CN103849691B - 一种甘薯病毒检测引物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明根据甘薯褪绿矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽状斑驳病毒三种病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列分别设计合成出了三对用以检测甘薯病毒的引物；并同时揭露了利用该三对引物对甘薯病毒进行检测的方法，具体地，采用RT-PCR方法，应用三对特异性引物同时对甘薯叶片中的3种病毒即甘薯褪绿矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽状斑驳病毒进行扩增检测，并将扩增产物克隆测序比对进行验证。本发明建立了一种通过一次反应能够同时可靠的检测出3种甘薯病毒即甘薯褪绿矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽状斑驳病毒的检测方法，具有检测效率高、成本低的特点，且具有很高的检测灵敏度。

Description

一种甘薯病毒检测引物及方法
【技术领域】
本发明涉及生物学领域的一种植物病毒检测方法，具体涉及一种甘薯病毒检测引物及方法。
【背景技术】
甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、甘薯G病毒（Sweet potato virus G，SPVG）和甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chloroticstunt virus，SPCSV）是危害甘薯的三种主要病毒。
甘薯羽状斑驳病毒和甘薯G病毒属马铃薯Y病毒属常常复合侵染，甘薯褪绿矮化病毒与甘薯羽状斑驳病毒协生共侵染引起的甘薯病害被称为甘薯病毒病害（(sweet potato virus disease，SPVD），我国于2010年首次报道了发现该病毒病症状。在田间这几种病毒常常复合侵染，造成甘薯叶片扭曲、畸形、叶片褪绿、明脉及植株矮化，严重影响甘薯产量及品质，严重时可造成90%以上的损失，甚至绝收，这几种病毒的复合侵染已经成为甘薯生产的主要限制因素。目前，甘薯病毒尚无特别有效的化学防治方法，培育和栽培无病毒苗是防治甘薯病毒最有效措施，但在无毒苗培育过程中，经常需要对脱毒苗进行病毒检测。
目前，植物病毒检测大多采用基于抗血清的酶联免疫吸附技术（即ELISA方法），但抗血清不仅价格较高、一种抗血清只能检测一种病毒、检测程序繁琐，而且还存在一定程度的假阳性反应、检测灵敏性相对较低等问题。近年来，为了提高病毒检测效率，基于PCR技术的病毒检测技术正在迅速发展，但单重PCR检测技术，一个反应只能检测一种病毒，若应用于田间多种病毒复合侵染的甘薯病毒的检测，则存在着耗时、耗力、费用高的问题。
【发明内容】
本发明所要解决的技术问题在于提供一种甘薯病毒检测引物及方法。
本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种甘薯病毒检测引物，其具体包括如下三个引物对：
甘薯褪绿矮化病毒引物对：正向引物5'-TGACTGGTGAGGCTACAAT-3'，反向引物5'-CACTTCCTTATGGCGTTCT-3'；
甘薯G病毒引物对：正向引物5'-AGGGTGTCAGGGAAGATTA-3'，反向引物5'-AGTGCTGCTGCTTTCATTT-3'；
甘薯羽状斑驳病毒引物对：正向引物5'-ATCCTCCACCACCTACAAT-3'，反向引物5'-GAAGTGCGTCATAATCTGC-3'。
进一步地，所述甘薯褪绿矮化病毒引物对对甘薯褪绿矮化病毒PCR扩增出220bp的产物；所述甘薯G病毒引物对对甘薯G病毒PCR扩增出391bp的产物；所述甘薯羽状斑驳病毒引物对对甘薯羽状斑驳病毒PCR扩增出566bp的产物。
进一步地，利用上述三个引物对甘薯病毒进行检测，且检测方法如下：根据甘薯褪绿矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽状斑驳病毒三种病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列分别设计合成出如权利要求1中所述甘薯褪绿矮化病毒引物对、甘薯G病毒引物对及甘薯羽状斑驳病毒引物对；然后分别利用褪绿矮化病毒引物对对甘薯叶片中的甘薯褪绿矮化病毒、甘薯G病毒引物对对甘薯叶片中的甘薯G病毒、甘薯羽状斑驳病毒引物对对甘薯叶片中的甘薯羽状斑驳病毒进行RT-PCR反应，最后将反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析和克隆测序比对。
进一步地，所述RT-PCR反应的反应体系和反应程序如下：
反应体系：反应体系的总体积为25μL，含有0.3μL5U/μL的Taq酶、5μL的10×Taq酶buffer、4μL2.5mmol/L的dNTPs、2μL模板、0.12-0.24μmol/L的甘薯褪绿矮化病毒正向引物、0.12-0.24μmol/L的甘薯褪绿矮化病毒反向引物、0.12-0.24μmol/L的甘薯G病毒正向引物、0.12-0.24μmol/L的甘薯G病毒反向引物、0.12-0.2μmol/L的甘薯羽状斑驳病毒正向引物、0.12-0.2μmol/L的甘薯羽状斑驳病毒反向引物、其余成分为灭菌双蒸水；其中，每所述引物对中的正向引物和反向引物的浓度均相等，所述甘薯褪绿矮化病毒正向引物、甘薯褪绿矮化病毒反向引物，甘薯G病毒正向引物、甘薯G病毒反向引物、甘薯羽状斑驳病毒正向引物、甘薯羽状斑驳病毒反向引物的浓度均是以反应体系的总体积25μL为基准；
反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，52-58℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min；4℃终止反应。
本发明的有益效果在于：
针对甘薯褪绿矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽状斑驳病毒三种病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列，分别设计合成了三对相应的特异性引物，并利用该三对特异性引物同时对甘薯叶片中的甘薯褪绿矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽状斑驳病毒三种病毒进行RT-PCR反应，建立了一种通过一次反应能够同时可靠的检测出3种甘薯病毒即甘薯褪绿矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽状斑驳病毒的检测方法，具有检测效率高、成本低的特点，且即使样本中3种甘薯病毒的RNA含量很低，本发明也能检测出来，即本发明检测方法具有很高的检测灵敏度。
【附图说明】
下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的描述。
图1为本发明中实施例一的1%琼脂糖凝胶电泳图。
图2为本发明中实施例二的1%琼脂糖凝胶电泳图。
图3为本发明中实施例三的1%琼脂糖凝胶电泳图。
【具体实施方式】
本发明列举了以下几个代表性实施例，这些实施例仅是示例性的，且不用于限制本发明的范围，这些实施例仅用于说明本发明的实施方法。
实施例一
本发明一种甘薯病毒的检测方法，根据甘薯褪绿矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽状斑驳病毒三种病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列分别设计合成了甘薯褪绿矮化病毒引物对、甘薯G病毒引物对及甘薯羽状斑驳病毒引物对，然后分别利用褪绿矮化病毒引物对对甘薯叶片中的甘薯褪绿矮化病毒、甘薯G病毒引物对对甘薯叶片中的甘薯G病毒、甘薯羽状斑驳病毒引物对对甘薯叶片中的甘薯羽状斑驳病毒进行RT-PCR反应，最后将反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析和克隆测序比对。
其中，各引物对具体为：（1）甘薯褪绿矮化病毒引物对（如SEQ ID NO：1、2所示）：正向引物5'-TGACTGGTGAGGCTACAAT-3'，反向引物5'-CACTTCCTTATGGCGTTCT-3'；（2）甘薯G病毒引物对（如SEQ ID NO：3、4所示）：正向引物5'-AGGGTGTCAGGGAAGATTA-3'，反向引物5'-AGTGCTGCTGCTTTCATTT-3'；（3）甘薯羽状斑驳病毒引物对（如SEQ IDNO：5、6所示）：正向引物5'-ATCCTCCACCACCTACAAT-3'，反向引物5'-GAAGTGCGTCATAATCTGC-3'。
另外，申请人为了描述方便，将甘薯褪绿矮化病毒简称为SPCSV，甘薯G病毒简称为SPVG，甘薯羽状斑驳病毒简称为SPFMV。本发明检测方法的具体操作步骤如下：
步骤1：根据甘薯褪绿矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽状斑驳病毒三种病毒的外壳蛋白基因核苷酸序列，利用Primer5.0软件设计三对特异性引物（即所述甘薯褪绿矮化病毒引物对、甘薯G病毒引物对及甘薯羽状斑驳病毒引物对），再用DNAman软件对所设计的三对特异性引物进行校正，证实三对引物间不存在自身匹配和竞争性扩增，以确保上述三种病毒能扩增出差异明显的特异性片段，并由大连宝生物工程有限公司合成上述三对特异性引物。
步骤2：RNA提取：将同时被SPCSV、SPVG和SPFMV三种病毒复合侵染的甘薯叶片0.2g、健康叶片0.2g分别进行RNA提取，并以健康叶片为阴性对照。RNA提取采用Trizol法：0.2g甘薯带病毒叶片或健康叶片放入研钵中，加入液氮研磨成粉状，接着将粉状转入1.5ml第一离心管中，再加入1mL Trizol并剧烈震荡20～30S，然后将离心管置于室温下静置5min以使叶片充分裂解，接着将离心管于12000rpm下离心5min，将上清移至第二离心管中，往第二离心管中加入1/5Trizol体积氯仿，并振荡混匀，于室温下放置3min，接着在4℃、12000rpm下离心15min，然后吸取上层水相至第三离心管中，往第三离心管中加入1/2Trizol体积异丙醇混匀，并于室温下放置10min，接着将第三离心管于4℃、12000rpm条件下离心10min，并弃去上清液，则RNA沉于管底；之后加1mL75%乙醇（DEPC处理水配制）于第三离心管中并温和振荡第三离心管，得到悬浮液，再于4℃、10000rpm条件下离心5min，并弃去上清液，然后将第三离心管置于冰上晾干3min，最后用30uL DEPC处理水溶解RNA样品。
步骤3：反转录cDNA：将经步骤2处理所得的RNA反转录成cDNA，具体内容为：将反应管置于冰上，加入1uL Primer Oligo(dt)、6uL DEPC处理水、1uL dNTP混合液（10mM each）、2uL RNA样品至反应管中，轻轻混匀再进行稍微离心，接着将反应管置于PCR仪中65℃反应5min后，立即将反应管置于冰上5min，之后于上述反应液再加入4uL5×反转录酶缓冲液、0.5uL（40U/uL）的RNAase抑制剂、1uL（200U/uL）反转录酶至反应管中，加入4.5uL DEPC处理水，轻轻混匀，再稍微离心，然后将反应管置于PCR仪中42℃反应50min，95℃反应5min，反应结束后冰上冷却。
步骤4：PCR扩增：以经步骤3处理所得的cDNA为模板，并以步骤1中获得的三对引物为引物对同时进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。
为了进行对比，本实施例同时进行了单重PCR扩增反应和多重PCR扩增反应，其中，单重PCR扩增反应和多重PCR扩增反应的反应程序一致但反应体系不同。PCR扩增反应的反应体系和反应程序具体如下：
单重PCR反应体系：反应体系的总体积为25μL，包括0.3μL5U/μL的Taq酶、2.5μL的10×Taq酶buffer、2.0μL2.5mmol/L的dNTP、2μL模板、1μL10μmol/L SPCSV或SPVG或SPFMV的正向引物、1μL10μmol/L SPCSV或SPVG或SPFMV的反向引物，其余成分为灭菌双蒸水。
多重PCR反应体系：反应体系的总体积为25μL，含有0.3μL5U/μL的Taq酶、2.5μL的10×Taq酶buffer、2μL2.5mmol/L的dNTP、2μL模板、0.24μmol/L的SPCSV正向引物、0.24μmol/L的SPCSV反向引物，0.12μmol/L的SPVG正向引物、0.12μmol/L的SPVG反向引物、0.12μmol/L的SPFMV正向引物、0.12μmol/L的SPFMV反向引物、其余成分为灭菌双蒸水；其中，所述SPCSV正向引物和反向引物、SPVG正向引物和反向引物、及SPFMV正向引物和反向引物的浓度均是以反应体系的总体积25μL为基准。
PCR反应程序：94℃预变性5min、94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min；4℃终止反应。
步骤5：取5μL PCR产物以1%琼脂糖凝胶（荧光染料）为电泳支持介质，在1×TAE和120V电压下电泳30min，用紫外透射仪观察，具体实验结果见图1。
本实施例1%琼脂糖凝胶电泳实验结果如图1所示，SPCSV引物对的单重PCR扩增反应结果如图1中的标识1所示，SPVG引物对的单重PCR扩增反应结果如图1中的标识2所示，SPFMV引物对的单重PCR扩增反应结果如图1中的标识3所示，由SPCSV引物对、SPVG引物对、SPFMV引物对的三对引物参与的多重PCR扩增反应结果如图1中的标识4所示，健康叶片的单重PCR扩增反应结果如图1中的标识5所示。由图1可知，SPCSV引物对的单重PCR扩增反应得到扩增片段长度为220bp的条带，SPVG引物对的单重PCR扩增反应得到扩增片段长度为391bp的条带，SPFMV引物对的单重PCR扩增反应得到扩增片段长度为566bp的条带；由SPCSV引物对、SPVG引物对、SPFMV引物对三对引物参与的多重PCR扩增反应，可同时得到扩增片段长度220bp、391bp和566bp的三条明亮清晰的条带，与单一RT-PCR检测结果一致；可见，本发明可以一次性同时检测出甘薯的SPCSV、SPVG、SPFMV三种病毒，且特异性好、检测效率高。
实施例二
将实施例一步骤4中的多重PCR反应体系得到的PCR扩增产物经割胶回收，然后分别与pMD18-T simple vector进行体外连接，再挑取阳性克隆，最后提取质粒测序，以检查甘薯褪绿矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽状斑驳病毒三种病毒的扩增结果。
且测序结果为：SPCSV、SPVG和SPFMV的扩增产物分别是由220、391和566个核苷酸组成的序列，其中所述SPCSV扩增产物序列如SEQ ID NO：7所示，所述SPVG扩增产物序列如SEQ ID NO：8所示，所述SPFMV扩增产物序列如SEQ ID NO：9所示。用NCBI分析同源性结果表明，所得的扩增产物序列SEQ ID NO：7与参考序列即SPCSV的外壳蛋白基因序列的同源率达到100%，序列SEQ ID NO：8与参考序列SPVG的外壳蛋白基因序列的同源率达到97%，序列SEQ ID NO：9与参考序列SPFMV的外壳蛋白基因序列的同源率达到100%；由此可见，所得的扩增产物SEQ ID NO：7、SEQ IDNO：8和SEQ ID NO：9序列分别为SPCSV、SPVG和SPFMV的外壳蛋白基因的部分序列，从而证明了本发明检测方法结果的可靠性。
此外，申请人还对本发明甘薯病毒检测方法的灵敏度进行了检测，具体地，对实施例一步骤2中的RNA样品进行10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6一系列的梯度稀释，然后经过多重RT-PCR扩增反应，再进行1%琼脂糖凝胶电泳实验，具体结果如图2所示。由图2可知，图2中的标识1、2、3分别为1、10-1和10-2倍的RNA样品，其中SPCSV、SPVG和SPFMV三种病毒在样品浓度稀释10-2倍后均能扩增出特异条带，而SPFMV、SPVG稀释10-4倍后仍能扩增出特异条带，由此可见本发明检测方法具有很高的灵敏度。
实施例三
多重RT-PCR同时检测SPCSV、SPVG和SPFMV的应用：
本实施例与实施例一不同之处在于：
步骤1：随机选取福建南安大田中疑似病毒症状的甘薯样品进行检测，10个采自大田样品和1个脱毒苗样品经ELISA检测为阴性作为阴性对照进行RNA提取，11个甘薯样品均为0.2g，接着对各样品进行RNA提取（操作同实施例一的步骤2），并将RNA反转录成cDNA（操作同实施例一的步骤3）。
步骤2：以处理所得的cDNA为模板，并以本发明所述的三对引物为引物对同时进行PCR扩增反应，得到PCR扩增产物。PCR扩增反应的反应体系和反应程序具体内容如下：
PCR反应体系：反应体系的总体积为25μL，含有0.3μL5U/μL的Taq酶、2.5μL的10×Taq酶buffer、2μL2.5mmol/L的dNTP、2μL模板、0.24μmol/L的SPCSV正向引物、0.24μmol/L的SPCSV反向引物、0.12μmol/L的SPVG正向引物、0.12μmol/L的SPVG反向引物、0.12μmol/L的SPFMV正向引物、0.12μmol/L的SPFMV反向引物，其余成分为灭菌双蒸水；PCR反应程序为94℃预变性5min、94℃变性30s、57℃退火30s、72℃延伸1min，循环35次，72℃延伸10min，4℃终止反应。
步骤3：取5μL PCR产物以1%琼脂糖凝胶（荧光染料）为电泳支持介质，在1×TAE和120V电压下电泳30min，用紫外透射仪观察，具体实验结果见图3。
本实施例1%琼脂糖凝胶电泳实验结果如图3所示，利用多重RT-PCR体系对11份甘薯样品进行检测，图3中标识9阳性对照未扩增出特异性条带，图3中标识1-11为田间样品中，均扩增出2条或3条特异性条带，说明采集的田间样品受SPCSV、SPVG和SPFMV种病毒复合侵染，得到扩增片段长度566bp、391bp和220bp的三条明亮清晰的条带，与实施例一中单一RT-PCR检测结果一致。可见，本发明检测方法可以一次性同时检测出甘薯的SPCSV、SPVG、SPFMV三种病毒，特异性好、检测效率高。
本发明针对SPCSV、SPVG和SPFMV三种病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列，分别设计合成了三对相应的特异性引物，并利用该三对特异性引物同时对甘薯叶片中的SPCSV、SPVG和SPFMV进行mRT-PCR反应，建立了一种新的PCR反应体系和反应程序，使RT-PCR反应得到了大小差异明显，长度分别为220bp、391bp和566bp的三条SPCSV、SPVG和SPFMV的扩增片段序列；本发明实现了一次反应就能同时检测出3种甘薯病毒即SPCSV、SPVG和SPFMV的目标，因而本发明检测效率高，本发明所用试剂为分子生物学常用试剂，所需成本低，即使样本中3种甘薯病毒的RNA含量很低，本发明也能检测出来，因而本发明具有很高的检测灵敏度。

Claims (4)

1.一种甘薯病毒检测引物，其特征在于：具体包括如下三个引物对：
甘薯褪绿矮化病毒引物对：正向引物5'-TGACTGGTGAGGCTACAAT-3'，反向引物5'-CACTTCCTTATGGCGTTCT-3'；
甘薯G病毒引物对：正向引物5'-AGGGTGTCAGGGAAGATTA-3'，反向引物5'-AGTGCTGCTGCTTTCATTT-3'；
甘薯羽状斑驳病毒引物对：正向引物5'-ATCCTCCACCACCTACAAT-3'，反向引物5'-GAAGTGCGTCATAATCTGC-3'。
2.根据权利要求1所述一种甘薯病毒检测引物，其特征在于：所述甘薯褪绿矮化病毒引物对对甘薯褪绿矮化病毒PCR扩增出220bp的产物；所述甘薯G病毒引物对对甘薯G病毒PCR扩增出391bp的产物；所述甘薯羽状斑驳病毒引物对对甘薯羽状斑驳病毒PCR扩增出566bp的产物。
3.一种甘薯病毒检测方法，其特征在于：根据甘薯褪绿矮化病毒、甘薯G病毒和甘薯羽状斑驳病毒三种病毒的外壳蛋白基因的核苷酸序列分别设计合成出如权利要求1中所述甘薯褪绿矮化病毒引物对、甘薯G病毒引物对及甘薯羽状斑驳病毒引物对；然后分别利用褪绿矮化病毒引物对对甘薯叶片中的甘薯褪绿矮化病毒、甘薯G病毒引物对对甘薯叶片中的甘薯G病毒、甘薯羽状斑驳病毒引物对对甘薯叶片中的甘薯羽状斑驳病毒进行RT-PCR反应，最后将反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳分析和克隆测序比对。
4.根据权利要求3所述一种甘薯病毒检测方法，其特征在于：所述RT-PCR反应的反应体系和反应程序如下：
反应体系：反应体系的总体积为25μL，含有0.3μL5U/μL的Taq酶、5μL的10×Taq酶buffer、4μL2.5mmol/L的dNTPs、2μL模板、0.12-0.24μmol/L的甘薯褪绿矮化病毒正向引物、0.12-0.24μmol/L的甘薯褪绿矮化病毒反向引物、0.12-0.24μmol/L的甘薯G病毒正向引物、0.12-0.24μmol/L的甘薯G病毒反向引物、0.12-0.2μmol/L的甘薯羽状斑驳病毒正向引物、0.12-0.2μmol/L的甘薯羽状斑驳病毒反向引物、其余成分为灭菌双蒸水；其中，每所述引物对中的正向引物和反向引物的浓度均相等，所述甘薯褪绿矮化病毒正向引物、甘薯褪绿矮化病毒反向引物，甘薯G病毒正向引物、甘薯G病毒反向引物、甘薯羽状斑驳病毒正向引物、甘薯羽状斑驳病毒反向引物的浓度均是以反应体系的总体积25μL为基准；
反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，52-58℃退火30s，72℃延伸1min，循环35次；72℃延伸10min；4℃终止反应。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104450977B (zh) * 2015-01-06 2016-08-17 西南大学 用于甘薯病毒病实时荧光定量pcr检测的引物及检测方法
CN106701909B (zh) * 2015-11-18 2022-04-01 中国检验检疫科学研究院 用于红薯源性成分检测的引物探针及方法和试剂盒
CN107360906A (zh) * 2017-08-04 2017-11-21 江苏徐淮地区徐州农业科学研究所(江苏徐州甘薯研究中心) 一种减轻甘薯spvd危害的方法
CN118028317A (zh) * 2024-04-09 2024-05-14 浙江大学山东(临沂)现代农业研究院 一种甘薯病毒g外壳蛋白cp及其编码基因、抗体和应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102108419B (zh) * 2010-11-30 2012-10-03 河南省农业科学院植物保护研究所 甘薯病毒病害spvd的多重rt-pcr检测方法
CN102230027B (zh) * 2011-06-10 2013-03-13 云南农业大学 同步检测spfmv、spvc、spvg和spv2的方法

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