CN113621636A

CN113621636A - 色氨酸脱羧酶基因原核表达载体及其应用

Info

Publication number: CN113621636A
Application number: CN202110711974.0A
Authority: CN
Inventors: 岳明瑞; 曹华杰; 谢沛; 郭永胜; 腾义卫
Original assignee: Shantou Jiahe Biological Technology Co ltd; Xintai Jiahe Biotech Co ltd
Current assignee: Shantou Jiahe Biological Technology Co ltd; Xintai Jiahe Biotech Co ltd
Priority date: 2021-06-25
Filing date: 2021-06-25
Publication date: 2021-11-09
Anticipated expiration: 2041-06-25
Also published as: CN113621636B

Abstract

本发明公开了一种色氨酸脱羧酶基因原核表达载体，由如下方法构建而成：(1)以pEGX‑4T‑1为出发质粒，将pEGX‑4T‑1利用pflmⅠ和btgⅠ双酶切之后连入长度为100bp的人造链，构建得到质粒pEGX‑4T‑J；(2)将编码水稻色氨酸脱羧酶的基因进行密码子优化，优化后的水稻色氨酸脱羧酶的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示；(3)采用SpeⅠ和Bsc91Ⅰ对质粒pEGX‑4T‑J进行双酶切处理，通过DNA连接酶将SEQ ID NO.1所示的核苷酸片段连入双酶切后的质粒pEGX‑4T‑J上，即构建得到色氨酸脱羧酶基因原核表达载体。采用本发明构建的色氨酸脱羧酶基因原核表达载体可以显著提高色氨酸脱羧酶的表达量。

Description

色氨酸脱羧酶基因原核表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种色氨酸脱羧酶基因原核表达载体及其应用。

背景技术

色氨酸脱羧酶(Tryptophan decarboxylase，TDC)是色氨酸脱羧反应的脱羧酶，在植物生长素合成、生物碱类以及次生代谢物合成等众多植物代谢过程中发挥重要作用。研究表明TDC能够将色氨酸和酪氨酸催化脱羧，生成色胺和酪胺。色氨途径是植物细胞内生长素合成的重要途径之一。TDC是色氨途径IAA合成的关键酶。TDC基因是个多基因家族，在烟草、水稻、喜树等多种植物中已被克隆。过量表达TDC基因提高了植物体内IAA含量，表明TDC和生长素生物合成之间的密切联系。

利用原核表达系统对外源基因进行表达，具有周期短、成本低、操作简便以及表达量高等优点。目前已有利用原核表达系统生产色氨酸脱羧酶的报道，例如：专利CN111849950A将川桑色氨酸脱羧酶基因TDC连入Pcold-tf质粒KpnI和SalI酶切位点，获得重组表达载体Pcold-tf-TDC，再将获得的重组表达载体转化大肠杆菌，诱导表达，获得重组川桑色氨酸脱羧酶。专利CN104232664A将易变山羊草TDC全长序列连接至克隆载体Peasy-T1，获得AeTDC双元植物表达载体。谢全亮等将棉花TDC基因连入pET32a。构建得到pET32a-GhTDC原核表达载体。但是，由于不同植物中的TDC基因的同源性存在差异，即使是同一种植物中也会存在多条色氨酸脱羧酶基因，因此，需要根据具体的色氨酸编码基因序列选择相应的表达载体；若表达载体选择不当，很可能会导致目的蛋白不能正常可溶表达。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种色氨酸脱羧酶基因原核表达载体及其应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种色氨酸脱羧酶基因原核表达载体，其由如下方法构建而成：

(1)以pEGX-4T-1为出发质粒，将pEGX-4T-1利用pflmⅠ和btgⅠ酶切之后连入长度为100bp的人造链，构建得到质粒pEGX-4T-J；

(2)将编码水稻色氨酸脱羧酶的基因进行密码子优化，优化后的水稻色氨酸脱羧酶的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示；

(3)采用SpeⅠ和Bsc91Ⅰ对质粒pEGX-4T-J进行双酶切处理，通过DNA连接酶将SEQID NO.1所示的核苷酸片段连入双酶切后的质粒pEGX-4T-J上，即构建得到色氨酸脱羧酶基因原核表达载体。

优选的，步骤(1)中，先采用pflmⅠ在pEGX-4T-1第3250位点处进行单酶切，再采用btgⅠ在pEGX-4T-1第4869位点处进行单酶切。

优选的，步骤(1)中，质粒pEGX-4T-J的长度为3449bp，所构建的质粒pEGX-4T-J仅在第3249位点处存在SpeⅠ酶切位点，仅在第3349位点处存在Bsc91Ⅰ酶切位点。

本发明的第二方面，提供含有上述色氨酸脱羧酶基因原核表达载体的重组菌。

本发明的第三方面，提供上述色氨酸脱羧酶基因原核表达载体或者重组菌在色氨酸脱羧酶生产中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明从营养匮乏的水稻叶片中克隆得到色氨酸脱羧酶的编码基因。为了使编码基因能够更适用于原核表达系统，本发明对编码基因进行了密码子优化，采用优化后的色氨酸脱羧酶编码基因进行原核表达，目的蛋白(色氨酸脱羧酶)的表达量显著提高。

(2)本发明以pGEX-4T-1为出发质粒，pGEX-4T-1为诱导型质粒，需要加入诱导物诱导后才能表达目的基因，因此可以控制目的基因的表达时间。本发明进一步对pGEX-4T-1进行了改造，将质粒pEGX-4T-1在第3250位点和第4869位点处进行双酶切之后又连接一段100bp的碱基，这样改造处理的好处是减小质粒大小，原质粒4969bp，经过改造后只有3449bp。而且在改造后的质粒第3249和3349位点处分别设有SpeⅠ和Bsc91Ⅰ两个酶切位点，这两个酶切位点与优化后的色氨酸脱羧酶的编码基因相呼应，编码基因的编码区不存在上述两个酶切位点，这样既方便目的基因的插入，又能防止目的基因被误剪。

附图说明

图1：优化前的密码子相对适应度图。

图2：优化后的密码子相对适应度图。

图3：表达载体pGEX-4t-J的结构示意图。

图4：色氨酸脱羧酶基因原核表达载体的结构示意图。

图5：SDS-PAGE测定结果；图中，泳道1：空载体(pGEX-4t-J)未诱导；泳道2：空载体(pGEX-4t-J)+IPTG诱导；泳道3：pEGX-已优化(pEGX-TDC-2)未诱导；泳道4：pEGX-未优化(pEGX-TDC-1)诱导2h；泳道5：pEGX-未优化(pEGX-TDC-1)诱导4h；泳道6：pEGX-已优化(pEGX-TDC-2)诱导2h。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例1：水稻色氨酸脱羧酶(TDC)基因的克隆

选取营养匮乏水稻的叶片，通过CTAB法提取材料的总RNA，根据从GenBank EST数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/GenBank)中所获得的完整cDNA ORF序列信息设计引物(TDCsense和TDCantisense)，以反转录合成的cDNA为模板，进行PCR扩增全长开放读码框。

TDCsense：5’-GTAAGGTATAGTATCATC-3’；(SEQ ID NO.4)

TDCantisense：5’-GTGAGTTAGCTAGGTTGGTGTG-3’。(SEQ ID NO.5)

水稻色氨酸脱羧酶(TDC)基因的cDNA全长包含完整开放读码框为1533bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码507个氨基酸的多肽，理论分子质量为56.21ku。

实施例2：水稻色氨酸脱羧酶(TDC)基因的密码子优化

为了使水稻色氨酸脱羧酶的编码基因能更好的适应于原核表达系统，本发明进一步对水稻色氨酸脱羧酶的编码基因进行了密码子优化。经密码子优化后的水稻色氨酸脱羧酶的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；实际编码507个氨基酸的多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

优化前的密码子相对适应度图如图1所示；优化后的密码子相对适应度图如图2所示。

实施例2：表达载体pGEX-4t-J的构建：

以质粒pGEX-4T-1为出发质粒，先采用pflmⅠ在3250位点处进行单酶切，3’末端再切2个，5’末端切6个，3’末端加A，5’末端加CTAGT；再保护；再用btgⅠ在4869位点处进行单酶切，5’末端切4个再加AAGA，去掉所有的保护；再加上5’-CTAGT……G-3’的全长100bp的人造链，人造链中间省略的序列，其只要不包含SpeⅠ和Bsc91Ⅰ两个酶切位点，中间省略的序列可任意选择。

用SpeⅠ和Bsc91Ⅰ对质粒pGEX-4t-J进行双酶切并鉴定，双酶切后pEGX-4t-J出现3349和100两条，则证明表达载体pGEX-4t-J构建成功(图3)。

密码子优化后的目的基因没额外增加酶切位点，在质粒上增加SpeⅠ和Bsc91Ⅰ两个酶切位点才能将目的基因整合到质粒上。

实施例3：色氨酸脱羧酶基因原核表达载体的构建

将实施例1扩增得到的PCR产物用SpeⅠ和Bsc91Ⅰ进行双酶切，回收得到水稻色氨酸脱羧酶的编码基因TDC；同时用SpeⅠ和Bsc91Ⅰ双酶切实施例3构建的表达载体pGEX-4t-J；通过DNA连接酶将基因TDC(SEQ ID NO.3)整合到双酶切后的表达载体pGEX-4t-J上，得到色氨酸脱羧酶基因原核表达载体pEGX-TDC-1。

对构建的色氨酸脱羧酶基因原核表达载体pEGX-TDC-1进行单酶切和双酶切(SpeⅠ和Bsc91Ⅰ)验证，单酶切后pEGX-TDC-1为4782bp，双酶切出现1533和3349两条带，证明目的基因已经整合到质粒上。

将实施例2优化后的TDC基因进行PCR扩增，同样使用SpeⅠ和Bsc91Ⅰ对质粒进行双酶切，再通过DNA连接酶将优化后的TDC基因(SEQ ID NO.1)整合到双酶切后的表达载体pGEX-4t-J上，得到色氨酸脱羧酶基因原核表达载体pEGX-TDC-2。

将上述构建原核表达载体pEGX-TDC-1和pEGX-TDC-2导入大肠杆菌B21(DE3)，首先在氨苄霉素选择培养基(所述氨苄霉素选择培养基是在LB固体培养基加60μg/mL的氨苄霉素，目的是为了筛选高拷贝质粒的菌株，注意一点，氨苄霉素需在培养基温度降至55℃后再通过滤膜加进去)上筛选，后通过SDS-PAGE测定(图5)，结果表明TDC基因在工程菌E.coli内表达；经密码子优化后的TDC基因的表达水平明显提高。

对比例1：

将实施例2优化后的TDC基因通过现有基因工程的方法连接到表达载体pGEX-4t-1上，得到色氨酸脱羧酶基因原核表达载体pEGX-TDC-3。

对比例2：

将实施例2优化后的TDC基因通过现有基因工程的方法连接到表达载体pET32a上，得到色氨酸脱羧酶基因原核表达载体pET32a-TDC。

对比例3：

将实施例2优化后的TDC基因通过现有基因工程的方法连接到表达载体Pcold-tf上，得到色氨酸脱羧酶基因原核表达载体Pcold-tf-TDC。

将本发明实施例构建的色氨酸脱羧酶基因原核表达载体pEGX-TDC-1和pEGX-TDC-2，以及对比例1-对比例3制备的色氨酸脱羧酶基因原核表达载体导入大肠杆菌B21(DE3)，分别获得重组菌；将重组菌接入到同样的LB液体培养基中进行诱导培养，诱导培养条件相同(IPTG终浓度均为1mM，25℃诱导培养6h)，诱导培养后超声破菌，分离上清液，检测上清液中目的蛋白(色氨酸脱羧酶)的表达情况以及活力。其中：

目的蛋白的表达情况是利用植物色氨酸脱羧酶(TDC)检测试剂盒(购自于上海臻科生物科技有限公司)测定色氨酸脱羧酶(TDC)的浓度进行表征，其检测原理为：用纯化的色氨酸脱羧酶(TDC)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入色氨酸脱羧酶(TDC)，再与HRP标记的色氨酸脱羧酶(TDC)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的色氨酸脱羧酶(TDC)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中色氨酸脱羧酶(TDC)浓度。检测方法按检测试剂盒说明书操作。

色氨酸脱羧酶的酶活的计算方法如下：

通过液相测定色胺生成量计算酶活，取1g L-色氨酸+0.01g辅酶PLP，加0.900g色氨酸脱羧酶(通过不同原核表达载体制备得到)，溶解，用稀硫酸和NaOH溶液调pH为6.0，定容100mL，25℃水浴。通过液相色谱测定反应开始后5-30min的色胺并绘制曲线，最终计算出酶活力。

结果见表1。

表1：

表达载体	色氨酸脱羧酶(TDC)浓度	色氨酸脱羧酶(TDC)酶活
			pEGX-TDC-1	0.010μmol/L	0.95-1.28U
pEGX-TDC-2	0.014μmol/L	1.03-1.35U
			pEGX-TDC-3	6nmol/L	0.90-1.10U
pET32a-TDC	3nmol/L	0.85-0.95U
			Pcold-tf-TDC	4nmol/L	0.75-0.90U

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 新泰市佳禾生物科技有限公司,汕头市佳禾生物科技有限公司

<120> 色氨酸脱羧酶基因原核表达载体及其应用

<130> 2021

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1533

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ctagttgttg atatgggttc tctggacacc aacccgaccg ctttctctgc tttcccggct 60

ggtgaaggtg aaaccttcca gccgctgaac gctgacgacg ttcgttctta cctgcacaaa 120

gctgttgact tcatctctga ctactacaaa tctgttgaat ctatgccggt tctgccgaac 180

gttaaaccgg gttacctgca ggacgaactg cgtgcttctc cgccgaccta ctctgctccg 240

ttcgacgtta ccatgaaaga actgcgttct tctgttgttc cgggtatgac ccactgggct 300

tctccgaact tcttcgcttt cttcccgtct accaactctg ctgctgctat cgctggtgac 360

ctgatcgctt ctgctatgaa caccgttggt ttcacctggc aggcttctcc ggctgctacc 420

gaaatggaag ttctggctct ggactggctg gctcagatgc tgaacctgcc gacctctttc 480

atgaaccgta ccggtgaagg tcgtggtacc ggtggtggtg ttatcctggg taccacctct 540

gaagctatgc tggttaccct ggttgctgct cgtgacgctg ctctgcgtcg ttctggttct 600

gacggtgttg ctggtctgca ccgtctggct gtttacgctg ctgaccagac ccactctacc 660

ttcttcaaag cttgccgtct ggctggtttc gacccggcta acatccgttc tatcccgacc 720

ggtgctgaaa ccgactacgg tctggacccg gctcgtctgc tggaagctat gcaggctgac 780

gctgacgctg gtctggttcc gacctacgtt tgcgctaccg ttggtaccac ctcttctaac 840

gctgttgacc cggttggtgc tgttgctgac gttgctgctc gtttcgctgc tggttgcacc 900

tctacccgtc gtaccccggc tgctcgtgct tctgctcgtt cttctggtac cacctctacc 960

gcttggtctg cttggacccc gtctgcttaa gctccgacca acggttaata accggcttct 1020

accgctccgg cttctacctg cgctaccccg accgcttctc cggctccgtc tcgtccgacc 1080

cgttctacct ctcgtaccac cccggctacc ccggctcgtt ctccgacctc tcgtacctgc 1140

cgttctgctt ctgctgctgc ttctggtggt tcttcttctg gttggtcttg cgctccgacc 1200

gcttctccgt cttgccgttc tacctctggt gctacctctc cgtggccgcg ttgctctcgt 1260

acctcttctg ctgctaccac cggttctcgt tcttcttgcc gtggtacctc tctgtcttct 1320

gcttctggtt ctggtccggg tcgtcgtcgt cgtcgtgacg gtggtggtcg tcgtcgtggt 1380

gaaccgcgtg ctgacggtgc tgctgaacag gaccgtcagg gtgttcgtgg tgctcacggt 1440

ggtcgtcgtc aggttcgtgc tgctctgcgt ggtggtctgg ttgctgctgg tcgtgcttct 1500

cgtgctgaac gtgttggtgc tcaccaggaa gac 1533

<210> 2

<211> 507

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Gly Ser Leu Asp Thr Asn Pro Thr Ala Phe Ser Ala Phe Pro Ala

1 5 10 15

Gly Glu Gly Glu Thr Phe Gln Pro Leu Asn Ala Asp Asp Val Arg Ser

20 25 30

Tyr Leu His Lys Ala Val Asp Phe Ile Ser Asp Tyr Tyr Lys Ser Val

35 40 45

Glu Ser Met Pro Val Leu Pro Asn Val Lys Pro Gly Tyr Leu Gln Asp

50 55 60

Glu Leu Arg Ala Ser Pro Pro Thr Tyr Ser Ala Pro Phe Asp Val Thr

65 70 75 80

Met Lys Glu Leu Arg Ser Ser Val Val Pro Gly Met Thr His Trp Ala

85 90 95

Ser Pro Asn Phe Phe Ala Phe Phe Pro Ser Thr Asn Ser Ala Ala Ala

100 105 110

Ile Ala Gly Asp Leu Ile Ala Ser Ala Met Asn Thr Val Gly Phe Thr

115 120 125

Trp Gln Ala Ser Pro Ala Ala Thr Glu Met Glu Val Leu Ala Leu Asp

130 135 140

Trp Leu Ala Gln Met Leu Asn Leu Pro Thr Ser Phe Met Asn Arg Thr

145 150 155 160

Gly Glu Gly Arg Gly Thr Gly Gly Gly Val Ile Leu Gly Thr Thr Ser

165 170 175

Glu Ala Met Leu Val Thr Leu Val Ala Ala Arg Asp Ala Ala Leu Arg

180 185 190

Arg Ser Gly Ser Asp Gly Val Ala Gly Leu His Arg Leu Ala Val Tyr

195 200 205

Ala Ala Asp Gln Thr His Ser Thr Phe Phe Lys Ala Cys Arg Leu Ala

210 215 220

Gly Phe Asp Pro Ala Asn Ile Arg Ser Ile Pro Thr Gly Ala Glu Thr

225 230 235 240

Asp Tyr Gly Leu Asp Pro Ala Arg Leu Leu Glu Ala Met Gln Ala Asp

245 250 255

Ala Asp Ala Gly Leu Val Pro Thr Tyr Val Cys Ala Thr Val Gly Thr

260 265 270

Thr Ser Ser Asn Ala Val Asp Pro Val Gly Ala Val Ala Asp Val Ala

275 280 285

Ala Arg Phe Ala Ala Trp Val His Val Asp Ala Ala Tyr Ala Gly Ser

290 295 300

Ala Cys Ile Cys Pro Glu Phe Arg His His Leu Asp Gly Val Glu Arg

305 310 315 320

Val Asp Ser Ile Ser Met Ser Pro His Lys Trp Leu Met Thr Cys Leu

325 330 335

Asp Cys Thr Cys Leu Tyr Val Arg Asp Thr His Arg Leu Thr Gly Ser

340 345 350

Leu Glu Thr Asn Pro Glu Tyr Leu Lys Asn His Ala Ser Asp Ser Gly

355 360 365

Glu Val Thr Asp Leu Lys Asp Met Gln Val Gly Val Gly Arg Arg Phe

370 375 380

Arg Gly Leu Lys Leu Trp Met Val Met Arg Thr Tyr Gly Val Ala Lys

385 390 395 400

Leu Gln Glu His Ile Arg Ser Asp Val Ala Met Ala Lys Val Phe Glu

405 410 415

Asp Leu Val Arg Gly Asp Asp Arg Phe Glu Val Val Val Pro Arg Asn

420 425 430

Phe Ala Leu Val Cys Phe Arg Ile Arg Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala

435 440 445

Ala Thr Glu Glu Asp Ala Asp Glu Ala Asn Arg Glu Leu Met Glu Arg

450 455 460

Leu Asn Lys Thr Gly Lys Ala Tyr Val Ala His Thr Val Val Gly Gly

465 470 475 480

Arg Phe Val Leu Arg Phe Ala Val Gly Ser Ser Leu Gln Glu Glu His

485 490 495

His Val Arg Ser Ala Trp Glu Leu Ile Lys Lys

500 505

<210> 3

<211> 1533

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 3

ctagttgttg atatgggcag cttggacacc aaccccacgg ccttctccgc cttccccgcc 60

ggcgagggtg aaaccttcca gccgctcaac gccgatgatg tccggtccta cctccacaag 120

gcggtggact tcatctcgga ctactacaag tccgtggagt ccatgccggt gctgcccaat 180

gtcaagccgg ggtacctgca ggacgagctc agggcctcgc cgccgacgta ctcggcgccg 240

ttcgacgtca ccatgaagga gctccggagc tccgtcgtcc ccgggatgac gcactgggcg 300

agccccaact tcttcgcgtt tttcccctcc acgaatagtg cggccgccat tgccggcgac 360

ctcatcgcgt cggcgatgaa cacggtcggg ttcacgtggc aggcgtcgcc ggcggccacc 420

gagatggagg tgctcgcgct ggactggctc gcgcagatgc tcaacctgcc gacgagcttc 480

atgaaccgca ccggcgaggg gcgtggcacc ggcggtgggg ttattctggg gacgaccagc 540

gaggcgatgc tcgtcacgct cgttgccgcg cgcgacgccg cgctgcggcg gagcggcagc 600

gacggcgtgg cgggactcca ccggctcgcc gtgtacgccg ccgaccagac gcactccacg 660

ttcttcaagg cgtgccgcct cgccgggttt gatccggcga acatccggtc gatccccacc 720

ggggccgaga ccgactacgg cctcgacccg gcgaggctgc tggaggcgat gcaggccgac 780

gccgacgccg ggctggtgcc cacctacgtg tgcgccacgg tgggcaccac gtcgtccaac 840

gccgtcgacc cggtgggcgc cgtggccgac gtcgcggcga ggttcgccgc tgggtgcacg 900

tcgacgcggc gtacgccggc agcgcgtgca tctgcccgga gttcaggcac cacctcgacg 960

gcgtggagcg cgtggactcc atcagcatga gcccccacaa atggctgatg acctgcctcg 1020

actgcacctg cctctacgtg cgcgacaccc accgcctcac cggctccctc gagaccaacc 1080

cggagtacct caagaaccac gccagcgact ccggcgaggt caccgacctc aaggacatgc 1140

aggtcggcgt cggccgccgc ttccgggggc tcaagctctg gatggtcatg cgcacctacg 1200

gcgtcgccaa gctgcaggag cacatccgga gcgacgtcgc catggccaag gtgttcgagg 1260

acctcgtccg cggcgacgac aggttcgagg tcgtcgtgcc gaggaacttc gctctcgtct 1320

gcttcaggat cagggccggg ccggcgccgc cgccgcgacg gaggaggacg ccgacgaggc 1380

gaaccgcgag ctgatggagc ggctgaacaa gaccggcaag gcgtacgtgg cgcacacggt 1440

ggtcggcggc aggttcgtgc tgcgcttcgc ggtgggctcg tcgctgcagg aagagcatca 1500

cgtgcggagc gcgtgggagc tcatcaagaa gac 1533

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtaaggtata gtatcatc 18

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gtgagttagc taggttggtg tg 22

Claims

1.一种色氨酸脱羧酶基因原核表达载体，其特征在于，由如下方法构建而成：

(3)采用SpeⅠ和Bsc91Ⅰ对质粒pEGX-4T-J进行双酶切处理，通过DNA连接酶将SEQ IDNO.1所示的核苷酸片段连入双酶切后的质粒pEGX-4T-J上，即构建得到色氨酸脱羧酶基因原核表达载体。

2.根据权利要求1所述的色氨酸脱羧酶基因原核表达载体，其特征在于，步骤(1)中，先采用pflmⅠ在pEGX-4T-1第3250位点处进行单酶切，再采用btgⅠ在pEGX-4T-1第4869位点处进行单酶切。

3.根据权利要求1所述的色氨酸脱羧酶基因原核表达载体，其特征在于，步骤(1)中，构建得到的质粒pEGX-4T-J的长度为3449bp；质粒pEGX-4T-J仅在第3249位点处存在SpeⅠ酶切位点，仅在第3349位点处存在Bsc91Ⅰ酶切位点。

4.含有权利要求1所述色氨酸脱羧酶基因原核表达载体的重组菌。

5.权利要求1所述的色氨酸脱羧酶基因原核表达载体或权利要求2所述的重组菌在色氨酸脱羧酶生产中的应用。