CN108060267A

CN108060267A - 一种检测芜菁花叶病毒所用pcr引物及其检测方法

Info

Publication number: CN108060267A
Application number: CN201711426414.0A
Authority: CN
Inventors: 杨彩霞; 付晶晶; 韩彤; 廖鸣; 廖一鸣; 李梁; 侯秋实; 于美春; 王筠竹
Original assignee: Shenyang University
Current assignee: Shenyang University
Priority date: 2017-12-26
Filing date: 2017-12-26
Publication date: 2018-05-22

Abstract

一种植物病毒引物及其检测方法，涉及一种检测芜菁花叶病毒所用PCR引物及其检测方法，一种检测芜菁花叶病毒所用到的PCR引物具体为：上游引物TuMV‑CP‑F（SEQ IN NO.1）：5’‑tgtgtwtaycaccaggca‑3’；下游引物TuMV‑CP‑R（SEQ IN NO.2）：5’‑cataagcgagaatactaacgag‑3’；本发明所提供的PCR引物对TuMV的检出具有特异性性，可检测出萝卜样品中的TuMV，并得到特异性条带。利用RT‑PCR法进行检测，具有灵敏性高、操作简便等特点。实验表明，利用本发明检测萝卜上的芜菁花叶病毒（TuMV）侵染，有较高的特异性。

Description

一种检测芜菁花叶病毒所用PCR引物及其检测方法

技术领域

本发明涉及一种植物病毒引物及其检验方法，特别是涉及一种检测芜菁花叶病毒所用PCR引物及其检测方法。

背景技术

芜菁花叶病毒（Turnip mosaic virus, TuMV），隶属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus），该病毒为弯曲线状粒子，长700-750nm，基因组为(+)ssRNA结构。该病毒只包含一个可开放阅读框，编码合成一个350 kDa多聚蛋白再利用已有的酶依次剪接成10个多肽，3’-UTR区域富含AUAU区及TATAbox，以维持结构的稳定并防止讲解，5’-UTR区包含一段特异性保守序列。TuMV主要通过蚜虫以非持久式进行传播，目前已报到的有超过89种蚜虫可传毒。TuMV在进入寄主植物之后，立即进行蛋白外壳的裂解及核酸的转录翻译，其3’-端的AUAU区及TATAbox可防止RNA讲解。TuMV包括两个主要株系：分别是BR寄主型和B寄主型，两种类型的株系均可侵染芸薹属植物，BR型对萝卜属植株也有侵染性，但B型对萝卜属植株没有侵染性。同其他potyvirus病毒一样，该病毒主要通过cp基因的核苷酸同源性及氨基酸同源性进行分类，利用核酸序分析对病毒株系进行划分。1921年美国Gardner等首次报道了TuMV白菜分离物，我国于1941年在四川的油菜花叶病样品中首次提取出TuMV。目前，TuMV在我国广州、山东、烟台、枣庄、四川、杭州、上海、北京、长春及长江中下游地区均有报道，已报道的寄主有油菜、芥菜、白菜、甘蓝、花菜、萝卜、豌豆、蚕豆、番红花、菠菜、青花菜等。

萝卜是我国一种重要的蔬菜作物，原产于我国，在我国各个地区都有栽培，具有食用及药用价值。萝卜为十字花科萝卜属植物，一年或两年生草本，该种植物中含有丰富的蛋白质、脂肪以及B族维生素，据相关数据显示，萝卜中的V_c含量高于苹果。萝卜属寒性，味辛辣，具有化痰、通气、排尿等疾病的食疗，还可用于结石等疾病的预防。萝卜品种极多，均可食用，是我国的蔬菜作物之一，近年，真菌类疾病及植物病毒病的泛滥，以萝卜为寄主多种植物病毒复合侵染，是各地萝卜减产的重要原因。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测芜菁花叶病毒所用PCR引物及其检测方法，该方法为一种检测芜菁花叶病毒的专用引物及其植物病理学科植物病毒病害分子检测方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种检测芜菁花叶病毒所用到的PCR引物具体为：

上游引物TuMV-CP-F（SEQ IN NO.1）：5’- tgtgtwtaycaccaggca -3’；

下游引物TuMV-CP-R（SEQ IN NO.2）：5’-cataagcgagaatactaacgag-3’；

所述检测芜菁花叶病毒所用引物在判定芜菁花叶病毒中的应用，可用于检测确定萝卜样品是否受到辣芜菁花叶病毒（TuMV）的侵染；包括如下步骤：

（1）提取待检测萝卜样品的总RNA，冰上备用；提取方法如下：

植物总RNA提取采用TRIzol法，具体实验步骤按照如下进行：

1）称取0.2g的萝卜病叶叶片，放于液研钵中，加入氮中并研磨成粉末状；将其转移至1.5ml RNase-free Eppendorf 管中，加入1ml TRIzol 试剂，室温放置10min使细胞充分裂解；

2）4℃，12000rpm/min 离心15 min，收集上清，加入等体积的氯仿，剧烈振荡后，混匀，室温静止3 min；

3）4℃，12000rpm/min 离心15 min，收集上清液，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀后室温静止10 min；

4）4℃，12000rpm/min 离心15 min，弃去上清液，加入1 ml 75% 无水乙醇洗涤沉淀；

5）4℃，12000rpm/min 离心10 min，弃去上清液；

6）室温干燥后，加入适量体积的 RNase-free H₂O溶解沉淀；

（2）依据TIANgel Midi Purification Kit（天根生化科技（北京）有限公司）cDNA第一条链合成试剂盒进行反转录；以该cDNA为模板进行PCR扩增；

cDNA第一条链合成：

在RNase-free微量Eppendorf 管中依次加入2μl M₄-T₍₁₈₎，2μl Super Pure dNTPs（2.5mmol each），3μl RNA，补RNase-Free ddH₂O至14.5μl，混匀，70℃温浴5min。迅速置于冰上静置2min；加入4μl 5×First-Strand buffer，0.5μl RNase抑制剂（20 U·μL-1），1μlTIANScript M-MLV反转录酶（200U·L-1），使用移液枪吹打混合均匀，42℃温浴50min，反应结束后于95℃下温浴5min以终止反应，待温度降至室温后加入RNase-Free ddH₂O稀释至50ul备用；

PCR体系设计如下：

使用上述模板进行PCR扩增，在微量PCR管中依次加入cDNA 2μl，上游引物 1μl，下游引物 1μl，dNTP 1μl，10*Taq Buffer 2.5μl，Taq 0.2μl，补灭菌水至25μl。反应程序为：95℃预变性5min，（94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸50s）实验进行40个循环，72℃终延伸10min。

（3）对（2）中的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，得到阳性条带，目的条带大小预计约为940bp，经测序后Blast比对，表明样品中含有芜菁花叶病毒；

（4）为进一步确定该样品中是否含有芜菁花叶病毒，继续如下实验；将（3）中阳性PCR产物样品进行切胶回收，回收产物直接与PMD18-T载体进行连接，转化到DH-5α菌株中进行培养，挑取阳性单菌落进行菌液复苏，经菌液PCR鉴定为阳性的样品进行进一步测序，依据测序结果进行比对以确定样品是否被芜菁花叶病毒侵染。

本发明的优点与效果是：

本发明所提供的PCR引物对TuMV的检出具有特异性性，可检测出萝卜样品中的TuMV，并得到特异性条带。利用RT-PCR法进行检测，，具有灵敏性高、操作简便等特点。实验表明，利用本发明检测萝卜上的芜菁花叶病毒（TuMV）侵染，有较高的特异性。

附图说明

图1为RT-PCR法检测萝卜中芜菁花叶病毒（TuMV）的凝胶电泳图。（Matker：DL2000，1~10为盖州病样，11~14为沈阳病样，CK^-为健康植物）；

图2 为待检萝卜样品检测出TuMV cp基因在NCBI blast比对结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。

下面结合实例对本发明做进一步解释说明，在介绍实例之前，首先对本发明中所涉及到的部分物料进行如下简介。

生物材料样品：

待检测样品为疑是被TuMV侵染的带有明显被病毒侵染症状的萝卜样品，该样品采自辽宁省盖州市、辽宁省沈阳市，其生理症状表现为：叶片泡状突起、褪绿的症状；

大肠杆菌DH-5α菌株，TIANGEN（天根生化科技（北京）有限公司）；

PMD18-T载体，TaKaRa（宝生物工程（大连）有限公司）；

上下游引物合成，生工生物工程（上海）股份有限公司合成；

实验仪器及试剂：

凝胶电泳仪（北京六一仪器厂）；PCR仪（德国）；TRIzol试剂（TIANGEN）；Taq DNA聚合酶（TIANGEN）；Marker DL2000（TaKaRa）；TIANScript RT Kit反转录试剂盒（TIANGEN）。

实例：本实例中的萝卜上芜菁花叶病毒的检测方法，具体包括如下步骤：

（1）提取萝卜植物病叶样品的总RNA，备用；具体操作过程如下：

采用TRIzol法对萝卜病叶的总RNA进行提取，实验步骤按照说明书进行。

1）称取0.2g的萝卜病叶叶片，放于液研钵中，加入氮中并研磨成粉末状；将其转移至1.5 ml RNase-free Eppendorf 管中，加入1ml TRIzol 试剂，室温放置10min使细胞充分裂解。

6）4℃，12000rpm/min 离心15 min，弃去上清液，加入1 ml 75% 无水乙醇洗涤沉淀；

8）4℃，12000rpm/min 离心10 min，弃去上清液；

9）室温干燥后，加入适量体积的 RNase-free H2O溶解沉淀。

（2）cDNA第一条链合成：

在RNase-free微量Eppendorf 管中依次加入2μl M4-T(18)，2μl Super Pure dNTPs（2.5mmol each），3μl （1）步骤中的RNA，补RNase-Free ddH2O至14.5μl，混匀，70℃温浴5min。迅速置于冰上静置2min；加入4μl 5×First-Strand buffer，0.5μl RNase抑制剂（20U·μL-1），1μl TIANScript M-MLV反转录酶（200U·L-1），使用移液枪吹打混合均匀，42℃温浴50min，反应结束后于95℃下温浴5min以终止反应，待温度降至室温后加入RNase-FreeddH2O稀释至50ul备用。

PCR引物设计如下：（该引物特异扩增TuMV cp基因序列片段，大小约为940bp）

上游引物TuMV-CP-F：5’-tgtgtwtaycaccaggca-3’；

下游引物TuMV-CP-R：5’-cataagcgagaatactaacgag-3’。

（3）RT-PCR法扩增：

使用（2）中cDNA进行PCR扩增，在微量PCR管中依次加入cDNA 2μl，上游引物 1μl，下游引物 1μl，dNTP 1μl，10*Taq Buffer 2.5μl，Taq 0.2μl，补灭菌水至25μl。反应程序为：95℃预变性5min，（94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸50s）实验进行40个循环，72℃终延伸10min。取PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物经电泳后，利用凝胶成像仪成像，若样品呈阳性且条带大小为940bp左右，表明样品中含有芜菁花叶病毒。

检测结果如图1所示，结果显示，1~10号采自盖州市的萝卜病叶样品呈现大小为940bp的阳性条带，11~14号采自沈阳市的萝卜病叶样品呈现大小为940bp的阳性条带，表明1~14号样品中受到TuMV的侵染。将（4）中待检测PCR产物样品进行回收，回收产物直接与PMD18-T载体连接，16℃温育3h，再转化到DH-5α菌株中培养，挑取单菌落进行菌液复苏，进行菌液PCR初步筛选，选取阳性样品送出测序，依据测序结果进行比对，测序结果如SEQ INNO.3所示，与TuMV cp基因（GENBANK Accession Nos）进行同源性比对，cp核苷酸序列同源性>76%，氨基酸同源性>80%，可确定侵染萝卜的病毒为TuMV。

总体而言，本发明中使用该种特异性引物并利用RT-PCR技术，即可快速即可快速对植物样品是否受到芜菁花叶病毒的侵染做出判断，该种方法适用于快速、大量样品的鉴定，若产物浓度低，还可通过连接转化，将其克隆到PMD18-T载体上，进行扩繁，在进行测序，进而判断芜菁花叶病毒中是否存在于样品中。该种方法鉴定操作简单，准确性良好，为芜菁花叶病毒（TuMV）的鉴定及基因的多样性分析提供良好的理论基础。

序列表

<110> 沈阳大学

<120> 一种检测芜菁花叶病毒所用PCR引物及其检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> Turnip mosaic virus(芜菁花叶病毒)

<400> 1

tgtgtwtayc accaggca 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Turnip mosaic virus

<400> 2

cataagcgag aatactaacg ag 22

<210> 3

<211> 940

<212> DNA

<213> 芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus)

<400> 3

tgtgtatatc accaggcagg tgaaacactt gatgcaggcc tgacagatga gcagaaacag 60

gcagaaaagg agaggaaaga gaaagagaga gcagagaaag agcgcgaaag gcaaaagcag 120

ttggcactca agaaaggcaa aaacgcagca ttagaggaag gcgaacgcga caacgaagtg 180

aacgccggaa cctctggaac ttttagtgtg cctaggctca aaagcctaac gagcaaaatg 240

cgtgtgccaa agtacgagaa aagagtagcc ctcaatctcg atcgtctgat tctgtacacg 300

ccggagcaaa cggatctatc caatacgcgt tcaacgcgga agcagtttga cacttggttt 360

gaaggtgtca tggctgacta cgagctaacg gaggataaaa tgcaaataat tctcaatggt 420

ttaatggtct ggtgcattga gaatggaacc tccccaaata taaacggaat gtgggtgatg 480

atggacggtg atgatcaggt ggaattcccg atcaaaccgc tcattgacca cgccaaaccc 540

acatttaggc aaataatggc ccatttcagt gacgtagctg aagcgtacat tgaaaagcgt 600

aaccaagacc gaccatacat gccacgatat ggtcttcagc gcaatttaac cgacatgagc 660

ttagctcggt acgcatttga tttctatgaa atgacttcta gaactccaat acgtgcgaga 720

gaggcacaca tccagatgaa agcagcagca ctgcgtggcg caaataataa tttgttcggc 780

ttggatggta acgtcggcac aacggtagag aacacggaaa ggcatacgac cgaggacgtt 840

aatcggaaca tgcataactt acttggcgtt aaggggttat gaagttgtat gctagtagac 900

tataagtagt taagtttact cgttagtatt ctcgcttatg 940

Claims

1.一种检测芜菁花叶病毒所用PCR引物，其特征在于，所述一种检测芜菁花叶病毒所用到的PCR引物具体为：

上游引物TuMV-CP-F（SEQ IN NO.1）：5’- tgtgtwtaycaccaggca -3’；

下游引物TuMV-CP-R（SEQ IN NO.2）：5’-cataagcgagaatactaacgag-3’。

2.一种检测芜菁花叶病毒所用PCR引物检测方法，其特征在于，所述方法为检测芜菁花叶病毒所用引物在判定芜菁花叶病毒中的应用，用于检测确定萝卜样品是否受到辣芜菁花叶病毒（TuMV）的侵染；包括如下步骤：

植物总RNA提取采用TRIzol法，具体实验步骤按照如下进行：

5）4℃，12000rpm/min 离心10 min，弃去上清液；

6）室温干燥后，加入适量体积的 RNase-free H₂O溶解沉淀；

（2）依据DNA第一条链合成试剂盒进行反转录；以该cDNA为模板进行PCR扩增；

cDNA第一条链合成：

PCR体系设计如下：

使用上述模板进行PCR扩增，在微量PCR管中依次加入cDNA 2μl，上游引物 1μl，下游引物 1μl，dNTP 1μl，10*Taq Buffer 2.5μl，Taq 0.2μl，补灭菌水至25μl；

反应程序为：95℃预变性5min，（94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸50s）实验进行40个循环，72℃终延伸10min；

3.根据权利要求2所述的一种检测芜菁花叶病毒所用PCR引物检测方法，其特征在于，所述cDNA第一条链合成：在RNase-free微量Eppendorf 管中依次加入2μl M₄-T₍₁₈₎，2μlSuper Pure dNTPs（2.5mmol each），3μl RNA，补RNase-Free ddH₂O至14.5μl，混匀，70℃温浴5min；迅速置于冰上静置2min；加入4μl 5×First-Strand buffer，0.5μl RNase抑制剂（20 U·μL-1），1μl TIANScript M-MLV反转录酶（200U·L-1），使用移液枪吹打混合均匀，42℃温浴50min，反应结束后于95℃下温浴5min以终止反应，待温度降至室温后加入RNase-Free ddH₂O稀释至50ul备用。