CN105755018A - 软枣猕猴桃l-半乳糖内酯脱氢酶基因及其表达方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种软枣猕猴桃L?半乳糖内酯脱氢酶基因及其表达方法。本发明所用的软枣猕猴桃品种为“魁绿”。本发明包括(1)克隆一种软枣猕猴桃L?半乳糖内酯脱氢酶基因；(2)提供该基因及其编码蛋白的序列；(3)提供将该基因表达载体的构建方法；(4)提供该基因在大肠杆菌中的表达方法。通过对软枣猕猴桃L?半乳糖内酯脱氢酶基因的研究，可为进一步开展软枣猕猴桃AsA代谢分子机制奠定基础。

Description

软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因及其表达方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因及其表达方法。
背景技术
维生素C(Vitamin C)，又叫L-抗坏血酸(L-ascorbic acid，AsA)是植物和大多数动物体内合成的一类高丰度己糖内酯化合物。由于人类缺乏其合成关键酶无法自身合成与储存维生素C而只能从食物中获取，因此AsA含量已成为衡量农产品品质的重要指标。前人研究表明植物Vc可能存在4条合成途径：L-半乳糖途径、糖醛酸途径、L-古洛糖途径和肌醇途径，其中以Smirnoff-Wheeler提出的L-半乳糖途径占主导地位。该途径中，L-半乳糖内酯脱氢酶(GalLDH)直接氧化半乳糖内酯形成AsA，起着关键酶的作用，是所有合成相关酶中研究的比较多的一个。
软枣猕猴桃[Actinidia arguta(Sieb.et Zucc.)Planch.ex Miq.]为猴桃科(Actinidiaceae)猴桃属(Actinidia)多年生落叶木质藤本果树，广泛分布于我国东北、华北、西北及长江流域，朝鲜、日本，俄罗斯亦有分布，但以我国东北三省的资源最为丰富，软枣猕猴桃果实品质优良、酸甜适口，风味独特，营养丰富，富含维生素含量高达4.3mg/g。较高的Vc含量可能预示其存在特殊的合成机制，到目前为止，GalLDH基因已从茶树(NCBI登陆号KF619448.1)、美味猕猴桃(NCBI登陆号GU339039.1)、毛花猕猴桃(NCBI登陆号HM237180.1)等植物中得到克隆，但软枣猕猴桃中却未见报道，这对进一步深入了解软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶的基因基础、进一步开展软枣猕猴桃AsA代谢分子机制带来了很大阻碍。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因及其表达方法。本发明所用的软枣猕猴桃品种为“魁绿”。本发明包括(1)克隆一种软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因；(2)提供该基因及其编码蛋白的序列；(3)提供将该基因表达载体的构建方法；(4)提供该基因在大肠杆菌中的表达方法。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种自软枣猕猴桃提取的L-半乳糖内酯脱氢酶基因，所述L-半乳糖内酯脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
应当理解，本领域人员可根据本发明公开的软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因的核苷酸序列(SEQ ID NO:1)，在保证其活性的前提下，取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸，得到该基因的突变序列。因此，本发明的软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因还包括SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸残基，具有与软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因编码的蛋白相同活性的L-半乳糖内酯脱氢酶基因衍生得到的基因。
该基因全长2486bp，SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列是由1833个核苷酸组成的开放阅读框序列基因。
本发明提供的软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因为首次克隆得到，其编码的L-半乳糖内酯脱氢酶的氨基酸序列也为第一次得到。本申请丰富了L-半乳糖内酯脱氢酶的研究领域，为进一步开展软枣猕猴桃AsA代谢分子机制奠定基础。
本发明还提供上述编码权利要求所述的软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列是由610个氨基酸残基组成的蛋白质，分子量为69309.5Da；等电点为8.54，负电荷残基(Asp+Glu)数为75个，正电荷残基(Arg+Lys)数为81个；不稳定系数为51.38，为不稳定蛋白质。
扩增所述软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因的引物对，所述引物对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
可以软枣猕猴桃全基因组或本申请提供的重组质粒为模板，利用该引物对扩增出SEQ ID NO:1所述的基因。
如上所述的软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆方法，包括：
1)、提取软枣猕猴桃总RNA，以此为模板进行反转录得到第一链cDNA；
2)、根据Genbank中已登录的植物L-半乳糖内酯脱氢酶基因保守序列设计引物，以所述第一链cDNA为模板进行PCR扩增，将所得扩增产物测序得到软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因保守区序列；
3)、根据所述软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因保守区序列设计3'-RACE引物和5'-RACE引物，以软枣猕猴桃总DNA为模板，利用cDNA末端快速扩增技术进行扩增，将扩增产物测序后通过生物信息学方法分析并去除载体序列，将5'-RACE和3'-RACE测序结果拼接获得cDNA全长；
4)、通过生物信息学方法对获得的软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶全长cDNA序列进行开放阅读框分析从而得到目的基因所编码蛋白质的氨基酸序列。
含有权利要求1所述基因的重组质粒。
可选的，如上所述的重组质粒，所述重组质粒为将SEQ ID No:1所示的核苷酸插入到pMD18-T、pEASY或pET-28a(+)中得到。
可选的，如上所述的重组质粒的构建方法：
将SEQ ID NO:1所示的基因片段连接到克隆载体pEASY上，得到pEASY-Gal；
对pEASY-Gal进行扩增；
将SEQ ID NO:1所示基因片段从pEASY-Gal上酶切下来，连接到经过相同限制性内切酶切割的表达载体pET-28a(+)上，构建获得的重组质粒即为L-半乳糖内酯脱氢酶表达载体。
本发明的一个实施例中，将核苷酸序列为SEQ ID NO:1的基因片段连接到克隆载体pEASY中；再通过限制酶剪切并连接到表达载体pET-28a(+)中构建重组表达载体。
本申请先将目的片段连接到克隆载体上，再酶切并与表达载体连接。此操作有主要两方面的原因：
进克隆载体比进表达载体容易很多，可以尽快拿到目的片段，一旦克隆不成功，或者因为Taq酶的错配出现了碱基突变，会需要重复几次，样本即耗材都会大量消耗；
克隆载体的最大优点是它一般都有成熟的筛选系统，这样在一些连接效率较低、特异性不强的时候容易筛选。
含有权利要求4或5所述重组质粒的宿主细胞。
可选的，所述宿主细胞为JM109或BL21(DE3)-T1R中的一种。
这两种宿主细胞均为大肠杆菌。
可选的，如上所述的重组质粒在BL21(DE3)-T1R细胞中表达制备重组蛋白的方法，包括以下步骤：
将连接有SEQ ID No:1所示核苷酸序列的表达载体pET-28a(+)转入BL21(DE3)-T1R细胞，使用含卡那霉素的LB培养基、36～38℃培养至OD600nm值为0.5～0.7后添加IPTG诱导；继续36～38℃培养表达重组蛋白；将表达后的蛋白经初步分离、纯化后制得重组蛋白。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1)、本发明提供了一种软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因，从而了解了软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶的基因基础，并为进一步开展软枣猕猴桃AsA代谢分子机制奠定基础。
2)、本申请还提供了该软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因的表达质粒的构建方法及该基因的表达方法，结合这些方法可运用基因工程方法生产高纯度的维生素C，有广阔的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1步骤S12中软枣猕猴桃总RNA电泳图；左边的泳道为DL2000Marker，右边的泳道为软枣猕猴桃；
图2为实施例1步骤S13中软枣猕猴桃RT-PCR产物电泳图；左边的泳道为DL2000Marker，右边的泳道为软枣泥猴桃RT-PCR产物；
图3为实施例2步骤S21中软枣猕猴桃PCR扩增产物电泳图；左边的泳道为DL2000Marker，右边的泳道为软枣泥猴桃PCR扩增产物；
图4为实施例3步骤S32各抽提液SDS-PAGE/CBB染色结果；1～6泳道分别为pET-28a(+)全细胞抽提液、pET-28a(+)上清抽提液、pET-28a(+)沉淀抽提液、EXP0273(CTC0297-6)全细胞抽提液、EXP0273(CTC0297-6)上清抽提液、EXP0273(CTC0297-6)沉淀抽提液；
图5为实施例3步骤S33各抽提液SDS-PAGE/CBB染色结果；1～6泳道分别为pET-28a(+)全细胞抽提液、pET-28a(+)上清抽提液、pET-28a(+)沉淀抽提液、EXP0273(CTC0297-6)全细胞抽提液、EXP0273(CTC0297-6)上清抽提液、EXP0273(CTC0297-6)沉淀抽提液；
图6为实施例3步骤S34显色后PVDF膜的扫描结果；1～6泳道分别为pET-28a(+)全细胞抽提液、pET-28a(+)上清抽提液、pET-28a(+)沉淀抽提液、EXP0273(CTC0297-6)全细胞抽提液、EXP0273(CTC0297-6)上清抽提液、EXP0273(CTC0297-6)沉淀抽提液。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆
S11、材料与方法
试验材料：软枣猕猴桃“魁绿”采自中国农业科学院特产研究所软枣猕猴桃资源圃。取果实样品，用液氮速冻处理后-70℃冰箱保存备用。
主要试剂：HS(Premix)、cDNA第一链合成试剂盒、胶回收试剂盒、载体连接试剂盒购自宝生物工程有限公司。RACE试剂盒购于Clontech公司，其他试剂为国产分析纯。
S12、软枣猕猴桃总RNA的提取和第一链cDNA合成
提取缓冲液的配制：
提取缓冲液的配制：3％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)，2％PVP(聚乙烯吡咯烷酮)，100mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，25mmol/L EDTA，2.0mol/LNaCl；SSTE缓冲液：1.0mol/L NaCl，0.5％SDS，10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA(pH 8.0)；10mol/L LiCl沉淀RNA。其中3％CTAB和2％PVP为重量(g)体积(mL)百分数。
提取缓冲液使用前65℃预热，加入3％的β-巯基乙醇。通过CTAB-PVP法提取RNA，RNA质量对反转录反应的影响很大。从图1可以看出，提取得到的RNA，其28S和18S两条带较亮，且28S亮度约为18S的2倍，这表明RNA质量较好。取1～5ug总RNA，参照PrimeScriptTM1st Strand cDNASynthesis Kit说明书进行操作，合成第一链cDNA。
S13、软枣猕猴桃GalLDH基因cDNA片段的RT-PCR
根据Genbank中已登录的植物GalLDH基因保守序列设计引物。引物F：5′-CTTCTATCTTGCTCGCTGT-3′；R：5′-CGTGCTTGATTGTATGTATCCAC-3′由吉林省库美生物科技有限公司合成。然后以第1链cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系(20μL)为：第一链cDNA1μL，引物(10umol/L)各1μL，HS 10μL，ddH2O 7μL。PCR扩增条件为:94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min,34个循环；72℃延伸10min。获得的PCR特异片段回收纯化后送到吉林省库美生物科技有限公司。获得了约1000bp的特异片断(图2)，与预期片段大小相近。产物经连接转化和筛选测序后获得保守序列片段，用NCBI/BLAST程序进行同源搜索，结果与美味猕猴桃(Actinidia deliciosa)和毛花猕猴桃(Actinidiaeriantha)GalLDH基因的相似性为98％和97％。因此初步认定该片段为软枣猕猴桃GalLDH基因的片段。
S14、软枣猕猴桃GalLDH基因全长克隆
根据保守区测序结果，设计基因特异引物GSP1(3'-RACE引物):5'-CTATCAGAGAACAAGCACGTA-3'和GSP2(5'-RACE引物):5'-CGTCCTTGTCCTTCGGAACCTCA-3'，利用Clontech的SMARTTMRACEcDNA Amplification Kit方法进行扩增除退火温度均为65℃外，反应体系，扩增程序，回收和转化方法同步骤S13。测序后应用Vector NTI Suite 9.0软件去除载体序列，将5'-RACE和3'-RACE测序结果拼接获得cDNA全长。
S15、序列特征分析
应用DNAStar软件对获得的GalLDH全长cDNA序列进行开放阅读框(ORF)分析并将其推导为相应的氨基酸序列；
蛋白质氨基酸相似性比对在NCBI的BlastP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastp)中分析；
不同植物GalLDH基因氨基酸序列的多序列比较应用ClustalW 1.82(http://www.ch.embnet.org/soft-ware)进行分析；
蛋白质的分子质量、等电点及基本性质用Protparam(http://au.expasy.org/tools/protparam.html)预测；
疏水性分析和二级结构预测分别在(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)和(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page＝/NPSA/npsa_hnn.html)网站进行。
应用DNAStar和Protparam程序对获得的新基因全长cDNA序列进行开放阅读框分析，并将其推导为相应的氨基酸序列。结果显示，该基因全长2486bp，包括开放阅读框1833bp。基因的开放阅读框编码610个氨基酸，分子量为69309.4Da，等电点为8.68；负电荷残基(Asp+Glu)数为75个，正电荷残基(Arg+Lys)数为81个；不稳定系数为51.41，为不稳定蛋白质。
本申请发现在其5'端具有一段推定的线粒体靶信号肽(putativemitochondrial targeting signal peptide),其氨基酸序列的100FR/YA103间存在该信号肽的剪切位点(cleavage site)，这说明与其他植物GalLDH一样,软枣猕猴桃GalLDH也定位于线粒体。
用Tmpred,SMART等软件对其在线粒体上可能的跨膜拓扑学模型的分析预测表明，具有3个跨膜区(transmembrane region)，分别位于68-86(19)，265-287(23)以及322-343(22)个氨基酸之间。在123-259部位，含有一个典型的该基因在所有植物中都保守的黄素腺嘌呤二核苷酸结合域(FAD-binding region)，在283-603部位含有一个ALO结构域。
通过Prosite的分析结果表明，Ga1LDH包含1个天门冬酰胺糖基化位点(114NWSG)、11个酪蛋白激酶2磷酸化位点(61SssE、131TlqE、176SvlE、214SirE、351ShdE、391SftE、422TksE、460SmkD、501SsaE、502SaeE、587SklD)、3个N端十四(烷)酰化位点(155GLspNG、160GIglTR、227GAhgTG)、8个蛋白激酶c磷酸化位点(214SiR、244SmK、343SpK、366SlK、460SmK、490TaR、530TeK、607SeK)、l个酪氨酸激酶磷酸化位点(261Kdp.Elf.Y)、l个依赖于cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点(537RRlT)等翻译后修饰位点。
用本申请提供的氨基酸序列与蛋白质数据库进行同源性比较，其氨基酸序列与美味猕猴桃(ADB85575.1)、欧亚种葡萄(CBI30081.3)、苹果(ABR88113.1)、辣木(BAP75922.1)、黄瓜(KGN53984.1)两两比对的相似性系数分别为97％、88％、83％、82％、80％。
实施例2软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因原核表达载体的构建
S21、Insert DNA的制备
以实施例1中第一链cDNA为模板，以SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列为引物进行PCR扩增。反应体系(20μL)为：第一链cDNA 1μL，引物(10umol/L)各1μL，HS 10μL，ddH2O 7μL。PCR扩增条件为:94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃1min,30个循环；72℃延伸10min。将扩增产物进行电泳，电泳结果如图3所示。挖胶回收，并将含软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因(Gal基因)的pEASY质粒酶切，并将回收的片段命名为Insert DNA。
1、酶切反应体系为：
反应条件为37℃反应4小时。
Nde I的酶切位点为：
GGAATTCCATATGATGTTCCGAGCTCTCATTCTCCGGCG
Sal I的酶切位点为：
ACGCGTCGACTCAAATTTTTTCAGACAGTGGGAATAA
加粗部分为酶切位点。
取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳。
2、片段回收
使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(CodeNo.9762)切胶回收目的片段，命名为Insert DNA。
S22、Vector DNA的制备
1、酶切反应体系为：
反应条件为37℃反应4小时。
取5μL进行1％琼脂糖凝胶电泳。
2、载体回收
使用Takara MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0(CodeNo.9762)切胶回收载体片段，命名为Vector DNA。
S23、克隆测序
使用DNA Ligation Kit(Code No.6022)中的Solution I，将Insert DNA与Vector DNA连接后，热转化E.coli Competent Cell JM109(Code No.9052)中，涂布平板，37℃过夜培养。
挑取单菌落提取质粒命名为CTC0297-6，对CTC0297-6质粒测序。
实施例3将质粒CTC0297-6转入BL21(DE3)T1R感受态细胞中，对阳性克隆进行诱导表达
S31、转化
将CTC0297-6质粒取1.0μL转入Competent cell BL21(DE3)T1R中；使用LB/抗生素Kan(50ug/ml)平板，30μL转化液涂布，37℃培养，未连接目的基因的对照组pET28a(+)进行同样操作。
S32、培养及诱导
1、种培养
挑取单菌落至2ml LB/Kan(50ug/ml)培养基中，37℃培养,命名为EXP0273(CTC0297-6)。
2、主培养诱导
分别在Glass tube中添加5ml LB/Kan(50ug/ml)培养基，添加种培养菌液100μL。37℃培养至OD600nm值约为0.6，添加150mM IPTG 33μL(最终浓度为1mM IPTG)进行诱导，37℃培养4h后进行吸光度测定，测定结果如表1所示。
表1吸光度测定值、
样品名称 诱导前吸光度 集菌前吸光度
pET-28a(+) 0.60 1.60
EXP0273(CTC0297-6) 0.60 1.85
3、蛋白质抽提
集菌后2.0OD相当的菌体加入320μL PBS悬浊后进行超声波破碎，对菌体破碎液进行离心分离(12000rpm、10min)。
4、抽提液电泳
取各抽提液(全蛋白、上清、沉淀)8μL(0.05OD相当)，加入2μL 5×SDSLoading Buffer，99℃加热10分钟，进行SDS-PAGE电泳。
电泳条件：10％的胶，25mA恒流跑80分钟；
电泳结束后，CBB-R250染色，使用脱色液脱色。SDS-PAGE/CBB染色结果如图4所示。
S33、Western Blotting样品电泳对照
取各抽提液(全蛋白、上清、沉淀)8μL(0.05OD相当)，加入2μL 5×SDSLoading Buffer，95℃加热10分钟，使用彩色Marker及组氨酸标签Marker，进行SDS-PAGE电泳。
电泳条件：10％的胶，25mA恒流跑80分钟；
SDS-PAGE/CBB染色结果如图5所示。
S34、Western Blotting
将PVDF膜、滤纸分别剪切成与凝胶相同大小，使用转膜缓冲液处理后，按滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸的顺序依次放在转膜仪电极板之间，开始转膜，设置转膜仪参数如下：电流39mA，转膜时间80min。
将PVDF膜置于含1.5％BSA的10ml Blocking buffer中，4℃平放过夜封闭。使用稀释后的Penta-His Antibody溶液5ml，进行一次抗体反应1小时。TBST缓冲液(20ml)洗涤2次；洗涤TBS缓冲液冲洗3次。使用稀释后的HRP-Rabbit Anti-Mouse IgG抗体溶液5ml，进行二次抗体反应1小时。TBST缓冲液(20ml)洗涤2次；洗涤TBS缓冲液冲洗3次。1ml TrueBluePeroxidase Substrate显色1min。显色后PVDF膜如图6所示。
通过Western blotting验证，质粒CTC0273的目的基因在pET-28a(+)表达系统中有表达，但基本为不溶性表达。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种自软枣猕猴桃提取的L-半乳糖内酯脱氢酶基因，其特征在于，所述L-半乳糖内酯脱氢酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.权利要求1所述的软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3.扩增权利要求1所述软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因的引物对，其特征在于，所述引物对的上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
4.权利要求1所述的软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因的克隆方法，其特征在于，包括：
1)、提取软枣猕猴桃总RNA，以此为模板进行反转录得到第一链cDNA；
2)、根据Genbank中已登录的植物L-半乳糖内酯脱氢酶基因保守序列设计引物，以所述第一链cDNA为模板进行PCR扩增，将所得扩增产物测序得到软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因保守区序列；
3)、根据所述软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶基因保守区序列设计3'-RACE引物和5'-RACE引物，以软枣猕猴桃总DNA为模板，利用cDNA末端快速扩增技术进行扩增，将扩增产物测序后通过生物信息学方法分析并去除载体序列，将5'-RACE和3'-RACE测序结果拼接获得cDNA全长；
4)、通过生物信息学方法对获得的软枣猕猴桃L-半乳糖内酯脱氢酶全长cDNA序列进行开放阅读框分析从而得到目的基因所编码蛋白质的氨基酸序列。
5.含有权利要求1所述基因的重组质粒。
6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为将SEQID No:1所示的核苷酸插入到pMD18-T、pEASY或pET-28a(+)中得到。
7.权利要求6所述的重组质粒的构建方法，其特征在于：
将SEQ ID NO:1所示的基因片段连接到克隆载体pEASY上，得到pEASY-Gal；
对pEASY-Gal进行扩增；
将SEQ ID NO:1所示基因片段从pEASY-Gal上酶切下来，连接到经过相同限制性内切酶切割的表达载体pET-28a(+)上，构建获得的重组质粒即为L-半乳糖内酯脱氢酶表达载体。
8.含有权利要求5或6所述重组质粒的宿主细胞。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为JM109或BL21(DE3)-T1R中的一种。
10.权利要求6所述的重组质粒在BL21(DE3)-T1R细胞中表达制备重组蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将连接有SEQ ID No:1所示核苷酸序列的表达载体pET-28a(+)转入BL21(DE3)-T1R细胞，使用含卡那霉素的LB培养基、36～38℃培养至OD600nm值为0.5～0.7后添加IPTG诱导；继续36～38℃培养表达重组蛋白；将表达后的蛋白经初步分离、纯化后制得重组蛋白。
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