CN106479928B - 一株耐高盐耐高cod盐水球菌菌株和来源该菌株的内源质粒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株盐水球菌菌株及其来源的该菌株的两个内源性质粒，并在此基础上构建了衍生质粒。本发明所提供的盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408，保藏编号为CGMCC No.13032,具有耐高盐高COD的特性，使得盐水球菌不仅在微生物制造领域有广阔的应用前景，而且在高盐高COD废水处理领域具有潜在的应用价值。本发明所提供的盐水球菌质粒pS408‑1和pS408‑2及其衍生质粒，能够在盐水球菌中自主复制；借助此质粒工具，能够在盐水球菌中成功表达外源基因。本发明同时提供了一株质粒消除的盐水球菌菌株作为宿主，成功表达了金黄色葡萄球菌来源的乳酸脱氢酶。

Description

一株耐高盐耐高COD盐水球菌菌株和来源该菌株的内源质粒

技术领域

本发明涉及废水处理技术领域，尤其涉及一种耐高盐耐高COD盐水球菌处理废水技术领域。

背景技术

盐水球菌属Salinicoccus的分类地位隶属于细菌域真细菌界硬壁菌门芽孢杆菌纲芽孢杆菌目葡萄球菌科，是一类能够耐受或嗜好轻度或中度盐环境的微生物。根据LPSN(List of prokaryotic names with standing in nomenclature)数据库的统计结果，目前Salinicoccus属有15个种，分别是S.albus，S.alkaliphilus，S.amylolyticus，S.carnicancri，S.halitifaciens，S.halodurans，S.hispanicus，S.iranensis，S.jeotgali，S.kekensis，S.kunmingensis，S.luteus，S.qingdaonensis，S.roseus，S.salitudinis，S.salsiraiae，S.sesuvii，S.siamensis。盐水球菌分布广泛，目前已报道的样品来源包括盐场，盐碱湖，盐矿，沿海海水，海洋沉积物，荒漠土，盐渍土，盐岩层，柴达木盆地，海马齿根际，发酵的海鲜，盐冰场等。

盐水球菌能产生多种耐高盐的胞外水解酶，如蛋白酶，脂肪酶等，这些耐盐的蛋白资源具有重要的应用前景。Salinicoccus sp.strain QW6(后命名为S.iranensis)，具有亚碲酸盐耐受和降解能力，经过优化亚碲酸盐(0.005-0.5mM)降解率达99％；从这株菌中分离到由三个亚基组成的亚碲酸盐还原相关的酶系。亚碲酸降解菌及其还原酶系的分离鉴定，不仅为微生物消除毒性无机物提供了新的见解，而且在废水治理方面具有潜在的应用价值。除此之外，Salinicoccus halodurans H3B36能够在胞内富集N(α)-acetyl-α-lysine，用以抵抗高盐和高温，这也是一种具有潜在应用价值的相容性溶质。

除提供重要的代谢产物、基因和蛋白资源外，盐水球菌本身作为生产菌株，也具有广阔的应用前景。盐水球菌能够耐受高盐环境，其作为生产菌株，不需经过严格的灭菌消毒过程。Salinicoccus roseus W12能够耐受高达20％的乳酸盐，研究表明，交叉保护和能量代谢相关蛋白发挥重要功能；耐盐耐有机酸的特性，使得盐水球菌不仅在乳酸生产等微生物制造领域有广阔的应用前景，而且在高盐高COD废水处理领域也具有潜在的应用价值。目前尚无盐水球菌具有致病性的报道，而且其革兰氏染色呈阳性，细胞破裂后不会释放出脂多糖等免疫抗原，不会引起人类免疫反应。盐水球菌的细胞是球形，具有更大的表面积体积比，也更利于物质的跨膜转运。

目前应用于工业化生产的微生物，如不同大肠杆菌菌株的基因组大小为4.64M到5.5M之间，枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168的基因组大小为4.22M，Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的基因组大小为3.31M；具有良好产业化生产PHB前景的耐盐细菌Halomonas sp.TD01的基因组的大小是4.09M。基因组中存在着大量的假基因和在工业生产中非必需的基因，这些基因的扩增需要大量的物质和能量，而且有些基因的产物可能对菌体生长带来负面影响，所以有很多科学家尝试通过基因工程将基因组上非必需的基因缺失，或通过理性设计构建最小基因组的菌株。目前有7株盐水球菌菌株完成了基因组测序(来源NCBI数据库)，基因组大小2.55M-2.78M不等，而本发明提供的盐水球菌菌株，基因组只有2.24M(数据尚未发表)。相比于其他常用的生产菌株，盐水球菌的基因组普遍偏小，如果将天然具有较小基因组的盐水球菌发展成为工业生产的底盘细胞，可能具有不可替代的优势。

但是，目前尚无盐水球菌的遗传工具和操作方法，极大地限制了其应用潜力的开发。挖掘利用盐水球菌的遗传资源，并进一步开发盐水球菌的应用潜力，具有重要的实际意义。

发明内容

盐水球菌具有良好的耐高盐高COD的特性，尤其是耐高盐高浓度有机酸，使其在高盐高COD废水处理等领域具有潜在的产业价值。化工、制药等生产过程会产生大量的高盐高COD废水，这类废水的处理一直是水处理的重点和难点。纤维素醚的生产过程会排放大量的高盐高有机酸废水，而且纤维素醚应用范围很广，在我国产能很大。物理化学等处理方法可以实现部分高盐废水的脱盐和降COD，但是处理成本高，而且会产生较严重的二次污染。

为了解决上述问题，本发明人经过大量实验和文献研究：生物处理认为是生态环保的处理方法。用耐高盐高COD的微生物将COD降低、去除或转化为有价值的产品，处理后的普通盐水经脱盐可获得无机盐或无机盐水直接循环利用。盐水球菌系统的构建就是为实现高盐高COD废水的廉价、环保处理。

本发明的目的之一是提供一株耐高盐高COD的盐水球菌菌株。一株耐高盐高COD的盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408,保藏编号为CGMCC No.13032。

本发明提供的细菌分离自天津大港油田采油井附近储油罐下方的土壤样品，分离方法是经额外添加5％乙酸钠盐度10％的液体完全培养基富集培养两次后，在相同培养基固体平板上划线获得单克隆，其实验室内部编号为408。

经测定，该细菌16S rDNA(序列1)与Salinicoccus salsiraiae RH-1，Salinicoccus jeotgali S2R53-5和Salinicoccus siamensis PN1-2的同源性都高达99％以上，由此确定其隶属于盐水球菌属(Salinicoccus)。盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408已于2016年9月22日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneral Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.13032。

本发明提供盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408可以耐受中度盐度和高浓度乙酸盐，在完全培养基中耐受NaCl浓度的范围2-15％(培养基成分为：酸水解酪素7.5克/升，酵母提取物10克/升，谷氨酸钠1克/升，柠檬酸三钠3克/升，氯化钠20-150克/升，七水合硫酸镁20克/升，氯化钾2克/升，柠檬酸铁铵0.008克/升，pH调节到7.0-7.2)，能够耐受高达5％的乙酸。

本发明的另一目的是提供一株盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE及其来源的两个内源性质粒。

盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE已于2016年10月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological CultureCollection Center,CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.13135。

本发明提供的两个内源性质粒分离提取自盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408中。两个质粒均为环形质粒。

其中较小质粒的大小为2191bp，命名为pS408-1(核苷酸序列见序列2)；较大质粒大小为3007bp，命名为pS408-2(核苷酸序列见序列3)。

序列表中序列2由2191个核苷酸组成。其中，序列2中的自5′端第715-1641位碱基为一个开放阅读框架，其编码具有序列表中序列4(由308个氨基酸残基组成)的氨基酸残基序列的质粒复制所需的反式作用因子Rep1。

序列表中序列3由3007个核苷酸组成。其中，序列3中的自5′端第1067-2080位碱基为一个开放阅读框架，其编码具有序列表中序列5(由337个氨基酸残基组成)的氨基酸残基序列的质粒复制所需的反式作用因子Rep2。

质粒pS408-1的物理图谱如图1所示，其包括的常见限制性内切酶位点有BamHI，ClaI，PvuII酶切位点各一个。其中，序列2中的自5′端第1500-1505位碱基为BamHI酶切位点；序列2中的自5′端第323-328位碱基为ClaI酶切位点；序列2的自5′端第1019-1024位碱基为PvuII酶切位点。质粒pS408-1不含ApaI，BglII，EcoRI，EcoRV，HindIII，KpnI，NcoI，NdeI，SacII，SalI，SmaI，SphI，XbaI等常见内切酶位点，因此这些内切酶位点可作为pS408-1的衍生载体的多克隆位点。

质粒pS408-2的物理图谱如图2所示，其包括的常见限制性内切酶位点有BamHI，ClaI，EcoRI，EcoRV酶切位点各一个。其中，序列3中的自5′端第1936-1941位碱基为BamHI酶切位点；序列3中的自5′端第2689-2694位碱基为ClaI酶切位点；序列3的自5′端第698-703位碱基为EcoRI酶切位点；序列3的自5′端第2821-2826位碱基为EcoRV酶切位点。质粒pS408-2不含ApaI，BglII，HindIII，KpnI，NcoI，NdeI，PvuII，SacII，SalI，SmaI，SphI，XbaI等常见内切酶位点，因此这些内切酶位点可作为pS408-2的衍生载体的多克隆位点。

为了进一步探讨质粒的应用范围，对其拷贝数进行了测定。质粒pS408-1在对数期的拷贝数是0.90±0.13个，在稳定期的拷贝数是1.12±0.07个；质粒pS408-2在对数期的拷贝数是0.97±0.07个，在稳定期的拷贝数是1.21±0.12个。质粒pS408-1和pS408-2的拷贝数都在1-2个范围内，均属于低拷贝数的质粒。

本发明的又一目的是提供pS408-1和pS408-2的衍生质粒载体pTCS101和pTCS201。

由于质粒pS408-1和pS408-2能够在盐水球菌中自主复制，在保证其提供的复制所需的元件完整的前提下，向其中引入性质明确的其它功能DNA片段，或反过来将复制所需的元件完整的引入性质明确的其他功能DNA序列，即可构成可转化盐水球菌的衍生质粒。

本发明提供的衍生质粒是在pUCm-T的基础上，首先连接入氯霉素抗性基因(方向为EcoRI到HindIII，质粒命名为pTC)，然后分别连接入质粒pS408-1的自5′端第1至2191位碱基或pS408-2的自5′端第1至3007位碱基至XbaI和HindIII位置，分别命名为pTCS101和pTCS201，物理图谱如图3和4所示。

这两个衍生质粒pTCS101和pTCS201分别含有来自pS408-1和pS408-2完整的在盐水球菌中复制所需的复制原点，都含有在大肠杆菌中复制所需的复制原点，和在大肠杆菌及在盐水球菌中筛选转化子的抗性选择标记基因AmpR和CmR，是大肠杆菌-盐水球菌穿梭质粒。

也对穿梭质粒在盐水球菌中的拷贝数分别进行了测定。质粒pTCS101在对数期的拷贝数是3.52±0.61个，在稳定期的拷贝数是8.57±0.88个；质粒pTCS201在对数期的拷贝数是2.23±0.20个，在稳定期的拷贝数是5.34±0.35个。

以穿梭质粒pTCS101和pTCS201为基础，引入适当的蛋白表达元件和目的基因，转化盐水球菌，以合适的条件培养即可得到足够量的目的蛋白。如在pTCS101中克隆金黄色葡萄球菌来源的乳酸脱氢酶编码基因(Gene ID：3921373)和上下游功能序列，获得的质粒命名为pTCS101-LDH；经电穿孔转化至质粒消除株Salinicoccus sp.PE获得乳酸脱氢酶成功表达的菌株Salinicoccus sp.PE(pTCS101-LDH)。因此，基于质粒pS408-1和pS408-2构建而成各种表达载体均在本专利保护之列。

由本发明的盐水球菌质粒及其衍生质粒载体转化所得到的微生物也属于本发明的保护范围。

本发明的盐水球菌质粒载体为盐水球菌的研究和开发提供了遗传工具系统，将在盐水球菌的研究和开发中发挥重要作用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

附图说明

图1质粒pS408-1的物理图谱。

图2质粒pS408-2的物理图谱。

图3质粒pTCS101的物理图谱。

图4质粒pTCS201的物理图谱。

具体实施方式

下述实施例中，如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

盐水球菌菌株的分离、制备、培养

本发明提供的细菌分离自天津大港油田采油井附近储油罐下方的土壤样品，分离方法是经额外添加5％乙酸钠盐度10％的液体完全培养基富集培养两次后，在相同培养基固体平板上划线获得单克隆，其编号为408。

经测定，该细菌16S rDNA(序列1)与Salinicoccus salsiraiae RH-1，Salinicoccus jeotgali S2R53-5和Salinicoccus siamensis PN1-2的同源性都高达99％以上，由此确定其隶属于盐水球菌属(Salinicoccus)。菌株已于2016年9月22日保藏中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microbiological CultureCollection Center,CGMCC)(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCCNo.13032。

本发明提供盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408可以耐受中度盐度和高浓度乙酸盐，在完全培养基中耐受NaCl浓度的范围2-15％(培养基成分为：酸水解酪素7.5克/升，酵母提取物10克/升，谷氨酸钠1克/升，柠檬酸三钠3克/升，氯化钠20-150克/升，七水合硫酸镁20克/升，氯化钾2克/升，柠檬酸铁铵0.008克/升，pH调节到7.0-7.2)，能够耐受高达5％的乙酸。

实施例2

盐水球菌质粒pS408-1和pS408-2的提取、测序和特点

将盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408培养至稳定期，离心收集菌体，采用提取低拷贝数质粒的方法提取盐水球菌质粒。质粒经限制性内切酶Sau3AI不完全酶切的DNA片段，连接入经BamHI(Sau3AI和BamHI是同尾酶)完全酶切的自连的pUCm-T载体，挑选有质粒片段连接入的质粒，测序；将获得的序列拼接。以部分拼接的片段为模板，设计向外方向的测序引物，以提取的盐水球菌质粒为模板测序，并进一步拼接质粒；最终获得两个环形质粒的DNA序列。

其中较小质粒的大小为2191bp，命名为pS408-1(核苷酸序列见序列2)；自5′端第715-1641位碱基为一个开放阅读框架，其编码具有序列表中序列4的氨基酸残基序列的质粒复制所需的反式作用因子Rep1，由308个氨基酸残基组成。

质粒pS408-1的物理图谱如图1所示，其包括的常见限制性内切酶位点有BamHI，ClaI，PvuII酶切位点各一个。其中，序列2中的自5′端第1500-1505位碱基为BamHI酶切位点；序列2中的自5′端第323-328位碱基为ClaI酶切位点；序列2的自5′端第1019-1024位碱基为PvuII酶切位点。质粒pS408-1不含ApaI，BglII，EcoRI，EcoRV，HindIII，KpnI，NcoI，NdeI，SacII，SalI，SmaI，SphI，XbaI等常见内切酶位点，因此这些内切酶位点可作为pS408-1的衍生载体的多克隆位点。

较大质粒大小为3007bp，命名为pS408-2(核苷酸序列见序列3)；自5′端第1067-2080位碱基为一个开放阅读框架，其编码具有序列表中序列5的氨基酸残基序列的质粒复制所需的反式作用因子Rep2，由337个氨基酸残基组成。

质粒pS408-2的物理图谱如图2所示，其包括的常见限制性内切酶位点有BamHI，ClaI，EcoRI，EcoRV酶切位点各一个。其中，序列3中的自5′端第1936-1941位碱基为BamHI酶切位点；序列3中的自5′端第2689-2694位碱基为ClaI酶切位点；序列3的自5′端第698-703位碱基为EcoRI酶切位点；序列3的自5′端第2821-2826位碱基为EcoRV酶切位点。质粒pS408-2不含ApaI，BglII，HindIII，KpnI，NcoI，NdeI，PvuII，SacII，SalI，SmaI，SphI，XbaI等常见内切酶位点，因此这些内切酶位点可作为pS408-2的衍生载体的多克隆位点。

为了进一步探讨质粒的应用范围，对其拷贝数进行了测定。测定方法是采用Real-time PCR测定质粒相对于染色体的拷贝数。在质粒pS408-1上设计的一对引物为CPN-P1-F：AAAAGAGGAGCAGAAGG和CPN-P1-R：TTGCGTGATAAGTGGAT，在质粒pS408-2上设计的一对引物为CPN-P2-F：TTCGTCAGTCTCGGTGGT和CPN-P2-R：TTCGGTTACTCTTCCTCAAT，在染色体上单拷贝基因RNA聚合酶beta亚基编码基因设计的一对引物为CPN-C-F：GAGACGGGCGAGGTTA和CPN-C-R：TTTCGACAGTTGGTGGTT。质粒pS408-1在对数期的拷贝数是0.90±0.13个，在稳定期的拷贝数是1.12±0.07个；质粒pS408-2在对数期的拷贝数是0.97±0.07个，在稳定期的拷贝数是1.21±0.12个。质粒pS408-1和pS408-2的拷贝数在1-2个范围内，均属于低拷贝数的质粒。

实施例3

大肠杆菌-盐水球菌衍生质粒pTCS101和pTCS201的构建

用引物CmR-F：CAACTAAAGCACCCAT和CmR-R：TCGGCATTATCTCATA扩增氯霉素抗性基因(J Bacteriol.1984,158(2):543-50)，直接连接入pUCm-T载体，经蓝白斑筛选和测序，获得的质粒插入T载体的方向为EcoRI到HindIII，将其命名为pTC。

以盐水球菌Salinicoccus sp.CGMCC No.13032的基因组为模板，用引物P1-F：GATCCATTTATGCCGAG和P1-R：TCCGATGATTATATGGC扩增即可获得pS408-1复制所需的完整的DNA序列；以盐水球菌Salinicoccus sp.CGMCC No.13135的基因组为模板，用引物P2-F：GATCTGTTTATGCCGAG和P2-R：ACTACCGTTTTATTTTC扩增即可获得pS408-2复制所需的完整的DNA序列。

上述两个盐水球菌质粒复制所需的完整的DNA序列通过分别在上下游引物的5’端添加酶切位点，经酶切连接入pTC质粒；所选限制性内切酶分别为XbaI和HindIII。由pS408-1复制所需的完整的DNA序列连接入pTC质粒获得衍生质粒pTCS101(物理图谱如图3所示)，由pS408-2复制所需的完整的DNA序列连接入pTC质粒获得衍生质粒pTCS201(物理图谱如图4所示)。

这两个衍生质粒pTCS101和pTCS201分别含有来自pS408-1和pS408-2完整的在盐水球菌中复制所需的复制原点，都含有在大肠杆菌中复制所需的复制原点，和在大肠杆菌及盐水球菌中筛选转化子的抗性选择标记基因AmpR和CmR，是大肠杆菌-盐水球菌穿梭质粒。

实施例4

质粒消除菌株的获得和穿梭质粒pTCS101和pTCS201的拷贝数

野生型盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408含有内源性质粒pS408-1和pS408-2，需将其消除掉。

首先将质粒pTCS101电穿孔法(参考FEMS Microbiol Lett.1992,73(1-2):133-138中金黄色葡萄球菌转化方法)转化到盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408中，在含有10μg/ml氯霉素的完全培养基中传代培养两次，基于质粒不相容性原理将pS408-1消除掉；然后再在无氯霉素的完全培养基中传代培养两次，通过影印平板法筛选获得无氯霉素抗性的菌株，即获得质粒pS408-1被消除的菌株。同理，在此基础上再次消除掉质粒pS408-2，获得质粒都被消除掉的菌株，即盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE。

将穿梭质粒pTCS101和pTCS201分别转化到质粒消除的菌株Salinicoccus sp.PE中，测定穿梭质粒在盐水球菌中的拷贝数。质粒pTCS101在对数期的拷贝数是3.52±0.61个，在稳定期的拷贝数是8.57±0.88个；质粒pTCS201在对数期的拷贝数是2.23±0.20个，在稳定期的拷贝数是5.34±0.35个。

实施例5

金黄色葡萄球菌来源的乳酸脱氢酶基因在盐水球菌中的表达

以金黄色葡萄球菌的基因组为模板，用引物LDH-SA-F：TGATTGGCTAGTTTGTA和LDH-SA-R：AGTTATTCCTCGTTGTC扩增即可获得乳酸脱氢酶编码基因和上下游功能序列。

上述乳酸脱氢酶编码基因和上下游功能序列通过在上下游引物的5’端添加酶切位点，经酶切连接入pTCS101质粒；所选限制性内切酶分别为PstI和EcoRI。由乳酸脱氢酶编码基因和上下游功能序列连接入pTCS101质粒获得表达质粒pTCS101-LDH。

分别将空质粒pTCS101和乳酸脱氢酶表达质粒pTCS101-LDH分别转入质粒消除盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE，得到盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE(pTCS101)和盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE(pTCS101-LDH)。

在相同条件下培养菌体并制作蛋白粗提液。在有10μg/ml氯霉素盐度5％的完全培养基中传代培养至稳定期，收集10ml培养液的菌体，用缓冲液(50mM Tris Cl,150mM NaCl,pH7.5)洗涤两次，最终重悬于1ml的缓冲液中。添加终浓度约为12U/ml溶葡球菌酶(购自生工生物工程上海(股份)有限公司)在37℃孵育1h，然后在低温以200W功率按工作3s间隔6s的方式超声破碎细胞，总超声时间为10min，最后在低温条件下12000rpm离心2min，上清转移至新EP管，作为蛋白粗提液。

测定并比较盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE(pTCS101)和盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE(pTCS101-LDH)的细胞粗提液中乳酸脱氢酶的比活力。

总蛋白质浓度采用北京普利莱基因技术有限公司生产的BCA蛋白定量试剂盒测定，测定结果为盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE(pTCS101)的蛋白粗提液的总蛋白质浓度为3.65±0.01mg/ml，盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE(pTCS101-LDH)的蛋白粗提液的总蛋白质浓度为3.71±0.01mg/ml，二者蛋白浓度相当。

测定乳酸脱氢酶的方法为：首先配制底物混合液(1mM丙酮酸，0.75mM NADH，pH7.0～7.5)；上述重悬菌体的缓冲液350μl，底物混合液130μl，蛋白粗提液或其稀释液20μl。

通过测定340nm吸光值的降低速率，代表底物NADH的消耗速率，计算比活力。测定结果为盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE(pTCS101)的蛋白粗提液中乳酸脱氢酶的比活力为0.42±0.10U/mg，盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE(pTCS101-LDH)的蛋白粗提液中乳酸脱氢酶的比活力为34.34±3.71U/mg，后者样品中乳酸脱氢酶的比活力提高了近80倍，表明乳酸脱氢酶得到成功表达。

序列表

<110> 中国科学院微生物研究所

<120> 一株耐高盐耐高COD盐水球菌菌株和来源该菌株的内源质粒

<160> 7

<210> 1

<211> 1436

<212> DNA

<213> 盐水球菌菌株Salinicoccus sp.

<400> 1

cagtcgaacg cgcagccccg gagcttgctc cgggttctgc gagtggcgga cgggtgagta 60

acacgtaggc aacctaccca tcagactggg ataaccgcgg gaaaccgtgg ctaataccgg 120

atgatcctga tccccgcagg gggatgagtt gaaaggcggt ctttgactgc cactgatgga 180

tgggcctgcg gcgcattagc tagttggtgg ggtaagggcc caccaaggcg acgatgcgta 240

gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300

aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgcaagtctg acggagcaac gccgcgtgag 360

tgaagaaggg tttcggctcg taaaactctg ttgtcaggga agaacgccgg tgggagtaac 420

tgtccatcgg gtgacggtac ctgaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480

ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgtaggcgg 540

ttcgttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactggcg 600

aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccatgtgtag cggtgaaatg cgcagagata 660

tggaggaaca ccagtggcga aggcggctct ctggtctgca actgacgctg atgtgcgaaa 720

gcgtggggat caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780

agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagcaaacg cattaagcac tccgcctggg 840

gagtacggcc gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggag 900

catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccaa atcttgacat cctctgaccg 960

ccatggagac atggcttccc ttcggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1020

tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatc attagttgcc 1080

agcattcagt tgggcactct agtgagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140

acgtcaaatc atcatgcccc ttatgatttg ggctacacac gtgctacaat ggacaggtta 1200

caaagggcag ctacgccgcg aggccaagcg aatcccataa aactgttctc agttcggatt 1260

ggagtctgca actcgactcc atgaagctgg aatcgctagt aatcgtggat cagaatgcca 1320

cggtgaatac gttcccgggt cttgtacaca ccgcccgtca caccacggaa gtcggtaaca 1380

cctgaagccg gtgggccaac ctttatggag gcagccgtcg aaggtgggac cgatga 1436

<210> 2

<211> 2191

<212> DNA

<213> 盐水球菌菌株Salinicoccus sp.

<400> 2

gatccattta tgccgagaaa acttttggtg ggaaaagcaa ccctgaataa actaaaaagc 60

cggtaggcag ataccgtgag gtatcaaaaa tgcctaccga cagcttttgg gtttttaggg 120

ttgccgttgg ttcacaccaa aaggaaattg gaataaatat taatttactg tatcttctta 180

attaaaagga ggagattaca ttaataatag tttaaattta tttcttattg tttctttttt 240

ctttttgctt tacttaatat tttctgaagg aaattttgcc ttttttatat tattagcgtt 300

tgttcttttt gtatttttct taatcgataa tggtgaaaag gaaaatgttg atgataaaag 360

gtattatgta ttacgtttat atattactgg tattgtaata ttctttttca ttactgattt 420

tatatatggg tggagtaatt cttttgttta tataatggct atgataccaa ttatgtatgt 480

aacagtaaaa aacaataaaa cgggtttctt cttatcttga tactatacgt cataatttct 540

atcgggggca atatgccttg agccgttggt atgactgctt taaacacaaa aaaacttgca 600

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agcaaaaaga cactggaacg ggtaaaggac tgtaatacat tcttatttat ggtggctgat 840

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tttaataata aaagacaata tattaaacgc gatagatggc tcgaactctg gcaacaatca 1260

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<212> DNA

<213> 盐水球菌菌株Salinicoccus sp.

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<210> 4

<211> 308

<212> PRT

<213> 盐水球菌菌株Salinicoccus sp.

<400> 4

Met Glu Lys Tyr Thr Gln Lys Lys Arg Lys Asn Gln Leu Leu Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ile Ser Lys His Val Ser Lys Lys Thr Leu Glu Arg Val

20 25 30

Lys Asp Cys Asn Thr Phe Leu Phe Met Val Ala Asp Ile Thr Met

35 40 45

Glu Lys Thr Lys Leu His Arg Ser Asn Asn Cys Glu His Arg Phe

50 55 60

Cys Pro Val Cys Ala Trp Lys Lys Ala Arg Lys Asn Ala Met Lys

65 70 75

Ile Ser Ile Leu Met Glu Tyr Leu Lys Lys Glu Glu Gln Lys Glu

80 85 90

Phe Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ala Pro Asn Val Pro Ala Gly Glu

95 100 105

Leu Asn Asp Glu Ile Lys His Tyr Asn Asn Ser Phe Lys Arg Met

110 115 120

Met Gln Arg Lys Glu Val Lys Thr Ala Val Lys Gly Tyr Val Arg

125 130 135

Lys Leu Glu Val Thr Tyr Asn Lys Asp Arg Asp Asp Tyr His Pro

140 145 150

His Phe His Val Ile Leu Ala Ala Asp Lys His Tyr Phe Asn Asn

155 160 165

Lys Arg Gln Tyr Ile Lys Arg Asp Arg Trp Leu Glu Leu Trp Gln

170 175 180

Gln Ser Thr Lys Asn Pro Leu Ile Thr Gln Val Asp Ile Arg Arg

185 190 195

Val Lys His Thr Asp Asn Lys Lys Glu Val Ser Glu Ile Ala Lys

200 205 210

Tyr Ser Ala Lys Asp Ser Asp Tyr Leu Gln Asp Glu Thr Val Phe

215 220 225

Asp Thr Phe Tyr Lys Thr Leu Ser Gly Lys Arg Leu Ile Val Tyr

230 235 240

Ser Gly Leu Phe Lys Asp Ala Ser Thr Leu Tyr Glu Thr Lys Ala

245 250 255

Leu Asp His Tyr Lys Asp Met Asp Pro Thr Tyr Tyr Ile Tyr Gln

260 265 270

Ile Phe Tyr His Trp Gly Lys Thr Asp Tyr Ile Glu Thr Glu Arg

275 280 285

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290 295 300

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305

<210> 5

<211> 337

<212> PRT

<213> 盐水球菌菌株Salinicoccus sp.

<400> 5

Met Glu Lys Tyr Thr Glu Lys Lys Leu Lys Asn Gln Leu Leu Gln

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Thr Leu Ile Gly Lys His Val Thr Asp Ser Thr Leu Leu Arg Ile

20 25 30

Lys Glu Cys Asn Thr Phe Met Leu Phe Leu Ala Asp Lys Thr Leu

35 40 45

Glu Lys Thr Lys Leu His Gly Ala Asn Ser Cys Lys His Arg Phe

50 55 60

Cys Pro Val Cys Ser Trp Arg Lys Ser Arg Lys Asn Ala Leu Lys

65 70 75

Ile Ser Ile Leu Met Gln Tyr Leu Arg Glu Glu Glu Asn Lys Glu

80 85 90

Phe Val Phe Leu Thr Leu Thr Ala Pro Asn Val Thr Ala Asp Glu

95 100 105

Leu Asn Asp Glu Ile Gln His Tyr Asn Lys Ser Phe Lys Arg Leu

110 115 120

Met Glu Arg Lys Glu Val Lys Ala Ala Val Lys Gly Tyr Val Arg

125 130 135

Lys Leu Glu Val Thr Tyr Asp Gly Lys Glu Ser Ile Thr Lys Ser

140 145 150

Met Tyr Lys His Arg Thr Asn Tyr Tyr Lys Lys Arg Gly Leu Asn

155 160 165

Ile Gly Asp Lys Asn Pro Asn Tyr Asp Thr Tyr His Pro His Phe

170 175 180

His Val Val Leu Ala Val Asn Lys Thr Tyr Phe Asn Lys Pro Asn

185 190 195

Val Tyr Ile Arg Gln Ser Arg Trp Leu Glu Leu Trp Gln Gln Ser

200 205 210

Thr Lys Asn Pro Met Ile Thr Gln Val Asp Val Arg Arg Val Lys

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His Thr Asp Asn Lys Lys Glu Val Ser Glu Ile Ala Lys Tyr Ser

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Phe Phe Asn Ser Leu Ser Gly Lys Arg Leu Ile Val Tyr Ser Gly

260 265 270

Leu Phe Lys Glu Ala Ser Lys Met Tyr Asp Asn Lys Glu Leu Glu

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335

<210> 6

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<212> DNA

<213> 盐水球菌菌株Salinicoccus sp.

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acaatttccc cgaaccatta tatttctcta catcagaaag gtataaatca taaaactctt 5280

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gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 240

ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact 300

ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc 360

gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc 420

gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga 480

aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag 540

acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 600

atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 660

tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg 720

gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa 780

gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt 840

gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt 900

ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat 960

tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg 1020

acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta 1080

cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat 1140

catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag 1200

cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa 1260

ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca 1320

ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc 1380

ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt 1440

atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc 1500

gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat 1560

atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 1620

tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 1680

cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 1740

ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 1800

actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta 1860

gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 1920

ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 1980

gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 2040

acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta 2100

tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 2160

gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 2220

cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 2280

cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 2340

ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc 2400

gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg 2460

agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt 2520

cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca 2580

attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct 2640

cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat 2700

gattacgcca agcttactac cgttttattt tctaatacct ttgcaactgt tttctcaata 2760

ccgaaaaata acacactaaa aacacacgac tcatctttgt gtttttagtg tgttttatat 2820

aattattgtg atggcataag gttaaggtcg gcactgccga ccatatcaac gtttagagcg 2880

taagcgataa gcgtttgata tcataaaccc cttatgctct ttataattta tttttgattt 2940

tcactcattc tcactttttt taaaaaaatt ctacttttga ttcccctttc tttattttct 3000

ttcacttgaa ttattaacaa tttttttaat cgattgaact gctaaataaa taatacataa 3060

tcctccaatc aataaaatta attcactagg tctagtatca aaaaatatat aaaaaataac 3120

ttcaaatatg ataattaata aaagaaaata aaaaatattt ttgataacta tcaactccta 3180

ttctttaccg ttttttcgag cgcaggcgag aaagattttg tgcaccccgt cagaataacg 3240

tataagtgca cccttacggg aatatgaaaa tatataaaac agtcccataa attattttga 3300

atccgcatat ataagccata aatcagttct gaggacattc aataatcaaa aatgaactga 3360

actacctaaa attaaataga aacgctcaga atcgcttatt tggcatttga acgatgttaa 3420

caatttaatt aaataaaata ttaattaaat gattcattat cttgataaca ttttatttaa 3480

ataacatatt aacatttatg ttaaatagca aaataacaga atcagatttc agtattttaa 3540

atactgccca gttacacgca cgtatttttc taacgaaaaa acgagcattc ccctggggaa 3600

atccgcctca agggtgaaat caaaaaaaga gcaacctttc ggttactctt cctcaatatt 3660

ttcatcatct agcatttgat tattaacttc tttttgcata tcttccgaca ttaatttttg 3720

ttccgtttga atatattctg tttgtcccca atgataaaac aataaaaata tatattgagt 3780

cggatccatt tctttatact tttctaattc tttattgtca tacatcttgc tggcttcttt 3840

aaacaatcct gaatacacaa tcaatcgttt gcctgacaat gaattaaaaa atgtatcaaa 3900

aactttttca ttttgtagat aatcagaatc cttcgcactg tatttcgcaa tctctgaaac 3960

ttcttttttg ttatctgtat gtttcactcg tctgacatcg acctgcgtaa tcattggatt 4020

ttttgtagat tgttgccaca attccaacca ccgagactga cgaatataaa cattcggttt 4080

attaaaatag gttttattaa ctgccagcac cacatgaaaa tgtggatgat aagtatcata 4140

gtttggattt ttatcgccga tatttaagcc acgtttttta taataattcg ttcgatgttt 4200

atacatactt ttcgtaatag attctttacc gtcataggtc acttctaatt ttctaacata 4260

acctttgact gctgctttca cttctttacg ttccatcaac cgtttaaaag atttgttata 4320

atgttgaatc tcatcattca attcatcagc agtcacgttt ggtgcagtaa gcgttaagaa 4380

aacaaattct ttattttctt cttctctcaa atactgcatg agaatgctga tcttcaatgc 4440

attcttccga gatttccgcc atgaacacac tggacaaaat ctatgcttgc aactattcgc 4500

accatgcaac ttcgtctttt caagcgtctt atcagcaaga aataacataa atgtgttgca 4560

ctcctttatt cttaatagtg tggaatcagt aacatgtttg cctatgagtg tctgtaacag 4620

ttgatttttc aactttttct ctgtatactt ctccatgaat tgaataatcc tttcatctgc 4680

gaaaggtaca aaaaaacttg cactttcccc tagtaattta tgttgttggc ttagtcacct 4740

agaacattaa actactaccc tggaaaatgc aagttttttt gtgtttaagt caactgtatc 4800

aagggatagg gtcatattta cccaaatcga aaatatgacc cttagtatca agataaaaga 4860

aactcgctca aaaacgctca tttctaagtt caaaagcaag ttctaaaaag acaataagta 4920

tctgcttatt gtctttttag aaacttgctt ttttatccta ctcatatagt ctgtgttcca 4980

ttcgtttata tcataataac aaaggagtat tagtttaatg aattctagca acattttttt 5040

cagattctta gcattcataa ttggtgtagc tatttttgca ttctatatct atgtcataaa 5100

caattttact actggaaaca tatttgaatt tccatatcta ttattaacaa tttattttgc 5160

tttctgcata attctatttc cttttatagc attcactgaa aatgaaatga tggaaaaact 5220

taaattttta cctaacactt tcatacaaat gggaatgttt ataatcgctc catacttatt 5280

tataaaacat cttacgaagg agtctaccga tgaaaactaa attactaata cctttaatag 5340

catttttaat aatgagttct atatagtttt tctcctttta ttcttttcct ttattctgtc 5400

ttagtatcat aactcctccg cccataacta gcagaacacc taatgtcata aataaaaatg 5460

cattatctgg tcttgcaatc acattaaata ataaaatccc tgcacctata aacataatta 5520

tcctaaaaat attaatcaaa aatgtaccaa ctctctttat atttttattc caatttcctt 5580

ttggtgtgaa ccaacaggga aacaaaaaat aaaaaagctg tcgaatggca aaattgatac 5640

ctaacggtat ccagccattc ggctttttag tatctttccg tttccctatt cccaccaaaa 5700

gttttctcgg cataaacaga tctctagact cgagggatcc agatctccag tctttcggca 5760

ttatctcata ttataaaagc cagtcattag gcctatctga caattcctga atagagttca 5820

taaacaatcc tgcatgataa ccatcacaaa cagaatgatg tacctgtaaa gatagcggta 5880

aatatattga attaccttta ttaatgaatt ttcctgctgt aataatgggt agaaggtaat 5940

tactattatt attgatattt aagttaaacc cagtaaatga agtccatgga ataatagaaa 6000

gagaaaaagc attttcaggt ataggtgttt tgggaaacaa tttccccgaa ccattatatt 6060

tctctacatc agaaaggtat aaatcataaa actctttgaa gtcattcttt acaggagtcc 6120

aaataccaga gaatgtttta gatacaccat caaaaattgt ataaagtggc tctaacttat 6180

cccaataacc taactctccg tcgctattgt aaccagttct aaaagctgta tttgagttta 6240

tcacccttgt cactaagaaa ataaatgcag ggtaaaattt atatccttct tgttttatgt 6300

ttcggtataa aacactaata tcaatttctg tggttatact aaaagtcgtt tgttggttca 6360

aataatgatt aaatatctct tttctcttcc aattgtctaa atcaatttta ttaaagttca 6420

tttgatatgc ctcctaaatt tttatctaaa gtgttacttg tctgctttct tcattagaat 6480

caatcctttt ttaaaagtca atattactgt aacataaata tatatatttt aaaaatatcc 6540

cactttatcc aattttcgtt tgttgaacta atgggtgctt tagttgagac ctggt 6595

Claims (2)

1.一株耐高盐耐高COD盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为：CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.13032。

2.一株质粒消除的盐水球菌(Salinicoccus sp.)菌株PE，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为：CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.13135。