CN113444819A - 一种用于检测花生丛枝植原体的引物、方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测花生丛枝植原体的引物、方法及应用，属于生物检测技术领域。提供了用于检测花生丛枝植原体的引物，其中引物包括五组引物对；方法包括以下步骤：(1)提取待测样品DNA；(2)以待测样品DNA为DNA模板，并选择五组引物对中的任意一组作为引物，配置反应体系，进行PCR扩增；(3)将得到的PCR扩增产物进行电泳检测。本发明采用独创设计的特异性引物组，只需进行一次PCR扩增，通过凝胶电泳检测系统即可确定检测花生样品是否感染花生丛枝植原体，不需要通过测序进行确定。本发明的检测方法特异性强、灵敏性高、操作简单，节约时间和经济成本，易于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体地说，涉及一种用于检测花生丛枝植原体的引物、方法及应用。
背景技术
花生(Arachis hypogaea)是我国重要的经济作物、油料作物和食用作物，在国民经济发展和对外贸易中具有重要地位，在保障我国食用油安全和供给方面具有重要意义。我国是世界上最大的花生生产国，2019年我国花生种植面积为463万公顷，产量1752万吨，占世界总产量的36％，种植业产值达1200亿元(https：//data.stats.gov.cn/)。在国内大宗油料作物中，花生的总产和种植业产值均已跃居首位，在大宗农作物中种植业产值仅次于水稻、小麦和玉米，是我国为数不多的具有国际竞争力的大宗净出口农产品，参考文献为：廖伯寿.我国花生生产发展现状与潜力分析[J].中国油料作物学报，2020，42(02)：5-10.。
花生丛枝病(Peanut witches’-broom，PnWB)，1952年在我国首次报道，是我国南方花生产区特别是热带地区广泛流行的重要病害，参考文献为：万琼莲，蔡红，杨子祥，等.云南花生丛枝植原体secY基因序列分析及结构预测[J].云南农业大学学报，2013(2)：163-168。花生丛枝病的病原为花生丛枝植原体，属于软壁菌门(Tenericutes)柔膜菌纲(Mollicutes)植原体暂定属[Candidatus(Ca.)genus Phytoplasma]，传播媒介为小绿叶蝉。花生丛枝病主要发生在我国的海南、广东、广西、福建、湖南、贵州和台湾等地，在山东等北方产区也有零星发生，参考文献为：万琼莲.云南元谋植原体病害多位点基因分子特性及相关株系的保存研究[D].昆明：云南农业大学，2013.，在小绿叶蝉大发生和干旱年份的发生尤为严重。花生丛枝病在秋花生上的发病率可达10％～20％，严重时可达80％以上，参考文献为：周桂元，梁炫强.花生丛枝病的发生与防治[J].广东农村实用技术，2012(7)：22-22.。花生感染丛枝病会导致花生产量减少和品质降低，受害花生植株一般减产10％～30％，严重时可达60％以上甚至绝收。
由于花生丛枝植原体为严格寄生病原菌，体外培养条件极其苛刻，参考文献为：Contald o，N，Bertaccini，et al.Axenic culture of plant pathogenic phytoplasmas[J].Phytopathol Mediterr，2012，51(3)：607-617.，多数实验室很难获得植原体的培养菌株。因此目前对于花生丛枝植原体的鉴定只能利用植原体通用的16SrDNA巢氏引物进行PCR扩增鉴定。由于16SrDNA为通用引物，因此扩增的产物需要通过测序才能确定是否为花生丛枝植原体，存在扩增片段不特异，需要进行测序，提高了检测成本；此外即使获得了与大小预期一致的片段，经测序证实为非植原体的假阳性序列，极大的限制了对花生丛枝植原体的检测及预测。因此，亟需一种针对花生丛枝植原体的特异性检测技术。
发明内容
1、要解决的问题
针对上述检测技术存在的问题，本发明提供一种用于检测花生丛枝植原体的引物、方法及应用，它可以提高花生丛枝植原体检测的特异性和灵敏度。
2、技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种用于检测花生丛枝植原体的引物，
所述的引物为如下五组中的任意一组：
(A)SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；
(B)SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；
(C)SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；
(D)SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；
(E)SEQ ID No：9和SEQ ID No：10。
上述所述的用于检测花生丛枝植原体的引物中，
所述的A组中SEQ ID No：1和SEQ ID No：2组成的引物所获得的电泳条带的大小为934bp；
所述的B组中SEQ ID No：3和SEQ ID No：4组成的引物所获得的电泳条带的大小为926bp；
所述的C组中SEQ ID No：5和SEQ ID No：6组成的引物所获得的电泳条带的大小为1058bp；
所述的D组中SEQ ID No：7和SEQ ID No：8组成的引物所获得的电泳条带的大小为1024bp；
所述的E组中SEQ ID No：9和SEQ ID No：10组成的引物所获得的电泳条带的大小为1021bp。
一种用于检测花生丛枝植原体的方法，包括以下步骤：
(1)提取待测样品DNA；
(2)以步骤(1)待测样品DNA为DNA模板，并选择权利要求1中五组引物对中的任意一组作为引物，配置反应体系，进行PCR扩增；
(3)将步骤(2)得到的PCR扩增产物进行电泳检测。
上述所述的用于检测花生丛枝植原体的方法中，步骤(1)中所述的待测样品DNA为花生丛枝病病株组织的总DNA。
上述所述的用于检测花生丛枝植原体的方法中，步骤(2)中反应体系为：PCR混合液总共20ul，其中2×EasyTaq PCR SuperMix 10ul，其中DNA模板2ul，其中引物对2ul，其中ddH2O 6ul。
上述所述的用于检测花生丛枝植原体的方法中，其中引物的使用浓度为10uM。
上述所述的用于检测花生丛枝植原体的方法中，步骤(2)中PCR扩增的程序如下：
94℃预变性3min；94℃ 45s，55℃ 40s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min。
上述所述的用于检测花生丛枝植原体的方法中，所述的PCR扩增的程序中，退火温度为53℃-60℃。
一种如上述所述的引物在检测花生丛枝植原体上的应用。
上述所述的引物在检测花生丛枝植原体上的应用中，所述的引物制成试剂盒或基因芯片。
3、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明中用于检测花生丛枝植原体的特异性引物，设计过程如下：从NVBI数据库下载花生丛枝植原体的基因组草图，使用SignalP V3.0和TMHMM V2.0对预测蛋白的信号肽序列和跨膜区进行预测，获得植原体效应因子信息，将效应因子的基因序列信息提交NCBI数据库进行比对，选择差异较大的基因并设计引物。对这些引物进行筛选，获得5对以效应因子基因设计的用于特异性检测花生丛枝植原体的PCR引物，这5对引物扩增片段大小分别为934bp、926bp、1058bp、1024bp、1021bp。与现有的通过16SrDNA巢氏引物进行PCR扩增鉴定花生丛枝病的方法相比，只需进行一次PCR扩增，通过凝胶电泳检测系统即可确定检测花生样品是否感染花生丛枝植原体，不需要通过测序进行确定。本检测方法特异性强、灵敏性高、操作简单，节约时间和经济成本，易于推广应用。
附图说明
图1为本发明中引物组检测感染丛枝植原体花生样品和健康花生样品的电泳图；其中，M为DNA Marker，“1”为感染花生丛枝花生样品，“2”为健康花生样品。
图2为本发明中引物特异性验证的结果图；图中为引物对SPP188检测结果，其中，M为DNA Marker，“1”-“8”分别为花生丛枝植原体、甘薯丛枝植原体、剑麻紫色卷叶植原体、花生早斑病病菌、花生晚斑病病菌、甘蔗黑穗病病菌、水稻橙叶病植原体、ddH2O。
图3为本发明引物检测灵敏性验证的结果图；图中为引物对SPP18检测结果，M为DNA Marker，“1”-“2”：DNA浓度为103ng/uL时的检测结果；“3”-“9”：分别时DNA浓度为102ng/uL、101ng/uL、100ng/uL、10-1ng/uL、10-2ng/uL、10-3ng/uL、10-4ng/uL时的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
实施例1
引物特异性检测实验
(1)选取100份的健康花生品种叶片作为待测样品，分别感染花生丛枝植原体(Peanut witches′-broom phytoplasma)、甘薯丛枝植原体(Sweet potatot witches′-broom phytoplasma)、花生早斑病病菌(Cercospora arachidicola)、花生晚斑病病菌(Cercospora arachidicola)、甘蔗黑穗病病菌(Sporisorium scitamineum)、水稻橙叶病植原体(Rice orange yellow leaf phytoplasma)、剑麻紫色卷叶病植原体(Sisal purpleleafroll phytoplasma)的植物叶片，并提取感染的待测样品的总DNA。
(2)配制PCR反应体系：PCR混合液总共20ul，其中2×EasyTaq PCR SuperMix10ul，其中DNA模板2ul(上游引物使用量为1ul，下游引物使用量为1ul)，其中引物对2ul，其中ddH2O 6ul。需要注意的是，引物的使用浓度为10uM。
所述的引物为如下五组中的任意一组：
(A)SEQ ID No：1和SEQ ID No：2，SPP10上下游引物对；
(B)SEQ ID No：3和SEQ ID No：4，SPP13上下游引物对；
(C)SEQ ID No：5和SEQ ID No：6，SPP14上下游引物对；
(D)SEQ ID No：7和SEQ ID No：8，SPP17上下游引物对；
(E)SEQ ID No：9和SEQ ID No：10，SPP18上下游引物对。
(3)PCR反应程序为：94℃预变性3min；94℃ 45s，55℃ 40s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min。
(4)电泳检测步骤：取5ul PCR产物经加入含1.2％的gel-red荧光染料的1％琼脂糖凝胶孔中；在0.5×TAE电泳缓冲液和120V电压条件下电泳20min；电泳完成后放置于荧光成像系统下观察。
(5)目标条带验证：使用用pEASY-T1 Cloning Kit对扩增获得的目标条带进行克隆测序，具体步骤如下：
(A)加入4ul PCR产物与1ul T1载体混合，轻弹混匀，瞬时离心后，25℃连接15min，结束后将其在冰上；
(B)待Trans-T1感受态细胞似化非化时，取50uL感受态细胞与连接产物轻轻混合，冰浴30min；
(C)从冰上取下离心管，42℃水浴锅中热激60s，再迅速插在冰上2min，于无菌条件下加入250ul的LB液体培养基(不加抗生素)，200rpm、37℃培养1h；
(D)取8ul 500mmol/L的IPTG以及40ul 20mg/mL的X-gal均匀混合后涂抹在新鲜的LB平板中，培养箱中37℃倒置30min；
(E)将培养好的菌液在无菌操作条件下取150ul均匀涂抹在LB平板上，37℃倒置培养过夜；
(F)挑取白色菌落至1mlLB液体培养基中，37℃、180rpm的摇床培养12-16h，进行测序；
(G)将测序后的序列与原始序列进行比对。
对感染花生丛枝植原体的待测样品和100份健康花生品种样品的检测结果如图1和表1所示，利用引物对SPP10、引物对SPP13、引物对SPP14、引物对SPP17、引物对SPP18分别可检测到934bp、926bp、1058bp、1024bp、1021bp的条带，而在健康叶片中均检测不到目标条带，其中引物对SPP10可在健康花生样品中检测到约600bp的条带，其余引物对未检测到任何条带。
其中SPP10上下游引物对扩增的序列如SEQ ID No：11所示，
其中SPP13上下游引物对扩增的序列如SEQ ID No：12所示，
其中SPP14上下游引物对扩增的序列如SEQ ID No：13所示，
其中SPP17上下游引物对扩增的序列如SEQ ID No：14所示，
其中SPP18上下游引物对扩增的序列如SEQ ID No：15所示。
表1引物特异性检测实验
注：+p表示未检测到目标条带，但检测出约600bp的花生片段，-表示无条带检出。
同时，如图2和表2所示，对不同植原体或病菌感染样品的DNA进行检测结果，仅在感染花生丛枝病检测到目标条带。
表2不同病菌中DNA检测结果
注：+表示检测到目标条带，-表示无条带检出。
实施例2
引物灵敏性检测实验
将初始浓度为103ng/uL的已知感染花生丛枝植原体样品的DNA作为初始浓度，按照以下浓度梯度依次稀释100、101、102、103、104、105、106、107、108，即稀释后的各组浓度分别为：103ng/uL、102ng/uL、101ng/uL、100ng/uL、10-1ng/uL、10-2ng/uL、10-3ng/uL、10-4ng/uL，然后采用实施例1所述的PCR扩增体系、扩增方法、电泳检测方法进行PCR反应和电泳检测。
检测结果如图3和表3所示，5对引物在DNA浓度低于10-1ng/uL时，均无目标条带检出，其中图3中SPP18扩增的产物在泳道3-5 1021bp左右出现了较亮的特异性条带，而泳道6特异性条带较弱，但依然可辨别出具有特异性条带，其他泳道均无明显特异性条带，表明在使用本发明的引物在检测花生丛枝植原体时，其模板浓度至少应为10-1ng/uL，即灵敏度为10-1ng/uL。
表3引物灵敏性检测结果
注：+表示检测出目标条带，-表示无条带检出。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。
序列表
<110> 中国热带农业科学院湛江实验站
<120> 一种用于检测花生丛枝植原体的引物、方法及应用
<141> 2021-06-04
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 花生丛枝植原体(Peanut witches'-broom phytoplasma)
<400> 1
caaaatccct gcttccacac g 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 花生丛枝植原体(Peanut witches'-broom phytoplasma)
<400> 2
tcgattttgc cgatttcacc a 21
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 花生丛枝植原体(Peanut witches'-broom phytoplasma)
<400> 3
aaatcttata tagtttacgc tggttcg 27
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 花生丛枝植原体(Peanut witches'-broom phytoplasma)
<400> 4
gcaatgaatc caaactttcc a 21
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 花生丛枝植原体(Peanut witches'-broom phytoplasma)
<400> 5
ccttttacga tatcacctca actga 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 花生丛枝植原体(Peanut witches'-broom phytoplasma)
<400> 6
cgctggttcg aattattcaa caatc 25
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 花生丛枝植原体(Peanut witches'-broom phytoplasma)
<400> 7
tgacttttac ctcctaccca tt 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 花生丛枝植原体(Peanut witches'-broom phytoplasma)
<400> 8
atttatttgc aaaagcggga gg 22
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 花生丛枝植原体(Peanut witches'-broom phytoplasma)
<400> 9
gaaataatgt tgctggatag ttttca 26
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 花生丛枝植原体(Peanut witches'-broom phytoplasma)
<400> 10
ttatgccgaa tccgaaagat 20
<210> 11
<211> 934
<212> DNA
<213> 花生丛枝植原体(Peanut witches'-broom phytoplasma)
<400> 11
caaaatccct gcttccacac gcattatttt taaagtagcg ggtagtttaa caaaaagaag 60
ttaaatcctt agtccttgaa gaataattgc aagtaagaga aaataaatgg tttcatagaa 120
caacaaaaaa caaaaaatat gctaaatgct atcaaccaat tatcaataaa taatgatgaa 180
ataaattttc attattattt tgtttcatca tttctttctt aaagttatat aatagtgata 240
tattcaaatt tccaaatttg ataataataa tcttattatt atcagaaagg ttatgaaatt 300
aatgaataaa aaaaactttt tacaaaaata ttttgttgaa ataatagtta ttttattatt 360
aggaatagca attatgatta tgattcataa aaatcatcat ggaactagcc aagcccaatc 420
acctttatct tctttgaatt ccgaaaaaga aacattagag tctgaaaaaa atgaaattga 480
aaaactcttt tctaatagac cgaaacgttc tgcagaagaa caacccatcc ctaaaattaa 540
aacaacatct tctcgtttag aacaaatgaa aaaatatctt ttttccgaac ctattaatcc 600
tactttatta ccaactgatt tatcagaacg agaacaagaa gaaatcaata aacttaaaaa 660
gagttgggaa tcaagtttag gttatttaaa tgaagaaaaa agtgtcatta acgaatacca 720
aaataaatgc gatgaatacc aagcacaatt aaattctctt caacctcaaa tagaatcttt 780
aaaaccacaa caacaaaaac tagaaaaaca acacgacgaa aaagaccaag aacttaatta 840
aattaaaaat taactttaga aaagctaacg aaacccaaat caaaaaactc caagctgaaa 900
atttagaaat agttggtgaa atcggcaaaa tcga 934
<210> 12
<211> 927
<212> DNA
<213> 花生丛枝植原体(Peanut witches'-broom phytoplasma)
<400> 12
aaatcttata tagtttacgc tggttcgaat tattcaacaa tcaaaagaac agaatcttct 60
gaaatattat ttgattgttt agaaactaaa atagaaattt taagagacaa aatagatcaa 120
ttttcaagga aaaaaaatga attattaaaa gaaattgata cagtagacaa agaattgtta 180
tcattgaatt taaaaattaa aaataaatcc cactttaatg tttctaaaag ttttttaaaa 240
tatcaaatat cttgtttaaa atcaaagaaa aataatctta aaacaaattt atatgattta 300
catttagaaa taacagaatt agaacttaaa ttaagaaaaa aattagattt attaactaaa 360
aaataatgtt gttctttttg aaattaattt tatcatttta ctaaaagcaa taattatcga 420
taaataattg attaatcatc atcaaaatat tattaataac ttatatgtat ccttattatt 480
tataataaat aaaaaataaa ttaaataaaa tctcttttaa atagtaaatc tttaaattaa 540
atacatttaa tgttttatta tatttattta ataaaaaaag accccccgca aaaaggcctt 600
ttatatttaa gaaaagaaaa ttatttttat attgataata tttttagtta ttgtcattat 660
ttaaagtata tttaaaagat gttgataaat ttttagttgt tctttttgat tattaactaa 720
ttgttcgtga tttgttttta atcttaatag tctttttttt catcatcagt aagattaact 780
gattctttga atgttttatt tatgtttgtt attgtggttg cattatcata aattttttgt 840
tttaaataga taatattttc ttcaatagtg agattatgtt gagaaaggtt gattgttact 900
agttcctgga aagtttggat tcattgc 927
<210> 13
<211> 1059
<212> DNA
<213> 花生丛枝植原体(Peanut witches'-broom phytoplasma)
<400> 13
ccttttacga tatcacctca actgagggat aaataaaagg agagttataa gttaaaatga 60
tgcaaataaa aaataaatta catcttttgt catcctcttt aattagttgt ttaggattat 120
tcttcttaat gaatattaat caagttatgg caatgaatcc aaactttcca ggaactagta 180
acaatcaacc ttctcaacat aatctcacta ttgaagaaaa tattatctat ttaaaacaaa 240
aaatttatga taatgcaacc acaataacaa acataaataa aacattaaaa gaatcagtta 300
atcttactga tgatgaaaaa aaagactatt aagattaaaa acaaatcacg aacaattagt 360
taataatcaa aaagaacaac taaaaattta tcaacatctt ttaaatatac tttaaataat 420
gacaataact aaaaatatta tcaatataaa aataattttc ttttcttaaa tataaaagac 480
ctttttgcgg ggggtctttt tttatttaaa taaatataat aaaacattaa atgtatttaa 540
tttaaagatt tactatttaa aagagatttt atttaattta ttttttattt attataaata 600
ataaggatac atataagtta ttaataatat tttgatgatg attaatcaat tatttatcga 660
taattattgc ttttagtaaa atgataaaat taattttaaa aagaacaaca ttatttttta 720
gttaataaat ctaatttttt tcttaattta agttctaatt ctgttatttc taaatgtaaa 780
tcatataaat ttgttttaag attatttttc tttgatttta aacaagatat ttgatatttt 840
aaaaaacttt tagaaacatt aaaatgggat ttatttttaa tttttaaatt caatgataac 900
aattctttgt ctactgtatc aatttctttt aataattcat tttttttcct tgaaaattga 960
tctattttgt ctcttaaaat ttctatttta gtttctaaac aatcaaataa tatttcagaa 1020
gattctgttc ttttgattgt tgaataattc gaaccagcg 1059
<210> 14
<211> 1025
<212> DNA
<213> 花生丛枝植原体(Peanut witches'-broom phytoplasma)
<400> 14
tgacttttac ctcctaccca ttttataaat ggtttaatgc acttttttct ttcattttaa 60
ttactttata tacaattaat caataaatta ttatttaatt accgtttatt gttttttatc 120
ataattatat ttattttgat aatctatgct taattaattt aaatattata attttgggta 180
tataagaata aaaagatctt attattattc gtaaattata aattaaaata taaaaaaagt 240
gatcacttaa taaggtcaaa aaaattactt tcaatatgta taatttataa ttgatggttt 300
ttctgtaaaa taataaaata ttattgtaaa tgaaaaattt tatatattta aatgttatcc 360
atttttatat taaaaattaa ttaattttaa atcgacttgt caaaaataat ttttattttt 420
ttattgaaaa atttttaaag taatatagaa tataaattgt aaattagtta gatttagttt 480
ctgattgaac acaaaaaaag gggcattatt taaaaaaaat atgcgaagtt tatggtattt 540
aactttttta tttatagttc taaatatgta taactatcaa aatgtagttg tagctatgcc 600
gccaagagag gaatttattg gccaaactag aattgtccat gtatctattg gcaatattaa 660
tattttaaaa caacatgcca tatttaataa atatttcgat tggagtttac aaagcgctcg 720
ttataatgaa gatttagaag atttcagcat gatttggaca attaaagatc cagacccaaa 780
tttattaggt gttttttttg atggcggaat tagacatggc caagatgata catataattt 840
gcaagaatta aaacatatgg gtaatggtgc taataatatg tattgtatat ttctaaaaaa 900
taattaaata ttaatttata attagattaa atattaattt taattaagtt atcattatat 960
ttgcattaaa tgtgataata gatacaaaac attttaaaat gtacctcccg cttttgcaaa 1020
taaat 1025
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<213> 花生丛枝植原体(Peanut witches'-broom phytoplasma)
<400> 15
gaaataatgt tgctggatag ttttcaaata attttttatt aatttgccga agttttttgt 60
caagtcataa aattataggc atattttatg atgatttaag ttatatataa catatctaaa 120
tagagatgta atataataat tatataattt atttttagta tttttactta taaaaaataa 180
aatttaacaa aatatatcca ataaatagat ttttcgatta atttttatta aaaatgaata 240
taaaagtaat taaggtagtt ttttttaaat atttttagta tactaaagta agcgtttttt 300
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tgacaacaat aacgaagata attatataac atctcttgaa gaaattcgaa aaacttggcg 480
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gtagttttat ttttatatag atattcgatt atttaaccat tctaaaatat ctttatatat 720
tgaagtataa aaattattat ttaataaatt atgattactt gtggaatata attttaaagt 780
tttatcagga cttttgatta attcaaataa ctctttacta tgtgtataat caataatatt 840
atcttttttt ccgtgtaata ataaaatagg tttaggatag tagaattcat aattaattaa 900
atttttttga aattgtgtaa tcattaaaat catagtatta tagataaatc tagttgtaac 960
agtagtaatt ctattactaa tttcttctaa tcttaaagtt aatctttcgg attcggcata 1020
a 1021
Claims (3)
1.一种用于检测花生丛枝植原体的引物，
所述的引物为如下五组中的任意一组：
（A）SEQ ID No：1和SEQ ID No：2；
（B）SEQ ID No：3和SEQ ID No：4；
（C）SEQ ID No：5和SEQ ID No：6；
（D）SEQ ID No：7和SEQ ID No：8；
（E）SEQ ID No：9和SEQ ID No：10。
上述所述的用于检测花生丛枝植原体的引物中，
所述的A组中SEQ ID No：1和SEQ ID No：2组成的引物所获得的电泳条带的大小为934bp；
所述的B组中SEQ ID No：3和SEQ ID No：4组成的引物所获得的电泳条带的大小为926bp；
所述的C组中SEQ ID No：5和SEQ ID No：6组成的引物所获得的电泳条带的大小为1058bp；
所述的D组中SEQ ID No：7和SEQ ID No：8组成的引物所获得的电泳条带的大小为1024bp；
所述的E组中SEQ ID No：9和SEQ ID No：10组成的引物所获得的电泳条带的大小为1021bp。
2.一种用于检测花生丛枝植原体的方法，包括以下步骤：
（1）提取待测样品DNA；
（2）以步骤（1）待测样品DNA为DNA模板，并选择权利要求1中五组引物对中的任意一组作为引物，配置反应体系，进行PCR扩增；
（3）将步骤（2）得到的PCR扩增产物进行电泳检测。
上述所述的用于检测花生丛枝植原体的方法中，步骤（1）中所述的待测样品DNA为花生丛枝病病株组织的总DNA。
上述所述的用于检测花生丛枝植原体的方法中，步骤（2）中反应体系为：PCR混合液总共20ul，其中2×EasyTaq PCR SuperMix 10ul，其中DNA模板 2ul，其中引物对 2ul，其中ddH2O 6ul。
上述所述的用于检测花生丛枝植原体的方法中，其中引物的使用浓度为10uM。
上述所述的用于检测花生丛枝植原体的方法中，步骤（2）中PCR扩增的程序如下：
94℃预变性3min；94℃ 45s，55℃ 40s，72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min。
上述所述的用于检测花生丛枝植原体的方法中，所述的PCR扩增的程序中，退火温度为53℃-60℃。
3.一种如上述所述的引物在检测花生丛枝植原体上的应用。
上述所述的引物在检测花生丛枝植原体上的应用中，所述的引物制成试剂盒或基因芯片。
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|---|---|
| CN (1) | CN113444819A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113999924A (zh) * | 2021-11-29 | 2022-02-01 | 菏泽学院 | 泡桐丛枝植原体thyA基因扩增与分型的引物、试剂盒及方法 |
| CN114107339A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-03-01 | 菏泽学院 | 泡桐丛枝植原体胸苷激酶基因引物、基因、融合蛋白、多克隆抗体及其应用 |
| CN117051160A (zh) * | 2023-09-08 | 2023-11-14 | 山东省农业科学院 | 一种与花生晚斑病紧密连锁的分子标记及其应用 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1824798A (zh) * | 2005-12-22 | 2006-08-30 | 云南农业大学 | 16SrⅡ组植原体PCR检测试剂盒及其检测方法 |
| CN101475995A (zh) * | 2009-01-16 | 2009-07-08 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 一种检测槟榔黄化病植原体病原的方法及其专用试剂盒 |
| US20140359899A1 (en) * | 2011-12-08 | 2014-12-04 | Carnegie Institution Of Washington | Sucrose Transporters and Methods of Generating Pathogen-Resistant Plants |
| US20150037893A1 (en) * | 2012-03-24 | 2015-02-05 | Carnegie Institution Of Washington | Pathogen resistant plant cells and methods of making |
| CN106167831A (zh) * | 2016-09-04 | 2016-11-30 | 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 | 检测枣疯病、槐树丛枝病或樱桃致死黄化植原体的lamp引物组及其试剂盒和应用 |
| CN106399490A (zh) * | 2016-09-04 | 2017-02-15 | 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 | 检测植原体的lamp引物组及其试剂盒和应用 |
| CN109207617A (zh) * | 2018-11-14 | 2019-01-15 | 河南农业大学 | 一种植物植原体基因组的测序方法 |
-
2021
- 2021-06-04 CN CN202110628507.1A patent/CN113444819A/zh active Pending
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1824798A (zh) * | 2005-12-22 | 2006-08-30 | 云南农业大学 | 16SrⅡ组植原体PCR检测试剂盒及其检测方法 |
| CN101475995A (zh) * | 2009-01-16 | 2009-07-08 | 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所 | 一种检测槟榔黄化病植原体病原的方法及其专用试剂盒 |
| US20140359899A1 (en) * | 2011-12-08 | 2014-12-04 | Carnegie Institution Of Washington | Sucrose Transporters and Methods of Generating Pathogen-Resistant Plants |
| US20150037893A1 (en) * | 2012-03-24 | 2015-02-05 | Carnegie Institution Of Washington | Pathogen resistant plant cells and methods of making |
| CN106167831A (zh) * | 2016-09-04 | 2016-11-30 | 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 | 检测枣疯病、槐树丛枝病或樱桃致死黄化植原体的lamp引物组及其试剂盒和应用 |
| CN106399490A (zh) * | 2016-09-04 | 2017-02-15 | 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 | 检测植原体的lamp引物组及其试剂盒和应用 |
| CN109207617A (zh) * | 2018-11-14 | 2019-01-15 | 河南农业大学 | 一种植物植原体基因组的测序方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MIAW-FAN CHEN ET AL.: "DNA probes and PCR primers for the detection of a phytoplasma associated with peanut witches’-broom", 《EUROPEAN JOURNAL OF PLANT PATHOLOGY》 * |
| 杨文君 等: "花生丛枝植原体免疫膜蛋白基因克隆及细菌双杂交诱饵质粒构建", 《植物研究》 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113999924A (zh) * | 2021-11-29 | 2022-02-01 | 菏泽学院 | 泡桐丛枝植原体thyA基因扩增与分型的引物、试剂盒及方法 |
| CN114107339A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-03-01 | 菏泽学院 | 泡桐丛枝植原体胸苷激酶基因引物、基因、融合蛋白、多克隆抗体及其应用 |
| CN114107339B (zh) * | 2021-12-09 | 2024-06-07 | 菏泽学院 | 泡桐丛枝植原体胸苷激酶基因引物、基因、融合蛋白、多克隆抗体及其应用 |
| CN117051160A (zh) * | 2023-09-08 | 2023-11-14 | 山东省农业科学院 | 一种与花生晚斑病紧密连锁的分子标记及其应用 |
| CN117051160B (zh) * | 2023-09-08 | 2024-05-07 | 山东省农业科学院 | 一种与花生晚斑病紧密连锁的分子标记及其应用 |
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210928 |