KR102636404B1 - 터펜 알코올 또는 그 유도체의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 Nudix 계열의 효소를 종래 알려지지 않은 기질인 파네실 파이로포스페이트와 반응시켜 터펜 알코올 또는 그 유도체를 제조할 수 있어, 다양한 기질로부터 터펜 알코올을 제조할 수 있어, 터펜 알코올 또는 그 유도체를 복합체의 형태로 제조할 수 있는 터펜 알코올 또는 그 유도체의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

터펜 알코올 또는 그 유도체의 제조 방법{PREPARING METHOD FOR TERPENE ALCOHOL OR ITS DERIVATIVES}
본 발명은 터펜 알코올 또는 그 유도체의 제조 방법에 관한 것이다.
터펜(테르펜, terpene)은 가연성의 불포화 탄화수소로 (C5H8)n 조성의 탄화수소 및 그 유도체를 총칭하는 것으로, n의 수에 의해 표시 명칭으로 부르고, 탄소 골격의 사슬 모양, 고리 모양에 의해 사슬식 테르펜 및 고리 모양 테르펜으로 또 성질에 의해 테르펜탄화수소, 테르펜알코올, 테르펜알데히드, 테르펜케톤 등으로 나뉜다.
터펜은 향료, 의약품, 화장품, 가습기 살균제 등의 원료로 사용되는 것으로, 천연 유기 화합물 화학의 한 분야를 이루고 있다.
이러한 테르펜의 생합성 경로 중 하나로는 메발로네이트 경로(mevalonate pathway)의 중간 산물인 디메틸알릴 파이로포스페이트(DMAPP) 또는 이소펜테닐 파이로포스페이트(IPP)를 Nudix 계열의 효소와 반응시켜 프레놀과 이소프레놀을 생성하는 방법이 알려져 있다.
그러나, 상기 방법으로는 IPP와 DMAPP만을 기질로 사용하여 2종의 터펜 알코올을 얻을 수 있을 뿐인데, 방향제, 향수 등은 단일 물질이 아닌 다양한 향기 물질의 조합으로 얻어지는 바, 상기 방법으로는 방향제, 향수 등의 제조를 위해 다양한 추가 향기 물질을 조합해야 하는 문제가 있다.
Synthetic pathway for production of five-carbon alcohols from isopentenyl diphosphate (Chou, Keasling. Appl Environ Microbiol. 2012 Nov;78(22):7849-55. doi: 10.1128/AEM.01175-12. Epub 2012 Aug 31.)
본 발명은 디메틸알릴 파이로포스페이트 및 이소펜테닐 파이로포스페이트 외에 다른 기질을 사용할 수 있는 Nudix 계열의 효소를 이용한 터펜 알코올 또는 그 유도체의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 터펜 알코올 또는 그 유도체의 제조 방법은 Nudix 계열의 효소를 파네실 파이로포스페이트와 반응시켜 파네솔을 얻는 단계를 포함한다.
Nudix 계열(Nudix family, Nucleoside Diphosphate linked to X)의 효소는 포스포하이드롤라제(phosphohydrolases)의 단백질 패밀리로서 다양한 파이로포스페이트를 기질로 사용할 수 있다.
본 명세서에서 Nudix 계열의 효소는 Nudix 계열에 속하는 것이라면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 NudA, NudB, NudC, NudD, NudE, NudF, NudG, NudH, NudI, NudJ, NudK, NudL 등일 수 있으며, 구체적으로 NudB (dihydroneopterin triphosphate pyrophosphohydrolase, DHNTPase)일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 NudB는 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 바람직하게는 상동성 80% 이상, 보다 바람직하게는 상동성 90% 이상, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에서 파네실 파이로포스페이트(Farnesyl pyrophosphate, Farnesyl diphosphate)는 HMG-CoA 리덕타제 경로(HMG-CoA reductase pathway)의 중간산물로서, 제라닐 파이로포스페이트를 파네실 파이로포스페이트 신타제(ispA)와 반응시켜 얻어지는 것일 수 있다.
본 발명자는 Nudix 계열의 효소가 파네실 파이로포스페이트를 기질로 사용할 수 있음을 발견한 것에 착안하여 본 발명을 고안한 것으로서, 본 발명의 방법은 Nudix 계열의 효소를 파네실 파이로포스페이트와 반응시키는 단계를 포함함으로써, C15 터펜 알코올인 파네솔(farnesol)을 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 Nudix 계열의 효소를 파네실 파이로포스페이트와의 반응은 미생물 내에서 수행될 수 있다.
상기 미생물은 원핵 세포 또는 진핵 세포로 액체 배지에서 배양될 수 있는 것일 수 있다. 상기 미생물은 예를 들면, 박테리아, 곰팡이, 또는 이들의 조합일 수 있다. 박테리아는 그람 양성 박테리아, 그람 음성 박테리아, 또는 이들의 조합일 수 있다. 그람 음성 박테리아는 에세리키아 (Escherichia) 속일 수 있다. 그람 양성 박테리아는 바실러스 속, 코리네박테리움 속, 액티노마이세스 속, 유산균 또는 이들의 조합일 수 있다. 곰팡이는 효모, 클루베로마이세스 속, 또는 이들의 조합일 수 있다.
에세리키아 속 미생물은 대장균일 수 있고, 구체적으로 DH5α, MG1655, BL21(DE), S17-1, XL1-Blue, BW25113 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 미생물은 Nudix 계열의 효소를 내재적으로 또는 형질전환에 의해 발현시키는 것일 수 있다. 그러한 경우, 미생물 내에서 Nudix 계열의 효소가 생성되어 상기 Nudix 계열의 효소와 파네실 파이로포스페이트의 미생물 내에서의 반응에 의해 제라니올의 생산이 연속적으로 수행될 수 있다.
상기 미생물이 Nudix 계열의 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환되어 Nudix 계열의 효소를 발현시키는 경우, 상기 미생물은 당 분야에 공지된 Nudix 계열의 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환된 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 에셰리키아 콜라이 유래의 NudB 효소의 서열번호 1의 아미노산 서열과 70% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 코딩하는 유전자, 바람직하게는 상동성 80% 이상, 보다 바람직하게는 상동성 90% 이상, 가장 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자로 형질전환된 것일 수 있다.
에셰리키아 콜라이 유래의 NudB 효소를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열(NCBI, Gene ID: 946383)을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 터펜 알코올 또는 그 유도체의 제조 방법은 상기 파네솔을 알코올 탈수소화 효소와 반응시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 파네솔을 알코올 탈수소화 효소와 반응시키면 파네살(Farnesal)이 얻어질 수 있다.
상기 알코올 탈수소화 효소는 알코올을 탈수소화 할 수 있는 효소라면 당 분야에 공지된 것이 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 에셰리키아 콜라이 유래의 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 yjgB일 수 있다.
에셰리키아 콜라이 유래의 yjgB를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열(NCBI, Gene ID: 948802)을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 파네솔과 알코올 탈수소화 효소의 반응은 미생물 내에서 수행될 수 있다.
상기 미생물은 알코올 탈수소화 효소를 내재적으로 또는 형질전환에 의해 발현시키는 것일 수 있다.
상기 미생물이 알코올 탈수소화 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환되어 알코올 탈수소화 효소를 발현시키는 경우, 상기 미생물은 당 분야에 공지된 알코올 탈수소화 효소를 코딩하는 유전자로 형질전환된 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 서열번호 3의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자로 형질전환된 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 터펜 알코올 또는 그 유도체의 제조 방법은 상기 파네솔을 아세틸 트랜스퍼라제(acetyl transferase) 및 코엔자임 A와 반응시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 파네솔을 아세틸 트랜스퍼라제 및 코엔자임 A와 반응시키면 파네실 아세테이트(farnesyl acetate)가 얻어질 수 있다.
상기 아세틸 트랜스퍼라제는 당 분야에 공지된 아세틸 트랜스퍼라제를 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들면 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(Chloramphenicol acetyltransferase)일 수 있다. 보다 구체적으로 pSTV28 (Takara Co.) 발현벡터(서열번호 30의 뉴클레오티드 서열)의 항생제 마커 유래의 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제일 수 있다.
pSTV28 (Takara Co.) 발현벡터의 항생제 마커 유래의 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자는 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 코엔자임 A는 아세틸 트랜스퍼라제의 기질로 사용될 수 있는 것이라면 당 분야에 공지된 코엔자임 A를 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 아세틸-CoA일 수 있고, 보다 구체적으로는 에셰리키아 콜라이 유래의 아세틸-CoA일 수 있다.
또한, 본 발명의 터펜 알코올 또는 그 유도체의 제조 방법은 상기 Nudix 계열의 효소를 이소펜테닐 파이로포스페이트 또는 디메틸알릴 파이로포스페이트와 반응시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
이소펜테닐 파이로포스페이트 및 디메틸알릴 파이로포스페이트는 메틸에리스리톨 4-포스페이트 경로(Methylerythritol 4-phosphate (MEP) pathway) 또는 메발로네이트 경로(Mevalonate pathway)의 산물이다.
Nudix 계열의 효소를 이소펜테닐 파이로포스페이트와 반응시킴으로써 C5 터펜 알코올인 이소프레놀을 얻을 수 있고, Nudix 계열의 효소를 디메틸알릴 파이로포스페이트와 반응시킴으로써 C5 터펜 알코올인 프레놀을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 Nudix 계열의 효소와 이소펜테닐 파이로포스페이트 또는 디메틸알릴 파이로포스페이트의 반응에서의 미반응 이소펜테닐 파이로포스페이트 또는 디메틸알릴 파이로포스페이트를 제라닐 파이로포스페이트 신타제와 반응시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
제라닐 파이로포스페이트 신타제는 이소펜테닐 파이로포스페이트 또는 디메틸알릴 파이로포스페이트의 제라닐 파이로포스페이트로의 전환을 촉매하는 것이라면 당 분야에 공지된 제라닐 파이로포스페이트 신타제가 사용될 수 있으며, 예를 들면 에셰리키아 콜라이 유래의 파네실 파이로포스페이트 신타제의 아미노산 서열 80번의 세린을 페닐알라닌으로 치환해서 제라닐 파이로포스페이트 신타제로 변형시킨 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
에셰리키아 콜라이 유래의 파네실 파이로포스페이트 신타제의 아미노산 서열 80번의 세린이 페닐알라닌으로 치환된 제라닐 파이로포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자(ispAS80F)는 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 상기 Nudix 계열의 효소와 이소펜테닐 파이로포스페이트 또는 디메틸알릴 파이로포스페이트에서의 미반응 이소펜테닐 파이로포스페이트 또는 디메틸알릴 파이로포스페이트를 파네실 파이로포스페이트 신타제와 반응시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
파네실 파이로포스페이트 신타제는 제라닐 파이로포스페이트로의 파네실 파이로포스페이트로의 전환을 촉매하는 것이라면 당 분야에 공지된 파네실 파이로포스페이트 신타제가 사용될 수 있으며, 보다 구체적으로, 에셰리키아 콜라이 유래의 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 에셰리키아 콜라이 유래의 파네실 파이로포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 갖는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 Nudix 계열의 효소와 이소펜테닐 파이로포스페이트 또는 디메틸알릴 파이로포스페이트의 반응은 미생물 내에서 수행될 수 있다.
상기 미생물은 메발로네이트 경로의 효소들을 내재적으로 또는 형질전환에 의해 발현시키는 것일 수 있다.
상기 메발로네이트 경로의 효소는 당 분야에 널리 알려진 것으로서, 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제, 하이드록시메틸글루타릴(HMG)-CoA 신타제, HMG-CoA 리덕타제, 메발로네이트 키나제, 포스포메발로네이트 키나제 및 메발로네이트 파이로포스페이트 데카르복실라제, IPP 이소머라제가 있다.
상기 미생물은 메발로네이트 경로의 효소들을 형질전환에 의해 발현시키는 경우, 상기 미생물은 상기 효소들을 코딩하는 당 분야에 공지된 유전자로 형질전환된 것일 수 있고, 예를 들면, 서열번호 11의 엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 유래의 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제/하이드록시메틸글루타릴 (HMG)-CoA 리덕타제의 아미노산 서열, 서열번호 12의 엔테로코커스 패칼리스 유래의 HMG-CoA 신타제의 아미노산 서열, 서열번호 13의 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 메발로네이트 키나제의 아미노산 서열, 서열번호 14의 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 포스포메발로네이트 키나제의 아미노산 서열, 서열번호 15의 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제의 아미노산 서열, 서열번호 16의 에셰리키아 콜라이 (Escherichia coli) 유래의 IPP 이소머라제의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자로 형질전환된 것일 수 있다.
엔테로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis) 유래의 아세틸-CoA 아세틸트란스퍼라제/하이드록시메틸글루타릴 (HMG)-CoA 리덕타제를 코딩하는 유전자는 서열번호 17의 뉴클레오티드 서열, 엔테로코커스 패칼리스 유래의 HMG-CoA 신타제를 코딩하는 유전자는 서열번호 18의 뉴클레오티드 서열, 스트렙토코커스 뉴모니애 (Streptococcus pneumoniae) 유래의 메발로네이트 키나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 19의 뉴클레오티드 서열, 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 포스포메발로네이트 키나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 20의 뉴클레오티드 서열, 스트렙토코커스 뉴모니애 유래의 메발로네이트 디포스페이트 데카르복실라제를 코딩하는 유전자는 서열번호 21의 뉴클레오티드 서열, 에셰리키아 콜라이 유래의 IPP 이소머라제를 코딩하는 유전자는 서열번호 22의 뉴클레오티드 서열(NCBI, Gene ID: 949020)을 갖는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 미생물의 IPP 이소머라제의 발현량을 조절하여 프레놀과 이소프레놀의 생산량을 조절할 수 있다.
구체적으로, IPP 이소머라제는 IPP의 DMAPP로의 전환을 촉매하므로, IPP 이소머라제의 발현량을 늘려 DMAPP 생산량을 늘리고, 이에 따라 프레놀 생산량을 늘릴 수 있다. 반대로, IPP 이소머라제의 발현량을 줄여 IPP의 량을 늘리고, 이에 따라 이소프레놀의 생산량을 늘릴 수 있다.
또한, 상기 미생물은 제라닐 파이로포스페이트 신타제를 내재적으로 또는 형질전환에 의해 발현시키는 것일 수 있다. 그러한 경우, 미반응 이소펜테닐 파이로포스페이트 및 디메틸알릴 파이로포스페이트가 제라닐 파이로포스페이트 신타제와 반응하여 제라닐 파이로포스페이트가 얻어지고, 이는 추가로 상기 Nudix 계열의 효소와 반응하여, C10 터펜 알코올인 제라니올이 생성될 수 있다.
상기 미생물이 제라닐 파이로포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자로 형질전환되어 제라닐 파이로포스페이트 신타제를 발현시키는 경우, 상기 미생물은 당 분야에 공지된 제라닐 파이로포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 대장균 유래의 파네실 파이로포스페이트 신타제의 아미노산 서열 80번의 세린을 페닐알라닌으로 치환해서 제라닐 파이로포스페이트 신타제로 변형시킨 서열번호 7의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자(ispAS80F)로 형질전환된 것일 수 있다.
또한, 상기 미생물은 파네실 파이로포스페이트 신타제를 내재적으로 또는 형질전환에 의해 발현시키는 것일 수 있다.
그러한 경우, 미반응 이소펜테닐 파이로포스페이트 및 디메틸알릴 파이로포스페이트가 파네실 파이로포스페이트 신타제와 반응하여 파네실 파이로포스페이트가 얻어지고, 이는 추가로 상기 Nudix 계열의 효소와 반응하여, 파네솔이 보다 많이 생성될 수 있다.
상기 미생물이 파네실 파이로포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자로 형질전환되어 파네실 파이로포스페이트 신타제를 발현시키는 경우, 상기 미생물은 당 분야에 공지된 파네실 파이로포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 것일 수 있고, 보다 구체적으로, 대장균 유래의 서열번호 9의 아미노산 서열을 코딩하는 유전자로 형질전환된 것일 수 있다.
상기 대장균 유래의 파네실 파이로포스페이트 신타제를 코딩하는 유전자는 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 가진 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 터펜 알코올 또는 그 유도체의 제조 방법은 상기 Nudix 계열의 효소와 이소펜테닐 파이로포스페이트 또는 디메틸알릴 파이로포스페이트와의 반응 생성물을 아세틸 트랜스퍼라제(acetyl transferase) 및 코엔자임 A와 반응시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 Nudix 계열의 효소와 이소펜테닐 파이로포스페이트 또는 디메틸알릴 파이로포스페이트의 반응 생성물인 이소프레놀과 프레놀을 아세틸 트랜스퍼라제 및 코엔자임 A와 반응시키면 각각 이소프레닐 아세테이트(isoprenyl acetate)와 프레닐 아세테이트(prenyl acetate)가 얻어질 수 있다.
상기 아세틸 트랜스퍼라제는 당 분야에 공지된 아세틸 트랜스퍼라제를 제한 없이 사용할 수 있으며, 예를 들면 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(Chloramphenicol acetyltransferase)일 수 있다. 보다 구체적으로 pSTV28 (Takara Co.) 발현벡터의 항생제 마커 유래의 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제일 수 있다.
상기 코엔자임 A는 아세틸 트랜스퍼라제의 기질로 사용될 수 있는 것이라면 당 분야에 공지된 코엔자임 A를 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 아세틸-CoA일 수 있고, 보다 구체적으로는 에셰리키아 콜라이 유래의 아세틸-CoA일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 상기 파네솔과 아세틸 트랜스퍼라제 및 코엔자임 A의 반응은 미생물 내에서 수행될 수 있다.
상기 미생물은 아세틸 트랜스퍼라제를 내재적으로 또는 형질전환에 의해 발현시키는 것일 수 있다.
상기 미생물이 아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자로 형질전환되어 아세틸 트랜스퍼라제를 발현시키는 경우, 상기 미생물은 당 분야에 공지된 아세틸 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 것일 수 있고, 보다 구체적으로, pSTV28 (Takara Co.) 발현벡터의 항생제 마커 유래의 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 것일 수 있다.
상기 미생물은 코엔자임 A를 내재적으로 또는 형질전환에 의해 발현시키는 것일 수 있다.
코엔자임 A의 경우, 통상 미생물 세포 내에 풍부하게 존재하고, 구체적으로 아세틸-CoA가 매우 풍부하게 존재하므로, 통상 별도의 형질전환 없이 상기 반응의 수행이 가능하다.
본 발명에 있어서, 전술한 각 단계들은 서로 독립적으로 수행될 수도 있고, 그 일부 또는 전부가 미생물 내에서 수행될 수 있다. 그 일부 또는 전부가 미생물 내에서 수행되는 경우에는 미생물은 각 단계에 필요한 효소를 코딩하는 유전자들로 형질전환된 것일 수 있고, 그러한 경우 전술한 일부 또는 전부의 터펜 알코올 및 그 유도체를 생산할 수 있으며, 전술한 각 단계가 모두 미생물 내에서 수행되는 경우에는 그 미생물은 프레놀, 프레닐 아세테이트, 이소프레놀, 이소프레닐 아세테이트, 제라니올, 시트랄 및 제라닐 아세테이트를 모두 생산할 수 있다.
전술한 반응들이 미생물 내에서 수행되는 경우, 미생물은 탄소원의 존재 하에서 해당 미생물에 적합한 배양 조건으로 배양될 수 있다.
배양은 합성, 반합성, 또는 복합 배양 배지에서 이루어질 수 있다. 배양 배지로는 탄소원, 질소원, 비타민 및 미네랄로 구성된 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, MRS (Man-Rogosa-Sharp) 액체 배지 또는 우유가 첨가된 액체 배지를 사용할 수 있다.
배지의 탄소원으로는 전분, 포도당, 자당, 갈락토스, 과당, 글리세롤, 글루코스 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 예를 들면, 글리세롤이 탄소원으로 사용될 수 있다. 질소원으로는 황산암모늄, 질산암모늄, 질산나트륨, 글루탐산, 카사미노산, 효모추출물, 펩톤, 트립톤, 대두박 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다. 미네랄은 염화나트륨, 인산제이칼륨, 황산마그네슘 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다.
배양이 발효조에서 이루어지는 경우 글루코스를 배지의 탄소원으로 사용하는 것이 좋다. 시험관 배양의 경우에는 글리세롤을 배지의 탄소원으로 사용하는 것이 좋다.
미생물 배양 배지 내 상기 탄소원, 질소원 및 미네랄 각각은 예를 들면, 리터당 10 내지 100 g, 5 내지 40 g 및 0.5 내지 4 g을 이용할 수 있다.
상기의 통상의 배양 배지에 첨가되는 비타민은 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 비타민은 통상의 배양 배지에 상기에서 언급된 탄소원, 질소원, 미네랄 등과 함께 첨가되거나, 멸균하여 준비된 배지에 별도로 첨가될 수 있다.
배양은 통상의 미생물 배양 조건으로 수행될 수 있다. 배양은 예를 들어 약 15-45℃, 예를 들면, 15-44℃, 15-43℃, 15-42℃, 15-41℃, 15-40℃, 15-39℃, 15-38℃, 15-37℃, 15-36℃, 15-35℃, 15-34℃, 15-33℃, 15-32℃, 15-31℃, 15-30℃, 20-45℃, 20-44℃, 20-43℃, 20-42℃, 20-41℃, 20-40℃, 20-39℃, 20-38℃, 20-37℃, 20-36℃, 20-35℃, 20-34℃, 20-33℃, 20-32℃, 20-31℃, 20-30℃, 25-45℃, 25-44℃, 25-43℃, 25-42℃, 25-41℃, 25-40℃, 25-39℃, 25-38℃, 25-37℃, 25-36℃, 25-35℃, 25-34℃, 25-33℃, 25-32℃, 25-31℃, 25-30℃, 27-45℃, 27-44℃, 27-43℃, 27-42℃, 27-41℃, 27-40℃, 27-39℃, 27-38℃, 27-37℃, 27-36℃, 27-35℃, 27-34℃, 27-33℃, 27-32℃, 27-31℃ 또는 27-30℃에서 수행될 수 있다.
배양액 중의 배양 배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하거나 제거하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며 이러한 단계는 당업자의 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동하거나 냉동건조하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.
배양의 일 예에 있어서, 배양은 탄소원으로서 글리세롤을 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다. 글리세롤은 배지 중의 유일한 탄소원일 수 있다. 0.5-5.0%(w/v), 예를 들면, 0.5-4.5%(w/v), 0.5-4.0%(w/v), 0.5-3.5%(w/v), 0.5-3.0%(w/v), 0.5-2.5%(w/v), 0.5-2.0%(w/v), 1-5.0%(w/v), 1-4.5%(w/v), 1-4.0%(w/v), 1-3.5%(w/v), 1-3.0%(w/v) 또는 1-2.5%(w/v)의 글리세롤을 포함하는 배지에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 배지는 글리세롤 및 아라비노스가 첨가된 YT 배지일 수 있다. YT 배지는 1.6중량% 트립톤, 1중량% 효모 추출물 및 0.5 중량% NaCl을 포함할 수 있다.
본 발명은 Nudix 계열의 효소를 종래 알려지지 않은 기질인 제라닐 파이로포스페이트와 반응시켜 터펜 알코올 또는 그 유도체를 제조할 수 있다.
본 발명은 Nudix 계열의 효소를 이용하여 다양한 기질로부터 터펜 알코올을 제조할 수 있어, 터펜 알코올 또는 그 유도체를 복합체의 형태로 제조할 수 있다.
도 1은 터펜 알코올과 유도체들의 생합성 경로 모식도이다. 점선은 다단계 효소반응으로 구성된 대사경로를 생략해서 표시한 것을 의미한다. 도 1에서 각 약자는 하기와 같다. G-3-P, glyceraldehyde 3-phosphate; MEP, methyl-erythritol phosphate; MVA, mevalonate; IPP, isopentenyl pyrophosphate; DMAPP, dimethylallyl pyrophosphate; GPP, geranyl pyrophosphate; FPP, (E,E)-farnesyl pyrophosphate. The abbreviations of enzymes are as follows: idi, isopentenyl diphosphate isomerase; NudB, phosphatase; ispA, (E,E)-farnesyl pyrophosphate synthase; cat, chloramphenicol acetyl transferase; YjgB and yahK, NADPH-dependent aldehyde reductases; YddN, ethanol dehydrogenase/alcohol dehydrogenase; transferase?, endogenous promiscuous transferase of E. coli.
도 2는 재조합 대장균 MT1에 도입된 플라스미드인 pSNA와 pT-NudB-ispA에 구축된 오페론 모식도이다. 직사각형 화살표는 유전자를 굽은 실선 화살표는 프로모터를 나타낸다. 첫번째 오페론은 MVA 경로 오페론으로 6개의 유전자로 구성되어 있고 lac promoter에 의해 발현이 된다. 본 발명의 일 실시예에서 이 오페론을 발현벡터인 pSTV28 (pACYC184 origin, CmR)에 클로닝해서 pSNA 플라스미드를 만들었다. NudB와 ispA 유전자로 구성된 두번째 오페론은 trc promoter에 의해 발현이 되고, 이 오페론을 발현벡터 pTrc99A (pBR322 ori, AmpR)에 클로닝해서 pT-NudB-ispA를 제조하였다. 도 2에서 각 약자는 하기와 같다. MvaE, bifunctional acetoacetyl-CoA thiolase and HMG-CoA reductase; MvaS, HMG-CoA synthase; MvaK1, mevalonate kinase; MvaK2, phosphomevalonate kinase; MvaD, mevalonate diphosphate decarboxylase; IDI, IPP isomerase; NudB, diphosphatase; ispA, FPP synthase.
도 3은 pSNA와 pT-NudB-ispA 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균(E. coli DH5α strain MT1)에서의 C5, C15 터펜 알코올과 그의 에스터 유도체 생산 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 pSNAK와 pT-NudB-ispA 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균(E. coli DH5α strain MT2)에서의 C5, C15 터펜 알코올과 그의 에스터 유도체 생산 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 pSNA와 pT-NudB-ispA-idi 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균(E. coli DH5α strain MT3)에서의 C5, C15 터펜 알코올과 그의 에스터 유도체 생산 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 pT-NudB-ispAS80F와 pSNA 또는 pSNAK 플라스미드로 형질전환된 재조합 대장균(E. coli DH5α strain MT4 또는 MT5)에서의 C5, C10 터펜 알코올과 그의 에스터 유도체 생산 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예 1. C5, C15 터펜 알코올과 그의 에스터 유도체 생산
C5, C15 터펜 알코올 생산을 위해서 IPP/DMAPP를 공급하는 외래 MVA 경로를 도입하고, 세포 내에서 과량으로 합성되는 IPP, DMAPP, FPP를 탈인산화해서 터펜 알코올을 만드는 탈인산화 효소 NudB를 과발현하였다.
NudB는 dihydroneopterin triphosphate pyrophosphohydrolase (DHNTPase)라고 불리는 효소로 dihydroneopterin triphosphate (DHNTP)에서 pyrophosphate를 제거해서 dihydroneopterin phosphate를 만드는 효소로 folate 생합성에 관련되어 있다. 상기 NudB는 IPP/DMAPP 이외의 다른 isoprenyl diphosphates 기질에도 작용할 것이라고 추정하는 연구 그룹은 없었다.
본 발명자들은 외래 MVA 경로를 갖는 플라스미드 pSNA와 FPP synthase와 NudB를 갖는 플라스미드 pT-NudB-ispA를 도입한 재조합 대장균(E. coli DH5α strain MT1)을 제조하고(도 2), 2%(v/v) glycerol을 포함하는 2YT 배지, 30℃에서 48시간 배양을 수행했다(도 3). 플라스미드 pSNA는 한국등록특허 제1440922호, 1392159호, 1359484호에 기재된 바와 동일한 방법으로 제조하였다.
배양 결과, 734 mg/L isoprenol, 15 mg/L prenol, 520 mg/L farnesol이 생산되었고, 예상하지 않았던 233 mg/L isoprenyl acetate, 31 mg/L farnesal, 121 mg/L farnesyl acetate도 얻어졌다. 상기의 물질들은 GC-MS 분석을 통해서 검증되었고, 최종 총 생산량은 1652 mg/L로 계산되었다.
Isoprenyl acetate와 farnesyl acetate는 isoprenol과 farnesol의 acetyl ester로 acetyl transferase 효소에 의해서 생성되는 것으로 추정된다. 1차적으로는 MVA 경로 플라스미드(pSNA)에 존재하는 항생제 마커인 chloramphenicol acetyl-transferase (CAT)에 의해서 생성이 되는 것으로 추정되어서, pSNA에 있는 항생제 마커를 kanamycin 저항성(Neomycin phosphotransferase II [NPT II/Neo]) 유전자로 대체한 pSNAK 플라스미드를 구축하였다. 플라스미드 pT-NudB-ispA와 pSNAK를 도입한 재조합 대장균(E. coli DH5α strain MT2)을 제조하고, 2%(v/v) glycerol을 포함하는 2YT 배지, 30℃에서 48시간 배양을 수행했다(도 4). 배양결과, 911 mg/L isoprenol, 12 mg/L prenol, 28 mg/L farnesal, 80 mg/L farnesyl acetate, 480 mg/L farnesol이 생산되었다. CAT의 제거를 통해서 isoprenyl acetate는 233 mg/L에서 0 mg/L로 생산이 중단되었고, farnesyl acetate는 121 mg/L에서 80 mg/L로 감소하였다. 그러나 상당한 양의 farnesyl acetate가 여전히 생산이 되는 것은 대장균 내의 다른 acetyl transferase가 farnesyl acetate 생성에 주로 관여하는 것으로 추정되고, 이 효소를 발굴해서 이용하면 farnesyl acetate의 생성량을 더 효과적으로 조절할 수 있을 것으로 예상된다. 또한 isoprenyl acetate 생성이 차단되면서 isoprenol은 734 mg/L에서 911 mg/L로 증가하였다.
Farnesol의 산화된 형태인 farnesal은 식물에서는 farnesol dehydrogenase에 의해 생성된다(Ahmad-Sohdi et al., 2015). 따라서 farnesol dehydrogenase를 대장균에 도입을 하면 farnesal을 생산할 수 있다. 그러나 상기의 실시예(도 3, 4)에 따르면 식물 유래 farnesol dehydrogenase의 도입 없이도 farnesal의 생성을 관찰할 수 있었다. 이것은 대장균이 갖고 있는 특정 alcohol dehydrogenases에에 의해서 생성이 된 것으로 추정된다. 대장균에 존재하는 farnesal 생성에 관련이 있을 것으로 추정되는 효소로 YjgB, YahK(서열번호 23의 아미노산 서열, 서열번호 24의 뉴클레오티드 서열((NCBI, Gene ID: 944975)로 코딩됨), YddN(서열번호 25의 아미노산 서열, 서열번호 26의 뉴클레오티드 서열(NCBI, Gene ID: 946036)로 코딩됨), AdhE(서열번호 27의 아미노산 서열, 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열((NCBI, Gene ID: 945837)로 코딩됨)를 선정하고 이들을 과발현하는 재조합 균주를 이용해서 farnesol의 farnesal로의 전환을 관찰하였다. 발현벡터 pTrc99A(서열번호 29의 뉴클레오티드 서열(GenBank: U13872.1))에 상기 효소들의 유전자가 클로닝된 pT-YjgB, pT-Yahk, pT-YddN, pT-adhE를 구축하고, 이들을 도입한 재조합 대장균들을 farnesol이 포함된 배지에서 배양하면서 farnesal의 생성을 관찰하였다. pT-YjgB로 형질전환된 균주에서만 150 mg/L의 farnesal의 생성이 관찰되었다. 따라서 대장균에서 farnesol을 farnesal로 전환을 하는 YjgB 효소의 발현을 조절해서 farnesol과 farnesal의 생산량을 조절할 수 있을 것이다.
상기 도 3의 재조합 대장균 MT1의 배양결과에서 prenol의 생산량이 isoprenol에 비해서 매우 낮은 것은 IPP를 DMAPP로 전환하는 IPP isomerase (IDI)의 발현량이 MVA 경로 플라스미드인 pSNA에서 발현되는 것만으로는 부족한 것으로 추정된다. 따라서 IDI 유전자(idi)를 pT-NudB-ispA 플라스미드에 추가로 도입한 pT-NudB-ispA-idi를 구축하였다. pT-NudB-ispA-idi와 pSNA로 형질전환된 재조합 대장균(E. coli DH5α strain MT3)을 제조하고, 2%(v/v) glycerol을 포함하는 2YT 배지, 30℃에서 48시간 배양을 수행했다(도 5). 실험결과, prenol의 생산량은 증가하고 isoprenol의 생산량은 예상대로 감소하였다. 그리고 farnesol 생산이 재조합 균주 MT1의 520 mg/L에 비해서 991 mg/L로 크게 증가하였다. 이것은 FPP 생합성을 개시하는 DMAPP의 세포 내 양이 IDI의 추가발현에 의해서 증가했기 때문으로 추정된다. 따라서 IDI의 발현량 조절을 통해서 생산되는 터펜 알코올의 prenol, isoprenol, farnesol의 생산량을 조절할 수 있다.
실시예 2. C5, C10 터펜 알코올과 그의 에스터 유도체 생산
MVA 경로와 IspA의 과발현을 통해서 세포내 IPP (C5), DMAPP (C5), FPP (C15) 생합성을 증가시킬 수 있고, 이들은 NudB에 의해서 각각의 터펜 알코올과 유도체들로 전환이 된다. 따라서 GPP synthase (GPPS) 발현을 통해서 GPP (C10)를 생합성하면 C10 터펜 알코올을 생산할 수 있을 것이다.
대장균은 GPP synthase를 갖고 있지는 않지만 IspA를 변이 시켜서 GPP synthase로 만들 수 있다(Reiling et al., 2004). GPP 생합성 능력을 갖도록 변이시킨 ispAS80F로 pT-NudB-ispA 플라스미드의 ispA를 대체한 pT-ispAS80F-NudB 플라스미드를 구축하고, pSNA와 함께 대장균에 도입해서 재조합 대장균(E. coli DH5α strain MT4)를 제조하였다. 이 균주를 2%(v/v) glycerol을 포함하는 2YT 배지, 30℃에서 48시간 배양을 수행하고 터펜 알코올 생산을 분석하였다(도 6).
실험결과, 21 mg/L geraniol, 13 mg/L citral, 65 mg/L geranyl acetate의 C10 터펜 알코올과 유도체가 얻어졌다. 이들 생산량은 재조합 대장균 MT1이 생산하는 C15 터펜 알코올과 유도체의 생산량 보다 상대적으로 매우 낮은 수준이다. 이것은 IspA 효소의 변이를 통해서 GPP 생합성 활성을 갖도록 할 수 있지만, 이 과정에서 효소의 비활성이 크게 감소한 것으로 추정된다. 따라서 효소 비활성이 높은 GPP synthase를 사용하게 되면 C10 터펜 알코올과 유도체의 생산량을 크게 증가시킬 수 있을 것이다.
에스터 유도체 생성을 줄이고 알코올 생산을 증가시키기 위해서 pT-ispAS80F-NudB와 pSNAK로 형질전환한 재조합 대장균(E. coli DH5α strain MT5)를 제조하였다. 이 균주를 2%(v/v) glycerol을 포함하는 2YT 배지, 30℃에서 48시간 배양을 수행하고 터펜 알코올 생산을 분석하였다(도 6).
구분 설명 서열번호 참조
프라이머(밑줄은 제한 효소 부위를 나타냄)
NudB-F1 CATCCATGGTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAGGATAAAGTGTATAAGCGTCC 31 -
NudB-R1 CATGGAGCTCTTAGGCAGCGTTAATTACAAACTG 32 -
NudB-F2 CTGGATCCTTTAAGAAGGAGATATACATATGAAGGATAAAGTGTATAAGCGTCC 33 -
NudB-R2 CCCAAGCTTAGGCAGCGTTAATTACAAACTG 34 -
ispA-F CTAGGAGCTCAGCCCTAAGGAACCAATATGGACTTTCCGCAGCAAC 35 -
ispA-R TGAGGTACCTTATTTATTACGCTGGATGATGTAG 36 -
ispAS80F-F GAGGTACCAACAATAATCTCGTATAGTATGGACTTTCCGCAGCAAC 37 -
ispAS80F-R CTGGATCCTTATTTATTACGCTGGATGATGTAG 38 -
Idi-F ACGGATCCTGAGGAGGTAACGTATGCAAACGGAACACGTCATTTTA 39 -
Idi-R TATCGTCGACTCTAAGATCTTATTTAAGCTGGGTAAATGCAG 40 -
플라스미드
pSTV28 P lac expression vector, pACYC184 origin, lacZ, Cmr 30 Takara Co., Ltd
pSNA pSTV28 containing mvaE and mvaS of E. faecalis, mvaK1, mvaK2, and mvaD of S. pneumoniae, and idi of E. coli - Yoon et al., (2009)
pSTV28K P lac expression vector, pACYC184 origin, lacZ, Kmr 41 Zhou et al., (2014)
pSNAK pTV28 K containing mvaE and mvaS from E. faecalis, mvaK1, mvaK2, and mvaD from S. pneumoniae, and idi from E. coli - Zhou et al., (2014)
pTrc99A P trc expression vector, pBR322 origin, lacIq, Ampr 29 Amann et al., (1988)
pT-NudB pTrc99A vector containing NudB from E. coli - -
pT-NudB-ispA pTrc99A vector containing NudB and ispA from E. coli - -
pT-NudB-ispA-idi pTrc99A vector containing NudB, ispA and idi from E. coli - -
pT-ispAS80F pTrc99A vector containing ispA mutant from E. coli - -
pT-ispAS80F-NudB pTrc99A vector containing ispA mutant and NudB from E. coli - -
pT-YahK pTrc99A vector containing YahK from E. coli - -
pT-YddN pTrc99A vector containing YddN from E. coli - -
pT-adhE pTrc99A vector containing adhE from E. coli - -
pT-YjgB pTrc99A vector containing YjgB from E. coli - -
pT-GPSGES pTrc99A containing GPS from E. coli and GES from Ocimum basilicum - Zhou et al., (2014)
균주
MG1655 E. coli K-12; F- lambda-, ilvG-, rfb-50, rph-1 - ATCC 700926
DH5α E. coli K-12; F-, Φ80lacZΔM15, Δ(lacZYA-argF)U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17(rK-, mK+) phoA, supE44, λ-, thi-1 - ATCC 98040
MT1 E. coli DH5α harboring pT-NudB-ispA and pSNA - -
MT2 E. coli DH5α harboring pT-NudB-ispA and pSNAK - -
MT3 E. coli DH5α harboring pT-NudB-ispA-idi and pSNA - -
MT4 E. coli DH5α harboring pT-ispAS80F-NudB and pSNA - -
MT5 E. coli DH5α harboring pT-ispAS80F-NudB and pSNAK - -
D-pTrc99A E. coli DH5α harboring pTrc99A - -
D-pT-YjgB E. coli DH5α harboring pT-YjgB - -
D-pT-Yahk E. coli DH5α harboring pT-Yahk - -
D-pT-YddN E. coli DH5α harboring pT-YddN - -
D-pT-adhE E. coli DH5α harboring pT-adhE - -
<110> GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY OFFICE OF ACADEMY AND INDUSTRY COLLABORATION <120> PREPARING METHOD FOR TERPENE ALCOHOL OR ITS DERIVATIVES <130> 16P06009 <160> 41 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 150 <212> PRT <213> Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 <400> 1 Met Lys Asp Lys Val Tyr Lys Arg Pro Val Ser Ile Leu Val Val Ile 1 5 10 15 Tyr Ala Gln Asp Thr Lys Arg Val Leu Met Leu Gln Arg Arg Asp Asp 20 25 30 Pro Asp Phe Trp Gln Ser Val Thr Gly Ser Val Glu Glu Gly Glu Thr 35 40 45 Ala Pro Gln Ala Ala Met Arg Glu Val Lys Glu Glu Val Thr Ile Asp 50 55 60 Val Val Ala Glu Gln Leu Thr Leu Ile Asp Cys Gln Arg Thr Val Glu 65 70 75 80 Phe Glu Ile Phe Ser His Leu Arg His Arg Tyr Ala Pro Gly Val Thr 85 90 95 Arg Asn Thr Glu Ser Trp Phe Cys Leu Ala Leu Pro His Glu Arg Gln 100 105 110 Ile Val Phe Thr Glu His Leu Ala Tyr Lys Trp Leu Asp Ala Pro Ala 115 120 125 Ala Ala Ala Leu Thr Lys Ser Trp Ser Asn Arg Gln Ala Ile Glu Gln 130 135 140 Phe Val Ile Asn Ala Ala 145 150 <210> 2 <211> 453 <212> DNA <213> Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 <400> 2 atgaaggata aagtgtataa gcgtcccgtt tcgatcttag tggtcatcta cgcacaagat 60 acgaaacggg tgctgatgtt gcagcggcgt gacgatcccg atttctggca gtcggtaacc 120 ggcagcgtgg aagagggtga aaccgcgccg caagctgcca tgcgcgaagt aaaggaagag 180 gtcaccattg atgttgtcgc tgaacaactg accttaattg actgtcagcg cacggtagag 240 tttgaaattt tttcacattt acgtcatcgc tatgcgccgg gcgtgacgcg taatacggaa 300 tcatggttct gtcttgcgct tccgcacgag cggcagatcg ttttcactga acatctggct 360 tacaagtggc ttgatgcgcc tgctgcggcg gcgctcacta agtcctggag caaccggcag 420 gcgattgaac agtttgtaat taacgctgcc taa 453 <210> 3 <211> 339 <212> PRT <213> Escherichia coli str. K-12 substr. 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tcactcgata cctcggcact ggaagcgcta gcggactaca tcatccagcg taataaataa 900 900 <210> 11 <211> 803 <212> PRT <213> Enterococcus faecalis <400> 11 Met Lys Thr Val Val Ile Ile Asp Ala Leu Arg Thr Pro Ile Gly Lys 1 5 10 15 Tyr Lys Gly Ser Leu Ser Gln Val Ser Ala Val Asp Leu Gly Thr His 20 25 30 Val Thr Thr Gln Leu Leu Lys Arg His Ser Thr Ile Ser Glu Glu Ile 35 40 45 Asp Gln Val Ile Phe Gly Asn Val Leu Gln Ala Gly Asn Gly Gln Asn 50 55 60 Pro Ala Arg Gln Ile Ala Ile Asn Ser Gly Leu Ser His Glu Ile Pro 65 70 75 80 Ala Met Thr Val Asn Glu Val Cys Gly Ser Gly Met Lys Ala Val Ile 85 90 95 Leu Ala Lys Gln Leu Ile Gln Leu Gly Glu Ala Glu Val Leu Ile Ala 100 105 110 Gly Gly Ile Glu Asn Met Ser Gln Ala Pro Lys Leu Gln Arg Phe Asn 115 120 125 Tyr Glu Thr Glu Ser Tyr Asp Ala Pro Phe Ser Ser Met Met Tyr Asp 130 135 140 Gly Leu Thr Asp Ala Phe Ser Gly Gln Ala Met Gly Leu Thr Ala Glu 145 150 155 160 Asn Val Ala Glu Lys Tyr His Val Thr Arg Glu Glu Gln Asp Gln Phe 165 170 175 Ser Val His Ser Gln Leu Lys Ala 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Thr Ser Ala Val Leu Leu Lys Arg Gly Asp 130 135 140 Asn Gly Ser Met Gly Asp Leu Ala Cys Ile Val Ala Glu Asp Leu Val 145 150 155 160 Leu Tyr Gln Ser Phe Asp Arg Gln Lys Val Ala Ala Trp Leu Glu Glu 165 170 175 Glu Asn Leu Ala Thr Val Leu Glu Arg Asp Trp Gly Phe Ser Ile Ser 180 185 190 Gln Val Lys Pro Thr Leu Glu Cys Asp Phe Leu Val Gly Trp Thr Lys 195 200 205 Glu Val Ala Val Ser Ser His Met Val Gln Gln Ile Lys Gln Asn Ile 210 215 220 Asn Gln Asn Phe Leu Ser Ser Ser Lys Glu Thr Val Val Ser Leu Val 225 230 235 240 Glu Ala Leu Glu Gln Gly Lys Ala Glu Lys Val Ile Glu Gln Val Glu 245 250 255 Val Ala Ser Lys Leu Leu Glu Gly Leu Ser Thr Asp Ile Tyr Thr Pro 260 265 270 Leu Leu Arg Gln Leu Lys Glu Ala Ser Gln Asp Leu Gln Ala Val Ala 275 280 285 Lys Ser Ser Gly Ala Gly Gly Gly Asp Cys Gly Ile Ala Leu Ser Phe 290 295 300 Asp Ala Glu Ser Thr Lys Thr Leu Lys Asn Arg Trp Ala Asp Leu Gly 305 310 315 320 Ile Glu Leu Leu Tyr Gln Glu Arg Ile Gly His Asp Asp Lys Ser 325 330 335 <210> 15 <211> 317 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <400> 15 Met Asp Arg Glu Pro Val Thr Val Arg Ser Tyr Ala Asn Ile Ala Ile 1 5 10 15 Ile Lys Tyr Trp Gly Lys Lys Lys Glu Lys Glu Met Val Pro Ala Thr 20 25 30 Ser Ser Ile Ser Leu Thr Leu Glu Asn Met Tyr Thr Glu Thr Thr Leu 35 40 45 Ser Pro Leu Pro Ser Pro Ala Thr Ala Asp Ala Phe Tyr Ile Asn Gly 50 55 60 Gln Leu Gln Asn Glu Ala Glu His Ala Lys Met Ser Lys Ile Ile Asp 65 70 75 80 Arg Tyr Arg Pro Asp Gly Glu Gly Phe Val Arg Ile Asp Thr Gln Asn 85 90 95 Asn Met Pro Thr Ala Ala Gly Leu Ser Ser Ser Ser Ser Gly Leu Ser 100 105 110 Ala Leu Val Lys Val Cys Asn Ala Tyr Phe Gln Leu Gly Leu Thr Arg 115 120 125 Ser Gln Leu Ala Gln Glu Ala Lys Phe Ala Ser Gly Ser Ser Ser Arg 130 135 140 Ser Phe Tyr Gly Pro Leu Gly Ala Trp Asp Lys Asp Ser Gly Glu Ile 145 150 155 160 Tyr Pro Val Glu Thr Asp Leu Lys Leu Ala Met Met Met Leu Val Leu 165 170 175 Glu Asp Lys Lys Lys Pro Ile Ser Ser Arg Asp Gly Met Lys Leu Cys 180 185 190 Val Glu Thr Ser Thr Thr Phe Asp Asp Trp Val Arg Gln Ser 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K-12 substr. MG1655 <400> 16 Met Gln Thr Glu His Val Ile Leu Leu Asn Ala Gln Gly Val Pro Thr 1 5 10 15 Gly Thr Leu Glu Lys Tyr Ala Ala His Thr Ala Asp Thr Arg Leu His 20 25 30 Leu Ala Phe Ser Ser Trp Leu Phe Asn Ala Lys Gly Gln Leu Leu Val 35 40 45 Thr Arg Arg Ala Leu Ser Lys Lys Ala Trp Pro Gly Val Trp Thr Asn 50 55 60 Ser Val Cys Gly His Pro Gln Leu Gly Glu Ser Asn Glu Asp Ala Val 65 70 75 80 Ile Arg Arg Cys Arg Tyr Glu Leu Gly Val Glu Ile Thr Pro Pro Glu 85 90 95 Ser Ile Tyr Pro Asp Phe Arg Tyr Arg Ala Thr Asp Pro Ser Gly Ile 100 105 110 Val Glu Asn Glu Val Cys Pro Val Phe Ala Ala Arg Thr Thr Ser Ala 115 120 125 Leu Gln Ile Asn Asp Asp Glu Val Met Asp Tyr Gln Trp Cys Asp Leu 130 135 140 Ala Asp Val Leu His Gly Ile Asp Ala Thr Pro Trp Ala Phe Ser Pro 145 150 155 160 Trp Met Val Met Gln Ala Thr Asn Arg Glu Ala Arg Lys Arg Leu Ser 165 170 175 Ala Phe Thr Gln Leu Lys 180 <210> 17 <211> 2412 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 17 ttgaaaacag tagttattat tgatgcatta cgaacaccaa ttggaaaata taaaggcagc 60 ttaagtcaag taagtgccgt agacttagga acacatgtta caacacaact tttaaaaaga 120 cattccacta tttctgaaga aattgatcaa gtaatctttg gaaatgtttt acaagctgga 180 aatggccaaa atcccgcacg acaaatagca ataaacagcg gtttatctca tgaaattccc 240 gcaatgacag ttaatgaggt ctgcggatca ggaatgaagg ccgttatttt ggcgaaacaa 300 ttgattcaat taggagaagc ggaagtttta attgctggcg ggattgagaa tatgtcccaa 360 gcacctaaat tacaacgatt taattacgaa acagaaagct atgatgcgcc tttttctagt 420 atgatgtacg atgggttaac ggatgccttt agtggtcaag caatgggctt aactgctgaa 480 aatgtggccg aaaagtatca tgtaactaga gaagagcaag atcaattttc tgtacattca 540 caattaaaag cagctcaagc acaagcagaa gggatattcg ctgacgaaat agccccatta 600 gaagtatcag gaacgcttgt ggagaaagat gaagggattc gccctaattc gagcgttgag 660 aagctaggaa cgcttaaaac agtttttaaa gaagacggta ctgtaacagc agggaatgca 720 tcaaccatta atgatggggc ttctgctttg attattgctt cacaagaata tgccgaagca 780 cacggtcttc cttatttagc tattattcga gacagtgtgg aagtcggtat tgatccagcc 840 tatatgggaa tttcgccgat taaagccatt caaaaactgt tagcgcgcaa tcaacttact 900 acggaagaaa ttgatctgta tgaaatcaac gaagcatttg cagcaacttc aatcgtggtc 960 caaagagaac tggctttacc agaggaaaag gtcaacattt atggtggcgg tatttcatta 1020 ggtcatgcga ttggtgccac aggtgctcgt ttattaacga gtttaagtta tcaattaaat 1080 caaaaagaaa agaaatatgg agtggcttct ttatgtatcg gcggtggctt aggactcgct 1140 atgctactag agagacctca gcaaaaaaaa aacagccgat tttatcaaat gagtcctgag 1200 gaacgcctgg cttctcttct taatgaaggc cagatttctg ctgatacaaa aaaagaattt 1260 gaaaatacgg ctttatcttc gcagattgcc aatcatatga ttgaaaatca aatcagtgaa 1320 acagaagtgc cgatgggcgt tggcttacat ttaacagtgg acgaaactga ttatttggta 1380 ccaatggcga cagaagagcc ctcagtgatt gcggctttga gtaatggtgc aaaaatagca 1440 caaggattta aaacagtgaa tcaacaacgt ttaatgcgtg gacaaatcgt tttttacgat 1500 gttgcagacg ccgagtcatt gattgatgaa ctacaagtaa gagaaacgga aatttttcaa 1560 caagcagagt taagttatcc atctatcgtt aaacgcggcg gcggcttaag agatttgcaa 1620 tatcgtgctt ttgatgaatc atttgtatct gtcgactttt tagtagatgt taaggatgca 1680 atgggggcaa atatcgttaa cgctatgttg gaaggtgtgg ccgagttgtt ccgtgaatgg 1740 tttgcggagc aaaagatttt attcagtatt ttaagtaatt atgccacgga gtcggttgtt 1800 acgatgaaaa cggctattcc agtttcacgt ttaagtaagg ggagcaatgg ccgggaaatt 1860 gctgaaaaaa ttgttttagc ttcacgctat gcttcattag atccttatcg ggcagtcacg 1920 cataacaaag ggatcatgaa tggcattgaa gctgtcgttt tagctacagg aaatgataca 1980 cgcgctgtta gcgcttcttg tcatgctttt gcggtgaagg aaggtcgcta ccaaggtttg 2040 actagttgga cgctggatgg cgaacaacta attggtgaaa tttcagttcc gcttgcgtta 2100 gccacggttg gcggtgccac aaaagtctta cctaaatctc aagcagctgc tgatttgtta 2160 gcagtgacgg atgcaaaaga actaagtcga gtagtagcgg ctgttggttt ggcacaaaat 2220 ttagcggcgt tacgggcctt agtctctgaa ggaattcaaa aaggacacat ggctctacaa 2280 gcacgttctt tagcgatgac ggtcggagct actggtaaag aagttgaggc agtcgctcaa 2340 caattaaaac gtcaaaaaac gatgaaccaa gaccgagcct tggctatttt aaatgattta 2400 agaaaacaat aa 2412 <210> 18 <211> 1152 <212> DNA <213> Enterococcus faecalis <400> 18 atgacaattg ggattgataa aattagtttt tttgtgcccc cttattatat tgatatgacg 60 gcactggctg aagccagaaa tgtagaccct ggaaaatttc atattggtat tgggcaagac 120 caaatggcgg tgaacccaat cagccaagat attgtgacat ttgcagccaa tgccgcagaa 180 gcgatcttga ccaaagaaga taaagaggcc attgatatgg tgattgtcgg gactgagtcc 240 agtatcgatg agtcaaaagc ggccgcagtt gtcttacatc gtttaatggg gattcaacct 300 ttcgctcgct ctttcgaaat caaggaagct tgttacggag caacagcagg cttacagtta 360 gctaagaatc acgtagcctt acatccagat aaaaaagtct tggttgtagc agcagatatt 420 gcaaaatatg gattaaattc tggcggtgag cctacacaag gagctggggc ggttgcaatg 480 ttagttgcta gtgaaccgcg catcttggct ttaaaagagg ataatgtgat gctgacgcaa 540 gatatctatg acttttggcg tccaacaggc catccgtatc ctatggtcga tggtcctttg 600 tcaaacgaaa cctacatcca atcttttgcc caagtctggg atgaacataa aaaaagaacc 660 ggtcttgatt ttgcagatta tgatgcttta gcgttccata ttccttacac aaaaatgggc 720 aaaaaagcct tattagcaaa aatctccgac caaactgaag cagaacagga acgaatttta 780 gcccgttatg aagaaagcat catctatagt cgtcgcgtag gaaacttgta tacgggttca 840 ctttatctgg gactcatttc ccttttagaa aatgcaacga ctttaaccgc aggcaatcaa 900 attgggttat tcagttatgg ttctggtgct gtcgctgaat ttttcactgg tgaattagta 960 gctggttatc aaaatcattt acaaaaagaa actcatttag cactgctaga taatcggaca 1020 gaactttcta tcgctgaata tgaagccatg tttgcagaaa ctttagacac agatattgat 1080 caaacgttag aagatgaatt aaaatatagt atttctgcta ttaataatac cgttcgctct 1140 tatcgaaact aa 1152 <210> 19 <211> 879 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 19 atgacaaaaa aagttggtgt cggtcaggca catagtaaga taattttaat aggggaacat 60 gcggtcgttt acggttatcc tgccatttcc ctgcctcttt tggaggtgga ggtgacctgt 120 aaggtagttc ctgcagagag tccttggcgc ctttatgagg aggatacctt gtccatggcg 180 gtttatgcct cactggagta tttggatatc acagaagcct gcattcgttg tgagattgac 240 tcggctatcc ctgagaaacg ggggatgggt tcgtcagcgg ctatcagcat agcggccatt 300 cgtgcggtat ttgactacta tcaggctgat ctgcctcatg atgtactaga aatcttggtc 360 aatcgagctg aaatgattgc ccatatgaat cctagtggtt tggatgctaa gacctgtctc 420 agtgaccaac ctattcgctt tatcaagaac gtaggattta cagaacttga gatggattta 480 tccgcctatt tggtgattgc cgatacgggt gtttatggtc atactcgtga agccatccaa 540 gtggttcaaa ataagggcaa ggatgcccta ccgtttttgc atgccttggg agaattaacc 600 cagcaagcag aagttgcgat ttcacaaaaa gatgctgaag gactgggaca aatcctcagt 660 caagcgcatt tacatttaaa agaaattgga gtcagtagcc ctgaggcaga ctttttggtt 720 gaaacgactc ttagccatgg tgctctgggt gccaagatga gcggtggtgg gctaggaggt 780 tgtatcatag ccttggtaac caatttgaca cacgcacaag aactagcaga aagattagaa 840 gagaaaggag ctgttcagac atggatagag agcctgtaa 879 <210> 20 <211> 1008 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 20 atgattgctg ttaaaacttg cggaaaactc tattgggcag gtgaatatgc tattttagag 60 ccagggcagt tagctttgat aaaggatatt cccatctata tgagggctga gattgctttt 120 tctgacagct accgtatcta ttcagatatg tttgatttcg cagtggactt aaggcctaat 180 cctgactaca gcttgattca agaaacgatt gctttgatgg gagacttcct cgctgttcgt 240 ggtcagaatt taagaccttt ttctctagaa atctgtggca aaatggaacg agaagggaaa 300 aagtttggtc taggttctag tggcagcgtc gttgtcttgg ttgtcaaggc tttactggct 360 ctgtatgatg tttctgttga tcaggagctc ttgttcaagc tgactagcgc tgtcttgctc 420 aagcgaggag acaatggttc catgggcgac cttgcctgta ttgtggcaga ggatttggtt 480 ctctaccagt catttgatcg ccagaaggtg gctgcttggt tagaagaaga aaacttggcg 540 acagttctgg agcgtgattg gggcttttca atttcacaag tgaaaccaac tttagaatgt 600 gatttcttag tgggatggac caaggaagtg gctgtatcga gtcacatggt ccagcaaatc 660 aagcaaaata tcaatcaaaa ttttttaagt tcctcaaaag aaacggtggt ttctttggtc 720 gaagccttgg aacaggggaa atcagaaaag attatcgagc aagtagaagt agccagcaag 780 cttttagaag gcttgagtac agatatttac acgcctttgc ttagacagtt gaaagaagcc 840 agtcaagatt tgcaggccgt tgccaagagt agtggtgctg gtggtggtga ctgtggcatc 900 gccctgagtt ttgatgcgca atcaaccaaa accttaaaaa atcgttgggc cgatctgggg 960 attgagctct tatatcaaga aaggatagga catgacgaca aatcgtaa 1008 <210> 21 <211> 954 <212> DNA <213> Streptococcus pneumoniae <400> 21 atggatagag agcctgtaac agtacgttcc tacgcaaata ttgctattat caaatattgg 60 ggaaagaaaa aagaaaaaga gatggtgcct gctactagca gtatttctct aactttggaa 120 aatatgtata cagagacgac cttgtcgcct ttaccagcca atgtaacagc tgacgaattt 180 tacatcaatg gtcagctaca aaatgaggtc gagcatgcca agatgagtaa gattattgac 240 cgttatcgtc cagctggtga gggctttgtc cgtatcgata ctcaaaacaa tatgcctact 300 gcagcgggcc tgtcctcaag ttctagtggt ttgtccgccc tggtcaaggc ttgtaatgct 360 tatttcaagc ttggattgga tagaagtcag ttggcacagg aagccaaatt tgcctcaggc 420 tcttcttctc ggagttttta tggaccacta ggagcctggg ataaggatag tggagaaatt 480 taccctgtag agacagactt gaaactagct atgattatgt tggtgctaga ggacaagaaa 540 aaaccaatct ctagccgtga cgggatgaaa ctttgtgtgg aaacctcgac gacttttgac 600 gactgggttc gtcagtctga gaaggactat caggatatgc tgatttatct caaggaaaat 660 gattttgcca agattggaga attaacggag aaaaatgccc tggctatgca tgctacgaca 720 aagactgcta gtccagcctt ttcttatctg acggatgcct cttatgaggc tatggacttt 780 gttcgccagc ttcgtgagaa aggagaggcc tgctacttta ccatggatgc tggtcccaat 840 gttaaggtct tctgtcagga gaaagacttg gagcatttat cagaaatttt cggtcatcgt 900 tatcgcttga ttgtgtcaaa aacaaaggat ttgagtcaag atgattgctg ttaa 954 <210> 22 <211> 549 <212> DNA <213> Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 <400> 22 atgcaaacgg aacacgtcat tttattgaat gcacagggag ttcccacggg tacgctggaa 60 aagtatgccg cacacacggc agacacccgc ttacatctcg cgttctccag ttggctgttt 120 aatgccaaag gacaattatt agttacccgc cgcgcactga gcaaaaaagc atggcctggc 180 gtgtggacta actcggtttg tgggcaccca caactgggag aaagcaacga agacgcagtg 240 atccgccgtt gccgttatga gcttggcgtg gaaattacgc ctcctgaatc tatctatcct 300 gactttcgct accgcgccac cgatccgagt ggcattgtgg aaaatgaagt gtgtccggta 360 tttgccgcac gcaccactag tgcgttacag atcaatgatg atgaagtgat ggattatcaa 420 tggtgtgatt tagcagatgt attacacggt attgatgcca cgccgtgggc gttcagtccg 480 tggatggtga tgcaggcgac aaatcgcgaa gccagaaaac gattatctgc atttacccag 540 cttaaataa 549 <210> 23 <211> 349 <212> PRT <213> Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 <400> 23 Met Lys Ile Lys Ala Val Gly Ala Tyr Ser Ala Lys Gln Pro Leu Glu 1 5 10 15 Pro Met Asp Ile Thr Arg Arg Glu Pro Gly Pro Asn Asp Val Lys Ile 20 25 30 Glu Ile Ala Tyr Cys Gly Val Cys His Ser Asp Leu His Gln Val Arg 35 40 45 Ser Glu Trp Ala Gly Thr Val Tyr Pro Cys Val Pro Gly His Glu Ile 50 55 60 Val Gly Arg Val Val Ala Val Gly Asp Gln Val Glu Lys Tyr Ala Pro 65 70 75 80 Gly Asp Leu Val Gly Val Gly Cys Ile Val Asp Ser Cys Lys His Cys 85 90 95 Glu Glu Cys Glu Asp Gly Leu Glu Asn Tyr Cys Asp His Met Thr Gly 100 105 110 Thr Tyr Asn Ser Pro Thr Pro Asp Glu Pro Gly His Thr Leu Gly Gly 115 120 125 Tyr Ser Gln Gln Ile Val Val His Glu Arg Tyr Val Leu Arg Ile Arg 130 135 140 His Pro Gln Glu Gln Leu Ala Ala Val Ala Pro Leu Leu Cys Ala Gly 145 150 155 160 Ile Thr Thr Tyr Ser Pro Leu Arg His Trp Gln Ala Gly Pro Gly Lys 165 170 175 Lys Val Gly Val Val Gly Ile Gly Gly Leu Gly His Met Gly Ile Lys 180 185 190 Leu Ala His Ala Met Gly Ala His Val Val Ala Phe Thr Thr Ser Glu 195 200 205 Ala Lys Arg Glu Ala Ala Lys Ala Leu Gly Ala Asp Glu Val Val Asn 210 215 220 Ser Arg Asn Ala Asp Glu Met Ala Ala His Leu Lys Ser Phe Asp Phe 225 230 235 240 Ile Leu Asn Thr Val Ala Ala Pro His Asn Leu Asp Asp Phe Thr Thr 245 250 255 Leu Leu Lys Arg Asp Gly Thr Met Thr Leu Val Gly Ala Pro Ala Thr 260 265 270 Pro His Lys Ser Pro Glu Val Phe Asn Leu Ile Met Lys Arg Arg Ala 275 280 285 Ile Ala Gly Ser Met Ile Gly Gly Ile Pro Glu Thr Gln Glu Met Leu 290 295 300 Asp Phe Cys Ala Glu His Gly Ile Val Ala Asp Ile Glu Met Ile Arg 305 310 315 320 Ala Asp Gln Ile Asn Glu Ala Tyr Glu Arg Met Leu Arg Gly Asp Val 325 330 335 Lys Tyr Arg Phe Val Ile Asp Asn Arg Thr Leu Thr Asp 340 345 <210> 24 <211> 1050 <212> DNA <213> Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 <400> 24 atgaagatca aagctgttgg tgcatattcc gctaaacaac cacttgaacc gatggatatc 60 acccggcgtg aaccgggacc gaatgatgtc aaaatcgaaa tcgcttactg tggcgtttgc 120 cattccgatc tccaccaggt ccgttccgag tgggcgggga cggtttaccc ctgcgtgccg 180 ggtcatgaaa ttgtggggcg tgtggtagcc gttggtgatc aggtagaaaa atatgcgccg 240 ggcgatctgg tcggtgtcgg ctgcattgtc gacagttgta aacattgcga agagtgtgaa 300 gacgggttgg aaaactactg tgatcacatg accggcacct ataactcgcc gacgccggac 360 gaaccgggcc atactctggg cggctactca caacagatcg tcgttcatga gcgatatgtt 420 ctgcgtattc gtcacccgca agagcagctg gcggcggtgg ctcctttgtt gtgtgcaggg 480 atcaccacgt attcgccgct acgtcactgg caggccgggc cgggtaaaaa agtgggcgtg 540 gtcggcatcg gcggtctggg acatatgggg attaagctgg cccacgcgat gggggcacat 600 gtggtggcat ttaccacttc tgaggcaaaa cgcgaagcgg caaaagccct gggggccgat 660 gaagttgtta actcacgcaa tgccgatgag atggcggctc atctgaagag tttcgatttc 720 attttgaata cagtagctgc gccacataat ctcgacgatt ttaccacctt gctgaagcgt 780 gatggcacca tgacgctggt tggtgcgcct gcgacaccgc ataaatcgcc ggaagttttc 840 aacctgatca tgaaacgccg tgcgatagcc ggttctatga ttggcggcat tccagaaact 900 caggagatgc tcgatttttg cgccgaacat ggcatcgtgg ctgatataga gatgattcgg 960 gccgatcaaa ttaatgaagc ctatgagcga atgctgcgcg gtgatgtgaa atatcgtttt 1020 gttatcgata atcgcacact aacagactga 1050 <210> 25 <211> 336 <212> PRT <213> Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 <400> 25 Met Lys Ala Ala Val Val Thr Lys Asp His His Val Asp Val Thr Tyr 1 5 10 15 Lys Thr Leu Arg Ser Leu Lys His Gly Glu Ala Leu Leu Lys Met Glu 20 25 30 Cys Cys Gly Val Cys His Thr Asp Leu His Val Lys Asn Gly Asp Phe 35 40 45 Gly Asp Lys Thr Gly Val Ile Leu Gly His Glu Gly Ile Gly Val Val 50 55 60 Ala Glu Val Gly Pro Gly Val Thr Ser Leu Lys Pro Gly Asp Arg Ala 65 70 75 80 Ser Val Ala Trp Phe Tyr Glu Gly Cys Gly His Cys Glu Tyr Cys Asn 85 90 95 Ser Gly Asn Glu Thr Leu Cys Arg Ser Val Lys Asn Ala Gly Tyr Ser 100 105 110 Val Asp Gly Gly Met Ala Glu Glu Cys Ile Val Val Ala Asp Tyr Ala 115 120 125 Val Lys Val Pro Asp Gly Leu Asp Ser Ala Ala Ala Ser Ser Ile Thr 130 135 140 Cys Ala Gly Val Thr Thr Tyr Lys Ala Val Lys Leu Ser Lys Ile Arg 145 150 155 160 Pro Gly Gln Trp Ile Ala Ile Tyr Gly Leu Gly Gly Leu Gly Asn Leu 165 170 175 Ala Leu Gln Tyr Ala Lys Asn Val Phe Asn Ala Lys Val Ile Ala Ile 180 185 190 Asp Val Asn Asp Glu Gln Leu Lys Leu Ala Thr Glu Met Gly Ala Asp 195 200 205 Leu Ala Ile Asn Ser His Thr Glu Asp Ala Ala Lys Ile Val Gln Glu 210 215 220 Lys Thr Gly Gly Ala His Ala Ala Val Val Thr Ala Val Ala Lys Ala 225 230 235 240 Ala Phe Asn Ser Ala Val Asp Ala Val Arg Ala Gly Gly Arg Val Val 245 250 255 Ala Val Gly Leu Pro Pro Glu Ser Met Ser Leu Asp Ile Pro Arg Leu 260 265 270 Val Leu Asp Gly Ile Glu Val Val Gly Ser Leu Val Gly Thr Arg Gln 275 280 285 Asp Leu Thr Glu Ala Phe Gln Phe Ala Ala Glu Gly Lys Val Val Pro 290 295 300 Lys Val Ala Leu Arg Pro Leu Ala Asp Ile Asn Thr Ile Phe Thr Glu 305 310 315 320 Met Glu Glu Gly Lys Ile Arg Gly Arg Met Val Ile Asp Phe Arg His 325 330 335 <210> 26 <211> 1011 <212> DNA <213> Escherichia coli str. K-12 substr. 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catccggaaa ctcacttcga agagctggcg ctgcgcttta tggatatccg taaacgtatc 1740 tacaagttcc cgaaaatggg cgtgaaagcg aaaatgatcg ctgtcaccac cacttctggt 1800 acaggttctg aagtcactcc gtttgcggtt gtaactgacg acgctactgg tcagaaatat 1860 ccgctggcag actatgcgct gactccggat atggcgattg tcgacgccaa cctggttatg 1920 gacatgccga agtccctgtg tgctttcggt ggtctggacg cagtaactca cgccatggaa 1980 gcttatgttt ctgtactggc atctgagttc tctgatggtc aggctctgca ggcactgaaa 2040 ctgctgaaag aatatctgcc agcgtcctac cacgaagggt ctaaaaatcc ggtagcgcgt 2100 gaacgtgttc acagtgcagc gactatcgcg ggtatcgcgt ttgcgaacgc cttcctgggt 2160 gtatgtcact caatggcgca caaactgggt tcccagttcc atattccgca cggtctggca 2220 aacgccctgc tgatttgtaa cgttattcgc tacaatgcga acgacaaccc gaccaagcag 2280 actgcattca gccagtatga ccgtccgcag gctcgccgtc gttatgctga aattgccgac 2340 cacttgggtc tgagcgcacc gggcgaccgt actgctgcta agatcgagaa actgctggca 2400 tggctggaaa cgctgaaagc tgaactgggt attccgaaat ctatccgtga agctggcgtt 2460 caggaagcag acttcctggc gaacgtggat aaactgtctg aagatgcatt cgatgaccag 2520 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aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 2340 gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 2400 ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 2460 ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 2520 acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 2580 gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 2640 cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 2700 tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc 2760 gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc 2820 gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg 2880 gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agcagatcaa 2940 ttcgcgcgcg aaggcgaagc ggcatgcatt tacgttgaca ccatcgaatg gtgcaaaacc 3000 tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa 3060 ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc 3120 gtggtgaacc aggccagcca 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caacttttgg cgaaaatgag acgttgatcg gcacgtaaga ggttccaact ttcaccataa 3120 tgaaataaga tcactaccgg gcgtattttt tgagttatcg agattttcag gagctaagga 3180 agctaaa 3187

Claims (15)

  1. Nudix 계열의 효소를 파네실 파이로포스페이트와 반응시켜 파네솔을 얻는 단계를 포함하고,
    상기 Nudix 계열의 효소는 NudB인 터펜 알코올의 제조 방법.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 NudB는 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 효소인 터펜 알코올의 제조 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 반응은 Nudix 계열의 효소를 발현하는 미생물 내에서 수행되는 터펜 알코올의 제조 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 미생물은 메발로네이트 경로의 효소를 더 발현하는 것인 터펜 알코올의 제조 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 미생물은 제라닐 파이로포스페이트 신타제 를 더 발현하는 것인 터펜 알코올의 제조 방법.
  7. 청구항 5 있어서, 상기 미생물은 파네실 파이로포스페이트 신타제를 더 발현하는 것인 터펜 알코올의 제조 방법.
  8. Nudix 계열의 효소를 파네실 파이로포스페이트와 반응시켜 파네솔을 얻는 단계; 및
    상기 파네솔을 알코올 탈수소화 효소와 반응시키는 단계;를 포함하는 터펜 알데히드의 제조 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 반응은 Nudix 계열의 효소를 발현하는 미생물 내에서 수행되는 터펜 알데히드의 제조 방법.
  10. Nudix 계열의 효소를 파네실 파이로포스페이트와 반응시켜 파네솔을 얻는 단계;
    상기 Nudix 계열의 효소를 이소펜테닐 파이로포스페이트 또는 디메틸알릴 파이로포스페이트와 반응시키는 단계;
    상기 반응에서의 미반응 이소펜테닐 파이로포스페이트 또는 디메틸알릴 파이로포스페이트를 제라닐 파이로포스페이트 신타제와 반응시키는 단계; 및
    상기 반응에서의 미반응 이소펜테닐 파이로포스페이트와 상기 반응으로 생성된 제라닐 파이로포스페이트를 파네실 파이로포스페이트 신타제와 반응시키는 단계를 포함하는 터펜 알코올의 제조 방법.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 청구항 10에 있어서, 상기 반응은 Nudix 계열의 효소 및 제라닐 파이로포스페이트 신타제를 발현하는 미생물 내에서 수행되는 터펜 알코올의 제조 방법.
  14. 청구항 10에 있어서, 상기 반응은 Nudix 계열의 효소 및 파네실 파이로포스페이트 신타제를 발현하는 미생물 내에서 수행되는 터펜 알코올의 제조 방법.
  15. Nudix 계열의 효소를 파네실 파이로포스페이트와 반응시켜 파네솔을 얻는 단계;
    상기 Nudix 계열의 효소를 이소펜테닐 파이로포스페이트 또는 디메틸알릴 파이로포스페이트와 반응시키는 단계;
    상기 반응에서의 미반응 이소펜테닐 파이로포스페이트 또는 디메틸알릴 파이로포스페이트를 제라닐 파이로포스페이트 신타제와 반응시키는 단계;
    상기 반응에서의 미반응 이소펜테닐 파이로포스페이트와 상기 반응으로 생성된 제라닐 파이로포스페이트를 파네실 파이로포스페이트 신타제와 반응시키는 단계; 및
    상기 Nudix 계열의 효소와 이소펜테닐 파이로포스페이트 또는 디메틸알릴 파이로포스페이트의 반응 산물을 아세틸 트랜스퍼라제 및 코엔자임 A와 반응시키는 단계를 포함하는 터펜 아세테이트의 제조 방법.
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