CN111424118B - 一种西番莲病毒病原多重复合pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法，包括以下步骤：提取样本总RNA；设计用于扩增西番莲中重要病毒病原黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒4种病毒基因片段的特异性引物；在无RNA酶的PCR管中加入提取的西番莲植物总RNA样品1~3μg高温变性获得病毒RNA作为模板进行逆转录反应合成cDNA第一链；利用单管多重PCR扩增反应得到PCR扩增产物；将获得的PCR扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。本发明应用黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒4种病毒特异引物可以同时在单PCR管中检测4种西番莲主要病毒，特异性、简便性、灵敏度和准确性较单一病毒或两种病毒检测有较大的优势。
Description
技术领域
本发明属于检测技术领域，进一步属于植物病毒学检测技术领域，具体涉及一种西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法。
背景技术
西番莲（Passiflora edulis L.）属于山茶亚目（Theoideae）西番莲科（Passifloraceae）西番莲属（Passiflora L.），有 530 多个种（Munhoz et al., 2018）。俗称百香果、激情果、番石榴、巴西果等，原产南美洲巴西和阿根廷。近年来作为国内水果市场的“新宠”，西番莲在中国台湾、福建、广东、广西、海南和云南等地区栽培推广，其商业化品种主要有紫果、黄果、黄果与紫果杂交品种等 3 大类，其中紫果品种在我国栽培面积最大。西番莲具有很高的营养价值，富含糖类、脂肪、蛋白质、维生素和矿质元素等物质。其果汁占鲜果重量的35%～38%，果皮占 50%～55%，种子占 5%～8%；干果皮中含果胶 20%，粗纤维25%。西番莲果汁具有芒果、石榴、柠檬等多种水果的浓郁香味，风味独特，具有“果汁之王”的美称。
西番莲生产种植过程中，真菌、细菌和病毒病害对其产质量造成重要影响。病毒病是西番莲生产上的第二大病害。目前已发现包括马铃薯Y病毒科、雀麦花叶病毒科、双生病毒科、芜菁黄花叶病毒科、乙型线状病毒科和帚状病毒科约20余种病毒可侵染西番莲。这些植物病毒病原侵染西番莲后，植株会表现出典型的病毒病症状，包括叶片花叶、黄化、小叶、畸形，果皮变厚变硬、着色异常，果肉少或无，植株矮化等，严重影响果树的产质量。
通过茎尖剥离脱毒技术可以脱除种苗中大部分病毒，该方法被用于马铃薯、果树、花卉等多种无性繁殖的农经作物。随着种植户对西番莲种苗需求量爆发式增长，大量西番莲组培苗涌向市场，但其种苗带毒情况是不清楚的，为了明确脱毒种苗、田间植株以及环境中各种病原重要中间寄主的带毒情况，研究并应用一套准确、简便、灵敏、经济的检测方法用于种苗脱毒筛选和田间病原检测。根据前期对各地西番莲田间植株、种苗及组培苗等样品的检测，以下4种病毒是目前为害最严重、发生区域较广泛，检出率最为普遍的病毒病原。
发明内容
本发明的目的在于提供一种西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法。
本发明的目的是这样实现的，所述的西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法包括以下步骤：
A、提取样本总RNA；
B、设计用于扩增西番莲中重要病毒病原黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒4种病毒基因片段的特异性引物；
C、在无RNA酶的PCR管中加入提取的西番莲植物总RNA样品1~3μg高温变性获得病毒RNA作为模板进行逆转录反应合成cDNA第一链；
D、利用单管多重PCR扩增反应得到PCR扩增产物；
E、将获得的PCR扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus, CMV）
感染西番莲的黄瓜花叶病毒属病毒主要为该属典型代表种黄瓜花叶病毒（cucumber mosaic virus, CMV），属于雀麦花叶病毒科（Bromoviridae）黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）。该病毒具有非常宽的寄主范围，可通过多种蚜虫以非持久方式传播侵染1000多种双子叶和单子叶植物，也可经汁液接触而机械传播，少数可由种子或者土壤传播。病毒粒子为等轴对称的二十面体，无包膜，三个组分的粒子大小一致，直径为28～30 nm。病毒含有三个独立的RNA，即RNA1、RNA2、RNA3，每个RNA单独编码蛋白，其外壳蛋白由RNA3的亚基因组RNA4编码，通常还存在卫星RNA分子。 Anon等首次报道CMV引起西番莲花叶病及果实木质化。我国先后在广东、福建、海南等西番莲病株上检测到CMV。
西番莲木质化病毒（passion fruit woodiness virus，PWV）
马铃薯Y病毒属（Potyvirus）属于马铃薯Ｙ病毒科（Potyviridae），其病毒粒子为线状病毒，长度680～900 nm，宽度12～15 nm。病毒粒子为正单链RNA 分子，大约10K bp，编码一个多聚蛋白。该属病毒常引起花叶、皱缩、木质化，分布较广且造成严重经济损失。主要通过蚜虫非持久性非循环传播，此外病毒还可通过嫁接传播或刀具、剪刀类机械传播[7]。Potyvirus多种病毒可侵染西番莲，主要包括豇豆蚜传花叶病毒(Cow-pea aphid-borne mosaic virus，CABMV)、西番莲环斑病毒(Passion fruit ringspot virus，PFRSV)、菜豆黄花叶病毒(Bean yellow mosaic virus，BYMV)、西番莲斑驳病毒(Passion fruit mottle virus，PaMV)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus，SMV)、西番莲Y病毒(Passiflora virus Y，PaVY)、马来西亚西番莲病毒(Malaysian Passiflora virus，MPV)、夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus，TeMV)。
西番莲木质化病毒（passion fruit woodiness virus，PWV）属于Potyvirus成员，其引起西番莲木质化病，目前该病害是西番莲生产中为害最大的病毒性病害之一。感病植株典型症状为整株长势弱小，叶片扭曲、皱缩、花叶，有时会伴随瘤状突起。果实木质化，果皮变厚。该病于1901年首次报道于澳大利亚，随后陆续报道于巴西、南非、日本、中国和乌干达等国，1973年证实为病毒侵染引起的病害。该病毒种下单元存在不同株系分化。根据不同寄主症状反应，可分为PWV-TB、PWV-S强毒株和PWV-M弱毒株。澳大利亚最早发现侵染西番莲的马铃薯Y病毒属病毒——西番莲木质化病毒(Passiflora woodiness virus, PWV)，但PWV不造成花叶。
夜来香花叶病毒（Telosma mosaic virus, TeMV）
夜来香花叶病毒（Telosma mosaic virus, TeMV）也属于马铃薯Y病毒属（Potyvirus）成员。2014年，在泰国首次发现田间种植的西番莲上出现类似病毒病症状，叶片表现不同程度的花叶，果形变小，果皮皱缩，着色异常，失去经济价值。感病植株组织内可观察到典型曲线状类马铃薯Ｙ病毒属病毒粒体结构，细胞质中可观察到病毒内涵体。经过CP基因及蛋白序列一致性比对发现，该病毒与在越南发现夜来香上的夜来香花叶病毒（Telosma mosaic virus, TeMV）具有最高的同源性，因此确定为TeMV的一个株系。目前，通过症状观察、血清学检测、电镜观察，我国广西西番莲产区也有夜来香花叶病毒。
芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus, TuMV）
芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus, TuMV）也属于马铃薯Y病毒属成员（Potyvirus），是危害蔬菜最严重的5 种病毒之一，寄主范围非常广泛，可侵染 43科156属的300多种植物。被侵染的植株初期表现为花叶、明脉、皱缩，后期出现矮化、畸形等症状，严重影响作物的产量和品质。自然状态下TuMV主要通过蚜虫以非持久性方式传播，人工接种也可以通过摩擦传毒。带毒蚜虫、田间带病毒十字花科等作物及杂草是大田传播的主要毒源。
近年来在云南各地田间调查发现，在西番莲在整个生长期，病毒病发生危害普遍且严重影响了产质量，经系统检测鉴定，这一时期主要病原为黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒，但对组培苗、田间植株难以通过症状区分，因此无法制定有效的病害预防措施；在研究病害侵染循环和病害发生早期，利用血清学检测方法检测时，其检测灵敏度不能较好地确定不同病毒的侵染情况，因此，需要建立一种可以大量、快速、准确、灵敏的检测方法对不同时期病样以及田间周边环境中病毒传播介体、中间寄主等进行检测。
基于4病毒全基因组核苷酸序列的多重PCR检测是目前应用较广泛的同时检测多种病毒的方法。通过提取植物总RNA；应用随机引物进行反转录；同时加入4种病毒引物进行聚合酶链式反应三个部分组成。
本发明应用多引物复合反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）结合，通过提取植物总RNA、随机引物合成不同种类病毒cDNA第一链、4种病毒特异引物多重复合PCR检测，省略了单一病毒引物逆转录合成cDNA第一链和病毒核苷酸序列测定与分析等步骤，利用多重PCR的快速和灵敏性获得目的片段，为大量、快速、准确、灵敏检测各类西番莲病样建立了一种科学的方法。
本发明的技术方案如下：
（1）应用Trizol试剂提取待测样品总RNA；
（2）高温变性获得病毒RNA作为模板，利用9个单核苷酸碱基的随机引物进行逆转录反应，合成cDNA链；
（3）利用黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒4种病毒特异引物对进行多重复合PCR反应；
（4）琼脂糖凝胶电泳检测。
结果分析：随机引物逆转录反应合成cDNA第一链，4种病毒特异性引物组合扩增样品中不同种类病毒，产物经琼脂糖电泳，根据片段大小：芜菁花叶病毒阳性样品中可扩增出大小约597bp的目的片段；黄瓜花叶病毒阳性样品中可扩增出大小739bp的目的片段；西番莲果实木质化病毒阳性样品中可扩增出大小约355bp的目的片段；夜来香花叶病毒阳性样品中可扩增出大小461bp的目的片段。根据不同样品中目的片段的有无、大小差异，快速、特异的确定西番莲样品中待测4种病毒种类及数量。
本发明的方法应用多重复合RT-PCR，从而快速、特异的检测西番莲样品中的黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒。
本发明的优点：应用黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒4种病毒特异引物可以同时在单PCR管中检测4种西番莲主要病毒，特异性、简便性、灵敏度和准确性较单一病毒或两种病毒检测有较大的优势。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。
本发明所述的西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法包括以下步骤：
A、提取样本总RNA；
B、设计用于扩增西番莲中重要病毒病原黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒4种病毒基因片段的特异性引物；
C、在无RNA酶的PCR管中加入提取的西番莲植物总RNA样品1~3μg高温变性获得病毒RNA作为模板进行逆转录反应合成cDNA第一链；
D、利用单管多重PCR扩增反应得到PCR扩增产物；
E、将获得的PCR扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
所述的提取样本总RNA是取新鲜或低温保存待测样品50~150mg，应用Trizol试剂1~1.5ml，提取植物总RNA，溶解于20~30μl DEPC处理的灭菌水中，-80℃下保存备用。
所述的用于扩增西番莲中重要病毒病原黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒4种病毒基因片段的特异性引物如下：
1）黄瓜花叶病毒特异引物：
CMV-312F：5′-GGTCGTATTGCTTCCTTCT-3′；
CMV-1050R：5′-GATGTCTACTGTATCAACTCAC-3′；
2）芜菁花叶病毒特异引物：
TuMV-8229F：5′-GCGACAGCATCATCAGAT-3′；
TuMV-8825R：5′-TCTCCTTCTTCTCCTTCTCT-3′；
3）西番莲果实木质化病毒特异引物：
PWV-9F：5′-CCAACTCCACAACGACAT-3′；
PWV-363R：5′-CCTTCACAGCCATCTTCC-3′；
4）夜来香花叶病毒特异引物：
TeMV-3775F：5′-GTAAGGAACCAACAGCAATG-3′；
TeMV-4235R：5′-GCACTCGTCTATGATGATGT-3′。
所述的PCR扩增反应的反应体系为50μL，10 倍Taq酶缓冲液5 μL、10 mmol/L 浓度的4对种引物各1 μL、2.5 mmol/L dNTPs 3 μL、cDNA 5 μL、Taq酶 1 μL、灭菌超纯水28μL。
所述的PCR扩增反应的反应条件为：94℃预变性3-5min；94℃变性40 s， 60℃退火30 s，72℃延伸1min，30-40个循环；最后72℃延伸10 min。
所述的琼脂糖凝胶电泳检测的特征为应用0.5倍TBE缓冲液配置1.0% 琼脂糖凝胶，按1/10的比例加入M5 Gelred Plus 核酸染料，取10 μL PCR反应液，加1 μL 6倍上样缓冲液，混合均匀后点样。电泳参数为电压120V/cm、电泳时间约为30-40 min，于紫外成像仪中观察、记录。
实施例1
1、引物设计：
根据GenBank中黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒4种病毒全基因组核苷酸序列，选择单一病毒中较为保守的区域设计引物，不同病毒间试验优化不同引物对间的内部配对、聚合等影响，筛选可用于复合PCR的不同病毒检测引物对（附表1）。
表1 用于多重复合PCR检测的黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒引物对
2、随机引物逆转录合成cDNA链
随机引物逆转录反应体系20 μL，高温变性获得病毒RNA模板时，加4 μL 5倍逆转录缓冲液和9 μL DEPC处理水至上述处理的PCR管中，手指轻弹2-3 min后短暂离心，加入10mmol/L 6个单核苷酸碱基随机引物（引物序列为：5′-(P)NNNNNN-3′）2 μL,充分混匀后短暂离心，65℃中放置5min，即刻将PCR管插入冰内放置5min，依次加入10 mmol/L dNTPs 4 μL、鼠源逆转录酶0.5 μL、RNA酶抑制剂0.5 μL，30 ℃反应10min后 40 ℃反应50 min，反应完成后PCR管（含20 μL反应液）4 ℃保存待用。
3、多重复合PCR检测
在上述PCR管内（含20 μL反应液）应用黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒4种病毒特异引物对进行复合PCR反应，PCR反应体系为50 μL，其中10 倍Taq酶缓冲液5 μL、10 mmol/L 浓度的6种引物（详见表1）各1 μL、2.5 mmol/LdNTPs 3 μL、Taq酶 1 μL、灭菌超纯水15 μL。反应条件为94℃预变性4min；94℃变性1min，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10 min。
4、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳检测特征为应用0.5倍TBE缓冲液配置1.0% 琼脂糖凝胶，按1/10的比例加入M5 Gelred Plus 核酸染料，取10 μL PCR反应液，加1 μL 6倍上样缓冲液，混合均匀后点样。电泳参数为电压120V/cm、电泳时间约为30-40 min，于紫外成像仪中观察、记录。
5、判定标准
芜菁花叶病毒阳性样品中可扩增出大小约597bp的目的片段；黄瓜花叶病毒阳性样品中可扩增出大小739bp的目的片段；西番莲果实木质化病毒阳性样品中可扩增出大小约355bp的目的片段；夜来香花叶病毒阳性样品中可扩增出大小461bp的目的片段。根据样品中目的片段的有无、大小差异，快速、特异的确定烟草样品中待测4种病毒种类及数量。
SEQUENCE LISTING
<110> 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所
<120> 一种西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法
<130> 2020
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> CMV-312F
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ggtcgtattg cttccttct 19
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> CMV-1050R
<400> 2
gatgtctact gtatcaactc ac 22
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<212> DNA
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<400> 3
gcgacagcat catcagat 18
<210> 4
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<400> 4
tctccttctt ctccttctct 20
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> PWV-9F
<400> 5
ccaactccac aacgacat 18
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> PWV-363R
<400> 6
ccttcacagc catcttcc 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> TeMV-3775F
<400> 7
gtaaggaacc aacagcaatg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> TeMV-4235R
<400> 8
gcactcgtct atgatgatgt 20
Claims (3)
1.一种西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法，其特征在于所述的西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法包括以下步骤：
A、提取样本总RNA；
B、设计用于扩增西番莲中重要病毒病原黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒4种病毒基因片段的特异性引物；所述的用于扩增西番莲中重要病毒病原黄瓜花叶病毒、芜菁花叶病毒、西番莲果实木质化病毒、夜来香花叶病毒4种病毒基因片段的特异性引物如下：
1）黄瓜花叶病毒特异引物：
CMV-312F：5′-GGTCGTATTGCTTCCTTCT-3′；
CMV-1050R：5′-GATGTCTACTGTATCAACTCAC-3′；
2）芜菁花叶病毒特异引物：
TuMV-8229F：5′-GCGACAGCATCATCAGAT-3′；
TuMV-8825R：5′-TCTCCTTCTTCTCCTTCTCT-3′；
3）西番莲果实木质化病毒特异引物：
PWV-9F：5′-CCAACTCCACAACGACAT-3′；
PWV-363R：5′-CCTTCACAGCCATCTTCC-3′；
4）夜来香花叶病毒特异引物：
TeMV-3775F：5′-GTAAGGAACCAACAGCAATG-3′；
TeMV-4235R：5′-GCACTCGTCTATGATGATGT-3′；
C、在无RNA酶的PCR管中加入提取的西番莲植物总RNA样品1~3μg高温变性获得病毒RNA作为模板进行逆转录反应合成cDNA第一链；
D、利用单管多重PCR扩增反应得到PCR扩增产物；所述的PCR扩增反应的反应体系为50μL，10 倍Taq酶缓冲液5 μL、10 mmol/L 浓度的4对种引物各1 μL、2.5 mmol/L dNTPs 3 μL、cDNA 5 μL、Taq酶 1 μL、灭菌超纯水28μL；所述的PCR扩增反应的反应条件为：94℃预变性3-5min；94℃变性40 s， 60℃退火30 s，72℃延伸1min，30-40个循环；最后72℃延伸10min；
E、将获得的PCR扩增产物进行2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.根据权利要求1所述的西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法，其特征在于所述的提取样本总RNA是取新鲜或低温保存待测样品50~150mg，应用Trizol试剂1~1.5ml，提取植物总RNA，溶解于20~30μl DEPC处理的灭菌水中，-80℃下保存备用。
3.根据权利要求1所述的西番莲病毒病原多重复合PCR检测方法，其特征在于所述的琼脂糖凝胶电泳检测的特征为应用0.5倍TBE缓冲液配置1.0% 琼脂糖凝胶，按1/10的比例加入M5 Gelred Plus 核酸染料，取10 μL PCR反应液，加1 μL 6倍上样缓冲液，混合均匀后点样；电泳参数为电压120V/cm、电泳时间为30-40 min，于紫外成像仪中观察、记录。
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
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