CN111235080B - 基因重组大肠杆菌及5-羟色胺的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基因重组大肠杆菌及5‑羟色胺的生产方法。本发明的基因重组大肠杆菌包含色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因，且所述色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因能够在所述大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的色氨酸羟化酶TPH和色氨酸脱羧酶TDC。本发明利用基因重组大肠杆菌生产5‑羟色胺，反应条件温和、转化效果显著。

Description

基因重组大肠杆菌及5-羟色胺的生产方法

技术领域

本发明涉及一种基因重组大肠杆菌及5-羟色胺的生产方法。

背景技术

5-羟色胺又称血清素(Serotonin)，是由L-色氨酸经羟化、脱羧两步反应得到的一种具高附加值的氨基酸衍生物，化学名称为3-(2-氨基乙基)-5-羟基吲哚。自然界中，血清素广泛存在于哺乳动物组织中，特别在其大脑皮层及神经突触内有较高含量，在植物和真菌中也存在少量分布。

在制药领域，血清素作为一种药物，可以参与生物体包括情绪调控、行为管理、睡眠周期维持、清除有害自由基等在内的多种生理功能。在农业领域，血清素的用途也十分广泛，如植物开花，形态发生，衰老等植物生理过程都有血清素的参与。

目前国内外血清素的生产还是以植物提取为主。例如，CN101337921B公开了一种从沙棘中制备5-羟色胺的方法。将沙棘果枝条进行采收和清洗，然后经过取汁、分离、水提取、过滤、离子交换、洗涤、洗脱、降酸、浓缩、乙醇提取、结晶得到5-羟色胺。又如，CN107827806A公开了一种从香蕉皮中提取血清素的方法，将香蕉皮加水破碎制浆得到浆液，向浆液中添加由甲醇和水混合而成的提取溶剂，并在超声辅助下浸提，然后经过过滤，向滤液中先后加入三氯乙酸和无水乙醇，静置沉淀；最后将沉淀物分别用无水乙醇和乙醚洗涤得到血清素。再如，KR20040084353A公开了一种从红花种子中提取5-羟色胺、木脂素和黄酮类化合物的分离纯化方法。将红花干种子烘烤，加入100％正己烷除去种子中的脂肪，再加入80％水溶性乙醇减压浓缩；用热水处理浓缩液，在热水处理浓缩液中加入果胶酶水解；水解产物经重离子传递，然后用水溶性乙醇洗脱再经凝胶柱层析得到5-羟色胺。植物组织提取法存在原料供应少、提取步骤复杂、提取率低的问题。

近年来，生物催化方法取得快速进展，其具有工艺简单、生产周期短、易于放大等优势，有望成为大规模生产5-羟色胺的理想途径。但是，现有技术中缺少相关途径的探索和研究，本领域内仍然需要生物合成5-羟色胺的新方法。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种基因重组大肠杆菌，其具有产生色氨酸羟化酶TPH和色氨酸脱羧酶TDC的能力。

根据本发明所述的基因重组大肠杆菌，其包含色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因，且所述色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因能够在所述基因重组大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的色氨酸羟化酶TPH和色氨酸脱羧酶TDC。

根据本发明的基因重组大肠杆菌；优选地，所述色氨酸羟化酶TPH基因为三角涡虫(Dugesia japonica)的色氨酸羟化酶TPH基因；所述色氨酸脱羧酶TDC基因为来自虫拟蜡菌(Gelatoporia subvermispora)的色氨酸脱羧酶TDC基因；所述基因重组大肠杆菌源自大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655。

本发明的另一个目的在于提供上述基因重组大肠杆菌的制备方法，其包括：

构建重组质粒的步骤；和

转化所述重组质粒至大肠杆菌的步骤；

其中，所述构建重组质粒的步骤包括：使用第一引物从三角涡虫的基因组中扩增得到色氨酸羟化酶TPH基因，使用第二引物从虫拟蜡菌的基因组中扩增得到色氨酸脱羧酶TDC基因，使用第三引物以pTrc99A质粒载体为模板扩增得到pTrc99A载体骨架；在设计引物时向引物中添加各自同源臂，扩增得到的色氨酸羟化酶TPH基因、色氨酸脱羧酶TDC基因和pTrc99A骨架三个片段都具有前后匹配的同源臂，将所述三个片段连接得到重组质粒pTrc99A-5HT。

根据本发明的制备方法；优选地，所述第一引物对中各引物的序列分别如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示；所述第二引物对中各引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示；所述第三引物对中各引物的序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

根据本发明的制备方法；优选地，所述转化所述重组质粒至大肠杆菌的步骤包括：

(1)采用氯化钙法制备化学感受态的大肠杆菌；

(2)使用热激转化的方式进行质粒转化；和

(3)质粒验证；

本发明再一个目的在于提供一种5-羟色胺的生产方法，其利用上述基因重组大肠杆菌进行5-羟色胺的生物合成。

根据本发明的生产方法；优选地，包括以下步骤：

将上述基因重组大肠杆菌在筛选培养基中进行筛选培养，选取长势良好的菌落得到筛选菌株；将获得的筛选菌株在种子培养基中进行种子培养，得到种子液；将种子液中按一定的接种量接种至发酵培养基中进行扩大培养，获得扩大菌液；向扩大菌液中加入诱导剂进行诱导培养，获得诱导菌体；将诱导菌体接入含有底物L-色氨酸的转化液中进行全细胞转化，获得5-羟色胺。

根据本发明的生产方法，优选地，扩大培养使用的发酵培养基为不含抗生素的LB液体培养基，包括以下组分：酵母粉4～6重量份，胰蛋白胨9～12重量份，NaCl 9～12重量份，余量为水；扩大培养在25～37℃的温度，100～300rpm的转速条件下进行。

根据本发明的生产方法，优选地，诱导剂在扩大菌液的OD₆₀₀＝0.4～1.4时加入到扩大菌液中；诱导菌体以OD₆₀₀＝5～60的浓度接种至转化液中；其中，OD₆₀₀表示溶液在600nm波长处的吸光值。

根据本发明的生产方法，优选地，所述转化液包含以下组分：Tris-HCl缓冲液、甘油、色氨酸和四氢生物喋呤(BH4)。

本发明通过基因工程的方式将色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因转化至常规的大肠杆菌中形成基因重组大肠杆菌，其具备产生色氨酸羟化酶TPH和色氨酸脱羧酶TDC的能力。进一步地，本发明利用该基因重组大肠杆菌，通过全细胞催化的手段将特定底物转化为5-羟色胺。该方法的反应条件温和。此外，产物易于分离、反应规模可放大。

附图说明

图1为本发明的pTrc99A-5HT质粒载体的构建示意图。

图2为本发明的L-色氨酸转化为5-羟色胺的过程图。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

本发明中，名词术语既包括单数形式，也包括复数形式，除非上下文另行明确指出。例如，“样品”包括一种或多种样品和为本领域技术人所已知的其等同物等等。本发明中所述的“至少之一”或“至少一种”不仅仅指包含“一个”或“一种”的情况，更重要的还包含“多个”或“多种”的情况。

本发明中所述的具体方法、步骤以及其中所使用的试剂、材料等，除非另作说明，否则均为本领域内通常已知的，并且也容易地通过公开出版物获知或通过购买获得。具体出版物可参见，例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物等。

大肠杆菌属于埃希氏菌属，革兰氏阴性菌，是人肠道的普遍寄生菌。它可以在很多类型的培养基上生长，繁殖速度快，一般对人无毒无害。大肠杆菌的基因组约为4.6MB，属于人类最早测序的生物之一

本发明发现将来自于三角涡虫基因组的色氨酸羟化酶TPH和来自于虫拟蜡菌基因组的色氨酸脱羧酶TDC基因转化到大肠杆菌进行表达，产生具有活性的色氨酸羟化酶TPH和色氨酸脱羧酶TDC，从而可以将底物L-色氨酸转化为5-羟色胺。至少基于上述部分发现完成了本发明。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一目的在于提供一种基因重组大肠杆菌，其包含色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因，且所述色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因能够在所述基因重组大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的色氨酸羟化酶TPH和色氨酸脱羧酶TDC。

本发明的基因重组大肠杆菌表示对常规的大肠杆菌通过基因重组技术改造得到的菌株。根据本发明的一个实施方式，通过基因重组技术，在那些不具有或缺少色氨酸羟化酶TPH和色氨酸脱羧酶TDC活性的野生型，或其它人工改造大肠杆菌中引入外来物种的基因来使这些基因表达，从而产生或带来增量的色氨酸羟化酶TPH和色氨酸脱羧酶TDC活性，从而获得基因重组大肠杆菌。优选地，常规的大肠杆菌可以为大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655，其可购自ATCC(保藏编号ATCC700926)。这些大肠杆菌属于市售产品，因而不需要额外的保藏证据及遗传资源登记资料。

本发明的色氨酸羟化酶TPH基因可以为来源于除了大肠杆菌之外的其他微生物、动物或植物的色氨酸羟化酶TPH基因，例如，三角涡虫(Dugesia japonica)色氨酸羟化酶TPH基因。色氨酸羟化酶TPH基因在基因重组大肠杆菌胞内表达形成具有活性的色氨酸羟化酶TPH。根据本发明的一个实施方式，色氨酸羟化酶TPH基因如SEQ ID NO:8所示。

本发明的色氨酸脱羧酶TDC基因可以为来源于除了大肠杆菌之外的其他微生物、动物或植物的色氨酸脱羧酶TDC基因，例如，来自于虫拟蜡菌(Gelatoporiasubvermispora)的色氨酸脱羧酶TDC基因。色氨酸脱羧酶TDC基因在基因重组大肠杆菌的胞内表达形成具有活性的色氨酸脱羧酶TDC。根据本发明的一个实施方式，色氨酸脱羧酶TDC基因的基因序列如SEQ ID NO:9所示。

另一方面，本发明提供一种基因重组大肠杆菌的制备方法，其包括构建重组质粒的步骤和转化所述重组质粒至大肠杆菌的步骤。

本发明中，所述质粒是指在天然质粒的基础上为适应实验室操作而进行人工构建的质粒。所述质粒带有一个或一个以上的选择性标记基因(如抗生素抗性基因)和一个人工合成的含有多个限制性内切酶识别位点的多克隆位点序列。所述质粒经扩增后可以与来源于除了大肠杆菌之外的其他微生物、动物或植物的色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因进行连接，形成重组质粒；所述重组质粒可以被转化至大肠杆菌细胞中进行表达。优选地，本发明中所述质粒为pTrc99A质粒，序列如SEQ ID NO:7所示。

在本发明中，构建重组质粒的步骤包括：先获得色氨酸羟化酶TPH基因片段和色氨酸脱羧酶TDC基因片段，再以质粒载体为模板扩增得到载体骨架，将上述两个基因片段和载体骨架进行连接以得到重组质粒。

具体地，设计相应的引物从除了大肠杆菌之外的其他微生物、动物或植物的组中获得色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因，设计相应的引物以质粒载体为模板扩增得到质粒载体骨架，然后将三个片段以无缝连接的方式进行连接，得到重组质粒。所述无缝连接的方式可以使用NEBuilder assemble mix或Gibson assembly无缝连接技术完成。具体连接步骤使用现有技术中已知的那些，这里不再赘述。

根据本发明的一个实施方式，使用第一引物从三角涡虫(Dugesia japonica)的基因组中扩增得到色氨酸羟化酶TPH基因，使用第二引物从虫拟蜡菌(Gelatoporiasubvermispora)的基因组中扩增得到色氨酸脱羧酶TDC基因，使用第三引物以pTrc99A质粒载体为模板扩增得到pTrc99A载体骨架；在设计引物时向引物中添加各自同源臂，使得扩增得到的色氨酸羟化酶TPH基因、色氨酸脱羧酶TDC基因和pTrc99A骨架三个片段都具有前后匹配的同源臂，用NEBuilder assemble mix无缝连接技术将所述三个片段连接得到重组质粒pTrc99A-5HT。

根据本发明的另一个实施方式，所述第一引物对中各引物的序列分别如SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2所示。所述第二引物对中各引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示。所述第三引物对中各引物的序列分别如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。

根据本发明提供的制备方法，转化所述重组质粒至大肠杆菌的步骤可包括：大肠杆菌化学感受态的制备；质粒转化；和质粒验证的步骤。所述大肠杆菌化学感受态的制备方法可选自TSS法和/或氯化钙法。优选的，使用氯化钙法。所述质粒转化的方法可选自电转化法和/或热激转化法；优选地，使用热激转化法。质粒验证方法可采用本领域内通常使用的任何方法，包括但不限于，PCR扩增验证法、酶切验证法、免疫验证法以及酶活性验证法等。从操作方法及成本节约角度；本发明优选PCR扩增验证法。具体地，提取培养后的大肠杆菌的基因组，并通过PCR扩增来确认大肠杆菌中是否存在色氨酸羟化酶TPH基因、色氨酸脱羧酶TDC基因。

本发明的构建pTrc99A-5HT重组质粒并转化大肠杆菌E.coli MG1655的更具体的示例性步骤如下：

构建pTrc99A-5HT重组质粒，根据NCBI提供的三角涡虫(Dugesia japonica)和虫拟蜡菌(Gelatoporia subvermispora)的基因组序列，以基因组序列为模板，分别使用引物从基因组中扩增得到色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因；以pTrc99A质粒载体为模板，用引物扩增得到pTrc99A质粒载体的载体骨架。

将扩增得到的色氨酸羟化酶TPH基因、色氨酸脱羧酶TDC基因和pTrc99A质粒载体的载体骨架进行回收，用NEBuilder assemble mix无缝连接技术将上述两个基因片段和载体骨架进行连接以得到重组质粒pTrc99A-5HT。连接完毕之后用热激法转化大肠杆菌E.coli MG1655中，挑取能够在含氨苄青霉素的培养基上生长的阳性菌株，提取质粒测序验证。验证正确的菌株置于甘油管中，-80℃保存。

再一方面，本发明还提供一种5-羟色胺的生产方法，包括使用本发明所述的基因重组大肠杆菌的步骤。在某些实施方案中，进一步包括所述5-羟色胺的检测步骤。

当在色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因在基因重组大肠杆菌的胞内表达形成具有活性的色氨酸羟化酶TPH和色氨酸脱羧酶TDC时，酶的活性并未对大肠杆菌内的其他代谢途径产生较大影响，大肠杆菌活性保持正常，并且将色氨酸转化为5-羟色胺。具体过程参见图2。作为可转化为5-羟色胺的物质为色氨酸，可以以底物的方式加入到转化液中。

根据本发明提供的生产方法，所述5-羟色胺的生产方法包括以下步骤：(1)筛选培养；(2)种子培养；(3)扩大培养；(4)诱导培养；和(5)全细胞转化步骤。优选地，包括以下步骤：将上述基因重组大肠杆菌在筛选培养基中进行筛选培养，选取长势良好的菌落得到筛选菌株；将获得的筛选菌株在种子培养基中进行种子培养，得到种子液；将种子液中按一定的接种量接种至发酵培养基中进行扩大培养，以获得扩大菌液；向扩大菌液中加入诱导剂进行诱导培养，获得诱导菌体；将诱导菌体接入含有底物L-色氨酸的转化液中进行全细胞转化，获得5-羟色胺。

(1)筛选培养：将上述基因重组大肠杆菌在筛选培养基中进行筛选培养，选取长势良好的菌落得到筛选菌株。

在筛选培养阶段，所述筛选培养基可以为含有抗生素的固体培养基；优选为含氨苄青霉素的LB固体培养基。其包括以下组分：酵母粉4～6重量份，胰蛋白胨9～12重量份，NaCl 9～12重量份、琼脂15～22重量份、氨苄青霉素0.025～0.1重量份，余量为水；pH为7.0～7.5。优选地，所述含氨苄青霉素的LB固体培养基中包括酵母粉4.5～6重量份、胰蛋白胨10～11重量份、NaCl 10～11重量份、琼脂16～20重量份、氨苄青霉素0.025～0.8重量份，余量为水；pH为7.1～7.4。更优选地，所述含氨苄青霉素的LB固体培养基中包括酵母粉5～5.5重量份、胰蛋白胨10～10.5重量份、NaCl 10～10.5重量份、琼脂18～20重量份、氨苄青霉素0.025～0.6重量份，余量为水；pH为7.2～7.3。

上述培养基中酵母提取物为菌株提供碳源，胰蛋白胨提供氮源，NaCl提供无机盐。采用上述培养基有利于菌株成倍扩增，并且能够抑制杂菌的生长。

筛选培养需在25～37℃恒温条件下培养20～28小时。优选地，温度为25～35℃，培养时间为20～26小时。更优选地，温度为28～33℃，培养时间为20～24小时。

(2)种子培养：将获得的筛选菌株在种子培养基中进行种子培养，得到种子液。

在种子培养阶段，种子培养基可以为含有抗生素的液体培养基；优选为含氨苄青霉素的LB液体培养基，其包括以下组分：酵母粉4～6重量份，胰蛋白胨9～12重量份，NaCl 9～12重量份，氨苄青霉素0.025～0.1重量份；余量为水；pH为7.0～7.5。优选地，所述含氨苄青霉素的LB液体培养基中包括酵母粉4.5～6重量份、胰蛋白胨10～11重量份、NaCl 10～11重量份、氨苄青霉素0.025～0.8重量份，余量为水；pH为7.1～7.4。更优选地，酵母粉5～5.5重量份、胰蛋白胨10～10.5重量份、NaCl 10～10.5重量份、氨苄青霉素0.025～0.6重量份，余量为水；pH为7.2～7.3。采用上述培养基有利于菌株的成倍扩增，并且能够抑制杂菌的生长。

种子培养需要在恒温搅拌的培养条件下进行，从而有利于均匀培养，避免微生物在局部浓度过高，影响生长。种子培养的温度一般控制在25～37℃之间；优选为28～35℃之间；更优选为30～33℃之间。搅拌转速一般为100～300rpm；优选为150～250rpm；优选为180～240rpm。如果转速过低，则培养基的流动性不足，培养基成分以及氧气分布不均；转速过高，则会产生过高的剪切力，进而影响细菌生长，甚至对细菌菌体造成损害。种子培养的时间一般为10～20小时；优选为12～18小时；更优选为12～16小时。

(3)扩大培养：将种子液中按一定的接种量接种至发酵培养基中进行扩大培养，以获得扩大菌液。种子液的接种量可以为1～10vol％。

在扩大培养阶段，发酵培养基可以为不含抗生素的LB液体培养基，一般包括以下组分：酵母粉4～6重量份，胰蛋白胨9～12重量份，NaCl 9～12重量份，余量为水；pH为7.0～7.5。优选地，所述不含抗生素的LB液体培养基中包括酵母粉4.5～6重量份、胰蛋白胨10～11重量份、NaCl 10～11重量份，余量为水；pH为7.1～7.4。更优选地，所述不含抗生素的LB液体培养基中包括酵母粉5～5.5重量份、胰蛋白胨10～10.5重量份、NaCl 10～10.5重量份，余量为水；pH为7.2～7.3。采用上述培养基有利于菌株的生长。

扩大培养同样也可以在恒温搅拌的培养条件下进行，从而有利于均匀培养，避免微生物在局部浓度过高，影响生长。扩大培养的温度一般控制在25～37℃之间；优选为28～35℃之间；更优选为30～33℃之间。搅拌转速一般为100～300rpm；优选为150～250rpm；优选为180～240rpm。

(4)诱导培养：向扩大菌液中加入诱导剂进行诱导培养，获得诱导菌体。

加入诱导剂进行诱导培养的时机选择在当菌体生长至对数生长期后期时为宜。在本发明中当OD₆₀₀＝0.4～1.4；优选OD₆₀₀＝0.6～1.3；更优选OD₆₀₀＝0.7～1.2时，向扩大菌液中添加一定浓度的诱导剂诱导目的基因进行表达。所述诱导剂可以选自乳糖、阿拉伯糖和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)；优选为IPTG，因其不被细胞消耗，可以实现持续的表达。IPTG对细胞生长存在抑制作用，因此过高的浓度会抑制细菌的生长，过低的浓度则诱导效果不佳。选择适宜的浓度对提高酶蛋白的表达至关重要。在本发明中，IPTG的浓度可以为0.4～1wt‰；优选为0.5～0.8wt‰；更优选为0.5～0.7wt‰。

酶蛋白诱导表达的效果除了与菌体的浓度有关外，还与培养温度和时间有关。较低的温度有利于酶蛋白的正确折叠。本发明中，诱导培养的温度以20～32℃之间；优选为20～30℃；更优选为20～28℃。培养时间为12～18小时；优选为13～16小时；更优选为14～16小时。将诱导培养的温度和时间控制在上述范围内，可以使菌体充分生长，并且诱导培养的效率最高。

除了温度及加入诱导剂外，诱导培养的条件可以与扩大培养的条件相同。例如，诱导培养也可以在搅拌的条件下进行，从而有利于均匀培养，提高表达效率。诱导培养的搅拌转速一般为100～300rpm；优选为150～250rpm；优选为180～240rpm。

对诱导培养后的菌体进行收集，例如，在4℃、4000rpm的条件下对诱导培养后的菌液进行离心，弃上清液，获得所述诱导菌体备用。

(5)全细胞转化：将诱导菌体接入含有底物L-色氨酸的转化液中进行全细胞转化，获得所述产物5-羟色胺。具体为：将诱导菌体按一定的浓度，将诱导菌体接入含有底物L-色氨酸的转化液中进行全细胞转化，从而得到产物5-羟色胺。

根据本发明提供的生产方法，所述诱导菌体可以以OD₆₀₀＝5～60的浓度接种至转化液中；优选地，OD₆₀₀＝10～50；更优选地，OD₆₀₀＝20～40。OD₆₀₀表示含基因重组大肠杆菌的培养基在600nm波长处的吸光值。所述转化液中可以包含以下组分：Tris-HCl、甘油、色氨酸、以及四氢生物喋呤(BH4)。根据本发明的一个实施方式，所述转化液用量为50mL，其中各组分含量为：50mM的pH 7.5Tris-HCl，2.5mL的甘油、25mM的L-色氨酸，以及3mM的BH4。

全细胞转化同样可以在恒温搅拌的培养条件下进行，从而有利于提高转化效率。全细胞转化的温度一般控制在25～37℃之间；优选为28～35℃之间；更优选为30～33℃之间。搅拌转速一般为100～300rpm；优选为150～250rpm；优选为180～240rpm。转化时间为22～30小时；优选为22-28小时；更优选为24～28小时。这样可以保证转化的效率，提高产物的产量。

在某些实施方案中，本发明的生产方法进一步包括5-羟色胺的检测步骤。使用高效液相色谱法对5-羟色胺含量进行测定，定量分析使用C18柱和UV检测器。

本发明的5-羟色胺的含量的检测步骤可示例性说明如下：取500μL转化液，用水稀释至1mL，12000g离心2分钟后取上清。上清液经过0.22μm滤头过滤后转移至液相瓶待用。色谱系统为Waters e2695高效液相色谱系统，配备Waters 2998 UV检测器。色谱柱为中谱RD-C18，规格4.6×250mm，粒径5μm。流动相A为50mM KH2PO4(85％)，流动相B为甲醇(15％)。采用等度洗脱，程序运行时间20分钟。流速1mL/min，进样量10μL。

实施例1

通过在大肠杆菌内构建外源合成5-羟色胺生物合成途径，以L-色氨酸作为底物，可以经全细胞催化将L-色氨酸转化为5-羟色胺，从而实现利用基因重组大肠杆菌来生产5-羟色胺。具体步骤如下：

1.构建pTrc99A-5HT重组质粒

使用NEBuilder assemble mix(NEB公司，美国)无缝连接的方法构建pTrc99A-5HT重组质粒。先根据NCBI提供的三角涡虫(Dugesia japonica)的TPH基因序列(SEQ ID NO:8)和虫拟蜡菌(Gelatoporia subvermispora)的TDC基因序列(SEQ ID NO:9)，用第一引物TPH-F(SEQ ID NO:1)和TPH-R(SEQ ID NO:2)、第二引物TDC-F(SEQ ID NO:3)和TDC-R(SEQID NO:4)，分别以三角涡虫和虫拟蜡菌的基因组为模板PCR扩增得到TPH和TDC基因。然后，以pTrc99A质粒(SEQ ID NO:7)为模板，使用第三引物pTrc99A-F(SEQ ID NO:5)和pTrc99A-R(SEQ ID NO:6)扩增得到pTrc99A载体骨架。在设计引物时向引物中添加了各自同源臂，扩增得到的TPH、TDC和pTrc99A骨架三个片段都具有前后匹配的同源臂。最后，利用NEBuilderassemble mix连接技术将三个片段连接构建重组质粒，得到重组质粒pTrc99A-5HT。

2.化学感受态的大肠杆菌的制备

将大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655(购自ATCC，保藏编号ATCC700926)接种至不含抗生素的LB平板培养基上，37℃温度下过夜培养，获得单菌落。挑取长势良好的单菌落接种至3mL液体LB培养基，在37℃和220rpm的条件下培养12小时。接着，将得到的菌液按1％的接种量接种至50mL的LB液体培养基，在37℃和220rpm的条件下培养大肠杆菌。当OD₆₀₀为0.6时，停止培养，迅速将培养物置于冰中冷却。然后，将冷却后的菌液转移至预冷的50mL离心管中，以3500rpm离心10分钟，弃上清液，收集菌体至EP管中。接着，用25mL预冷无菌的0.1mol/L的CaCl₂冲洗菌体两次，以3500rpm的转速离心10分钟，再次弃上清液，收集菌体。最后，用2mL预冷的0.1mol/L的CaCl₂(含10wt％甘油)重悬菌体，按每管100μL分装至预冷的1.5mL离心管，得到化学感受态的大肠杆菌，置于-80℃保存待用。

3.质粒转化

将一管容纳有化学感受态的大肠杆菌的离心管置于冰上，然后加入0.5μL的重组质粒pTrc99A-5HT，冰浴处理30分钟，用42℃热水浴处理90s，然后立即冰浴处理2分钟。随后，将650μL的LB液体培养基加入容纳有化学感受态的大肠杆菌的离心管内，将离心管置于37℃摇床，150rpm的条件下培养1小时；摇床培养后，500rpm离心2分钟，留少许上清液重悬细胞，并涂布至含有氨苄青霉素的LB平板培养基上，37℃过夜培养。挑取转化子菌落进行PCR验证。将验证通过的菌株置于甘油管中，得到含有pTrc99A-5HT质粒的大肠杆菌，置于-80℃保存待用。

4.重组菌体培养及全细胞催化

将含有pTrc99A-5HT质粒的大肠杆菌接种至含有氨苄青霉素的LB平板培养基，37℃过夜培养，挑取长势良好的单菌落获得筛选菌株，接种至3mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中进行试管种子培养，在37℃和220rpm下培养12小时，得到种子液。将种子液按1vol％的接种量接种至125mL的LB液体培养基中进行扩大培养。在37℃和220rpm的条件下培养至OD₆₀₀为1时，向扩大培养后的菌液中添加0.5wt‰IPTG进行诱导培养；在28℃和220rpm的条件下诱导培养14小时，然后在4℃，4000rpm的条件下进行离心，弃上清液，获得诱导培养后的诱导菌体。

5.全细胞催化

将培养后的菌体以OD₆₀₀＝30的菌体浓度加入到含有L-色氨酸的转化液中进行全细胞转化。所述转化液用量为50ml，其中各组分含量为：50mM的pH 7.5Tris-HCl，2.5ml的甘油、25mM的L-色氨酸，以及3mM的BH4。

6.5-羟色胺产量的检测

取500μL转化液，用水稀释至1mL，12000g的条件下离心2分钟后取上清。上清液经过0.22μm滤头过滤后转移至液相瓶。接着，使用高效液相色谱仪(HPLC)对液相瓶中的5-羟色胺进行测定。测定条件设定如下：色谱系统为Waters e2695高效液相色谱系统，配备Waters 2998 UV检测器。色谱柱为中谱RD-C18，规格4.6×250mm，粒径5μm。流动相A为50mMKH₂PO₄(85％)，流动相B为甲醇(15％)。采用等度洗脱，程序运行时间20分钟。流速1mL/min，进样量10μL。

经过检测，基因重组的大肠杆菌的5-羟色胺最高产量为25.42mg/L。未经过转化的大肠杆菌则不能合成5-羟色胺。

本发明通过简单的基因工程改造方法可以使大肠杆菌合成5-羟色胺。

序列表

<110> 福建师范大学

<120> 基因重组大肠杆菌及5-羟色胺的生产方法

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> TPH-F 人工序列

<400> 1

ggaaacagac catggaattc aggaggatgt gtgaacgcga taaagt 46

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> TPH-R 人工序列

<400> 2

gatccccggg taccgagctc ttaaatactc tgatctgctt 40

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> TDC-F 人工序列

<400> 3

cgtaacagga ggaattaacc aggaggatgg atatcgaagc atttcg 46

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> TDC-R 人工序列

<400> 4

ttgcatgcct gcaggtcgac ttactgcacg tctttactaa 40

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> pTrc99A-F 人工序列

<400> 5

ttagtaaaga cgtgcagtaa gtcgacctgc aggcatgcaa 40

<210> 6

<211> 46

<212> DNA

<213> pTrc99A-R 人工序列

<400> 6

actttatcgc gttcacacat cctcctgaat tccatggtct gtttcc 46

<210> 7

<211> 4176

<212> DNA

<213> pTrc99A 质粒序列

<400> 7

gtttgacagc ttatcatcga ctgcacggtg caccaatgct tctggcgtca ggcagccatc 60

ggaagctgtg gtatggctgt gcaggtcgta aatcactgca taattcgtgt cgctcaaggc 120

gcactcccgt tctggataat gttttttgcg ccgacatcat aacggttctg gcaaatattc 180

tgaaatgagc tgttgacaat taatcatccg gctcgtataa tgtgtggaat tgtgagcgga 240

taacaatttc acacaggaaa cagaccatgg aattcgagct cggtacccgg ggatcctcta 300

gagtcgacct gcaggcatgc aagcttggct gttttggcgg atgagagaag attttcagcc 360

tgatacagat taaatcagaa cgcagaagcg gtctgataaa acagaatttg cctggcggca 420

gtagcgcggt ggtcccacct gaccccatgc cgaactcaga agtgaaacgc cgtagcgccg 480

atggtagtgt ggggtctccc catgcgagag tagggaactg ccaggcatca aataaaacga 540

aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt gtttgtcggt gaacgctctc 600

ctgagtagga caaatccgcc gggagcggat ttgaacgttg cgaagcaacg gcccggaggg 660

tggcgggcag gacgcccgcc ataaactgcc aggcatcaaa ttaagcagaa ggccatcctg 720

acggatggcc tttttgcgtt tctacaaact ctttttgttt atttttctaa atacattcaa 780

atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat tgaaaaagga 840

agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg gcattttgcc 900

ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg 960

gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc 1020

gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat 1080

tatcccgtgt tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg 1140

acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag 1200

aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa 1260

cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc 1320

gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca 1380

cgatgcctac agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc 1440

tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc 1500

tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg 1560

ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta 1620

tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag 1680

gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat atactttaga 1740

ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt tttgataatc 1800

tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac cccgtagaaa 1860

agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc ttgcaaacaa 1920

aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca actctttttc 1980

cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgtccttcta gtgtagccgt 2040

agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct ctgctaatcc 2100

tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg gactcaagac 2160

gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc acacagccca 2220

gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta tgagaaagcg 2280

ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg gtcggaacag 2340

gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt cctgtcgggt 2400

ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg cggagcctat 2460

ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg ccttttgctc 2520

acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc gcctttgagt 2580

gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg agcgaggaag 2640

cggaagagcg cctgatgcgg tattttctcc ttacgcatct gtgcggtatt tcacaccgca 2700

tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg atgccgcata gttaagccag tatacactcc 2760

gctatcgcta cgtgactggg tcatggctgc gccccgacac ccgccaacac ccgctgacgc 2820

gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga ccgtctccgg 2880

gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgaggc agcagatcaa 2940

ttcgcgcgcg aaggcgaagc ggcatgcatt tacgttgaca ccatcgaatg gtgcaaaacc 3000

tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat tcagggtggt gaatgtgaaa 3060

ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct cttatcagac cgtttcccgc 3120

gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg aaaaagtgga agcggcgatg 3180

gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac tggcgggcaa acagtcgttg 3240

ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc cgtcgcaaat tgtcgcggcg 3300

attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg tgtcgatggt agaacgaagc 3360

ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg cgcaacgcgt cagtgggctg 3420

atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg tggaagctgc ctgcactaat 3480

gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca tcaacagtat tattttctcc 3540

catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg cattgggtca ccagcaaatc 3600

gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc tgcgtctggc tggctggcat 3660

aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac gggaaggcga ctggagtgcc 3720

atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg gcatcgttcc cactgcgatg 3780

ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg ccattaccga gtccgggctg 3840

cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga tacgacgata ccgaagacag ctcatgttat 3900

atcccgccgt caaccaccat caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac cagcgtggac 3960

cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt gcccgtctca 4020

ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg 4080

gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg 4140

caacgcaatt aatgtgagtt agcgcgaatt gatctg 4176

<210> 8

<211> 1641

<212> DNA

<213> 三角涡虫(Dugesia japonica) TPH基因序列

<400> 8

atgtgtgaac gcgataaagt ttttgcagaa aataagaaaa acagcatcat cagcctgacc 60

aaagcaaaaa gcgttagtga aaatctgatt cagattaata gcgccaaaca tcgccgtggt 120

cgctttagta gcgttagcag catgattgat gaagaagatt ttgaaatcat caagggcgaa 180

ctgctggatc tgaatattgt tatggaagaa aataagagca tcagcacccg ccgtagcacc 240

agttttattt ttggtgttaa tgataacgtg aagggtctgg tgcgcgttct ggaaattttt 300

gaaaaatttg aagtgagcgt gatccatatt gaaacccgca aaagcctgaa aaataagagt 360

aaatttgaga tcttcatcga cgtggattgt aaaaaagatg aaattaagag cctgatcaag 420

tgtctggaac agaatgtgga taatgatttt catgtgcagg aagttgatat gattagcagt 480

aatccgaatg gcattaagtg cgatagtgcc gatcgcccga ataatgaaag tctggatcag 540

aatcagattc agattaaggc caaaaaacgt gccatgaccg ttgataatct gccgtggttt 600

ccgaaatata ttaaggatct ggataagatt agcaaccgtg ttattatgta tggtagcgaa 660

ctggatgcag atcatccggg ttttaaagat gaactgtatc gcaaacgccg caatcagttt 720

agcgaaattg cctatagtta taaacacggc aatccgattc cgaaaattga atataccaaa 780

gatgagatta ccacctgggg taatgtgtat cgtgaactga ccaaactgta tccgacccat 840

gcctgtcgtg aatttctgga aaatctgccg ctgctgcaga aatattgcgg ctatcgcgaa 900

gataatattc cgcagctgga agaagttagc cagtttctga aaaatcgtag cggttttacc 960

ctgcgcccgg ttgcaggcta tctgagtagc cgcgattttc tggcaggcct ggcatttcgc 1020

gtgtttcatt gcacccagta tattcgtcat ccgagcgatc cgttttatac cccggaaccg 1080

gattgttgtc atgaactgat gggccatgtg ccgctgctgg ccgatagcag ttttgcccag 1140

tttagccagg aaattggcct ggccagcctg ggtgcaagcg aagaagaagt gcagaaactg 1200

gcaacctgct atttctttac cattgaattt ggcctgtgtc atcaggatgg tgaactgcgt 1260

gcatacggtg caggcctgct gagtagcatt ggtgaactga aacatgcact gagtaccgaa 1320

agtaatattc agaaatttga cccgaaactg gttatggaac aggaatgcct ggttaccacc 1380

tttcagaatg cctattttta tacccctagt tttgaagatg caaaagataa aatgcgcgat 1440

tttgccaaaa ccattaagaa accgtttgat gtgcattata acccgtatac ccagatgatt 1500

gaaattctgg atagcaccga tagcgtgacc agcgttattg aaaatattaa gggcgaatta 1560

gccaccatta ccaatgccct gaaaaaactg aatatctatt ggtatggtag ccatcgtagt 1620

gaagcagatc agagtattta a 1641

<210> 9

<211> 1482

<212> DNA

<213> 虫拟蜡菌(Gelatoporia subvermispora) TDC基因序列

<400> 9

atggatatcg aagcatttcg caaagccggt tatcaggcaa ttgatcgcat ttgcgattat 60

tattatagcc tgcagaatcg cccggtggtt ccgagtgtgc agccgggtta tctgctggat 120

gcactgccgg atagcccgcc ggaacagggc gaagatttta ccgtgattgc cgatgattat 180

cagaaatata ttctgccggg cctgacccat tggcagcatc cgagcttttt cgcctatttt 240

ccgaccgcat gtacctttga aggcattctg ggtgacctgt atagcaccag taccgccaat 300

ccgggtttta attggctggc cagtccggcc tgtaccgaac tggaaatggt ggttatggat 360

tggagtgcaa aactgctggg cctgagcgaa cattttctgc atagtagtgg taaaggtggt 420

ggcgttattc agaccaccgc aagtgaactg gcactggtgg ttgttgttgc cgcccgtgaa 480

cgctatctgc gtattcatcc ggatgcaaaa gcagatgaac tggttatcta taccaccacc 540

cagacccata gtctgggcgt taaagcaggt ctggtttttg gtatggaatg tcgtgcactg 600

gaagtgaaag cagaagatgc ctatgccctg cgcggtgcca ccctgaaaag cgccctggaa 660

gaagatgaaa aacgtggtaa acgcccgttt attctggttg ccaccgtggg caccaccagt 720

agcggcgcaa ttgatcgtct ggatgaaatt ggtcaggtta gcgaagatta tccgagcctg 780

tggattcatg ttgatgccgc ctgggcaggt gttaccctgg catgcccgga atatcgtggt 840

accgcccagc tggaaaatat taatgcctat gcaaccagct ttggtaccaa ttttcataaa 900

tggggcctgg ttaattttga tgcagccctg ctgtgggtga aagatcgcaa agatctgacc 960

gatgccctgg atgttacccc ggaatttctg cgtaccaaac agggtgacgc cggtgcagtt 1020

gttgattttc gtaattggca tctgggcctg ggccgccgct ttcgtagcct gaaagtttgg 1080

tttgtgctgc gcagctatgg tgttgaaggt tttcgcaatt atattcgtca gggtattaag 1140

ctgaatgaac attttaccag tctgattcgt gccagtctgg attttagcct ggttaccgca 1200

ccgagctttg ccctgaccgt gtttcgcctg accccggccg gtgcaagtct gaccggtagc 1260

gaactgaatg aactgaatcg cgccttttat gcccgtctga gtagccgtca tgatattatg 1320

ctgacccaga ccgtgctgaa tggtgtgttt tgtattcgct ttgccgttgg tgcagcccgt 1380

acccagcagg aacatattga taccgcctgg gatctgctgc agcaggaagg cgcagttgca 1440

gtgcaggaat atatgcagaa aattagtaaa gacgtgcagt aa 1482

Claims (5)

1.一种5-羟色胺的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

将基因重组大肠杆菌在筛选培养基中进行筛选培养，选取长势良好的菌落得到筛选菌株；将获得的筛选菌株在种子培养基中进行种子培养，得到种子液；将种子液中按一定的接种量接种至发酵培养基中进行扩大培养，获得扩大菌液；向扩大菌液中加入诱导剂进行诱导培养，获得诱导菌体；将诱导菌体接入含有底物L-色氨酸的转化液中进行全细胞转化，获得5-羟色胺；

其中，所述基因重组大肠杆菌包含色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因，且所述色氨酸羟化酶TPH基因和色氨酸脱羧酶TDC基因能够在所述基因重组大肠杆菌的胞内表达，形成具有活性的色氨酸羟化酶TPH和色氨酸脱羧酶TDC；

所述色氨酸羟化酶TPH基因为来自三角涡虫(Tryptophan hydroxylase)的色氨酸羟化酶TPH基因，基因序列如SEQ ID NO:8所示；所述色氨酸脱羧酶TDC基因为来自虫拟蜡菌(Gelatoporia subvermispora)的色氨酸脱羧酶TDC基因，基因序列如SEQ IDNO:9所示；所述基因重组大肠杆菌源自大肠杆菌(Escherichia coli)MG1655；

其中，所述基因重组大肠杆菌的制备方法包括：

构建重组质粒的步骤；和

转化所述重组质粒至大肠杆菌的步骤；

其中，所述构建重组质粒的步骤包括：使用第一引物从三角涡虫的基因组中扩增得到色氨酸羟化酶TPH基因，使用第二引物从虫拟蜡菌的基因组中扩增得到色氨酸脱羧酶TDC基因，使用第三引物以pTrc99A质粒载体为模板扩增得到pTrc99A载体骨架；在设计引物时向引物中添加各自同源臂，扩增得到的色氨酸羟化酶TPH基因、色氨酸脱羧酶TDC基因和pTrc99A骨架三个片段都具有前后匹配的同源臂，将所述三个片段连接得到重组质粒pTrc99A-5HT；

所述第一引物对中各引物的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示；所述第二引物对中各引物的序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；所述第三引物对中各引物的序列分别如SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示。

2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，扩大培养使用的发酵培养基为不含抗生素的LB液体培养基，包括以下组分：酵母粉4～6重量份，胰蛋白胨9～12重量份，NaCl 9～12重量份，余量为水；扩大培养的条件为：温度25～37℃，转速100～300rpm。

3.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，诱导剂在扩大菌液的OD₆₀₀＝0.4～1.4时加入到扩大菌液中；诱导菌体以OD₆₀₀＝5～60的浓度接种至转化液中；其中，OD₆₀₀表示溶液在600nm波长处的吸光值。

4.根据权利要求1～3任一项所述的生产方法，其特征在于，所述转化液包含以下组分：Tris-HCl缓冲液、甘油、L-色氨酸和四氢生物喋呤。

5.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，所述转化所述重组质粒至大肠杆菌的步骤包括：

(1)采用氯化钙法制备化学感受态的大肠杆菌；

(2)使用热激转化的方式进行质粒转化；和

(3)质粒验证。

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