CN108486283A - 一种夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒及检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒及检测方法，属于植物检疫技术领域。本发明提供的夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒，包括以下组分：病毒抽提缓冲液；PBST缓冲液；包被缓冲液；夜来香花叶病毒特异性抗体；正向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；RT Buffer；RNA酶抑制因子；反转录酶；dNTPs；PCRMix；夜来香花叶病毒阳性对照样品；阴性对照样品；RNase‑free ddH2O。本发明提供的试剂盒能够克服现有技术中存在的缺陷和不足，实现快速、准确、灵敏地检测夜来香花叶病毒。

Description

一种夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒及检测方法
技术领域
本发明涉及植物检疫技术领域，具体涉及一种夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒及检测方法。
背景技术
西番莲(Passiflora edulia Sims)是西番莲科(Passifloraceae)西番莲属(passiflora)多年生草质藤本植物，原产南美的巴西、阿根廷，广泛分布于热带、亚热带地区，我国主要分布在台湾、广东、福建、广西、浙江、四川等地区。西番莲作为一种高级天然饮料作物，在栽培生产过程中，常常受到病虫害的危害，其中病毒病是西番莲生产上的第二大病害，严重影响西番莲的产量和品质，在巴西、澳大利亚、秘鲁、肯尼亚及我国台湾地区已成为限制西番莲生产发展的重要因素。迄今为止，国内外报道能够侵染西番莲的病毒主要包括马铃薯病毒科(Potyviridae)马铃薯Y病毒属(Potyvirus)、雀麦花叶病毒科(Bramovirida)黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)、双生病毒科(Geminiviridae)菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)、芜菁黄花叶病毒科(Tymoviridae)芜菁黄花叶病毒属(Tymovirus)、柑橘粗糙病毒属(Cilevirus)、乙型线状病毒科(Betaflexiviridae)香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)、帚状病毒科(Virgaviridae)烟草花叶病毒属(Tobamovirus)、豇豆花叶病毒科(Comovirinae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)等病毒。其中，夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus，TeMV)是近年来西番莲上新报道的一种马铃薯Y病毒属病毒，基因组具有典型的Potyvirus结构特征，正义ssRNA，全长9689nts，编码一个长的聚合蛋白。夜来香花叶病毒的病毒粒体呈线状，长约750nm，宽约12nm。夜来香花叶病毒侵染寄主植物主要引起花叶症状，在泰国西番莲、越南夜来香、印度尼西亚广霍香上已有发生危害的报道，该病毒可通过机械接种传播，但是否通过蚜虫传播尚未明确。由于西番莲在生产上常采用扦插、嫁接育苗，因此夜来香花叶病毒可能通过上述途径大面积或远距离传播。
近年来，随着国内外对西番莲需求的不断增长，我国的西番莲种植面积逐渐增大，病毒病随之发生、传播和扩散的风险也越来越高。为预防与控制西番莲病毒病，加强病毒的早期检测，明确病毒发生的种类，对于及时制定有效的防治措施，保护西番莲生产安全具有重要意义。鉴别寄主鉴定、电子显微镜观察、血清学检测、RT-PCR是植物病毒检测诊断的常用方法。目前，用于夜来香花叶病毒检测的方法主要有生物学测定、电镜观察及酶联免疫吸附测定。利用生物学测定方法需要隔离种植的指示植物，结果虽直观，但易受环境条件的影响；电镜观察需要昂贵的仪器，并对操作的专业技术人员有较高的要求；酶联免疫吸附测定方法的灵敏度相对较低，检测结果容易出现假阴性。基于核酸水平的分子生物学方法检测植物病毒，具有特异性强、灵敏度高和时间快的显著优点，但该方法在夜来香花叶病毒上应用的研究报道极少。对于夜来香花叶病毒的检测，并没有高效且简便的方法见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒及检测方法。本发明提供的试剂盒能够克服现有技术中存在的缺陷和不足，实现快速、准确、灵敏地检测夜来香花叶病毒。
本发明提供了一种夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒，包括以下组分：
病毒抽提缓冲液；PBST缓冲液；包被缓冲液；夜来香花叶病毒特异性抗体；正向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；RT Buffer；RNA酶抑制因子；反转录酶；dNTPs；PCR Mix；夜来香花叶病毒阳性对照样品；阴性对照样品；RNase-free ddH2O。
优选的是，所述正向引物和反向引物的浓度独立地为10μmol/L。
优选的是，所述RNA酶抑制因子的浓度为40U/μL。
优选的是，所述反转录酶的浓度为200U/μL。
优选的是，所述dNTPs的浓度为10mmol/L。
本发明还提供了基于上述技术方案所述试剂盒的夜来香花叶病毒分子检测方法，包括以下步骤：
1)将检测样品与病毒抽提缓冲液按质量体积比1g:10mL混合，得到样品提取液；
2)将用包被缓冲液稀释500倍的夜来香花叶病毒特异性抗体溶液加入PCR管中，37℃孵育2h后，倒去夜来香花叶病毒特异性抗体溶液，用PBST缓冲液清洗，将步骤1)得到的样品提取液加入PCR管中，4℃包被过夜，得到免疫捕获病毒的PCR管；
3)清洗步骤2)得到的免疫捕获病毒的PCR管后，进行反转录，得到cDNA，所述反转录为：在免疫捕获病毒的PCR管中加入RNase-free ddH2O和反向引物，72℃水浴10min后冰浴5min；再加入RT Buffer、dNTPs、RNA酶抑制因子、反转录酶，42℃水浴60min，72℃水浴10min；
4)将所述步骤3)得到的cDNA进行PCR扩增反应，得到PCR反应产物；所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸10min；
5)将所述步骤4)得到的PCR反应产物进行电泳检测，若在847bp处出现DNA条带，则所述检测样品含有夜来香花叶病毒。
优选的是，步骤1)所述混合后还包括研磨和离心的过程，所述离心后取上清液。
优选的是，所述离心的条件为4℃，10000g离心10min。
优选的是，步骤3)所述清洗为：采用PBST缓冲液清洗3次后，再用RNase-freeddH2O洗管2次。
优选的是，步骤5)所述电泳检测采用1.5％的琼脂糖凝胶进行。
本发明提供了一种夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒。本发明提供的试剂盒能够实现夜来香花叶病毒通过IC-RT-PCR技术(结合了免疫捕捉和RT-PCR两种技术)进行检测，夜来香花叶病毒抗体先特异性捕捉病毒粒体，再在PCR管中直接进行反转录和PCR，得到夜来香花叶病毒的检测结果。本发明所提供的夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒及检测方法有益效果在于：1)操作简便、安全：本发明省去RNA提取步骤，不仅避免了某些植物组织成分对RNA质量的影响，有效去除了PCR抑制因子，而且避免接触用于RNA提取的有毒化学试剂；2)特异、灵敏：本发明根据夜来香花叶病毒基因保守区域序列设计引物，并经反复实验筛选获得特异性引物，本发明仅从感染夜来香花叶病毒的样品上扩增到大小为847bp的目的片段，而从健康样品及其他病毒样品上没有扩增到相应的目的片段，证明本发明具有很强的特异性；本发明具有很高的灵敏度，能够检测到稀释至10-3倍的病毒样品提取液原液，比血清学ELISA方法灵敏度高1000倍，可用于病毒含量极低样品的检测。
附图说明
图1为本发明实施例2提供的夜来香花叶病毒检测结果图；其中，M：DNA分子量标准(100bp)，1：夜来香花叶病毒的阳性对照样品，2：夜来香花叶病毒病叶，3：夜来香花叶病毒的阴性对照样品，4：空白对照；
图2为本发明实施例3提供的特异性测定结果图；其中，M：DNA分子量标准(100bp)，1：阴性对照，2：黄瓜花叶病毒(CMV)样品，3：甜菜花叶病毒(BtMV)样品，4：大豆花叶病毒(SMV)样品，5：虎眼万年青花叶病毒(OrMV)样品，6：东亚西番莲病毒(EAPV)样品，7：夜来香花叶病毒(TeMV)样品；
图3为本发明实施例4提供的灵敏度测定结果图；其中，M：DNA分子量标准(100bp)，1：夜来香花叶病毒样品提取液原液，2：10-1倍稀释，3：10-2倍稀释，4：10-3倍稀释，5：10-4倍稀释，6：10-5倍稀释，7：10-6倍稀释，8：阴性对照。
具体实施方式
本发明提供了一种夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒，包括以下组分：
病毒抽提缓冲液；PBST缓冲液；包被缓冲液；夜来香花叶病毒特异性抗体；正向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；RT Buffer；RNA酶抑制因子；反转录酶；dNTPs；PCR Mix；夜来香花叶病毒阳性对照样品；阴性对照样品；RNase-free ddH2O。
在本发明中，所述夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒包括病毒抽提缓冲液，本发明对所述病毒抽提缓冲液的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的病毒抽提缓冲液市售产品即可。在本发明具体试剂盒中，所述病毒抽提缓冲液优选为1×病毒抽提缓冲液。
在本发明中，所述夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒包括PBST缓冲液，本发明对所述PBST缓冲液的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的PBST常规市售产品或PBST常规配制配方进行配制即可。在本发明具体试剂盒中，所述PBST优选为1×PBST。
在本发明中，所述夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒包括包被缓冲液。本发明对所述包被缓冲液的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的包被缓冲液常规市售产品即可。
在本发明中，所述夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒包括夜来香花叶病毒特异性抗体。本发明对所述夜来香花叶病毒特异性抗体的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规抗体制备方法进行制备即可，如利用提纯的夜来香花叶病毒免疫家兔制备抗体。
在本发明中，所述夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒包括正向引物和反向引物。在本发明中，所述正向引物和反向引物的浓度独立地为10μmol/L。在本发明中，所述正向引物和反向引物根据夜来香花叶病毒外壳蛋白基因设计，能够实现烟草花叶病毒的准确、特异性检测。本发明所述正向引物序列为5’-TCAGTGTCTTTACAGTCAAGT-3’，所述反向引物序列为5’-GTTTACCCAGCCTCTACTGC-3’。本发明对所述正向引物和反向引物的合成方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的生物公司进行人工合成即可。
在本发明中，所述夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒包括RT Buffer，本发明对所述RT Buffer的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的RT Buffer的常规市售产品即可。在本发明具体试剂盒中，所述RT Buffer优选为5×RT Buffer。
在本发明中，所述夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒包括RNA酶抑制因子。本发明对所述RNA酶抑制因子的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的RNA酶抑制因子的常规市售产品即可。在本发明中，所述RNA酶抑制因子的浓度为40U/μL。
在本发明中，所述夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒包括反转录酶。本发明对所述反转录酶的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的反转录酶的常规市售产品即可。在本发明中，所述反转录酶的浓度为200U/μL。
在本发明中，所述夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒包括dNTPs。本发明对所述dNTPs的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的dNTPs的常规市售产品即可。在本发明中，所述dNTPs的浓度为10mmol/L。
在本发明中，所述夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒包括PCR Mix。本发明对所述PCR Mix的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的PCR Mix的常规市售产品即可。在本发明具体试剂盒中，所述PCR Mix优选为2×PCR Mix。
在本发明中，所述夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒包括夜来香花叶病毒阳性对照样品和不含夜来香花叶病毒阴性对照样品。本发明对所述夜来香花叶病毒阳性对照样品和不含夜来香花叶病毒阴性对照样品的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的夜来香花叶病毒阳性对照样品和不含夜来香花叶病毒阴性对照样品的常规市售产品即可。在本发明中，所述夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒包括RNase-free ddH2O。本发明对所述RNase-free ddH2O的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的RNase-freeddH2O的常规市售产品或常规制备方法制得即可。
本发明还提供了基于上述技术方案所述试剂盒的夜来香花叶病毒分子检测方法，包括以下步骤：
1)将夜来香花叶病毒检测样品与病毒抽提缓冲液按质量体积比1g:10mL混合，得到样品提取液；
2)将用包被缓冲液稀释500倍的夜来香花叶病毒特异性抗体溶液加入PCR管中，37℃孵育2h后，倒去夜来香花叶病毒特异性抗体溶液，用PBST缓冲液清洗，将步骤1)得到的样品提取液加入PCR管中，4℃包被过夜，得到免疫捕获病毒的PCR管；
3)清洗步骤2)得到的免疫捕获病毒的PCR管后，进行反转录，得到cDNA，所述反转录为：在免疫捕获病毒的PCR管中加入RNase-free ddH2O和反向引物，72℃水浴10min后冰浴5min；再加入RT Buffer、dNTPs、RNA酶抑制因子、反转录酶，42℃水浴60min，72℃水浴10min；
4)将所述步骤3)得到的cDNA进行PCR扩增反应，得到PCR反应产物；所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸10min；
5)将所述步骤4)得到的PCR反应产物进行电泳检测，若在847bp处出现DNA条带，则所述检测样品含有夜来香花叶病毒。
本发明将夜来香花叶病毒检测样品与病毒抽提缓冲液按质量体积比1g:10mL混合，得到样品提取液。在本发明中，所述混合后还包括研磨和离心的过程，所述离心后取上清液。在本发明中，所述离心的条件为4℃，10000g离心10min。在本发明中，所述检测样品优选为叶片。
得到样品提取液后，本发明将用包被缓冲液稀释500倍的夜来香花叶病毒特异性抗体溶液加入PCR管中，37℃孵育2h后，倒去夜来香花叶病毒特异性抗体溶液，用PBST缓冲液清洗，将样品提取液加入PCR管中，4℃包被过夜，得到免疫捕获病毒的PCR管。在本发明中，所述夜来香花叶病毒特异性抗体溶液、PBST缓冲液和样品提取液的添加体积优选相同。
得到免疫捕获病毒的PCR管后，本发明清洗得到的免疫捕获病毒的PCR管后，进行反转录，得到cDNA，所述反转录为：在免疫捕获病毒的PCR管中加入RNase-free ddH2O和反向引物，72℃水浴10min后冰浴5min；再加入RT Buffer、dNTPs、RNA酶抑制因子、反转录酶，42℃水浴60min，72℃水浴10min。在本发明中，所述反转录体系包括：RNase-free ddH2O 10μL、反向引物1μL、RT Buffer 5μL、dNTPs 2μL、RNA酶抑制因子1μL和反转录酶1μL。在本发明中，所述清洗为：采用PBST缓冲液清洗3次后，再用RNase-free ddH2O洗管2次。
得到cDNA后，本发明将所述cDNA进行PCR扩增反应，得到PCR反应产物；所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸10min。在本发明中，每25μL的所述PCR扩增反应体系包括：cDNA2μL、PCR Mix 12.5μL、正向引物1μL、反向引物1μL和RNase-free ddH2O 8.5μL。
得到PCR反应产物后，本发明将所述PCR反应产物进行电泳检测，若在847bp处出现DNA条带，则所述检测样品含有夜来香花叶病毒。在本发明中，所述电泳检测采用1.5％的琼脂糖凝胶进行。本发明提供的检测方法操作简便、经济、安全；本发明无需复杂的RNA提取步骤，不仅避免了受植物成分影响造成无法提取高质量的RNA，而且有效去除了样品中PCR抑制因子，同时操作人员避免了接触用于RNA提取的有毒化学试剂；与普通RT-PCR相比，大大节约了检测成本。且本发明提供的检测方法特异性强、灵敏度好、准确性高。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒及检测方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒的配置(10次检测量)
1)病毒抽提缓冲液：1×，1瓶(100mL)；
2)PBST缓冲液1×，1瓶(100mL)；
3)包被缓冲液：1×，1瓶(100mL)；
4)夜来香花叶病毒特异性抗体，1管(50μL)；
5)正向引物：10μmol/L，引物序列为5’-TCAGTGTCTTTACAGTCAAGT-3’，1管(100μL)；
6)反向引物：10μmol/L，引物序列为5’-GTTTACCCAGCCTCTACTGC-3’，1管(100μL)；
7)RT Buffer：5×，1管(100μL)；
8)RNA酶抑制因子：40U/μL，1管(20μL)；
9)反转录酶：200U/μL，1管(20μL)；
10)dNTPs：10mmol/L，1管(20μL)；
11)PCR Mix：2×，1管(100μL)；
12)夜来香花叶病毒阳性对照样品，1管(1mL)；
13)不含夜来香花叶病毒阴性对照样品，1管(1mL)；
14)RNase-free ddH2O，1管(5mL)。
实施例2
夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒的检测方法
上述夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
1)样品提取液制备：取一定量的样品，按照样品与病毒抽提缓冲液的质量体积比1g:10mL的比例加入病毒抽提缓冲液，充分研磨，4℃下10000g离心10min，取上清作为样品提取液；
2)免疫捕获病毒粒体：将100μL用包被缓冲液稀释500倍的夜来香花叶病毒特异性抗体溶液加入PCR管中，37℃孵育2h；倒去抗体溶液，用PBST缓冲液洗管3次，再加入100μL样品提取液至PCR管中，4℃包被过夜，得到免疫捕获病毒的PCR管；
3)反转录：倒去免疫捕获病毒的PCR管中的样品提取液，先用PBST缓冲液洗管3次，再用RNase-free ddH2O洗管2次，在免疫捕获病毒的PCR管中直接进行反转录；先向免疫捕获病毒的PCR管中加入RNase-free ddH2O 10μL、反向引物1μL，72℃水浴10min后立即冰浴5min，再加入下列试剂：5×RT Buffer 5μL、浓度为10mmol/LdNTPs 2μL、浓度为40U/μL RNA酶抑制因子1μL、浓度为200U/μL反转录酶1μL，42℃水浴60min，72℃水浴10min，合成cDNA；
4)PCR反应：取步骤3)合成的cDNA2μL，按每管加2×PCR Mix 12.5μL、浓度为10μmol/L正向引物1μL、浓度为10μmol/L反向引物1μL、RNase-free ddH2O 8.5μL，使反应总体积为25μL；混合后的反应液于94℃预变性3min，然后94℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸1.5min，如此共35个循环，最后一个循环结束后于72℃继续延伸10min，反应结束，得到PCR反应产物；
5)PCR扩增产物电泳检测：取PCR反应产物10μL，用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像系统上观察并记录实验结果；含有夜来香花叶病毒样品的电泳检测结果为在847bp处出现明亮的DNA条带(图1)，否则无。
实施例3
夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒的特异性测定
1)样品提取液的制备：分别以健康西番莲叶片、黄瓜花叶病毒(CMV)样品、甜菜花叶病毒(BtMV)样品、大豆花叶病毒(SMV)样品、虎眼万年青花叶病毒(OrMV)样品、东亚西番莲病毒(EAPV)样品和夜来香花叶病毒(TeMV)样品为材料，按照样品与病毒抽提缓冲液的质量体积比1g:10mL的比例加入病毒抽提缓冲液，充分研磨，4℃下10000g离心10min，取上清作为样品提取液；
2)免疫捕获病毒粒体：将100μL用包被缓冲液稀释500倍的夜来香花叶病毒特异性抗体溶液加入PCR管中，37℃孵育2h；倒去抗体溶液，用PBST缓冲液洗管3次，再加入100μL样品提取液至PCR管中，4℃包被过夜，得到免疫捕获病毒的PCR管；
3)反转录：倒去免疫捕获病毒的PCR管中的样品提取液，先用PBST缓冲液洗管3次，再用RNase-free ddH2O洗管2次，在免疫捕获病毒的PCR管中直接进行反转录；先向免疫捕获病毒的PCR管中加入RNase-free ddH2O10μL、反向引物1μL，72℃水浴10min后立即冰浴5min，再加入下列试剂：5×RT Buffer 5μL、浓度为10mmol/LdNTPs 2μL、浓度为40U/μL RNA酶抑制因子1μL、浓度为200U/μL反转录酶1μL，42℃水浴60min，72℃水浴10min，合成cDNA；
4)PCR反应：取步骤2)合成的cDNA2μL，按每管加2×PCR Mix 12.5μL、浓度为10μmol/L正向引物1μL、浓度为10μmol/L反向引物1μL、RNase-free ddH2O 8.5μL，使反应总体积为25μL；混合后的反应液于94℃预变性3min，然后94℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸1.5min，如此共35个循环，最后一个循环结束后于72℃继续延伸10min，反应结束，得到PCR反应产物；
5)PCR扩增产物电泳检测：取PCR反应产物10μL用1.5％琼脂糖凝胶电泳进行检测，在凝胶成像系统上观察并记录实验结果(图2)；由图2可见，仅从夜来香花叶病毒(TeMV)样品上扩增到大小为847bp的目的片段，而从阴性对照(健康西番莲)及其他病毒样品上均未扩增到目的片段。
实施例4
夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒的灵敏度测定
将夜来香花叶病毒(TeMV)样品提取液利用健康西番莲叶片提取液进行10倍梯度稀释，依次稀释为原液的10-1，10-2，10-3，10-4，10-5和10-6倍，按实施例2方法进行检测，同时采用血清学ELISA方法进行检测，比较两种方法的灵敏度。结果表明，本发明试剂盒具有良好的灵敏度，能够检测到稀释103倍的夜来香花叶病毒样品提取液，而采用血清学ELISA方法，仅能检测到夜来香花叶病毒样品提取液原液(图3)。本发明的灵敏度比血清学ELISA方法高103倍。
实施例5
田间和进境西番莲样品的实际检测
选取田间采集和口岸进境的西番莲样品为材料(共50份)，按实施例2方法进行检测，同时用普通RT-PCR方法进行验证。结果从12份西番莲样品上检出夜来香花叶病毒，检出率为24％，其余38份西番莲样品上未检出夜来香花叶病毒，该结果与普通RT-PCR方法的测定结果完全相符。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 福建省农业科学院果树研究所
<120> 一种夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒及检测方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcagtgtctt tacagtcaag t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtttacccag cctctactgc 20

Claims (10)

1.一种夜来香花叶病毒分子检测用试剂盒，其特征在于，包括以下组分：
病毒抽提缓冲液；PBST缓冲液；包被缓冲液；夜来香花叶病毒特异性抗体；正向引物，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；反向引物，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；RT Buffer；RNA酶抑制因子；反转录酶；dNTPs；PCR Mix；夜来香花叶病毒阳性对照样品；阴性对照样品；RNase-free ddH2O。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述正向引物和反向引物的浓度独立地为10μmol/L。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述RNA酶抑制因子的浓度为40U/μL。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述反转录酶的浓度为200U/μL。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述dNTPs的浓度为10mmol/L。
6.基于权利要求1～5所述试剂盒的夜来香花叶病毒分子检测方法，包括以下步骤：
1)将检测样品与病毒抽提缓冲液按质量体积比1g:10mL混合，得到样品提取液；
2)将用包被缓冲液稀释500倍的夜来香花叶病毒特异性抗体溶液加入PCR管中，37℃孵育2h后，倒去夜来香花叶病毒特异性抗体溶液，用PBST缓冲液清洗，将步骤1)得到的样品提取液加入PCR管中，4℃包被过夜，得到免疫捕获病毒的PCR管；
3)清洗步骤2)得到的免疫捕获病毒的PCR管后，进行反转录，得到cDNA，所述反转录为：在免疫捕获病毒的PCR管中加入RNase-free ddH2O和反向引物，72℃水浴10min后冰浴5min；再加入RT Buffer、dNTPs、RNA酶抑制因子、反转录酶，42℃水浴60min，72℃水浴10min；
4)将所述步骤3)得到的cDNA进行PCR扩增反应，得到PCR反应产物；所述PCR扩增反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性30s，54℃退火1min，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸10min；
5)将所述步骤4)得到的PCR反应产物进行电泳检测，若在847bp处出现DNA条带，则所述检测样品含有夜来香花叶病毒。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤1)所述混合后还包括研磨和离心的过程，所述离心后取上清液。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述离心的条件为4℃，10000g离心10min。
9.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤3)所述清洗为：采用PBST缓冲液清洗3次后，再用RNase-free ddH2O洗管2次。
10.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤5)所述电泳检测采用1.5％的琼脂糖凝胶进行。
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