CN112794886A - 类植物乳杆菌LuxS蛋白、其应用及类植物乳杆菌重组菌 - Google Patents
类植物乳杆菌LuxS蛋白、其应用及类植物乳杆菌重组菌 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及类植物乳杆菌LuxS蛋白、其应用及类植物乳杆菌重组菌。本发明成功克隆得到类植物乳杆菌L‑ZS9菌株中的luxS基因，并将该基因与过表达质粒pMG76e连接，导入类植物乳杆菌L‑ZS9菌株中，成功构建了过表达工程菌株luxS‑pMG76e‑L‑ZS9。通过对比过表达luxS基因的luxS‑pMG76e‑L‑ZS9菌株和L‑ZS9菌株的AI合成和生物膜形成能力等相关生理指标发现，luxS基因的过表达会促进类植物乳杆菌L‑ZS9信号分子AI‑2的合成，且可增强L‑ZS9菌株的被膜形成能力。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及类植物乳杆菌LuxS蛋白、其应用及类植物乳杆菌重组菌。
背景技术
生物被膜是多数细菌自然状态下的一种生长方式，有助于菌体抵抗外界环境胁迫，其形成与发展常受到群体感应QS系统的调控。然而，目前生物被膜的研究多集中于病原菌，涉及益生菌生物被膜的相关研究非常匮乏。
类植物乳杆菌L-ZS9分离自传统发酵肉制品，产IIb类细菌素，对结直肠癌细胞有抑制作用，具有作为益生菌及发酵剂开发的潜力。被膜态的类植物乳杆菌L-ZS9比浮游态具有更强的耐热、耐酸和耐胆盐能力；信号分子AI-2对其生物被膜具有促进作用，同时可以缓解胃、胰蛋白酶对初始生物被膜的抑制作用，还可缓解二者对已形成被膜的破坏作用。类植物乳杆菌L-ZS9的生物被膜形成调控相关蛋白的发现以及高活性被膜态益生菌制剂的开发对于益生菌生产与利用具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供类植物乳杆菌LuxS蛋白、其应用及类植物乳杆菌重组菌。
本发明对类植物乳杆菌L-ZS9进行全基因组测序分析，发现L-ZS9具有合成AI-2的关键基因luxS，且AI-2的合成通路完整，同时不具有SAH水解酶编码基因sahH，说明L-ZS9的SAH代谢通路唯一，具有合成AI-2的分子基础，经验证，L-ZS9具有合成和分泌AI-2的能力，且L-ZS9的被膜形成与信号分子AI-2和luxS基因具有相关性。本发明克隆了类植物乳杆菌L-ZS9菌株的luxS基因，并构建了该基因过表达的类植物乳杆菌L-ZS9工程菌株，该工程菌株的生物被膜形成能力和AI-2合成能力均显著增强。进一步通过对该工程菌株的转录组和蛋白表达情况进行分析，发现了类植物乳杆菌L-ZS9中响应luxS基因过表达差异表达的基因。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供类植物乳杆菌LuxS蛋白，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供编码所述类植物乳杆菌LuxS蛋白的基因，其具有如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。
第三方面，本发明提供含有编码所述类植物乳杆菌LuxS蛋白的基因的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或重组微生物。
第四方面，本发明提供所述类植物乳杆菌LuxS蛋白或所述基因或所述生物材料在增强类植物乳杆菌的生物被膜形成能力中的应用。
第五方面，本发明提供所述类植物乳杆菌LuxS蛋白或所述基因或所述生物材料在增强类植物乳杆菌的信号分子AI-2合成能力中的应用。
第六方面，本发明提供所述类植物乳杆菌LuxS蛋白或所述基因或所述生物材料在调控类植物乳杆菌中谷氨酸-蛋白质共转运体glutamate:protein symporter、RNA假尿苷合酶RNA pseudouridine synthase、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶N-acetylglucosaminyltransferase、乙酰转移酶acetyltransferase或蛋氨酸ABC转运蛋白methionine ABC transporter permease的表达中的应用。
以上所述的应用中，所述类植物乳杆菌优选为类植物乳杆菌L-ZS9。
类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)L-ZS9分离自比利时发酵肉SAUCISSON SEC PUR，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.11669，该菌株已在专利申请CN111374278A中公开。
第七方面，本发明提供类植物乳杆菌重组菌，该菌株以类植物乳杆菌为出发菌，所述重组菌较所述出发菌具有提高的LuxS蛋白的表达水平，所述LuxS蛋白具有如SEQ IDNO.1所示的氨基酸序列。
优选地，所述出发菌为类植物乳杆菌L-ZS9，所述重组菌含有LuxS蛋白编码基因的pMG76e表达载体。
第八方面，本发明提供所述类植物乳杆菌重组菌的构建方法，该方法包括如下步骤：
(1)以类植物乳杆菌L-ZS9的基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO.3-4所示的引物扩增luxS基因；
(2)将所述luxS基因连接至pMG76e表达载体，构建过表达重组质粒luxS-pMG76e；
(3)将过表达重组质粒luxS-pMG76e转化至类植物乳杆菌L-ZS9，得到过表达luxS基因的类植物乳杆菌L-ZS9的重组菌。
具体地，以上所述的构建方法包括如下步骤：
(1)引物设计：根据类植物乳杆菌L-ZS9的luxS基因序列设计luxS基因PCR扩增引物，其序列如下：
luxS-F：5’-TGC TCTAGA ATGGCTAAAGTAGAAAGTTT-3’；
luxS-R：5’-CCG CTCGAG CTATTCAACGACTTTGCGAA-3’；
(2)利用步骤(1)的引物对类植物乳杆菌L-ZS9基因组中luxS基因片段进行PCR扩增；
(3)过表达重组质粒的构建：以pMG76e为表达载体，通过双酶切将线性化的质粒pMG76e片段与扩增出的luxS目的基因进行连接，构建过表达luxS-pMG76e重组质粒，然后对重组质粒进行验证；
(4)重组质粒的转化：制备类植物乳杆菌L-ZS9感受态细胞，并通过电击转化的方法将重组质粒luxS-pMG76e导入到类植物乳杆菌L-ZS9原生质体中，得到luxS过表达菌株；
(5)luxS基因过表达菌株构建结果验证。
以上所述的过表达重组质粒的构建具体包括如下步骤：
a.首先，将luxS基因胶回收产物与pMD-18T载体进行连接，连接体系包括：luxS基因胶回收产物8μL，pMD-18T 2μL，Solution I 10μL；连接温度18℃，连接时间2h；
b.连接结束后将连接产物化学转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃振荡培养60min后，取2mL菌体6000rpm离心2min，去上清1.8mL，将菌体重悬于剩余上清中，均匀涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板中，37℃培养至肉眼可见，筛选出阳性单克隆菌落；
c.将筛选的阳性菌株接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养10h，采用高纯度小提中量质粒提取试剂盒提取重组质粒luxS-pMD-18T，并进行琼脂糖凝胶电泳验证；
d.将重组质粒luxS-pMD-18T进行双酶切，酶切体系包括：质粒luxS-pMD-18T 3μL，XbaI FastDigest 1μL，XhoI FastDigest 1μL，10×Buffer 5μL，ddH2O 40μL；酶切温度为22℃，酶切时间10min；双酶切完毕后，进行琼脂糖凝胶电泳，对luxS基因片段进行切胶回收；
e.将质粒pMG76e进行双酶切，酶切体系包括：质粒pMG76e 5μL，XbaI FastDigest1μL，XhoI FastDigest 1μL，10×Buffer 5μL，ddH2O 38μL；酶切温度为22℃，酶切时间10min；双酶切完毕后，进行琼脂糖凝胶电泳，对线性化的质粒pMG76e片段进行切胶回收；
f.将切胶回收的luxS基因片段和线性化的质粒pMG76e片段进行连接，连接体系为：luxS基因片段8μL，质粒pMG76e 2μL，Solution I 10μL；连接温度18℃，连接时间2h；
g.连接结束后将连接产物化学转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中；转化步骤同上述b；转化完成后将菌株均匀涂布于含有200μg/mL红霉素的LB固体平板中，37℃培养48h，筛选阳性单克隆菌落；
h.将阳性菌株接种至含有200μg/mL红霉素的LB液体培养基中进行扩大培养，按照上述c中的方法提取质粒luxS-pMG76e，然后对重组质粒进行双酶切鉴定。
以上所述的重组质粒的转化的具体步骤如下：
a.将1μL重组质粒luxS-pMG76e DNA同20μL类植物乳杆菌L-ZS9感受态细胞混合后置于冰上，转移到2mm电击杯中，冰浴5～10min，确保没有气泡；
b.设定点击程序：1.5KV，25μL，400Ω，进行点击后，冰上静置5min；
c.加入0.5mL MRSSM复苏培养基，转移到1.5mL离心管中，37℃培养2h；
d.将复苏的菌液5000rpm，常温离心5min，去除400μL上清后，涂布于含3μg/mL红霉素的MRS平板，37℃培养36～48h。
以上所述的luxS基因过表达菌株构建结果验证的具体步骤如下：
a.挑取单克隆菌落，置于含有3μg/mL红霉素的MRS液体培养基的试管中，37℃静置培养36～48h，按照上述相同的方法提取重组质粒luxS-pMG76e；
b.取4μL重组质粒于1％琼脂糖凝胶进行电泳检测；
c.双酶切验证：利用XbaI FastDigest和XhoI FastDigest对重组质粒进行酶切，如果酶切产物有两个条带，且条带大小与质粒大小和目标片段大小相符，则证明成功构建重组质粒和luxS基因过表达菌株。
本发明的有益效果在于：
本发明成功克隆得到类植物乳杆菌L-ZS9菌株中的luxS基因，并将该基因与过表达质粒pMG76e连接，导入类植物乳杆菌L-ZS9菌株中，成功构建了过表达工程菌株luxS-pMG76e-L-ZS9。
通过对比过表达luxS基因的luxS-pMG76e-L-ZS9菌株和L-ZS9菌株的AI合成和生物膜形成能力等相关生理指标发现，luxS基因的过表达会促进类植物乳杆菌L-ZS9信号分子AI-2的合成，且可增强L-ZS9菌株的被膜形成能力。
通过qRT-PCR和差异转录组分析表明，重组菌株luxS-pMG76e-L-ZS9中有35个基因发生2倍以上差异表达，其中9个基因上调，26个基因下调；而iTRAQ试验表明，重组菌株luxS-pMG76e-L-ZS9中有35个蛋白发生≥1.2或≤0.83的差异表达，其中11个蛋白下调，24个蛋白上调。luxS基因过表达影响转运及膜相关蛋白，在已知功能差异蛋白中所占的比例超过50％，通过调节细胞膜蛋白及膜上转运蛋白进而调控菌体对胞外环境的适应及应答，从而影响生物被膜的形成。另外，luxS基因过表达会影响AraC家族转录调节子、LacI家族转录调节子及PadR转录调节子的表达，它们与生物被膜形成及QS调控机制相关。
附图说明
图1为本发明实施例1中luxS基因PCR产物电泳图，其中，M代表DL5000 DNAMarker；luxS代表luxS基因PCR扩增产物。
图2为本发明实施例1中类植物乳杆菌L-ZS9的luxS基因的酶切位点分析示意图。
图3为本发明实施例1中为pMG76e空载体导入菌株的PCR鉴定结果，其中，M代表DNAMarker，pMG76e代表pMG76e空载体导入菌株的PCR扩增产物。
图4为本发明实施例1中luxS基因过表达菌株luxS-pMG76e-L-ZS9的PCR鉴定结果，其中，M代表DNA Marker，luxS-pMG76e-L-ZS9代表luxS-pMG76e-L-ZS9菌株的PCR扩增产物。
图5为本发明实施例2中重组菌株luxS-pMG76e-L-ZS9、空载菌株pMG76e-L-ZS9和野生株L-ZS9的luxS基因转录水平。
图6为本发明实施例3中重组菌株luxS-pMG76e-L-ZS9、空载菌株pMG76e-L-ZS9和野生株L-ZS9的AI-2活性检测。
图7为本发明实施例4中重组菌株luxS-pMG76e-L-ZS9、空载菌株pMG76e-L-ZS9和野生株L-ZS9的生物被膜形成能力。
图8为本发明实施例5中重组菌株pMG76e-L-ZS9和luxS-pMG76e-L-ZS9差异表达基因火山图。
图9为本发明实施例6中重组菌株pMG76e-L-ZS9和luxS-pMG76e-L-ZS9差异蛋白火山图。
图10为本发明实施例6中差异蛋白的GO细胞组分分类分析。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1类植物乳杆菌L-ZS9 luxS基因过表达菌株的构建
本实施例提供类植物乳杆菌L-ZS9 luxS基因过表达菌株及其构建方法，具体如下：
1.实验材料
1.1实验菌株及质粒载体
类植物乳杆菌(Lactobacillus paraplantarum)L-ZS9分离自比利时发酵肉SAUCISSON SEC PUR，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(China GeneralMicrobiological Culture Collection Center,CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.11669；哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)BB170及BB152由中国农业科学院上海兽医研究所韩先干研究员提供；大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α购于宝生物工程(大连)有限公司；载体pMG76e(陈喜玲，魏艳杰，左芳雷等，合成海藻糖乳酸菌重组菌株的构建及其抗逆性评价[J].生物技术,2013(02):29-34.)由中国农业科学院陈尚武教授提供。
1.2主要试剂及材料
MRS培养基、LB培养基、哈维氏弧菌培养用培养基、AB培养基、甘氨酸购买自青岛海博生物有限公司；PrimeSTAR HS DNA Polymerase(R010Q)、TaKaRa Ex Taq(RR001A)、pMD18-T Vector Cloning Kit(6011)购于Takara-宝生物工程(大连)有限公司；T4 DNALigase(EL0021)、蛋白定量染液、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)、DNase I(RNase-free)和RNase抑制剂购于Thermo Scientific公司；普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(DP209)、高纯度质粒小提中量试剂盒(DP107)购于天根生化科技(北京)有限公司；反转录试剂盒TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit和TRIpure购于北京艾德莱生物科技有限公司；SYBGreen染料购自Kapa Biosystems公司；RNeasy MinElute Cleanup Kit购自德国QIAGEN公司；Ribo-ZeroTM Magnetic Kit(Gram-Negative Bacteria or Gram-positive Bacteria)购自美国Epicentre公司；
UltraTM Directional RNA LibraryPrep Kit for Illumina购自美国NEB公司；AMPure XP Beads购自美国Agencourt公司；XbaI和XhoI快速限制性内切酶均购自美国Fermentas公司；尿素、CHAPS购自美国Bio-Rad公司；Protease Inhibitor Cocktail购自美国Roche公司；硫脲等其它试剂购自美国Sigma-Aldrich公司。
1.3主要仪器
主要仪器设备如表1所示。
表1主要仪器设备
2.实验方法
2.1菌种培养及基因组提取
将活化的菌株L-ZS9接种于MRS液体培养基中，37℃200rpm振荡培养24h后，12000g离心2min收集菌体。之后经溶菌酶破壁后采用细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)提取菌株L-ZS9基因组DNA，置于-20℃冻存。
2.2luxS基因片段扩增
以GenBank中植物乳杆菌Lactobacillus plantarum WCFS1的luxS基因序列为参照，设计luxS基因鉴定引物。引物序列为luxS-F’：5’-ATGGCTAAAGTAGAAAGTTT-3’，luxS-R’：5’-CTATTCAACGACT TTGCGTA-3’。以类植物乳杆菌L-ZS9基因组DNA为模板扩增luxS基因片段(图1)，扩增体系包括：PrimeSTAR HS DNA Polymerase 15μL，luxS-F和luxS-R各1μL，模板1μL，无菌ddH2O 12μL。PCR反应程序：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃1min(30个循环)；72℃10min；4℃保存。
2.3全基因组测序及分析
将提取的类植物乳杆菌L-ZS9基因组DNA进行文库构建，于Illumina Hiseq 2000测序平台进行高通量测序，测序深度为311×。所有DNA读取短片段经SOAPdenovo进行收集，以GenBank中Lactobacillus plantarum WCFS1全基因组序列为参考基因组，经SOAPGapCloser进行gap弥合，获得大片段(无gap)拼接的全基因组草图。大片段之间的空缺DNA经多轮PCR和Sanger测序进行弥合。之后采用Subsystem Technology进行基因组快速注释。全基因组完成图生成后，对类植物乳杆菌L-ZS9的基因组全长大小，GC含量，蛋白编码序列CDSs(Coding sequences)，基因和rRNA操纵子等进行分析。基于全基因组序列及注释，对luxS基因进行序列大小和位置分析。
2.4类植物乳杆菌L-ZS9 luxS基因序列分析及酶切位点分析
基于对类植物乳杆菌L-ZS9的全基因组信息分析，定位至其luxS基因，对其片段大小及酶切位点进行分析(图2)。同时对载体pMG76e的酶切位点进行分析，选取合适的酶切位点，设计载体pMG76e鉴定引物和luxS基因扩增引物(表2)。
表2引物序列
2.5过表达载体构建，以pMG76e为过表达载体，通过双酶切将线性化的质粒pMG76e片段与扩增出的luxS目的基因进行连接，构建过表达luxS-pMG76e重组质粒，然后对重组质粒进行验证，步骤如下：
a.首先，将luxS基因胶回收产物与pMD-18T载体进行连接，连接体系包括：luxS基因胶回收产物8μL，pMD-18T 2μL，Solution I 10μL；连接温度18℃，连接时间2h；
b.连接结束后将连接产物化学转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，37℃振荡培养60min后，取2mL菌体6000rpm离心2min，去上清1.8mL，将菌体重悬剩余上清中，均匀涂布于含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板中，37℃培养至肉眼可见，筛选出阳性单克隆菌落；
c.将筛选的阳性菌株接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养10h，采用高纯度小提中量质粒提取试剂盒提取重组质粒luxS-pMD-18T，并进行琼脂糖凝胶电泳验证；
d.将重组质粒luxS-pMD-18T进行双酶切，酶切体系包括：质粒luxS-pMD-18T 3μL，XbaI FastDigest 1μL，XhoI FastDigest 1μL，10×Buffer 5μL，ddH2O 40μL；酶切温度为22℃，酶切时间10min。双酶切完毕后，进行琼脂糖凝胶电泳，对luxS基因片段进行切胶回收；
e.将质粒pMG76e进行双酶切，酶切体系包括：质粒pMG76e 5μL，XbaI FastDigest1μL，XhoI FastDigest 1μL，10×Buffer 5μL，ddH2O 38μL。酶切温度为22℃，酶切时间10min；双酶切完毕后，进行琼脂糖凝胶电泳，对线性化的质粒pMG76e片段进行切胶回收；
f.将切胶回收的luxS基因片段和线性化的质粒pMG76e片段进行连接，连接体系为：luxS基因片段8μL，质粒pMG76e 2μL，Solution I 10μL；连接温度18℃，连接时间2h；
g.连接结束后将连接产物化学转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中；转化步骤同上所述；转化完成后将菌株均匀涂布于含有200μg/mL红霉素的LB固体平板中，37℃培养48h，筛选阳性单克隆菌落；
h.将阳性菌株接种至含有200μg/mL红霉素的LB液体培养基中进行扩大培养，按照上述相同的方法提取质粒luxS-pMG76e，然后对重组质粒进行双酶切鉴定。
2.6类植物乳杆菌L-ZS9感受态制备
a.将500μL 20％甘氨酸贮液加到9.5mL MRSS(MRSS+0.3M葡萄糖)中；以1％接种量将类植物乳杆菌L-ZS9接种至以上培养基中，待菌生长至OD600nm在0.6左右；
b.将培养好的菌液至于4mL离心管中，5000rpm，4℃离心10min，收集菌体；
c.去上清，加入2mL Washing Buffer(0.3M蔗糖，0.1M MgCl2)洗涤沉淀，5000rpm，4℃离心10min，收集菌体；重复此步骤；
d.去上清，加入2mL 30％PEG-1500重悬后，5000rpm，4℃离心10min；
e.去上清，加入200μL 30％PEG-1500重悬，分成每管20μL，置于冰上待用，或用液氮速冻存放-80℃冰箱待用。
2.7重组质粒的转化
通过电击转化的方法将过表达质粒导入到类植物乳杆菌L-ZS9感受态细胞中，得到pMG76e空载导入菌株(图3)和luxS过表达菌株(图4)，具体实施步骤如下：
a.将1μL重组质粒luxS-pMG76e DNA同20μL感受态细胞的混合后置于冰上，转移到2mm电击杯中，冰浴6min，确保没有气泡；
b.设定点击程序：1.5KV，25μL，400Ω；进行点击后，冰上静置5min；
c.加入0.5mL MRSSM复苏培养基，转移到1.5mL离心管中，37℃培养2h；
d.将复苏的菌液5000rpm，常温离心5min，去除400μL上清后，涂布于含3μg/mL红霉素的MRS平板，37℃培养48h。
2.8luxS基因过表达菌株构建结果验证
a.挑取单克隆菌落，置于含有3μg/mL红霉素的MRS液体培养基的试管中，37℃静置培养48h，按照上述相同的方法提取重组质粒luxS-pMG76e；
b.取4μL重组质粒于1％琼脂糖凝胶进行电泳检测；
c.双酶切验证：利用XbaI FastDigest和XhoI FastDigest对重组质粒进行酶切，如果酶切产物有两个条带，且条带大小与质粒大小和目标片段大小相符，则证明成功构建重组质粒，luxS基因过表达的类植物乳杆菌luxS-pMG76e-L-ZS9构建成功。
实施例2 luxS-pMG76e-L-ZS9菌株中luxS基因的表达分析
利用qRT-PCR验证成功构建的过表达luxS基因的luxS-pMG76e-L-ZS9菌株中luxS基因的表达情况，具体如下：
1.实验方法
a.将类植物乳杆菌L-ZS9野生株、空载体pMG76e导入菌株和luxS过表达重组菌株接种于MRS培养基中，至37℃静置培养8h；培养完成12,000g离心收集菌体，液氮研磨，加TRIpure，置于-80℃冻存；
b.参照北京艾德莱生物科技有限公司的TRIpure提取步骤提取总RNA；
c.cDNA的合成参照该公司TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行，具体方法为：Total RNA50 ng-5μg，Random Primer 1μL，5×RT Reaction Mix 4μL，TUREscript H-RTase 1μL，之后用RNase free H2O定容至20μL；25℃孵育10min，之后42℃孵育30～50min，65℃加热15min以失活TUREscript H-Rtase；再用DNase I处理合成的cDNA后，置于-80℃待用；
d.参照菌株L-ZS9全基因组序列，分析luxS基因序列，以16s RNA为内参基因，采用Primer 3Input(version0.4.0)设计引物，用于进行qRT-PCR，引物序列如表3所示：
表3引物序列
e.qRT-PCR的反应体系为：1μL模板cDNA，10μL 2×SYB green，上游引物和下游引物各1μL(10μmol/L)，以及7μL无RNase水。扩增程序为：95℃10min；95℃15s，60℃30s，共40个循环；采用Livak法进行数据分析；
2.实验结果
通过qRT-PCR确定了luxS过表达重组菌株luxS基因的表达倍数(图5)，空载体pMG76e对菌株L-ZS9的luxS基因表达没有影响，而重组过表达菌株luxS-pMG76e-L-ZS9的luxS基因转录水平显著上调。同时，进一步说明过表达菌株构建成功。
实施例3 luxS基因过表达对菌株L-ZS9信号分子AI-2合成能力的影响
1.实验方法
a.上清制备：将类植物乳杆菌L-ZS9野生株、空载体pMG76e导入菌株和luxS过表达重组菌株接种于脱脂乳培养基中，分别于2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22和24h收集菌液，制备上清于-80℃冻存；制备Vibrio harveyi BB152上清为阳性对照，制备E.coli DH5α上清为阴性对照，置于-80℃冻存；
b.信号分子检测：将Vibrio harveyi BB170接种于MB培养基中，28℃200rpm振荡培养，至暗室中可见黄绿色荧光；将其按照1:5000转接入新鲜配置的AB培养基中，以10％(v/v)的比例加入制备好的上清，28℃，200rpm振荡培养5h，从中取100μL于白色酶标板，用多功能酶标仪生物发光模式检测发光强度，重复5孔；进行3次生物学重复；
2.实验结果
由于luxS基因负责信号分子AI-2的合成，因此对过表达重组菌株luxS-pMG76e-L-ZS9上清中的AI-2活性进行了检测，检测结果(图6)表明，空载体pMG76e的导入对菌株L-ZS9上清中AI-2的活性没有影响，但是luxS基因过表达将使AI-2的产生显著上调，表明luxS基因过表达将显著增强菌株L-ZS9的AI-2合成能力。
实施例4 luxS基因过表达对菌株L-ZS9生物被膜形成能力的影响
1.实验方法
生物被膜形成能力检测采用结晶紫染色法，具体如下：将活化的类植物乳杆菌L-ZS9野生株、空载体pMG76e导入菌株和luxS过表达重组菌株接种于MRS培养基中，将培养液加至96孔细胞培养板中，每孔200μL，37℃静置培养36h；培养结束后用PBS轻柔冲洗3次，去除悬浮菌体，室温晾干；每孔加0.1％结晶紫溶液，室温染色30min，无菌水轻柔冲洗至洗液无色为止，室温晾干；加100μL无水乙醇充分溶解结晶紫；检测OD595nm吸光数值。
2.实验结果
通过结晶紫染色法对上述各菌株的生物被膜形成能力进行了检测，结果(图7)表明，空载体pMG76e的导入对菌株L-ZS9生物被膜形成能力没有影响。但是luxS过表达使菌株L-ZS9的生物被膜形成能力增强。
实施例5 luxS基因过表达对菌株L-ZS9基因转录信息的影响
1.实验方法
1.1转录组测序
a.总RNA提取、质检及纯化：将类植物乳杆菌L-ZS9空载体pMG76e导入菌株和luxS过表达重组菌株接种于MRS培养基中，至37℃静置培养8h；
b.培养完成12,000g离心收集菌体，液氮研磨，加TRIpure。按照北京艾德莱生物科技有限公司的TRIpure提取步骤提取总RNA；
c.提取的RNA通过琼脂糖凝胶电泳和2100bioanalyzer对其进行质检。合格的总RNA取10μL用5U的DNase I在37℃消化30min，然后用RNeasy MinElute Cleanup Kit纯化，用15μL RNase-free water洗脱；
d.DNase消化后的RNA用Ribo-ZeroTM Magnetic Kit(Gram-Negative Bacteria orGram-positive Bacteria)去除rRNA：加入Ribo-Zero Reaction Buffer和Ribo-Zero rRNARemoval Solution(Gram-Negative Bacteria or Gram-positive Bacteria)，体积补足至40μL，68℃反应10min，然后室温放置5min，将处理后的RNA加入预洗涤的磁珠中，立即充分混匀，室温放置5min，随后50℃反应5min，立即置于磁力架上1min以上，吸取上清，加水补足至180μL，加入3M Sodium Acetate和Glycogen(10mg/mL)，加600μL无水乙醇，-20℃放置1h以上，离心得到沉淀，加水溶解即为rRNA-depleted RNA。
1.2RNA-Seq文库构建
取100ng的rRNA-depleted RNA，利用NEB
UltraTM Directional RNALibrary Prep Kit for Illumina构建文库：加入Random Primers及First StrandSynthesis Reaction Buffer(5×)打断mRNA，94℃反应15min，迅速置冰上；加入MurineRNase Inhibitor、Actinomycin D(0.1μg/μL)和ProtoScript II Reverse Transcriptase进行cDNA第一链合成，反应程序为25℃10min、42℃15min、70℃15min；加入Second StrandSynthesis Reaction Buffer with dUTP Mix(10×)和Second Strand Synthesis EnzymeMix进行cDNA第二链合成，16℃反应1h；用AMPure XP Beads(Agencourt，美国)进行纯化，加入End Repair Reaction Buffer(10×)和End Prep Enzyme Mix进行末端修复，反应程序为20℃30min、65℃30min；加入NEBNext Adaptor和Blunt/TA Ligase Master Mix连接接头，20℃反应15min；加入AMPure XP Beads混匀，静置5min，置磁力架上5min，小心吸取上清，后加入AMPure XP Beads进行纯化，即得到300～500bp范围的ligated cDNA；随后进行PCR扩增，引物为Universal PCR Primer和Index(X)Primer，同时加入USER Enzyme，PCR反应条件为37℃15min、98℃10Sec、98℃10Sec、65℃30Sec、72℃30Sec；最后采用AMPure XPBeads进行纯化，得到用于测序的文库。
1.3文库质检及上及测序
文库构建完成后，进行三重检验，即Qubit定量、2％琼脂糖凝胶电泳检测、High-sensitivity DNA chip检测，以确保文库质量。之后采用Illumina Hiseq TM 4000(PE150)平台进行双向测序，数据量为2-3G。
1.4数据分析
a.数据量统计与质量评估
高通量测序所得的原始图像数据文件经CASAVA碱基识别(Base Calling)分析转化为原始测序序列，即Raw Data或Raw Reads；对Raw Reads进行质量过滤，生成Filteredreads；
b.基因表达分析
利用Tophat将各样本Filtered reads与参考基因组进行mapping，然后使用Cufflinks程序，根据Tophat比对结果，依托于参考基因组的GTF注释文件，计算出各个基因的count和RPKM值；利用Cuffdiff进行处理组和对照组的差异表达分析，筛选出2倍以上差异表达基因。根据RPKM值，对差异表达基因进行聚类分析；
c.GO分类、富集分析和KEGG分析
根据GO数据库上的注释列表，对差异基因进行分类统计，然后使用超几何分布对两样本间差异表达的基因进行GO富集分析；对差异表达的基因进行pathway分类统计，根据KEGG的分类结果，使用超几何分布对差异基因进行KEGG富集分析。
2.实验结果
差异表达基因分析表明(图8)，重组菌株luxS-pMG76e-L-ZS9与对照菌株pMG76e-L-ZS9相比共有35个基因发生2倍以上差异表达，其中9个基因上调，26个基因下调。这些基因中，有6个基因仅在菌株luxS-pMG76e-L-ZS9中表达，有4个基因仅在菌株pMG76e-L-ZS9中表达。具体的基因编号、差异表达倍数及编码蛋白如表4示。
表4转录组分析的差异表达基因信息
实施例6 luxS基因过表达对菌株L-ZS9蛋白表达的影响
1.实验方法
1.1样品蛋白提取及定量
将离心的菌体用液氮研磨，将粉末按照1:10(W/V)加入裂解液Lysis Buffer(7M尿素，2M硫脲，4％CHAPS，片/50mL Protease Inhibitor Cocktail)，进行涡旋混匀；超声60s，0.2s on，0.2s off，振幅为22％；室温提取30min；15,000g 10℃离心1h，取出上清，分装并于-80℃冻存。
采用Bradford法测定样本提取的蛋白浓度：先将样本用Lysis Buffer(7M尿素、2M硫脲、0.1％CHAPS)进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品(将BSA用Lysis Buffer溶解成系列浓度的标准蛋白)各取10μL分别和300μL蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线。根据曲线公式计算各样品蛋白浓度。
1.2蛋白酶解及iTRAQ标记
取200μg蛋白溶液，加入25mM的DTT，60℃反应1h；之后加入50mM碘乙酰胺，室温反应10min。将还原烷基化后的蛋白溶液置入10K的超滤管中，12,000g离心20min，弃去收集管底部溶液；加入Dissolution Buffer 100μL，12,000g离心20min，弃去收集管底部溶液，进行3次重复；更换收集管，在超滤管中加入总量4μg(与蛋白质量比1:50)的胰蛋白酶，37℃反应过夜；12,000g离心20min收集酶解消化后的肽段；加入50μL Dissolution Buffer，12,000g离心20min，与上一步合并，收集管底部酶解后的样品。
从冰箱取出iTRAQ试剂，室温平衡后，离心
试剂至管底；向每管
试剂中加入150μL异丙醇，涡旋振荡后离心至管底；取50μL样品即100μg酶解产物，转移至新离心管中；将iTRAQ试剂添加至样品中，涡旋振荡后离心至管底，室温反应2h；加入100μL水以终止反应；从样品中各取出1μL混合，用Ziptip脱盐，进行MALDI-TOF-TOF(AB SCIEX4800Plus)鉴定，确认标记反应成功；混合标记后的样品经涡旋振荡，离心至管底。后经真空冷冻离心干燥。
1.3酶解肽段离线预分离及LC-MS/MS质谱分析
a.高pH条件下的反相色谱分离
混合标记后的样品用100μL流动相A1溶解，14,000g离心20min，取上清待用。使用400μg酶解后的BSA进行分离(柱温45℃，检测波长214nm)，对系统情况进行检测。取100μL准样品上样。流速为0.7mL/min，分离梯度如表5所示。
表5反相色谱分离梯度
b.纳升级反相色谱-Q Exactive进行蛋白质分析
将高pH反相分离后的组份用20μL甲醇(2％)和甲酸(0.1％)复溶。12,000g离心10min，吸取上清上样。采取夹心法进行上样，上样体积为10μL。Loading Pump流速350nL/min，15min。分离流速300nL/min，分离梯度如表6所示。
表6反相色谱分离梯度
1.4质谱数据分析及差异蛋白定量信息统计
本研究数据库为NCBI库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，数据库本版为Lactobacillus Paraplantrum_pro database。iTRAQ的质谱分析采用Thermo Q Exactive型质谱，产生的质谱原始文件*.RAW采用Mascot软件搜库处理，采用scaffold软件对搜库结果进行质控。对实验对照组和实验组样本的蛋白定量数据进行成组t检验，筛选P value≤0.5，并且2组样本中蛋白ratio≥1.2或ratio≤0.83的差异蛋白。
1.5差异蛋白层次聚类、功能注释与功能分类
采取perseus软件对蛋白质定量信息进行层次聚类分析(Hierarchicalclustering)。对每个蛋白定量值进行中心化，消除数据偏差；计算蛋白之间的欧氏距离获得其相关性矩阵，实现层次聚类。
利用Blast2GO软件对差异蛋白进行GO注释分析，包括GO分类和通路等注释信息。由于背景注释库的局限性，因此不是所有的蛋白都能获得相应的注释信息。
2.实验结果
iTRAQ实验共鉴定出1630个蛋白。其中发生≥1.2或≤0.83的差异表达蛋白35个，luxS-pMG76e-L-ZS9与pMG76e-L-ZS9相比，发生下调的蛋白有11个，发生上调的蛋白有24个(图9)。火山图Volcano Plot中，绿色点代表luxS-76e-L-ZS9表达发生下调的差异蛋白，红色点代表luxS-76e-L-ZS9表达发生上调的差异蛋白。差异蛋白的具体信息，包括蛋白产物名称、登录号、分子量及差异表达倍数如表7所示。
表7差异表达蛋白信息
对差异蛋白进行GO分类分析(图10)，在35个差异表达蛋白中，有11个是膜蛋白，占35.48％，10个是膜部分蛋白，占32.26％。膜蛋白或膜相关蛋白在差异表达蛋白中所占比例最大，说明LuxS基因过表达对菌体膜蛋白和膜相关蛋白的影响最为显著。同时，luxS基因过表达会影响AraC家族转录调节子、LacI家族转录调节子及PadR转录调节子的表达，它们与生物被膜形成及QS调控机制相关。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 类植物乳杆菌LuxS蛋白、其应用及类植物乳杆菌重组菌
<130> KHP211110885.7
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 158
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Lys Val Glu Ser Phe Thr Leu Asp His Thr Lys Val Leu Ala
1 5 10 15
Pro Tyr Val Arg Lys Ile Thr Val Glu Asn Gly Pro Lys Gly Asp Ala
20 25 30
Ile Thr Asn Phe Asp Leu Arg Leu Val Gln Pro Asn Lys Thr Ala Ile
35 40 45
Asp Thr Ala Gly Leu His Thr Ile Glu His Met Leu Ala Gly Leu Leu
50 55 60
Arg Asp Arg Met Asp Gly Val Ile Asp Cys Ser Pro Phe Gly Cys Arg
65 70 75 80
Thr Gly Phe His Leu Ile Thr Trp Gly Glu His Asp Thr Val Glu Val
85 90 95
Ala Lys Ala Leu Lys Ser Ser Leu Glu Phe Ile Ala Gly Pro Ala Lys
100 105 110
Trp Glu Asp Val Gln Gly Thr Thr Ile Asp Ser Cys Gly Asn Tyr Lys
115 120 125
Asp His Ser Leu Phe Ser Ala Lys Glu Trp Ala Lys Leu Ile Leu Ser
130 135 140
Gln Gly Ile Ser Ser Asp Pro Phe Val Arg Lys Val Val Glu
145 150 155
<210> 2
<211> 477
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggctaaag tagaaagttt tacattagat cataccaaag ttttagcacc ttatgttcgt 60
aaaattacgg tggaaaatgg tcctaagggc gatgccatca ctaattttga tttgcggtta 120
gttcagccta ataagactgc gattgataca gcgggcttac acacgattga acacatgtta 180
gccggattat tgcgtgatcg gatggatggc gtgatcgact gctcaccatt tggttgccgg 240
actggttttc atttgatcac ttggggtgaa catgacaccg tggaagttgc taaggcattg 300
aagtcctcat tagaattcat tgctggtcca gctaagtggg aagatgttca aggaacgacg 360
attgatagtt gtggaaatta taaggatcat tcgttgttct cagctaagga atgggctaag 420
ctgatcttat cacaaggaat ttcatcggac ccattcgttc gcaaagtcgt tgaatag 477
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgctctagaa tggctaaagt agaaagttt 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ccgctcgagc tattcaacga ctttgcgaa 29
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttcggtcctc gggatatg 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ctgtcttggc cgcttcaa 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgatacagcg ggcttacaca 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cttcccactt agctggacca 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
caacgagcgc aacccttatt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcagcctaca atccgaactg 20
Claims (10)
1.类植物乳杆菌LuxS蛋白，其特征在于，其具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述的类植物乳杆菌LuxS蛋白的基因，其特征在于，其具有如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。
3.含有权利要求2所述的基因的生物材料，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体或重组微生物。
4.权利要求1所述的类植物乳杆菌LuxS蛋白或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的生物材料在增强类植物乳杆菌的生物被膜形成能力中的应用。
5.权利要求1所述的类植物乳杆菌LuxS蛋白或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的生物材料在增强类植物乳杆菌的信号分子AI-2合成能力中的应用。
6.权利要求1所述的类植物乳杆菌LuxS蛋白或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的生物材料在调控类植物乳杆菌中谷氨酸-蛋白质共转运体glutamate:proteinsymporter、RNA假尿苷合酶RNA pseudouridine synthase、N-乙酰氨基葡萄糖转移酶N-acetylglucosaminyltransferase、乙酰转移酶acetyltransferase或蛋氨酸ABC转运蛋白methionine ABC transporter permease的表达中的应用。
7.根据权利要求4～6任一项所述的应用，其特征在于，所述类植物乳杆菌为类植物乳杆菌L-ZS9。
8.类植物乳杆菌重组菌，其特征在于，以类植物乳杆菌为出发菌，所述重组菌较所述出发菌具有提高LuxS蛋白的表达水平，所述LuxS蛋白具有如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的类植物乳杆菌重组菌，其特征在于，所述出发菌为类植物乳杆菌L-ZS9，所述重组菌含有LuxS蛋白编码基因的pMG76e表达载体。
10.权利要求8或9所述的重组菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以类植物乳杆菌L-ZS9的基因组DNA为模板，采用SEQ ID NO.3-4所示的引物扩增luxS基因；
(2)将所述luxS基因连接至pMG76e表达载体，构建过表达重组质粒luxS-pMG76e；
(3)将过表达重组质粒luxS-pMG76e转化至类植物乳杆菌L-ZS9，得到过表达luxS基因的类植物乳杆菌L-ZS9的重组菌。
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| CN115029366A (zh) * | 2022-06-11 | 2022-09-09 | 江苏科技大学 | 一种基于重组大肠杆菌高产生物被膜的方法及其在催化黄酮苷类化合物上的应用 |
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20210514 |
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