CN105506174A - 玉米中甘蔗花叶病毒的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及玉米中甘蔗花叶病毒的检测方法，首先提取高质量的病毒RNA样品，根据甘蔗花叶病毒外壳蛋白(CP)基因设计引物，并利用RT-PCR和Real-time？PCR技术进行检测，最终建立了一套快速、高效的病毒检测方法。该检测方法通过有效检测玉米中低含量的甘蔗花叶病毒，从而减少甘蔗花叶病毒的潜在危害，降低农作物生产的损失。

Description

玉米中甘蔗花叶病毒的检测方法

技术领域

本发明涉及分子生物学检测领域，具体地说，涉及玉米中甘蔗花叶病毒的RT-PCR及RealTimePCR检测方法。

背景技术

聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)PCR，是1985年由美国PE-Cetus公司的科学家KaryBanksMulis发明的一种可在体外快速扩增特定基因或DNA序列的分子生物学技术。这项技术是根据生物体内DNA序列能进行快速复制的某些特点，实现在体外对特定DNA序列进行快速扩增，可在短时间内在试管中获得数百万个特异DNA序列拷贝。PCR技术操作简便、结果可靠，并被世界各国广泛应用于医学、农业、考古学等各个领域的基因研究和分析，对分子生物学的发展产生了革命性的影响。

PCR技术的原理是：DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3’-OH末端，并以此为起始点，沿模板5’→3’方向延伸，合成一条新的DNA互补链。PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。PCR反应中，通过双链DNA的高温变性(denaturation)、引物与模板的低温退火(annealing)和适温延伸(extension)这三步反应反复循环。每一循环中所合成的新链，又都可作为下一循环中的模板。PCR合成的特定DNA序列产量随着循环次数呈指数增加，从而达到迅速大量扩增的目的。

植物病毒为害是农业生产上损失最大的病害之一，有“植物癌症”之称。在自然界中，植物病毒侵染植物的现象相当广泛，很多植物病毒病害与人们生活密切相关，例如在经济上非常重要的农作物，像粮食、油料、果树、蔬菜、药材、林木和花卉等各种植物。一种病毒可侵染许多植物，而同种植物又可被许多病毒侵染。不同植物病毒病害可以通过各种途径传播；病叶汁液接种传毒；介体传毒，即各种昆虫(叶蝉、飞虱、蚜虫)线虫；真菌作媒介传毒，还可经土壤和种子传毒。植物病毒对作物的危害可使农业生产受到巨大的损失。病毒侵染首先引起寄主在生物化学上和代谢上的变化，接着产生细胞结构上的变化，最后导致宏观症状的出现。客观症状可分为两大类：一类是由细胞和组织结构发生的变化而引起的如颜色变化、黄化、褪绿、坏死、枯斑和缺水等；另一类是由于细胞和组织的不正常生长引起的，细胞的结构并不发生变化，如植株矮化、木栓化形成、叶片卷曲，变形。病变可造成植物产量减少，果实减小。在病害流行期间，常常使感病作物造成毁灭性的灾害。一般危害性在一年生种子繁殖作物，多年生作物和营养繁殖作物上有所不同。在一年生种子繁殖的作物上，如稻、麦、棉和蔬菜等，可以采取一些预防措施，减轻当年病害的发生程度，一般不影响下一季的发病。有些种子传染的病害，当年发病的轻重在不同程度上影响下一年发病程度。对木本植物和果树等经济林木危害更大一些。木本植物一旦发病，以后连年都发病，必要时只有采取铲除的方法来防止病毒传染到健康的植物上。例如遍布欧美的马铃薯退化病，被带进我国薯区后，1955年在河北中部发病率为85-90％，减产50-70％，造成当地马铃薯不能留种，产量很低，给农民带来巨大的损失。因此，高效的病毒鉴定或检测技术是防治植物病毒病害的关键。

植物病毒检测技术中应用的方法包括很多，目前应用到病毒检测中的方法根据其原理可分为四种：1、生物学方法。2、电子显微镜观察法。3、免疫学方法：在ELISA的基础上,发展出了组织印迹法，包括斑点免疫结合测定法(DIBA-ELISA或dot-ELISA)、直接组织斑点免疫测定(IDDTB-ELISA)等。免疫技术与电泳技术结合发展出了免疫毛细管区带电泳技术(ImmunoCapillaryZoneElectrophoresis，I-CZE)。免疫技术与PCR技术结合发展出了免疫PCR技术(I-PCR或IC-PCR)。4、以分子生物学技术为基础的病毒检测方法：(1)核酸斑点杂交技术是采用带有放射性或非放射性物质标记的已知序列核酸单链作为探针，在一定条件下与靶病毒的核酸单链退火形成杂交双链。通过杂交信号的检测,检测出样本中病毒的基因组份。(2)多聚酶链式反应是一种特异性DNA体外扩增技术，现已渗透到分子生物学的各个领域。(3)双链RNA分析技术。(4)芯片技术检测法。

Saiki等于1998年首创RT-PCR技术，先将mRNA反转录为cDNA，再做PCR扩增，电泳后即可得到检测结果，已经成功应用于不同的植物病毒检测。周国辉使用双重RT-PCR在兰花样品上检测到CymMV和ORSV，这种方法的灵敏度高，所需样品量少，在快速检测低含量样品时十分有用。柳爱春等研究建立兰花病毒CymMV和ORSV双重一步法RT-PCR的检测方法，获得较理想的检出效果；扩增产物的核酸序列经BLAST分析，同源性均在85％以上，证实了检测结果的准确性。张威等根据大蒜普通潜隐病毒(garliccommonlatentvirus，GCLV)的外壳蛋白区域的保守序列设计合成一对寡核苷酸引物，以带毒植物的总RNA为模板，进行反转录和PCR扩增，通过反应体系和反应程序的建立与优化，扩增得到长300bp的目的片段，并将目的片段转入大肠杆菌进行了克隆和序列测定，测序结果与GenBank中其他GCLV相应区域的序列同源性最高达98％，并对其检测的特异性和灵敏度进行了验证，从而建立了快速、灵敏、特异性强的GCLV分子生物学检测方法。吴志朋等根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列，设计合成了一对寡核苷酸引物，从感染PLRV的马铃薯病叶组织中提取出病毒RNA，进行cDNA合成及PCR扩增，得到一条长度约620bp的特异PCR扩增产物，与理论设计的外壳蛋白基因大小一致。建立了快速灵敏简便的PLRV检测的新方法，其灵敏度要比PLRV的血清学检测方法高10⁴倍，在基因水平上为PLRV的检测提供了更新手段，并在农业部植物检疫实验所马铃薯病毒检测中心推广应用。此外，其他学者采用RT-PCR技术对马铃薯S病毒、马铃薯X病毒、黄瓜病毒、辣椒轻微斑驳病毒和香蕉分化芽中的黄花叶病毒进行了检测。

漆艳香等设计合成了苜蓿萎蔫病菌实时荧光PCR引物和特异性探针，在国内首次建立了苜蓿萎蔫病菌的实时荧光PCR检测体系，与普通PCR相比，实时荧光PCR的灵敏度高100倍。

免疫捕捉反转录PCR(IC-RT-PCR)检测技术是免疫学技术与RT-PCR技术相结合建立起来的检测技术。该技术不需进行病毒RNA的抽提，操作更容易，并且在不破坏病毒粒体的情况下，即可实现病毒的检测。该方法中的病毒特异性抗体可用依赖于dsRNA的单克隆抗体替代，为不具备病毒特异性抗体或采用免疫学技术很难检测的病毒提供了一个可行的检测方法。其灵敏度与典型的RT-PCR检测技术相同。陈建军等在检测葡萄卷叶病毒Ⅲ时，比较了常规的RT-PCR和IC-RT-PCR技术，发现RT-PCR不很稳定，易受环境、实验仪器和实验员身体上RNA酶的影响，植物组织中蛋白质、DNA和多糖也直接影响试验结果，而IC-RT-PCR可以避免上述问题，使检测简便、快速。已有报道表明，从10稀释度的番木瓜叶粗汁液(相当于0.5μg鲜叶组织的量)中检测到了番木瓜环斑病毒。

PCR-单链构型多态性(PCRsingle-strandconformationalpolymorphism，PCR-SSCP)是一种简单、快速和经济的检测突变的技术，是进一步研究细菌、真菌及病毒在不同地理区间差异的有效手段刘升学等利用PCR-SSCP对新疆甜菜坏死黄脉病毒RNA2变异进行了研究，通过分析来自新疆不同地区BNYVVRNA2的片段，将12个BNYVV分离株分为4个变异类型，初步明确了新疆分离株存在分化，并有明显的地域分布性。

1992年，Liang和Pardee首次提出差异显示技术(DD-PCR)，并且利用这一技术克隆了几个基因。差异显示的基本原理是，利用一系列的oligo(dT)引物，逆转录真核生物细胞中全部表达的mRNA，通过PCR扩增的方法，转换成cDNA双链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片段分开，筛选出目的基因。叶楠等以中国优良大豆品种东农46及大豆疫霉优势生理小种1号菌株为材料，利用mRNA差异显示技术研究东农46与大豆疫霉根腐病菌非亲和互作中前后基因表达的差异，寻找并分离出与大豆疫霉根腐病抗病性相关的9条cDNA片段，通过这些差异片段的序列分析进一步阐述大豆对疫霉根腐病菌的分子抗病机制。

陈微等以3株黄瓜尖镰孢菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumarinum)、23株镰孢菌属(Fusariumspp.)真菌和分离自土壤的20株真菌、6株细菌和7株放线菌为材料，采用化学裂解法提取总DNA，进行PCR-RFLP和巢式PCR检测。试验证明PCR-RFLP程序不能完全区分Fusarium属内不同种，而巢式PCR对黄瓜尖镰孢菌具有特异性。

玉米是我国主要农作物之一，同时也是重要的饲料和工业原料，玉米的品质和产量等关系到整个国民经济的发展，提高玉米品质有重大意义，植物病毒检测技术是对玉米种子健康与否进行检测的重要手段。目前植物病毒检测技术还有很多问题，如高质量RNA的提取，特异性引物的筛选等，这些问题严重阻碍了植物病毒检测技术在种子检测中的推广和应用。植物组织带毒量低，组织RNA提取质量不高在病毒检测技术中是首要的难题。

发明内容

本发明的目的是提供玉米中甘蔗花叶病毒的RT-PCR及RealTimePCR检测方法。

为了实现本发明目的，本发明首先提供玉米中甘蔗花叶病毒的RT-PCR检测用引物对，所述引物对包括：

正向引物F：5'-GTGATGTTGCTGCACTCCCAA-3'

反向引物R：5'-AAGTGGAGGCACTGGATCTGG-3'。

本发明还提供含有上述引物对的用于RT-PCR及RealTimePCR检测玉米中甘蔗花叶病毒的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括M-MLV反转录酶、M-MLV酶反应缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液等中的至少一种。更优选地，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

本发明还提供玉米中甘蔗花叶病毒的检测方法，即利用上述引物对或试剂盒对玉米中甘蔗花叶病毒进行RT-PCR以及Real-timePCR检测。所述方法包括以下步骤：

1)RT-PCR：提取玉米叶片中的总RNA，反转录获得第一条cDNA链，以cDNA链为模板进行PCR扩增反应；

2)以步骤1)中的cDNA链为模板，进行Real-timePCR扩增反应；

3)分析RT-PCR和Real-timePCR扩增产物。

步骤1)具体为：

①在经DEPC处理的离心管中配制RNA/引物混合物体系6μl：700ng/μlRNA1μl，50mΜOligO(dT)-18Primer0.2μg，DEPC-H₂O补足至6μl，70℃保温10min，冰上冷却2min，然后瞬时离心，使溶液聚于管底；

②向管中加入以下成分，配制反转录缓冲液：5×M-MLV酶反应缓冲液10μl，2μM正向引物F0.5μl，2μM反向引物R0.5μl，M-MLV反转录酶1μl，DEPC-H₂O17.5μl，混匀后瞬时离心，42℃保温60min；

③PCR扩增反应

PCR反应体系：

PCR反应条件：94℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃45s，共30个循环；72℃10min。

采用SYBRGreenI嵌合荧光法进行RealTimePCR，反应体系以25μl计为：

RealTimePCR反应条件为：95℃10秒；95℃5秒，60℃30秒，共40个循环。

本发明提供的玉米中甘蔗花叶病毒的检测方法，首先提取高质量的病毒RNA样品，根据甘蔗花叶病毒外壳蛋白(CP)基因设计引物，并利用RT-PCR和Real-timePCR技术进行检测，最终建立了一套可以快速、高效检测到病毒检测方法。该检测方法通过有效检测玉米中低含量的甘蔗花叶病毒，从而减少甘蔗花叶病毒的潜在危害，降低农作物生产的损失。

具体采用以下技术方案：

(1)提取受甘蔗花叶病毒侵染的玉米叶片的总RNA；

(2)获得甘蔗花叶病毒外壳蛋白(CP)基因的反转录cDNA序列，并设计引物；

(3)将受甘蔗花叶病毒侵染的玉米叶片的总RNA进行反转录得到cDNA，利用筛选的引物对反转录cDNA进行扩增。

进一步地，步骤(1)中利用Trizol法提取受甘蔗花叶病毒侵染的玉米叶片中的总RNA。

进一步地，步骤(2)中通过NCBI查找病毒外壳蛋白(CP)基因序列(GenBank：JX286708.1)，利用Primer3.0获得甘蔗花叶病毒外壳蛋白基因(CP)序列的反转录cDNA序列。步骤(2)中设计的引物为：

进一步地，步骤(3)中筛选的引物为：

SCMV-874-F：5'-GTGATGTTGCTGCACTCCCAA-3'(SeqIDNo.1)

SCMV-874-R：5'-AAGTGGAGGCACTGGATCTGG-3'(SeqIDNo.2)

在病毒检测中，检测样本高质量的RNA的提取是实现成功检测的第一步，检测样本RNA需要有足够高的浓度和纯度。本发明利用Trizol法提取受侵染植物组织器官中RNA，实验证明经改良完善的RNA提取方法有效可行，可得到质量较高，可用于进一步检测的RNA样品。

利用本发明的检测体系可以从受侵染玉米叶片中提取较高质量的RNA，并检测到fg水平病毒，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例中对提取的甘蔗花叶病毒RNA进行琼脂糖凝胶电泳结果。

图2为本发明实施例中对提取的玉米幼苗发病叶片总RNA进行反转录得到cDNA，利用筛选的引物对cDNA进行PCR扩增的结果。

图3为本发明实施例中对提取的总RNA按10倍浓度稀释后进行RT-PCR扩增的结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例玉米中甘蔗花叶病毒的检测方法

本实施例中使用的植物材料为受甘蔗花叶病毒侵染的玉米叶片。

具体实施步骤如下：

1、植物组织总RNA的提取

(1)将约100mg样品加入1.5mlEppendorf管中，加入液氮将样品磨碎；

(2)向离心管中加入1mlTrizol，迅速混匀，室温下静置15-20分钟，使核酸与蛋白复合物完全分离；

(3)4℃12000rp离心10分钟，吸取上清；

(4)加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15秒，室温放置5分钟；

(5)4℃12000rpm离心15分钟，样品分为底层、中间层和上层三层，底层为黄色有机相，上层为无色水相，RNA主要存在于水相中，将水相(上清液)吸出转移至新的1.5mlEppendorf管中；

(6)加入0.5ml异丙醇混匀，室温放置10分钟；

(7)4℃12000rp离心10分钟，弃去上清，管底和管壁的胶状沉淀为植物组织中的RNA；

(8)向管中加入1ml75％乙醇洗涤RNA沉淀，使沉淀悬浮；

(9)4℃12000rp离心5分钟，弃去上清液；

(10)室温放置10分钟左右，晾干，加入30μlDEPC水，60℃放置10分钟，使RNA溶解。

2、DNaseI处理RNA

(1)反应体系为，RNA30μl，Buffer4μl，DNaseI3μl，RNaseInhibitor1μl，加DEPC-H₂O补足至40μl；

(2)将40μl反应体系37℃水浴45分钟；

(3)加入60μlDEPC-H₂O，100μl氯仿:异戊醇(24:1，体积比)，混匀后12000rpm离心10分钟；

(4)吸取上清至另一干净离心管中，加入400μl氯仿:异戊醇(24:1，体积比)，充分混匀，12000rpm离心10分钟；

(5)吸取上清至另一干净离心管中，加入2倍体积无水乙醇，-20℃沉淀1小时；

(6)12000rpm离心15分钟，回收沉淀，用70％乙醇洗两次，吸走乙醇后室温下放置10分钟左右，将RNA沉淀晾干；

(7)加入30μlDEPC-H₂O将RNA沉淀溶解，经1％琼脂糖凝胶电泳检测后放于-70℃保存。

对提取的RNA进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，由图中可以看出，所提取RNA浓度较好，可以进一步用于PCR的检测。

对提取的玉米叶片RNA进行浓度测定：

结果显示可以用于进一步PCR检测。

3、引物设计

通过NCBI查找病毒外壳蛋白(CP)基因序列(GenBank：JX286708.1)，利用Primer3.0获得病毒外壳蛋白基因序列的反转录cDNA序列。并进行引物设计。根据目的片段大小，共设计4对引物：

4、提取接种甘蔗花叶病毒的玉米幼苗发病叶片的总RNA，并将RNA进行反转录得到cDNA。利用筛选的上述4对引物对反转录cDNA进行扩增，结果如图2所示，其中，引物Primer271没有目的条带；引物Primer434有目的条带，但目的条带较暗；引物Primer621有目的条带，但没有特异性；引物Primer874目的条带较亮，且具有特异性。

5、将提取的玉米幼苗发病叶片的总RNA按10倍浓度稀释后进行RT-PCR扩增，RT-PCR扩增步骤如下：

(1)在经DEPC处理的离心管中配制RNA/引物混合物，6μl体系：

(2)70℃保温10min，冰上冷却2min；

(3)瞬时离心，使溶液聚于管底；

(4)向管中加入以下成分，配制反转录缓冲液：

(5)混匀后瞬时离心，在42℃保温60min。

(6)PCR扩增反应

PCR反应体系：

PCR反应条件：94℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃45s，共30个循环；72℃10min。

PCR扩增结果如图3所示，由图中可以看出，在稀释1/10浓度的RNA中检测到目的片段的存在。

实验所用总RNA浓度为300-900ng/μl，稀释1/10后浓度为30-90ng/μl。即RT-PCR的最低检测浓度为总RNA30-90ng/μl中所含病毒RNA的浓度。

6、将提取的玉米幼苗发病叶片的总RNA按100倍浓度稀释后进行Real-timePCR，Real-timePCR步骤如下：

利用SYBRGreenI嵌合荧光法进行RealTimePCR。

(1)配制PCR反应液(冰上操作)

(2)使用RealTimePCR扩增仪进行扩增。

采用两步法进行PCR反应程序：预变性95℃10s；95℃5s，60℃30s，共40个循环。

(3)反应结束后分析实验结果，确认PCR反应的扩增曲线和溶解曲线，制作Real-timePCR标准曲线。结果表明，本发明方法可在稀释1/100浓度的RNA中检测到目的片段的存在。

实验所用总RNA浓度为300-900ng/μl，稀释1/100后浓度为3-9ng/μl。即Real-timePCR的最低检测浓度为总RNA3-9ng/μl中所含病毒RNA的浓度。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.玉米中甘蔗花叶病毒的RT-PCR检测用引物对，其特征在于，所述引物对包括：

正向引物F：5'-GTGATGTTGCTGCACTCCCAA-3'

反向引物R：5'-AAGTGGAGGCACTGGATCTGG-3'。

2.含有权利要求1所述引物对的用于RT-PCR及RealTimePCR检测玉米中甘蔗花叶病毒的试剂盒。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括M-MLV反转录酶、M-MLV酶反应缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg²⁺、PCR反应缓冲液中的至少一种。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。

5.玉米中甘蔗花叶病毒的检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述引物对或权利要求2-4任一项所述试剂盒对玉米中甘蔗花叶病毒进行RT-PCR以及Real-timePCR检测。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取玉米叶片中的总RNA，反转录获得第一条cDNA链，以cDNA链为模板进行PCR扩增反应；

2)以步骤1)中的cDNA链为模板，进行Real-timePCR扩增反应；

3)分析RT-PCR和Real-timePCR扩增产物。

7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，步骤1)具体为：

①在经DEPC处理的离心管中配制RNA/引物混合物体系6μl：700ng/μlRNA1μl，50mΜOligO(dT)-18Primer0.2μg，DEPC-H₂O补足至6μl，70℃保温10min，冰上冷却2min，然后瞬时离心，使溶液聚于管底；

②向管中加入以下成分，配制反转录缓冲液：5×M-MLV酶反应缓冲液10μl，2μM正向引物F0.5μl，2μM反向引物R0.5μl，M-MLV反转录酶1μl，DEPC-H₂O17.5μl，混匀后瞬时离心，42℃保温60min；

③PCR扩增反应

PCR反应体系：

PCR反应条件：94℃5min；94℃45s，60℃45s，72℃45s，共30个循环；72℃10min。

8.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，采用SYBRGreenI嵌合荧光法进行RealTimePCR，反应体系以25μl计为：

9.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于，RealTimePCR反应条件为：95℃10秒；95℃5秒，60℃30秒，共40个循环。