CN110093338B - 海带γ型碳酸酐酶基因Sjγ-CA2及其编码蛋白和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了海带γ型碳酸酐酶基因Sjγ‑CA2及其编码蛋白和应用，基因Sjγ‑CA2的cDNA序列如SEQ ID NO:1所示，其DNA序列如SEQ ID NO:2所示；其编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，通过上述基因Sjγ‑CA2和表达载体构建所产生的重组蛋白rSjγ‑CA2的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，且具有CO₂水合反应的酶活性；本发明的上述基因Sjγ‑CA2、其编码蛋白和重组蛋白rSjγ‑CA2可用于高产转基因海带的培育。

Description

海带γ型碳酸酐酶基因Sjγ-CA2及其编码蛋白和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及海带γ型碳酸酐酶基因Sjγ-CA2及其编码蛋白和应用。

背景技术

海带(Saccharina japonica)对CO₂的吸收有助于缓解温室气体及水体酸化，

占海水总无机碳含量的90％左右，是海水无机碳的主要形式；而CO₂所占的比例不足无机碳总量的1％，但海带等大型海藻的光合作用效率却远远高于陆地植物(Gao&McKinley，1994)。这是因为多数海藻存在一种无机碳浓缩机制(CCM)，可以增加1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCO)周围的CO₂浓度，使藻体能固定更多的CO₂以提高其光合作用效率。在CCM中，碳酸酐酶(CArbonic anhydrase，CA)是一个不可缺少的组分，CA是一种含锌金属酶，能够有效地催化

与CO₂之间的可逆反应，有助于将CO₂运输到RuBisCO周围。到目前为止，已经报道的CA有8种亚型，它们分别是α-CA、β-CA、γ-CA、δ-CA、ε-CA、ζ-CA、η-CA和θ-CA，其中，前三者广泛分布在植物、动物、真细菌和古细菌中。

发明内容

本发明的主要目的在于提供海带γ型碳酸酐酶基因Sjγ-CA2。

本发明的另一目的在于提供上述基因Sjγ-CA2的编码蛋白。

本发明的目的之三在于提供上述基因Sjγ-CA2与表达载体构建获得的重组蛋白rSjγ-CA2。

本发明的目的之四在于提供上述基因Sjγ-CA2、其编码蛋白、和/或其重组蛋白rSjγ-CA2在培育高产转基因海带作物上的应用。

本发明在海带高通量测序所得到一条长为741bp的contig序列基础上，利用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)技术获得该基因的cDNA全长序列如SEQ ID NO:1所示，它长1396bp，包括59bp的5′-非翻译区(un-translated region，UTR)，570bp且具有明显poly A尾的3′-UTR和741bp的开放阅读框(open reading frame，ORF)；它编码一个由246个氨基酸组成的蛋白如SEQ ID NO:3所示，相对分子质量为25.7kD，等电点为5.70。经ChloroP1.1预测，在16Arg～17Ala处有一个类似叶绿体转运肽的酶切位点，酶切后的成熟蛋白是由230个氨基酸组成的多肽，该成熟蛋白的相对分子质量约为24.0kDa，等电点为5.38。邻接法(neighbour-joining,NJ)进化树分析结果显示该基因属于γ-CA家族，因而将该基因命名为Sjγ-CA2。

将Sjγ-CA2基因连接至表达载体pET-28a中，然后导入大肠杆菌(Escherichiacoli)表达菌株BL21中，经过诱导表达和亲和层析纯化，获得重组蛋白rSjγ-CA2如SEQ IDNO:4所示。最后，用电极法对rSjγ-CA2进行检测，发现它具有将CO₂水合成

的功能，进而从功能上证明该基因为γ-CA基因家族成员。

为实现上述目的，本发明所采用的主要操作包括：

1)在温度17±1℃、光照强度40μmol photons/(m²·s)和光周期16h/8h(光照/黑暗)的条件下培养海带配子体，收集海带配子体细胞，并提取总RNA和基因组DNA。

2)在海带高通量测序所得到一条长为741bp且与长囊水云γ-CA(GenBank登录号：CBJ49068)所编码蛋白具有86.7％的序列一致性的基础上设计引物，利用RACE技术获得该基因5′-和3′-末端的cDNA序列，经拼接和重新设计引物验证，获得该基因的cDNA序列。

3)将Sjγ-CA2与搜索到的其他CA氨基酸序列利用MEGA6软件进行聚类分析，发现它与其他的γ-CA聚为一支，但与基因Sjγ-CA不同(基因Sjγ-CA的cDNA序列如SEQ ID NO:5所示、DNA序列如SEQ ID NO:6所示，基因Sjγ-CA编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示)。经BlastP比对，发现它与长囊水云的γ-CA(GenBank登录号：CBJ49068)所编码的蛋白具有86.7％的序列一致性，故将其命名为Sjγ-CA2。

4)根据Sjγ-CA2的cDNA序列设计引物，利用海带配子体基因组DNA作为模板进行PCR扩增，得到Sjγ-CA2的DNA序列，如SEQ ID NO:2所示。

5)根据Sjγ-CA2不含有叶绿体转运肽的ORF序列和克隆质粒pMD19-T及表达质粒pET28a多克隆位点序列设计带酶切位点的引物，利用PCR方法构建携带目的基因的克隆质粒pMD19-T/Sjγ-CA2。

6)利用核酸内切酶BamHI和HindIII分别对pMD19-T/Sjγ-CA2和pET28a进行双酶切，回收目的片段，再用T4连接酶连接得到含目的片段的重组质粒pET28a/Sjγ-CA2。

7)将测序正确的重组表达质粒pET28a/Sjγ-CA利用热激法转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中，筛选到含有目的基因的转基因菌株PET28a/Sjγ-CA2。将该转基因菌株接种到LB液体培养基中进行放大培养，当菌液在600nm的光密度(OD₆₀₀)值达到0.6～0.8时，加入1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)继续培养以诱导目的蛋白的表达。

8)收集菌体并破碎，利用Bio-Scale^TM Mini Profinity^TM IMAC Cartridges蛋白亲和层析纯化预装柱(Bio-Rad公司)纯化得到目的基因Sjγ-CA2的重组蛋白rSjγ-CA2。

9)利用十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)电泳技术对目的重组蛋白进行电泳，然后从凝胶上分离出目的条带，使用胰蛋白酶(Trypsin)对蛋白质样品进行酶解，再使用液相色谱-质谱-质谱(nanoLC-QE)联用对酶解后的多肽样品进行分析，以鉴定重组蛋白的氨基酸序列。

10)利用纯化到的rSjγ-CA2构建体外的CO₂水合反应体系，用电极法测定rSjγ-CA2的酶活性，进而鉴定了基因Sjγ-CA2编码蛋白的功能。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明首次从海带中分离得到海带γ型碳酸酐酶基因Sjγ-CA2，通过基因克隆获得Sjγ-CA2基因的DNA序列，然后利用原核表达获得其重组蛋白rSjγ-CA2，最后利用电极法检测rSjγ-CA2在CO₂水合反应中的酶活性，通过在转基因海带作物中增加Sjγ-CA2的基因表达量有助于提高海带的产量。

附图说明

图1是基因Sjγ-CA2的cDNA和DNA扩增产物电泳图(上)及基因结构(下)示意图；泳道1：5′-RACE末端扩增产物；泳道2：3′-RACE末端扩增产物；泳道3：Sjγ-CA2的DNA序列扩增产物；M：DL-2000分子量标准。

图2是基于CA的氨基酸序列所构建的聚类图；每个物种的拉丁名后面括号内表示该物种CA的蛋白序列号，节点处的数据为NJ的靴带值，箭号指示的是本发明基因Sjγ-CA2，梅花指示的已知海带γ-CA基因。

图3是Sjγ-CA2原核表达载体构建过程中相关产物的电泳图；M：Marker IV的DNA分子标准量(天根生化)；泳道1：pMD19T/SjγCA2的双酶切产物；泳道2：pET28a的双酶切产物；泳道3：pET28a/SjγCA2的双酶切产物。

图4是重组蛋白诱导表达产物的电泳图及Western免疫印迹图；M：预染的蛋白分子量标准(Fermentas)；泳道1：空载对照；泳道2、3和4：分别为IPTG诱导表达2h、4h和6h后的蛋白；泳道5和6：上清中的蛋白；泳道7和8：沉淀中的蛋白；泳道9为抗聚His标签抗体的Western免疫印迹。

图5是pET28a质粒图谱(上)及多克隆位点区域的序列(下)。

图6是rSjγ-CA2一个肽段的质谱图(上)及这个肽段在Sjγ-CA2中的位置(下)；下划线表示质谱检测到的肽段序列，其中，红色字母表示上述质谱图所检测到的且在Sjγ-CA2中对应的氨基酸序列。

图7是rSjγ-CA2纯化过程中洗脱产物的电泳图；M：预染的蛋白分子量标准(Fermentas)；泳道1：过柱后的包涵体；泳道2、3、4和5：分别用5mM、10mM、20mM和250mM咪唑变性漂洗缓冲液的洗脱产物；泳道6：250mM咪唑变性漂洗缓冲液的第二次洗脱产物。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

1、材料

海带配子体材料来自申请人，在温度为17±1℃、光照强度为40μmol photons/(m²·s)和光/暗比为16h/8h的条件下培养。所用培养基为PES(Starr&Zeikus，1993)，每两个星期换一次培养基。

大肠杆菌克隆菌株DH5α、表达菌株BL21(DE3)和增强型HRP-DAB底物显色试剂盒购自天根生化科技有限公司。

表达载体pET28a购自鼎国生物公司。

Taq DNA聚合酶、限制性核酸内切酶BamHI和HindIII、T4 DNA连接酶、TA克隆载体pMD19-T购自TaKaRa公司。

Bio-Scale^TM Mini Profinity^TM IMAC Cartridges蛋白亲和层析纯化预装柱购自Bio-Rad公司。

质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法植物基因组DNA提取试剂盒均购自北京艾德莱生物科技有限公司。

预染的蛋白质分子量标准购自Fermentas公司。

抗聚His标签抗体和辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔IgG购买于上海友科生物科技有限公司。

TRIzol试剂、SMART^TM RACE cDNA扩增试剂盒购自Clontech公司。

氨苄青霉素钠(Amp)、卡那霉素(Kan)、异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)均购自上海生工生物公司。

2、方法

(1)取0.1g刚离心收集的新鲜藻细胞置预冷的研钵中，加入液氮充分研磨。

(2)利用CTAB法提取基因组DNA，-80℃保存备用；利用TRIzol试剂法抽提总RNA，-20℃保存备用。

(3)利用反转录试剂盒对RNA进行反转录(RT)PCR反应合成cDNA。

①去除基因组DNA反应。PCR反应体系包含2μL的5×基因组DNA去除酶缓冲液、1μL的基因组DNA去除酶、总RNA的量最大为500ng，然后加无RNA酶的去离子H₂O至10μL。PCR反应条件为42℃保持2min，冷却至4℃保存。

②cDNA合成。PCR反应体系包含10μL的上述PCR反应液、4μL无RNA酶去离子H₂O、4μL的5×Prime Script缓冲液、1μL的Prime Script^RT Enzyme Mix I及1μL的RT Primer Mix。PCR反应条件为37℃保持15min、85℃保持5s、冷却至4℃保存，即完成cDNA的合成反应。

(4)在海带高通量测序所得到的一条长为741bp的contig序列，利用BlastX比对，发现它与长囊水云一个γ-CA基因(GenBank登录号：CBJ49068)所编码的蛋白具有86.7％的同源性。根据该contig序列设计1对引物C1(ATGCTGGCATCTTCCGCGAAACG)和C2(CTACGCCTCCTCCGCCTG)，以上述合成的cDNA为模板进行PCR扩增，反应产物经琼脂糖凝胶电泳并纯化及测序，以验证该contig序列。PCR反应体系包含1μL的cDNA、12.5μL的2×Taq PCRMaster Mix及上、下游引物各1μL，最后加去离子H₂O至25μL。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，63℃退火45s，72℃延伸45s，运行35个循环；72℃延伸10min，10℃保存。PCR产物经胶回收后连接至pMD19-T载体，然后利用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，蓝白斑筛选后挑取阳性克隆，进行菌落PCR验证，将验证后含有目的片段的阳性克隆菌液送至上海生工生物工程有限公司测序，以验证目的片段的序列。

(5)根据验证的contig序列设计基因特异引物，并利用RACE技术分别获得该基因的5′-和3′-末端的cDNA序列。

①使用Smart^TM RACE cDNA扩增试剂盒先合成5′-RACE和3′-RACE的cDNA第一链。

5′-RACE的cDNA第一链合成。PCR合成体系包含1.75μL的无RNA酶去离子H₂O，1μL总RNA，1μL的5′-RACE CDS Primer A。PCR反应条件为72℃保持3min，42℃反应2min后冷却至4℃保存。取出并短暂离心后加入2μL的5×第一链缓冲液，1μL的二硫苏糖醇(DTT)(20mM)，1μL的dNTP(10mM)，1μL的Smart Scribe反转录酶，1μL的SMARTer IIA，0.25μL的RNA酶抑制剂。PCR反应条件为42℃保持90min，72℃保持10min，冷却至4℃保存；取出后加入100μL的Tricine-EDTA溶液(10mM Tricine-NaOH，0.1mM EDTA，pH 8.0)进行稀释后，于-20℃冰箱保存备用。

3′-RACE的cDNA第一链合成。PCR合成体系包含2.75μL的无RNA酶的去离子H₂O及1μL的3′-RACE CDS Primer A，其他的反应组成及反应条件与5′-RACE的cDNA第一链合成反应一致。反应后同样稀释、保存备用。

②5′-RACE与3′-RACE的PCR反应。

5′-RACE采用巢式PCR反应。第一轮的PCR反应体系包含12.5μL的2×Taq PCRMaster Mix，9.5μL的无RNA酶去离子H₂O，1μL 5′-RACE的cDNA第一链反应液作为模板，1μL的引物γNF5(CGCTCAGCTCTCGCACAAACTTCGC)，1μL的引物UPM(试剂盒自带)。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s、66.9℃退火45s及72℃延伸2min，最后72℃延伸10min；40个循环。第二轮PCR的反应包含1μL第一轮PCR产物作为模板，引物为γNS5(CCAGCTCCGATGCGGCACCTGTTGC)和试剂盒中的NUP，其他组分同第一轮反应。反应条件为94℃预变性5min；94℃变性45s、70.2℃退火45s和72℃延伸2min，最后72℃延伸10min；共40个循环。

3′-RACE也采用巢式PCR反应。第一轮的PCR反应体系基本与5′-RACE的第一轮PCR反应体系相同，只是模板为3′-RACE的cDNA第一链反应液，基因特异性引物为γNF3(GCACCAGGAGCGAGGGTTCACGATGAC)。反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s、69.6℃退火45s及72℃延伸2min，最后72℃延伸10min；40个循环。第二轮PCR反应体系包含1μL第一轮PCR产物作为模板，引物为γNS3(CGTGGCGACAAGAATGCCGTGAAGATC)和试剂盒中的NUP，其他组分同第一轮反应。反应条件为94℃预变性5min；94℃变性45s、66.6℃退火45s和72℃延伸2min，最后72℃延伸10min；共40个循环。第二轮PCR反应后的产物经上述相同的胶回收、连接、转化、蓝白斑筛选和测序等过程，从而获得Sjγ-CA2的5′-及3′-末端的cDNA序列。

(6)Sjγ-CA2的DNA序列获得

根据所获得的CA基因的cDNA序列，在其开放阅读框(ORF)内利用contig验证所设计的引物C1和C2，以基因组DNA为模板进行PCR扩增来确定其基因结构。PCR反应体系同(4)，仅将模板换成DNA。PCR反应条件也同(4)。反应产物经上述相同的胶回收、连接、转化、蓝白斑筛选和测序后，获得Sjγ-CA2的DNA序列。

(7)运用NCBI中的Blast Server(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)对已获得的序列进行同源性搜索。利用MEGA6软件中的邻接法(NJ)进行聚类分析。

(8)带酶切位点的目的基因ORF序列克隆

根据Sjγ-CA2不含有叶绿体转运肽的ORF序列及克隆质粒pMD19T和表达质粒pET28a多克隆位点的序列设计带酶切位点的引物C2bamh(ggatccGCCGCGAGCGGCGTGACG，小写字母为BamHI酶切位点)和C3hind(aagcttCTACGCCTCCTCCGCCTG，小写字母为HindIII酶切位点)，利用PCR技术扩增Sjγ-CA2不含有转运肽的ORF片段。25μL的反应体系包括1μL的cDNA、12.5μL的2×Taq PCR Master Mix、9.5μL的去离子H₂O、1μL的上游引物及1μL的下游引物。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，72℃退火45s，72℃延伸1min，运行35个循环；72℃延伸10min，10℃保存。PCR产物经过胶回收、TA克隆，以构建携带目的片段的克隆质粒pMD19T/Sjγ-CA2，然后送上海生工生物工程公司测序确保目的片段序列的准确性。

(9)重组表达质粒pET28a/Sjγ-CA2的构建

从测序正确的菌液中抽提质粒pMD19T/Sjγ-CA2，用限制性内切酶BamHI和HindIII分别对其及表达质粒pET28a进行双酶切反应，37℃反应4h。酶切反应体系包含1μL的10×K缓冲液(200mM Tris-HCl，100mM MgCl₂，10mM DTT，1M KCl，pH 8.5)、1μL的BSA、6μL的pMD19T/Sjγ-CA或pET28a、1μL的BamHI、1μL的HindIII及10μL去离子H₂O。胶回收酶切后的目的片段，并用T4 DNA连接酶将酶切后的Sjγ-CA2片段与pET28a片段连接得到重组表达载体pET28a/Sjγ-CA2。连接反应体系为：3μL的目的基因片段、7.5μL的pET28a大片段、1μL的T4连接酶及2.5μL的T4缓冲液，然后加去离子H₂O至25μL。将连接后的产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，按照上述方法进行菌落PCR验证和测序。

(10)重组表达质粒的提取与转化

利用质粒提取试剂盒从测序正确的菌液中抽提重组表达质粒pET28a/Sjγ-CA2，经双酶切反应验证后，将pET28a/Sjγ-CA2利用热激法转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。培养并吸取转化的菌液进行PCR验证，并将验证后携带目的基因的菌液送至上海生工生物工程公司测序。

(11)重组蛋白的诱导表达与检测

将测序正确的携带重组质粒pET28a/Sjγ-CA2的菌液按1:1000(菌液:LB液体培养基)的比例接种于LB液体培养基，在37℃下、以180转/min(rpm)的转速活化培养10～12h。再按1:100(活化菌液:LB液体培养基)的比例，将活化的转基因菌液接种于LB液体培养基，放大培养至菌液的OD₆₀₀值为0.6～0.8，加IPTG至终浓度为1mM，在37℃下、以180rpm的转速继续震荡培养，以诱导目的蛋白的表达。

取培养4h的菌液在4℃下、以7000rpm的转速离心5min，并将沉淀的菌体用1×磷酸缓冲液(PBS，含0.137M NaCl、2.7mM KCl、10mM Na₂HPO₄、2mM KH₂PO₄，pH 7.4)重悬。取50μL重悬全菌与2×蛋白上样缓冲液(100mM Tris-HCl，pH 6.8，200mM的DTT，4％SDS，20％甘油，0.2％溴酚蓝)以1:1的比例混合，沸水中煮10min留样备用。将重悬的样品在液氮中反复冻融3次并超声破碎至溶液透亮。4℃下、以14000rpm的转速离心10min。收集上清并用1×PBS按10:1(菌液:1×PBS)的比例重悬沉淀，分别留样保存。利用十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测重组蛋白的诱导表达情况。

(12)重组蛋白rSjγ-CA2的Western免疫印迹

在将蛋白样品进行SDS-PAGE电泳时，将事先剪好的与凝胶块大小一样的硝酸纤维素膜(NC)用去离子H₂O浸泡1h，95％乙醇处理5s，然后放入转膜缓冲液(将30.2g的Tris和144g的Gly溶解于去离子H₂O中并定容至1000mL)中至少平衡10min。待电泳结束后，在电转仪上，由下至上分别放入事先用转膜缓冲液平衡过的海绵垫、三层滤纸、电泳凝胶、NC膜、三层滤纸、海绵垫，使NC膜与正极相连。于4℃冰箱中在100V电压下转膜120min。转膜结束后，将NC膜取出用丽春红染色，观察蛋白是否成功转到膜上，然后用1×TBST(含0.137M的NaCl、2.7mM的KCl、0.025M的Tris和0.05％的Tween 20，pH 7.4)溶液在室温下用摇床洗3次，每次10min。清洗后，将NC膜立即浸入含5％脱脂奶粉的1×TBST封闭液中，室温下孵育60min。选用抗聚His标签的商用抗体作为一抗，用封闭液按1:2000(一抗:封闭液)的比例稀释一抗。将标记好的NC膜放入，室温孵育90min后，用1×TBST在摇床上洗3次，每次10min。用1×TBST按1:4000的比例稀释HRP标记的羊抗兔IgG，室温下在摇床中孵育60min后，再用1×TBST洗3次，每次10min。用增强型HRP-DAB底物显色试剂盒在暗室中进行显色，并拍照记录。

(13)重组蛋白rSjγ-CA2的分离与纯化

根据His标签能够与金属离子发生亲和作用的原理，利用Bio-Scale^TM MiniProfinity^TM IMAC Cartridges蛋白亲和层析纯化预装柱来分离与纯化与组氨酸标签融合表达的重组蛋白rSjγ-CA2。

①新的1mL预装层析柱分别用5倍(即5×)于层析柱柱床体积(column volume，CV)的超纯水、5×CV的20％的乙醇和5×CV的超纯水以2mL/min左右流速清洗层析柱。经过这样处理的层析柱即可用于后续的蛋白纯化。

②用至少5×CV的洗脱缓冲液1(6M尿素、5mM咪唑、50mM KH₂PO₄、300mM KCl，pH8.0)平衡层析柱，流速控制在1mL/min以内。

③将自转基因菌液中制备的包涵体先用20～30mL 1×PBS配制的2M尿素冰浴洗涤包涵体1h，4℃下、以14000rpm的转速离心10min，洗去杂蛋白；再用1×PBS配制0.1％的Triton X-100，在冰浴条件下搅拌洗涤包涵体30min，4℃下、以14000rpm的转速离心10min，去除脂类和膜蛋白；接着用10mL的8M尿素溶解包涵体，再用滤膜过滤一下，以防止堵塞柱子，然后以1mL/min的流速通过层析柱。

④再用16×CV的洗脱缓冲液1以1mL/min的流速清洗层析柱。

⑤然后，依次用16×CV的洗脱缓冲液2(含10mM咪唑，其他组分同缓冲液1，以下的洗脱缓冲液都如此，均省略)、洗脱缓冲液3(含20mM咪唑)、洗脱缓冲液4(含250mM咪唑)以1mL/min的流速再次清洗层析柱，最后用洗脱缓冲液4(含250mM咪唑)再次清洗层析柱，分别留样，4℃保存备用。

(14)重组蛋白rSjγ-CA2的质谱鉴定与复性

吸取50μL每一梯度的洗脱液与2×蛋白上样缓冲液等体积混合后于沸水中煮10min，-20℃留样保存，利用SDS-PAGE进行电泳检测。从SDS-PAGE上分离出目的条带，使用胰蛋白酶(Trypsin)对蛋白质样品进行酶解，然后使用液相色谱-质谱-质谱(nanoLC-QE)联用对酶解后的多肽样品进行分析。采集多肽和多肽碎片的质量电荷比，通过搜索蛋白质质谱数据库解析氨基酸序列，并与目的基因所编码蛋白进行序列比对，以鉴定重组蛋白是否为目的蛋白。

将洗脱下来经过电泳检测的重组目的蛋白，用100×体积的缓冲液(0.05M Tris-HCl，150mM NaCl，1mM GSH，0.2mM GSSG，1mM EDTA，4M尿素，Arg 0.4M，5％甘油，pH 8.0)在4℃下透析24h；之后依次在尿素浓度为2M、1M、0M的透析缓冲液中透析12h以复性；4℃下、以10000rpm的转速离心30min，取上清，测定蛋白浓度并浓缩，利用SDS-PAGE电泳检测，置4℃冰箱保存备用。

(15)重组蛋白rSjγ-CA2的水合酶活性测定

①CO₂饱和水溶液的制备：将CO₂通入到0℃的去离子H₂O中，持续通气1h。

②巴比妥混合液的配制：巴比妥0.184g，巴比妥钠1.030g，加去离子H₂O至100mL，调pH至8.4，放在冰水混合物中备用。

③酶活性检测：将2mL纯化的rSjγ-CA2(用50mM Tris-HCl，pH 8.0，将蛋白浓度调至0.496mg/mL)溶液加入到4mL巴比妥钠的缓冲液中，测定pH值；然后加入2mL的CO₂饱和水，测定下降一个pH单位(即pH自8.3降至7.3)所需要的时间(min)，整个过程要保持在冰水混合物中。

④酶活性计算：若1个酶活性单位(U)定义为(t₀-t)/t(Haglund et al.，1992)，其中，t₀和t分别代表加入50mM的Tris-HCl和蛋白酶液后下降一个pH单位所用的时间(min)，那么，rSjγ-CA2的比活力即可用“(t₀-t)/t/mg蛋白质”来计算。

3、结果

(1)根据一条长为741bp的contig序列设计引物C1和C2，以海带配子体的cDNA为模板，扩增得到一条大小为741bp的产物。利用RACE技术分别获得572bp长5′-RACE的PCR产物(图1A泳道1)和1083bp长3′-RACE的PCR产物(图1A泳道2)。经与验证的长741bp片段拼接，并重新设计引物扩增、克隆与测序后，可知Sjγ-CA2的cDNA序列大小为1396bp(序列1)，包括一个长为741bp的ORF区、59bp的5′-非翻译区(UTR)以及570bp的3′-UTR，并在3′-UTR末端含有一个Poly A的尾巴。Sjγ-CA2编码一个由246个氨基酸组成的蛋白，相对分子质量为25.7kD，等电点为5.70。经SignalP预测，该基因编码的蛋白无信号肽，但通过ChloroP 1.1的预测，发现在16Arg～17Ala处存在一个类似叶绿体转运肽的酶切位点。酶切后的成熟蛋白是由230个氨基酸组成的多肽，该成熟蛋白的相对分子质量约为24.0kDa，等电点为5.38。

根据所获得CA基因的cDNA序列在其ORF内设计引物C1和C2，以基因组DNA为模板进行PCR扩增来确定其基因结构。将扩增产物进行电泳(图1A泳道3)后，并将最亮的那条约750bp大小的电泳带进行克隆和测序，获得ORF相应的DNA序列，它长741bp，无论长度和序列，都与其相应的cDNA一致，表明该CA基因的ORF没有被内含子序列割裂，即不存在内含子(图1B)。图1A泳道3中发现数条不太亮的条带，特别是比目的条带长的3条带，经克隆和测序后发现它们都是非特异性的扩增产物。

(2)将自NCBI中同源搜索获得的38条不同物种CA的氨基酸序列与Sjγ-CA2用邻接法(NJ)进行聚类分析。结果(图2)显示，39条序列明显地被聚成3大支，分别对应于α-CA(NJ的靴带值为100％)、β-CA(NJ的靴带值为99％)和γ-CA(NJ的靴带值为100％)。本研究自海带中所克隆的Sjγ-CA2在聚类图中位于γ-CA分支，与同属于褐藻的长囊水云(Ectocarpussiliculosus)γ-CA关系最近，在γ-CA分支中，假微型海链藻(Thalassiosira pseudonanaCCMP1335)γ-CA(GenBank登录号：BAO52722.1)的功能已得到证实，从而表明Sjγ-CA2应属于γ-CA家族。

(3)基于Sjγ-CA2不含转运肽的ORF序列和克隆质粒pMD19T及表达质粒pET28a多克隆位点的序列，设计带酶切位点的引物C2bamh和C3hind，以海带配子体的cDNA为模板，扩增到Sjγ-CA2不含有叶绿体转运肽的ORF序列，并连接至克隆质粒pMD19T上构建pMD19T/Sjγ-CA2；再用BamHI和HindIII双酶切pMD19T/Sjγ-CA2(图3泳道1)及表达质粒pET28a(图3泳道2)，连接目的片段以构建含目的基因的重组表达质粒pET28a/Sjγ-CA2。提取该表达质粒，经BamHI和HindIII双酶切反应，其产物经电泳检测(图3泳道3)，只出现目的基因大小(693bp)和载体序列大小(5337bp)的片段，表明已经成功地构建了重组表达质粒pET28a/Sjγ-CA2。

(4)将pET28a/Sjγ-CA2转化大肠杆菌BL21的感受态细胞中，获得转基因细胞系ET28a-SjγCA2。经放大培养及添加IPTG诱导培养后，收集菌体，将全菌经SDS-PAGE电泳，发现经IPTG诱导培养的转目的基因菌体中出现一条约34kD大小的条带(图4泳道2、3和4)，而空载中无此条带(图4泳道1)，说明这条约34kD大小的条带应是目的基因表达的产物；图4泳道2、3和4之间的比较结果显示，4h的诱导有利于目的基因的表达。因此，从诱导培养4h的菌体中分别提取上清和沉淀中的蛋白，经SDS-PAGE电泳，发现上清(图4泳道5和6)和沉淀(图4泳道7和8)中均出现与目的蛋白大小相近的条带，但主要在沉淀中，说明该重组蛋白主要以包涵体的形式表达。它的大小约为34kD，比重组目的蛋白的理论分子量(包含24.0kD由目的基因编码且不含转运肽的蛋白和3.56kD由图5所示表达质粒pET28a中His标签及多克隆位点碱基所编码的多肽)大了约6kD。

为了证明这条34kD大小的条带是重组的目的蛋白，首先，由于是运用表达质粒pET28a中的His标签融合表达目的蛋白，利用商业提供的抗聚His标签的抗体，对自转基因细胞系中提取的总蛋白进行Western免疫印迹，以确定表达的是否目的蛋白。Western印迹结果(图4泳道9)显示在目的蛋白大小处只出现一条信号，说明该蛋白中具有His标签，即融合表达的目的蛋白。同时，从SDS-PAGE上分离约34kD的目的条带，经酶解上样至Trap柱，利用液相色谱-质谱-质谱联用技术，采集多肽及多肽碎片的质荷比，并搜索蛋白质谱数据库，检测到5个肽段(图6)共99个氨基酸，占目的蛋白总长度(230个氨基酸)的43.04％，每个肽段均与Sjγ-CA2所编码蛋白的相应片段完全匹配，结果表明重组的目的基因Sjγ-CA2所编码的蛋白。

(5)由于上清中的目的蛋白无法与亲和层析柱的镍结合，难以从上清中纯化到目的蛋白，于是选择从包涵体中纯化重组蛋白。利用Bio-Scale^TM Mini Profinity^TM IMACCartridges蛋白亲和层析纯化预装柱，对自包涵体中提取的蛋白用含不同浓度咪唑的洗脱缓冲液进行纯化。其中，用含250mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱下来的蛋白，经SDS-PAGE电泳和染色，在目的蛋白大小处只显现一条带(图7泳道5)而无杂带，这样就得到纯化的重组蛋白rSjγ-CA2。

(6)自包涵体中纯化的蛋白因构象折叠错误而无酶活性，因此在进行活性检测之前，必须对纯化的重组蛋白进行复性。将经过尿素梯度透析而复性的rSjγ-CA2在体外构建CO₂的水合反应(即

)体系，利用电极法测定可知，需要约3min的时间，反应体系中的pH就从8.3下降到7.3；而在不加rSjγ-CA2的体系中，约需要4min的时间，pH才能下降到7.3。这个结果表明rSjγ-CA2具有加速CO₂的水合反应能力，从而使反应体系在指定的时间内形成更多的H⁺。通过计算可知，rSjγ-CA2的水合反应比活力为0.27±0.075U/mg蛋白(3次重复试验的平均值±标准差)。这样，通过酶活性的检测鉴定了Sjγ-CA2编码蛋白的功能。

序列表

<110> 上海海洋大学

<120> 海带γ型碳酸酐酶基因Sjγ-CA2及其编码蛋白和应用

<141> 2019-05-21

<160> 7

<170> SIPO Sequence Listing 1.0

<210> 1

<211> 1396

<212> DNA

<213> 海带（Saccharina japonica）

<400> 1

acatgggggg agcgggagac aaagggagat attgagagag caacaaattg agagctgcaa 60

tgctggcatc ttccgcgaaa cgaggaggcc ttgatgtcgc gttccgggcc gcgagcggcg 120

tgacggcggg gaggcaggta gccgcttgcc tcgctgcatc ttcgagaggt tcgctggccg 180

gacgaccgag gacgctgtct tccaccccaa gtcccgaata ccttaagcac cgaccggtca 240

tgaacctgca ccaggagcga gggttcacga tgaccacgac ttttgtcgcg ccgtgtgctt 300

cggtggtggg caacgtgagg atcatcgacc actcgtgcgt gtggtacggg gcagttattc 360

gtggcgacaa gaatgccgtg aagatcggcg cgcacgtaca cgtcggcgac aaggccgtcg 420

tcaacaccgt ggggagcgtc gacacaggct tcacttcgga ggtgatcatc gactcctggg 480

tcatcgtcga gcccggggct gtcctcacgt cctgcatgat cggcaacagg tgccgcatcg 540

gagctggggc ggtggtagcc gagggctccg tgatggagga ggggggccag attgccgcgg 600

ggacggtggt gccccccggc tgcctcgtgc ccaagaacga gctctgggcg ggcaaccccg 660

cgaagtttgt gcgagagctg agcgaggaag aggtgacgaa ggtggagacc gacgccgaag 720

cgatgagcgc gctcggagag ctgcacgccg acgagttcaa cccttacggc caggcctacg 780

tgcaggcgga ggaggcgtag ttgtttcaat tgcctcgctg cgttttttgc ggctttcgtt 840

tggaggttct ttgagggggg atgggccggt gggccagaga ggggccacac aggagggggt 900

gggcgggggg ggggcgtgct catgccatga atggtcgtgg tcttatggcc atagaccttc 960

tcgcatccct acaatgccgg gacggagtac gtcggatttt caccgaccag gcacagcggg 1020

atctgaagca gggagatact ttaaaaaggg agaaggatca cagggggggg gggtgtactc 1080

atgtcgtgca cggccgtagt cgtatgacca tagaccctcg catccctaca atgccgggac 1140

agagcacgtt gggttttcac caaccaggca gacattgctt gcaccaagcg cgaagcgccg 1200

tgaggtatgg ggcgagtcgc atggagggtg agctgcatcc tgctaagaac cgcctctgag 1260

gcggacttgc atatggacga cagcttcaat gagttaattt aatttctggt gtggccactt 1320

ccagagacaa caatgggagc actatgtaac tgcctcgcag atgccttact aaaaaaaaaa 1380

aaaaaaaaaa aaaaaa 1396

<210> 2

<211> 1370

<212> DNA

<213> 海带（Saccharina japonica）

<400> 2

acatgggggg agcgggagac aaagggagat attgagagag caacaaattg agagctgcaa 60

tgctggcatc ttccgcgaaa cgaggaggcc ttgatgtcgc gttccgggcc gcgagcggcg 120

tgacggcggg gaggcaggta gccgcttgcc tcgctgcatc ttcgagaggt tcgctggccg 180

gacgaccgag gacgctgtct tccaccccaa gtcccgaata ccttaagcac cgaccggtca 240

tgaacctgca ccaggagcga gggttcacga tgaccacgac ttttgtcgcg ccgtgtgctt 300

cggtggtggg caacgtgagg atcatcgacc actcgtgcgt gtggtacggg gcagttattc 360

gtggcgacaa gaatgccgtg aagatcggcg cgcacgtaca cgtcggcgac aaggccgtcg 420

tcaacaccgt ggggagcgtc gacacaggct tcacttcgga ggtgatcatc gactcctggg 480

tcatcgtcga gcccggggct gtcctcacgt cctgcatgat cggcaacagg tgccgcatcg 540

gagctggggc ggtggtagcc gagggctccg tgatggagga ggggggccag attgccgcgg 600

ggacggtggt gccccccggc tgcctcgtgc ccaagaacga gctctgggcg ggcaaccccg 660

cgaagtttgt gcgagagctg agcgaggaag aggtgacgaa ggtggagacc gacgccgaag 720

cgatgagcgc gctcggagag ctgcacgccg acgagttcaa cccttacggc caggcctacg 780

tgcaggcgga ggaggcgtag ttgtttcaat tgcctcgctg cgttttttgc ggctttcgtt 840

tggaggttct ttgagggggg atgggccggt gggccagaga ggggccacac aggagggggt 900

gggcgggggg ggggcgtgct catgccatga atggtcgtgg tcttatggcc atagaccttc 960

tcgcatccct acaatgccgg gacggagtac gtcggatttt caccgaccag gcacagcggg 1020

atctgaagca gggagatact ttaaaaaggg agaaggatca cagggggggg gggtgtactc 1080

atgtcgtgca cggccgtagt cgtatgacca tagaccctcg catccctaca atgccgggac 1140

agagcacgtt gggttttcac caaccaggca gacattgctt gcaccaagcg cgaagcgccg 1200

tgaggtatgg ggcgagtcgc atggagggtg agctgcatcc tgctaagaac cgcctctgag 1260

gcggacttgc atatggacga cagcttcaat gagttaattt aatttctggt gtggccactt 1320

ccagagacaa caatgggagc actatgtaac tgcctcgcag atgccttact 1370

<210> 3

<211> 246

<212> PRT

<213> 海带（Saccharina japonica）

<400> 3

Met Leu Ala Ser Ser Ala Lys Arg Gly Gly Leu Asp Val Ala Phe Arg

1 5 10 15

Ala Ala Ser Gly Val Thr Ala Gly Arg Gln Val Ala Ala Cys Leu Ala

20 25 30

Ala Ser Ser Arg Gly Ser Leu Ala Gly Arg Pro Arg Thr Leu Ser Ser

35 40 45

Thr Pro Ser Pro Glu Tyr Leu Lys His Arg Pro Val Met Asn Leu His

50 55 60

Gln Glu Arg Gly Phe Thr Met Thr Thr Thr Phe Val Ala Pro Cys Ala

65 70 75 80

Ser Val Val Gly Asn Val Arg Ile Ile Asp His Ser Cys Val Trp Tyr

85 90 95

Gly Ala Val Ile Arg Gly Asp Lys Asn Ala Val Lys Ile Gly Ala His

100 105 110

Val His Val Gly Asp Lys Ala Val Val Asn Thr Val Gly Ser Val Asp

115 120 125

Thr Gly Phe Thr Ser Glu Val Ile Ile Asp Ser Trp Val Ile Val Glu

130 135 140

Pro Gly Ala Val Leu Thr Ser Cys Met Ile Gly Asn Arg Cys Arg Ile

145 150 155 160

Gly Ala Gly Ala Val Val Ala Glu Gly Ser Val Met Glu Glu Gly Gly

165 170 175

Gln Ile Ala Ala Gly Thr Val Val Pro Pro Gly Cys Leu Val Pro Lys

180 185 190

Asn Glu Leu Trp Ala Gly Asn Pro Ala Lys Phe Val Arg Glu Leu Ser

195 200 205

Glu Glu Glu Val Thr Lys Val Glu Thr Asp Ala Glu Ala Met Ser Ala

210 215 220

Leu Gly Glu Leu His Ala Asp Glu Phe Asn Pro Tyr Gly Gln Ala Tyr

225 230 235 240

Val Gln Ala Glu Glu Ala

245

<210> 4

<211> 264

<212> PRT

<213> 海带（Saccharina japonica）

<400> 4

Met Gly Ser Ser His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

1 5 10 15

Arg Gly Ser His Met Ala Ser Met Thr Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg

20 25 30

Gly Ser Ala Ala Ser Gly Val Thr Ala Gly Arg Gln Val Ala Ala Cys

35 40 45

Leu Ala Ala Ser Ser Arg Gly Ser Leu Ala Gly Arg Pro Arg Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Thr Pro Ser Pro Glu Tyr Leu Lys His Arg Pro Val Met Asn

65 70 75 80

Leu His Gln Glu Arg Gly Phe Thr Met Thr Thr Thr Phe Val Ala Pro

85 90 95

Cys Ala Ser Val Val Gly Asn Val Arg Ile Ile Asp His Ser Cys Val

100 105 110

Trp Tyr Gly Ala Val Ile Arg Gly Asp Lys Asn Ala Val Lys Ile Gly

115 120 125

Ala His Val His Val Gly Asp Lys Ala Val Val Asn Thr Val Gly Ser

130 135 140

Val Asp Thr Gly Phe Thr Ser Glu Val Ile Ile Asp Ser Trp Val Ile

145 150 155 160

Val Glu Pro Gly Ala Val Leu Thr Ser Cys Met Ile Gly Asn Arg Cys

165 170 175

Arg Ile Gly Ala Gly Ala Val Val Ala Glu Gly Ser Val Met Glu Glu

180 185 190

Gly Gly Gln Ile Ala Ala Gly Thr Val Val Pro Pro Gly Cys Leu Val

195 200 205

Pro Lys Asn Glu Leu Trp Ala Gly Asn Pro Ala Lys Phe Val Arg Glu

210 215 220

Leu Ser Glu Glu Glu Val Thr Lys Val Glu Thr Asp Ala Glu Ala Met

225 230 235 240

Ser Ala Leu Gly Glu Leu His Ala Asp Glu Phe Asn Pro Tyr Gly Gln

245 250 255

Ala Tyr Val Gln Ala Glu Glu Ala

260

<210> 5

<211> 1647

<212> DNA

<213> 海带（Saccharina japonica）

<400> 5

gacctgaaat atgttcttgt cccgctgggt ctccgcctcc gcaatgttta tgaaaccctt 60

tgcgtgcaaa agacaggaga cgagctctcg ttcgggtagg tagcagaagc gaggaatatc 120

ggacgagaag ggctctacat accgtttccc gaggaagaag aggacgtcgc tccggcgttt 180

tcattggcac gatgctgcag caggcacgaa gcgcggtcgg agcggcagcg cggacactgg 240

gccgaagctt ggacggaatc ggagttgcgc tagagacgca cccttaccac gagcaactgt 300

tgccgtcgac ccggagcgtc gcccacaagg gcaaggtgcc gtcgacagcg ccggcctcct 360

tcgtggctcc taacgctacc gtcgtcgggg acgtgaaggt gggcagcgga gcgtctctgt 420

ggtacgggtc tgtggtccgc ggcgacgtga accacgtggt catcgggccc gggagctcgg 480

tgggggactc tgccgttctc cacgtggctg gtcttgccgg gaacaagccc accatcgtcg 540

gcaccaacgt ggttatcggc cccagagcga ccatccacgc gtgcacgcta gaggacgact 600

gcatggttgg ggcgggggct acggtgatgg acggggcgac ggtctcgagc ggggccatgg 660

tggcgcccgg cgcaaccgta acaccgaaca ctaacgtgcc gacgggacag ctctgggctg 720

gaactcctgc ggcgtacgtt cgggacatgt ctgtgaatga gtccgcttcg atcgtcgcca 780

tggcagtcga gactcaggcg ctttccctgg ctcacgcctc ggagtgctcc aaaggccccc 840

tcgagataga gcttgatgaa cggaagtggg ccgagaaggc cagccgcgac ccaacttacg 900

ttttccaggt gccggccgac ggagacgaca accttgctta caacgacgtc gaggggcggg 960

gagtgcccgg aagggtgttc aacaccaact tgcgcgagcc cgacgtggaa cccttcgtgc 1020

ccgagtacgc gggggacatc accaccgatg tggaaccggg aagcgacgag aagccgacga 1080

cacccgaagc tactggggca aaagcttaag cacggggagg gagggggggg ggggagggtg 1140

agggctaggc tatagaagcc tttttttact actgctgctg gcatgatttg actcgtattc 1200

cgggcggtgt tgtcctccga gatgtgggtg caactttgtc gcggggctca cagacgggtt 1260

cggtgacagg ggggatgggg tggtatgtgg aatggtaggg aggaaggagg gggggggggg 1320

gttgacgctg ccgcggtagc tatatagctt cgcgacgcag ctagctatct gcagagactg 1380

cgtcgtagga aataacacag gggttttcga tattgtggtt gcggctgctg gtggtgggtc 1440

tggtccagag aaatcttagc ctgcattgtt cggagtcggc ttgcagggcg cccattgtgc 1500

tgttgtcacc agcaaatgcg agcttctaat ttacacgacg ccaaaaaata ggggcccctt 1560

tcgagatcgc cttcgcctac agtaaaaccc gaataaaata ataaaaaaca gcaatggtaa 1620

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 1647

<210> 6

<211> 11812

<212> DNA

<213> 海带（Saccharina japonica）

<400> 6

gacctgaaat atgttcttgt cccgctgggt ctccgcctcc gcaatgttta tgaaaccctt 60

tgcgtgcaaa agacaggaga cgagctctcg ttcgggtagg tagcagaagc gaggaatatc 120

ggacgagaag ggctctacat accgtttccc gaggaagaag aggacgtcgc tccggcgttt 180

tcattggcac gatgctgcag caggcacgaa gcgcggtcgg agcggcagcg cggacactgg 240

gccgaagctt ggacggaatc ggagttgcgc tagagacgca cccttaccac gagcaacgta 300

agagcgacca ccttgatact tggtagctcc cccgcctgct ctgtgctggt gtcgcctgat 360

acgaggccat atgttgcgca catgcgtgca gtgctttgta tattcagtgt tttgggattg 420

ctacggtgaa ctgctgacat ccgtctgcga aggtggcagc gttccgggtg cagaatcaca 480

ggcccgccgg caagtgctcc tgcttgcgaa gcagcggcga gctacgtaca gacagcagta 540

tttatcgagc tcaccagaag tggtcgacta catatgatgc tgcatgctga tgtgtcttct 600

tacctgatgt gcagcagtag caggcttaga atgttttaca gtagtggaga cctgtcacag 660

cgtacatgca tactcgtagt ggtgctgcac tcgtacgttg tcttgttttt ccagggtaca 720

tacttgctgc actgctgctg tagacagcag tacaagacag cagtacgaca tgtgtcgaaa 780

gtcacagagc ccaacataac atctctttac gtacgtttac gacacaccaa ccggtactcg 840

tacttcatta ctgtgtagtt ttgtagactc gtaccaagta ggagagtacc ttgtacctgg 900

tagggcttag ctacgtaaca actgtatgga acataaaacc tcctttaggc actgcggtgg 960

tgggcacaaa acaaaacact tgaggagtag acgcagattc gggtttccac acagcagtgc 1020

attaaaaaaa ctaacgtata cactggtacc tgtacctggt acacaccagt acgtaacggg 1080

tgccggtaca cgatactgct gttacacccc agataccaga taaataccct tgagaacaac 1140

gtgcctctgg tgtgtaggta cgtggtagac gtgaagtcct ttttgctcca cagcctacgc 1200

cgttcgtccg aagtaccggt gttgcttgat gcagtgcctc gagaatgcaa cccctggtcg 1260

tgcatacgta gggagttctc agcctattcc gccgcgtcct ctgcaccgtt tttgcatgga 1320

tttttgtaga atagtgatgg gtttcgaacg ataatcgagt tcgatacgat acgatgccga 1380

tagacaaaaa aaaaaatcga tacgatttcg acctttggtt tatacctcga agctttcgtt 1440

cagtacatct gcttaaaaaa cacggggacg ccaggggatg gacggaaaaa cacgttcgtt 1500

acgatatatc gaaagttcga tatatcgaaa tttcaatatt tccatatttc gatgtatcaa 1560

tttcgatatt tcaatgtatc aatatcgaac gccaggggat ggacggcaaa acatgttcga 1620

tacctggtac atggaaattt cgatatttcg atatatcgaa ctttcgatat acgatatcga 1680

aacgttcgat acgatatcca acaccattgc agaaacatca gctgccgtac tcgtagggaa 1740

gttctcaacc tattccgccg cgtcctcttg ccatccttgt tgccgattgc cgactttttc 1800

ctgtcgaatt tcttcttgct gactttttct gctgttttct tgtccttgtt ttgttttgtt 1860

ttgtttgtcg gctttttgtc ttgtggccga cgcactagtg ttgccgtcga cccggagcgt 1920

cgcccacaag ggcaaggtgc cgtcgacagc gccggcctcc ttcgtggctc ctaacgctac 1980

cgtcgtcggg gacgtgaagg tgagcttccc cgcaaacacg aggaggagac gttttggcta 2040

atctgcggta ggtatcgccg ctctttcgat tgccgtaaac ctctgccttt attggtcttc 2100

gtgcacagag tggttacagg ctgagcacag agtggttata ggctgagcac ggagtggtgg 2160

tggtggtagc atggtagcag tagcggtagg gatggcagta ggggcaacag ttgcagcagt 2220

ggtaacagta gcagtagtgg caacagtagc agtagtggca gcagtagcag cagaggtagc 2280

tgtatcgaca acggtagggg tacatagcgg gagaggtagc ggtagtggta cgcggtagca 2340

gcagcgatgg aggtgacagt agcggcagca gaagcagtaa gcggtaggtg tatcgacagc 2400

gtctaggagt atagcaggag cggttgcagt agtggtaatt gtagcagtag gccgtaccgg 2460

tagcttaatc gatagcggta ggggtatagc ggcggcgtta gtggtagtgg tggcagtagc 2520

gatagtggta gtagtagcga cagggatggc agaagctgta gcagtggcag tagtgataca 2580

tacatagctg tatcgacaac gacatgtatg cccgggccgc cgcctataca aaaatgattc 2640

tatttcaagg taaagcttaa catttgcagt gtttgcaggc ggcatgtata tgtcgtgcga 2700

tccaccgcgt gcgtgtgtgc aatgattaca ctacaaggca aatatgtgca tttgctgtgt 2760

ttgcatgtct actgtacctg gtaggcggga ccacgggccg ggcgcaggag gccccatcca 2820

atccgatacc tacattaaat tctccacggt agggttaagt aacccgacag taaaggccgt 2880

tcttatggag caaagttttc ccagaaattc caatgttgtt tttcaagaaa aacaggaaaa 2940

tcaggaaaca tttccgaagt ttgaaaaatt aacagagggg aaaatatttg caaggcttcg 3000

cattccaata gttgaaaaac aaaaaaggaa aatatggaaa tacaagaaat tccgcgaaaa 3060

aaaaaatgga attttttgga aattcatggc tccaataaaa atggccctaa aaagggcgat 3120

cctctcgaag ggttcaaatt tggcacaaac acttgaacca cgggttggat caaaatgcct 3180

caaatttttc gttttcgctc aaaccgttct atccaggccg ccgtcgccac cgccgccgcc 3240

actactacag ccttcacttt cgaccccctt cctgcaattt gcgttattat ttattttatt 3300

ttattttttt gcaccggccg tttcaggtgg gcagcggagc gtctctgtgg tacgggtctg 3360

tggtccgcgg cgacgtgaac cacgtggtca tcgggcccgg gagctcggtg ggggactctg 3420

ccgttctcca cgtggctggt cttgccggga acaagcccac catcgtcggc accaacgtgg 3480

ttatcggtgc gtgtgtgttg ggcgtactta ggggtggcat ttattttgct gaaaataaac 3540

gaatctgacc ttttaaccca ttcagaactg aaaaaatcct acactaattc caagtagttt 3600

gtctccaaat tcgtggaacc agttctcaag gggttaagac atgttcttct gaacagagga 3660

gctattatat gtaccaaata tcgttcatcc cttttttttg tttatactct ggtaaaatat 3720

atatttttcg aacaatacgt acctatatga tacgctgagt ttatgcgtcc atcccccacc 3780

cttccgccct tcaagattag caaaactttt cgttgtaata tatggaaaca acgtaatgtc 3840

atggtattca tggtatcccc gtttcccctc tatggttgag gtggcgtgtt tctgatgata 3900

acacgcacga gcaagtaatg ctttgcttgc ccgcgtgctc agaaatctct cagcacggca 3960

ccagcgcggt attataataa tacatcaaac atcaatcttg tgagtgaccg aaggccttct 4020

cgtctcaacc tgctccggtg gtcgggcttg ccccataccg catgattgtc ctagggtagc 4080

aataccatat cacatggcgt cgtcgtagac acgtgagtct agatcgctct tggttgctct 4140

ctccgcgagc ctggtccccg ataggctcgg cgcagataac agcttttgtg tttccaactt 4200

tgtttattgt attattctcg tttcccgtac gtacgagtaa aattgctggg gttttttttt 4260

catttgattt ttttcaatga acccctctga tgatgagatt tctccgtcgg acctgcaacc 4320

acccgacgta cccaacgagc cttgcgtaga cacggtggta gtggtcgtag ccccagtggg 4380

cactagctgc gacagcagta gcgattatag ccgcgccgca cctgcagcag tacctcctct 4440

gctgacaggt ccgagaaccc ctgatttgct tcgccacctg atcaaaattc gagatgcaac 4500

tcaaactttt cgcctggtag ccagctccca aagcctgtcg ccctctaaat caggctccct 4560

cgatttgagc gtagcccccc cctctagcga gcgcgctgct gcacctccgc tcggccccag 4620

ccagatcctt accctagcct tgagtactgc tgtagctcca gcctcgtgcg ctgctgtagc 4680

cactgtcttc cgctctactg ctgtagacac agaccttgcc ccgtgtgtaa gttcagcgtc 4740

agtcttagac agtatcctgt cccagctcgt ctcaacatcg atcatgttga cccgccctga 4800

gaaaactacc agtctgagtc cttccgtctc ggatcctctt tcatgttcga ctgcagctgt 4860

aagctccctc gacatgctga ccccttccgc aagcgagcct gccaccgctc aacctgtcga 4920

atgtctcccc gacaactctg gtcagatctg catgatgttg cagctctagc cgtggaagtc 4980

actctgacga caccgattcc gttgccacgc gcgatcgatg ccgtgctggg ccagttgaac 5040

agccgcgaca aaacagcgaa acttcacctc aagcacccgc ccgcccgccc acctcgggac 5100

caagaattcg gaggtgtgcc cgcgccgctc tccagcccgc tcgatagcct cttgccagcg 5160

tctgccctcg ggactttaac cgccgacgtt atcgctgcgc gccagagcag cagtagcacc 5220

tcaccggtgt cggttctcga accctcgccc gtggatgcca ctgctgctac caccgccgtg 5280

acgaacacag ttcgccaccc caatccgaca aggactggac agcccttgca ctttaatgaa 5340

aatcatatta tttttctcga atcatgcgac cagctgtcct ctccccggac tacggccaag 5400

gccgctatgt acccccccac gagatgtatc tccggagcgg ctgcacagct cacccgccct 5460

agtggcctat acgatcagcg cattcccgta ttcccgggga cacagtgatg cctaataggc 5520

acgggcacca cagcagcacc tgcctcacgt gcacccctgg tagcacacag cagtgactga 5580

tacgagtact cgctctgttc gtacagcggt acttttttgc gactgctcac gacccctcgt 5640

gcacgagtga cgtcctcgaa aacttcaggc tgtgagtggc ggacaaattc gctcaagact 5700

atgtccataa aagcggcatc caccgtttgc ggctcgtacg tagtcgaggg tgggaagacg 5760

acatcacgga atgccctcgg gaaggggcgg ggtgtgggag gcggtggtat ccggtccggc 5820

gagggcgtcg gatacggagt ccacccaccg ggcagtggat gcagcaaagc caaatctgcc 5880

agggccttgc aggccagccg gcgcaggtca gggaagacac ggggttcagc ccgctcgcat 5940

cgccctcgcc ggaccacagt ggcggaagtt tgcagggggg gggggggctt tccgaaaccg 6000

ccccacgatc gtgggggggt ttgtgtctcg catatggttg aggctgcacc ggagcgcacc 6060

atgtgctccc aggcggtacg acgaagaacg catatttttc ataagctctg gaggcctctc 6120

tcttaataac cccccggcct cgagtcttgg cttgggtggg ctcgcgccct ccagccaaag 6180

catcggtttg ggtgggctcc cactctcccg caccgatttt cgcgattttc gcgaacacgg 6240

gccacgaatg agaattgacg acctgtgata ttgtattgct gccctaggac aattatgcgg 6300

tatggggcaa gcccgactac cggggcaggt tgagacgaga aggccttcgg tcactcacaa 6360

gattgatgtt cgatgtacca ttatattacc gccctggttc cgtgctgaga gatttctgag 6420

cacgcgggcg atcaaagcat tatttgctcg tgcgtgttcc atcagaaaca cgccacctca 6480

acaatagagg ggaaacaggg ataccattaa tgccatgaca caagcccacc ctgaagggca 6540

gtatatgcag atgcatagaa atcaggaggg tacaaaatct attcagaaaa atctgagaaa 6600

tggatcgaag atactgtgct tcacaaccct ctcccacacc tctatatctt tcaaggcgaa 6660

agcctggtaa accctcggta atgaccgccc aactgttggg cgtgtctctg ttgggagtag 6720

gaacggtgct ccgtctcgaa agggatgcgt gctcaaatgg ctacgccaag caacaaatga 6780

gtacgccccc cccctgcatt gtagggatgc gagggtctat ggtcatacga ccacggccat 6840

cgaacgatac gcgaaggggt agcgggtcag cacgcgcgcg gcttcttaat ggagagtggc 6900

gcagtcaacc tcagaactca catacagtac gtaacgcagc gaaggctaac caggttgaag 6960

gaaacctcga cgcctagacc agagacgata ttatgtaccg gctagcaaaa cctgcacgac 7020

cacgatcaga cagaccgcga cggaacaaca ccgaagtgtc gcgggggcgt cgcccgattg 7080

gtgggaggcg gcttggcagc ctctccgatt aactcccccc catctttttc tagagatagt 7140

ccgggaacca gaaaggactc aaagcttttg accagtttac cacgatgatc accgggaggg 7200

taccggtgca cgcaaactgc aactagagta cagctaaaac acgcgtgcaa tacgacaatc 7260

accgcggcgc cggcagtaca taccggcaat ccgaacaggc cagtgacacg aagtcgttcg 7320

cgcatggggt ttacaagtcg cctgtttcct cttgccatct gtgactttct ttcatacgat 7380

gttgtgtcct tgatgagcga gcgtagcgcg ggcggaaccg ccggctacgc gaagcgcctt 7440

gtaaacatat atgtacacca attgtgcaag cgtctgccca aatccctgca ggccccagag 7500

cgaccatcca cgcgtgcacg ctagaggacg actgcatggt tggggcgggg gctacggtga 7560

tggacggggc gacggtctcg agcggggcca tggtggcgcc cggcgcaacc gtaacaccga 7620

acactaacgt gccgacggga caggtgcgat ttttttaagc acaaaatacg gggtaggcgg 7680

agttggtttg ggggggggcg gggggcgtac gcacttgttg tttgccgtgg ttatttggcc 7740

attgaccacg catccctttc gagacggagc aggagggagg ggggggtact tcattttcat 7800

gcatggccgt agtcgtacat atgaccataa atccctacaa tgctgcgacg gagcatgtcg 7860

ggttttcacc accgatcagg cagacattgc tagctagcac caagcgcgaa acgaaacgtg 7920

attgattctg atttttctga cccgaaatat aaggaacatt tctattacac attactgtaa 7980

aaaggttcat tatattcccg gtcagagtgg tactttttac tacattagcc caccccgtaa 8040

tacttggaat aaggcctatt aatagtcccg gaggtcttcc ccgtcacaat ggtaacgccc 8100

cttgcctctc ccctaccccc acccccaccc ctgtgttcag ctctgggctg gaactcctgc 8160

ggcgtacgtt cgggacatgt ctgtgaatga gtccgcttcg atcgtcgcca tggcagtcga 8220

gactcaggta ctgcctgctt tgcatcaaga gtgttgttgt tgttgttgtt gttgttgttg 8280

ttgttgttgt tgttgttgtt gttgttgttg ttgttgttgt tgttgttgtt gttgttgttg 8340

tcgttgttgt tgttgttgtt gttgttgttt ttgttgctgc tgctgctgct gctgctgctg 8400

ctgctggttg ccgccgctgc tggttgttgt tgttgatttt actgctgttt ctgctgacgt 8460

tcgtcggttg atttcgcagc agctgttgct tgttgcttct gctgctgtgt ttgttgagtt 8520

tgattttgcg ttttgctgtt gttggttttg gtgctgcttt tattgttgct ggtgctggta 8580

ttggtgctgt tgctactgtt gccgctacga gtactgttac tattgctact gccgttactg 8640

ctgctgatga tactttgtct aatgcttccg ttgggaaccg tccaaaccat gagggttatc 8700

gtgcaaagca cggcagagat cgcggaaggc gcttgggtat tcctcgcgaa aagaatgata 8760

ctggcggtat aaggaattga agacaacgtg atagggagat ctctcaaatc gcgcaaataa 8820

ctttaatgat attcgcagga gttgtgaaaa taactggaga cgatctggaa aaaaacttgc 8880

aaatatagac aacactcgag tatagtgttg aatgatcagg gcatatctat tgatagcggc 8940

aaccatcaaa aggcagacga agaactgagg tcgatatccc atcaagaacc gtactcgtaa 9000

aagtatctga cagataattt tcacaaatgc ggtacaacct gaaccaatga gcttctgaac 9060

acatgtagat gttttgttga aaaaagcgca atgtctgacc agctgagcct ccggtaaaca 9120

gctaatagct gctcaacgct ggtgctgctg ctaccacctt tcgatacatt agcagctagc 9180

tgctcgatgc cgggcctgcg tttgggtcca tcaacagcta cctgctcgct ttcacttttg 9240

ccagctgtcg cctcgtcccg ctgatgctgg tactgcgttt ggacacgcca acagctgcat 9300

agctgctcaa tttcacctta ttttacctgc ttctgctgct tctaattatt ttccgaacct 9360

gcttgctgat tttgatgttt ttcgcttgtg ttacttcttt ccttctgccg ctgctgctgc 9420

tgctgcctct gctgcttctg tcgctgcctc tgctgcttct gttgcttctg tcgcccctgc 9480

tgctgctgta ccgtccaggc gctttccctg gctcacgcct cggagtgctc caaaggcccc 9540

ctcgagatag agcttgatga acggaagtgg gccgagaagg ccagccgcga cccaacgtga 9600

gtatttttgg ttgtcgcggt ggcgtgggtg gttggatgag tgggtgggtg gtgtgggtgg 9660

tgtgggtggg tgggtggtgg gtggtgtgtg ggggtggtgg gtgggtggtt tttcccgcgt 9720

cacaatcggc attgcatcgt gtgggcattc gaatgccggg attgaatgga aatcgaacat 9780

cgaatacgaa gtagtgtcgc acatcattgc atcggcatag cataccgacg aattggtacc 9840

catgtgtggt atcgctgccg ctatcgcttt gctggcggta ttggcgtctc catcaccaaa 9900

ggttagggca aacacctcgc agccgtatag cttcgaattt gtatcgccag cgtggcagcc 9960

cacatcgcgt atcgcaacta tagcaagcgc attcgttaga tgcgtgttac ccgatatcgg 10020

ggtttgtatc gcatcgtatt cgcgtagtat gtactgtttg ttacctgcgt taggtgatta 10080

tgggcaggcc aacatttggt ttgaaggccg cactcccacc gccacacccc actccctccc 10140

tgccctccat gcaaataaaa tattccgcac ccccctaccc tgccgcgcca atcctcccgc 10200

ccgccccccc cgactacgcc atgcacgaca taagttaccc cccctccccc gcctatgcga 10260

atccttcgac acatcctcta accccccccc cccccccccc tataaatata tgatatattt 10320

ataggttggg ttggcgtcgg ttggcaacgg acgctgtaaa acaacgccac tcgcggtggc 10380

gtgagctaga caccagggtg ccgttttttt tttttttttt tttttggcgg ttcaccaaag 10440

ctggcggtcg agtagatcat tttgcggggt ggaaaacctt tgctccggca caggggaatg 10500

gtcgtaccac gtcagtgtta atatgggtaa ggcttcccgc ggaggcagtt acatttagta 10560

aaacccaatt gctgttctcc gacatggcca cacagaaatt aaattaagct cattgaagct 10620

gtcgtcatat gcaagtccac ctcagaggcg gttcttagca ggatgcagct caccctccat 10680

gcgacttgcc caatacctca cggcgtttcg cgcttggtgc aagcaatgtc tgcctggttg 10740

gtgaaaaccc aacgcgctcc gtcccggcat tgtagggatg cgagggtcta tggtcatatg 10800

actacggccg tgcacaacat gagtacaccc cccccccctc gctcgcgccg gtcaaatcgt 10860

ccgcacactc gtttcctttc ccgataccgt tccggtttcg atttctattc atgttgcgat 10920

tgtattaccg agtatggctc cggttccgat tcctgtgcca gttcttgttc caattccgat 10980

tatggtctcg attccaattc cgattgtggc gcctgttccg aatccgattc caatgccgat 11040

tgtgacacct gttccgattc cgattccaat tccggttcgg gtcccgcagt tacgttttcc 11100

aggtgccggc cgacggagac gacaaccttg cttacaacga cgtcgagggg cggggagtgc 11160

ccggaagggt gttcaacacc aacttgcgcg agcccgacgt ggaacccttc gtgcccgagt 11220

acgcggggga catcaccacc gatgtggaac cgggaagcga cgagaagccg acgacacccg 11280

aagctactgg ggcaaaagct taagcacggg gagggagggg ggggggggag ggtgagggct 11340

aggctataga agcctttttt tactactgct gctggcatga tttgactcgt attccgggcg 11400

gtgttgtcct ccgagatgtg ggtgcaactt tgtcgcgggg ctcacagacg ggttcggtga 11460

caggggggat ggggtggtat gtggaatggt agggaggaag gagggggggg gggggttgac 11520

gctgccgcgg tagctatata gcttcgcgac gcagctagct atctgcagag actgcgtcgt 11580

aggaaataac acaggggttt tcgatattgt ggttgcggct gctggtggtg ggtctggtcc 11640

agagaaatct tagcctgcat tgttcggagt cggcttgcag ggcgcccatt gtgctgttgt 11700

caccagcaaa tgcgagcttc taatttacac gacgccaaaa aataggggcc cctttcgaga 11760

tcgccttcgc ctacagtaaa acccgaataa aataataaaa aacagcaatg gt 11812

<210> 7

<211> 305

<212> PRT

<213> 海带（Saccharina japonica）

<400> 7

Met Leu Gln Gln Ala Arg Ser Ala Val Gly Ala Ala Ala Arg Thr Leu

1 5 10 15

Gly Arg Ser Leu Asp Gly Ile Gly Val Ala Leu Glu Thr His Pro Tyr

20 25 30

His Glu Gln Leu Leu Pro Ser Thr Arg Ser Val Ala His Lys Gly Lys

35 40 45

Val Pro Ser Thr Ala Pro Ala Ser Phe Val Ala Pro Asn Ala Thr Val

50 55 60

Val Gly Asp Val Lys Val Gly Ser Gly Ala Ser Leu Trp Tyr Gly Ser

65 70 75 80

Val Val Arg Gly Asp Val Asn His Val Val Ile Gly Pro Gly Ser Ser

85 90 95

Val Gly Asp Ser Ala Val Leu His Val Ala Gly Leu Ala Gly Asn Lys

100 105 110

Pro Thr Ile Val Gly Thr Asn Val Val Ile Gly Pro Arg Ala Thr Ile

115 120 125

His Ala Cys Thr Leu Glu Asp Asp Cys Met Val Gly Ala Gly Ala Thr

130 135 140

Val Met Asp Gly Ala Thr Val Ser Ser Gly Ala Met Val Ala Pro Gly

145 150 155 160

Ala Thr Val Thr Pro Asn Thr Asn Val Pro Thr Gly Gln Leu Trp Ala

165 170 175

Gly Thr Pro Ala Ala Tyr Val Arg Asp Met Ser Val Asn Glu Ser Ala

180 185 190

Ser Ile Val Ala Met Ala Val Glu Thr Gln Ala Leu Ser Leu Ala His

195 200 205

Ala Ser Glu Cys Ser Lys Gly Pro Leu Glu Ile Glu Leu Asp Glu Arg

210 215 220

Lys Trp Ala Glu Lys Ala Ser Arg Asp Pro Thr Tyr Val Phe Gln Val

225 230 235 240

Pro Ala Asp Gly Asp Asp Asn Leu Ala Tyr Asn Asp Val Glu Gly Arg

245 250 255

Gly Val Pro Gly Arg Val Phe Asn Thr Asn Leu Arg Glu Pro Asp Val

260 265 270

Glu Pro Phe Val Pro Glu Tyr Ala Gly Asp Ile Thr Thr Asp Val Glu

275 280 285

Pro Gly Ser Asp Glu Lys Pro Thr Thr Pro Glu Ala Thr Gly Ala Lys

290 295 300

Ala

305

Claims (4)

1.海带γ型碳酸酐酶基因Sjγ-CA2，其特征在于，其cDNA序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述海带γ型碳酸酐酶基因Sjγ-CA2的编码蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.重组蛋白rSjγ-CA2，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，具有CO₂水合反应的酶活性。

4.权利要求3所述的重组蛋白rSjγ-CA2在加速CO₂的水合反应能力上的应用。

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