CN113999924A - 泡桐丛枝植原体thyA基因扩增与分型的引物、试剂盒及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明具体涉及泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因扩增与分型的引物、试剂盒及方法。本发明提供了：(1)PaWB thyA基因扩增方法和引物PIthyAF/PIthyAR，所述方法和引物可扩增PaWB thyA基因ORF全长及其上游97bp和下游95bp的序列；(2)PaWB thyA基因分型引物PathyA F/PathyA ORFR，所述引物可把PaWB thyA基因分为两种基因型；(3)PaWB thyA基因的两种基因型PaWB thyA‑1和PaWB thyA‑2及序列；(4)PaWB thyA基因快速分型试剂盒及方法。相比于通过测序鉴定基因型的方法，本发明提供的试剂盒与方法更简单、更快速、成本更低。本发明为后续研究PaWB thyA基因型功能以及PaWB thyA基因型与植原体增殖致病的相关性奠定了基础。
Description
技术领域
本发明属于病原分子检测与鉴定技术领域，具体涉及泡桐丛枝植原体thyA基因扩增与分型的引物、试剂盒及方法。
背景技术
植原体是一类无细胞壁的植物病原原核生物，可危害世界范围内的1000多种植物。在我国，植原体引起的泡桐丛枝病(paulownia witches’-broom，PaWB)、枣疯病(jujubewitches’-broom，JWB)、桑树萎缩病(mulberry dwarf，MD)、小麦蓝矮病(wheat bluedwarf，WBD)发病严重。其中，由隶属16SrI组的泡桐丛枝植原体引起的泡桐丛枝病在我国分布极其广泛，分布于北至山海关、南到长江流域的广大范围内(Tian etal.，1996)，给泡桐生产造成重大损失。因此，关于植原体病害的基础理论和防治技术研究具有重要意义。
寄主植物中的植原体增殖到一定浓度是植原体病害发生的必要条件(任争光等，2015)，阐明植原体增殖及致病机理可为设计、筛选药物控制植原体病害奠定基础，具有重要的理论和现实意义。除少数RNA病毒外，细胞增殖离不开DNA合成。生物体内，DNA合成有从头合成和补救途径两种方式，原核生物仅含补救合成途径，在补救途径中，细胞合成DNA原料(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)需要多种酶参与，其中，胸苷酸合成酶(原核生物中简写成thyA，真核生物中简写成TS)是该途径中的关键酶，能将5，10-亚甲基四氢叶酸中的甲基转移到dUMP中，使dUMP形成dTMP。该酶广泛存在于多种生物体中，医学中，TS被广泛深入研究，TS在快速增殖的肿瘤细胞中高度表达(Kawakami et al.，2001)，通过药物(如：5-氟尿嘧啶)抑制TS使DNA合成受阻而引发细胞死亡，达到治疗肿瘤的目的，因此，TS是肿瘤治疗的重要靶标。TS还可作为调控蛋白，在细胞周期和细胞凋亡中具有重要作用。研究表明，TS基因多态性与晚期结直肠癌氟尿嘧啶敏感性存在相关性，即不同的TS基因型对氟尿嘧啶敏感性不同(聂启鸿等，2021)。
截止到目前，未有关于植原体thyA基因的任何研究报道。泡桐丛枝病在我国分布极其广泛，不同地区的泡桐丛枝植原体存在丰富的变异，克隆泡桐丛枝植原体thyA基因并阐明其多态性，可为探寻thyA基因多态性与植原体增殖致病的相关性以及深入研究thyA基因功能奠定基础，对揭示泡桐丛枝植原体增殖致病机理具有重要意义。
发明内容
一、本发明提供了泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因的PCR扩增引物PIthyAF/PIthyAR。
进一步，所述引物可扩增泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因ORF全长及其上游97bp和下游95bp的序列。
进一步，正向引物PIthyAF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，反向引物PIthyAF的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
二、本发明还提供了泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因的PCR扩增方法。
进一步，所述PaWB thyA基因的PCR扩增方法是以PaWB DNA为模板，利用所述的引物PIthyAF/PIthyAR进行扩增。
进一步，所述的PCR扩增方法包括PCR反应体系和反应条件。
优选地，所述PCR反应体系为：2×Taq PCR Mix 12.5μL，正向引物PIthyAF 0.5μL，反向引物PIthyAR 0.5μL，ddH2O 10μL，DNA模板1.5μL。
优选地，所述PCR扩增程序为：94℃4分钟；94℃30秒钟，53℃30秒钟，72℃1分钟，35个循环；72℃10分钟；10℃保温。
三、本发明还提供了泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因的两种基因型及序列。
进一步，所述的两种基因型及序列是通过所述引物PIthyAF/PIthyAR的PCR扩增产物测序获得的。
进一步，所述的两种基因型为PaWB thyA-1和PaWB thyA-2。
进一步，所述PaWB thyA-1基因型的ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述PaWBthyA-2基因型的ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
四、本发明还提供了泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因快速分型试剂盒及方法
进一步，所述基因快速分型试剂盒与方法用于快速鉴别PaWB thyA-1和PaWBthyA-2基因型。
进一步，所述试剂盒包含试剂：PaWB316 DNA、PaWB324 DNA、正向引物PathyA F、反向引物PathyA ORFR、2×Taq Mix、限制性内切酶DraI、10×Mbuffer。
具体地，PaWB316 DNA和PaWB324 DNA为参照用PaWB DNA，PaWB316 DNA为thyA-1基因型，PaWB324 DNA为thyA-2基因型。
具体地，引物PathyA F/PathyA ORFR可用于扩增PaWB thyA基因的部分ORF序列，PathyA F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，PathyA ORFR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
进一步，所述试剂盒使用方法如下：
步骤S1：以待测PaWB DNA、参照DNA PaWB316、参照DNA PaWB324为模板，利用引物PathyA F/PathyA ORFR进行PCR扩增。
步骤S2：取步骤S1中的PCR产物6μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。
步骤S3：对步骤S1中的阳性PCR产物进行DraI限制性酶切分析。
步骤S4：对步骤S3中的酶切产物进行1.5-2.0％琼脂糖凝胶电泳。
步骤S5：基因型判别方法为，若待测PaWB样品出现和PaWB316 DNA相同的DraI酶切谱带，则为PaWB thyA-1基因型；若出现和PaWB324 DNA相同的DraI酶切谱带，则为PaWBthyA-2基因型。
优选地，步骤S1所述PCR反应体系为：2×Taq PCR Mix 12.5μL，正向引物PathyA F0.5μL，反向引物PathyA ORFR 0.5μL，ddH2O 10μL，DNA模板1.5μL。
优选地，步骤S1所述PCR反应程序为：94℃4分钟；94℃30秒钟，60℃30秒钟，72℃1分钟，36个循环；72℃10分钟；10℃保温。
优选地，步骤S3所述酶切反应体系为：PCR产物16μL、限制性内切酶DraI 2μL、10×M buffer 2μL。
优选地，步骤S3所述酶切反应条件为：37℃水浴2-6小时。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明提供了两对扩增泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因的引物，其中PIthyAF/PIthyAR不仅可扩增PaWB thyA基因ORF全长，还可扩增到ORF上游97bp和下游95bp的序列，为克隆和测定准确的PaWB thyA基因ORF序列提供了可能。
2、本发明提供了泡桐丛枝植原体PaWB thyA两种基因型，为后续研究该两种基因型功能以及thyA基因型与植原体增殖致病的相关性奠定了基础。
3、通过PCR产物测序鉴定基因型时，通常需要对PCR产物直接纯化或切胶纯化，还需要价值昂贵的测序仪；对于无测序仪的单位，需要测序公司代测，这都大大增加了时间成本和科研经费支出。本发明中的试剂盒可扩增泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因的部分ORF序列，PCR产物不经纯化直接单酶切后检测酶切条带，便可区分上述PaWB thyA的两种基因型。相比于通过PCR产物直接测序鉴定基因型的方法，本试剂盒及方法更简单、更快速、成本更低，适于大量鉴定PaWB thyA基因型时使用。
附图说明
图1为PaWB thyA-1基因型序列酶切位点软件分析结果图。
图2为PaWB thyA-2基因型序列酶切位点软件分析结果图。
图3为PathyA F/PathyA ORFR引物的PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；PaH样品为健康泡桐，其余样品为丛枝病泡桐。
图4为PathyA F/PathyA ORFR引物的PCR产物经DraI酶切后琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因全长及上下游部分序列引物设计
在NCBI中下载洋葱黄化植原体(OY-M，Genbank AP00628)、翠菊黄化植原体(AYWB，Genbank CP000061)、玉米丛矮植原体(M3，Genbank CP015149)基因组序列，分别截取thyA基因及其上下游部分序列后进行多序列比对，在thyA基因ORF上游97bp处和下游95bp处设计上下游引物。
上游引物PIthyAF的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)：5’-TTAACTGCCATTTACACAGAAG-3’；
下游引物PIthyAR的核苷酸序列(SEQ ID NO.2)：5’-TTTTTAAAATATTGTAAATCTTGG-3’。
实施例2：泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因两个基因型的获得
1、PCR扩增方法的建立：
以泡桐丛枝病样品DNA为模板，利用引物PIthyAF/PIthyAR进行PCR扩增。
PCR扩增反应体系为：2×Taq PCR Mix 12.5μL，正向引物PIthyAF0.5μL，反向引物PIthyAR 0.5μL，ddH2O 10μL，DNA模板1.5μL。
PCR扩增程序为：94℃4分钟；94℃30秒钟，53℃30秒钟，72℃1分钟，35个循环；72℃10分钟；10℃保温。
利用引物PIthyAF/PIthyAR对PCR反应产物进行测序，利用DNAMAN等软件对序列进行拼接和比对分析。
2、结果分析
在采集的我国88份泡桐丛枝病样品中，PCR结果阳性样品65份，成功测序62份，该62份样品分布在我国15个省和直辖市的41个县区市。序列比对结果表明，成功测序的62份样品中，共有两种PaWB thyA基因型，我们命名为PaWB thyA-1基因型和PaWB thyA-2基因型，PaWB thyA-1和PaWB thyA-2基因型样品各占56份和6份，因此在我国，PaWB thyA-1为该基因的优势基因型。序列分析表明，PaWB thyA-1ORF和PaWB thy-2ORF长度均为867bp，两基因型间仅有8个碱基差异。
PaWB thyA-1ORF序列如SEQ ID NO.3所示。
PaWB thyA-2ORF序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例3：泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因型快速鉴定方法的建立与试剂盒开发
综合引物特异性、防止二聚体形成等因素，设计PaWB ORF部分序列的扩增引物PathyA F/PathyA ORFR，该引物的扩增片段长度为814bp。
上游引物PathyA F的核苷酸序列(SEQ ID NO.5)：5’-AAACGACCGCACTAATACAGGTACC-3’；
下游引物PathyA ORFR的核苷酸序列(SEQ ID NO.6)：5’-TCATACAGCAATATCGCCTTTCAA-3’。
PaWB thyA-1基因型DNA样品的PathyA F/PathyA ORFR扩增产物序列如SEQ IDNO.7所示。
PaWB thyA-2基因型DNA样品的PathyA F/PathyA ORFR扩增产物序列如SEQ IDNO.8所示。
利用DNAMAN等软件，分别对SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8序列进行限制性内切酶位点分析，分析结果如图1和图2所示。SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8序列的DraI(AhaIII)和XmnI酶切位点存在差异。利用软件进行DraI酶切分析，SEQ ID NO.7序列的DraI酶切片段为579bp、188bp、69bp、31bp，SEQ ID NO.8序列的DraI酶切片段为485bp、188bp、94bp、69bp、31bp。因此，PaWB thyA-1和PaWB thyA-2基因型DNA样品的PathyA F/PathyA ORFR扩增产的DraI酶切谱带存在明显差异。
因此，只要待测PaWB DNA样品出现和参照PaWB316 DNA相同的DraI酶切谱带，则为PaWB thyA-1基因型；若出现和PaWB324 DNA相同的DraI酶切谱带，则为PaWB thyA-2基因型。
基于以上论述，提供了PaWB thyA-1和PaWB thyA-2基因型鉴定试剂盒及方法。
所述试剂盒包含试剂：PaWB316 DNA、PaWB324 DNA、正向引物PathyA F、反向引物PathyA ORFR、2×Taq Mix、限制性内切酶DraI、10×M buffer。
所述试剂盒使用方法如下：
步骤1：以待测PaWB DNA、参照DNA PaWB316、参照DNA PaWB324为模板，利用引物PathyA F/PathyA ORFR进行PCR扩增。
具体地，步骤1所述PCR反应体系为：2×Taq PCR Mix 12.5μL，正向引物PathyA F0.5μL，反向引物PathyA ORFR 0.5μL，ddH2O 10μL，DNA模板1.5μL。
具体地，步骤1所述PCR反应程序为：94℃4分钟；94℃30秒钟，60℃30秒钟，72℃1分钟，36个循环；72℃10分钟；10℃保温。
步骤2：取步骤1中的PCR产物6μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。
步骤3：对步骤2中的阳性PCR产物进行DraI限制性酶切分析。
具体地，步骤3所述酶切反应体系为：PCR产物16μL、DraI 2μL、10×Mbuffer 2μL。
具体地，步骤3所述酶切反应条件为：37℃水浴2-6小时。
步骤4：步骤3中的酶切产物进行1.5-2.0％琼脂糖凝胶电泳。
判别方法：若待测PaWB DNA样品出现和PaWB316 DNA相同的DraI酶切谱带，则为PaWB thyA-1基因型；若出现和PaWB324 DNA相同的DraI酶切谱带，则为PaWB thyA-2基因型。
实施例4：上述试剂盒及方法在PaWB植原体thyA基因型鉴定中的应用实例
为了检验本发明中所述试剂盒及其方法的可靠性和效果，在已知PaWB thyA基因型的样品中，选取实施例2中的14个样品作为待测样品进行试验。上述14个样品的PathyAF/PathyA ORFR引物扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示，待测样品扩增到了和对照DNA PaWB316、PaWB324相同大小的目的条带。DraI酶切产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图4所示，待测样品PaWB13、PaWB15、PaWB32、PaWB42、PaWB101、PaWB228、PaWB315的酶切谱带与对照PaWB316一致，因此这些待测样品的thyA基因型为PaWB thyA-1型。待测样品PaWB40、PaWB87、PaWB89、PaWB92、PaWB225、PaWB304、PaWB307的酶切图谱与PaWB316一致，表明这些待测样品的thyA基因型为PaWB thyA-2型。依据实施例2中的测序结果，PaWB13、PaWB15、PaWB32、PaWB42、PaWB101、PaWB228、PaWB315的thyA基因型均为PaWB thyA-1型；PaWB40、PaWB87、PaWB89、PaWB92、PaWB225、PaWB304、PaWB307的thyA基因型均为PaWB thyA-2型。综上所述，该试剂盒鉴定的PaWB thyA基因型结果与测序鉴定结果完全相符。本应用实例表明该试剂盒及方法的可靠性和效果很好。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
序列表
<110> 菏泽学院
<120> 泡桐丛枝植原体thyA基因扩增与分型的引物、试剂盒及方法
<130> 1
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ttaactgcca tttacacaga ag 22
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
tttttaaaat attgtaaatc ttgg 24
<210> 3
<211> 867
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
atgaatactt atttagattt atgtcgtttt attttgcaaa aaggcagttt tagaaacgac 60
cgcactaata caggtaccaa aagtgttttt ggctaccaaa tgcgttttaa tcttgaagaa 120
ggttttcctt tgttaactac taaaaaaatg aatcttagat caattatcca cgaactttta 180
tggtttttaa aaggggatac taatatttgt tatttggtac aaaacaatgt taatatttgg 240
aatgaatggc cttatcaaaa atataaacaa tcagcttttt ttcaaaatga aacattaaaa 300
gaatttgtag aaaaaattaa aaatgatcct ctttttgcca taaagcacgg taatttaggt 360
cctgtttatg gtaaacaatg gcgcgatttt aatggcgttg atcaaatcaa atttttaatt 420
tctgaaatca aaaccaatcc caattccagg cgtttgattc ttaattcttg gaatccgccc 480
ttattaaacc aaatggcatt gccaccttgt catgtcttaa ttcaattcta cgttcatcaa 540
ggcaaactct ccttgcaatt atatcaacgt agtggagatg tttttttggg aatacctttt 600
aatatcgctt cttattcttt attacttatg atggtcgcac aagtaactaa cttacaacct 660
tacgaattta tccatacttt aggagatgcc cacatttatt ccaatcacct tgcacaagtt 720
cagacccaaa ttcaaagaac tcctaaaaaa ttacctcaaa tgattttaaa tcctgacatc 780
aaaaatattg atgattttaa atttagtgat tttactttgc aaaattatca atgtgatggc 840
attttgaaag gcgatattgc tgtatga 867
<210> 4
<211> 867
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 4
atgaatactt atttagattt atgtcgtttt attttgcaaa aaggcagttt tagaaacgac 60
cgcactaata caggtaccaa aagtgttttt ggctaccaaa tgcgctttaa tcttgaagaa 120
gggttccctt tgttaactac taaaaaaatg aatcttagat caattatcca cgaactttta 180
tggtttttaa aaggggatac taatatttgt tatttggtac aaaacaatgt taatatttgg 240
aatgaatggc cttatcaaaa atataaacaa tcagcttttt ttaaaaatga aacattgaaa 300
gaatttgtag aaaaaatcaa aaatgatcct ctttttgcca taaagcacgg taatttaggt 360
cctgtttatg gtaaacaatg gcgcgatttt aatggcgttg atcaaatcaa atttttaatt 420
tctgaaatca aaaccaatcc caattccaga cgtttgattc ttaattcttg gaatccgccc 480
ttattaaacc aaatggcatt gccaccttgt catgtcttaa ttcaattcta cgttcatcaa 540
ggcaaactct ccttgcaact atatcaacgt agtggagatg tttttttggg aatacctttt 600
aatatcgctt cttattcttt attacttatg atggtcgcac aagtaactaa cttacaacct 660
tacgaattta tccatacttt aggagatgcc cacatttatt ccaatcacct tgcacaagtt 720
cagacccaaa ttcaaagaac tcctaaaaaa ttacctcaaa tgattttaaa tcctgacatc 780
aaaaatattg atgattttaa atttagtgat tttactttgc aaaattatca atgtgatggc 840
attttgaaag gcgatattgc tgtatga 867
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 5
aaacgaccgc actaatacag gtacc 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 6
tcatacagca atatcgcctt tcaa 24
<210> 7
<211> 814
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 7
aaacgaccgc actaatacag gtaccaaaag tgtttttggc taccaaatgc gttttaatct 60
tgaagaaggt tttcctttgt taactactaa aaaaatgaat cttagatcaa ttatccacga 120
acttttatgg tttttaaaag gggatactaa tatttgttat ttggtacaaa acaatgttaa 180
tatttggaat gaatggcctt atcaaaaata taaacaatca gctttttttc aaaatgaaac 240
attaaaagaa tttgtagaaa aaattaaaaa tgatcctctt tttgccataa agcacggtaa 300
tttaggtcct gtttatggta aacaatggcg cgattttaat ggcgttgatc aaatcaaatt 360
tttaatttct gaaatcaaaa ccaatcccaa ttccaggcgt ttgattctta attcttggaa 420
tccgccctta ttaaaccaaa tggcattgcc accttgtcat gtcttaattc aattctacgt 480
tcatcaaggc aaactctcct tgcaattata tcaacgtagt ggagatgttt ttttgggaat 540
accttttaat atcgcttctt attctttatt acttatgatg gtcgcacaag taactaactt 600
acaaccttac gaatttatcc atactttagg agatgcccac atttattcca atcaccttgc 660
acaagttcag acccaaattc aaagaactcc taaaaaatta cctcaaatga ttttaaatcc 720
tgacatcaaa aatattgatg attttaaatt tagtgatttt actttgcaaa attatcaatg 780
tgatggcatt ttgaaaggcg atattgctgt atga 814
<210> 8
<211> 814
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 8
aaacgaccgc actaatacag gtaccaaaag tgtttttggc taccaaatgc gctttaatct 60
tgaagaaggg ttccctttgt taactactaa aaaaatgaat cttagatcaa ttatccacga 120
acttttatgg tttttaaaag gggatactaa tatttgttat ttggtacaaa acaatgttaa 180
tatttggaat gaatggcctt atcaaaaata taaacaatca gcttttttta aaaatgaaac 240
attgaaagaa tttgtagaaa aaatcaaaaa tgatcctctt tttgccataa agcacggtaa 300
tttaggtcct gtttatggta aacaatggcg cgattttaat ggcgttgatc aaatcaaatt 360
tttaatttct gaaatcaaaa ccaatcccaa ttccagacgt ttgattctta attcttggaa 420
tccgccctta ttaaaccaaa tggcattgcc accttgtcat gtcttaattc aattctacgt 480
tcatcaaggc aaactctcct tgcaactata tcaacgtagt ggagatgttt ttttgggaat 540
accttttaat atcgcttctt attctttatt acttatgatg gtcgcacaag taactaactt 600
acaaccttac gaatttatcc atactttagg agatgcccac atttattcca atcaccttgc 660
acaagttcag acccaaattc aaagaactcc taaaaaatta cctcaaatga ttttaaatcc 720
tgacatcaaa aatattgatg attttaaatt tagtgatttt actttgcaaa attatcaatg 780
tgatggcatt ttgaaaggcg atattgctgt atga 814
Claims (10)
1.用于泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因扩增的引物，其特征在于，包括可扩增PaWBthyA基因ORF全长及其上游97bp和下游95bp序列的正向引物PIthyAF和反向引物PIthyAR，所述正向引物PIthyAF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物PIthyAR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.基于权利要求1所述的用于泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因扩增的方法，其特征在于，所述方法包括PCR扩增体系和程序，所述PCR扩增体系为：2×Taq PCR Mix 12.5μL，正向引物PIthyAF 0.5μL，反向引物PIthyAR 0.5μL，ddH2O 10μL，DNA模板1.5μL；所述PCR扩增程序为：94℃4分钟；94℃30秒钟，53℃30秒钟，72℃1分钟，35个循环；72℃10分钟；10℃保温。
3.根据权利要求2所述的用于泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因扩增的方法，其特征在于，所述方法的扩增产物测序得到PaWB thyA基因的两种基因型，PaWB thyA-1和PaWBthyA-2，所述PaWB thyA-1的ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述PaWB thyA-2的ORF核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.用于泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因快速分型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于对权利要求3所述的PaWB thyA基因的两种基因型的分型鉴定。
5.根据权利要求4所述的用于泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因快速分型的试剂盒，其特征在于，包括以下有效成分：PaWB thyA-1基因型阳性对照DNA PaWB316、PaWB thyA-2基因型阳性对照DNA PaWB324、正向引物PathyA F、反向引物PathyA ORFR、2×Taq Mix、限制性内切酶DraI、10×M buffer。
6.根据权利要求5所述的用于泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因快速分型的试剂盒，其特征在于，所述的正向引物PathyA F和反向引物PathyA ORFR可扩增PaWB thyA基因ORF的部分序列，所述正向引物PathyA F的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述反向引物PathyAORFR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
7.用于泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因快速分型的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
步骤S1：以待测PaWB DNA、对照DNA PaWB316和对照DNA PaWB324为模板，利用权利要求5或6所述的试剂盒进行PCR扩增，获得PCR产物；
步骤S2：取步骤S1中的PCR产物6μL进行琼脂糖凝胶电泳检测；
步骤S3：对步骤S2中的阳性PCR产物进行DraI限制性酶切分析；
步骤S4：对步骤S3中的酶切产物进行1.5-2.0％琼脂糖凝胶电泳；
步骤S5：判断待测PaWB thyA基因的分型。
8.根据权利要求7所述的用于泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因快速分型的方法，其特征在于，所述步骤S1中PCR扩增的反应体系为：2×Taq PCR Mix 12.5μL，正向引物PathyA F0.5μL，反向引物PathyA ORFR 0.5μL，ddH2O 10μL，DNA模板1.5μL；所述PCR扩增的反应程序为：94℃4分钟；94℃30秒钟，60℃30秒钟，72℃1分钟，36个循环；72℃10分钟；10℃保温。
9.根据权利要求7所述的用于泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因快速分型的方法，其特征在于，所述步骤S3中的酶切反应体系为：所述步骤S1中的PCR产物16μL、限制性内切酶DraI2μL、10×M buffer 2μL；所述步骤S3中的酶切条件为：37℃水浴2-6小时。
10.根据权利要求7所述的用于泡桐丛枝植原体PaWB thyA基因快速分型的方法，其特征在于，所述步骤S5中判断分型的具体方法为：若待测PaWB DNA出现和PaWB316相同的DraI酶切谱带，则为PaWB thyA-1基因型；若出现和PaWB324相同的DraI酶切谱带，则为PaWBthyA-2基因型。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113943719A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-01-18 | 菏泽学院 | 泡桐丛枝植原体胸苷酸合成酶融合蛋白、多克隆抗体及其制备方法和应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008306974A (ja) * | 2007-06-14 | 2008-12-25 | Saitama Medical Univ | Ｈｃｖ遺伝子型判定方法、並びに、これに用いるｌｎａプローブ及びキット |
| CN101440399A (zh) * | 2008-10-07 | 2009-05-27 | 东北农业大学 | 用mmp23基因预示和鉴定猪产仔数的分子标记方法 |
| CN106167831A (zh) * | 2016-09-04 | 2016-11-30 | 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 | 检测枣疯病、槐树丛枝病或樱桃致死黄化植原体的lamp引物组及其试剂盒和应用 |
| CN106399490A (zh) * | 2016-09-04 | 2017-02-15 | 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 | 检测植原体的lamp引物组及其试剂盒和应用 |
| CN113444819A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-09-28 | 中国热带农业科学院湛江实验站 | 一种用于检测花生丛枝植原体的引物、方法及应用 |
-
2021
- 2021-11-29 CN CN202111429636.4A patent/CN113999924A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008306974A (ja) * | 2007-06-14 | 2008-12-25 | Saitama Medical Univ | Ｈｃｖ遺伝子型判定方法、並びに、これに用いるｌｎａプローブ及びキット |
| CN101440399A (zh) * | 2008-10-07 | 2009-05-27 | 东北农业大学 | 用mmp23基因预示和鉴定猪产仔数的分子标记方法 |
| CN106167831A (zh) * | 2016-09-04 | 2016-11-30 | 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 | 检测枣疯病、槐树丛枝病或樱桃致死黄化植原体的lamp引物组及其试剂盒和应用 |
| CN106399490A (zh) * | 2016-09-04 | 2017-02-15 | 中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所 | 检测植原体的lamp引物组及其试剂盒和应用 |
| CN113444819A (zh) * | 2021-06-04 | 2021-09-28 | 中国热带农业科学院湛江实验站 | 一种用于检测花生丛枝植原体的引物、方法及应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| GENBANK: CP035949.1: "\'Catharanthus roseus\' aster yellows phytoplasma strain De Villa chromosome, complete genome", NCBI * |
| GENBANK: CP066882.1: "Paulownia witches\'-broom phytoplasma strain Zhengzhou chromosome, complete genome", NCBI * |
| 耿显胜等: "泡桐丛枝植原体pPaWBNy-1-ORF5 编码蛋白的原核表达和抗体制备", 植物病理学报, vol. 43, no. 5, pages 467 - 474 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113943719A (zh) * | 2021-12-09 | 2022-01-18 | 菏泽学院 | 泡桐丛枝植原体胸苷酸合成酶融合蛋白、多克隆抗体及其制备方法和应用 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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