CN114231665A - 一种菜豆金色花叶病毒属rpa-lfd检测试剂盒及其应用 - Google Patents

一种菜豆金色花叶病毒属rpa-lfd检测试剂盒及其应用 Download PDF

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韩科雷
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Abstract

本发明公开了一种菜豆金色花叶病毒属RPA‑LFD检测试剂盒及其应用，涉及基因工程技术领域，包含如下引物组和核酸检测试纸条：所述的引物组的核苷酸序列如下所示：FITC‑Beg‑310R：FITC‑TGTGTGAGTCCGGTTCCTCGTGTAACATC，RPA‑Beg‑64F：AACTTCGACAGCCCATATGTTTCCCGTG；探针Bio‑Beg‑Probe：Biotin‑GACAAACAGGCCGATGAACAGAAAACCAAAG(THF)ATGTACAGGATGTA‑PHO。本发明引物和探针适用于菜豆金色花叶病毒属，能够有效且特异的检测该属四种病毒的外壳蛋白片段，可以高效灵敏的检测菜豆金色花叶病毒属的4种病毒，同时本发明将RPA所需试剂按照一定比例混合，应用此配比下的试验反应可以高效灵敏的检测菜豆金色花叶病毒属的中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)、烟草曲茎病毒(ToCSV)、甜瓜曲叶病毒(MLCV)和辣椒曲叶病毒(PepLCV)四种病毒。

Description

一种菜豆金色花叶病毒属RPA-LFD检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种菜豆金色花叶病毒属RPA-LFD检测试剂盒及其应用。
背景技术
菜豆金色花叶病毒属的病毒粒子为双联体结构，无包膜，由两个不完整的二十面体组成。是有效的免疫源。该属病毒在寄主植物中的分布局限于韧皮部及相邻的薄壁细胞，病毒侵染后细胞核呈现明显的病理变化，核膨大并形成颗粒状结构和纤维状结构，纤维状物质可浓缩成各种大小的环。现有的技术菜豆金色花叶病毒属检测都是单个病毒的RPA-LFD的检测，不能针对多种病毒进行检测，因此，提出一种菜豆金色花叶病毒属RPA-LFD检测试剂盒及其应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种菜豆金色花叶病毒属RPA-LFD检测试剂盒及其应用。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供了一种菜豆金色花叶病毒属RPA-LFD检测试剂盒，包含如下引物组和核酸检测试纸条：
所述的引物组的核苷酸序列如下所示：
FITC-Beg-310R：FITC-TGTGTGAGTCCGGTTCCTCGTGTAACATC，
RPA-Beg-64F：AACTTCGACAGCCCATATGTTTCCCGTG；
探针Bio-Beg-Probe：
Biotin-GACAAACAGGCCGATGAACAGAAAACCAAAG(THF)ATGTACAGGATGTA-PHO。
进一步改进在于，所述的核酸检测试纸条为通用型核酸检测试纸条。
本发明还提供了一种上述的菜豆金色花叶病毒属RPA-LFD检测试剂盒在检测菜豆金色花叶病毒属中的应用。
进一步改进在于，所述菜豆金色花叶病毒属包括中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)、烟草曲茎病毒(ToCSV)、甜瓜曲叶病毒(MLCV)和辣椒曲叶病毒(PepLCV)。
进一步改进在于，RPA反应试剂包括以下成分：BufferA：50mMTris(pH7.9)，100mM醋酸钾，2mMDTT，5％Carbowax20M，200μMdNTPs，3mMATP，50mM磷酸肌酸，100ng/μl肌酸激酶，30ng/μlBsu；10μM上游引物，10μM下游引物，探针，ddH2O；14mM醋酸镁。
进一步改进在于，除醋酸镁外，预先将上述试剂混合制成预混液，该预混液比例为BufferA29.5μl，上游引物2.1μl，下游引物3μl，探针0.6μl，ddH2O11.3μl，待进行试验时再加入1-2μl模板和2.5μl醋酸镁，反应即可开始。
进一步改进在于，包含以下步骤：
(1)对待测样本提取植物基因组DNA或者直接提取待测样本的破碎种子或汁液作为模板，采用预混液对待测样本进行重组酶聚合酶扩增，反应条件为39℃、18min，由此得到带有修饰标记的扩增产物；
(2)将待测样品进行RPA反应后的扩增产物用无菌水稀释20倍后，将侧流层析试纸条插入该反应液中，待3-5min后观察。
(3)结果判读：
若试纸条上显示两条带，上面条带代表控制线，下面条带代表检测线，表明该样本含有中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)、烟草曲茎病毒(ToCSV)、甜瓜曲叶病毒(MLCV)和辣椒曲叶病毒(PepLCV)四种病毒；
若试纸条上只显示出一条控制线条带，表明该样本不含有中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)、烟草曲茎病毒(ToCSV)、甜瓜曲叶病毒(MLCV)和辣椒曲叶病毒(PepLCV)四种病毒。
本发明提具有如下有益效果：
本发明提供了一种菜豆金色花叶病毒属RPA-LFD检测试剂盒，本发明引物和探针适用于菜豆金色花叶病毒属，能够有效且特异的检测该属四种病毒的外壳蛋白片段，可以高效灵敏的检测菜豆金色花叶病毒属的4种病毒，同时本发明将RPA所需试剂按照一定比例混合，应用此配比下的试验反应可以高效灵敏的检测菜豆金色花叶病毒属的中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)、烟草曲茎病毒(ToCSV)、甜瓜曲叶病毒(MLCV)和辣椒曲叶病毒(PepLCV)四种病毒。
附图说明
图1为中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)、烟草曲茎病毒(ToCSV)、甜瓜曲叶病毒(MLCV)和辣椒曲叶病毒(PepLCV)的RPA恒温扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为菜豆金色花叶病毒属RPA-LFD检测试剂盒检测阴阳性对照图；
图3为菜豆金色花叶病毒属RPA-LFD检测试剂盒检测假阳性图。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
1、材料
本发明所用方法如无特别说明均为本领域技术人员所知晓的常规方法，所用试剂等，如无特别说明，均为市售购买产品。
2、方法
2.1引物及探针序列的设计
根据菜豆金色花叶病毒属病毒外壳蛋白基因序列的保守区和RPA引物设计原则，针对该区域设计了引物和探针，RPA对引物长度的要求是30-35bp，扩增产物在500bp之内，扩增效率较高，要建立一种快速、敏感的检测方法，需要进行多次引物的筛选，引物个别碱基差异会对扩增效果产生影响，所以，在保守基因区域，设计一系列梯度候选物，再根据RT-RPA凝胶检测的结果，从中选择最佳引物。应用引物设计软件PrimePremier5.0进行RPA引物设计，同时应用生物软件Oligo7.0对引物进行筛选，以确保各引物对之间产生的二聚体较少为原则。
本发明合成的引物组的核苷酸序列如下所示：
FITC-Beg-310R：FITC-TGTGTGAGTCCGGTTCCTCGTGTAACATC，
RPA-Beg-64F：AACTTCGACAGCCCATATGTTTCCCGTG；
探针Bio-Beg-Probe：
Biotin-GACAAACAGGCCGATGAACAGAAAACCAAAG(THF)ATGTACAGGATGTA-PHO。
2.2病毒RPA反应
2.2.1扩增
将引物组和探针利用RPA试剂盒进行RPA等温扩增。RPA反应试剂主要包括以下成分：
BufferA：50mMTris(pH7.9)，100mM醋酸钾，2mMDTT，5％Carbowax20M，200μMdNTPs，3mMATP，50mM磷酸肌酸，100ng/μl肌酸激酶，30ng/μlBsu。10μM上游引物，10μM下游引物，探针，ddH2O；14mM醋酸镁。
可以预先将上述试剂(除醋酸镁和模板)按照一定比例混合制成预混液，该预混液比例为BufferA29.5μl，上游引物2.1μl，下游引物3μl，探针0.6μl，ddH2O11.3μl。通过试验该预混液按照此配比可在4度下存放一年，反应体系稳定，灵敏度高。待进行试验时再加入模板和2.5μl醋酸镁，反应即可开始。
2.2.2效果检测
(1)对待测样本提取植物基因组DNA或者直接提取待测样本的破碎种子或汁液作为模板，采用预混液对待测样本进行重组酶聚合酶扩增，反应条件为39℃、18min，由此得到带有修饰标记的扩增产物，如图1所示；
(2)将待测样品进行RPA反应后的扩增产物用无菌水稀释20倍后，将侧流层析试纸条插入该反应液中，待3-5min后观察。
(3)结果判读：
如图2所示，若试纸条上显示两条带，上面条带代表控制线，下面条带代表检测线，表明该样本含有中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)、烟草曲茎病毒(ToCSV)、甜瓜曲叶病毒(MLCV)和辣椒曲叶病毒(PepLCV)四种病毒；
若试纸条上只显示出一条控制线条带，表明该样本不含有中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)、烟草曲茎病毒(ToCSV)、甜瓜曲叶病毒(MLCV)和辣椒曲叶病毒(PepLCV)四种病毒。
若在试验过程中改变RPA反应试剂的配比，如提高引物浓度，则会导致试纸条结果呈现假阳性，即阴性对照出现检测条带，如图3所示。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种菜豆金色花叶病毒属RPA-LFD检测试剂盒，其特征在于，包含如下引物组和RPA-LFD检测试纸条：
所述的引物组的核苷酸序列如下所示：
FITC-Beg-310R：FITC-TGTGTGAGTCCGGTTCCTCGTGTAACATC，
RPA-Beg-64F：AACTTCGACAGCCCATATGTTTCCCGTG；
探针Bio-Beg-Probe：
Biotin-GACAAACAGGCCGATGAACAGAAAACCAAAG(THF)ATGTACAGGATGTA-PHO。
2.根据权利要求1所述的一种菜豆金色花叶病毒属RPA-LFD检测试剂盒，其特征在于，所述的核酸检测试纸条为通用型RPA-LFD核酸检测试纸条。
3.一种如权利要求1-2任一所述的菜豆金色花叶病毒属RPA-LFD检测试剂盒在检测菜豆金色花叶病毒属中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述菜豆金色花叶病毒属包括中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)、烟草曲茎病毒(ToCSV)、甜瓜曲叶病毒(MLCV)和辣椒曲叶病毒(PepLCV)。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，RPA反应试剂包括以下成分：BufferA：50mMTris(pH7.9)，100mM醋酸钾，2mMDTT，5％Carbowax20M，200μMdNTPs，3mMATP，50mM磷酸肌酸，100ng/μl肌酸激酶，30ng/μlBsu；10μM上游引物，10μM下游引物，探针，ddH2O；14mM醋酸镁。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，除醋酸镁外，预先将上述试剂混合制成预混液，该预混液比例为BufferA29.5μl，上游引物2.1μl，下游引物3μl，探针0.6μl，ddH2O11.3μl，待进行试验时再加入1-2μl模板和2.5μl醋酸镁，反应即可开始。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，包含以下步骤：
(1)对待测样本提取植物基因组DNA或者直接提取待测样本的破碎种子或汁液作为模板，采用预混液对待测样本进行重组酶聚合酶扩增，反应条件为39℃、18min，由此得到带有修饰标记的扩增产物；
(2)将待测样品进行RPA反应后的扩增产物用无菌水稀释20倍后，将侧流层析试纸条插入该反应液中，待3-5min后观察。
(3)结果判读：
若试纸条上显示两条带，上面条带代表控制线，下面条带代表检测线，表明该样本含有中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)、烟草曲茎病毒(ToCSV)、甜瓜曲叶病毒(MLCV)和辣椒曲叶病毒(PepLCV)四种病毒；
若试纸条上只显示出一条控制线条带，表明该样本不含有中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)、烟草曲茎病毒(ToCSV)、甜瓜曲叶病毒(MLCV)和辣椒曲叶病毒(PepLCV)四种病毒。
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