zwf的表达强度随着甜菜碱浓度的增加逐步增强。因此本发明尝试将大肠杆菌染色体上的P_ppc替换为P_zwf，并采取发酵过程中流加甜菜碱的方式以调节磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达强度。随着发酵时间的延伸，甜菜碱的浓度逐渐提高，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达强度也随之增强。采用这种调控方式，在不影响细胞正常生长的前提下，实现对大肠杆菌发酵生产L-苏氨酸的调控，达到提高L-苏氨酸产量和糖酸转化率的目的。

发明内容：

为了实现上述目的，本发明提供的技术方案之一：是一株大肠杆菌基因工程菌，所述基因工程菌是将出发菌株的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因(ppc)的启动子P_ppc替换为6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因(zwf)的启动子P_zwf，从而达到能通过甜菜碱调节其L-苏氨酸生产能力的目的；

优选地，所述出发菌株为E coli THRD，编号CGMCC No.11074，所述菌株已在申请号为201510579005.9的中国发明专利中公布；

所述基因工程菌的构建方法如下：

(1)ppc基因启动子P_ppc上、下游同源臂(ppc-up和ppc-down)、Cm基因和zwf基因启动子P_zwf的扩增；

(2)构建包含上述片段的连接片段ppc-up-Cm-P_zwf-ppc-down；

(3)将上述连接片段转化入大肠杆菌THRD感受态细胞即得所述基因工程菌。

本发明提供的技术方案之二：是利用上述基因工程菌生产L-苏氨酸的摇瓶发酵方法，具体如下：

(1)将上述菌株进行斜面培养活化，37℃培养14-16h，转接一次，37℃培养8-10h；

(2)将斜面菌种接种到种子培养基中，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀为6-8；

(3)按照10％的接种量将种子培养液接种到发酵培养基中，37℃，200rpm培养，发酵过程中，缺糖后开始流加糖，甜菜碱随葡萄糖进行流加，发酵28-32h结束；

所述缺糖标准为：培养基超过20min没有颜色变化，即pH没有发生变化，即可确定是缺糖；

所述流加的糖为80％的葡萄糖，含2.5g/L甜菜碱，每次每30mL发酵体系流加1mL；

所述种子培养基组成以g/L计：葡萄糖20-40，酵母粉5-20，蛋白胨2-10，磷酸二氢钾0.75-2.5，硫酸镁0.25-1.0，硫酸亚铁0.005-0.02，硫酸锰0.005-0.02，V_B10.001-0.003，V_H 0.0001-0.0005，苯酚红15-30，其余为水，pH 7.0-7.2；

所述发酵培养基组成以g/L计：葡萄糖15-45，酵母粉1-5，蛋白胨1-8，磷酸二氢钾1-4，柠檬酸钠0.5-2.5，硫酸镁0.5-1.5，V_B1 0.0004-0.002，V_H 0.01-0.04，硫酸锰0.05-0.2，硫酸亚铁0.05-0.2，甜菜碱0.4-0.6，苯酚红15-30，其余为水，pH 7.0-7.2；

发酵结束后，L-苏氨酸产量达到50-55g/L，糖酸转化率提高至38-42％；

本发明提供的技术方案之三：利用上述基因工程菌生产L-苏氨酸发酵罐发酵方法，具体如下：

(1)将上述菌株进行斜面活化，37℃培养14-16h，转接一次，37℃培养8-10h；

(2)将斜面菌种接种到种子培养基中，37℃，DO控制在25％-40％，培养至OD₆₀₀为12-16，按照14-18％的接种量将种子培养液转接发酵培养基；

(3)发酵过程中利用氨水(25％)调节pH为6.8-7.2，DO控制在30％-40％，待底糖耗尽，流加80％的葡萄糖(含2.5g/L的甜菜碱)，整个发酵过程葡萄糖浓度控制在5g/L以下；

种子培养基以g/L计：葡萄糖15-45，玉米浆20-50mL/L或干粉8-20，酵母粉1-5，硫酸镁0.15-0.5，硫酸亚铁0.005-0.025，硫酸锰0.005-0.025，磷酸二氢钾1.0-4.0，柠檬酸1.0-5.0，硫酸铵1.0-5.0，其余为水，pH 7.0-7.2；

发酵培养基以g/L计：葡萄糖10-25，酵母粉1-5，玉米浆10-25mL/L或干粉4.0-10，硫酸镁0.25-1.0，硫酸亚铁0.005-0.02，硫酸锰0.005-0.02，磷酸二氢钾1.0-5.0，甜菜碱0.4-0.6，其余为水，pH 7.0-7.2；

(4)发酵28-32h结束发酵；

发酵结束后L-苏氨酸产量达到120-150g/L，糖酸转化率提高至59-61％。

有益效果：

1、本发明提供的菌株可以按照发酵不同阶段的需要来调节目的基因的表达强度，从而提高糖酸转化率。发酵前期需要菌体快速生长，糖酵解途径和三羧酸循环代谢快，提供充足的能量。发酵后期菌体不需要快速生长，此时开始添加甜菜碱以增强磷酸戊糖途径，合成更多的NADPH。L-苏氨酸合成需要大量的还原力NADPH，磷酸戊糖途径代谢的增强对于L-苏氨酸合成有益。本发明将甜菜碱促进基因表达的机制引入到L-苏氨酸合成的另一个关键蛋白磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达中。通过将ppc基因启动子P_ppc替换为P_zwf，从而使磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的表达随着甜菜碱的添加逐步提高，从而增强L-苏氨酸的产量和糖酸转化率。在实际应用当中可以采用流加方式进行调控，其可操作性强，使用便利，效果明显，显著提高L-苏氨酸生产效率，降低生产成本。

2、采用本发明构建的基因工程菌，在发酵过程中通过添加甜菜碱，可以使L-苏氨酸摇瓶发酵产量达到50-55g/L，摇瓶糖酸转化率达到38-42％；发酵罐产量达到120-150g/L，糖酸转化率达到59-61％。

附图说明：

图1：不同浓度甜菜碱对P_zwf表达强度的影响；

图2：不同浓度甜菜碱对G6PDH酶活的影响；

图3：不同浓度甜菜碱对生物量的影响；

图4：E.coli DH5αpUC19L-P_zwf-gfp菌株构建各阶段PCR验证图

其中，M为DNA marker；

A中泳道1为反向PCR扩增pUC19-L片段(2252bp)；

B中泳道2为PCR扩增P_zwf片段(485bp)；

C中泳道3为PCR扩增gfp片段(720bp)；

D中泳道4为重叠PCR扩增P_zwf-gfp片段(1205bp)；

E中泳道5为PCR鉴定阳性菌株(2208bp)；

图5：大肠杆菌THRD的P_ppc替换为P_zwf各阶段PCR验证图

其中，M为DNA marker；1为P_ppc上游同源臂；2为Cm；3为P_ppc下游同源臂；4为P_zwf；5为重叠片段；

图6：大肠杆菌THRD的P_ppc替换为P_zwf阳性转化子PCR验证图

其中，1为原菌THRD；2为Cm片段敲除前阳性转化子；3为Cm片段敲除后阳性转化子。

具体实施方式：

实施例1：甜菜碱增强P_zwf表达强度试验

1、包含zwf基因启动子和绿色荧光蛋白表达基因gfp的重组载体的构建

(1)载体pUC19的改造

对载体pUC19进行改造，通过设计反向扩增引物pUC19-F/pUC19-R用以去除其整个Lac操纵子(见图4)，改造后的载体片段命名为pUC19-L(SEQ ID No.1)；

(2)zwf基因启动子和gfp基因的扩增及重叠片段的构建

以大肠杆菌MG1655基因组中的zwf启动子序列(SEQ ID No.2)为模版设计扩增引物P_zwf–up和P_zwf-down；以pEGFP-N1质粒上的gfp(SEQ ID No.3)基因序列为模版设计扩增引物gfp–up和gfp–down，引物P_zwf–down与gfp–up中间含有20bp的重叠序列，引物P_zwf–up与gfp–down的5’端各含有与载体待克隆位置上下游的同源序列。

使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase分别扩增zwf基因启动子P_zwf和gfp基因，电泳验证得到目的条带(见图4)，使用广州飞扬生物工程有限公司的OMEGA的PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行回收得到P_zwf和gfp基因片段；

PCR体系如下：

再通过PrimeSTAR HS DNA Polymerase酶对P_zwf片段和gfp基因片段进行重叠PCR扩增，电泳验证得到目的条带(见图4)，使用试剂盒进行回收得到P_zwf-gfp待用；

PCR体系如下：

(3)构建载体pUC19-P_zwf-gfp

使用ClonExpress-II One Step Cloning Kit试剂盒将载体pUC19-L与重叠片段P_zwf-gfp进行重组连接；

重组连接体系如下：

(4)重组连接产物转化：

①将重组连接产物37℃水浴30min后冰浴5min，加入至E.coli DH5α感受态中，用移液器混匀，继续冰浴20min；

②将EP管放置于42℃水浴锅中，热激60s；

③冰浴2min，加入800μL SOC复苏液，37℃，200rpm孵育1h；

④8000rpm离心2min，留100μL液体，重悬菌体，涂布于含有氨苄青霉素抗性的LB平板中，37℃培养过夜。

(5)阳性克隆子的验证：

菌落PCR体系

在超净台中用牙签尖端精确的挑取一个单菌落，作为模板进行菌落PCR验证。PCR实验后进行电泳验证(见图4)，得到阳性菌株，将阳性突变子接种至LB摇管中，37℃培养过夜，甘油管保藏于-80℃中，命名为pUC19L-P_zwf-gfp。

2、荧光检测及G6PDH的酶活力测定

(1)从甘油管中吸取20μL的pUC19L-P_zwf-gfp菌液至含氨苄青霉素抗性的5mL LB摇管中，37℃，200rpm培养12h；

(2)从5mL摇管中按0.1％的接种量转接至30mL的LB培养基中，37℃，200rpm培养8h；

(3)按2％的接种量接种至50mL的LB培养基中(试验组中分别添加终浓度为0.05g/L、0.1g/L、0.5g/L、0.75g/L、1g/L甜菜碱；对照组中不添加甜菜碱)，37℃，200rpm培养，分别取6h、9h、12h的样品测定OD₆₀₀；

(4)使用日本Hitachi公司的F-7000型荧光分光光度计测量样品的GFP的荧光值。设定激发波长为491nm，发射波长为511nm；

试验结果见下表(荧光增强系数)及图1，可知甜菜碱的添加能够增强P_zwf的表达；

(5)取甜菜碱添加量分别为0.5g/L和1g/L的12h样品测定G6PDH的活力；

G6PDH的酶活力按照苏州科铭生物技术有限公司的6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G6PDH)试剂盒进行操作，结果见图2。由图2可知，甜菜碱的添加能够提高菌体的G6PDH酶活；

(6)测定添加甜菜碱的培养体系对菌体生物量的影响，见图3，可知添加甜菜碱对于菌体的生长(OD₆₀₀)有一定的影响，高浓度的抑制作用比较明显，综合图1中甜菜碱对P_zwf表达量的影响，确定在表达或发酵体系中甜菜碱的添加量为0.5-1g/L，可在目的产物生产高峰期通过流加的方式补充甜菜碱，这样可以减少甜菜碱对菌体生长的不利影响，也可以提高P_zwf表达强度。

实施例2：大肠杆菌THRD的P_ppc替换为P_zwf

1、ppc基因启动子P_ppc上、下游同源臂、Cm基因和zwf基因启动子P_zwf的扩增

以大肠杆菌MG1655基因组上ppc基因(SEQ ID No.20)启动子P_ppc上、下游同源臂序列为模板设计引物ppc-up-1/2和ppc-down-1/2；

以大肠杆菌MG1655基因组上zwf启动子序列为模板设计引物zwf-1和zwf-2；

以质粒pKD3为模板设计Cm片段引物Cm-up和Cm-down。

使用高保真酶PrimeSTAR HS DNA Polymerase分别扩增ppc基因启动子上、下游同源臂序列和zwf启动子序列，电泳验证得到目的条带(见图5)，使用广州飞扬生物工程有限公司的OMEGA的PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行回收得到ppc基因启动子上、下游同源臂和zwf启动子片段；再通过PrimeSTAR HS DNAPolymerase酶对P_zwf片段、ppc启动子上、下游同源臂和Cm片段进行重叠PCR扩增，电泳验证得到目的条带(见图5)，使用试剂盒进行回收得到ppc-up-Cm-P_zwf-ppc-down待用；

PCR体系如下：

2、将重叠片段ppc-up-Cm-P_zwf-ppc-down转化入大肠杆菌THRD感受态细胞

首先利用CaCl₂转化法将pKD46质粒转化入大肠杆菌THRD感受态细胞内，筛选阳性转化子。而后利用电转化的方法将重叠片段ppc-up-Cm-P_zwf-ppc-down转化入带有质粒pKD46(温敏质粒)的大肠杆菌感受态细胞内，32℃培养，筛选阳性转化子。在42℃培养丢失质粒pKD46。

利用CaCl₂转化法将质粒pCP20(温敏质粒)转化入丢掉pKD46的重组菌感受态细胞内进行Cm片段敲除，32℃过夜培养，利用引物ppc-up-1和ppc-down-2进行PCR验证和筛选阳性转化子(见图6)，筛选阳性转化子并转接到液体LB培养基，42℃继续培养。次日进行对点平板培养基(分别为添加氯霉素的LB固体培养基和无抗性LB固体培养基)，筛选在添加氯霉素的平板上不可以生长，而在无抗平板上可以生长的单菌落，将筛选到的阳性菌转接到LB液体培养基中扩大培养，送部分菌液到金唯智生物科技有限公司测序以保证启动子序列没有突变。保菌备用。

实施例3：摇瓶发酵

试验菌株：实施例2所得菌株；原始菌THRD；

(1)将试验菌株分别进行斜面培养活化，37℃培养16h，进行转接一次(二代斜面活化)，37℃培养10h；

(2)用接种环划取上述二代斜面两环菌泥到30mL种子培养基中，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀为8；

(3)按照10％的接种量将种子培养液接种到发酵培养基中，37℃，200rpm培养，缺糖后开始流加糖，甜菜碱随糖进行流加(流加80％的葡萄糖，含2.5g/L甜菜碱，每次每30mL发酵体系流加1mL)，发酵28h结束；

缺糖标准：培养基超过20min没有颜色变化(即pH没有发生变化)，即可确定是缺糖表现；

所述种子培养基组成以g/L计：葡萄糖40，酵母粉20，蛋白胨10，磷酸二氢钾2.5，硫酸镁1.0，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.02，V_B1 0.003，V_H 0.0005，苯酚红30，其余为水，pH 7.0-7.2；

所述发酵培养基组成以g/L计：葡萄糖45，酵母粉5，蛋白胨8，磷酸二氢钾4，柠檬酸钠2.5，硫酸镁1.5，V_B1 0.002，V_H 0.04，硫酸锰0.2，硫酸亚铁0.2，甜菜碱0.6，苯酚红30，其余为水，pH 7.0-7.2；

(4)发酵结束后，利用高效液相色谱法(HPLC,C18,150mm*4.6mm/5μm,UV-VIS,Shimadzu)检测L-苏氨酸浓度，柱温33℃，检测波长360nm，流动相0.42％乙酸钠和50％的乙腈，流速1mL/min；

试验结果见下表：

由表可知，实施例2所得菌株L-苏氨酸产量52.1g/L，原菌的产量为48.7g/L。从启动子替换前后菌体的OD值来看，两者在生长上没有明显差异。启动子替换后菌株的糖酸转化率提高到38.2％，说明代谢流更多地流向L-苏氨酸合成的方向。

实施例4：摇瓶发酵试验

试验菌株：实施例2所得菌株

(1)将上述菌株进行斜面培养活化，37℃培养14h，转接一次，37℃培养8h；

(2)将斜面菌种接种到种子培养基中，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀为6；

(3)按照10％的接种量将种子培养液接种到30mL发酵培养基中，37℃，200rpm培养，发酵过程中，缺糖后开始流加糖，甜菜碱随糖进行流加(流加80％的葡萄糖，含2.5g/L甜菜碱，每次每30mL发酵体系流加1mL)，发酵32h结束；

所述种子培养基组成以g/L计：葡萄糖20，酵母粉5，蛋白胨2，磷酸二氢钾0.75，硫酸镁0.25，硫酸亚铁0.005，硫酸锰0.005，V_B1 0.001，V_H 0.0001，苯酚红15，其余为水，pH7.0-7.2；

所述发酵培养基组成以g/L计：葡萄糖15，酵母粉1，蛋白胨1，磷酸二氢钾1，柠檬酸钠0.5，硫酸镁0.5，V_B1 0.0004，V_H 0.01，硫酸锰0.05，硫酸亚铁0.05，甜菜碱0.4，苯酚红15，其余为水，pH 7.0-7.2；

试验组即为上述试验，对照组为上述试验中去除培养基以及流加葡萄糖中的甜菜碱，其他均相同。试验结果见下表：

由表格数据可知，对照组L-苏氨酸产量为51.2g/L，而试验组摇瓶发酵L-苏氨酸产量达到54.7g/L，糖酸转化率从37.5％提高至40.9％。

实施例5：摇瓶发酵试验

试验菌株：实施例2所得菌株

(3)按照10％的接种量将种子培养液接种到30mL发酵培养基中，37℃，200rpm培养，发酵过程中，缺糖后开始流加糖，甜菜碱随糖进行流加(流加80％的葡萄糖，含2.5g/L甜菜碱，每次每30mL发酵体系流加1mL)，发酵30h结束；

所述种子培养基组成以g/L计：葡萄糖30，酵母粉15，蛋白胨5，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.0075，硫酸锰0.01，V_B1 0.0015，V_H 0.0002，苯酚红15，其余为水，pH7.0-7.2；

所述发酵培养基组成以g/L计：葡萄糖25，酵母粉2，蛋白胨1.5，磷酸二氢钾1.5，柠檬酸钠0.75，硫酸镁0.75，V_B1 0.0006，V_H 0.015，硫酸锰0.075，硫酸亚铁0.075，甜菜碱0.5，苯酚红25，其余为水，pH 7.0-7.2；

由表中数据可知，对照组L-苏氨酸的产量是50.2g/L，试验组L-苏氨酸产量达到53.9g/L，糖酸转化率从37.6％提高至41.2％。

实施例6：5L罐发酵试验

试验菌株：实施例2所得菌株；

(1)进行斜面培养活化，37℃培养14h，进行转接一次(二代斜面活化)，37℃培养10h。

(2)转接6根上述二代斜面到种子培养基，37℃，DO控制在25-40％。培养至OD₆₀₀为16，按照16.6％的接种量将种子培养液转接发酵培养基，定容至3L。

种子培养基(g/L)：葡萄糖35，玉米浆30mL/L，酵母粉3，硫酸镁0.25，硫酸亚铁0.01，硫酸锰0.01，磷酸二氢钾1.5，柠檬酸2，硫酸铵2，其余为水，pH 7.0-7.2；

发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，酵母粉2，玉米浆12mL/L，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.01，硫酸锰0.01，磷酸二氢钾2，甜菜碱0.4，其余为水，pH 7.0-7.2。

(3)发酵过程中利用氨水(25％)调节pH为6.8-7.2，DO控制在30％-40％，待底糖耗尽，流加80％的葡萄糖(含2.5g/L的甜菜碱)，整个发酵过程葡萄糖浓度控制在5g/L以下。

(4)发酵30h结束发酵，统计、分析相关数据并测定L-苏氨酸产量；

试验组即为上述试验，对照组为上述试验中去除培养基以及流加葡萄糖中的甜菜碱，其他均相同。试验结果见下表；

由表中数据可知，添加甜菜碱前后菌体生长没有明显差异，不添加甜菜碱L-苏氨酸的产量为126.4g/L；添加甜菜碱后L-苏氨酸产量为127.9g/L。糖酸转化率从57.2％提高至60.2％。

实施例7：5L罐发酵试验

试验菌株：实施例2所得菌株；

(1)将上述菌株进行斜面活化，37℃培养14h，转接一次，37℃培养8h；

(2)将斜面菌种接种到种子培养基中，37℃培养，DO控制在25-40％，至OD₆₀₀为12，按照18％的接种量将种子培养液转接发酵培养基；

种子培养基以g/L计：葡萄糖15，玉米浆20mL/L，酵母粉1，硫酸镁0.15，硫酸亚铁0.005，硫酸锰0.005，磷酸二氢钾1.0，柠檬酸1.0，硫酸铵1.0，其余为水，pH 7.0-7.2；

发酵培养基以g/L计：葡萄糖10，酵母粉1，玉米浆10mL/L，硫酸镁0.25，硫酸亚铁0.005，硫酸锰0.005，磷酸二氢钾1.0，甜菜碱0.6，其余为水，pH 7.0-7.2；

(4)发酵32h结束发酵，统计、分析相关数据并测定L-苏氨酸产量；

由表格数据可知，对照组L-苏氨酸产量为119.6g/L，试验组L-苏氨酸产量达到125.2g/L，糖酸转化率从56.9％提高至59.2％。

实施例8：5L罐发酵试验

试验菌株：实施例2所得菌株；

(1)进行斜面培养活化，37℃培养16h，进行转接一次(二代斜面活化)，37℃培养10h。

(2)转接6根上述二代斜面到种子培养基，37℃培养，DO控制在25-40％，至OD₆₀₀为14，按照14％的接种量将种子培养液转接发酵培养基，定容至3L。

种子培养基以g/L计：葡萄糖45，玉米浆50mL/L，酵母粉5，硫酸镁0.5，硫酸亚铁0.025，硫酸锰0.025，磷酸二氢钾4.0，柠檬酸5.0，硫酸铵5.0，其余为水，pH 7.0-7.2；

发酵培养基以g/L计：葡萄糖25，酵母粉5，玉米浆25mL/L，硫酸镁1.0，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.02，磷酸二氢钾5.0，甜菜碱0.5，其余为水，pH 7.0-7.2。

由表格数据可知，对照组L-苏氨酸的产量为139.6g/L，试验组L-苏氨酸产量达到147.2g/L，糖酸转化率从56.9％提高至60.6％。

SEQUENCE LISTING

<110> 天津科技大学

<120> 一株大肠杆菌基因工程菌及利用其生产L-苏氨酸的方法

<130> 1

<160> 20

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2252

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc 60

ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt 120

tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga aagggcctcg tgatacgcct atttttatag 180

gttaatgtca tgataataat ggtttcttag acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg 240

cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga 300

caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat 360

ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca 420

gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc 480

gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca 540

atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg 600

caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca 660

gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata 720

accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag 780

ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg 840

gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca 900

acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta 960

atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct 1020

ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca 1080

gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag 1140

gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat 1200

tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga ttgatttaaa acttcatttt 1260

taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa 1320

cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga 1380

gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg 1440

gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc 1500

agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag 1560

aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc 1620

agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac gatagttacc ggataaggcg 1680

cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca gcttggagcg aacgacctac 1740

accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga 1800

aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt 1860

ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag 1920

cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg 1980

gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta 2040

tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc 2100

agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc 2160

aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc 2220

gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca at 2252

<210> 2

<211> 485

<212> DNA

<213> MG1655

<400> 2

tcggttcgct aacattggct tccagtgcca tagcagcaat actcgaatgg atcgcgttat 60

cgggcgaagc cagaatgacc tcggcaactt tgcgctctga tttgctcaaa tgttccagct 120

gagactggat tttttccagc atattcatga tgtaaagaga ctcacgggta atgacgattt 180

ccgcactgaa agaaatcgaa atgcagtttt gtcagatatt acgcctgtgt gccgtgttaa 240

tgacaaaagc agataaaaaa gttgttattt tttttcataa catgatcagt gtcagatttt 300

tacccaatgg aaaacgatga tttttttatc agttttgccg cactttgcgc gcttttcccg 360

taatcgcacg ggtggataag cgtttacagt tttcgcaagc tcgtaaaagc agtacagtgc 420

accgtaagaa aattacaagt ataccctggc ttaagtaccg ggttagttaa cttaaggaga 480

atgac 485

<210> 3

<211> 720

<212> DNA

<213> pEGFP-N1质粒

<400> 3

atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60

ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120

ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180

ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240

cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300

ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360

gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420

aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480

ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540

gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600

tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660

ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttaagccagc cccgacaccc 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

attgcgttgc gctcactg 18

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ggcagtgagc gcaacgcaat tcggttcgct aacattggct 40

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

tgctcaccat gtcattctcc ttaagttaac taacccg 37

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggagaatgac atggtgagca agggcgag 28

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gggtgtcggg gctggcttaa ttacttgtac agctcgtcca tgc 43

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

agcaccgcct acatacctcg 20

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gcatttatca gggttattgt ctcat 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

caactggttg aagtggttga gaa 23

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

tacacaatcg ctcaatcact gtcggtcgga taagatg 37

<210> 14

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cttaaggaga atgacatatg aacgaacaat attccgcat 39

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

atttcggttg ggtgagccgt gag 23

<210> 16

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gtgcgttaca tcccttcggt tcgctaacat tggcttc 37

<210> 17

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

attgttcgtt catatgtcat tctccttaag ttaactaacc cg 42

<210> 18

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

tccgaccgac agtgattgag cgattgtgta ggctggag 38

<210> 19

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

atgttagcga accgaaggga tgtaacgcac tgagaagc 38

<210> 20

<211> 2652

<212> DNA

<213> MG1655

<400> 20

atgaacgaac aatattccgc attgcgtagt aatgtcagta tgctcggcaa agtgctggga 60

gaaaccatca aggatgcgtt gggagaacac attcttgaac gcgtagaaac tatccgtaag 120

ttgtcgaaat cttcacgcgc tggcaatgat gctaaccgcc aggagttgct caccacctta 180

caaaatttgt cgaacgacga gctgctgccc gttgcgcgtg cgtttagtca gttcctgaac 240

ctggccaaca ccgccgagca ataccacagc atttcgccga aaggcgaagc tgccagcaac 300

ccggaagtga tcgcccgcac cctgcgtaaa ctgaaaaacc agccggaact gagcgaagac 360

accatcaaaa aagcagtgga atcgctgtcg ctggaactgg tcctcacggc tcacccaacc 420

gaaattaccc gtcgtacact gatccacaaa atggtggaag tgaacgcctg tttaaaacag 480

ctcgataaca aagatatcgc tgactacgaa cacaaccagc tgatgcgtcg cctgcgccag 540

ttgatcgccc agtcatggca taccgatgaa atccgtaagc tgcgtccaag cccggtagat 600

gaagccaaat ggggctttgc cgtagtggaa aacagcctgt ggcaaggcgt accaaattac 660

ctgcgcgaac tgaacgaaca actggaagag aacctcggct acaaactgcc cgtcgaattt 720

gttccggtcc gttttacttc gtggatgggc ggcgaccgcg acggcaaccc gaacgtcact 780

gccgatatca cccgccacgt cctgctactc agccgctgga aagccaccga tttgttcctg 840

aaagatattc aggtgctggt ttctgaactg tcgatggttg aagcgacccc tgaactgctg 900

gcgctggttg gcgaagaagg tgccgcagaa ccgtatcgct atctgatgaa aaacctgcgt 960

tctcgcctga tggcgacaca ggcatggctg gaagcgcgcc tgaaaggcga agaactgcca 1020

aaaccagaag gcctgctgac acaaaacgaa gaactgtggg aaccgctcta cgcttgctac 1080

cagtcacttc aggcgtgtgg catgggtatt atcgccaacg gcgatctgct cgacaccctg 1140

cgccgcgtga aatgtttcgg cgtaccgctg gtccgtattg atatccgtca ggagagcacg 1200

cgtcataccg aagcgctggg cgagctgacc cgctacctcg gtatcggcga ctacgaaagc 1260

tggtcagagg ccgacaaaca ggcgttcctg atccgcgaac tgaactccaa acgtccgctt 1320

ctgccgcgca actggcaacc aagcgccgaa acgcgcgaag tgctcgatac ctgccaggtg 1380

attgccgaag caccgcaagg ctccattgcc gcctacgtga tctcgatggc gaaaacgccg 1440

tccgacgtac tggctgtcca cctgctgctg aaagaagcgg gtatcgggtt tgcgatgccg 1500

gttgctccgc tgtttgaaac cctcgatgat ctgaacaacg ccaacgatgt catgacccag 1560

ctgctcaata ttgactggta tcgtggcctg attcagggca aacagatggt gatgattggc 1620

tattccgact cagcaaaaga tgcgggagtg atggcagctt cctgggcgca atatcaggca 1680

caggatgcat taatcaaaac ctgcgaaaaa gcgggtattg agctgacgtt gttccacggt 1740

cgcggcggtt ccattggtcg cggcggcgca cctgctcatg cggcgctgct gtcacaaccg 1800

ccaggaagcc tgaaaggcgg cctgcgcgta accgaacagg gcgagatgat ccgctttaaa 1860

tatggtctgc cagaaatcac cgtcagcagc ctgtcgcttt ataccggggc gattctggaa 1920

gccaacctgc tgccaccgcc ggagccgaaa gagagctggc gtcgcattat ggatgaactg 1980

tcagtcatct cctgcgatgt ctaccgcggc tacgtacgtg aaaacaaaga ttttgtgcct 2040

tacttccgct ccgctacgcc ggaacaagaa ctgggcaaac tgccgttggg ttcacgtccg 2100

gcgaaacgtc gcccaaccgg cggcgtcgag tcactacgcg ccattccgtg gatcttcgcc 2160

tggacgcaaa accgtctgat gctccccgcc tggctgggtg caggtacggc gctgcaaaaa 2220

gtggtcgaag acggcaaaca gagcgagctg gaggctatgt gccgcgattg gccattcttc 2280

tcgacgcgtc tcggcatgct ggagatggtc ttcgccaaag cagacctgtg gctggcggaa 2340

tactatgacc aacgcctggt agacaaagca ctgtggccgt taggtaaaga gttacgcaac 2400

ctgcaagaag aagacatcaa agtggtgctg gcgattgcca acgattccca tctgatggcc 2460

gatctgccgt ggattgcaga gtctattcag ctacggaata tttacaccga cccgctgaac 2520

gtattgcagg ccgagttgct gcaccgctcc cgccaggcag aaaaagaagg ccaggaaccg 2580

gatcctcgcg tcgaacaagc gttaatggtc actattgccg ggattgcggc aggtatgcgt 2640

aataccggct aa 2652

Claims

1.一株大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是将出发菌株的磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因的启动子P_ppc替换为6-磷酸葡萄糖脱氢酶基因的启动子P_zwf，从而达到能通过甜菜碱调节其L-苏氨酸生产能力的目的；

发菌株为E coli THRD，编号CGMCC No.11074；

所述启动子P_zwf序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的一株大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的构建方法如下：

(1)ppc基因启动子P_ppc上、下游同源臂ppc-up和ppc-down、Cm基因和zwf基因启动子P_zwf的扩增；

(2)构建包含上述片段的连接片段ppc-up-Cm-P_zwf-ppc-down；

(3)将上述连接片段转化入大肠杆菌THRD感受态细胞，筛选获得ppc基因启动子P_ppc被zwf基因启动子P_zwf替换的突变株。

3.一种利用权利要求1所述菌株生产L-苏氨酸的方法，其特征在于，发酵过程中在发酵体系中添加0.5-1g/L的甜菜碱，从而实现L-苏氨酸产量及糖酸转化率的提高。

4.如权利要求3所述的生产L-苏氨酸的方法，其特征在于，摇瓶发酵方法具体如下：

(1)将菌株进行斜面培养活化，37℃培养14-16h，转接一次，37℃培养8-10h；

(3)按照10％的接种量将种子培养液接种到发酵培养基中，37℃，200rpm培养，发酵过程中，缺糖后开始流加糖，甜菜碱随糖进行流加，所述流加的糖为80％的葡萄糖，含2.5g/L甜菜碱，每次每30mL发酵体系流加1mL，发酵28-32h结束；

所述种子培养基组成以g/L计：葡萄糖20-40，酵母粉5-20，蛋白胨2-10，磷酸二氢钾0.75-2.5，硫酸镁0.25-1.0，硫酸亚铁0.005-0.02，硫酸锰0.005-0.02，V_B1 0.001-0.003，V_H0.0001-0.0005，苯酚红15-30，其余为水，pH 7.0-7.2；

所述发酵培养基组成以g/L计：葡萄糖15-45，酵母粉1-5，蛋白胨1-8，磷酸二氢钾1-4，柠檬酸钠0.5-2.5，硫酸镁0.5-1.5，V_B1 0.0004-0.002，V_H 0.01-0.04，硫酸锰0.05-0.2，硫酸亚铁0.05-0.2，甜菜碱0.4-0.6，苯酚红15-30，其余为水，pH 7.0-7.2。

5.如权利要求3所述的生产L-苏氨酸的方法，其特征在于，发酵罐发酵方法具体如下：

(1)将菌株进行斜面活化，37℃培养14-16h，转接一次，37℃培养8-10h；

(2)将斜面菌种接种到种子培养基中，37℃培养，至OD₆₀₀为12-16，按照14-18％的接种量将种子培养液转接发酵培养基；

(3)发酵过程中利用氨水调节pH为6.8-7.2，DO控制在30％-40％，待底糖耗尽，流加含2.5g/L的甜菜碱的80％的葡萄糖，整个发酵过程葡萄糖浓度控制在5g/L以下；

(4)发酵28-32h结束发酵；

发酵培养基以g/L计：葡萄糖10-25，酵母粉1-5，玉米浆10-25mL/L或干粉4.0-10，硫酸镁0.25-1.0，硫酸亚铁0.005-0.02，硫酸锰0.005-0.02，磷酸二氢钾1.0-5.0，甜菜碱0.4-0.6，其余为水，pH 7.0-7.2。

6.权利要求1所述菌株在发酵生产L-苏氨酸中的应用。