CN111849950A

CN111849950A - 川桑色氨酸脱羧酶tdc及其应用

Info

Publication number: CN111849950A
Application number: CN201910342319.5A
Authority: CN
Inventors: 赵爱春; 郑莎; 朱映雪; 曹博宁; 刘长英; 张帅; 向仲怀
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Southwest University
Priority date: 2019-04-26
Filing date: 2019-04-26
Publication date: 2020-10-30

Abstract

本发明公开了川桑色氨酸脱羧酶TDC及其应用，其中川桑色氨酸脱羧酶TDC的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，将川桑色氨酸脱羧酶TDC基因克隆后构建原核表达系统，然后进行酶活测定，测得具有较高的色氨酸脱羧酶的活性，因此川桑色氨酸脱羧酶TDC可以作为工程菌的目的基因，川桑色氨酸脱羧酶TDC也可以作为体外催化L‑色氨酸转化为色胺的催化剂，具有很好的应用前景。

Description

川桑色氨酸脱羧酶TDC及其应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及川桑色氨酸脱羧酶TDC，还涉及川桑色氨酸脱羧酶TDC的应用。

背景技术

褪黑素，学名N-乙酰基-5-甲氧基-色胺，是一种吲哚胺，色氨酸的代谢产物。目前已知它广泛存在于人体、动物体及植物体内，生理作用非常广泛。由于其首先在人体的松果体内被发现，因此又被称为松果体素。随后的研究发现，其广泛存在于人体内的各个部位，含量极少，只有pg(1×10^-12g)/mL水平。目前已知的褪黑素的生理功能主要有调节生物体的昼夜节律，缓解睡眠障碍；抗氧化，褪黑素本身及其代谢产物不仅有强大的自由基清除能力，而且能够诱导生物体相关抗氧化酶活性增强，增强免疫作用，抗肿瘤，抗衰老，特别是对阿尔茨海默病有明显效果等优点。

长期以来褪黑素被认为是动物体内专有的，自从1995年在植物中检测到褪黑素之后，人们陆续在许多高等植物中也发现褪黑素存在。在动物中，褪黑素的生物合成途径已经非常清楚。在植物中褪黑素的合成途径包括3条：(1)色氨酸脱羧酶将色氨酸转化成色胺；色氨酸羟化酶将色胺转化为5-羟色胺；N-乙酰-5羟色胺转移酶将5-羟色胺转化为N-乙酰-5羟色胺；N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶或者咖啡酸氧甲基转移酶将N-乙酰-5羟色胺转化成褪黑素。(2)色氨酸脱羧酶将色氨酸转化成色胺；N-乙酰-5羟色胺转移酶将色胺转化为N-乙酰-5羟色胺；N-乙酰色胺氧甲基转移酶将N-乙酰-5羟色胺转化成褪黑素。(3)色氨酸脱羧酶将色氨酸转化成色胺；色氨酸羟化酶将色胺转化为5-羟色胺；N-乙酰-5-羟色胺氧甲基转移酶或者咖啡酸氧甲基转移酶将5-羟色胺转化成5-甲氧基-色胺；N-乙酰色胺转移酶将5-甲氧基-色胺转化成褪黑素。在植物中，褪黑素合成的酶促反应中的前两步反应不同于动物中褪黑素合成的前两步反应。第一步反应产物是色氨酸被催化生产色胺而不是5-羟色氨酸，第二步酶促反应是色胺被色胺-5-羟化酶催化形成5-羟色胺。在这两步特异反应中起关键作用的是TDC催化L-色氨酸生成了色胺，该反应高度特异且在反应中酶活较高。TDC是芳香族-L-氨基酸脱羧酶，被认为是褪黑素合成过程中的第一个限速酶。

川桑中含有褪黑素，但是其含量极低，并不能大量提取获得。因此，研究褪黑素合成途径的第一个限速酶及其基因，有利于体外合成途径的建立，为褪黑素规模化生产点奠定基础。

发明内容

有鉴于此，本发明采用分子生物学技术，克隆出褪黑素合成相关酶色氨酸脱羧酶基因TDC的核苷酸序列、分析该基因的核苷酸和翻译的氨基酸序列，然后采用大肠杆菌原核表达系统进行褪黑素合成相关酶色氨酸脱羧酶TDC的功能验证。用发酵的产物纯化、得到相关的色氨酸脱羧酶直接体外合成色胺。本发明的目的之一在于提供一种川桑色氨酸脱羧酶TDC；本发明的目的之二在于提供一种川桑色氨酸脱羧酶基因TDC；本发明的目的之三在于提供所述川桑色氨酸脱羧酶TDC在制备L-色氨酸转化为色胺的催化剂中的应用；本发明的目的之四在于提供所述川桑色氨酸脱羧酶基因TDC在原核生物中重建褪黑素合成途径中的应用；本发明的目的之五在于提供一种制备重组川桑色氨酸脱羧酶TDC的方法；本发明的目的之六在于提供由所述的方法制得的重组川桑色氨酸脱羧酶TDC；本发明的目的之七在于提供所述重组川桑色氨酸脱羧酶TDC在制备L-色氨酸转化为色胺的催化剂中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、一种川桑色氨酸脱羧酶TDC，所述川桑色氨酸脱羧酶TDC的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。

优选的，编码川桑色氨酸脱羧酶TDC的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2、一种川桑色氨酸脱羧酶基因TDC，所述川桑色氨酸脱羧酶基因TDC的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3、所述川桑色氨酸脱羧酶TDC在作为L-色氨酸转化为色胺的催化剂中的应用。所述色氨酸脱羧酶TDC可以在体外催化合成，也可以在宿主细胞内催化反应进行，其宿主细胞可以为真核细胞，也可以为原核细胞。

4、所述川桑色氨酸脱羧酶基因TDC在宿主中重建褪黑素合成途径中的应用，所述TDC为L-色氨酸转化为色胺的关键酶基因。

5、一种制备重组川桑色氨酸脱羧酶TDC的方法，所述将如SEQ ID NO.3所示的川桑色

氨酸脱羧酶基因TDC连入Pcold-tf质粒KpnⅠ和SalⅠ酶切位点，获得重组表达载体

Pcold-tf-TDC，再将获得的重组表达载体转化表达菌株B21(DE3)，在28℃、IPTG终浓度

为1mM条件下诱导表达，提取，纯化，获得重组川桑色氨酸脱羧酶TDC。

优选的，所述提取的方法是收集菌体，在功率为200W条件下超声破碎，超声总时间15min，每超声1s，暂停3s；然后在4℃、15000g条件下离心20min，收集上清。

优选的，所述纯化是使用镍柱纯化，用含咪唑浓度为100mM的洗脱液进行洗脱。

6、由所述的方法制得的重组川桑色氨酸脱羧酶TDC。

7、所述重组川桑色氨酸脱羧酶TDC在作为L-色氨酸转化为色胺的催化剂中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明公开了川桑色氨酸脱羧酶TDC及其基因，将川桑色氨酸脱羧酶TDC进行原核表达和酶活性的测定，测得其具有较高的色氨酸脱羧酶的活性，其DNA碱基序列和氨基酸序列均与已报道的色氨酸脱羧酶基因序列有差异。因此，我们认为这是新的色氨酸脱羧酶基因，其原核表达的酶活性高，作为工程菌的目的基因表达重组酶，重组酶作为催化剂合成褪黑素前体色胺，然后经不同的途径合成褪黑素，作为抗肿瘤，抗衰老，特别是对阿尔茨海默病候选药物，具有很好的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为目的基因分别扩增的重组子转化电泳图。

图2为Pcold-tf-MnTDC诱导上清经镍柱纯化后咪唑洗脱SDS-PAGE电泳图(1：蛋白质Marker；2：Pcold-tf空载(+IPTG)；3：重组子(-IPTG)；4：重组子(+IPTG)；5：上清经最适浓度咪唑浓度洗脱液)。

图3为底物L-色氨酸在色氨酸脱羧酶的催化下生成物经UPLC-MS/MS鉴定的质谱图(A：色胺标品；B：生成物(底物在TDC酶催化下生成物))。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明使用色胺(Sigma，市售价195元/5G)作为标品对照，检验色氨酸脱羧酶基因所表达的酶活性。

实施例1、川桑色氨酸脱羧酶基因TDC克隆

根据Morus.TDC datebase上已报道的Morus.TDC色氨酸脱羧酶基因(Morus002214)设计引物进行扩增，TDC上游引物为：5'-ggggtaccatgggtagccttggtttt-3'(SEQ ID NO.1)，TDC下游引物为：5'-acgcgtcgacttatacacttctgagcac-3'(SEQ ID NO.2)，提取Morus RNA，反转录为cDNA。然后以合成的cDNA为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物进行PCR扩增，扩增产物进行电泳检测，结果如图1所示。回收目的片段，回收产物与pMD19-T载体连接，转入E.coli.Trans1-T1感受态细胞，获得的阳性克隆送往华大基因公司测序，结果显示，TDC基因全长编码的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码的氨基酸如SEQ ID NO.4所示。

实施例2、川桑色氨酸脱羧酶基因TDC重组载体构建及原核表达

将实施例1扩增得到的PCR产物用KpnⅠ和SalⅠ进行双酶切，同时用KpnⅠ和SalⅠ双酶切Pcold-tf质粒，分别回收TDC基因目标载体和Pcold-tf质粒表达框，回收产物用T₄DNA连接酶获得重组表达载体Pcold-tf-TDC，在将获得的重组表达载体送往华大基因公司测序，测序结果与第一次测序得到的序列一致从而获得了正确的序列。

提取Pcold-tf-TDC质粒，将其转入表达菌株B21(DE3)，在1.5ml的离心管加入450μl含有Amp抗性的LB培养基，按照1：100扩大培养到试管中，28℃、220rpm摇床培养至OD₆₀₀＝0.6，取1ml菌液保存作为诱导前阳性对照，加入IPTG进行诱导，使IPTG终浓度为1mM，28℃下诱导8h，诱导后取1ml菌液保存作为诱导后总蛋白，剩余菌液4℃，5000rpm离心10min收菌，弃上清，菌体用PBS洗两次；超声破碎，超声功率为200W，超声1s，暂停3s，超声总时间15min；4℃，15000g，20min，取上清于新的离心管中。将之前保存的诱导前和诱导后的菌液10000rpm离心1min沉淀用PBS重悬，加入适量5×Loading buffer。取破碎离心后的上清加入适量5×Loading buffer。将加入的样品沸水浴，之后12000rpm离心2min，吸取上清进行检测目的蛋白的表达情况；

将含Pcold-tf-TDC质粒的菌株诱导8小时的上清进行镍柱纯化，分别用含咪唑浓度为：100mM，200mM，250mM，300mM的洗脱液进行洗脱，SDS-PAGE检测其咪唑洗脱浓度，结果如图2所示。结果显示，100mM的咪唑可以将大量的目的蛋白洗脱下来。

实施例3、重组色氨酸脱羧酶TDC浓度及活性检测

取含Pcold-tf-TDC质粒的菌株诱导8小时的上清经镍柱纯化，后采用UPLC-MS/MS测定酶促反应的产物的物质量来表示酶活力，酶的活力单位定义为每分钟生成1nmol的物质的量为一个比活力即1U诱导诱导菌液摇了8小时之后，5ml上清经纯化后，用10ml咪唑浓度为100mM洗脱，液洗脱后，洗脱液里面所含的色氨酸脱羧酶的浓度为：0.159mg/ml。

使用浓度为2.0μM L-色氨酸为底物，使用酶活力为0.096U的色氨酸脱羧酶在温度为28℃，pH为6.5下催化反应20min，然后使用UPLC-MS/MS鉴定，结果如图3所示，结果显示生成色氨总量为1.86nmol(299.46ng)。

上述结果表明原核表达的重组色氨酸脱羧酶TDC具有较高的色氨酸脱羧酶的活性，可以用于在原核构建褪黑素代谢途径的目的基因，也可将获得的重组色氨酸脱羧酶TDC用于体外合成褪黑素前体物质色氨酸。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110> 西南大学

<120> 川桑色氨酸脱羧酶TDC及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggggtaccat gggtagcctt ggtttt 26

<210> 2

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

acgcgtcgac ttatacactt ctgagcac 28

<210> 3

<211> 3042

<212> DNA

<213> 川桑(Morus alba)

<400> 3

atgggtagcc ttggttttag ctatgacgac tcagctccat ttccccaaac tgatcatgtt 60

gatcaacaac aattcaagcc cttagaccct gaagagttcc gcaaacaagc tcaccaaatg 120

gttgacttta tagccgatta ctacgctaaa atcgagtcct acccggtcct agcccaagtc 180

caaccgggtt acctcagaac ccggataccc caaaacgcac cgtatcgccc cgagccactc 240

gaaaccatct tcaacgacat taaccgccac atcattcccg gcatgaccca ttggctcagc 300

cctaaattct tcgcattctt tcccgccacc gtcagcaccg ccgctttcct cggtgaaatg 360

ctctgcactg gcttcaactc cgtcggcttc aactggctat cgtctcctgc cgtgaccgag 420

ctcgagatga tcgtcatgga ctggctagcc aacatgctca agctcccaaa atgcttcacg 480

ttcgccggat ccggcggcgg cgtgatccag aacaccacga gtgaggccgt tcttgtcact 540

ctcatcgctg cgagggacaa agccctagag agaatcagca ccgacgacac gcgaaatctc 600

gtcgtttact gctccgacca gacccattcg acgttcacga aggcgtcgaa gatggcggga 660

atacacccga gaaacattcg gtcgatccag acgagcatcg acgctggatt ctgtctctgc 720

cccgtggcgc tccgcgaggc cgtgcgggaa gacgtggcgg aggggctggt cccgctctac 780

ctctgcgcta cggtggggac aacctcaacc accgccgtgg acccactcga gccgctcgcc 840

gacgtggcaa gggattacgg gatgtggttc catgtggacg ccgcgtacgg cgggagcgcc 900

tgcatctgcc ctgaattccg gcactatttc aacggcgtgg agcgagttga ctcgctgagt 960

ctgagcccac acaagtggct actcagctac ctcgactgct gttgcctctg ggtcaagaaa 1020

ccagaactgc tggtgaactc gctgagcacg aaccccgagt acttgaagaa caaactcagt 1080

gagtcagact cggtggtgga ctacaaggac tggcaagtag ggacgggccg gagattcaag 1140

tcactccggc tatggctggt tctccggagc tacggggtcg agaacctcca aagccacatc 1200

cggtccgacg tcaggatggc gaagaaattc gagtggctgg tgaggtcgga cccgaggttc 1260

gaggtggtgg tgccgagatt gttcgcactg gtgtgttttc ggctgaaccc ggactcaccg 1320

ggtcgtagca cggagtcgct gaatcggaag cttctggagt gggtcaactc gaccgggaag 1380

gcttacctga ctcacaccat agtcggtggg gtatatatgt tgaggttcgc agtgggggcc 1440

acactgacag aagagcgcca cgtcatcgcc gcgtgggagc tgatcggaga aggagccgat 1500

gaggtgctca gaagtgtata aatgggtagc cttggtttta gctatgacga ctcagctcca 1560

tttccccaaa ctgatcatgt tgatcaacaa caattcaagc ccttagaccc tgaagagttc 1620

cgcaaacaag ctcaccaaat ggttgacttt atagccgatt actacgctaa aatcgagtcc 1680

tacccggtcc tagcccaagt ccaaccgggt tacctcagaa cccggatacc ccaaaacgca 1740

ccgtatcgcc ccgagccact cgaaaccatc ttcaacgaca ttaaccgcca catcattccc 1800

ggcatgaccc attggctcag ccctaaattc ttcgcattct ttcccgccac cgtcagcacc 1860

gccgctttcc tcggtgaaat gctctgcact ggcttcaact ccgtcggctt caactggcta 1920

tcgtctcctg ccgtgaccga gctcgagatg atcgtcatgg actggctagc caacatgctc 1980

aagctcccaa aatgcttcac gttcgccgga tccggcggcg gcgtgatcca gaacaccacg 2040

agtgaggccg ttcttgtcac tctcatcgct gcgagggaca aagccctaga gagaatcagc 2100

accgacgaca cgcgaaatct cgtcgtttac tgctccgacc agacccattc gacgttcacg 2160

aaggcgtcga agatggcggg aatacacccg agaaacattc ggtcgatcca gacgagcatc 2220

gacgctggat tctgtctctg ccccgtggcg ctccgcgagg ccgtgcggga agacgtggcg 2280

gaggggctgg tcccgctcta cctctgcgct acggtgggga caacctcaac caccgccgtg 2340

gacccactcg agccgctcgc cgacgtggca agggattacg ggatgtggtt ccatgtggac 2400

gccgcgtacg gcgggagcgc ctgcatctgc cctgaattcc ggcactattt caacggcgtg 2460

gagcgagttg actcgctgag tctgagccca cacaagtggc tactcagcta cctcgactgc 2520

tgttgcctct gggtcaagaa accagaactg ctggtgaact cgctgagcac gaaccccgag 2580

tacttgaaga acaaactcag tgagtcagac tcggtggtgg actacaagga ctggcaagta 2640

gggacgggcc ggagattcaa gtcactccgg ctatggctgg ttctccggag ctacggggtc 2700

gagaacctcc aaagccacat ccggtccgac gtcaggatgg cgaagaaatt cgagtggctg 2760

gtgaggtcgg acccgaggtt cgaggtggtg gtgccgagat tgttcgcact ggtgtgtttt 2820

cggctgaacc cggactcacc gggtcgtagc acggagtcgc tgaatcggaa gcttctggag 2880

tgggtcaact cgaccgggaa ggcttacctg actcacacca tagtcggtgg ggtatatatg 2940

ttgaggttcg cagtgggggc cacactgaca gaagagcgcc acgtcatcgc cgcgtgggag 3000

ctgatcggag aaggagccga tgaggtgctc agaagtgtat aa 3042

<210> 4

<211> 506

<212> PRT

<213> 川桑(Morus alba)

<400> 4

Met Gly Ser Leu Gly Phe Ser Tyr Asp Asp Ser Ala Pro Phe Pro Gln

1 5 10 15

Thr Asp His Val Asp Gln Gln Gln Phe Lys Pro Leu Asp Pro Glu Glu

20 25 30

Phe Arg Lys Gln Ala His Gln Met Val Asp Phe Ile Ala Asp Tyr Tyr

35 40 45

Ala Lys Ile Glu Ser Tyr Pro Val Leu Ala Gln Val Gln Pro Gly Tyr

50 55 60

Leu Arg Thr Arg Ile Pro Gln Asn Ala Pro Tyr Arg Pro Glu Pro Leu

65 70 75 80

Glu Thr Ile Phe Asn Asp Ile Asn Arg His Ile Ile Pro Gly Met Thr

85 90 95

His Trp Leu Ser Pro Lys Phe Phe Ala Phe Phe Pro Ala Thr Val Ser

100 105 110

Thr Ala Ala Phe Leu Gly Glu Met Leu Cys Thr Gly Phe Asn Ser Val

115 120 125

Gly Phe Asn Trp Leu Ser Ser Pro Ala Val Thr Glu Leu Glu Met Ile

130 135 140

Val Met Asp Trp Leu Ala Asn Met Leu Lys Leu Pro Lys Cys Phe Thr

145 150 155 160

Phe Ala Gly Ser Gly Gly Gly Val Ile Gln Asn Thr Thr Ser Glu Ala

165 170 175

Val Leu Val Thr Leu Ile Ala Ala Arg Asp Lys Ala Leu Glu Arg Ile

180 185 190

Ser Thr Asp Asp Thr Arg Asn Leu Val Val Tyr Cys Ser Asp Gln Thr

195 200 205

His Ser Thr Phe Thr Lys Ala Ser Lys Met Ala Gly Ile His Pro Arg

210 215 220

Asn Ile Arg Ser Ile Gln Thr Ser Ile Asp Ala Gly Phe Cys Leu Cys

225 230 235 240

Pro Val Ala Leu Arg Glu Ala Val Arg Glu Asp Val Ala Glu Gly Leu

245 250 255

Val Pro Leu Tyr Leu Cys Ala Thr Val Gly Thr Thr Ser Thr Thr Ala

260 265 270

Val Asp Pro Leu Glu Pro Leu Ala Asp Val Ala Arg Asp Tyr Gly Met

275 280 285

Trp Phe His Val Asp Ala Ala Tyr Gly Gly Ser Ala Cys Ile Cys Pro

290 295 300

Glu Phe Arg His Tyr Phe Asn Gly Val Glu Arg Val Asp Ser Leu Ser

305 310 315 320

Leu Ser Pro His Lys Trp Leu Leu Ser Tyr Leu Asp Cys Cys Cys Leu

325 330 335

Trp Val Lys Lys Pro Glu Leu Leu Val Asn Ser Leu Ser Thr Asn Pro

340 345 350

Glu Tyr Leu Lys Asn Lys Leu Ser Glu Ser Asp Ser Val Val Asp Tyr

355 360 365

Lys Asp Trp Gln Val Gly Thr Gly Arg Arg Phe Lys Ser Leu Arg Leu

370 375 380

Trp Leu Val Leu Arg Ser Tyr Gly Val Glu Asn Leu Gln Ser His Ile

385 390 395 400

Arg Ser Asp Val Arg Met Ala Lys Lys Phe Glu Trp Leu Val Arg Ser

405 410 415

Asp Pro Arg Phe Glu Val Val Val Pro Arg Leu Phe Ala Leu Val Cys

420 425 430

Phe Arg Leu Asn Pro Asp Ser Pro Gly Arg Ser Thr Glu Ser Leu Asn

435 440 445

Arg Lys Leu Leu Glu Trp Val Asn Ser Thr Gly Lys Ala Tyr Leu Thr

450 455 460

His Thr Ile Val Gly Gly Val Tyr Met Leu Arg Phe Ala Val Gly Ala

465 470 475 480

Thr Leu Thr Glu Glu Arg His Val Ile Ala Ala Trp Glu Leu Ile Gly

485 490 495

Glu Gly Ala Asp Glu Val Leu Arg Ser Val

500 505

Claims

1.一种川桑色氨酸脱羧酶TDC，其特征在于：所述川桑色氨酸脱羧酶TDC的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.根据权利要求1所述川桑色氨酸脱羧酶TDC，其特征在于：编码川桑色氨酸脱羧酶TDC的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

3.一种川桑色氨酸脱羧酶基因TDC，其特征在于：所述川桑色氨酸脱羧酶基因TDC的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.权利要求1所述川桑色氨酸脱羧酶TD在作为L-色氨酸转化为色胺的催化剂中的应用。

5.权利要求3所述川桑色氨酸脱羧酶基因TDC在宿主中重建褪黑素合成途径中的应用，其特征在于：所述TDC为L-色氨酸转化为色胺的关键酶基因。

6.一种制备重组川桑色氨酸脱羧酶TDC的方法，其特征在于：所述将如SEQ ID NO.3所示的川桑色氨酸脱羧酶基因TDC连入Pcold-tf质粒KpnⅠ和SalⅠ酶切位点，获得重组表达载体Pcold-tf-TDC，再将获得的重组表达载体转化表达菌株B21(DE3)，在28℃、IPTG终浓度为1mM条件下诱导表达，提取，纯化，获得重组川桑色氨酸脱羧酶TDC。

7.根据权利要求6所述制备重组川桑色氨酸脱羧酶TDC的方法，其特征在于：所述提取的方法是收集菌体，在功率为200W条件下超声破碎，超声总时间15min，每超声1s，暂停3s；然后在4℃、15000g条件下离心20min，收集上清。

8.根据权利要求6所述制备重组川桑色氨酸脱羧酶TDC的方法，其特征在于：所述纯化是使用镍柱纯化，用含咪唑浓度为100mM的洗脱液进行洗脱。

9.由权利要求6～8任一项所述的方法制得的重组川桑色氨酸脱羧酶TDC。

10.权利要求9所述重组川桑色氨酸脱羧酶TDC在作为L-色氨酸转化为色胺的催化剂中的应用。