CN114657167B

CN114657167B - 一种脱羧酶及5-羟色胺的制备方法

Info

Publication number: CN114657167B
Application number: CN202011541984.6A
Authority: CN
Inventors: 谢新开; 徐伟; 范俊英
Original assignee: Suzhou Lead Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Lead Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2020-12-23
Publication date: 2023-09-05
Anticipated expiration: 2040-12-23
Also published as: CN114657167A

Abstract

本发明提供了一种真菌来源的重组芳香族氨基酸脱羧酶催化剂，所述脱羧酶具有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列，本发明还提供一种制备5‑羟色胺的方法，其特征在于，包括将5‑羟色氨酸与脱羧酶或所述的宿主细胞接触制得5‑羟色胺。

Description

一种脱羧酶及5-羟色胺的制备方法

技术领域

本发明属于基因工程和生物催化领域，具体涉及一种用于生产5-羟色胺的脱羧酶及其在具体催化中的应用

背景技术

5-羟色胺(5-hydroxytrptamine，5-HT)是一种吲哚衍生物，化学名称为3-(2-氨基乙基)-5-羟基吲哚。由于最早是从血清中发现的，又称血清素(Serotonin)。5-HT是由L-色氨酸代谢而来，具体经羟化、脱羧两步反应得到。自然界中，5-HT作为一种神经传递物质广泛，存在于一些植物和菌类中。在动物大脑皮层及神经突触内有较高含量。

5-HT会影响人的胃口、内驱力(食欲、睡眠、性)以及情绪。在制药领域，5-HT可以作为一种药物，具有调节包括情绪、行为、睡眠周期等多种生理功能。在农业领域，5HT的用途也比较广泛。

目前5-HT的合成方式可以分成三类，分别是天然提取法，化学合成法与生物法。其中目前比较经济的方式还是以植物提取为主，主要是以沙棘(CN101337921B)、红花种子(KR20040084353A)或香蕉皮(CN107827806A)等植物组织为原料，经过较复杂的提取与分离步骤。不仅涉及较多的步骤和设备，而且植物组织提取法还存在原料供应少、提取率低等问题。化学法合成5-HT则需要经保护的乙醇胺和5-羟基吲哚为原料，经分子间缩合反应获得(Tetrahedron,72(18),2233-2238；2016)。由于涉及到较昂贵的原料和较多保护脱保护步骤，化学法在成本上并没有优势。

近年来，生物技术取得快速进展，相应的发展出多种制备5-HT的方法。其中主要分为直接发酵法和生物/酶催化法。发酵法是构建基因工程菌，引入色氨酸羟化酶和脱羧酶，利用简单的碳源，如葡萄糖，经发酵直接获得5-HT。但目前此法得到的5-HT产量很低，没有经济效益。与之相比，酶法则可以获得较高的产物浓度，具有相对较好的产量。酶法生成5-HT的方法通常都是通过脱羧酶，但是目前的特异性5-羟基色氨酸脱羧酶都是来自高等生物，在常见微生物宿主中表达不好。而来自微生物的脱羧酶往往都是色氨酸脱羧酶，其底物特异性差，酶活不高，且因降解必须氨基酸L-色氨酸而造成菌体生长不健康等问题。因此，本领域内仍然需要较好的生物催化剂，生物合成5-羟色胺的新方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，本发明提供了一种真菌来源的重组芳香族氨基酸脱羧酶催化剂，所述脱羧酶具有如SEQ ID No.1所述的氨基酸序列：

所述脱羧酶具有选择性对5-羟色氨酸进行脱羧而不识别常见的芳香族氨基酸的效果；

另一方面，本发明提供编码本发明所述的脱羧酶的多核苷酸，以及包含本发明的多核苷酸的载体，例如常用的大肠杆菌表达载体：Novagen的pET&Duet Vectors,GEHealthcare的pGEX Vectors或Takara Bio的pCold Vectors等，所述多核苷酸具有如SEQID No.2所述的核苷酸序列:

另一方面，本发明提供包含本发明所述的脱羧酶、所述的多核苷酸或包含所述多核苷酸的载体的宿主细胞。

另一方面，本发明还提供一种制备5-羟色胺的方法，其特征在于，包括将5-羟色氨酸与所述脱羧酶或所述的宿主细胞接触制得5-羟色胺。优选的，添加磷酸吡哆醛作为辅酶。

附图说明

图1为SEQ ID No.1编码的蛋白在大肠杆菌中的表达情况的SDS-PAGE胶图，其中：

1：空质粒对照的裂解液上清；

2：空质粒对照的裂解后非水溶部分；

3：表达了脱羧酶的裂解液上清；

4：表达了脱羧酶的裂解后非水溶部分。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验材料

如无特别说明，本发明中使用的实验方法均为常规方法，基因克隆操作具体可参见前述Sambrook et al.,1989；Davis et al.,Basic Methods in Molecular Biology(1986)或其它分子生物实验室手册。

i)试剂：DNA聚合酶(PrimeSTAR Max DNA Polymerase)和T4连接酶购自TaKaRa公司，质粒提取试剂盒购自Axygen公司，5-羟色胺、磷酸吡哆醛及L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-5-羟色氨酸和L-酪氨酸等试剂都购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

ii)载体和菌株：所使用的表达载体为pET-30a(+)，质粒购自Novagen公司，所使用的宿主细胞为大肠杆菌BL21(DE3)，购自天根生化科技(北京)有限公司。

iii)测序与引物合成由苏州泓迅生物科技股份有限公司完成。

实施例1：分子克隆

设计特异性引物对，在所需突变的氨基酸位置对应碱基引入所需的取代。用提取的黑曲霉Aspergillus niger ATCC 1015基因组DNA为模版，通过PCR扩增出编码SEQ IDNo.1(GenBank:EHA26219.1)对应氨基酸序列的外显子片段并纯化。

利用重叠延伸PCR技术，将各外显子序列重组连接，形成含完整的编码序列的PCR产物,编码区核酸序列如SEQ ID No.2所述。

纯化后的PCR产物经NdeI-HindIII消化后，与同样位点消化的pET-30a载体用T4连接酶连接。连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于LB琼脂培养基(含有50mg/L的卡那霉素)、挑单菌落至LB液体培养基(含有50mg/L的卡那霉素)中培养，测序验证突变正确性。经验证的克隆置于-80℃保藏备用。

实施例2：SEQ ID No.1编码的未知蛋白在大肠杆菌中的重组可溶表达。

在LB琼脂培养基上将保藏的克隆活化。然后将单菌落接种至LB液体培养基(含有50mg/L的卡那霉素)中，37℃震荡温育12h。将1mL培养物转接至50mL新鲜的LB液体培养基(含有50mg/L的卡那霉素)中，37℃震荡温育至OD600达到0.6左右，加入IPTG(终浓度为0.4mM)在25℃温育16h以诱导蛋白质表达。

温育后，将培养物以4,000g在4℃离心10min，弃上清，收集大肠杆菌细胞。将收集的大肠杆菌细胞重悬于预冷的15mL pH 7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中，在4℃超声破碎大肠杆菌细胞。细胞破碎液以6,000g在4℃离心15min去除沉淀，得到的上清为含重组酶的粗酶液。从对应的SDS-PAGE分析的结果看，脱羧酶(如图1箭头所指)在大肠杆菌宿主中是可溶表达的。

实施例3：SEQ ID No.1编码的脱羧酶对5－羟色氨酸的脱羧实验

将L-5羟色氨酸溶解于100mM pH＝7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中，使得最终反应体系溶液中L-5羟色氨酸的终浓度为25mM。向上述溶液加入10％体积的酶试剂样品。在30℃，于振荡器上持续震荡(800rpm)3小时，取样并用高效液相色谱检测底物的转化情况。在有的反应中，还加入了终浓度为50μM的磷酸吡哆醛(PLP)溶液。反应结束后，经HPLC定量分析，分别测量残留的底物5-HTP以及产物5-HT的浓度，实验结果见表1。

样品名	底物5-HTP(mM)	产物5-HT(mM)	摩尔转化率％
				无酶液	25.0	0	0
空质粒酶液	24.4	0	0
				含脱羧酶液	9	14.58	58.3
空质粒酶液+50uM PLP	24.8	0	0
				含脱羧酶液+50uM PLP	0	23.41	93.6

表1

以上结果表明，本发明的脱羧酶对5-羟色氨酸(5-HTP)有脱羧作用，且脱羧生成的产物即为5-羟色胺(5-HT)，且PLP对反应是有促进作用的辅酶。

实施例4：SEQ ID No.1编码的脱羧酶对常见氨基酸的脱羧实验

在100mM pH＝7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)中加入待测试的L-氨基酸(L-色氨酸或L-酪氨酸或L-苯丙氨酸)、磷酸吡哆醛(PLP)溶液和10％体积的超声粗酶液，使得最终反应体系溶液中L-氨基酸的终浓度为25mM，PLP终浓度为50μM的。在30℃，于振荡器上持续震荡(800rpm)3小时，取样并用高效液相色谱检测底物的转化情况。经HPLC定量分析显示，该脱羧酶对以上三种氨基酸都无脱羧活性。

本领域技术人员可根据实际情况对上述条件进行一定幅度的调整，并不影响本发明目的的实现。本实施例仅提供一种具体实现方案。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

序列表

<110> 苏州引航生物科技有限公司

<120> 一种脱羧酶及5-羟色胺的制备方法

<130> 2020

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 516

<212> PRT

<213> Aspergillus niger

<400> 1

Met Asp Arg Glu Gln Phe Arg Glu Ala Ala His Ser Ala Ile Asp Asp

1 5 10 15

Ile Ile Asn Tyr Phe Asp Asp Leu Pro Asn Gln Arg Val Val Pro Thr

20 25 30

Ile Glu Pro Gly Tyr Leu Arg Pro Leu Ile Pro Thr Ser Pro Pro Glu

35 40 45

Asn Pro Glu Pro Trp Ser Ala Ile Gln Ser Asp Ile Glu Thr Lys Ile

50 55 60

Lys Pro Gly Ile Thr His Trp Gln Ser Pro Asn Phe Met Ala Phe Phe

65 70 75 80

Pro Ala Gly Val Thr Tyr Pro Ser Ile Leu Gly Glu Met Tyr Ser Ala

85 90 95

Ala Phe Thr Ala Pro Ala Phe Asn Trp Leu Cys Ser Pro Ala Cys Thr

100 105 110

Glu Leu Glu Thr Ile Val Met Asp Trp Leu Ala Gln Ala Leu Ala Leu

115 120 125

Pro Glu Cys Phe Leu Ser Thr Ser Glu Asn Arg Gly Gly Gly Val Ile

130 135 140

Gln Val Thr Ala Ser Asp Thr Val Ala Thr Met Met Ile Ala Ala Arg

145 150 155 160

Glu Arg Arg Val Thr Glu Met Val Val Ser Glu Gly Phe Lys Pro Asp

165 170 175

Thr Val Glu Tyr Glu Asp Arg Met Met Glu Leu Arg Ser Arg Leu Val

180 185 190

Ala Leu Ala Ser Asn Gln Ala His Ser Ser Thr Ala Lys Gly Ala Leu

195 200 205

Leu Ala Gly Thr Arg Phe Arg Ser Val Glu Ala Arg Leu Glu Asp Asn

210 215 220

Leu Glu Met Thr Gly Glu Arg Leu Arg Ala Val Leu Glu Gly Leu Asp

225 230 235 240

Arg Asp Lys Leu Thr Pro Tyr Phe Ile Thr Leu Gly Leu Gly Thr Thr

245 250 255

Asn Ser Cys Ala Val Asp Arg Phe Arg Glu Ile Lys Ala Val Leu Ala

260 265 270

Glu Lys Glu His Trp Lys Arg Ile Trp Val His Ile Asp Ala Ala Tyr

275 280 285

Ala Gly Ala Ala Leu Val Ala Asp Glu Trp Gln Tyr Ile Ser Lys Glu

290 295 300

Phe Ala Glu Gly Val Asp Ser Phe Asn Leu Asn Met His Lys Trp Leu

305 310 315 320

Leu Val Asn Phe Asp Ala Ser Cys Leu Phe Ile Arg Asn Arg Glu Asp

325 330 335

Leu Thr Asn Ala Leu Asp Ile Thr Pro Ala Tyr Leu Arg Asn His Tyr

340 345 350

Ser Asp Ser Gly Lys Val Thr Asp Tyr Arg Asn Trp Ser Met Ser Leu

355 360 365

Gly Arg Arg Phe Arg Ala Leu Lys Ile Trp Phe Val Met Arg Ser Tyr

370 375 380

Gly Leu Thr Gly Met Lys Asp Tyr Ile Arg Lys Ser Ile Gly Leu Gly

385 390 395 400

Asp Thr Phe Ala Ser Leu Val Arg Gly Arg Ala Asp Leu Phe Glu Ile

405 410 415

Ile Thr Thr Pro Ala Phe Gly Leu Thr Val Phe Arg Ile Lys Ser Pro

420 425 430

Lys Ser Gly Thr Thr Met Val Glu Ala Asp Asn Gly Val Leu Val Ala

435 440 445

Gln Pro Asp Glu Ala Ala Asn Glu Leu Thr Lys Glu Val Tyr Glu Leu

450 455 460

Val Asn Ser Arg Gly Glu Ile Phe Ile Thr Ser Thr Val Val Cys Gly

465 470 475 480

Val Tyr Ala Ile Arg Val Val Ser Thr Asn Pro Ala Ala Glu Glu Lys

485 490 495

Tyr Val Lys Arg Ala Phe Glu Ile Leu Val Glu Thr Ala Glu Glu Val

500 505 510

Ile Lys Arg Gly

515

<210> 2

<211> 1551

<212> DNA

<213> Aspergillus niger

<400> 2

atggaccgcg aacagttccg ggaggccgcc cactcggcca ttgacgacat aattaactac 60

ttcgatgacc tcccaaacca gcgcgtcgtc cccaccattg aaccaggcta tcttcgcccc 120

ctaatcccga cctcaccccc cgagaatccc gaaccatgga gcgccatcca atccgacatc 180

gaaaccaaga tcaagccggg catcactcac tggcaatccc ccaacttcat ggccttcttc 240

cccgcaggtg tcacctaccc cagtattttg ggtgaaatgt acagcgcggc attcacagcg 300

cctgcgttca actggctctg ctccccggcg tgcacggaac tcgaaaccat cgttatggat 360

tggctcgctc aggcccttgc attgccggaa tgttttctca gcacatcgga gaatcgcgga 420

ggtggtgtga ttcaggtgac ggcgagtgat acggtcgcga caatgatgat tgcggcaagg 480

gagagacggg tgactgagat ggtggtgagt gaggggttca agcctgatac agtggagtat 540

gaggatcgga tgatggagtt gaggagtcgg ttggtggctt tggcgagtaa ccaggcgcat 600

agcagtacgg cgaagggggc gttgttggcg ggaacgaggt tcaggagtgt tgaggcgagg 660

ttggaagata acttggagat gaccggggag aggttgcggg ctgttttgga ggggttggat 720

cgtgataagc tgacgcctta ttttatcacc ctgggattgg gcacaacgaa ttcgtgtgct 780

gttgatcggt tcagggagat caaggctgtg ttggccgaga aggaacattg gaagaggatt 840

tgggtccata ttgatgctgc ttatgcgggt gcagcgctgg tcgcggatga gtggcagtat 900

atttcgaagg agtttgccga gggcgtcgac agctttaacc tcaatatgca taagtggctg 960

ttggttaact ttgatgctag ctgcctcttc atccgcaacc gcgaagatct caccaacgcc 1020

ctcgacatca cccccgccta cctgcgcaac cactactccg actccggcaa ggtgaccgac 1080

taccgcaact ggagcatgtc tctgggccgc cgattccgcg ccctaaagat ctggttcgtc 1140

atgcgcagct acggtctcac cggcatgaag gattacatcc gcaaatctat cggattgggc 1200

gacacctttg cgagcctggt gcgtgggcgt gccgatctgt ttgaaatcat cacgacaccc 1260

gcctttgggt tgaccgtgtt ccggattaag agccccaagt cagggaccac gatggtggaa 1320

gctgacaatg gggtccttgt tgcgcagccg gatgaggcgg cgaatgagct cacgaaggag 1380

gtgtatgagt tggtgaactc tcggggagag atctttatta catcgacggt tgtttgtggg 1440

gtttatgcca ttcgggttgt gagtacgaat ccggcggccg aggagaagta tgtgaagcgg 1500

gcatttgaga ttttggtgga gacggcggag gaggtcatta agcgggggta g 1551

Claims

1.脱羧酶作为制备5-羟色氨的催化剂的用途，其特征在于，所述脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所述。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述脱羧酶由如SEQ ID No.2所述的多核苷酸编码。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述多核苷酸来源于真菌。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述真菌为黑曲霉菌。

5.一种制备5-羟色胺的方法，其特征在于，包括将5-羟色氨酸与权利要求1所述的脱羧酶或宿主细胞接触制得5-羟色胺，所述宿主细胞包含权利要求1所述的脱羧酶或权利要求2所述的多核苷酸。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，添加磷酸吡哆醛作为辅酶。