KR100971508B1 - 이소프레노이드 생산성이 향상된 에세리키아 속 미생물 및그를 이용하여 이소프레노이드를 생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 메발로네이트 경로에 관여하는 효소뿐만 아니라 비메발로네이트 경로의 속도 결정 단계에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 도입되어, 이소프레노이드 생산성이 향상된 에세리키아 속 미생물 및 그를 이용하여 이소프레노이드를 생산하는 방법을 제공한다.

에세리키아 속 미생물, 이소프레노이드, 레티날, β-카로틴

Description

이소프레노이드 생산성이 향상된 에세리키아 속 미생물 및 그를 이용하여 이소프레노이드를 생산하는 방법{A microorganism of Escherichia genus having enhanced isoprenoid productivity and method of producing isoprenoid using the same}

본 발명은 이소프레노이드 생산성이 향상된 에세리키아 속 미생물 및 그를 이용하여 이소프레노이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.

이소프레노이드는 탄소수가 5개인 이소프렌을 기본 단위로 하여 이루어진 화합물의 총칭이다. 이소프레노이드에는 라이코펜, β-카로틴, 아스타잔틴, 코엔자임 큐텐, 레티놀 및 레티날 등이 포함된다.

이소프레노이드를 생합성하는 경로에는 메발로네이트 경로와 비메발로네이트 경로가 알려져 있다. 에세리키아 속 미생물, 예를 들면 대장균은 비메발로네이트 경로인 MEP 경로만을 가지고 있다. 도 1은 MEP 경로와 메발로네이트 경로를 통하여 기본 빌딩 블록으로부터 이소프레노이드의 일종인 레티날을 합성하는 과정을 도식적으로 나타낸 도면이다. 도 1에서, DXP는 1-데옥시-D-자일룰로즈-5-포스페이트이고, MEP는 2-C-메틸-D-에리스리톨-4-포스페이트이고, IPP는 이소펜테닐 디포스페이 트이고, DMAPP는 디메틸알릴 디포스페이트이고, FPP는 파네실 피로포스페이트이고, GGPP는 제라닐제라닐 피로포스페이트이고, HMG는 하이드록시메틸글루타릴을 나타낸다.

에세리키아 속 미생물, 예를 들면 대장균은 증식이 빠르고 그 대사가 잘 연구되어 있으나, 내재적 MEP 경로는 이소프레노이드를 생합성하는데 있어서, 메발로네이트를 생산하는데 효율적이지 않은 것으로 알려져 왔다. 따라서, 에세리키아 속 미생물에 외래 이소프레노이드 합성 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입한 미생물을 개발하고자 하는 연구가 알려져 있었다. 예를 들면, 한국특허공개 제2007-0103100호에는 다양한 생물체로부터 유래된 메발로네이트 경로 관련 효소들의 유전자 조합에 의해 형질전환된 미생물 및 이를 이용하여 메발로네이트 경로를 통해 이소프레이노이드를 생산하는 방법이 개시되어 있다. 구체적으로, a) 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) 유래의 메발로네이트 인산화효소, 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 인산메발로네이트 인산화효소 및 이인산메발로네이트 탈카복실화효소; 및 (b-1) 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 유래의 아세틸-CoA 아세틸전달효소/하이드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소 및 하이드록시메틸글루타릴-CoA 합성효소, 또는 (b-2) 랄스토니아 유트로파 (Ralstonia eutropha) 유래의 아세틸-CoA 아세틸전달효소, 및 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneunomiae) 유래의 하이드록시메틸글루타릴-CoA 합성효소 및 하이드록시메틸글루타릴-CoA 환원효소를 암호화하는 유전자들을 숙주 미생물에 도입시켜 형질전환시킨 후, 형질전환된 숙주 미생물을 배양하여 이 소프레노이드를 생산하는 것을 포함하는, 이소프레노이드의 제조방법이 개시되어 있다.

그러나, 상기 방법에 의하더라도 여전히 β-카로틴 및 레티날과 같은 이소프레이노이드를 높은 생산성으로 생산하는 에세리키아 속 미생물 및 그를 이용하여 이소프레이노이드를 생산하는 방법이 요구되고 있다. 이에 본 발명자들은 대장균에 최적의 외래 메발로네이트 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 도입하는 동시에, 내재적 MEP 경로의 속도 결정에 단계인 DXP 신타제를 코딩하는 유전자를 에세리키아 속 미생물에 도입하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 β-카로틴 및 레티날과 같은 이소프레노이드를 높은 효율로 생산할 수 있는 에세리키아 속 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 목적은 β-카로틴 및 레티날과 같은 이소프레노이드를 높은 효율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 유래의 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제/하이드록시메틸글루타릴 (HMG)-CoA 리덕타제를 코딩하는 유전자, 엔테로코커스 패칼리스 유래의 HMG-CoA 신타제를 코딩하는 유전자, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 메발로네이트 키나제를 코딩하는 유전자, 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 포스포메발로네이트 키나제를 코딩하는 유전자, 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제를 코딩하는 유전자, 대장균 유래의 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 이소머라제를 코딩하는 유전자, 판토에아 아글루메란스 (pantoea agglomerans) 유래의 제라닐제라닐 피로포스페이트 (GGPP) 신타제를 코딩하는 유전자, 판토에아 아글루메란스 유래의 피토엔 신타제를 코딩하는 유전자, 판토에아 아글루메란스 유래의 피토엔 데히드로게나제를 코딩하는 유전자, 판토에아 아나나티스 (pantoea ananatis) 유래의 라이코펜-β-시클라제를 코딩하는 유전자 및 대장균 유래 1-데옥시자일룰로즈-5-포스페이트 (DXP) 신타제를 코딩하는 유전자로 형질전환되고, 이소 프레노이드를 생산하는 에세리키아 속 미생물을 제공한다.

상기 에세리키아 속 미생물에는 대장균, 예를 들면, MG1655, DH5α, XL1-Blue 및 BL21이 포함되며, 바람직하게는 대장균 DH5α이다.

본 발명의 이소프레노이드를 생산하는 에세리키아 속 미생물은, 내재적으로 MEP 경로를 가지고 있는 것이나, 아세틸-CoA로부터 IPP를 생산하는데 관여하는 외래 메발로네이트 경로의 효소를 코딩하는 유전자가 도입된 균주이다. 또한, 상기 IPP로부터 β-카로틴을 합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자가 추가적으로 도입된 균주이다. 또한, 내재적 MEP 경로에서 속도 결정 단계에 해당하는 효소 DXP 신타제를 코딩하는 유전자가 추가적으로 도입된 균주이다. 따라서, 상기 미생물은 β-카로틴을 고농도로 생산할 수 있다.

본 발명의 이소프레노이드를 생산하는 에세리키아 속 미생물은, 헤마토코커스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis) 유래의 IPP 이소포머레제를 코딩하는 유전자로 추가적으로 형질전환된 것일 수 있다. 이렇게 함으로써, 두 카피의 IPP 이소포머레제가 도입되어, IPP로부터 DMAPP로의 전환이 촉진된다.

본 발명의 이소프레노이드를 생산하는 에세리키아 속 미생물은, 배양되지 않은 해양 박테리아 (uncultured marine bacterium) 66A03 (Sabehi et al., PLoS Biol. 2005 , 3, 1409-1417) 유래의 β-카로틴 모노옥시게나제를 코딩하는 유전자, 생쥐 (Mus musculus) 유래의 β-카로틴 15,15'-모노옥시게나제를 코딩하는 유전자, 나트로노모나스 파라오니스 (Natronomonas pharaonis) ATCC35678 유래의 brp 유사 단백질 2 (brp-like protein 2)를 코딩하는 유전자, 할로박테리움 살리나룸 (Halobacterium salinarum) ATCC700922 유래의 β-카로틴 모노옥시게나제를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로 선택되는 하나 이상의 유전자로 더 형질전환된 것일 수 있다. 상기 유전자들은 β-카로틴을 레티날로 전환시키는 효소를 코딩하는 것으로, 바람직하게는 배양되지 않은 해양 박테리아 (uncultured marine bacterium) 66A03 유래의 β-카로틴 모노옥시게나제를 코딩하는 유전자이고, 더욱 바람직하게는, 배양되지 않은 해양 박테리아 (uncultured marine bacterium) 66A03 유래의 β-카로틴 모노옥시게나제를 코딩하는 유전자는 대장균에서 코돈 사용 최적화된 서열번호 32의 염기서열을 갖는 것이다.

본 발명의 이소프레노이드를 생산하는 에세리키아 속 미생물은, 상기 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 유래의 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제/하이드록시메틸글루타릴 (HMG)-CoA 리덕타제가 서열번호 1, 엔테로코커스 패칼리스 유래의 HMG-CoA 신타제가 서열번호 2, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 메발로네이트 키나제가 서열번호 3, 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 포스포메발로네이트 키나제가 서열번호 4, 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제가 서열번호 5, 대장균 유래의 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 이소머라제가 서열번호 6, 판토에아 아글루메란스 (pantoea agglomerans) 유래의 제라닐제라닐 피로포스페이트 (GGPP) 신타제가 서열번호 7, 판토에아 아글루메란스 유래의 피토엔 신타제가 서열번호 8, 판토에아 아글루메란스 유래의 피토엔 데히드로게나제가 서열번호 9, 판토에아 아나나티스 (pantoea ananatis) 유래의 라이코펜-β-시클라제가 서열번호 10 및 대장균 유래 1-데옥시자일룰로즈-5-포스페이트 (DXP) 신타제가 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

또한, 상기 헤마토코커스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis) 유래의 IPP 이소포머레제는 서열번호 12의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

또한, 상기 배양되지 않은 해양 박테리아 (uncultured marine bacterium) 66A03 유래의 β-카로틴 모노옥시게나제가 서열번호 13, 생쥐 (Mus musculus) 유래의 β-카로틴 15,15'-모노옥시게나제가 서열번호 14, 나트로노모나스 파라오니스 (Natronomonas pharaonis) ATCC35678 유래의 brp 유사 단백질 2 (brp-like protein 2)가 서열번호 15, 할로박테리움 살리나룸 (Halobacterium salinarum) ATCC700922 유래의 β-카로틴 모노옥시게나제가 서열번호 16 또는 17의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다

본 발명의 이소프레노이드를 생산하는 에세리키아 속 미생물의 일 예는, 기탁번호 KCTC 11254BP로 기탁된 대장균 DH5α/pTDHB/pSNA 또는 기탁번호 KCTC 11255BP로 기탁된 대장균 DH5α/pTDHBSR/pSNA인 것을 특징으로 하는 미생물인 것을 특징으로 하는 미생물이다. 기탁번호 KCTC 11254BP로 기탁된 대장균 DH5α/pTDHB/pSNA 또는 기탁번호 KCTC 11255BP로 기탁된 대장균 DH5α/pTDHBSR/pSNA는 배지 중의 탄소원로부터 β-카로틴 또는 레티날을 높은 생산성으로 생산할 수 있는 균이다.

상기 β-카로틴을 레티날로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자는 각각, 배양되지 않은 해양 박테리아 (uncultured marine bacterium) 66A03 (Sabehi et al., PLoS Biol . 2005 , 3, 1409-1417) 유래의 β-카로틴 모노옥시게나제를 코딩하는 유전자, 생쥐 (Mus musculus) 유래의 β-카로틴 15,15'-모노옥시게나제를 코딩하는 Bcmo1 유전자, 나트로노모나스 파라오니스 (Natronomonas pharaonis) ATCC35678 유래의 brp 유사 단백질 2 (brp-like protein 2)를 코딩하는 brp2 유전자, 할로박테리움 살리나룸 (Halobacterium salinarum) ATCC700922 유래의 β-카로틴 모노옥시게나제를 코딩하는 blh 및 brp 유전자로 이루어진 군으로 선택되는 하나 이상의 유전자인 것일 수 있다.

본 명세서에 있어서, 상기 이소프레노이드는 β-카로틴, 레티날, 레티놀, 레티닐 아세테이트 및 레틴산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 바람직하게는, β-카로틴 또는 레티날이다.

본 발명은 또한, 상기한 바와 같은 본 발명의 미생물을 배양하는 단계; 및 배양물로부터 이소프레노이드를 분리하는 단계;를 포함하는, 에세리키아 속 미생물로부터 이소프레노이드를 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명의 에세리키아 속 미생물로부터 이소프레노이드를 생산하는 방법은 상기한 바와 같은 본 발명의 미생물을 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명의 방법에 있어서, 배양은 합성, 반합성, 또는 복합 배양 배지에서 배양할 수 있다. 배양 배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, MRS (Man-Rogosa-Sharp) 액체 배지 및 우유가 첨가된 액체 배지를 사용할 수 있다. 탄소원으로는 전분, 포도당, 자당, 갈락토스, 과당, 글리세롤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으며, 바람직하기로는 글리세롤이다. 질소원으로는 황산암모늄, 질산암모늄, 질산나트륨, 글루탐산, 카사미노산, 효모추출물, 펩톤, 트립톤, 대두박 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있으며, 미네랄은 염화나트륨, 인산제이칼륨, 황산마그네슘 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있다.

미생물 배양 배지 내 상기 탄소원, 질소원 및 미네랄 각각은 리터당 10 내지 100 g, 5 내지 40 g 및 0.5 내지 4 g 을 이용할 수 있다.

상기의 통상의 배양 배지에 첨가되는 비타민은 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 비타민은 통상의 배양 배지에 상기에서 언급한 탄소원, 질소원, 미네랄 등의 배지와 동시에 첨가하거나, 멸균하여 준비된 배지에 첨가할 수 있다.

배양은 통상의 대장균 배양 조건으로 수행할 수 있으며, 예를 들어 약 15-45℃에서 배양할 수 있다. 배양액 중의 배양 배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동하거나 냉동건조하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.

상기 배양의 일 예에 있어서, 탄소원으로서 글리세롤을 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다. 바람직하게는, 0.5 부피 % 내지 2.0부피 %의 글리세롤을 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 배지는 글리세롤 및 아라비노즈가 첨가된 YT 배지일 수 있다. YT 배지는 1.6중량% 트립톤, 1중량% 효모 추출물, 0.5 중량% NaCl이다.

본 발명의 미생물에 대하여는 상기한 바와 같다.

본 발명의 방법은 또한, 배양물로부터 이소프레노이드를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 이소프레노이드, 예를 들면, β-카로틴 또는 레티날을 분리하는 것은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들면, 이온교환 크로마토그래피, HPLC 등의 방법에 의하여 분리될 수 있다. 구체적으로, 균체를 회수한 후에 아세톤등의 용매를 이용한 추출 후에 고순도의 제품을 얻기 위해서는 HPLC 또는 결정화 작업등을 통한 분리정제가 진행될 수 있다.

본 발명의 이소프레노이드를 생산하는 에세리키아 속 미생물에 의하면, β- 카로틴 및 레티날과 같은 이소프레노이드를 높은 효율로 생산할 수 있다.

본 발명의 에세리키아 속 미생물로부터 이소프레노이드를 생산하는 방법에 의하면, β-카로틴 및 레티날과 같은 이소프레노이드를 높은 효율로 생산할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

레티노이드 분석 조건

이하의 실시예에서 레티노이드는 다음의 방법으로 분석하였다.

배양액 100㎕를 취해서 14,000rpm에서 40초 동안 원심분리하여 균체를 회수하였다. 아세톤 1ml을 첨가하여 균체를 재현탁시킨 다음 어두운 곳에서 55℃에서 15분 동안 추출하였다. 다음으로, 14,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액만을 취하여 HPLC 정량 분석을 실시하였다. 레티노이드의 HPLC 분석 조건은 아래 표 1과 같다.

표 1. 레티노이드 분석을 위한 HPLC 조건

품목	조건
HPLC 모델	SHIMADZU Class 10Avp series with UV/Vis detector
칼럼	Symmetry C18(250x4.6,5㎛) with Symmetry guard C18(15x4.6,5㎛)
유속	1.5 mL/min
주입 부피	20 μL
이동상	아세토니트릴 : 메탄올 = 5 : 95
오븐 온도	40℃
작동 시간	15 분

β-카로틴의 HPLC 조건은 레티노이드 HPLC 조건과 동일하고 이동상만 아세토니트릴 : 메탄올 = 30 : 70을 사용하였다. UV 검출기의 분석파장은 β-카로틴은 454nm, 레티날은 370nm, 레티놀과 레티닐 아세테이트는 340nm에서 분석하였다.

실시예 1 : β-카로틴 및 레티날 고생산성 대장균의 제조용 벡터의 제조

본 실시예에서는 MEP 경로를 가지고 있는 대장균에, 속도 결정 단계에 해당하는 효소인 DXP 신타제를 코딩하는 유전자를 대장균에 추가적으로 도입하는 동시에, 메발로네이트 경로에 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 다양한 유전자원으로부터 선별하여 도입하여, β-카로틴 고생산성 대장균을 제조하였다.

(1) 탄소원으로부터 IPP 를 합성하는데 관여하는 메발로네이트 경로의 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 pSNA 벡터의 제조

본 절에서 사용된 탄소원으로부터 IPP를 합성하는데 관여하는 메발로네이트 경로의 효소를 코딩하는 유전자는 다음 표 2와 같다.

표 2.

효소명	유전자	유전자 서열 (Genbank 허가번호)
엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 유래의 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제/하이드록시메틸글루타릴 (HMG)-CoA 리덕타제	mvaE	서열번호 18(AF290092)
엔테로코커스 패칼리스 유래의 HMG-CoA 신타제	mvaS	서열번호 19(AF290092)
스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 메발로네이트 키나제	mvaK1	서열번호 20(AF290099)
스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 포스포메발로네이트 키나제	mvaK2	서열번호 21(AF290099)
스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제	mvaD	서열번호 22 AF290099
대장균 유래의 이소펜테닐 디포스페이트(IPP) 이소머라제	idi	서열번호 23 (U00096)

표 3. 표 2의 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 및 제한 효소

유전자	프라이머 서열		제한 효소
mvaE	F	서열번호 37	SacI
	R	서열번호 38	SmaI
mvaS	F	서열번호 39	SmaI
	R	서열번호 40	BamHI
mvaK1, mvaK2, mvaD	F	서열번호 41	KpnI
	R	서열번호 42	XbaI
idi	F	서열번호 43	SmaI
	R	서열번호 44	SphI

표 3에 표 2의 유전자 클로닝에 사용된 프라이머 서열 및 제한효소를 나타내었다. mvaK1, mvaK2, mvaD는 하나의 오페론으로 염색체상에 존재해서 각각의 유전자를 PCR 클로닝하지 않고 오페론을 통째로 한번에 PCR 클로닝을 하였다.

표 2의 유전자들은 표 3에 열거된 프라이머를 사용하고, 해당 유전자를 포함하고 있는 균주의 염색체 DNA를 주형으로 한, PCR을 통하여 증폭하였다. 증폭된 산물을 표 3에 열거된 제한 효소를 이용하여 pSTV28 벡터 (Takara Korea, 한국) (서열번호 45)에 도입하여, 벡터 pSNA를 제조하였다. 벡터 pSNA는 아세틸-CoA로부터 IPP를 생산할 수 있는 메발로네이트 경로의 효소를 코딩하는 유전자를 모두 포함하고 있다.

도 2는 pSNA 벡터의 지도를 나타내는 도면이다.

(2) IPP 로부터 β-카로틴을 합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터 pTDHB 의 제조

본 절에서 사용된 IPP로부터 β-카로틴을 합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 MEP 경로의 속도결정 단계의 효소인 DXP 신타제 유전자는 다음 표 4와 같다.

표 4.

효소명	유전자	유전자 서열 (Genbank 허가번호)
헤마토코커스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis) 유래의 IPP 이소포머레제	ipiHp1	서열번호 24(AF082325)
대장균 유래 1-데옥시자일룰로즈-5-포스페이트 (DXP) 신타제	dxs	서열번호 25(U00096)
판토에아 아글루메란스 (pantoea agglomerans) 유래의 제라닐제라닐 피로포스페이트 (GGPP) 신타제	crtE	서열번호 26(M87280)
판토에아 아글루메란스 유래의 피토엔 신타제	crtB	서열번호 27(M87280)
판토에아 아글루메란스 유래의 피토엔 데히드로게나제	crtI	서열번호 28M87280
판토에아 아나나티스 (pantoea ananatis) 유래의 라이코펜-β-시클라제	crtY	서열번호 29(D90087)

표 5.

유전자		프라이머	제한 효소
ipiHp1	F	서열번호 46	SmaI SphI
	R	서열번호 47
dxs	F	서열번호 48	EcoRI SnaBI
	R	서열번호 49
crtE	F	서열번호 50	BspHI EcoRI
	R	서열번호 51
crtB , crtI	F	서열번호 52	EcoRI SacI
	R	서열번호 53
crtY	F	서열번호 54	SalI PstI
	R	서열번호 55

상기 표 4의 유전자 클로닝에 사용된 프라이머 서열 및 제한효소는 표 5와 같다. crtB, crtI는 하나의 오페론으로 염색체상에 존재해서 각각의 유전자를 PCR 클로닝하지 않고 오페론을 통째로 한번에 PCR 클로닝을 하였다.

표 4의 유전자들은 표 5에 열거된 프라이머를 사용하고, 해당 유전자를 포함하고 있는 균주의 염색체 DNA를 주형으로 한, PCR을 통하여 증폭하였다. 증폭된 산물을 표 5에 열거된 제한 효소를 이용하여 pTrc99A 벡터 (Genbank 허기 번호 M22744) (서열번호 29)에 도입하여, 벡터 pTDHB를 제조하였다. 벡터 pTDHB는 IPP로부터 β-카로틴을 합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 MEP 경로의 속도결정 단계의 효소인 DXP 신타제 유전자를 모두 포함하고 있다.

도 3은 pTDHB의 벡터 지도를 나타내는 도면이다.

(3) β-카로틴으로부터 레티날을 합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터의 제조

본 절에서 사용된 β-카로틴으로부터 레티날을 합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자는 다음 표 6과 같다. 표 6에서 배양되지 않은 해양 박테리아 (uncultured marine bacterium) 66A03 유래의 β-카로틴 모노옥시게나제를 코딩하는 유전자는 blh의 대장균 코돈 최적화 서열인 SR 유전자를 사용하였다.

표 6.

효소명	유전자	유전자 서열 (Genbank 허가번호)
배양되지 않은 해양 박테리아 (uncultured marine bacterium) 66A03 유래의 β-카로틴 모노옥시게나제	blh	서열번호 31 (DQ065755)
배양되지 않은 해양 박테리아 (uncultured marine bacterium) 66A03 유래의 β-카로틴 모노옥시게나제	SR (blh의대장균 코돈최적화 서열)	서열번호 32
생쥐 (Mus musculus) 유래의 β-카로틴 15,15'-모노옥시게나제	bcmo1	서열번호 33 (NM_021486)
나트로노모나스 파라오니스 (Natronomonas pharaonis) ATCC35678 유래의 brp 유사 단백질 2 (brp-like protein 2)	brp2	서열번호 34 (CR936257)
할로박테리움 살리나룸 (Halobacterium salinarum) ATCC700922 유래의 β-카로틴 모노옥시게나제	blh	서열번호 35 (AE004437)
할로박테리움 살리나룸 (Halobacterium salinarum) ATCC700922 유래의 β-카로틴 모노옥시게나제	brp	서열번호 36 (AE004437)

표 7.

유전자		프라이머 서열	제한 효소
SR	F	서열번호 56	Spe1 SpeI
	R	서열번호 57
bcmo1	F	서열번호 58	EcoRI SpeI
	R	서열번호 59
brp2	F	서열번호 60	EcoRI SpeI
	R	서열번호 61
blh	F	서열번호 62	EcoRI SpeI
	R	서열번호 63
brp	F	서열번호 64	EcoRI SpeI
	R	서열번호 65

표 6의 유전자 클로닝에 사용된 프라이머 서열 및 제한효소는 표 7과 같다. 표 6의유전자들은 표 7에 열거된 프라이머를 사용하고, 해당 유전자를 포함하고 있는 균주의 염색체 DNA와 생쥐의 cDNA 라이브러리를 주형으로 한, PCR을 통하여 증폭하였다. 증폭된 산물을 표 7에 열거된 제한 효소를 이용하여 벡터 pTDHB에 각각 도입하여, 벡터 pTDHBSR, pTDHBBcmo1, pTDHBbrp2, pTDHBblh, pTDHBbrp를 제조하였다. 벡터 pTDHBSR, pTDHBBcmo1, pTDHBbrp2, pTDHBblh 및 pTDHBbrp는 각각 pTDHB 벡터에 SR, Bcmo1, brp2, blh, brp 유전자가 도입된 벡터로서, IPP로부터 β-카로틴 을 거쳐 레티날을 합성하는데 관여하는 효소를 코딩하는 유전자 및 MEP 경로의 속도결정 단계의 효소인 DXP 신타제 유전자를 모두 포함하고 있다.

도 4는 pTDHBSR의 벡터 지도를 나타내는 도면이다. pTDHBBcmo1, pTDHBbrp2, pTDHBblh 및 pTDHBbrp는 pTDHBSR에서 SR 유전자가 각각 Bcmo1, brp2, blh 및 brp 유전자로 치환된 것을 제외하고는 동일하다.

실시예 2: β-카로틴 및 레티날 고생산성 대장균의 제조

(1) 레티날 및 β-카로틴 생산의 최적 균주의 선발

실시예 1에서 제조된 pSNA 벡터와, pTDHB, pTDHBSR, pTDHBBcmo1, pTDHBbrp2, pTDHBblh 또는 pTDHBbrp를 각각 대장균 DH5α에 도입하고, 배양하였다.

배양은 탄소원으로 0.5 중량% 글리세롤 및 0.2 중량% 아라비노스를 포함하는 2YT 배지에서 29℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양은 50 ml 시험관에서 배지 7ml 중에서 균주 0.2ml을 초기 접종하고, 250rpm에서 교반하면서 배양하였다. 48시간 배양액에서 균체를 회수하고 아세톤으로 β-카로틴과 레티날을 추출한 후에 HPLC를 이용하여 레티날 및 β-카로틴의 농도를 측정하였다.

48 시간 경과 후 레티날 및 β-카로틴의 생산량은 다음 표 8과 같다.

표 8.

농도	균주
	pTDHB	pTDHBSR	pTDHBBcmo1	pTDHBbrp2	pTDHBblh	pTDHBbrp
레티날(mg/L)	0	2	0	0.05	0.14	0.22
β-카로틴(mg/L)	120	0	11	35	3	0

위의 결과로부터 pTDHBSR를 포함하는 재조합 대장균 DH5α 균주가 레티날 생 산 균주로, pTDHB를 포함하는 재조합 대장균 DH5α 균주가 β-카로틴 생산 균주로 가장 적합한 것으로 확인되었다.

(2) pTDHBSR 균주를 이용한 레티날 생산을 위한 최적 배양 조건의 탐색

(2.1) 용존산소의 영향

레티날 생산에 미치는 용존산소의 영향을 알아 보기 위하여 시험관에 배양액 의 부피를 3, 5, 7, 10ml으로 변화시켜, pSNA와 pTDHBSR를 포함하는 재조합 대장균 DH5α 균주를 배양하였다.

배양은 탄소원으로 0.5중량% 글리세롤 및 0.2중량% 아라비노스를 포함하는 2YT 배지에서 29℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양은 50ml 시험관에서 상기한 바와 같은 배지 양에 균주 0.2ml를 초기 접종하고, 250 rpm에서 진탕하면서 배양하였다. 레티노이드 생산량을 분석하기 위해서 배양액에서 균체를 회수하고 아세톤으로 추출한 후에 HPLC를 이용하여 레티날, 레티놀, 레티닐 아세테이트의 농도를 측정하였다.

배양 결과, 배양에 사용된 균주는 레티놀 데히드로게나제, 레티날 데히드로게나제, 레티놀 O-지방산 트란스퍼라제 유전자가 도입되어 있지 않은 균주임에도 불구하고, 레티날, 레티놀, 레티닐 아세테이트 등의 다양한 레티노이드가 생산되었다. 이들 레티노이드는 공통적으로 대수기 말기까지 생산이 증가하다가 정지기에 접어들어 분해되는 양상을 보였다. 특히, 레티노이드 중 생산량이 가장 많은 레티놀은 최대 생산량에 도달한 이후 급속하게 분해되었다.

레티노이드의 최대 생산량 및 시간은 다음 표 9,10,11과 같다.

표 9. 레티날 생산량

농도 및 시간	배양 부피(mL)
	3	5	7	10
최대 농도 (mg/L)	10	18	19	13
시간(h)	18	30	36	36

레티날의 생산은 대수기 말기에서 최대 생산량이 되었고, 그 후 완만하게 분해되었다.

표 10. 레티닐 아세테이트 생산량

농도 및 시간	배양 부피(mL)
	3	5	7	10
최대 농도 (mg/L)	5	8.5	9	10
시간(h)	18	30	36	42

레티닐 아세테이트의 생산은 배양액의 부피에 따른 큰 차이를 보이지 않았다.

표 11. 레티놀 생산량

농도 및 시간	배양 부피(mL)
	3	5	7	10
최대 농도 (mg/L)	5	23	25	20
시간(h)	18	30	36	42

이상의 결과로부터, 총 레티노이드의 양은 7ml에서 36시간에 최대 55mg/L이 되었다. 따라서, 레티노이드 생산을 위한 시험관 배양의 최적 배양액량은 7ml이었다.

(2.2) 최적 숙주세포의 선발

본 절에서는 pSNA 벡터와 pTDHBSR 벡터를 5종의 대장균, 즉 MG1655, DH5α, XL1-Blue, S17-1, 및 BL21에 도입하고, 7ml 배지를 포함하는 시험관에서 배양하였다.

기타 배양조건 및 분석조건은 (2.1)절에 기재된 바와 동일하게 실험하였다.

그 결과, DH5α 균주가 레티노이드 생산량이 36시간에서 50mg/L로 가장 높았으며, MG1655 균주는 레티노이드 생산과 균체 성장이 모두 가장 낮았다. BL21은 균체성장은 높았으나, 레티노이드 생산은 낮았다.

표 12.

농도 및 시간	숙주 세포
	MG1655	DH5α	XL1-Blue	BL21	S17-1
레티놀 최대농도 (mg/L)	0.06	30	7.5	1.9	8
총레티노이드 최대 농도 (mg/L)	2.26	50	23.4	3.7	24
시간(h)	24	36	36	48	24

(2.3) 최적 탄소원의 선발

본 절에서는 pSNA 벡터와 pTDHBSR 벡터를 포함하는 대장균 DH5α를 7ml 배지를 포함하는 시험관에서 배양하였다.

배양은 탄소원으로 0.5% 글리세롤, 0.5% 포도당, 0.5% 자일로스, 0.5% 말토스, 0.5% 갈락토스 중 하나와 0.2중량% 아라비노스를 포함하는 2YT 배지에서 29℃에서 48시간 동안 배양하였다. 기타 배양조건 및 분석조건은 (2.2)절에 기재된 바와 동일하게 실험하였다.

그 결과, 글리세롤을 탄소원으로 사용한 경우 다른 탄소원을 사용한 경우에 비하여 36시간에서 20mg/L로 최대 15배까지 레티놀 생산이 증가하였으며, 포도당 및 말토스를 사용한 경우 레티놀이 24 시간에 9.3 mg/L와 5 mg/L로 생산된 반면, 자일로스, 및 갈락토스를 사용한 경우, 레티놀 생산이 탄소원을 첨가하지 않은 경우와 비슷하였다. 탄소원을 첨가하지 않은 경우 레티노이드 생산이 거의 되지 않는 것으로 탄소원이 중요한 것을 알 수 있다.

표 13.

농도 및 시간	탄소원 (중량%)
	없음	0.5% 글리세롤	0.5%포도당	0.5% 자일로스	0.5%말토스	0.5%갈락토스
레티놀 최대농도 (mg/L)	2.6	20	9.3	2.8	5	1.3
총 레티노이드 최대농도 (mg/L)	4.7	36	11	7	13	3.6
시간 (h)	24	36	24	24	24	24

(2.4) 글리세롤의 최적 농도의 선발

본 절에서는 글리세롤의 농도를 0, 0.5, 1.0, 2.0 중량%로 각각 포함하고 0.2중량% 아라비노스를 포함하는 2YT 배지에서 96시간 동안 배양하는 것을 제외하고는, (2.3)절에 기재된 바와 동일하게 실험하였다.

그 결과, 1.0% 글리세롤을 포함하는 배지에서 48시간만에 43mg/L의 레티놀이 생산되었고, 2.0% 글리세롤을 포함하는 배지에서 96시간까지 45mg/L의 레티놀이 계속 생산되었다. 소수 산물인 레티날과 레티닐 아세테이트도 역시 글리세롤 농도가 증가함에 따라 생산량이 증가하였다. 레티노이드 총 생산량에 있어서, 1.0% 글리세롤를 포함하는 배지에서 48시간에서 80mg/L로 가장 많은 생산량을 보였다.

표 14.

농도 및 시간	글리세롤 농도(중량%)
	0%	0.5%	1.0%	2.0%
레티날 최대농도 (mg/L)	2.6	14.3	25	13
레티닐 아세테이트 최대농도 (mg/L)	1.6	8	12	8.3
레티놀 최대농도 (mg/L)	3.8	20	43	45
레티노이드 최대농도 (mg/L)	8	42.3	80	66.3
시간 (h)	24	36	48	96

실시예 3: pSNA 및 pTDHB 벡터를 포함하는 대장균 DH5 α의 β-카로틴 생산성의 확인

본 실시예에서는 pSNA 벡터와 pTDHB 벡터를 포함하는 대장균 DH5α를 7ml 배지를 포함하는 시험관에서 배양하였다.

배양은 탄소원으로 0.5, 1.5, 및 2.0 중량% 글리세롤 중 하나와 0.2중량% 아라비노스를 포함하는 2YT 배지에서 29℃에서 168시간 동안 배양하였다. 배양은 50ml 시험관에서 상기한 바와 같은 배지 양에 균주 0.2ml를 초기 접종하고, 250rpm에서 진탕하면서 배양하였다. β-카로틴 생산량을 분석하기 위해서 배양액에서 균체를 회수하고 아세톤으로 추출한 후에 HPLC를 이용하여 β-카로틴의 농도를 측정하였다.

그 결과, 글리세롤의 농도가 증가할수록 β-카로틴의 생산은 증가하였으며, 2.0%를 포함하는 배지에서 144 시간에서 약 500mg/L의 β-카로틴이 생산되었다.

표 15.

농도 및 시간	글리세롤 농도(중량%)
	0.5%	1.5%	2.0%
β-카로틴 최대 농도 (mg/L)	150	250	500
시간(hr)	48	120	120

본 발명자들은 본 실시예에서 얻어진 균주 DH5α/pTDHB/pSNA (수탁번호 KCTC 11254BP)와 DH5α/pTDHBSR/pSNA (수탁번호 KCTC 11255BP)를 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 유전자원 센터 유전자은행에 2008년 1월 2일자로 기탁하였다.

도 1은 MEP 경로와 메발로네이트 경로를 통하여 기본 빌딩 블록으로부터 이소프레노이드의 일종인 레티날을 합성하는 과정을 도식적으로 나타낸 도면이다.

도 2는 pSNA 벡터의 지도를 나타내는 도면이다.

도 3은 pTDHB의 벡터 지도를 나타내는 도면이다.

도 4는 pTDHBSR의 벡터 지도를 나타내는 도면이다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> A microorganism of Escherichia genus having enhanced isoprenoid productivity and method of producing isoprenoid using the same <130> PN077141 <160> 65 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 803 <212> PRT <213> Enterococcus faecalis <400> 1 Met Lys Thr Val Val Ile Ile Asp Ala Leu Arg Thr Pro Ile Gly Lys 1 5 10 15 Tyr Lys Gly Ser Leu Ser Gln Val Ser Ala Val Asp Leu Gly Thr His 20 25 30 Val Thr Thr Gln Leu Leu Lys Arg His Ser Thr Ile Ser Glu Glu Ile 35 40 45 Asp Gln Val Ile Phe Gly Asn Val Leu Gln Ala Gly Asn Gly Gln Asn 50 55 60 Pro Ala Arg Gln Ile Ala Ile Asn Ser Gly Leu Ser His Glu Ile Pro 65 70 75 80 Ala Met Thr Val Asn Glu Val Cys Gly Ser Gly Met Lys Ala Val Ile 85 90 95 Leu Ala Lys Gln Leu Ile Gln Leu Gly Glu Ala Glu Val Leu Ile Ala 100 105 110 Gly Gly Ile Glu Asn Met Ser Gln Ala Pro Lys Leu Gln Arg Phe Asn 115 120 125 Tyr Glu Thr Glu Ser Tyr Asp Ala Pro Phe Ser Ser Met Met Tyr Asp 130 135 140 Gly Leu Thr Asp Ala Phe Ser Gly Gln Ala Met Gly Leu Thr Ala Glu 145 150 155 160 Asn Val Ala Glu Lys Tyr His Val Thr Arg Glu Glu Gln Asp Gln Phe 165 170 175 Ser Val His Ser Gln Leu Lys Ala Ala Gln Ala Gln Ala Glu Gly Ile 180 185 190 Phe Ala Asp Glu Ile Ala Pro Leu Glu Val Ser Gly Thr Leu Val Glu 195 200 205 Lys Asp Glu Gly Ile Arg Pro Asn Ser Ser Val Glu Lys Leu Gly Thr 210 215 220 Leu Lys Thr Val Phe Lys Glu Asp Gly Thr Val Thr Ala Gly Asn Ala 225 230 235 240 Ser Thr Ile Asn Asp Gly Ala Ser Ala Leu Ile Ile Ala Ser Gln Glu 245 250 255 Tyr Ala Glu Ala His Gly Leu Pro Tyr Leu Ala Ile Ile Arg Asp Ser 260 265 270 Val Glu Val Gly Ile Asp Pro Ala Tyr Met Gly Ile Ser Pro Ile Lys 275 280 285 Ala Ile Gln Lys Leu Leu Ala Arg Asn Gln Leu Thr Thr Glu Glu Ile 290 295 300 Asp Leu Tyr Glu Ile Asn Glu Ala Phe Ala Ala Thr Ser Ile Val Val 305 310 315 320 Gln Arg Glu Leu Ala Leu Pro Glu Glu Lys Val Asn Ile Tyr Gly Gly 325 330 335 Gly Ile Ser Leu Gly His Ala Ile Gly Ala Thr Gly Ala Arg Leu Leu 340 345 350 Thr Ser Leu Ser Tyr Gln Leu Asn Gln Lys Glu Lys Lys Tyr Gly Val 355 360 365 Ala Ser Leu Cys Ile Gly Gly Gly Leu Gly Leu Ala Met Leu Leu Glu 370 375 380 Arg Pro Gln Gln Lys Lys Asn Ser Arg Phe Tyr Gln Met Ser Pro Glu 385 390 395 400 Glu Arg Leu Ala Ser Leu Leu Asn Glu Gly Gln Ile Ser Ala Asp Thr 405 410 415 Lys Lys Glu Phe Glu Asn Thr Ala Leu Ser Ser Gln Ile Ala Asn His 420 425 430 Met Ile Glu Asn Gln Ile Ser Glu Thr Glu Val Pro Met Gly Val Gly 435 440 445 Leu His Leu Thr Val Asp Glu Thr Asp Tyr Leu Val Pro Met Ala Thr 450 455 460 Glu Glu Pro Ser Val Ile Ala Ala Leu Ser Asn Gly Ala Lys Ile Ala 465 470 475 480 Gln Gly Phe Lys Thr Val Asn Gln Gln Arg Leu Met Arg Gly Gln Ile 485 490 495 Val Phe Tyr Asp Val Ala Asp Ala Glu Ser Leu Ile Asp Glu Leu Gln 500 505 510 Val Arg Glu Thr Glu Ile Phe Gln Gln Ala Glu Leu Ser Tyr Pro Ser 515 520 525 Ile Val Lys Arg Gly Gly Gly Leu Arg Asp Leu Gln Tyr Arg Ala Phe 530 535 540 Asp Glu Ser Phe Val Ser Val Asp Phe Leu Val Asp Val Lys Asp Ala 545 550 555 560 Met Gly Ala Asn Ile Val Asn Ala Met Leu Glu Gly Val Ala Glu Leu 565 570 575 Phe Arg Glu Trp Phe Ala Glu Gln Lys Ile Leu Phe Ser Ile Leu Ser 580 585 590 Asn Tyr Ala Thr Glu Ser Val Val Thr Met Lys Thr Ala Ile Pro Val 595 600 605 Ser Arg Leu Ser Lys Gly Ser Asn Gly Arg Glu Ile Ala Glu Lys Ile 610 615 620 Val Leu Ala Ser Arg Tyr Ala Ser Leu Asp Pro Tyr Arg Ala Val Thr 625 630 635 640 His Asn Lys Gly Ile Met Asn Gly Ile Glu Ala Val Val Leu Ala Thr 645 650 655 Gly Asn Asp Thr Arg Ala Val Ser Ala Ser Cys His Ala Phe Ala Val 660 665 670 Lys Glu Gly Arg Tyr Gln Gly Leu Thr Ser Trp Thr Leu Asp Gly Glu 675 680 685 Gln Leu Ile Gly Glu Ile Ser Val Pro Leu Ala Leu Ala Thr Val Gly 690 695 700 Gly Ala Thr Lys Val Leu Pro Lys Ser Gln Ala Ala Ala Asp Leu Leu 705 710 715 720 Ala Val Thr Asp Ala Lys Glu Leu Ser Arg Val Val Ala Ala Val Gly 725 730 735 Leu Ala Gln Asn Leu Ala Ala Leu Arg Ala Leu Val Ser Glu Gly Ile 740 745 750 Gln Lys Gly His Met Ala Leu Gln Ala Arg Ser Leu Ala Met Thr Val 755 760 765 Gly Ala Thr Gly Lys Glu Val Glu Ala Val Ala Gln Gln Leu Lys Arg 770 775 780 Gln Lys Thr Met Asn Gln Asp Arg Ala Leu Ala Ile Leu Asn Asp Leu 785 790 795 800 Arg Lys Gln <210> 2 <211> 383 <212> PRT <213> Enterococcus faecalis <400> 2 Met Thr Ile Gly Ile Asp Lys Ile Ser Phe Phe Val Pro Pro Tyr Tyr 1 5 10 15 Ile Asp Met Thr Ala Leu Ala Glu Ala Arg Asn Val Asp Pro Gly Lys 20 25 30 Phe His Ile Gly Ile Gly Gln Asp Gln Met Ala Val Asn Pro Ile Ser 35 40 45 Gln Asp Ile Val Thr Phe Ala Ala Asn Ala Ala Glu Ala Ile Leu Thr 50 55 60 Lys Glu Asp Lys Glu Ala Ile Asp Met Val Ile Val Gly Thr Glu Ser 65 70 75 80 Ser Ile Asp Glu Ser Lys Ala Ala Ala Val Val Leu His Arg Leu Met 85 90 95 Gly Ile Gln Pro Phe Ala Arg Ser Phe Glu Ile Lys Glu Ala Cys Tyr 100 105 110 Gly Ala Thr Ala Gly Leu Gln Leu Ala Lys Asn His Val Ala Leu His 115 120 125 Pro Asp Lys Lys Val Leu Val Val Ala Ala Asp Ile Ala Lys Tyr Gly 130 135 140 Leu Asn Ser Gly Gly Glu Pro Thr Gln Gly Ala Gly Ala Val Ala Met 145 150 155 160 Leu Val Ala Ser Glu Pro Arg Ile Leu Ala Leu Lys Glu Asp Asn Val 165 170 175 Met Leu Thr Gln Asp Ile Tyr Asp Phe Trp Arg Pro Thr Gly His Pro 180 185 190 Tyr Pro Met Val Asp Gly Pro Leu Ser Asn Glu Thr Tyr Ile Gln Ser 195 200 205 Phe Ala Gln Val Trp Asp Glu His Lys Lys Arg Thr Gly Leu Asp Phe 210 215 220 Ala Asp Tyr Asp Ala Leu Ala Phe His Ile Pro Tyr Thr Lys Met Gly 225 230 235 240 Lys Lys Ala Leu Leu Ala Lys Ile Ser Asp Gln Thr Glu Ala Glu Gln 245 250 255 Glu Arg Ile Leu Ala Arg Tyr Glu Glu Ser Ile Ile Tyr Ser Arg Arg 260 265 270 Val Gly Asn Leu Tyr Thr Gly Ser Leu Tyr Leu Gly Leu Ile Ser Leu 275 280 285 Leu Glu Asn Ala Thr Thr Leu Thr Ala Gly Asn Gln Ile Gly Leu Phe 290 295 300 Ser Tyr Gly Ser Gly Ala Val Ala Glu Phe Phe Thr Gly Glu Leu Val 305 310 315 320 Ala Gly Tyr Gln Asn His Leu Gln Lys Glu Thr His Leu Ala Leu Leu 325 330 335 Asp Asn Arg Thr Glu Leu Ser Ile Ala Glu Tyr Glu Ala Met Phe Ala 340 345 350 Glu Thr Leu Asp Thr Asp Ile Asp Gln Thr Leu Glu Asp Glu Leu Lys 355 360 365 Tyr Ser Ile Ser Ala Ile Asn Asn Thr Val Arg Ser Tyr Arg Asn 370 375 380 <210> 3 <211> 292 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 3 Met Thr Lys Lys Val Gly Val Gly Gln Ala His Ser Lys Ile Ile Leu 1 5 10 15 Ile Gly Glu His Ala Val Val Tyr Gly Tyr Pro Ala Ile Ser Leu Pro 20 25 30 Leu Leu Glu Val Glu Val Thr Cys Lys Val Val Ser Ala Glu Ser Pro 35 40 45 Trp Arg Leu Tyr Glu Glu Asp Thr Leu Ser Met Ala Val Tyr Ala Ser 50 55 60 Leu Glu Tyr Leu Asp Ile Thr Glu Ala Cys Val Arg Cys Glu Ile Asp 65 70 75 80 Ser Ala Ile Pro Glu Lys Arg Gly Met Gly Ser Ser Ala Ala Ile Ser 85 90 95 Ile Ala Ala Ile Arg Ala Val Phe Asp Tyr Tyr Gln Ala Asp Leu Pro 100 105 110 His Asp Val Leu Glu Ile Leu Val Asn Arg Ala Glu Met Ile Ala His 115 120 125 Met Asn Pro Ser Gly Leu Asp Ala Lys Thr Cys Leu Ser Asp Gln Pro 130 135 140 Ile Arg Phe Ile Lys Asn Val Gly Phe Thr Glu Leu Glu Met Asp Leu 145 150 155 160 Ser Ala Tyr Leu Val Ile Ala Asp Thr Gly Val Tyr Gly His Thr Arg 165 170 175 Glu Ala Ile Gln Val Val Gln Asn Lys Gly Lys Asp Ala Leu Pro Phe 180 185 190 Leu His Ala Leu Gly Glu Leu Thr Gln Gln Ala Glu Val Ala Ile Ser 195 200 205 Gln Lys Tyr Ala Glu Gly Leu Gly Leu Ile Phe Ser Gln Ala His Leu 210 215 220 His Leu Lys Glu Ile Gly Val Ser Ser Pro Glu Ala Asp Phe Leu Val 225 230 235 240 Glu Thr Ala Leu Ser Tyr Gly Ala Leu Gly Ala Lys Met Ser Gly Gly 245 250 255 Gly Leu Gly Gly Cys Ile Ile Ala Leu Val Thr Asn Leu Thr His Ala 260 265 270 Gln Glu Leu Ala Glu Arg Leu Glu Glu Lys Gly Ala Val Gln Thr Trp 275 280 285 Ile Glu Ser Leu 290 <210> 4 <211> 336 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 4 Met Ile Ala Val Lys Thr Cys Gly Lys Leu Tyr Trp Ala Gly Glu Tyr 1 5 10 15 Ala Ile Leu Glu Pro Gly Gln Leu Ala Leu Ile Lys Asp Ile Pro Ile 20 25 30 Tyr Met Arg Ala Glu Ile Ala Phe Ser Asp Ser Tyr Arg Ile Tyr Ser 35 40 45 Asp Met Phe Asp Phe Ala Val Asp Leu Arg Pro Asn Pro Asp Tyr Ser 50 55 60 Leu Ile Gln Glu Thr Ile Ala Leu Met Gly Asp Phe Leu Ala Val Arg 65 70 75 80 Gly Gln Asn Leu Arg Pro Phe Ser Leu Lys Ile Cys Gly Lys Met Glu 85 90 95 Arg Glu Gly Lys Lys Phe Gly Leu Gly Ser Ser Gly Ser Val Val Val 100 105 110 Leu Val Val Lys Ala Leu Leu Ala Leu Tyr Asn Leu Ser Val Asp Gln 115 120 125 Asn Leu Leu Phe Lys Leu Thr Ser Ala Val Leu Leu Lys Arg Gly Asp 130 135 140 Asn Gly Ser Met Gly Asp Leu Ala Cys Ile Val Ala Glu Asp Leu Val 145 150 155 160 Leu Tyr Gln Ser Phe Asp Arg Gln Lys Ala Ala Ala Trp Leu Glu Glu 165 170 175 Glu Asn Leu Ala Thr Val Leu Glu Arg Asp Trp Gly Phe Phe Ile Ser 180 185 190 Gln Val Lys Pro Thr Leu Glu Cys Asp Phe Leu Val Gly Trp Thr Lys 195 200 205 Glu Val Ala Val Ser Ser His Met Val Gln Gln Ile Lys Gln Asn Ile 210 215 220 Asn Gln Asn Phe Leu Ser Ser Ser Lys Glu Thr Val Val Ser Leu Val 225 230 235 240 Glu Ala Leu Glu Gln Gly Lys Ala Glu Lys Val Ile Glu Gln Val Glu 245 250 255 Val Ala Ser Lys Leu Leu Glu Gly Leu Ser Thr Asp Ile Tyr Thr Pro 260 265 270 Leu Leu Arg Gln Leu Lys Glu Ala Ser Gln Asp Leu Gln Ala Val Ala 275 280 285 Lys Ser Ser Gly Ala Gly Gly Gly Asp Cys Gly Ile Ala Leu Ser Phe 290 295 300 Asp Ala Gln Ser Ser Arg Asn Thr Leu Lys Asn Arg Trp Ala Asp Leu 305 310 315 320 Gly Ile Glu Leu Leu Tyr Gln Glu Arg Ile Gly His Asp Asp Lys Ser 325 330 335 <210> 5 <211> 317 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 5 Met Asp Arg Glu Pro Val Thr Val Arg Ser Tyr Ala Asn Ile Ala Ile 1 5 10 15 Ile Lys Tyr Trp Gly Lys Lys Lys Glu Lys Glu Met Val Pro Ala Thr 20 25 30 Ser Ser Ile Ser Leu Thr Leu Glu Asn Met Tyr Thr Glu Thr Thr Leu 35 40 45 Ser Pro Leu Pro Ala Asn Val Thr Ala Asp Glu Phe Tyr Ile Asn Gly 50 55 60 Gln Leu Gln Asn Glu Val Glu His Ala Lys Met Ser Lys Ile Ile Asp 65 70 75 80 Arg Tyr Arg Pro Ala Gly Glu Gly Phe Val Arg Ile Asp Thr Gln Asn 85 90 95 Asn Met Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gly Leu Ser 100 105 110 Ala Leu Val Lys Ala Cys Asn Ala Tyr Phe Lys Leu Gly Leu Asp Arg 115 120 125 Ser Gln Leu Ala Gln Glu Ala Lys Phe Ala Ser Gly Ser Ser Ser Arg 130 135 140 Ser Phe Tyr Gly Pro Leu Gly Ala Trp Asp Lys Asp Ser Gly Glu Ile 145 150 155 160 Tyr Pro Val Glu Thr Asp Leu Lys Leu Ala Met Ile Met Leu Val Leu 165 170 175 Glu Asp Lys Lys Lys Pro Ile Ser Ser Arg Asp Gly Met Lys Leu Cys 180 185 190 Val Glu Thr Ser Thr Thr Phe Asp Asp Trp Val Arg Gln Ser Glu Lys 195 200 205 Asp Tyr Gln Asp Met Leu Ile Tyr Leu Lys Glu Asn Asp Phe Ala Lys 210 215 220 Ile Gly Glu Leu Thr Glu Lys Asn Ala Leu Ala Met His Ala Thr Thr 225 230 235 240 Lys Thr Ala Ser Pro Ala Phe Ser Tyr Leu Thr Asp Ala Ser Tyr Glu 245 250 255 Ala Met Ala Phe Val Arg Gln Leu Arg Glu Lys Gly Glu Ala Cys Tyr 260 265 270 Phe Thr Met Asp Ala Gly Pro Asn Val Lys Val Phe Cys Gln Glu Lys 275 280 285 Asp Leu Glu His Leu Ser Glu Ile Phe Gly Gln Arg Tyr Arg Leu Ile 290 295 300 Val Ser Lys Thr Lys Asp Leu Ser Gln Asp Asp Cys Cys 305 310 315 <210> 6 <211> 182 <212> PRT <213> E. coli K12 MG1655 <400> 6 Met Gln Thr Glu His Val Ile Leu Leu Asn Ala Gln Gly Val Pro Thr 1 5 10 15 Gly Thr Leu Glu Lys Tyr Ala Ala His Thr Ala Asp Thr Arg Leu His 20 25 30 Leu Ala Phe Ser Ser Trp Leu Phe Asn Ala Lys Gly Gln Leu Leu Val 35 40 45 Thr 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ttccctaaaa atctgtggca aaatggaacg agaagggaaa 300 aagtttggtc taggttctag tggcagcgtc gttgtcttgg ttgtcaaggc tttactggct 360 ctctataatc tttcggttga tcagaatctc ttgttcaagc tgactagcgc tgtcttgctc 420 aagcgaggag acaatggttc catgggcgac cttgcctgta ttgtggcaga ggatttggtt 480 ctttaccagt catttgatcg ccagaaggcg gctgcttggt tagaagaaga aaacttggcg 540 acagttctgg agcgtgattg gggatttttt atctcacaag tgaaaccaac tttagaatgt 600 gatttcttag tgggatggac caaggaagtg gctgtatcga gtcacatggt ccagcaaatc 660 aagcaaaata tcaatcaaaa ttttttaagt tcctcaaaag aaacggtggt ttctttggtc 720 gaagccttgg agcaggggaa agccgaaaaa gttatcgagc aagtagaagt agccagcaag 780 cttttagaag gcttgagtac agatatttac acgcctttgc ttagacagtt gaaagaagcc 840 agtcaagatt tgcaggccgt tgccaagagt agtggtgctg gtggtggtga ctgtggcatc 900 gccctgagtt ttgatgcgca atcttctcga aacactttaa aaaatcgttg ggccgatctg 960 gggattgagc tcttatatca agaaaggata ggacatgacg acaaatcgta a 1011 <210> 22 <211> 954 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 22 atggatagag agcctgtaac agtacgttcc tacgcaaata 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gatgagtttt gatattgcca aatacccgac cctggcactg 60 gtcgactcca cccaggagtt acgactgttg ccgaaagaga gtttaccgaa actctgcgac 120 gaactgcgcc gctatttact cgacagcgtg agccgttcca gcgggcactt cgcctccggg 180 ctgggcacgg tcgaactgac cgtggcgctg cactatgtct acaacacccc gtttgaccaa 240 ttgatttggg atgtggggca tcaggcttat ccgcataaaa ttttgaccgg acgccgcgac 300 aaaatcggca ccatccgtca gaaaggcggt ctgcacccgt tcccgtggcg cggcgaaagc 360 gaatatgacg tattaagcgt cgggcattca tcaacctcca tcagtgccgg aattggtatt 420 gcggttgctg ccgaaaaaga aggcaaaaat cgccgcaccg tctgtgtcat tggcgatggc 480 gcgattaccg caggcatggc gtttgaagcg atgaatcacg cgggcgatat ccgtcctgat 540 atgctggtga ttctcaacga caatgaaatg tcgatttccg aaaatgtcgg cgcgctcaac 600 aaccatctgg cacagctgct ttccggtaag ctttactctt cactgcgcga aggcgggaaa 660 aaagttttct ctggcgtgcc gccaattaaa gagctgctca aacgcaccga agaacatatt 720 aaaggcatgg tagtgcctgg cacgttgttt gaagagctgg gctttaacta catcggcccg 780 gtggacggtc acgatgtgct ggggcttatc accacgctaa agaacatgcg cgacctgaaa 840 ggcccgcagt tcctgcatat catgaccaaa aaaggtcgtg gttatgaacc ggcagaaaaa 900 gacccgatca ctttccacgc cgtgcctaaa tttgatccct ccagcggttg tttgccgaaa 960 agtagcggcg gtttgccgag ctattcaaaa atctttggcg actggttgtg cgaaacggca 1020 gcgaaagaca acaagctgat ggcgattact ccggcgatgc gtgaaggttc cggcatggtc 1080 gagttttcac gtaaattccc ggatcgctac ttcgacgtgg caattgccga gcaacacgcg 1140 gtgacctttg ctgcgggtct ggcgattggt gggtacaaac ccattgtcgc gatttactcc 1200 actttcctgc aacgcgccta tgatcaggtg ctgcatgacg tggcgattca aaagcttccg 1260 gtcctgttcg ccatcgaccg cgcgggcatt gttggtgctg acggtcaaac ccatcagggt 1320 gcttttgatc tctcttacct gcgctgcata ccggaaatgg tcattatgac cccgagcgat 1380 gaaaacgaat gtcgccagat gctctatacc ggctatcact ataacgatgg cccgtcagcg 1440 gtgcgctacc cgcgtggcaa cgcggtcggc gtggaactga cgccgctgga aaaactacca 1500 attggcaaag gcattgtgaa gcgtcgtggc gagaaactgg cgatccttaa ctttggtacg 1560 ctgatgccag aagcggcgaa agtcgccgaa tcgctgaacg ccacgctggt cgatatgcgt 1620 tttgtgaaac cgcttgatga agcgttaatt ctggaaatgg ccgccagcca tgaagcgctg 1680 gtcaccgtag aagaaaacgc cattatgggc ggcgcaggca 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cagggaggac 840 aagacataca ttcatatcat cgaccagagg accaggaagc ctgtgcctac caagttctac 900 acagatccca tggtggtctt ccatcatgtc aatgcctacg aggaggacgg ctgtgtgctg 960 tttgatgtga tcgcctatga ggacagcagc ctctatcagc tcttctacct ggccaacctg 1020 aacaaggact tcgaggagaa gtccaggctg acctcagtgc ctaccctcag gaggtttgct 1080 gtgcccctcc atgtggacaa ggatgcagaa gtgggctcaa atttagtcaa ggtgtcatct 1140 acaactgcaa cagccctgaa ggagaaagac ggccatgtct attgccagcc cgaggtcctc 1200 tacgaaggcc tagagctccc tcggataaat tatgcttaca acgggaagcc atatcgctac 1260 atctttgcag ctgaagtaca gtggagtcca gtcccaacca agatactgaa atatgacatt 1320 ctcacaaagt cctccttaaa gtggtctgag gagagctgct ggccagcaga gcctctgttt 1380 gttcccacgc caggtgcgaa ggatgaagat gatggagtca ttttatcagc catcgtctct 1440 acggatcccc aaaagctgcc ttttttactc attctggatg ccaaaagttt tacggaactg 1500 gctcgcgcct ctgttgatgc ggacatgcac ctggaccttc atggtttatt tatcccagat 1560 gcagactgga atgcagtgaa gcagactcca gctgaaacgc aagaggttga aaactcagat 1620 catcccacag atccgacagc accagaactg agccacagtg aaaatgactt cacagcgggt 1680 catggtggct caagtcttta a 1701 <210> 34 <211> 1053 <212> DNA <213> Natronomonas pharaonis ATCC35678 <400> 34 atgagtaacg cgtcgctccg gccctccggg acggccagtg cgacactgtt ccggctggcg 60 ttcctcccgg gctgggctgt catcgcggcg acgacgggtg cgttcctcgt gggagcctca 120 ctacccctta cctaccaact catcccgctc gccgctagcg tggtcctgct cgggctccca 180 cacggcgctg tcgaccattt ggcgctcccg cggacccgaa acgagcgggt cacggttcga 240 tggcttgcgg ccatcggtgt cctctatgcc gttgtcggcg ggctctatgc ggcagtctgg 300 tttctcgcgc ccgtcggtgc cgtcgccgcg ttcattttta tgacgtgggt tcactggggc 360 caaggagaaa tctatccgct tgttgcgctc gctgacgccg accacctcga tgggcggctc 420 gaacgcggac tgacagccgc catccgcggc gcattgccga tgctcgtccc gtttgtcgcc 480 tttcccgacc agtacgagct cgtcgtgaca accctcgtcg ggctcttcga cgccgatgca 540 gcggcgacgg cggcggccgc gttcacgccg accgcacggc tcgcagtcgc ggtcaccgtc 600 ggggggttgg tggcggtcac cctcggtatt ggagctgtcg ctgccagcga gaccggctgg 660 gggccgtggc tgcttgatgc cggcgaaaca gggcttctga ttctgttctt tgcggcggtg 720 ccgccgattt tcgccatcgg cctctacttt tgtttctggc actcgcttcg ccacatcgtc 780 cggttgctcg ctgtcgataa ccgggcagca ccggcgctcg atggtcgccg atacggcgcg 840 gcgcttgcgc gctttgctcg ggatgcagcc ccgctgtcag cggcgtcgct cgtgttgctc 900 gggctgttgt atctagccgt gcccggcagc gtcgactcgc cgctttcgct tgtcgggacc 960 tacctcgtgt tgatagccgt gctcacgctc ccgcacgtgg tcgtcgtggc gtggatggac 1020 cacgaacagc ggctctggcg acccggagca tag 1053 <210> 35 <211> 855 <212> DNA <213> Halobacterium salinarum ATCC700922 <400> 35 atgccacacg gcgcgatcga ctacctcgcg ttgccccgcg cggtcacggg caccgtcacc 60 gtgcggtggc tggcggtcgt cggcgtcctc tacctcgtgc tcggtggtgg ctacgccgcc 120 gcgtggtttt tcgcgcccgt tcccgctgcg ttcgcgttcg tcgcgatcac gtggctgcac 180 tgggggcagg gcgacctcta cccgctgctc gacttcctcg acgtcgacta cctcgatacg 240 cgcccgcggc gcgcggcgac ggtcctgatc cggggtggcc tcccgatgct cgtgccgctg 300 ctcgggttcc cggagcggta ccgcagcgtc gtcgacgcgt tcgccgcgcc gttcggcggc 360 tccgtcggcg acctcgcggt gttcgacccg cgcgtccgcc tgtggctggg cgtcgcgttc 420 gcagccgcga ccgtcgcggt gctcgcggcg ggcagacgcc gcacccactc ccccggcgcg 480 tggcgcgtcg acgccgccga aaccctcctg ttgtgggtgt tcttcttcgt cgtgccgccg 540 gtgttcgccg tcggcgtcta cttctgcgtc tggcactcgg tccggcacgt cgcgcgcgcc 600 atcgccgtcg acggctcggt ccacccgtcg ctgcgcgcgg gcgacatcct cggaccgctg 660 gcccggttcg gcgtggaggc cgcgccgatg acggcggccg cgctcgcgtt gggcggcgtg 720 ctgtggtggg cggtacccaa cccgccgacc acgctcgaat ccggggccgc actctacctc 780 gtgttgatcg ccgtgctcac cctgccacac gtcgccgtgg tcacgtggat ggaccgcgtg 840 cagggcgtcc tctga 855 <210> 36 <211> 1080 <212> DNA <213> Halobacterium salinarum ATCC700922 <400> 36 atgagcaata ggtcgcagtt cgtcccgtcg tggctcgtgc cggaggcagc cggcgacctc 60 ccgttgaccg tgtcgcggct gtcactgctc gcgcttgccg ccgcgttcgc ggtcggatac 120 ggcgcgggct tcgcggtccc actggaggtc caggcgggcg tctacctgtt gggtatggtc 180 gcgatgaacc tcccgcacgg cggctacgag catttcgaga acctgcggcg acgggctgcc 240 tccttccagg gcaagtatat cgtcgcctac ctggtcggga tcgcggcgtt cggcgcgctg 300 tttttcgtcg cgcccgtcgc cggactgggg ctggcagtca cggtggccgt cgccaaaggt 360 gggttcggtg gcgtgcagtc gatggacgcc ctctacggaa ctgaccattt gcgcacgcgc 420 ccccagcggt ggctcgccgc cgtcgtccgg ggcggcgcgg tgatggtggt tcccatgttg 480 ttctggacgg acgtgttcta cgcgttcagc tcggtcatga tctcgatttt cgaccccagc 540 gccgtgtcgg cgctcggcgg tgacatcgca acccggcggc tcgtgctcgg cggcgggtac 600 ggggcgctcg tggtcgcaca cctggggctc ggctaccggc gggcggccgg caccgggtcg 660 ttcctcgccg acgccgccga gacgctgctg ttgatcgcgt acttcgcgct cgttccggtg 720 gtcatcgccg tcgggctgta cttcccgctg tggtactcgg cccgccaggt ggcccgatcg 780 tcggccgtcg acgacacggc gatgacgcag gcagacgcca ccggcatgct tgacgccctg 840 gacgccgacg acccggcgcg cgccacgctt gcctcgtggg cggtgctcat cgtcggcagc 900 gtcgccacgt tcggcctggc ggccgtgctc tggctgctgt ccccacagcc cctgggtggt 960 ggtgggatcc tcgtgggctt ggtcgcgttc tggagcatct tcgtgagcat catcgcgctc 1020 ccgcacgtcg tcgtcggcgg gtggcttgac cgcactcgcg gcatctggta cgtcccataa 1080 1080 <210> 37 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 37 cgagctcagg agcatttaga tgttgaaaac agtagttatt attg 44 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 38 gcccggggtg gcctgaaacg gctacc 26 <210> 39 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 39 gcccgggagg agttaaagaa atgacaattg 30 <210> 40 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 40 cggatccctt agtttcgata agagcgaac 29 <210> 41 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 41 cggtaccaat gacaaaaaaa gttggtgtcg g 31 <210> 42 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 42 ttctagatta cgatttgtcg tcatgtcc 28 <210> 43 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 43 ccccgggagg agagaaatta tgcaaacgga ac 32 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 44 tgcatgctta tttaagctgg gtaaatg 27 <210> 45 <211> 2999 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pSTV28 vector sequence <400> 45 cgtatggcaa tgaaagacgg tgagctggtg atatgggata gtgttcaccc ttgttacacc 60 gttttccatg agcaaactga aacgttttca tcgctctgga gtgaatacca cgacgatttc 120 cggcagtttc tacacatata ttcgcaagat gtggcgtgtt acggtgaaaa cctggcctat 180 ttccctaaag ggtttattga gaatatgttt ttcgtctcag ccaatccctg ggtgagtttc 240 accagttttg atttaaacgt ggccaatatg gacaacttct tcgcccccgt tttcaccatg 300 ggcaaatatt atacgcaagg cgacaaggtg ctgatgccgc tggcgattca ggttcatcat 360 gccgtctgtg atggcttcca tgtcggcaga atgcttaatg aattacaaca gtactgcgat 420 gagtggcagg gcggggcgta atttttttaa ggcagttatt ggtgccctta aacgcctggt 480 gctacgcctg aataagtgat aataagcgga tgaatggcag aaattcgaaa gcaaattcga 540 cccggtcgtc ggttcagggc agggtcgtta aatagccgct tatgtctatt gctggtttac 600 cggtttattg actaccggaa gcagtgtgac cgtgtgcttc tcaaatgcct gaggccagtt 660 tgctcaggct ctccccgtgg aggtaataat tgacgatatg atcatttatt ctgcctccca 720 gagcctgata aaaacggtta gcgcttcgtt aatacagatg taggtgttcc acagggtagc 780 cagcagcatc ctgcgatgca gatccggaac ataatggtgc agggcgcttg tttcggcgtg 840 ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg ctgccggcac ctgtcctacg 900 agttgcatga taaagaagac agtcataagt gcggcgacga tagtcatgcc ccgcgcccac 960 cggaaggagc taccggacag cggtgcggac tgttgtaact cagaataaga aatgaggccg 1020 ctcatggcgt tccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca 1080 gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga 1140 gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt 1200 gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgaat 1260 tcgagctcgg tacccgggga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag cttggcactg 1320 gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact taatcgcctt 1380 gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac cgatcgccct 1440 tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgagcttatc gatgataagc tgtcaaacat 1500 gagaattaca acttatatcg tatggggctg acttcaggtg ctacatttga agagataaat 1560 tgcactgaaa tctagaaata ttttatctga ttaataagat gatcttcttg agatcgtttt 1620 ggtctgcgcg taatctcttg ctctgaaaac gaaaaaaccg ccttgcaggg cggtttttcg 1680 aaggttctct gagctaccaa ctctttgaac cgaggtaact ggcttggagg agcgcagtca 1740 ccaaaacttg tcctttcagt ttagccttaa ccggcgcatg acttcaagac taactcctct 1800 aaatcaatta ccagtggctg ctgccagtgg tgcttttgca tgtctttccg ggttggactc 1860 aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcggactga acggggggtt cgtgcataca 1920 gtccagcttg gagcgaactg cctacccgga actgagtgtc aggcgtggaa tgagacaaac 1980 gcggccataa cagcggaatg acaccggtaa accgaaaggc aggaacagga gagcgcacga 2040 gggagccgcc aggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccaccactg 2100 atttgagcgt cagatttcgt gatgcttgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacggctt 2160 tgccgcggcc ctctcacttc cctgttaagt atcttcctgg catcttccag gaaatctccg 2220 ccccgttcgt aagccatttc cgctcgccgc agtcgaacga ccgagcgtag cgagtcagtg 2280 agcgaggaag cggaatatat cctgtatcac atattctgct gacgcaccgg tgcagccttt 2340 tttctcctgc cacatgaagc acttcactga caccctcatc agtgccaaca tagtaagcca 2400 gtatacactc cgctagcgct gatgtccggc ggtgcttttg ccgttacgca ccaccccgtc 2460 agtagctgaa caggagggac agctgataga aacagaagcc actggagcac ctcaaaaaca 2520 ccatcataca ctaaatcagt aagttggcag catcacccga cgcactttgc gccgaataaa 2580 tacctgtgac ggaagatcac ttcgcagaat aaataaatcc tggtgtccct gttgataccg 2640 ggaagccctg ggccaacttt tggcgaaaat gagacgttga tcggcacgta agaggttcca 2700 actttcacca taatgaaata agatcactac cgggcgtatt ttttgagtta tcgagatttt 2760 caggagctaa ggaagctaaa atggagaaaa aaatcactgg atataccacc gttgatatat 2820 cccaatggca tcgtaaagaa cattttgagg catttcagtc agttgctcaa tgtacctata 2880 accagaccgt tcagctggat attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa aataagcaca 2940 agttttatcc ggcctttatt cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat ccggaattt 2999 <210> 46 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 46 ccccgggagg agagaaatta tgcaaacgga ac 32 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 47 tgcatgctta tttaagctgg gtaaatg 27 <210> 48 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 48 ccggaattca taatgagttt tgatattgcc 30 <210> 49 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 49 ctcctcgagt acgtatcatt atgccagcca ggccttg 37 <210> 50 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 50 ctcatgacgg tctgcgcaaa aaaacacgtt c 31 <210> 51 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 51 ggaattctta actgacggca gcgagttttt tg 32 <210> 52 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 52 cgaattcagg agcgactaca tgaaaccaac tacgg 35 <210> 53 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 53 ggagctctta gagcgggcgc tgccagagat g 31 <210> 54 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 54 ggtcgacagg aggatcggga tgaccgcgag ac 32 <210> 55 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 55 gctgcagtta tgcgcgggtt cctgcaaatg 30 <210> 56 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 56 gactagtgaa ttcaggaggt aataaatatg g 31 <210> 57 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 57 cactagttag tttttgattt tg 22 <210> 58 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 58 gactagtagg agcggttcca tggagataat atttg 35 <210> 59 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 59 catggtggct caagtcttta actagtc 27 <210> 60 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 60 gactagtagg aggccgagta tgagtaacgc gtc 33 <210> 61 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 61 ctctggcgac ccggagcata actagtc 27 <210> 62 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 62 gactagtagg aggtgttcgg catgccacac gg 32 <210> 63 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 63 gaccgcgtgc agggcgtcct ctaactagtc 30 <210> 64 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 64 gactagtagg aggtattcat atgagcaata ggtc 34 <210> 65 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 65 cggcatctgg tacgtcccat aactagtc 28

Claims (9)

1. 서열번호 1의 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 유래의 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제/하이드록시메틸글루타릴 (HMG)-CoA 리덕타제를 코딩하는 유전자, 서열번호 2의 엔테로코커스 패칼리스 유래의 HMG-CoA 신타제를 코딩하는 유전자, 서열번호 3의 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 메발로네이트 키나제를 코딩하는 유전자, 서열번호 4의 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 포스포메발로네이트 키나제를 코딩하는 유전자, 서열번호 5의 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제를 코딩하는 유전자, 서열번호 6의 대장균 유래의 이소펜테닐 디포스페이트 (IPP) 이소머라제를 코딩하는 유전자, 서열번호 7의 판토에아 아글루메란스 (Pantoea agglomerans) 유래의 제라닐제라닐 피로포스페이트 (GGPP) 신타제를 코딩하는 유전자, 서열번호 8의 판토에아 아글루메란스 유래의 피토엔 신타제를 코딩하는 유전자, 서열번호 9의 판토에아 아글루메란스 유래의 피토엔 데히드로게나제를 코딩하는 유전자, 서열번호 10의 판토에아 아나나티스 (Pantoea ananatis) 유래의 라이코펜-β-시클라제를 코딩하는 유전자 및 서열번호 11의 대장균 유래 1-데옥시자일룰로즈-5-포스페이트 (DXP) 신타제를 코딩하는 유전자로 형질전환되고, 이소프레노이드를 생산하는 에세리키아 속 미생물.
2. 제1항에 있어서, 서열번호 12의 헤마토코커스 플루비알리스 (Haematococcus pluvialis) 유래의 IPP 이소포머레제를 코딩하는 유전자로 추가적으로 형질전환된, 이소프레노이드를 생산하는 에세리키아 속 미생물.
3. 제1항에 있어서, 서열번호 13의 배양되지 않은 해양 박테리아 (uncultured marine bacterium) 66A03 유래의 β-카로틴 모노옥시게나제를 코딩하는 유전자, 서열번호 14의 생쥐 (Mus musculus) 유래의 β-카로틴 15,15'-모노옥시게나제를 코딩하는 유전자, 서열번호 15의 나트로노모나스 파라오니스 (Natronomonas pharaonis) ATCC35678 유래의 brp 유사 단백질 2 (brp-like protein 2)을 코딩하는 유전자, 및 서열번호 16 또는 17의 할로박테리움 살리나룸 (Halobacterium salinarum) ATCC700922 유래의 β-카로틴 모노옥시게나제를 코딩하는 유전자로 이루어진 군으로 선택되는 하나 이상의 유전자로 더 형질전환된 것인 미생물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 제1항에 있어서, 상기 미생물은 기탁번호 KCTC 11254BP로 기탁된 대장균 DH5α/pTDHB/pSNA 또는 기탁번호 KCTC 11255BP로 기탁된 대장균 DH5α/pTDHBSR/pSNA인 것을 특징으로 하는 미생물.
8. 제1항에 있어서, 상기 이소프레노이드는 β-카로틴, 레티날, 레티놀, 레티닐 아세테이트 및 레틴산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 미생물.
9. 제1항 내지 제3항, 제7항 및 제8항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배양하는 단계; 및

   배양물로부터 이소프레노이드를 분리하는 단계;를 포함하는, 에세리키아 속 미생물로부터 이소프레노이드를 생산하는 방법.

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