CN106521028A

CN106521028A - 一种用于同步检测4种虫传病毒的多重rt－pcr方法

Info

Publication number: CN106521028A
Application number: CN201610971730.5A
Authority: CN
Inventors: 王锡锋; 张培培; 刘艳
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-11-07
Filing date: 2016-11-07
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2036-11-07
Also published as: CN106521028B

Abstract

本发明具体属于农业生物分子生物学检测领域，公开了一种用于同步检测4种虫传病毒的多重RT－PCR方法，该PCR体系中含有4对特异性引物(SEQ ID NO1～8)，在一个PCR体系中同步对4种病毒进行扩增，得到273、565、783、1296bp的特异性条带，建立并优化了能同步检测RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV的多重RT‑PCR鉴定体系。检测结果表明优化后的多重RT‑PCR体系能在田间样品中快速、高效地检测出4种病毒，准确度高，灵敏性好。对监测小麦上NCMV等4种虫传病毒病在田间的发生情况以及病害流行预测具有十分重要的意义。

Description

一种用于同步检测4种虫传病毒的多重RT－PCR方法

技术领域

本发明属于农业生物学技术领域，具体地涉及在同一PCR体系中同步对4种侵染小麦的虫传病毒进行扩增，达到快速区分、高效检测的目的。

背景技术

小麦是我国的三大粮食作物之一，而病毒病是危害小麦生产的一类重要病害，国际上已报道的有50多种，病毒病在小麦的苗期和成株期均能侵染，一般侵染愈早，对小麦生长和产量的影响愈大。近年来由于全球气候变暖、免耕和高毒农药的禁用等因素使传毒介体昆虫群体逐渐加大，加之品种抗病性程度普遍较低等，虫传麦类作物病毒病在我国危害日趋严重，发生面积及为害程度迅速增长，成为影响国家粮食安全的重要因素。近年来，在我们北部麦区危害严重的虫传病毒病有小麦丛矮病、小麦矮缩病、小麦绿矮病等多种，小麦丛矮病由北方禾谷花叶病毒(Northern cereal mosaic virus，NCMV)引起，小麦绿矮病由水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)引起,小麦矮缩病则由小麦矮缩病毒(Wheat dwarf virus,WDV)引起。前两种病毒均由灰飞虱(Laodelphaxstriatellus Fallen)传播，而小麦矮缩病毒病的传播主要通过介体条沙叶蝉(Psammotettix striatus L.)以持久循回方式传播的。小麦丛矮病和小麦绿矮病以及小麦矮缩病在症状表现上很难区分，均表现植株矮缩、分蘖增多等症状，且田间多为混合发生，近年来新发现小麦上另一种病毒病即由灰飞虱传播的大麦黄条点花叶病毒(Barleyyellow striate mosaic virus,BYSMV)也表现黄化，矮化等症状。因此生产上急需可靠、方便且经济实用的区分这四种病毒的检测方法。

分子检测技术因其快速、灵敏、特异、准确等优点，被广泛应用于细菌、真菌、病毒、的快速检测和鉴定，以及病害的早期筛查与诊断中。随着生物技术的发展，基于核酸的多重检测技术在核酸诊断领域发挥了越来越重要的作用，主要包括以多重PCR、核酸等温扩增、基因芯片为基础的多重核酸检测技术，这些技术可对多个靶标进行同时检测，具有快速、高通量、样品消耗少等特点。多重PCR(multiplex PCR)是Chamberlain于1988年报道的一种PCR衍生方法，即在一个PCR体系中加入1对以上的引物，以对两种及以上的目的基因进行同时扩增的检测技术。多重PCR的基本原理、反应试剂和操作均与常规PCR相同，区别在于多重PCR体系中含有2对或多对引物，分别扩增不同模板，以对多个靶标进行同时检测。该发明即利用以上原理针对侵染小麦的4种虫传病毒建立了特异、高效的多重PCR检测体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种快速又高效的用于同步检测侵染小麦的4种虫传病毒的方法，准确度高，灵敏性好。

一种用于同步检测RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV 4种虫传病毒的多重RT-PCR方法，在同一PCR体系中，包含有如下特异性引物对：

扩增RBSDV病毒的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1：5′-ACGAACAACGACCTAAGTGA-3′；

SEQ ID NO.2：5′-AAGTATTCCCATTTGAGCAG-3′。

扩增BYSMV病毒的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.3：5′-TGGGACTCTTCAGGTTGTGG-3′；

SEQ ID NO.4：5′-CTGGCTGTTGGATTCATTTCTC-3′。

扩增WDV病毒的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.5：5′-TCTTCAAAGGTTTGCGTGTC-3′；

SEQ ID NO.6：5′-GGGAGGCATAAGTCCATCTA-3′。

扩增NCMV病毒的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.7：5′-CTATGCAAGAACAAAGCAGGAT-3′；

SEQ ID NO.8：5′-ACCGACAGTAATGAAGAGGC-3′。

所述PCR体系中引物对的摩尔比为WDV：RBSDV：BYSMV：NCMV＝1：2：2：5。

所述的PCR体系总体积25μL，其中含有2μLcDNA，2μL浓度为2.5mM的dNTP、0.2μLrTaq、1.5μL浓度为25mM的Mg²⁺以及浓度为10μmol/L WDV/RBSDV/BYSMV/NCMV上下游引物各0.1μL、0.2μL、0.2μL、0.5μL。

所述PCR扩增反应条件为：94℃3min；94℃30s、53℃45s和72℃80s共35个循环；72℃10min。

上述方法在同步检测农作物上RBSDV、BYSMV、WDV、NCMV四种病毒中的应用。

所述农作物为小麦、大麦、燕麦或黑麦。

本发明提供的扩增RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV四种病毒的特异性引物，通过RT-PCR可分别获得273bp,565bp,783bp和1296bp的单一条带，通过对体系中退火温度，dNTP Mix，rTaq以及Mg²⁺浓度进行系列优化，建立了基于单重RT-PCR技术的多重RT-PCR检测方法，从而实现对小麦上RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV等四种虫传病毒同步检测技术的突破。具体发明内容涉及到：1)4种病毒的植物样品采集与保存；2)病毒RNA的提取；3)特异性引物的设计；4)4种病毒的单重RT-PCR鉴定体系；5)基于单重RT-PCR技术的多重RT-PCR检测方法的建立与优化；6)多重RT-PCR检测方法灵敏度的测定；7)多重RT-PCR体系成功应用于田间样品的检测。本发明的多重PCR经优化，确定了体系中最佳条件为：退火温度为53℃，2μL dNTP mix(2.5mM each)、0.2μL rTaq以及1.5μL Mg²⁺(25mM)的使用量。多重RT-PCR扩增体系如下：94℃3min，(94℃30s、53℃45s和72℃80s)×35个循环，72℃10min。

以上所述的四对特异性引物可做为组合应用于小麦上RBSDV、BYSMV、WDV、NCMV四种病毒的同步检测的应用。

所述的RBSDV和NCMV毒源均采自山东济南，所述的BYSMV采自河北石家庄，所述的WDV毒源是采自陕西韩城，经PCR和血清学鉴定为阳性的植株，分别经相应的介体灰飞虱或条沙叶蝉活体饲喂保存在感病小麦品种扬麦12号。

所述的灰飞虱种群采自江苏盐城，常年在水稻幼苗上饲养；

所述的条沙叶蝉种群采自陕西韩城，常年在小麦幼苗上饲养。

所述的介体饲养和作为饲料的寄主小麦或水稻材料均种植在22℃培养箱内，16h光照、8h黑暗，光照强度为20000Lx。每两周将叶蝉或灰飞虱转移到新种的幼苗上，以此方法来保存介体。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1.本发明首次提出在小麦上同步检测RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV四种病毒；

2.本发明提出的检测引物具有特异性和兼并性，优化了PCR扩增程序，大大地提高了检测效率、缩短了检测时间，提高了检测结果的可信度；

3.本发明实施的检测是在同一个PCR体系完成，节约了病毒RNA以及PCR扩增体系各试剂特别是反转录酶、Taq的使用量，大大减低了检测成本。

附图说明

图1.四种病毒的单重PCR检测的引物特异性电泳结果；其中：M代表DL2000DNAMarker,从上到下依次为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp；1～4泳道依次为RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV病毒样品分别应用相应的特异性引物扩增的结果。

图2.四种病毒特异性引物扩增的兼容性电泳结果；其中：M代表D2000DNA Marker,从上到下依次为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp；1～5泳道依次为RBSDV、BYSMV、WDV、NCMV以及四种病毒样品混合物分别用混合的四种病毒特异性引物扩增的结果，6泳道为健康样品对照。

图3.多重PCR体系的优化；其中A:退火温度的优化,从左到右分别为49/51/53/55/57℃；B:dNTP用量的优化,从左到右分别为1/2/4/6/8μL；C:rTaq用量的优化,从左到右分别为0.1/0.2/0.3/0.4/0.5μL；D:Mg²⁺用量的优化，从左到右分别为0.5/1.0/1.5/2.0/2.5μL。所有图中的M代表DL2000DNA Marker,从上到下依次为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp。

图4.多重PCR体系的灵敏度测定；图中的M代表DL2000DNA Marker,从上到下依次为2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp,100bp。1～5泳道依次为混合病毒样品的cDNA 5个浓度梯度(10⁰～10^-4)的电泳结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

需特别指出的是，尽管本发明阐述的是针对小麦上RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV四种虫传病毒的鉴定技术，但RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV病毒也侵染大麦、燕麦、黑麦等多种麦类种质资源，因此应用本发明对任何引起RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV病毒的寄主如大麦、燕麦、黑麦等麦类种质资源均也包括在本发明所要求的权利范围之内。

实施例1.四种虫传病毒的分离与保存

所述的水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)毒源是水稻黑条矮缩病毒山东济南分离物，挑选症状明显的植株经PCR和血清学鉴定为阳性后，由介体灰飞虱传毒活体保存在寄主小麦上。所述的大麦黄条点病毒(BYSMV)毒源是大麦黄条点花叶病毒河北石家庄分离物，挑选症状明显的植株经PCR和血清学鉴定为阳性后，由介体灰飞虱传毒活体保存在寄主小麦上。所述的北方禾谷花叶病毒(NCMV)毒源是北方禾谷花叶病毒山东济南分离物，挑选症状明显的植株经PCR和血清学鉴定为阳性后，由介体灰飞虱传毒活体保存在寄主小麦上。传毒介体灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)采自江苏盐城，经脱毒纯化后在健康水稻上常年扣罩饲养繁殖。所述的介体饲养和作为饲料的水稻品种均饲养在25℃光照培养箱内，16h光照、8h黑暗，光照强度为20000Lx。所述的小麦矮缩病毒(WDV)毒源是小麦矮缩病毒陕西韩城分离物，挑选症状明显的植株经PCR和血清学鉴定为阳性后，经条沙叶蝉传毒活体保存在寄主小麦上。传毒介体条沙叶蝉[Psammotettix striatus(Linnaeus)]采自陕西韩城，经脱毒纯化后在健康小麦上常年扣罩饲养繁殖。所述的介体饲养和作为饲料及传毒寄主的小麦品种扬麦12号均饲养在22℃光照培养箱内，16h光照、8h黑暗，光照强度为20000Lx。

实施例2.病毒RNA的提取

采用TRIzol(Invitrogen,USA)法分别提取四种病毒样品及待检测样品的总RNA。具体提取过程为：将约0.1g新鲜或冰冻的样品在液氮中充分研磨成粉末，迅速转移入液氮冷冻过的1.5mL离心管中，然后加入1mLTRIzol，剧烈摇晃混匀，冰上静置5min；加入200μL氯仿，用力摇15s，冰上静置5min。4℃，12,000rpm离心10min；将上清转入新的离心管，加入与上清等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，冰上静置10min；4℃，12,000rpm离心15min，去上清；加入1mL预冷的75％乙醇(灭菌的DEPC水配制)，洗涤沉淀。4℃，12,000rpm离心5min弃上清，重复上述洗涤步骤，以彻底洗干净盐分；用枪头尽量吸出上清。在通风厨中，开口朝上，干燥15～20min后用50μL灭菌的DEPC水溶解。取1μL RNA用NanoDrop-2000紫外分光光度计测定RNA样品的纯度和浓度值。合格样品置于-70℃冰箱保存待用。

实施例3.特异性引物的设计

每种病毒依据GenBank上登录的序列用Primer Premier 5软件设计特异性引物，每对引物选择相似的退火温度且不同的PCR产物大小及避免二级结构和引物之间的互作，具体引物如表1，引物由上海生物工程有限公司合成。

表1.RBSDV、WDV、BYSMV和NCMV四种病毒的多重PCR检测体系中的特异性引物

实施例4.四种病毒的单重RT-PCR体系

cDNA合成体系总体积为20μL，其中RNA(大约1μg)1μL,反向引物(10μmol/L)2μL,dNTP Mix(2.5mM each)2μL,5×MMLV-buffer 4μL，DEPC H₂O补足至10μL,混匀后90℃变性1min，立即置于冰上2min；然后加入M-MLV反转录酶(Promega,USA)1μL,RRI(Takara,China)0.5μL以及DEPC H₂O 8.5μL。混匀后，37℃孵育1hr,70℃10min。

PCR体系如下：cDNA2μL,10×PCR Buffer(Mg²⁺plus,15mM)2.5μL,dNTP Mix(each2.5mM)2μL,上下游引物各0.5μL,rTaq(Takara,China)0.2μL，用ddH₂O补足至25μL。扩增体系如下：94℃3min，(94℃30s、55℃45s和72℃80s)×35个循环，72℃10min。PCR产物用1％琼脂糖电泳，用EB染色观察结果。电泳结果显示：用相应的特异性引物扩增RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV分别获得了273bp,565bp,783bp和1296bp的单一条带(图1)。

实施例5.PCR产物的克隆与多重RT-PCR产物回收测序测序

将实施例4中的PCR产物切胶回收，与pEASY-T5载体(全式金生物有限公司，中国)进行连接，导入到感受态细胞Trans-T1(全式金生物有限公司，中国)中实现转化，挑取10个克隆斑，经菌液PCR扩增阳性并送样测序，每个样品送3个克隆，测序工作由上海生物工程有限公司完成。测序结果经比对表明获得的序列与原参考序列的同源性在98％以上，证明了扩增结果的可靠性。

实施例6.四种病毒的多重RT-PCR体系建立与优化

多重RT-PCR体系与单重RT-PCR体系的试剂成分相同，但是多重PCR体系是在一个反应体系中检测所有4种病毒，因此多重PCR体系中的RNA和引物为4种病毒RNA和特异性引物对的混合物，引物对的最佳比例为WDV：RBSDV：BYSMV：NCMV＝1：2：2：5。结果表明4对引物有良好的兼容性(图2)。为了优化多重PCR体系，将不同的退火温度，不同的dNTP Mix，rTaq以及Mg²⁺浓度做为优化的因素，其中：分49/51/53/55/57℃5个梯度对退火温度进行优化；分别以1/2/4/6/8μL的用量对dNTP mix的浓度进行优化；分别以0.1/0.2/0.3/0.4/0.5μL的用量对rTaq使用浓度进行优化；分别以0.5/1.0/1.5/2.0/2.5μL的用量对Mg²⁺浓度进行优化。优化体系中最佳条件为退火温度53℃、2μL dNTP mix、0.2μL rTaq以及1.5μL Mg²⁺浓度，结果分别如图3(A-D)。

最终优化的多重RT-PCR体系如下：cDNA合成体系总体积为20μL，其中RNA(大约1μg)1μL,反向引物(10μmol/L)各0.5μL,dNTP Mix(2.5mM each)2μL，5×MMLV buffer 4μL，DEPC H₂O补足至10μL,混匀后90℃变性1min，立即置于冰上2min；然后加入M-MLV反转录酶1μL,RRI 0.5μL以及DEPC H₂O 8.5μL。混匀后，37℃孵育1hr，70℃10min。取上述合成体系中的cDNA2μL,10×PCR buffer(Mg²⁺-Free)2.5μL,Mg²⁺(25mM)1.5μL,dNTP Mix(each 2.5mM)2μL,WDV/RBSDV/BYSMV/NCMV上下游引物各0.1/0.2/0.2/0.5μL,rTaq(Takara,China)0.2μL，用ddH₂O补足至25μL。扩增体系如下：94℃3min，(94℃30s、53℃45s和72℃80s)×35个循环，72℃10min。

实施例7.多重RT-PCR体系的灵敏度测定

为检测多重RT-PCR体系的灵敏度，将cDNA成10倍系列稀释(10⁰-10^-4)，结果表明多重RT-PCR的检测底限是10^-2的cDNA，当稀释100倍时，NCMV和WDV的条带比较模糊，而BYSMV的条带依然清晰,结果如图4。

实施例8.多重RT-PCR体系的应用

2016年3月至4月期间，采集陕西韩城等5个不同地区的具典型矮化、丛生症状的117份小麦病株，按照实施例2的方法提取样品总RNA,利用实施例6中建立的多重RT-PCR体系鉴定样品中的病原物，具体检测结果如表2所示。该体系成功地从陕西韩城27份样品中检出5个WDV和1个NCMV阳性样品，山东济南9份样品中5个RBSDV和2个NCMV阳性样品，河南郑州的6份样品中检出1个BYSMV阳性样品，河北石家庄的62份样品中检出38个BYSMV和4个WDV阳性样品，以上结果表明建立的多重RT-PCR方法可以较好地应用于田间样品的检测。

表2.应用多重RT-PCR法检测田间小麦样品中的四种病毒

SEQUENCE LISTING

<110> 中国农业科学院植物保护研究所

<120> 一种用于同步检测4种虫传病毒的多重RT－PCR方法

<130> PP16122-ZWB

<160> 8

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增RBSDV病毒的正向特异性引物的核苷酸序列

<400> 1

acgaacaacg acctaagtga 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增RBSDV病毒的反向特异性引物的核苷酸序列

<400> 2

aagtattccc atttgagcag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增BYSMV病毒的正向特异性引物的核苷酸序列

<400> 3

tgggactctt caggttgtgg 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 扩增BYSMV病毒的反向特异性引物的核苷酸序列

<400> 4

ctggctgttg gattcatttc tc 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增WDV病毒的正向特异性引物的核苷酸序列

<400> 5

tcttcaaagg tttgcgtgtc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增WDV病毒的反向特异性引物的核苷酸序列

<400> 6

gggaggcata agtccatcta 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 扩增NCMV病毒的正向特异性引物的核苷酸序列

<400> 7

ctatgcaaga acaaagcagg at 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 扩增NCMV病毒的反向特异性引物的核苷酸序列

<400> 8

accgacagta atgaagaggc 20

Claims

1.一种用于同步检测RBSDV、BYSMV、WDV和NCMV 4种虫传病毒的多重RT-PCR方法，在同一PCR体系中，包含有如下特异性引物对：

扩增RBSDV病毒的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1：5′-ACGAACAACGACCTAAGTGA-3′；

SEQ ID NO.2：5′-AAGTATTCCCATTTGAGCAG-3′。

扩增BYSMV病毒的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.3：5′-TGGGACTCTTCAGGTTGTGG-3′；

SEQ ID NO.4：5′-CTGGCTGTTGGATTCATTTCTC-3′。

扩增WDV病毒的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.5：5′-TCTTCAAAGGTTTGCGTGTC-3′；

SEQ ID NO.6：5′-GGGAGGCATAAGTCCATCTA-3′。

扩增NCMV病毒的特异性引物的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.7：5′-CTATGCAAGAACAAAGCAGGAT-3′；

SEQ ID NO.8：5′-ACCGACAGTAATGAAGAGGC-3′。

2.根据权利要求1所述的方法，所述PCR体系中引物对的摩尔比为WDV：RBSDV：BYSMV：NCMV＝1：2：2：5。

3.根据权利要求2所述的方法，所述的PCR体系25μL，其中含有2μLcDNA，2μL浓度为2.5mM的dNTP、0.2μL rTaq、1.5μL浓度为25mM Mg²⁺以及浓度为10μmol/L的WDV/RBSDV/BYSMV/NCMV上下游引物各0.1μL、0.2μL、0.2μL、0.5μL。

4.根据权利要求3所述的方法，所述PCR扩增反应条件为：94℃3min；94℃30s、53℃45s和72℃80s共35个循环；72℃10min。

5.权利要求1－4任一所述方法在同步检测农作物上RBSDV、BYSMV、WDV、NCMV四种病毒中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，所述农作物为小麦、大麦、燕麦或黑麦。