CN111254104B

CN111254104B - 基因工程化大肠杆菌及吲哚-3-乙酸的制备方法

Info

Publication number: CN111254104B
Application number: CN202010070793.XA
Authority: CN
Inventors: 祁峰; 黄建忠; 吴弘轩; 罗艺献; 秦丽娜; 李清晨; 林金新
Original assignee: Fujian Normal University
Current assignee: Fujian Normal University
Priority date: 2020-01-21
Filing date: 2020-01-21
Publication date: 2023-02-10
Anticipated expiration: 2040-01-21
Also published as: CN111254104A

Abstract

本发明公开了一种基因工程化大肠杆菌及吲哚‑3‑乙酸的制备方法。本发明的基因工程化大肠杆菌中含有色氨酸脱羧酶基因、二胺氧化酶基因和吲哚‑3‑乙醛脱氢酶基因，且所述的基因工程化大肠杆菌能够产生具有活性的色氨酸脱羧酶、具有活性的二胺氧化酶和具有活性的吲哚‑3‑乙醛脱氢酶。本发明的基因工程化大肠杆菌能够将色氨酸转化为吲哚‑3‑乙酸。

Description

基因工程化大肠杆菌及吲哚-3-乙酸的制备方法

技术领域

本发明涉及一种基因工程化大肠杆菌及吲哚-3-乙酸的制备方法。

背景技术

吲哚-3-乙酸( indole-3-acetic acid, IAA)又称为植物生长素，可以通过调节植物的形态来适应外界压力，尤其可以促进根的生长，是植物体自身合成的用以调控植物生长发育的重要化学物质。吲哚-3-乙酸可以激发和调控植物体内众多生理反应，在植物细胞分裂、向性生长、顶端优势、果实发育和衰老以及其他应激反应中起着重要作用。吲哚-3-乙酸还会对病原菌、干旱、重金属及其螯合物的胁迫缓解等作出应答。此外，生长素还可以通过与其他激素的相互作用调节植物修复等其他生理活动。

除了植物本身可以合成吲哚-3-乙酸，多种微生物如假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、固氮菌(Azotobacter sp.)和固氮螺菌(Azospirillum sp.)等植物中的内生菌也可以产生吲哚-3-乙酸。在植物和细菌中，目前已知存在五种不同的吲哚-3-乙酸生物合成途径。这些途径均以色氨酸为底物，分别通过色氨酸的衍生物吲哚-3-乙酰胺(IAM)、吲哚-3-丙酮酸(IPA)、色胺、吲哚-3-乙醛肟和吲哚-3-乙醛获得吲哚-3-乙酸。从植物或其特定的内生菌株中提取获得吲哚-3-乙酸，可以有效应用于植物的人工定向培育和生长控制，所以吲哚-3-乙酸被广泛应用在现代农业生产中。但是植物或细菌自发合成吲哚-3-乙酸会受到复杂的环境胁迫调节，包括pH、渗透胁迫和碳限制等；另外吲哚-3-乙酸各个合成途径基因的表达方式以及转录调节因子也会限制吲哚-3-乙酸的合成，所以植物或内生菌株只能自发合成极微量的吲哚-3-乙酸。目前，也存在使用化学合成吲哚-3-乙酸的报道，但是化学法涉及到多步反应，导致产物吲哚-3-乙酸得率很低并且会对环境造成污染。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种基因工程化大肠杆菌，其能够产生具有活性的色氨酸脱羧酶、具有活性的二胺氧化酶和具有活性的吲哚-3-乙醛脱氢酶。本发明的另一个目的在于提供上述基因工程化大肠杆菌的制备方法。本发明再一个目的在于提供一种吲哚-3-乙酸的制备方法，该方法利用上述基因工程化大肠杆菌制得吲哚-3-乙酸。

一方面，本发明提供一种基因工程化大肠杆菌，所述的基因工程化大肠杆菌中含有色氨酸脱羧酶基因、二胺氧化酶基因和吲哚-3-乙醛脱氢酶基因，且所述的基因工程化大肠杆菌能够产生具有活性的色氨酸脱羧酶、具有活性的二胺氧化酶和具有活性的吲哚-3-乙醛脱氢酶。优选地，色氨酸脱羧酶基因的碱基序列如SEQ ID NO:17所示。本发明的色氨酸脱羧酶基因可以来源于长春花（Catharanthus roseus）。优选地，二胺氧化酶基因的碱基序列如SEQ ID NO:18所示。本发明的二胺氧化酶基因可以来源于黑曲霉（Aspergillus niger）。优选地，吲哚-3-乙醛脱氢酶基因的碱基序列如SEQ ID NO:19所示。本发明的吲哚-3-乙醛脱氢酶基因可以来源于黑粉霉（Ustilago maydis）。这样有利于色氨酸脱羧酶基因、二胺氧化酶基因和吲哚-3-乙醛脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达。

根据本发明的一个实施方式，所述的色氨酸脱羧酶基因的碱基序列如SEQ ID NO:17所示，所述二胺氧化酶基因的碱基序列如SEQ ID NO:18所示，且所述的吲哚-3-乙醛脱氢酶基因的碱基序列如SEQ ID NO:19所示。

根据本发明的另一个实施方式，所述的色氨酸脱羧酶基因来源于长春花（Catharanthus roseus），所述二胺氧化酶基因的碱基来源于黑曲霉（Aspergillus niger），且所述的吲哚-3-乙醛脱氢酶基因的碱基来源于黑粉霉（Ustilago maydis）。

根据本发明的基因工程化大肠杆菌，优选地，基因工程化大肠杆菌由基因工程化大肠杆菌重组质粒转化至大肠杆菌获得，所述基因工程化大肠杆菌重组质粒由色氨酸脱羧酶基因、二胺氧化酶基因和吲哚-3-乙醛脱氢酶基因与大肠杆菌质粒重组得到。大肠杆菌质粒可以为pTrc99A，其碱基序列如SEQ ID NO:22所示。大肠杆菌可以为大肠杆菌（Escherichia coli） MG1655，其可购自ATCC (保藏编号ATCC700926)。这些大肠杆菌属于市售产品，因而不需要额外的保藏证据及遗传资源登记资料。

根据本发明的基因工程化大肠杆菌，优选地，所述的大肠杆菌质粒为pTrc99A，所述的大肠杆菌为大肠杆菌（Escherichia coli） MG1655。

另一方面，本发明提供一种基因工程化大肠杆菌的制备方法，其通过对常规的大肠杆菌进行基因重组使其具有色氨酸脱羧酶、二胺氧化酶和吲哚-3-乙醛脱氢酶活性而得到。具体包括构建基因工程化大肠杆菌重组质粒的步骤和转化所述基因工程化大肠杆菌质粒至大肠杆菌的步骤。

构建基因工程化大肠杆菌重组质粒的步骤包括：使用第一引物以色氨酸脱羧酶基因为模板扩增得到色氨酸脱羧酶基因扩增物，使用第二引物以大肠杆菌质粒为模板扩增得到大肠杆菌载体骨架，将色氨酸脱羧酶基因扩增物和大肠杆菌载体骨架连接，得到第一重组载体；其中，所述的第一引物和第二引物中含有匹配的同源臂；优选地，所述第一引物的碱基序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；所述第二引物的碱基序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

使用第三引物以二胺氧化酶基因为模板扩增得到二胺氧化酶基因扩增物，使用第四引物以第一重组载体为模板扩增得到第一重组载体扩增物，将二胺氧化酶基因扩增物和第一重组载体扩增物连接，得到第二重组载体，其中，所述的第三引物和第四引物中含有匹配的同源臂；优选地，所述第三引物的碱基序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；所述第四引物的碱基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；

使用第五引物以吲哚-3-乙醛脱氢酶基因为模板扩增得到吲哚-3-乙醛脱氢酶基因扩增物，使用第六引物以第二重组载体为模板扩增得到第二重组载体扩增物，将吲哚-3-乙醛脱氢酶基因扩增物和第二重组载体扩增物连接，得到第三重组载体；其中，所述的第五引物和第六引物中含有匹配的同源臂；优选地，所述第五引物的碱基序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；所述第六引物的碱基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；

分别使用第七引物和第八引物以第三重组载体为模板扩增得到含有tac启动子序列的扩增物和第三重组载体扩增物，将含有tac启动子序列的扩增物连接在第三重组载体扩增物的色氨酸脱羧酶基因之前，得到基因工程化大肠杆菌重组质粒；其中，所述的第七引物和第八引物中含有匹配的同源臂；优选地，所述第七引物的碱基序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；所述第八引物的碱基序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。

本发明对于基因片段的连接方法不作限制。根据本发明的一个实施方式，基因片段采用Gibson Assembly（NEB公司，美国）无缝连接的方法构建。

根据本发明的基因工程化大肠杆菌的制备方法，优选地，色氨酸脱羧酶基因的碱基序列如SEQ ID NO:17所示。本发明的色氨酸脱羧酶基因可以来源于长春花（Catharanthus roseus）。优选地，二胺氧化酶基因的碱基序列如SEQ ID NO:18所示。本发明的二胺氧化酶基因可以来源于黑曲霉（Aspergillus niger）。优选地，吲哚-3-乙醛脱氢酶基因的碱基序列如SEQ ID NO:19所示。本发明的吲哚-3-乙醛脱氢酶基因可以来源于黑粉霉（Ustilago maydis）。这样有利于色氨酸脱羧酶基因、二胺氧化酶基因和吲哚-3-乙醛脱氢酶基因在大肠杆菌中的表达。

根据本发明的基因工程化大肠杆菌的制备方法，优选地，所述第一引物的碱基序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；所述第二引物的碱基序列如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示；所述第三引物的碱基序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；所述第四引物的碱基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；所述第五引物的碱基序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；所述第六引物的碱基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；所述第七引物的碱基序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；所述第八引物的碱基序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。这样能够成功地获得基因工程化大肠杆菌重组质粒，并使色氨酸脱羧酶基因、二胺氧化酶基因和吲哚-3-乙醛脱氢酶基因表达。

在重组质粒中，色氨酸脱氢酶基因的启动子为大肠杆菌质粒自带的启动子，二胺氧化酶基因和吲哚-3-乙醛脱氢酶基因的共用外加tac启动子，这三个基因共用一个TrrnB终止子，从而构建成为色氨酸脱氢酶基因、二胺氧化酶基因和吲哚-3-乙醛脱氢酶基因共同表达的重组质粒。

转化所述基因工程化大肠杆菌质粒至大肠杆菌的步骤包括：（1）制备化学感受态的大肠杆菌；和（2）质粒转化。优选地，采用氯化钙法制备化学感受态的大肠杆菌。优选地，使用热激转化的方式进行质粒转化。这样有利于成功地获得基因工程化大肠杆菌。

任选地，本发明还可以包含质粒验证的步骤。挑选能够在含有氨苄青霉素的培养基上生长的阳性菌株，提取质粒验证，将验证通过的菌株置于-80 ℃保存待用。优选地，所述质粒验证使用的引物的碱基序列如SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示。

再一方面，本发明提供一种吲哚-3-乙酸的制备方法，包括使用上述基因工程化大肠杆菌的步骤。具体地，采用所述的基因工程化大肠杆菌催化色氨酸，获得吲哚-3-乙酸。在某些实施方式中，上述基因工程化大肠杆菌催化作为底物的色氨酸，获得吲哚-3-乙酸。当在色氨酸脱羧酶基因、二胺氧化酶基因和吲哚-3-乙醛脱氢酶基因在基因工程化大肠杆菌的胞内表达形成具有活性的色氨酸脱羧酶、二胺氧化酶和吲哚-3-乙醛脱氢酶时，酶的活性并未对大肠杆菌内的其他代谢途径产生较大影响，大肠杆菌活性保持正常，并且将色氨酸转化为吲哚-3-乙酸。具体过程参见图2。

在本发明的某些实施方式中，吲哚-3-乙酸的制备方法，包括如下步骤：

（1）将所述的基因工程化大肠杆菌先在包含氨苄青霉素的液体培养基中培养，得到第一培养液；将至少一部分第一培养液在无氨苄青霉素的液体培养基中培养，获得第二培养液；

（2）向第二培养液中加入异丙基-硫代半乳糖苷继续培养，获得第三培养液，收集第三培养液中的菌体；

（3）将收集的菌体用缓冲液重悬，形成悬浮液；然后向悬浮液中加入色氨酸，得到吲哚-3-乙酸。

在步骤（1）中，包含氨苄青霉素的液体培养基可以为包含氨苄青霉素的液体LB培养基；优选地，包含氨苄青霉素的液体LB培养基中，以每1L去离子水计，含有10g胰蛋白胨，10 g酵母提取物5 g氯化钠。包含氨苄青霉素的液体培养基中，液体培养基与氨苄青霉素的体积比为800～1200:1；优选为900～1100:1。无氨苄青霉素的液体培可以为液体LB培养基；优选地，液体LB培养基中，以每1L去离子水计，含有10g胰蛋白胨，10 g酵母提取物5 g氯化钠。这样有利于收集基因工程化大肠杆菌质粒转化成功的大肠杆菌，提高吲哚-3-乙酸的产量。

在本发明中，第二培养液在600nm波长处的吸光值OD₆₀₀为0.1～1；优选为0.4～0.8。异丙基-硫代半乳糖苷的浓度为0.5～2mol/L；优选为0.8～1.3mol/L。无氨苄青霉素的液体培养基与异丙基-硫代半乳糖苷的体积比1700～2200:1；优选为1900～2100:1。这样有利于基因化大肠杆菌的生长和蛋白质的表达。

在本发明中，第三培养液在600nm波长处的吸光值OD₆₀₀为2～6；优选为3～5。在某些实施方式中，可以采用离心的方式收集第三培养液中的菌体。这样有利于基因工程化大肠杆菌的收集，从而提高吲哚3-乙酸的产量。

在步骤（3）中，所述的缓冲液为Tris-HCl缓冲液。优选地，Tris-HCl缓冲液的pH值为6～8；更优选为7～8。优选地，Tris缓冲液的浓度为10～80mM；更优选为40～60mM。色氨酸以色氨酸溶液的形式加入。色氨酸溶液浓度为1～4g/L；优选为1～3g/L。这样有利于提高吲哚3-乙酸的产量。

本发明通过基因工程的方式将色氨酸脱羧酶基因、二胺氧化酶基因和吲哚-3-乙醛脱氢酶基因转化至常规的大肠杆菌中形成基因工程化大肠杆菌，其能够产生具有活性的色氨酸脱羧酶、二胺氧化酶和吲哚-3-乙醛脱氢酶。进一步地，本发明利用该基因工程化大肠杆菌，能够将色氨酸转化为吲哚-3-乙酸。更进一步地，该方法反应条件温和，吲哚-3-乙酸产量较高。

附图说明

图1为本发明的基因工程化大肠杆菌重组质粒的构建示意图。

图2为本发明的色氨酸转化为吲哚-3-乙酸的反应过程图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

本发明中，名词术语既包括单数形式，也包括复数形式，除非上下文另行明确指出。例如，“样品”包括一种或多种样品和为本领域技术人员所已知的其等同物等等。本发明中所述的“至少之一”或“至少一种”不仅仅指包含“一个”或“一种”的情况，更重要的还包含“多个”或“多种”的情况。

本发明中所述的具体方法、步骤以及其中所使用的试剂、材料等，除非另作说明，否则均为本领域内通常已知的，并且也容易地通过公开出版物获知或通过购买获得。具体出版物可参见，例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物等。

下面描述实施例使用的原料：

LB培养基：包括重量比为2:2:1的胰蛋白胨，酵母提取物和氯化钠。

液体LB培养基：每1 L去离子水中含有10g胰蛋白胨，10g酵母提取物，5g氯化钠。

LB平板培养基：在液体LB培养基的基础上，加入1.5%（w/v）琼脂粉，然后121℃高压灭菌20min；待培养基冷却至50℃左右时，将培养基倒至无菌培养皿，得到无抗LB平板培养基。

含有氨苄青霉素的LB平板培养基：向无抗LB平板培养基中加入氨苄青霉素，使氨苄青霉素浓度为100μg/mL，获得具有氨苄青霉素抗性的LB平板培养基。

实施例1

1. 构建基因工程化大肠杆菌重组质粒

使用Gibson Assembly（NEB公司，美国）无缝连接的方法构建基因工程化大肠杆菌重组质粒。使用第一引物（碱基序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示）以色氨酸脱羧酶基因（碱基序列如SEQ ID NO:17所示）为模板扩增得到色氨酸脱羧酶基因扩增物，使用第二引物（碱基序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示）以大肠杆菌质粒pTrc99A（碱基序列如SEQID NO:22 所示）为模板扩增得到大肠杆菌载体骨架，将色氨酸脱羧酶基因扩增物和大肠杆菌载体骨架连接，得到第一重组载体；

使用第三引物（碱基序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示）以二胺氧化酶基因（碱基序列如SEQ ID NO:18所示）为模板扩增得到二胺氧化酶基因扩增物，使用第四引物（碱基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示）以第一重组载体为模板扩增得到第一重组载体扩增物，将二胺氧化酶基因扩增物和第一重组载体扩增物连接，得到第二重组载体；

使用第五引物（碱基序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示）以吲哚-3-乙醛脱氢酶基因（碱基序列如SEQ ID NO:19所示）为模板扩增得到吲哚-3-乙醛脱氢酶基因扩增物，使用第六引物（碱基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示）以第二重组载体为模板扩增得到第二重组载体扩增物，将吲哚-3-乙醛脱氢酶基因扩增物和第二重组载体扩增物连接，得到第三重组载体；

分别使用第七引物（碱基序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示）和第八引物（碱基序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示）以第三重组载体为模板扩增得到含有tac启动子序列的扩增物和第三重组载体扩增物，将含有tac启动子序列的扩增物连接在第三重组载体扩增物的色氨酸脱羧酶基因之前，得到基因工程化大肠杆菌重组质粒。

2. 化学感受态的大肠杆菌的制备

将大肠杆菌（Escherichia coli）MG1655（购自ATCC，保藏编号ATCC700926）接种至无抗LB平板培养基上，37℃温度下过夜培养，获得单菌落。挑取长势良好的单菌落接种至3mL液体LB培养基，在37℃和220rpm的条件下培养12h。接着，将种子液按1%的接种量接种至50mL液体LB培养基，在37℃和220rpm的条件下培养大肠杆菌。当OD₆₀₀为0.6时，停止培养，迅速将培养物置于冰中冷却。然后，将菌液转移至预冷的50mL离心管中，以3500rpm离心10min，弃上清液，收集菌体至EP管中。接着，用25mL预冷无菌的0.1M的CaCl₂冲洗菌体两次，以3500rpm离心10min，再次弃上清液，收集菌体。最后，用2mL预冷0.1M的CaCl₂（含10wt%甘油）重悬菌体，按每管100μL分装至预冷的1.5mL离心管，得到化学感受态的大肠杆菌，置于-80 ℃保存待用。

3. 质粒转化

将一管容纳有化学感受态的大肠杆菌的离心管置于冰上，然后加入0.5μL的基因工程化大肠杆菌重组质粒，冰浴处理30min，用42℃热水浴处理90s，然后立即冰浴处理2min。随后，将650μL的LB液体培养基加入容纳有化学感受态的大肠杆菌的离心管内，将离心管置于37℃摇床，150rpm培养1h；摇床培养后，500rpm离心2min，留少许上清液重悬细胞，并涂布至具有氨苄青霉素抗性的LB平板培养基上，37℃过夜培养。挑取转化子菌落进行PCR验证，验证引物的碱基序列如SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:21所示。将验证通过的菌株置于甘油管中，得到基因工程化大肠杆菌，将基因工程化大肠杆菌置于-80℃保存待用。

4. 工程菌菌体培养及全细胞催化

将基因工程化大肠杆菌接入5ml液体LB培养基，然后再加入5μl氨苄青霉素，在摇床（温度为37℃，转数为220rpm）中培养12h ，得到第一培养液；取1vol%第一培养液接入含有50ml的液体LB培养基中，在摇床（温度为37℃，转数为220rpm）中培养至OD₆₀₀为0.6时，加入25μl的异丙基-硫代半乳糖苷（浓度为1mol/L），在摇床（温度为30℃，转数为220rpm）中培养至OD₆₀₀为4，采用离心的方式收集菌体。

在收集到的菌体中加入50mlTris-HCl缓冲液（浓度为50mM，pH值为7.5），然后再加入2g/L的色氨酸，在摇床（温度为30℃，转数为220rpm）中培养48h，得到含有吲哚-3-乙酸的菌液。

5. 吲哚-3-乙酸产量的检测

取1.5ml得到的含有吲哚-3-乙酸的菌液，8000rpm离心4min，取上清液；将上清液用0.22μm的滤头过滤到液相瓶中，用HPLC 2998PDA Detector（购买自Waters）检测吲哚-3-乙酸的产量。

检测条件设定如下：

流动相A为水，含0.1vol%甲酸；

流动相B为甲醇。

经过检测，实施例1中吲哚3-乙酸的产量为52mg/L。未经基因工程化的大肠杆菌则不能将色氨酸转化为吲哚3-乙酸。

本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。

序列表

<110> 福建师范大学

<120> 基因工程化大肠杆菌及吲哚-3-乙酸的制备方法

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatccgaagc agcggcaaaa aggaggatgg gcagcattga tagtac 46

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgcatgcct gcaggtcgac ttatgcttct ttcagcagat 40

<210> 3

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atctgctgaa agaagcataa gtcgacctgc aggcatgcaa 40

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaatgctgc ccatcctcct ttttgccgct gcttcggatc 40

<210> 5

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

acctgcaggc atgcaagctt aaggagatgc tgccgcatcc g 41

<210> 6

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tctcatccgc caaaacagcc ttaaatatgg gcattacgac 40

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtcgtaatgc ccatatttaa ggctgttttg gcggatgaga 40

<210> 8

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggatgcggca gcatctcctt aagcttgcat gcctgcaggt 40

<210> 9

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ccatatttaa ggctgttttg aaggagatgc cgaccctgaa tctg 44

<210> 10

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gaaaatcttc tctcatccgc ttaaatcggt gccggct 37

<210> 11

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gccagccggc accgatttaa gcggatgaga gaagatttt 39

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ttcagggtcg gcatctcctt caaaacagcc ttaaatatgg 40

<210> 13

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

acctgcaggc atgcaagctt cacagctaac accacgt 37

<210> 14

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggatgcggca gcatctcctt ggttaattcc tcctgttacg 40

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cgtaacagga ggaattaacc aaggagatgc tgccgcatcc 40

<210> 16

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

acgacgtggt gttagctgtg aagcttgcat gcctgcaggt 40

<210> 17

<211> 1503

<212> DNA

<213> 长春花(Catharanthus roseus)

<400> 17

atgggcagca ttgatagtac caatgttgca atgagcaata gtccggttgg tgagtttaaa 60

ccgctggaag ccgaagaatt tcgtaaacag gcccatcgta tggttgattt tattgcagat 120

tattacaaga acgtggaaac ctatccggtg ctgagcgaag tggaaccggg ttatctgcgt 180

aaacgcattc cggaaaccgc accgtatctg ccggaaccgc tggatgatat tatgaaagat 240

attcagaagg acatcatccc gggtatgacc aattggatga gcccgaattt ttatgccttt 300

ttcccggcaa ccgttagcag cgcagccttt ctgggcgaaa tgctgagtac cgccctgaat 360

agtgtgggtt ttacctgggt tagtagtccg gccgcaaccg aactggaaat gattgtgatg 420

gattggctgg cacagattct gaaactgccg aaaagcttta tgtttagcgg tacaggcggt 480

ggtgtgattc agaataccac cagcgaaagc attctgtgca ccattattgc cgcccgcgaa 540

cgtgcactgg aaaaactggg cccggatagc attggcaaac tggtgtgtta tggcagcgat 600

cagacccata ccatgtttcc gaaaacctgc aaactggcag gcatctatcc gaataatatt 660

cgtctgattc cgaccaccgt ggaaaccgat tttggtatta gtccgcaggt tctgcgtaaa 720

atggttgaag atgatgttgc cgcaggctat gttccgctgt ttctgtgtgc caccctgggt 780

acaaccagca ccaccgccac cgatccggtt gatagtctga gtgaaattgc caatgaattt 840

ggtatttgga ttcatgtgga tgcagcctat gccggcagcg catgcatttg tccggaattt 900

cgccattatc tggatggtat tgaacgcgtt gatagcctga gcctgagccc gcataaatgg 960

ctgctggcct atctggattg tacctgcctg tgggttaaac agccgcatct gctgctgcgt 1020

gcactgacca ccaatccgga atatctgaaa aataagcaga gtgatctgga taaagtggtg 1080

gattttaaaa attggcagat tgcaaccggt cgcaaatttc gtagtctgaa actgtggctg 1140

attctgcgta gctatggcgt tgttaatctg cagagtcata ttcgcagtga tgtggccatg 1200

ggcaaaatgt ttgaagaatg ggttcgtagc gatagtcgtt ttgaaattgt tgtgccgcgt 1260

aattttagcc tggtgtgctt tcgcctgaaa ccggatgtta gcagtctgca tgttgaagaa 1320

gtgaataaga aactgctgga tatgctgaat agtaccggcc gcgtgtatat gacccatacc 1380

attgttggtg gtatctatat gctgcgtctg gcagtgggta gtagtctgac cgaagaacat 1440

catgtgcgtc gtgtgtggga tctgattcag aaactgaccg atgatctgct gaaagaagca 1500

taa 1503

<210> 18

<211> 2016

<212> DNA

<213> 黑曲霉(Aspergillus niger)

<400> 18

atgctgccgc atccgctggc cattctgagc gaagaagaaa ccaatattgc acgtaatgtt 60

attctggcac agcatccgaa taccgtgatt gattttcgtg aaatctatct gagcgaaccg 120

ccgaaagccc agctgctgga atttctggcc ctggaacata gcggtcgtct gagtccgacc 180

agcccgcgcc ctcctcgtct ggcactgtgt cagtatgatg ttattggtaa tgatcgtatt 240

ccgagctttg aagaaagtgt tgtggatgtg ggtacccgcc agcgcgtgca gcatcgcgtt 300

gttggcaaag aacatcatgc cagtctgacc ctgagtgaat ttgataccct ggttgaacgt 360

tgttttgcca gtccgctgtt tcagaaagcc ctggccgatt ttgatctgcc ggaaggtttt 420

gaagttgtta ttgaaccgtg gccgtatggc ggtctggatt atgtggaaga aaaacgccgc 480

tattttcagg gcctgtgctt tgccaccgat aaacgcaaaa ataatccgga tgcaaatttt 540

tatagctacc cgctgccgct gattccggtt atggatgccc tgacccagga aattattcgt 600

gtggatcgtc cggcaaccgg tggtaaaggt gaaggcctga ccgaacagac ctttaaacgt 660

gatattattg gccattgtaa ggatagtgat tatgttccgg aactgaatcc gggcggcacc 720

cgcaaagatc tgaaaccgct gaatgttgtt cagccggaag gtccgagctt tcgcattacc 780

gaagaaagcc tggttgaatg gcagaaatgg cgctttcgcg ttgcattcaa tccgcgtgaa 840

ggcgccacca ttcatgatgt ttggtatgat ggccgcagcg tgctgtatcg cctgagcgtt 900

agtgaaatga ccgtgccgta tgccgatccg cgcccgcctt ttcatcgcaa acaggccttt 960

gattttggcg atggtggtgg cggtaatatg gcaaataatc tgagcattgg ttgcgattgt 1020

ctgggcgtga ttaagtattt tgatgcagtg atgaccggtg cagatggtag cgcaaaaaag 1080

atgccgaatg caatttgcct gcatgaacag gataatggca ttggctggaa acatagcaat 1140

tggcgcaccg gtcgtgccgt tgtgacccgt catcgcgaac tggttgttca gtttattatt 1200

accctggcca attatgaata catttttgcc tataagttcg accagagcgg cggcattacc 1260

gttgaaagtc gtgccaccgg tattctgaat gttgtgaata ttgatgcagg caaagtgagt 1320

gaatatggta atgtggtgag cggtggcgtg ctggcacaga atcatcagca tattttctgt 1380

gttcgcattg atccggcaat tgatggtccg aataatagtg ttcaggttga agaaagccat 1440

ccggttccga tgaatgcagt gaccaatccg aatggcaatt tttataaagt gaacaccgaa 1500

accatggaac gcgcaggctt tttcgatgca gcaccggaac tgaaccgtac cgttaaaatg 1560

gtgaatccgc ataaaaagaa tccgattagt cagaaaccgg tgggttataa attcattccg 1620

ctggccaccc agcgtctgct ggcagatccg aatagtattc aggcacgtcg tgcacagttt 1680

gcccagcatc atgtttgggt taccaaatat cgtgatggtg aactgtatgc aggtggtcgt 1740

tataccctgc agagtcagga agaaattgaa ggtgtgagtg atgcagttaa acgtggcgat 1800

agtgttgtgg acaccgatgt tgttgtgtgg agcacctttg gcattaccca taatccgcgc 1860

gttgaagatt ggccggttat gccggtggaa atttttcagc tgatgattcg tccggccgat 1920

ttctttaccg ccaatccgag tctggatgtt ccgagtgata aaaatattag cagccgtgtg 1980

gtgggtaatg attgctgtcg taatgcccat atttaa 2016

<210> 19

<211> 1494

<212> DNA

<213> 黑粉菌(Ustilago maydis)

<400> 19

atgccgaccc tgaatctgga tctgccgaat ggtattaaga gcaccattca ggccgatctg 60

tttattaata ataagtttgt gccggccctg gatggcaaaa cctttgccac cattaatccg 120

agtaccggca aagaaattgg tcaggttgca gaagcaagcg ccaaagatgt ggatctggca 180

gttaaagcag cacgtgaagc ctttgaaacc acctggggtg aaaatacccc gggcgatgca 240

cgtggccgtc tgctgattaa gctggccgaa ctggtggaag ccaatattga tgaactggca 300

gccattgaaa gcctggataa tggcaaagca ttttctattg caaaaagttt tgacgtggca 360

gccgtggccg caaatctgcg ctattatggt ggttgggccg ataaaaatca tggcaaagtg 420

atggaagtgg ataccaaacg tctgaattat acccgccatg aaccgattgg cgtttgtggc 480

cagattattc cgtggaattt tccgctgctg atgtttgcat ggaaactggg cccggcactg 540

gcaaccggta ataccattgt tctgaaaacc gcagaacaga ccccgctgag cgcaattaag 600

atgtgtgaac tgattgttga agccggcttt ccgccgggtg ttgttaatgt gattagcggt 660

tttggcccgg ttgccggcgc cgctattagc cagcatatgg atattgataa aatcgcattc 720

actggcagta ccctggtggg tcgcaatatt atgaaagccg ccgcaagtac caatctgaaa 780

aaagtgaccc tggaactggg tggcaaaagc ccgaatatta tttttaaaga tgcggatctg 840

gaccaggccg tgcgttggag cgcctttggc attatgttta atcatggcca gtgttgctgt 900

gcaggcagcc gtgtttatgt ggaagaaagc atctatgatg cctttatgga aaaaatgacc 960

gcacattgta aagccctgca ggttggcgat ccgtttagtg ccaatacctt tcagggtccg 1020

caggttagcc agctgcagta tgatcgcatt atggaatata ttgaaagcgg taaaaaggat 1080

gcaaatctgg cactgggtgg tgtgcgcaaa ggcaatgaag gttattttat tgaaccgacc 1140

atttttaccg atgtgccgca tgatgcaaaa attgccaaag aagaaatttt cggtccggtg 1200

gttgttgtga gcaaattcaa agatgaaaaa gatctgatcc gtattgcaaa tgatagcatc 1260

tatggtctgg ccgcagccgt gttcagccgt gatattagtc gtgccattga aaccgcacat 1320

aaactgaaag caggcaccgt ttgggtgaat tgttataatc agctgattcc gcaggtgccg 1380

tttggcggct ataaagccag tggcattggc cgcgaactgg gtgaatatgc cctgagtaat 1440

tataccaata ttaaggcagt tcacgttaat ctgagccagc cggcaccgat ttaa 1494

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ataatgtttt ttgcgccgac 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

atctgtatca ggctgaaaat 20

<210> 22

<211> 4176

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 22

gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc 60

ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc 120

gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc 180

tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga 240

taacaatttc acacaggaaa cagaccatgg aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta 300

gagtcgacct gcaggcatgc aagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc 360

tgatacagat taaatcagaa cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca 420

gtagcgcggt ggtcccacct gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg 480

atggtagtgt ggggtctccc catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga 540

aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc 600

ctgagtagga caaatccgcc gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg 660

tggcgggcag gacgcccgcc ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg 720

acggatggcc tttttgcgtt tctacaaact ctttttgttt atttttctaa atacattcaa 780

atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 840

agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 900

ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 960

gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 1020

gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 1080

tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 1140

acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 1200

aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 1260

cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 1320

gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 1380

cgatgcctac agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 1440

tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 1500

tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 1560

ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 1620

tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 1680

gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 1740

ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1800

tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1860

agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1920

aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1980

cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt 2040

agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 2100

tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 2160

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 2220

gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 2280

ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 2340

gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 2400

ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 2460

ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 2520

acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 2580

gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 2640

cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 2700

tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc 2760

gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc 2820

gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg 2880

gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agcagatcaa 2940

ttcgcgcgcg aaggcgaagc ggcatgcatt tacgttgaca ccatcgaatg gtgcaaaacc 3000

tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa 3060

ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc 3120

gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg 3180

gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac tggcgggcaa acagtcgttg 3240

ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg 3300

attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc 3360

ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg cgcaacgcgt cagtgggctg 3420

atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg tggaagctgc ctgcactaat 3480

gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca tcaacagtat tattttctcc 3540

catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc 3600

gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat 3660

aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc 3720

atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg gcatcgttcc cactgcgatg 3780

ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg ccattaccga gtccgggctg 3840

cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat 3900

atcccgccgt caaccaccat caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac 3960

cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca 4020

ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg 4080

gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg 4140

caacgcaatt aatgtgagtt agcgcgaatt gatctg 4176

Claims

1.一种基因工程化大肠杆菌，其特征在于，所述的基因工程化大肠杆菌由基因工程化大肠杆菌重组质粒转化至大肠杆菌获得，所述基因工程化大肠杆菌重组质粒由色氨酸脱羧酶基因、二胺氧化酶基因和吲哚-3-乙醛脱氢酶基因和大肠杆菌质粒重组得到；

其中，所述的大肠杆菌质粒为pTrc99A，所述的大肠杆菌为大肠杆菌（Escherichia coli） MG1655，所述的色氨酸脱羧酶基因的碱基序列如SEQ ID NO:17所示，所述二胺氧化酶基因的碱基序列如SEQ ID NO:18所示，且所述的吲哚-3-乙醛脱氢酶基因的碱基序列如SEQ ID NO:19所示。

2. 一种权利要求1所述的基因工程化大肠杆菌的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）构建基因工程化大肠杆菌重组质粒的步骤；和

（2）转化所述基因工程化大肠杆菌重组质粒至大肠杆菌的步骤；

其中，所述构建基因工程化大肠杆菌重组质粒的步骤包括：

使用第一引物以色氨酸脱羧酶基因为模板扩增得到色氨酸脱羧酶基因扩增物，使用第二引物以大肠杆菌质粒为模板扩增得到大肠杆菌载体骨架，将色氨酸脱羧酶基因扩增物和大肠杆菌载体骨架连接，得到第一重组载体；其中，所述的第一引物和第二引物中含有匹配的同源臂；

使用第三引物以二胺氧化酶基因为模板扩增得到二胺氧化酶基因扩增物，使用第四引物以第一重组载体为模板扩增得到第一重组载体扩增物，将二胺氧化酶基因扩增物和第一重组载体扩增物连接，得到第二重组载体，其中，所述的第三引物和第四引物中含有匹配的同源臂；

使用第五引物以吲哚-3-乙醛脱氢酶基因为模板扩增得到吲哚-3-乙醛脱氢酶基因扩增物，使用第六引物以第二重组载体为模板扩增得到第二重组载体扩增物，将吲哚-3-乙醛脱氢酶基因扩增物和第二重组载体扩增物连接，得到第三重组载体；其中，所述的第五引物和第六引物中含有匹配的同源臂；

分别使用第七引物和第八引物以第三重组载体为模板扩增得到含有tac启动子序列的扩增物和第三重组载体扩增物，将含有tac启动子序列的扩增物连接在第三重组载体扩增物的色氨酸脱羧酶基因之前，得到基因工程化大肠杆菌重组质粒；其中，所述的第七引物和第八引物中含有匹配的同源臂。

3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述第一引物的碱基序列如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示；所述第二引物的碱基序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；所述第三引物的碱基序列如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；所述第四引物的碱基序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；所述第五引物的碱基序列如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；所述第六引物的碱基序列如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示；所述第七引物的碱基序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；所述第八引物的碱基序列如SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16所示。

4.一种吲哚-3-乙酸的制备方法，其特征在于，包括使用如权利要求1所述的基因工程化大肠杆菌的步骤。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：采用所述的基因工程化大肠杆菌催化色氨酸，获得吲哚-3-乙酸。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将所述的基因工程化大肠杆菌先在包含氨苄青霉素的液体培养基中培养，得到第一培养液；将至少一部分第一培养液在无氨苄青霉素的液体培养中培养，获得第二培养液；

（3）将收集的菌体用缓冲液重悬，形成悬浮液；然后向悬浮液中加入色氨酸，反应得到吲哚-3-乙酸。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，第二培养液在600nm波长处的吸光值OD₆₀₀为0.1～1；第三培养液的OD₆₀₀为2～6；缓冲液为Tris-HCl缓冲液；色氨酸以浓度为1～4g/L的色氨酸溶液的形式加入。