CN111808992A - 辣椒脉斑驳病毒多基因联合检测鉴定方法 - Google Patents

辣椒脉斑驳病毒多基因联合检测鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供辣椒脉斑驳病毒多基因联合检测鉴定方法，属于植物病毒检测领域，其采用了两个引物对CP337‑F/CP337‑R、CI655‑F/CI655‑R，建立基于ChiVMV外壳蛋白（CP）与细胞质内含体（CI）两个基因的多基因联合检测体系。该方法不仅具有良好的特异性，而且灵敏度与单一RT‑PCR的灵敏度相当，均为10‑4数量级，显示出良好的检测灵敏度。本发明建立的多基因联合检测体系能在一个反应中同时检测出ChiVMV的CP及CI基因保守区片段，可以满足口岸进出境和农业生产上辣椒脉斑驳病毒的快速、准确检测需求。

Description

辣椒脉斑驳病毒多基因联合检测鉴定方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及辣椒脉斑驳病毒多基因联合检测鉴定方法。
背景技术
辣椒（Capsicum annuum L.）是茄科辣椒属一年或有限多年生草本植物，原产于中南美洲热带地区，在世界范围内广泛种植。在我国，辣椒种植面积高达140 hm2以上，约占我国所有蔬菜种植面积的10%。病毒病是辣椒作物上的一类重要病害，严重影响辣椒作物的品质和产量，目前世界各地陆续报道的辣椒病毒有70种以上，而我国发现至少有37种，其中辣椒脉斑驳病毒（Chilli veinal mottle virus, ChiVMV）是辣椒上重要病毒之一，其传播速度快且危害大，侵染辣椒能造成严重的经济损失。ChiVMV是一种正义单链RNA病毒，属马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员，其基因组全长约9711个核苷酸，粒体形态呈弯曲线状。该病毒最早是1979年于马来西亚被报道，在我国最早发现于海南的黄灯笼椒上，随后在陕西、云南、福建、湖南等地区被发现并报道。ChiVMV侵染辣椒的典型症状为叶脉呈暗绿色条纹，叶片皱缩、畸形，植株矮小，结果前落花落果，仅留下少量杂色畸形果。该病毒的自然寄主主要为辣椒、番茄等茄科作物，自然条件下主要依靠蚜虫进行非持久性传播。除此之外，ChiVMV还可以通过机械传播和汁液传播，但不能通过种子传播。由于该病毒常与其他病毒复合侵染，且不同病毒侵染后症状也较为相似，因此建立一种可靠、高效的检测鉴定方法显得尤为重要。
近年来，国内外关于ChiVMV的研究报道越来越多，且已有多种成熟的技术用于该病毒的检测与鉴定，如Ravi等利用电镜对提纯后的病毒进行观察首次报道了该病毒粒体形态；Siriwong等通过对该病毒泰国分离物的血清学研究，发现其与ChiVMV分离物抗血清存在强烈的阳性反应；Moury 等根据不同辣椒病毒的核内含体蛋白b（Nuclear inclusionbody protein,NIb）及外壳蛋白（Coat protein, CP）基因序列相互比较并设计引物，通过RT-PCR的特异性片段区分了ChiVMV与其他辣椒病毒；唐前君等通过建立能够同时检测包含ChiVMV等4种辣椒病毒的四重RT-PCR检测体系，提高了辣椒病毒病复合侵染的检测效率；汤亚飞等]依据CP基因设计了能检测ChiVMV的RT-LAMP引物，建立了ChiVMV的RT-LAMP检测体系，后又利用小RNA深度测序及RT-PCR的方法鉴定了包括ChiVMV在内侵染广东省辣椒的8种病毒。由于Potyvirus的不同病毒之间可能存在非常高的亲缘关系，无法实现ChiVMV的快速、准确检测与鉴定。例如ChiVMV与甜椒脉斑驳病毒 （Pepper veinal mottle virus,PVMV）之间在系统发育上亲缘关系非常近，且两者CP基因的C末端有一段长204个氨基酸的保守区，序列一致性超过90.2%，应用传统的血清学容易产生交叉反应。因此生产上建立一种基于多基因联合快速、准确检测ChiVMV的方法尤为迫切。
多基因联合检测是一种特殊的多重RT-PCR扩增方法，该方法通过选取两个或多个靶基因，分别设计引物，通过反应体系的构建、优化从而建立起针对两个或多个靶标基因的快速检测体系，多基因联合PCR检测相比于常规PCR具有更高的准确性和可靠性。多基因联合检测的方法现广泛用于病原菌的快速检测与鉴定，谯天敏等利用factor 1-α(tef1)和β-tubulin两个保守基因，建立了水稻叶鞘网斑病的双基因联合PCR检测技术；刘真真等应用mecA、femB基因联合PCR扩增法提高了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检出效率。在植物病毒的检测中，相对保守的CP基因是最为常用的分子标记，而Adams等发现Potyvirus属的CI基因相对于CP基因更为保守，因此也可以用于区分不同病毒种。截止目前，尚未有多基因联合检测的方法应用于检测ChiVMV的研究报道。本发明针对ChiVMV已报道序列的CI与CP基因设计、筛选引物，建立ChiVMV的多基因检测体系，以实现ChiVMV的快速、准确检测。通过设计、筛选引物，对建立的多基因联合检测体系进行反应条件和参数的优化，以提高ChiVMV的检测效率和准确率，旨在为辣椒生产上以及口岸检疫中ChiVMV的快速、准确检测提供可靠的技术支持。
发明内容
本发明的目的在于提供辣椒脉斑驳病毒多基因联合检测鉴定方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
根据GenBank已登录的ChiVMV的CI和CP基因序列，设计、筛选用于RT-PCR检测以及多基因联合检测所需的引物，所述引物包含两对引物：具体为：
CP337-F: ACACCTTCTTGATTATGCTCC，
CP337-R: ATAAGGCTTCTCAGAATTGCG；
CI655-F: ACAGCRCCAGATGCAAAATC，
CI655-R: CCTGTGCCYTGYGCATCMA。
以含ChiVMV阳性样品cDNA为模板，取相同浓度的两个引物对 CP337-F/CP337-R、CI655-F/CI655-R进行反应，初步建立基于ChiVMV CP与CI两个基因的多基因联合检测体系。25 μL总反应体系，其中cDNA 2μL、CP337-F/ CP337-R 各0.625 μL (10 μmol/L)、CI655-F/CI655R 各1.375 μL (10 μmol/L)、2×PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O 6.5 μL。94 ℃、3min； 94 ℃、30s，50 ℃、45 s，72 ℃、1 min，共35个循环，72 ℃延伸10 min。取PCR产物5μL用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察凝胶电泳结果。
本发明的优点在于：
本发明根据ChiVMV的CP和CI两个基因设计引物，筛选了Tm值相近、片段大小差异显著的两对引物，通过优化退火温度、引物浓度等反应条件，建立了能够同时检测扩增CP、CI两个基因片段的多基因联合检测方法。该方法与单一常规RT-PCR扩增结果一致，具有良好的特异性；灵敏度也与单一的RT-PCR灵敏度相同，均为10-4数量级，显示出良好的检测灵敏度。
带病植株的调运容易造成病毒的远距离传播，且不同地区间病毒存在很强的地区适应性，一旦传入易造成定殖和传播，为保护我国辣椒产业的健康发展，应实施严格的检疫，防止国外辣椒病毒的传入。本发明建立的多基因联合检测体系能在一个反应中同时检测出ChiVMV的CP及CI基因保守区片段，可以满足口岸进出境ChiVMV的快速、准确检测需求，而且能够有效用于农业生产上ChiVMV的检测鉴定。
附图说明
图1 印度进境辣椒常规RT-PCR扩增结果，其中，M:DNA分子量标准；1：供试辣椒样品；2-4：阳性对照、阴性对照和空白对照。
图2 多基因联合检测RT-PCR结果，其中，M: DNA分子量标准；1：CP 基因单独扩增产物； 2：CI基因单独扩增产物；3：多基因联合检测；4：单独扩增CP 基因的阴性对照；5：单独扩增CI 基因的阴性对照；6：多基因联合检测的阴性对照。
图3 多基因联合检测体系退火温度的优化，其中，M：DNA分子量标准；1-6：退火温度分别为46℃、48℃、50℃、52℃、54℃和56℃；7：阴性对照。
图4 多基因联合检测体系引物浓度的优化，其中M：DNA分子量标准；1-9：组合T1-T9；10：阴性对照。
图5 多基因联合检测特异性，其中a.多基因联合检测；b.基于CP 基因的PCR检测；c.基于CI基因PCR检测。M：DNA分子量标准；1：辣椒脉斑驳病毒；2-5：辣椒环斑病毒（Chilli ringspot virus, ChiRSV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）、辣椒脉黄化病毒（Pepper vein yellows virus, PeVYV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）；6：阴性对照。
图6 多基因联合检测灵敏度，其中a.多基因联合检测；b.基于CP 基因的PCR检测；c.基于CI基因PCR检测。M：DNA分子量标准；1-8：100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7；9：阴性对照。
图7 多基因联合检测辣椒样品，其中a. M：DNA分子量标准；1：阳性对照；2-6：福州郊区辣椒样品；7-16：福清辣椒样品；17：阴性对照；b. M：DNA分子量标准；1：阳性对照；2-16：福清地区辣椒样品；17：阴性对照。
图8 普通RT-PCR检测辣椒样品，其中a. M：DNA分子量标准；1：阳性对照；2-6：福州郊区辣椒样品；7 -16：福清辣椒样品；17：阴性对照；b. M：DNA分子量标准；1：阳性对照；2-16：福清地区辣椒样品；17：阴性对照。
具体实施方式
供试样品为2016年3月福建口岸截获的印度进境辣椒、2019年3月福州郊区田间采集的辣椒样品和2019年4月福清地区田间采集的辣椒样品，均由福州海关技术中心保存。同时，供试的辣椒环斑病毒（Chilli ringspot virus, ChiRSV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）、辣椒脉黄化病毒（Pepper vein yellows virus, PeVYV）、马铃薯Y病毒（Potato virus Y, PVY）病毒阳性样品为福州海关技术中心保存。
引物设计：
根据GenBank已登录的ChiVMV的CI和CP基因序列，设计用于RT-PCR检测以及多基因联合检测所需的引物，引物由上海铂尚生物技术有限公司合成。
表1 本研究中辣椒样品病毒检测所用引物
Figure 610939DEST_PATH_IMAGE001
a, 用于常规RT-PCR检测；b, 用于多基因联合检测。
实施例1印度进境辣椒样品的血清学和常规RT-PCR检测
每个辣椒样品称取0.1 g，参照病毒试剂盒说明书进行DAS-ELISA检测，用多功能酶标仪测定其405 nm下的光密度值（OD），当样品OD405 nm与阴性对照OD405 nm比值大于2时，即判定为阳性。其中，本实施例设携带ChiVMV的样品材料为阳性对照，健康辣椒为阴性对照，提取缓冲液为空白对照。
采用Trizol 试剂法提取侵染ChiVMV的辣椒阳性样品，提取方法参考试剂盒说明书进行。取3 μL总RNA，加入1 μL随机引物（Random Primer）按照操作说明书进行反转录获得cDNA。PCR扩增采用25μl反应体系：cDNA 2 μL、10 μmol/L CP861-F/ CP861-R上下游引物各1 μL、2×PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL。PCR反应条件：94℃、 3min；94 ℃、30s，55 ℃、45 s，72℃、1min，共35个循环，72℃延伸10 min。反应结束后，取PCR产物5 μL用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
利用ChiVMV特异性引物（CP861-F/CP861-R）对血清学检测到ChiVMV的阳性样品进行常规RT-PCR检测，结果扩增到大小约861 bp的目的片段（图1），与预期相符，而阴性对照和空白对照中均未扩增出目的片段。
实施例2多基因联合检测体系的建立及其优化
以含ChiVMV阳性样品cDNA为模板，取相同浓度的两个引物对 CP337-F/CP337-R、CI655-F/CI655-R进行反应，初步建立基于ChiVMV CP与CI两个基因的多基因联合检测体系。25 μL总反应体系，其中cDNA 2μL、10 μmol/L两个引物对各1μL、2×PCR Master Mix12.5 μL、ddH2O 6.5 μL。94 ℃、3min；94 ℃、30s，50 ℃、45 s，72 ℃、1 min，共35个循环，72 ℃延伸10 min。取PCR产物5 μL用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察凝胶电泳结果。
根据凝胶电泳结果对反应体系进行部分优化，根据两对引物的Tm值，对反应条件的退火温度进行优化，设置46 ℃、48 ℃、50 ℃、52 ℃、54 ℃、56 ℃共6个温度梯度，根据凝胶电泳结果，选取最优的退火温度。
在优化退火温度反应条件的基础上，为保证两对引物扩增条带亮度、效果基本一致，适当调整两对引物的用量，设置九个不同的引物浓度组合（表2），根据凝胶电泳结果，寻找最优的两对引物浓度组合，建立多基因联合检测体系。
表2 不同梯度组合及引物用量
Figure 780889DEST_PATH_IMAGE002
利用CP337-F/CP337-R、CI655-F/CI655-R两对引物分别进行RT-PCR扩增及多基因联合检测，结果显示（图2），多基因联合检测体系扩增出与预期大小一致的CP基因及CI基因两个片段，大小分别约为337 bp和655 bp，与两基因单独扩增效果一致，且无非特异性扩增。不同退火温度梯度下扩增结果表明（图3），在6个温度梯度下均能获得清晰且特异的目的条带，其中50℃为最佳退火温度。针对两对引物设置不同的用量组合，结果显示（图4），T8组合效果最佳，即CP337-F/CP337-R用量各 0.625 μL、CI655F/CI655R 用量为1.375 μL时，扩增出两核酸片段亮度、大小基本一致，因此，该反应体系优化的各参数最终确定为cDNA 2μL、CP337-F/ CP337-R 各0.625 μL (10 μmol/L)、CI655-F/CI655R 各1.375 μL (10 μmol/L)、2×PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O 6.5 μL，反应条件为94 ℃、3min，94 ℃、30 s，50℃、45 s，72 ℃、1min，共35个循环，72 ℃延伸10 min。
实施例3多基因联合检测特异性及其灵敏度检测
分别以ChiVMV、ChiRSV、CMV、PeVYV、PVY病毒阳性样品为材料，提取RNA后按照建立的多基因联合检测方法进行检测，同时采用单个基因进行常规RT-PCR检测，测定多基因联合检测方法的特异性。
将反转录后辣椒样品cDNA按10倍梯度稀释，原溶液依次稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，按照建立的多基因联合检测方法进行检测，同时采用单个基因进行常规RT-PCR灵敏度检测，两者进行对比，以测定多基因联合检测方法的灵敏度。
经优化之后的多基因联合检测体系能够从ChiVMV上同时扩增出CP基因及CI基因的目的片段，且未出现非特异性扩增，而其他辣椒主要病毒均未扩增出相应的条带（图5）；同时，两个基因片段的PCR产物经回收纯化后进行克隆测序，所测的序列与已报道的ChiVMV序列一致性均高达98%以上，表明所扩增出的2条带均为特异性产物。因此，该多基因联合检测体系具有良好的特异性。
灵敏度测定结果表明，当阳性样品cDNA模板浓度稀释至10-4时，优化之后的多基因联合检测体系样品仍能扩增出大小为300 bp和600 bp左右清晰可见的条带（图6a），灵敏度与CP和CI基因单独RT-PCR的灵敏度相当，检测下限均为稀释至10-4倍的阳性样品cDNA（图6b-6c），说明该多基因联合检测体系具有较高的灵敏度。
实施例4 多基因联合检测体系检测辣椒带毒样品
利用本发明建立的多基因联合检测体系和常规RT-PCR对田间采集的辣椒样品进行检测，样品信息如表3所示。多基因联合检测方法扩增结果显示，福州郊区田间采集的5个样品均样品能够扩增出大小为300 bp和600 bp左右的2个特异性条带，与预期的337 bp和655bp的大小相吻合，福清地区采集的25个样品均未扩增出目的条带（图7）。常规RT-PCR方法验证结果与多基因联合检测体系检测结果完全一致，福州郊区田间采集的5个样品能够扩增出861 bp的条带，福清地区采集的25个样品均未扩增出条带（图8）；上述结果表明该多基因联合检测体系能够准确用于ChiVMV的实际检测。
表3 用于多基因联合检测辣椒样品信息
Figure 739880DEST_PATH_IMAGE003
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建农林大学
福州海关技术中心
<120> 辣椒脉斑驳病毒多基因联合检测鉴定方法
<130> 6
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
acaccttctt gattatgctc c 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ataaggcttc tcagaattgc g 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
acagcrccag atgcaaaatc 20
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cctgtgccyt gygcatcma 19
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
gcaggagaga gtgttgatgc 20
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caatcctcga acgcccagca g 21

Claims (3)

1.辣椒脉斑驳病毒多基因联合检测鉴定引物，其特征在于：所述引物包含两个引物对，具体为：CP337-F: ACACCTTCTTGATTATGCTCC，CP337-R: ATAAGGCTTCTCAGAATTGCG；
CI655-F: ACAGCRCCAGATGCAAAATC，CI655-R: CCTGTGCCYTGYGCATCMA。
2.利用权利要求1所述引物用于辣椒脉斑驳病毒多基因联合检测鉴定方法，其特征在于：以含辣椒脉斑驳病毒阳性样品cDNA为模板，取权利要求1中相同浓度的两个引物对CP337-F/CP337-R、CI655-F/CI655-R进行反应，25 μL总反应体系：cDNA 2μL、10 μmol/LCP337-F/ CP337-R 各0.625 μL、CI655-F/CI655R各1.375 μL、2×PCR Master Mix 12.5 μL、ddH2O 6.5 μL；反应条件为94 ℃、3min，94 ℃、30 s，50 ℃、45 s，72 ℃、1min，共35个循环，72 ℃延伸10 min；取PCR产物5 μL用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测，观察凝胶电泳结果。
3.如权利要求1所述的引物在检测辣椒脉斑驳病毒中的应用。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112195288A (zh) * 2020-11-19 2021-01-08 广西壮族自治区农业科学院 同时检测辣椒四种病毒的多重rt-pcr引物组及其方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080172766A1 (en) * 2005-04-08 2008-07-17 De La Recherche Agronomique Methods for Detecting Isolates of the Potato Virus (Pvy) Responsible for Necroses
CN103667529A (zh) * 2013-12-03 2014-03-26 中国检验检疫科学研究院 番茄斑萎病毒的液相芯片检测引物及检测方法
CN105177188A (zh) * 2015-10-22 2015-12-23 湖南农业大学 同时检测多种辣椒病毒的四重rt-pcr检测引物及方法
CN105274258A (zh) * 2015-11-27 2016-01-27 湖南省植物保护研究所 用于检测辣椒斑驳病毒的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用
CN109880934A (zh) * 2019-02-26 2019-06-14 福清出入境检验检疫局综合技术服务中心 一种辣椒脉斑驳病毒检疫鉴定方法

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080172766A1 (en) * 2005-04-08 2008-07-17 De La Recherche Agronomique Methods for Detecting Isolates of the Potato Virus (Pvy) Responsible for Necroses
CN103667529A (zh) * 2013-12-03 2014-03-26 中国检验检疫科学研究院 番茄斑萎病毒的液相芯片检测引物及检测方法
CN105177188A (zh) * 2015-10-22 2015-12-23 湖南农业大学 同时检测多种辣椒病毒的四重rt-pcr检测引物及方法
CN105274258A (zh) * 2015-11-27 2016-01-27 湖南省植物保护研究所 用于检测辣椒斑驳病毒的引物组合物及其应用、由其组成的试剂盒及试剂盒的应用
CN109880934A (zh) * 2019-02-26 2019-06-14 福清出入境检验检疫局综合技术服务中心 一种辣椒脉斑驳病毒检疫鉴定方法

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112195288A (zh) * 2020-11-19 2021-01-08 广西壮族自治区农业科学院 同时检测辣椒四种病毒的多重rt-pcr引物组及其方法
CN112195288B (zh) * 2020-11-19 2024-04-26 广西壮族自治区农业科学院 同时检测辣椒四种病毒的多重rt-pcr引物组及其方法

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