CN114807447A - 一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的rpa引物、探针、试剂盒及检测方法 - Google Patents

一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的rpa引物、探针、试剂盒及检测方法 Download PDF

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陈莹
王芳
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韩科雷
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Abstract

本发明公开了一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法，属于生物安全技术领域。RPA引物基于中国南瓜曲叶病毒外壳蛋白基因序列设计的，RPA引物序列如SEQ ID No:1和2所示；PRA探针根据RPA引物扩增区域设计，其序列大小为49 bp，其5'端用FAM标记，3'端用C3‑Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5'端的33bp处进行THF修饰。本发明还提供含有RPA引物和探针的试剂盒。本发明进一步提供基于RPA引物和探针建立的RPA检测方法，将RPA技术应用到媒介昆虫烟粉虱体内的中国南瓜曲叶病毒的分子检测，其兼具特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点，为中国南瓜曲叶病毒的早期监控、带毒烟粉虱的防治和病毒病防治提供新方法。

Description

一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA引物、探针、试剂盒及 检测方法
技术领域
本发明属于生物安全技术领域，具体地说，涉及一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法。
背景技术
中国南瓜曲叶病毒（ Squash leaf curl China virus，SLCCNV ）是一类具有双联体孪生颗粒形态的植物病毒，属于双生病毒科（ Geminiviridae ）菜豆金色花叶病毒属（Begomovirus ）。SLCCNV基因组结构包含DNA-A和DNA-B[1,2]。该病毒寄主范围较窄，主要为葫芦科作物，在自然条件下可以侵染南瓜、甜瓜、木、佛手瓜、哈密瓜、冬瓜等，近期有报道表明SLCCNV也可侵染水茄。该病毒由烟粉虱进行持久性传播，目前在东南亚地区包括越南、菲律宾、柬埔寨、泰国和东帝汶等以及中国地区包括安徽省云南省、广东省、海南省、广西省和台湾省等均有发生。该病毒能够造成瓜类作物皱缩卷曲，植株表现为矮化，且严重影响果实的产量和品质。
目前针对SLCCNV的检测方法主要包括RT-PCR（检测AV1编码的CP ）、滚环复制（rolling circle amplification ）、三抗夹心酶联免疫吸附试验（ TAS-ELISA ）、斑点杂交免疫结合试验（ DIBA ）、免疫吸附技术聚合酶链反应（ IC-PCR ）等。RT-PCR方法检测时耗时较长且设备昂贵，ELISA等血清学方法检测时灵敏度较低，抗体制备和PVDF膜等价格也较为昂贵，实验室设置复杂，技术人员也应经验丰富，并且无法进行田间现场检测。因此，建立一种快速有效的田间检测技术对于控制病毒的传播和预防病害的流行至关重要。
重组酶聚合酶扩增-侧流层析试纸条（Recombinase Polymerase Amplificationcombined with lateral flow strips，RPA-LFS ）是一种通过等温扩增核酸结合试纸条实现可视化病害检测的新方法。该方法提供极少量目标DNA即可进行高度特异性DNA扩增，在设计引物和探针时加入特定的标签，在37-42℃的等温扩增后，将扩增产物通过滴定法滴在试纸条上，或者将试纸条直接插入稀释后的扩增产物中，2-3 min 内即可呈现可视化检测结果。该检测方法方便快速、简捷灵敏、对仪器设备等方面要求低，并且适合田间可视化检测。目前，RPA技术已广泛应用于病毒、细菌、支原体和寄生虫的快速检测中，但尚未见其在中国南瓜曲叶病毒检测方面的报道。
发明内容
、要解决的问题
针对中国南瓜曲叶病毒尚无有效RPA检测技术的问题，本发明提供一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法，为该病毒在寄主植物和媒介昆虫中的现场检测和早期诊断提供新方法。
、技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA引物和探针，
所述的RPA引物基于中国南瓜曲叶病毒的外壳蛋白基因设计，
所述的RPA引物的上游引物如SEQ ID No:1所示，
所述的RPA引物的下游引物如SEQ ID No:2所示；
所述的PRA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计，
所述的RPA探针的序列大小为49bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在RPA中间距5’端的33bp处进行THF修饰。
优选地，所述的RPA引物的下游引物包括如SEQ ID No:2所示的序列，且其5’端用Biotin修饰；所述的RPA探针包括如SEQ ID No:3所示的序列，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的33bp处进行THF修饰。
一种含有上述所述的RPA引物和RPA探针的用于检测主植物和媒介昆虫中的中国南瓜曲叶病毒的试剂盒。
优选地，所述的试剂盒还包括RPA反应管、阳性对照模板、阴性对照模板中的至少一种。
一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的检测方法，
包括以下步骤:
（1）提取样品中的DNA；
（2）以步骤（1）提取的DNA作为待检测DNA模板，采用上述所述的RPA引物和RPA探针，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
（3）分析RPA扩增产物。
优选地，步骤（1）中所述的样品为病的外壳蛋白基因全长的构造的质粒，所述的RPA引物和RPA探针的检出限为102 copies/μL。
优选地，步骤（2）中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
优选地，步骤（3）中分析RPA扩增产物的方法包括如下步骤:取RPA扩增产物与缓冲液混匀制备混合液，将试纸条上样区置于混合液中，4min-5min后观察并记录结果；结果的判定如下:若试纸条的检测线位置出现条带（即为检测线），而且质控线位置出现条带（即为质控线），则表明该样品中含有中国南瓜曲叶病毒，若试纸条仅质控线位置出现条带（即为质控带），则表明该样品中不含有中国南瓜曲叶病毒。
、有益效果
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
本发明RPA引物、探针、试剂盒及检测方法，首次将RPA技术应用到中国南瓜曲叶病毒的分子检测，其兼具特异性强、灵敏度高、实用性好、对仪器设备要求较低的特点；其中RPA引物和探针基于中国南瓜曲叶病毒外壳蛋白基因序列设计，可稳定扩增且特异性较高，对中国南瓜曲叶病毒的检测准确率高；其中试剂盒和检测方法具有较高的检测灵敏度，可在38°C下和20min内完成对中国南瓜曲叶病毒的恒温扩增和可视化检测，无需PCR仪、凝胶电泳和成像系统，极大提高检测效率，解决了现有常规检测手段所需时间较长、对仪器设备条件和实验人员素质要求高的现象。由此可见，建立的用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA检测方法操作简单且结果易判定，为中国南瓜曲叶病毒在寄主植物和媒介昆虫上的的早期诊断、监测和指导科学施药提供有力技术支持。
附图说明
图1为实施例2中国南瓜曲叶病毒RPA检测方法的建立的检测结果图；
图2为实施例3中国南瓜曲叶病毒RPA引物和探针的特异性检测结果图；
图3为实施例4中国南瓜曲叶病毒RPA引物和探针的灵敏度检测结果图；
图4为实施例5皖北南瓜生产区南瓜的中国南瓜曲叶病毒发病情况的检测结果图。
图5为实施例5皖北南瓜生产区烟粉虱的中国南瓜曲叶病毒发病情况的检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
以下实施例中使用的RPA反应管以及反应缓冲液均购自安普未来公司，商品编号WLN8203KIT；其中，重组酶、单链结合蛋白和DNA聚合酶以RPA冻干粉状态存在于RPA反应管中，使用时，用反应缓冲液溶解，整个RPA扩增反应在RPA反应管中进行。
实施例1
将中国南瓜曲叶病毒外壳蛋白基因为靶标，设计用于RPA试剂盒（安普未来公司，商品编号WLN8206KIT）的引物并进行筛选，得到扩增效率高、灵敏度和特异性最好的引物对。筛选得到的最佳引物（即为RPA引物的上下游引物）序列如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示。随后，对上述引物进行修饰，在RPA引物的下游引物5’端加入一个生物素（Biotin）标记位点，另外，根据RPA引物扩增片段设计一条大小为49 bp的探针，探针的5’端用FAM标记，3’端进行C3-Spacer修饰，且在探针中间距5’端33bp处进行THF修饰。最后根据要求筛选得到用于检测中国南瓜曲叶病毒的灵敏度高、特异性强的RPA引物和探针，它们的序列如下:
上游引物Rc-RPA-F（SEQ ID No.1）: 5'- CCTATGTTTCCCGTGCAGTTGTCCCCATTG -3'，
下游引物Rc-RPA-R（SEQ ID No.2）: 5'-Biotin-CACGATGCATGTTCTTCACCGTTGCAGTGC -3'；
探针Rc-LF-Probe（SEQ ID No.3）: FAM-TATGGATGGATGAAAATATCAAGACTAAAAAT（THF）CATACTAATAGTGTCAT-C3-Spacer；
实施例2
中国南瓜曲叶病毒RPA检测方法的建立
本实施例的用于检测中国南瓜曲叶病毒的检测方法，包括以下步骤：
（1）提取样品中的DNA；
（2）以步骤（1）提取的DNA作为待检测DNA模板，采用实施例1中所述的RPA引物和RPA探针，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
步骤（2）中RPA扩增反应的反应条件为：38℃下反应20分钟，随后冰上终止反应；
步骤（2）中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：
待检测DNA模板 1.0 μL
10μmol/L 上述所述的RPA引物的上游引物 2.1μL
10μmol/L 上述所述的RPA引物的上游引物 3.0μL
10μmol/L 上述所述的RPA探针 0.6μL
反映缓冲液 29.5μL
RPA冻干粉 5.0 mg
280 mmol/L 醋酸镁 2.5μL
ddH<sub>2</sub>O 补足至50μL
（3）分析RPA扩增产物；取10 μl RPA产物加入含有190 μl ddH2O的离心管中，混匀后，将胶体金试纸条的样品端放入离心管中，2-3 min内观察质控线与检测线判读结果。若试纸条的检测线位置出现条带，而且质控线位置出现条带，则表明该样品中含有中国南瓜曲叶病毒，若试纸条仅质控线位置出现条带，则表明该样品中不含有中国南瓜曲叶病毒。
如图1所示，分别进行阳性对照模板与阴性对照模板的试验，阳性对照模板为中国南瓜曲叶病毒的寄主植物南瓜和媒介昆虫烟粉虱DNA，阴性对照模板为ddH2O。图1中的标号“1”指的是阳性对照模板南瓜的检测结果图，可见试纸条的检测线位置出现条带，且质控线位置出现条带；图1中的标号“2”指的是阳性对照模板烟粉虱的检测结果图，可见试纸条的检测线位置出现条带，且质控线位置出现条带；图1中的标号“3”指的是阴性对照模板的检测结果图，可见试纸条仅质控线位置出现条带。
上述图1的检测结果图表明本发明RPA引物和探针可稳定扩增。
实施例3
中国南瓜曲叶病毒RPA引物和探针的特异性检测
本实施例的用于检测中国南瓜曲叶病毒的检测方法同实施例2，不同在于：
所述的样品分别为黄瓜花叶病毒（ Cucumber mosaic virus，CMV ）、黄瓜绿斑驳花叶病毒（ Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV ）、瓜类褪绿黄化病毒（Cucurbit chlorotic yellows virus，CCYV ）、西葫芦绿斑驳花叶病毒（ Zucchini greenmottle mosaic virus，ZGMMV ）、马铃薯X病毒（ Potato virus X，PVX ）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y，PVY ）、烟草曲茎病毒（ Tobacco curly shoot vitus，ToCSV ）、中国番茄黄曲叶病毒（ Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNV ）、番茄黄曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV ）、豇豆金色花叶病毒（ Cowpea golden mosaicvirus，CpGMV ）和甜瓜曲叶病毒（ Melon leaf curl virus，MLCV ）。
如图2所示，图2中的标号“ 1”指的是中国南瓜曲叶病毒的检测结果，图2中的标号“ 2”指的是黄瓜花叶病毒的检测结果、图2中的标号“3”指的是黄瓜绿斑驳花叶病毒的检测结果、图2中的标号“4”指的是瓜类褪绿黄化病毒的检测结果、图2中的标号“5”指的是西葫芦绿斑驳花叶病毒的检测结果、图2中的标号“6”指的是马铃薯X病毒的检测结果、图2中的标号“7”指的是马铃薯Y病毒的检测结果、图2中的标号“8”指的是烟草曲茎病毒的检测结果、图2中的标号“9”指的是中国番茄黄曲叶病毒的检测结果、图2中的标号“10”指的是番茄黄曲叶病毒的检测结果、图2中的标号“11”指的是豇豆金色花叶病毒的检测结果和图2中的标号“12”指的是甜瓜曲叶病毒的检测结果
上述图2的检测结果图表明，仅中国南瓜曲叶病毒的检测结果的检测线和质控线同时出现条带，而其他病菌的检测结果仅质控线位置出现条带，这表明本发明RPA引物和探针特异性较高。
实施例4
中国南瓜曲叶病毒RPA引物和探针的灵敏度检测
本实施例的用于检测中国南瓜曲叶病毒检测方法同实施例2，不同在于：
构建中国南瓜曲叶病毒的外壳蛋白基因质粒（pClone007- SLCCNV-CP），按10倍梯度依次稀释为109 copies /μL、108 copies /μL、107 copies /μL、106 copies /μL、105copies /μL、104 copies /μL、103 copies /μL、102 copies/μL、101copies/μL、100 copy/μL、negative control。
如图3所示，其标号“ 1”、“ 2”、“ 3”、“ 4”、“ 5”、“ 6”、“ 7”、“ 8”、“ 9”、“ 10”、“11”分别指的是不同浓度（109 copies /μL、108 copies /μL、107 copies /μL、106 copies/μL、105 copies /μL、104 copies /μL、103 copies /μL、102 copies/μL、101copies/μL、100copy/μL、negative control）基因组DNA的检测结果。
上述图3的检测结果图表明，中国南瓜曲叶病毒DNA的检出限为102 copies/μL。
实施例5
皖北瓜类种植区南瓜的中国南瓜曲叶病毒的发生情况
为了验证中国南瓜曲叶病毒的RPA检测技术的实用性，对采集自皖北瓜类种植区6份南瓜发病样本分别进行RPA检测，方法同实施例2。
图4为发病南瓜样本的检测结果图，标号“1”中国南瓜曲叶病毒阳性南瓜样本、“2”指的是健康南瓜、“3”、“4”、“5”、“6”、“7”、“8”、分别指的是6份田间发病南瓜样本。
上述图4的检测结果图表明，6份发病南瓜样本均能检测到中国南瓜曲叶病毒，而健康南瓜样本中未能检测到中国南瓜曲叶病毒，这表明本发明中国南瓜曲叶病毒RPA引物和探针具有较强的实用性。
实施例6
皖北瓜类种植区南瓜发病植株上烟粉虱中的中国南瓜曲叶病毒发生情况
为了验证中国南瓜曲叶病毒的RPA检测技术的实用性，对采集自皖北瓜类种植区6份媒介昆虫烟粉虱样本分别进行RPA检测，方法同实施例2。
图4为发病南瓜样本的检测结果图，标号“1”中国南瓜曲叶病毒阳性南瓜样本、“2”指的是实验室无毒烟粉虱、“3”、“4”、“5”、“6”、“7”、“8”、分别指的是6份田间发病南瓜上采集的烟粉虱。
上述图4的检测结果图表明，6份发病田间发病南瓜上采集的烟粉虱均能检测到中国南瓜曲叶病毒，而实验室无毒烟粉虱中未能检测到中国南瓜曲叶病毒，这表明本发明中国南瓜曲叶病毒RPA引物和探针检测媒介昆虫具有较强的实用性。
综上所述，由实施例1-6可见，本发明RPA引物、探针、试剂盒及检测方法，首次将RPA技术应用到中国南瓜曲叶病毒的分子检测方面，可在30min内完成中国南瓜曲叶病毒的可视化检测，极大提升了寄主植物和媒介昆虫中的中国南瓜曲叶病毒的检测效率，同时降低对仪器设备、实验人员素质的要求，为中国南瓜曲叶病毒的早期诊断、病害监测和农药减量使用提供了有力的技术支持。
以上内容是结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明，不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的构思的前提下，还可以做出若干简单的推演或替换，都应当视为属于本发明所提交的权利要求书确定的保护范围。
序列表
<110> 安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所
<120> 一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA引物、探针、试剂盒及检测方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> 中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)
<400> 1
cctatgtttc ccgtgcagtt gtccccattg 30
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)
<400> 2
cacgatgcat gttcttcacc gttgcagtgc 30
<210> 3
<211> 49
<212> DNA
<213> 中国南瓜曲叶病毒(SLCCNV)
<400> 3
tatggatgga tgaaaatatc aagactaaaa atcatactaa tagtgtcat 49

Claims (9)

1.一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA引物和RPA探针，其特征在于：
所述的RPA引物基于中国南瓜曲叶病毒外壳蛋白基因序列设计，
所述的RPA引物的上游引物如SEQ ID No:1所示，
所述的RPA引物的下游引物如SEQ ID No:2所示； 所述的PRA探针根据所述的RPA引物扩增区域设计， 所述的RPA探针的序列大小为49 bp，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的33bp处进行THF修饰。
2.根据权利要求1所述的用于检测中国南瓜曲叶病毒的RPA引物和RPA探针，其特征在于：
所述的RPA引物的下游引物包括如SEQ ID No:2所示的序列，且其5’端用Biotin修饰；所述的RPA探针包括如SEQ ID No:3所示的序列，其5’端用FAM标记，3’端用C3-Spacer修饰，且在RPA探针的序列中间距5’端的33bp处进行THF修饰。
3.一种含有权利要求1或2所述的RPA引物和RPA探针的用于检测中国南瓜曲叶病毒的试剂盒。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括RPA反应管、阴性对照模板、阳性对照模板中的至少一种。
5.一种用于检测中国南瓜曲叶病毒的检测方法，其特征在于：
包括以下步骤：
（1）提取样品中的DNA；
（2）以步骤（1）提取的DNA作为待检测DNA模板，采用权利要求1或2所述的RPA引物和RPA探针，在RPA反应管中进行RPA扩增反应；
（3）分析RPA扩增产物。
6.根据权利要求5所述的用于检测中国南瓜曲叶病毒的检测方法，其特征在于：所述的RPA引物和RPA探针的检出限为102 copies/μL。
7.根据权利要求5所述的用于检测中国南瓜曲叶病毒的检测方法，其特征在于：步骤（2）中RPA扩增反应的反应体系以50μL计为：
待检测DNA模板 1.0μL
10μmol/L 权利要求1所述的RPA引物的上游引物 2.1μL
10μmol/L 权利要求1或2所述的RPA引物的下游引物 3μL
10μmol/L 权利要求1或2所述的RPA探针 0.6μL
反应缓冲液 29.4μL
RPA冻干粉 5.0mg
280mmol/L醋酸镁 2.5μL
ddH2O 补足至50μL。
8.根据权利要求5所述的用于检测中国南瓜曲叶病毒的检测方法，其特征在于：步骤（2）中RPA扩增反应的反应条件为：38℃下反应20分钟，随后冰上终止反应。
9.根据权利要求5-8任意一项所述的用于检测中国南瓜曲叶病毒的检测方法，其特征在于：步骤（3）中分析RPA扩增产物的方法包括如下步骤：取RPA扩增产物与缓冲液混匀制备混合液，将试纸条上样区置于混合液中，4min-5min后观察并记录结果；结果的判定如下：若试纸条的检测线位置出现条带，而且质控线位置出现条带，则表明该样品中含有中国南瓜曲叶病毒，若试纸条的仅质控线位置出现条带，则表明该样品中不含有中国南瓜曲叶病毒。
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